JP2023502658A

JP2023502658A - 人工ナノポアおよびそれに関する使用および方法

Info

Publication number: JP2023502658A
Application number: JP2022529047A
Authority: JP
Inventors: マッリア、ジョヴァンニ; ジャン、シェンリ
Original assignee: レイクスユニフェルシテイトフローニンゲン
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2020-11-19
Publication date: 2023-01-25
Also published as: IL293024A; KR20220100901A; WO2021101378A1; MX2022006018A; BR112022009402A2; US20220412948A1; CN114981450A; CA3161981A1; AU2020389020A1; EP4061965A1

Abstract

本発明は、ナノポアの分野、およびポリペプチドおよびポリヌクレオチドを含む、生体高分子の分析におけるその使用に関する。サブユニットの多量体集合を含み、各サブユニットは、（ｉｉ）集合のＴＭ領域を横切るポリペプチドまたはポリヌクレオチドの輸送を制御することができる環形成タンパク質のサブユニットの（ｉ）アミノ酸配列に融合したβ－バレルまたはα－ヘリカルポア形成タンパク質の膜貫通（ＴＭ）配列を含む、人工ナノポアが提供される。【選択図】図１

Description

本発明は、一般に、ナノポアの分野、および生体ポリマーおよび他の（生物学的）化合物の分析におけるその使用に関する。特に、それは、人工ナノポアおよびそれらのマルチ－タンパク質集合、および単分子ポリペプチド配列決定などの単分子分析におけるそれらの応用に関する。

細胞において、スプライシングおよび翻訳後修飾は、集合技術によって容易に対処されないタンパク質集団に大きな不均一性を誘発する。しかし、今日、単タンパク質の配列決定を可能にする技術は存在しない。生物学的ナノポアは、強力な単分子ツールとして浮上している。

生体膜上にナノスケールの開口部を形成するタンパク質を通過するイオン電流は、強力な単分子ツールとして浮上している。固体膜上に形成されたナノポアと比較して、生物学的ナノポアは、原子精度で自己組織化するという利点を有し、生体分子を処理するために数十億年にわたって進化した自然のナノマシンと結び付くことができる。

最も注目すべきは、ＤＮＡ処理酵素によって支援されたナノポアが現在ＤＮＡの配列決定に使用されていることである（非特許文献１、２）。近年、我々は、イソギンチャクのアクチニア・フラガセア（Ａｃｔｉｎｉａｆｒａｇａｃｅａ）からの八量体フラガセアトキシンＣ（ＦｒａＣ）ナノポアを使用して、タンパク質およびペプチドを研究できること、および低ｐＨ（すなわちｐＨ３．８）では、ペプチド封鎖からＦｒａＣナノポアへのイオン信号がペプチドの体積に直接関係すること、を示した（非特許文献２９）。また、本出願人の名における特許文献１も参照されたい。

タンパク質の同定および配列決定は、ポリペプチドの通過を制御することができる新しいナノポアを設計することおよび操作することを必要とするであろう。しかしながら、タンパク質の折り畳みと集合は簡単に予測できないため、ポリペプチドを用いてナノスケールで構築することは非常に困難なままである。今日まで、進んだ機能を備えたナノポアの調製は言うまでもなく、脂質二重層中で開いたままでいることができるタンパク質ナノポアの設計でさえ、まだ報告されていない。完全にタンパク質で作られた複雑な分子機械に結合された人工ナノポアを設計する能力は、ナノテクノロジーにおける生物学的ナノポアの使用を拡大し、膜タンパク質構造に関する基本的な問題を解明するであろう。複雑なタンパク質構造の製造は、ナノスケールの組み立てにおける新たに生じる課題に対処するであろう。したがって、強固な膜貫通機械の構築は、ナノテクノロジーにおける重要な目標である。

単分子タンパク質配列決定への主流のアプローチでは、タンパク質は展開され、ナノポアを横切って進行的に位置を変える。重要な概念実証作業（非特許文献３７）では、ポアの反対側に可溶性タンパク質として存在するＣｌｐＸアンフォールダーゼが、ナノポアの侵入に対してタンパク質を展開することによって強制的にタンパク質の位置を変えながら、Ｎ末端ポリペプチドによって伸長されたタンパク質がα－ＨＬナノポアを部分的に通過した。タンパク質ドメインは認識できたが、展開プロセスから生じる複雑な電流サインはポリペプチド配列決定の認識を妨げた。別のアプローチ（非特許文献２９）では、タンパク質は特定の部位で切断される可能性があり、ナノポア電流は放出されたペプチドを識別するために使用される。

国際公開第２０１８／０１２９６３号国際公開第２０１０／００４２６５号米国特許出願公開第２０１６／００３２２３５号明細書

Ｍａｎｒａｏ，Ｅ．Ａ．，Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｉ．Ｍ．，Ｌａｓｚｌｏ，Ａ．Ｈ．，Ｌａｎｇｆｏｒｄ，Ｋ．Ｗ．，Ｈｏｐｐｅｒ，Ｍ．Ｋ．，Ｇｉｌｌｇｒｅｎ，Ｎ．，Ｐａｖｌｅｎｏｋ，Ｍ．，Ｎｉｅｄｅｒｗｅｉｓ，Ｍ．ａｎｄＧｕｎｄｌａｃｈ，Ｊ．Ｈ．ＲｅａｄｉｎｇＤＮＡａｔｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈａｍｕｔａｎｔＭｓｐＡｎａｎｏｐｏｒｅａｎｄｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０，３４９－３５３（２０１２）Ｎｏａｋｅｓ，Ｍ．Ｔ．，Ｂｒｉｎｋｅｒｈｏｆｆ，Ｈ．，Ｌａｓｚｌｏ，Ａ．Ｈ．，Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｉ．Ｍ．，Ｌａｎｇｆｏｒｄ，Ｋ．Ｗ．，Ｍｏｕｎｔ，Ｊ．Ｗ．，Ｂｏｗｍａｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｂａｋｅｒ，Ｋ．Ｓ．，Ｄｏｅｒｉｎｇ，Ｋ．Ｍ．，Ｔｉｃｋｍａｎ，Ｂ．Ｉ．ａｎｄＧｕｎｄｌａｃｈ，Ｊ．Ｈ．ＩｎｃｒｅａｓｉｎｇｔｈｅａｃｃｕｒａｃｙｏｆｎａｎｏｐｏｒｅＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｕｓｉｎｇａｔｉｍｅ－ｖａｒｙｉｎｇｃｒｏｓｓｍｅｍｂｒａｎｅｖｏｌｔａｇｅ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７，６５１－６５６（２０１９）Ｃｒｅｓｓｉｏｔ，Ｂ．，Ｏｕｋｈａｌｅｄ，Ａ．，Ｐａｔｒｉａｒｃｈｅ，Ｇ．，Ｐａｓｔｏｒｉｚａ－Ｇａｌｌｅｇｏ，Ｍ．，Ｂｅｔｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ａｕｖｒａｙ，Ｌ．，Ｍｕｔｈｕｋｕｍａｒ，Ｍ．，Ｂａｃｒｉ，Ｌ．ａｎｄＰｅｌｔａ，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｔｈｒｏｕｇｈａｎａｒｒｏｗｓｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅｎａｎｏｐｏｒｅａｔｈｉｇｈｖｏｌｔａｇｅ：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓａｎｄｔｈｅｏｒｙ．ＡＣＳＮａｎｏ６，６２３６－６２４３（２０１２）Ｂｕｒｎｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｇｏｅｐｆｒｉｃｈ，Ｋ．，Ｗｏｏｄ，Ｊ．Ｗ．，Ｔｈａｃｋｅｒ，Ｖ．Ｖ．，Ｓｔｕｌｚ，Ｅ．，Ｋｅｙｓｅｒ，Ｕ．Ｆ．ａｎｄＨｏｗｏｒｋａ，Ｓ．Ｌｉｐｉｄ－ｂｉｌａｙｅｒ－ｓｐａｎｎｉｎｇＤＮＡｎａｎｏｐｏｒｅｓｗｉｔｈａｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｏｒｐｈｙｒｉｎａｎｃｈｏｒ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ－Ｉｎｔ．Ｅｄ．５２，１２０６９－１２０７２（２０１３）Ｓｐｒｕｉｊｔ，Ｅ．，Ｔｕｓｋ，Ｓ．Ｅ．＆Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．ＤＮＡｓｃａｆｆｏｌｄｓｓｕｐｐｏｒｔｓｔａｂｌｅａｎｄｕｎｉｆｏｒｍｐｅｐｔｉｄｅｎａｎｏｐｏｒｅｓ．Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３，７３９－７４５（２０１８）Ｗｅｉ，Ｂ．，Ｄａｉ，Ｍ．＆Ｙｉｎ，Ｐ．Ｃｏｍｐｌｅｘｓｈａｐｅｓｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄｆｒｏｍｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｔｉｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ４８５，６２３－６２６（２０１２）Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｊ．Ｓ．，Ｇｌｏｗａｃｋｉ，Ｊ．，Ｇｒａｎｄｃｈａｍｐ，Ａ．Ｅ．，Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｒ．Ｓ．＆Ｍａｄｄｏｃｋｓ，Ｊ．Ｈ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅｌｅｎｇｔｈｓｏｆＤＮＡ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．ＴｈｅｏｒｙＣｏｍｐｕｔ．１３，１５３９－１５５５（２０１７）Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｇ．Ｓ．ＴｈｅｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅｌｅｎｇｔｈｏｆＤＮＡｉｓｒｅａｃｈｅｄｆｒｏｍｔｈｅｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅｌｅｎｇｔｈｏｆｉｔｓｎｕｌｌｉｓｏｍｅｒｔｈｒｏｕｇｈａｎｉｎｔｅｒｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇｆｏｒｃｅ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．９１，３６０７－３６１６（２００６）Ｙｕｓｕｐｏｖ，Ｍ．Ｍ．，Ｙｕｓｕｐｏｖａ，Ｇ．Ｚ．，Ｂａｕｃｏｍ，Ａ．，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｋ．，Ｅａｒｎｅｓｔ，Ｔ．Ｎ．，Ｃａｔｅ，Ｊ．Ｈ．Ｄ．，＆Ｎｏｌｌｅｒ，Ｈ．Ｆ．Ｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍｅａｔ５．５Å ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２９２，８８３－８９６（２００１）Ｍｉｓｈｒａ，Ｒ．，Ｕｐａｄｈｙａｙ，Ａ．，Ｐｒａｊａｐａｔｉ，Ｖ．Ｋ．＆Ｍｉｓｈｒａ，Ａ．Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｏｓｔａｓｉｓ：Ｎｏｖｅｌｍｅｄｉｃｉｎａｌａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．３８，１９１６－１９７３（２０１８）Ｂｅｃｋｅｒ，Ｓ．Ｈ．，＆Ｄａｒｗｉｎ，Ｋ．Ｈ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｎｓｉｇｈｔｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．８１，１－２０（２０１７）Ｌｏｅｗｅ，Ｊ．ｅｔａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅ２０ＳｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｆｒｏｍｔｈｅａｒｃｈａｅｏｎＴ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍａｔ３．４Å ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６８，５３３－５３９（１９９５）Ｆｏｅｒｓｔｅｒ，Ａ．＆Ｈｉｌｌ，Ｃ．Ｐ．ＰｒｏｔｅａｓｏｍｅＡｃｔｉｖａｔｏｒｓ．ＰｒｏｔｅｉｎＤｅｇｒａｄ．２，８９－１１０（２００７）Ｈｕｂｅｒ，Ｅ．Ｍ．＆Ｇｒｏｌｌ，Ｍ．ＴｈｅＭａｍｍａｌｉａｎＰｒｏｔｅａｓｏｍｅＡｃｔｉｖａｔｏｒＰＡ２８ＦｏｒｍｓａｎＡｓｙｍｍｅｔｒｉｃ α４β３Ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２５，１４７３－１４８０（２０１７）Ｊｉａｎｇ，Ｊ．，Ｐｅｎｔｅｌｕｔｅ，Ｂ．Ｌ．，Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｒ．Ｊ．＆ＨｏｎｇＺｈｏｕ，Ｚ．Ａｔｏｍｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｎｔｈｒａｘｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｎｔｉｇｅｎｐｏｒｅｅｌｕｃｉｄａｔｅｓｔｏｘｉｎｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ５２１，５４５－５４９（２０１５）Ｍａｇｌｉａ，Ｇ．，Ｒｅｓｔｒｅｐｏ，Ｍ．Ｒ．，Ｍｉｋｈａｉｌｏｖａ，Ｅ．＆Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．ＥｎｈａｎｃｅｄｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｏｆｓｉｎｇｌｅＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌｅｓｔｈｒｏｕｇｈ α－ｈｅｍｏｌｙｓｉｎｎａｎｏｐｏｒｅｓｂｙｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｎａｌｃｈａｒｇｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５，１９７２０－１９７２５（２００８）Ｃｈｅｎ，Ｂ．，Ｓｙｓｏｅｖａ，Ｔ．Ａ．，Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｓ．，Ｇｕｏ，Ｌ．，ＤｅＣａｒｌｏ，Ｓ．，Ｈａｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｙａｎｇ，Ｈ．ａｎｄＮｉｘｏｎ，Ｂ．Ｔ．，２０１０．ＥｎｇａｇｅｍｅｎｔｏｆａｒｇｉｎｉｎｅｆｉｎｇｅｒｔｏＡＴＰｔｒｉｇｇｅｒｓｌａｒｇｅｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｃｈａｎｇｅｓｉｎＮｔｒＣ１ＡＡＡ＋ＡＴＰａｓｅｆｏｒｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｌＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ１８，１４２０－１４３０（２０１０）Ｓｔｏｄｄａｒｔ，Ｄ．，Ａｙｕｂ，Ｍ．，Ｈｏｅｆｌｅｒ，Ｌ．，Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｐ．，Ｋｌｉｎｇｅｌｈｏｅｆｅｒ，Ｊ．Ｗ．，Ｍａｇｌｉａ，Ｇ．，Ｈｅｒｏｎ，Ａ．ａｎｄＢａｙｌｅｙ，Ｈ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｔｒｕｎｃａｔｅｄｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｒｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，２４２５－２４３０（２０１４）Ｐｉｇｕｅｔ，Ｆ．，Ｏｕｌｄａｌｉ，Ｈ．，Ｐａｓｔｏｒｉｚａ－Ｇａｌｌｅｇｏ，Ｍ．，Ｍａｎｉｖｅｔ，Ｐ．，Ｐｅｌｔａ，Ｊ．，＆Ｏｕｋｈａｌｅｄ，Ａ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｉｎｇｌｅａｍｉｎｏａｃｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｕｎｉｆｏｒｍｌｙｃｈａｒｇｅｄｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃｐｅｐｔｉｄｅｓｗｉｔｈａｅｒｏｌｙｓｉｎｎａｎｏｐｏｒｅ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．９，９６６（２０１８）Ｇｕ，Ｌ．Ｑ．，Ｂｒａｈａ，Ｏ．，Ｃｏｎｌａｎ，Ｓ．，Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．＆Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃｓｅｎｓｉｎｇｏｆｏｒｇａｎｉｃａｎａｌｙｔｅｓｂｙａｐｏｒｅ－ｆｏｒｍｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｍｏｌｅｃｕｌａｒａｄａｐｔｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ３９８，６８６－６９０（１９９９）Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｍ．，Ｓａｈａｓｈｉ，Ｈ．，Ｋｕｒｉｍｏｔｏ，Ｅ．，Ｔａｋａｔａ，Ｓ．Ｉ．，Ｙａｇｉ，Ｈ．，Ｋａｎａｉ，Ｋ．，Ｓａｋａｔａ，Ｅ．，Ｍｉｎａｍｉ，Ｙ．，Ｔａｎａｋａ，Ｋ．ａｎｄＫａｔｏ，Ｋ．Ｓｐａｔｉａｌａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｏｌｅｏｆ α ｓｕｂｕｎｉｔｓｏｆｐｒｏｔｅａｓｏｍｅａｃｔｉｖａｔｏｒＰＡ２８ｉｎｈｅｔｅｒｏ－ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃｆｏｒｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４３２，１４１－１４５（２０１３）Ｋｕｅｈｎ，Ｌ．＆Ｄａｈｌｍａｎｎ，Ｂ．ＰｒｏｔｅａｓｏｍｅａｃｔｉｖａｔｏｒＰＡ２８ａｎｄｉｔｓｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈ２０Ｓｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３２９，８７－９６（１９９６）Ｆｏｅｒｓｔｅｒ，Ａ．，Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｅ．Ｉ．，Ｗｈｉｔｂｙ，Ｆ．Ｇ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．＆Ｈｉｌｌ，Ｃ．Ｐ．Ｔｈｅ１．９Å ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ－１１Ｓａｃｔｉｖａｔｏｒｃｏｍｐｌｅｘａｎｄｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ－ＰＡＮ／ＰＡ７００ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ１８，５８９－５９９（２００５）Ｂｅｎａｒｏｕｄｊ，Ｎ．，Ｚｗｉｃｋｌ，Ｐ．，Ｓｅｅｍｕｅｌｌｅｒ，Ｅ．，Ｂａｕｍｅｉｓｔｅｒ，Ｗ．＆Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ａ．Ｌ．ＡＴＰｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｂｙｔｈｅｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｃｏｍｐｌｅｘＰＡＮｓｅｒｖｅｓｍｕｌｔｉｐｌｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ１１，６９－７８（２００３）Ｈｕａｎｇ，Ｒ．，Ｒｉｐｓｔｅｉｎ，Ｚ．Ａ．，Ａｕｇｕｓｔｙｎｉａｋ，Ｒ．，Ｌａｚｎｉｅｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｇｉｎａｌｓｋｉ，Ｋ．，Ｋａｙ，Ｌ．Ｅ．ａｎｄＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．ＵｎｆｏｌｄｉｎｇｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔｈｅＡＡＡ＋ｕｎｆｏｌｄａｓｅＶＡＴｂｙａｃｏｍｂｉｎｅｄｃｒｙｏ－ＥＭ，ｓｏｌｕｔｉｏｎＮＭＲｓｔｕｄｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１３，Ｅ４０９０－Ｗ４１９９（２０１６）Ｓｅｅｍｕｌｌｅｒ，Ｅ．，Ｌｕｐａｓ，Ａ．，Ｓｔｏｃｋ，Ｄ．，Ｌｏｗｅ，Ｊ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．ａｎｄＢａｕｍｅｉｓｔｅｒ，Ｗ．ＰｒｏｔｅａｓｏｍｅｆｒｏｍＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ：ＡＴｈｒｅｏｎｉｎｅＰｒｏｔｅａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８，５７９－５８２（２０１６）Ｋｉｍ，Ｙ．Ｉ．，Ｂｕｒｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｂｕｒｔｏｎ，Ｂ．Ｍ．，Ｓａｕｅｒ，Ｒ．Ｔ．＆Ｂａｋｅｒ，Ｔ．Ａ．ＤｙｎａｍｉｃｓｏｆｓｕｂｓｔｒａｔｅｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｂｙｔｈｅＣｌｐＸＰｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｍａｃｈｉｎｅ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ５，６３９－６４８（２０００）Ａｋｏｐｉａｎ，Ｔ．Ｎ．，Ｋｉｓｓｅｌｅｖ，Ａ．Ｆ．＆Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ａ．Ｌ．ＰｒｏｃｅｓｓｉｖｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｏｔｈｅｒｃａｔａｌｙｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｆｒｏｍＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１７９１－１７９８（１９９７）Ｈｕａｎｇ，Ｇ．，Ｖｏｅｔ，Ａ．＆Ｍａｇｌｉａ，Ｇ．ＦｒａＣｎａｎｏｐｏｒｅｓｗｉｔｈａｄｊｕｓｔａｂｌｅｄｉａｍｅｔｅｒｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｍａｓｓｏｆｏｐｐｏｓｉｔｅ－ｃｈａｒｇｅｐｅｐｔｉｄｅｓｗｉｔｈ４４ｄａｌｔｏｎｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０，１－１０（２０１９）Ｋｉｓｓｅｌｅｖ，Ａ．Ｆ．，Ｓｏｎｇｙａｎｇ，Ｚ．＆Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ａ．Ｌ．Ｗｈｙｄｏｅｓｔｈｒｅｏｎｉｎｅ，ａｎｄｎｏｔｓｅｒｉｎｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｓｔｈｅａｃｔｉｖｅｓｉｔｅｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｉｎｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓ？Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１４８３１－１４８３７（２０００）Ｈｕｂｅｒ，Ｅ．Ｍ．，Ｈｅｉｎｅｍｅｙｅｒ，Ｗ．，Ｌｉ，Ｘ．，Ａｒｅｎｄｔ，Ｃ．Ｓ．，Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，Ｍ．ａｎｄＧｒｏｌｌ，Ｍ．Ａｕｎｉｆｉｅｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｆｏｒｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓａｎｄａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｎｔｈｅ２０Ｓｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７，１－１０（２０１６）Ｒｉｐｓｔｅｉｎ，Ｚ．Ａ．，Ｈｕａｎｇ，Ｒ．，Ａｕｇｕｓｔｙｎｉａｋ，Ｒ．，Ｋａｙ，Ｌ．Ｅ．＆Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａＡＡＡ＋ｕｎｆｏｌｄａｓｅｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｕｎｆｏｌｄｉｎｇｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ｅｌｉｆｅ６，１－１４（２０１７）Ｍｉｌｅｓ，Ｇ．，Ｃｈｅｌｅｙ，Ｓ．，Ｂｒａｈａ，Ｏ．＆Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．Ｔｈｅｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎｂｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔｔｏｘｉｎｆｏｒｍｓｌａｒｇｅｉｏｎｉｃｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４０，８５１４－８５２２（２００１）Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．＆Ｐｅａｓｅ，Ｌ．Ｒ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｈｙｂｒｉｄｇｅｎｅｓｗｉｔｈｏｕｔｔｈｅｕｓｅｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓ：ｇｅｎｅｓｐｌｉｃｉｎｇｂｙｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎ．Ｇｅｎｅ７７，６１－６８（１９８９）Ｌｉｕ，Ｈ．＆Ｎａｉｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｈ．Ａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｎｅ－ｓｔｅｐｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｄｅｌｅｔｉｏｎ，ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ，ｓｉｎｇｌｅａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｓｉｔｅｐｌａｓｍｉｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｐｒｏｔｏｃｏｌ．ＢＭＣＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８，９１（２００８）Ｍａｇｌｉａ，Ｇ．，Ｈｅｒｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ｓｔｏｄｄａｒｔ，Ｄ．，Ｊａｐｒｕｎｇ，Ｄ．＆Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｍｏｌｅｃｕｌｅｓｗｉｔｈｐｒｏｔｅｉｎｎａｎｏｐｏｒｅｓ．ＩｎＭｅｔｈｏｄｓｉｎｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ４７５，５９１－６２３（２０１０）Ｎｉｖａｌａｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３Ｍａｒ；３１（３）：４７－２５０ＢＢＡ，Ｖｏｌ．１８５８，Ｉｓｓｕｅ３，２０１６，Ｐａｇｅｓ４４６－４５６Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．ＮａｔＣｏｍｍｕｎ，１０：２９００－２９００，２０１９Ｄｏｎｇｅｔａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ４４４：２２６Ｈｕｂｅｒｅｔａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０１７Ｏｃｔ３；２５（１０）：１４７３－１４８０Ｍａｅｔａｌ．（２００５）Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｔｒｙｐｓｉｎａｎｄｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ：ｌｏｏｐ－ｍｏｔｉｏｎ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｄｙｎａｍｉｃｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｓａｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ．ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＪ．８９（２），１１８３－１１９３Ｄｏｕｇａｎｅｔａｌ．ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ５２９（２００２）１８７３－３４６８Ｓａｕｅｒｅｔａｌ．，２００４Ｆｏｒｏｕｚａｎ，Ｄａｒａ，ｅｔａｌ． "ＴｈｅａｒｃｈａｅａｌｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｉｓｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙａｎｅｔｗｏｒｋｏｆＡＡＡＡＴＰａｓｅｓ．" Ｊ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２８７．４６（２０１２）：３９２５４－３９２６２Ｓｅｒｅｋ－Ｈｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｊｕｓｔｙｎａ，ｅｔａｌ． "Ｔｗｏｕｎｉｑｕｅｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄＡＡＡｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ．"（２００９）：１１８－１２２Ｈｕｍｂａｒｄ，ＭａｔｔｈｅｗＡ．，ｅｔａｌ． "Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅｓｍａｌｌａｒｃｈａｅａｌｍｏｄｉｆｉｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＳＡＭＰｓ）ｉｎＨａｌｏｆｅｒａｘｖｏｌｃａｎｉｉ．"Ｎａｔｕｒｅ４６３．７２７７（２０１０）：５４Ｗａｎｇｅｔａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ９１：４４７－４５６

したがって、本発明者らは、（マルチタンパク質センサー複合体の一部として）タンパク質を展開し、ナノポアを横切るそれらの進行性および一方向の通過を制御し、イオン電流によってタンパク質を認識することができる、新しいタンパク質ベースのナノポアを設計し、立案することを目的とした。

驚くべきことに、ナノポアの真上にプロテアーゼを導入すると、ペプチドが、放出されるとすぐに、捕捉および読み取られ、それによって、溶液中のタンパク質を配列決定するために有利に使用される人工ナノポアが提供されることが示された。より具体的には、本発明者らは、サーモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）からの２０Ｓプロテアソームに、気密に接続された、安定で低ノイズのβバレルナノポアを設計し、製造した。後者は、高塩分、高温、低ｐＨなどのさまざまな条件でポリペプチドを分解するマルチサブユニットプロテアーゼである。驚くべきことに、人工ナノポアを含むマルチタンパク質集合は、アンフォールダーゼの結合を可能にし、ナノポア信号に影響を与えることなく、選択されたタンパク質を線形化してプロテアソームチャンバーに供給した。切断および読み込みモードでは、展開されたポリペプチドは最初にプロテアソームによって分解され、次にイオン電流によって認識された。通過および読み込みモードでは、アンフォールダーゼは、無傷の基質を、不活性化されたプロテアソームを横断し、ナノポアの中を通って通過した。次に、線形化された基質は、ナノポア電流の特異的制御によって認識される。この統合された分子センサーには、例えば、ＤＮＡまたはタンパク質の配列決定および同定において多くの用途がある。

したがって、本発明は、タンパク質性サブユニットの集合を含む人工ナノポアを提供し、各サブユニットは以下を含む：
（ｉｉ）集合のＴＭ領域を横切るポリペプチドまたはポリヌクレオチドの輸送を制御することができる環形成タンパク質のサブユニットの、（ｉ）アミノ酸配列に融合したβバレルまたはαヘリカルポア形成タンパク質の、膜貫通（ＴＭ）アミノ酸配列。

そのようなナノポアは、核酸処理酵素に共有結合したアルファ溶血素からなるナノポアを開示している特許文献２に係る酵素ポア構築物とは異なる。具体的に開示されている核酸処理酵素はエキソヌクレアーゼである。しかしながら、本発明に係る、膜貫通領域を環状タンパク質に付加するのではなく、特許文献２は、ナノポア全体と環状タンパク質との融合を記載している。

（ＴＭ領域）
本明細書で提供される人工ナノポアは、ポア形成タンパク質のＴＭ領域を含む。このＴＭ領域は、各サブユニット中に存在する複数のＴＭ配列の集合によって形成され、これらが一緒になって機能的人工ナノポアを形成する。典型的には、ＴＭ配列は、膜タンパク質およびポア形成毒素の天然の膜貫通領域で観察されるように、疎水性および親水性とグリシン残基との交代を反映している。ポア形成タンパク質（ＰＦＰ）は通常、細菌によって産生され、多くのタンパク質外毒素（ＰＦＴ、ポア形成毒素としても知られている）を含むが、ミミズによって産生される、リセニンなどの他の生物によって産生される可能性もある。それらは、標的細胞の膜に無秩序なポアを作るので、しばしば細胞毒性である（すなわち、それらは細胞を殺す）。膜構成要素の二次構造に応じて、ＰＦＰは、両親媒性ヘリックスの環を使用してポアを構築するα－ＰＦＰ、またはβバレルを使用して膜を通過するβ－ＰＦＰに分類され得る。

一実施形態では、人工ナノポアは、α－ヘリカルポア形成タンパク質のＴＭ領域を含む。アルファ－ポア－形成毒素は、当技術分野でよく知られており、ヘモリシンＥファミリー、アクチノポリン、コリネバクテリアポリンＢ、大腸菌のシトリシンＡ（ＣｌｙＡ）が含まれる。好ましくは、ＦｒａＣ、ＣｌｙＡ、ＡｈｌＢまたはＷｚａ（大腸菌莢膜多糖のためのトランスロコン）のＴＭ領域が使用される。

一態様では、アクチノポリンまたはアクチノポリン様タンパク質のＴＭ配列が使用される。アクチノポリン（ＡＰ）は、イソギンチャクからのポア形成毒素である（Ｒｏｊｋｏらによるレビュー（非特許文献３８）を参照）。ＡＰは、二面にα－ヘリックスが隣接するβ－サンドイッチで構成されている。ポアは、α－ヘリックスのクラスターによって形成される。ＡＰは約４０種類のイソギンチャク中に見いだされる。これまで、最も特徴的なＡＰは、イソギンチャクのアクチニア・エクイナ（Ａｃｔｉｎｉａｅｑｕｉｎａ）からのエクイナトキシンＩＩ（ｅｑｕｉｎａｔｏｘｉｎＩＩ）（ＥｑｔＩＩ）、スチコダクチラ・ヘリアンサス（Ｓｔｉｃｈｏｄａｃｔｙｌａｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）からのスチコリシンＩおよびＩＩ（ｓｔｉｃｈｏｌｙｓｉｎＩａｎｄＩＩ）（ＳｔｎＩおよびＳｔｎＩＩ）およびアクチナ・フラガセア（Ａｃｔｉｎｉａｆｒａｇａｃｅａ）からのフラガセアトキシンＣ（ｆｒａｇａｃｅａｔｏｘｉｎＣ）（ＦｒａＣ）である。一態様では、ＦｒａＣのＴＭ配列が使用され、これは、配列ＳＡＤＶＡＧＡＶＩＤＧＡＧＬＧＦＤＶＬＫＴＶＬＥＡＬＧＮからなる。

別の好ましい実施形態では、ＣｌｙＡ（サイトリシンＡ（ｃｙｔｏｌｙｓｉｎＡ））タンパク質ファミリーのメンバーのアルファ－ヘリカルＴＭ配列が使用される（ＰＤＢ：２ＷＣＤ（ｃｌｙａ）および６ＧＹ６（ＸａｘＡＢ））。

例えば、ＴＭ配列は、ＱＤＬＤＥＶＤＡＧＳＭＴＥＩＶＡＤＫＴＶＥＶＶＫＮＡＩＥＴＡＤＧＡＬＤＬＹＮＫＹＬＤＱＶ（ＣｌｙＡ）、ＦＴＧＡＩＧＧＩＩＡＭＡＩＴＧＧＩＦ（ＹａｘＡ）、またはＬＶＤＡＦＫＤＬＩＰＴＧＥＮＬＳＥＬＤＬＡＫＰＥＩＥＬＬＫＱＳＬＥＩＴＫＫＬＬＧＱＦ（ＹａｘＢ）である。

さらに別の好ましい実施形態では、ＡｈｌＢ：アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）の十量体ポアの、アルファ－ヘリカルＴＭ配列が使用される（ＰＤＢ：６ＧＲＪ；非特許文献３９）。

さらに別の態様では、大腸菌中の莢膜多糖の放出（ｅｘｐｏｒｔｉｎｇ）に関与する一体型外膜タンパク質であるワザ（Ｗｚａ）のＴＭ配列ＡＰＬＶＲＷＮＲＶＩＳＱＬＶＰＴＩＳＧＶＨＤＭＴＥＴＶＲＹＩＫＲＷＰＮ（ＰＤＢ：２Ｊ５８；非特許文献４０）が使用される。

あるいは、人工ナノポアは、β－バレルポア形成タンパク質またはβ－ＰＦＰのＴＭ領域を含み、それらは主にβ－ストランドベースのドメインで構成されているため、そのように名付けられている。それらは異なる配列を有し、Ｐｆａｍにより、ロイコシジン、Ｅｔｘ－Ｍｔｘ２、トキシン－１０、およびエーゲロリシン（ａｅｇｅｒｏｌｙｓｉｎ）を含むいくつかのファミリーに分類される。Ｘ線結晶構造はいくつかの共通点：α－溶血素とパントン－バレンタインロイコシジンＳは構造的に関連している、を明らかにした。同様に、アエロリジンとクロストリジウムイプシロン－毒素およびＭｔｘ２は、Ｅｔｘ／Ｍｔｘ２ファミリーで結び付けられている。好ましい実施形態において、本発明のナノポアは、α－溶血素、アエロリジンまたは炭疽菌防御抗原（ＰＡ）のＴＭ領域を含む。特定の態様では、ＴＭ配列は、アミノ酸配列ＶＨＧＮＡＥＶＨＡＳＦＦＤＩＧＧＳＶＳＡＧＦを含むか、またはそれからなる。

（環－形成タンパク質）
本明細書で提供される人工ナノポアは、ナノポアのＴＭ領域を横切る、ポリマー、例えばポリペプチドまたはＤＮＡ分子、の輸送を制御することができる環－形成タンパク質によって、とりわけ特徴付けられる。例えば、それは、２０Ｓプロテアソームのアルファ環に結合できる、環状またはドーナツ－形のマルチ－サブユニットタンパク質である。一実施形態では、それは、八量体、七量体または六量体タンパク質などの環－形成多量体タンパク質である。一態様では、環－形成多量体タンパク質の化学量論は、ＴＭ配列の由来であるポア形成タンパク質の化学量論と同じである。例えば、炭疽菌防御抗原のＴＭ領域は、七量体環を形成する輸送タンパク質と適切に組み合わされる。他方、多くのナノポアは異なる化学量論で集合することができるので、化学量論が一致することは必須ではない。例えば、本発明のナノポアは、七量体である可溶性タンパク質に基づくこともでき、ここで膜貫通部分は六量体、八量体、九量体または十量体に由来する。

一実施形態では、環－形成タンパク質は、ＴＭ領域を横切るポリヌクレオチドの輸送を制御するまたは制御することができる七量体タンパク質である。適切な七量体タンパク質には、以下の固有の受入または識別コードコード：１ｇ３１、１ｈ６４，１ｈｘ５、１ｉ４ｋ、１ｉ５ｌ、１ｉ８ｆ、１ｉ８１、１ｉｏｋ、１ｊ２ｐ、１ｊｒｉ、１ｌｅｐ、１ｌｎｘ、１ｌｏｊ、１ｍｇｑ、１ｎ９ｓ、１ｎｙ６、１ｐ３ｈ、１ｔｚｏ、１ｗｎｒ、１ｘｃｋ、２ｃｂ４、２ｃｂｙ、２ｙｆ２、３ｂｐｄ、３ｃｆ０、３ｊ８３、３ｋｔｊ、３ｍ０ｅ、３ｓｔ９、４ｂ０ｆ、４ｅｍｇ、４ｇｍ２、４ｈｎｋ、４ｈｗ９、４ｊｃｑ、４ｋｉ８、４ｏｗｋ、４ｑｈｓ、４ｘｑ３、５ｊｚｈ、５ｍｓｊ、５ｍｓｋ、５ｍｘ５および５ｕｗ８ｅ、の１つでタンパク質データバンク（ＰＤＢ）に提出されたものが含まれる。

良好な結果は、七量体ＡＴＰアーゼタンパク質、好ましくはＡ．アエオリカス（Ａ．ａｅｏｌｉｃｕｓ）ＡＴＰアーゼまたはその相同体または機能的同等物を使用して得ることができる。例えば、炭疽菌防御抗原のＴＭ配列は、分子モーターとして機能してＤＮＡの融解とオープンコンプレックスの安定化を可能にするアクウィフェクス・アエオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ）ＡＴＰアーゼのモノマーに（挿入置換によって）融合された（図９）。

別の実施形態において、環－形成多量体タンパク質は、ＴＭ領域を横切るポリペプチドの輸送を制御する、または制御することができる七量体タンパク質である。非常に良好な結果は、七量体哺乳動物プロテアソーム活性化因子ＰＡ２８のサブユニットまたはその相同体または機能的同等物で得られる（実施例１－５を参照）。七量体プロテアソーム活性化因子（ＰＡ）２８αβは、２０Ｓプロテアソームコア粒子（ＣＰ）に結合することにより、クラスＩ抗原処理を調節することが知られている（非特許文献４１を参照）。一態様では、ＰＡ２８アルファサブユニットまたはその相同体が使用される（実施例１－４を参照）。別の実施形態では、ＰＡ２８ベータサブユニットまたはその相同体が使用される。さらに別の実施形態では、ＰＡ２８ガンマサブユニットまたはその相同体が使用される。

ＰＡ２８相同体は、当技術分野から得られる。プロテアソーム結合（活性化ループおよびＣ末端）に関与するマウスＰＡ２８配列の配置は、１４３－１４９および２４１－２４９の領域中に重要な配列を明らかにした。相同配列は、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉ）由来のＰＡ２６サブユニットなどの他の配列中に見出すことができる（ＰＡ２６：非特許文献２３を参照）。特定の態様では、本発明は、人工ＰＡ２６－ナノポアを提供する（実施例５を参照）。

本発明に係る人工ナノポアは、ポアを横切る基質（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）の転移を制御する環形成タンパク質によって表される水溶性部分に融合された、膜貫通のポア形成領域によって表される疎水性部分を含むと見なすことができる。そのために、βバレルまたはαヘリカルポア形成タンパク質のＴＭアミノ酸配列は、（ｉｉ）集合のＴＭ領域を横切るポリペプチドまたはポリヌクレオチドの輸送を制御することができる環形成多量体タンパク質のサブユニットのアミノ酸配列に融合される。２つの部分の間の「融合界面」に存在するアミノ酸は、疎水性膜および膜を水和状態に保つ親水性層（例：リン脂質のリン酸基）と接触しており、挿入効率とナノポアの安定性に関連していると考えられる。一実施形態では、ＴＭ配列は、環形成多量体タンパク質のサブユニットにＮ－またはＣ－末端で融合されている。別の実施形態では、ＴＭ配列は、環形成タンパク質のサブユニットの配列内に挿入される。場合によっては、１つまたは複数の残基を、ナノポア形成を最適化するために、環形成多量体タンパク質のサブユニットの天然配列から除去することが望ましい。したがって、本明細書で使用されるように、「β－バレルまたはα－ヘリカルポア形成タンパク質のＴＭ配列が、環形成（多量体）タンパク質のサブユニットのアミノ酸配列と融合された」という表現には、（ｉ）環形成タンパク質サブユニットの（任意に先端を切り取った）Ｎ－またはＣ－末端のどちらかへのＴＭ配列の遺伝子融合、（ｉｉ）環形成タンパク質サブユニットの配列内へのＴＭ配列の挿入、および（ｉｉｉ）環形成タンパク質サブユニットの配列の削除を伴うＴＭ配列の挿入が含まれる。後者の場合、削除された配列のサイズは、挿入されたＴＭ配列のサイズよりも小さく、大きく、または同一にすることができる。３つの場合すべてにおいて、ＴＭ配列は、柔軟なリンカーが融合部位に隣接し得る。

ＴＭ配列の挿入、置換または付加の部位は、使用されるタンパク質に応じて変化し得るが、それは通常、脂質二重層に垂直に、かつ新しく形成された人工ナノポアの開口部に平行に位置する環形成タンパク質のループを置き換えることによって作られる。ループは、数個から数十個のアミノ酸の長さにすることができる。通常、削除されるループは、１つまたは複数の不調な領域を含む。一態様では、挿入は、環形成タンパク質の長く伸びたアミノ酸を置換（交換）することを伴う。例えば、非常に良好な結果は、ＴＭ配列がＡＰ２８サブユニットに、ＡＰ２８のアミノ酸残基６３－１００によって表される、いわゆる「不調領域」を置き換えながら、挿入される場合に達成されうる。別の例として、ＴＭ配列は、Ａ．エオリカス（Ａ．ｅｏｌｉｃｕｓ）のＡＴＰアーゼのサブユニットに、ＡＴＰアーゼサブユニットの長く伸びた９つのアミノ酸残基を置き換えながら、挿入される。

あるいは、環形成タンパク質のＮ－またはＣ－末端は、膜貫通領域を形成するＴＭ配列によって置換または伸長され得る。

（柔軟リンカー）
最適な機能（膜挿入、二重層安定性など）を可能にするために、挿入されたＴＭ配列は、少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸、例えば５－２０個のアミノ酸、の柔軟な親水性リンカーによって、Ｎ－および／またはＣ－末端側で（必須ではないが）隣接しうる。本明細書で使用される場合、用語「親水性」は、その側鎖が膜（リン）脂質の荷電した頭部基と相互作用しうるアミノ酸を指す。例えば、親水性残基には、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジンおよびアルギニンが含まれる。自然界に見られる多くの例では、両親媒性－疎水性残基（チロシン、トリプトファンおよびヒスチジン）は、タンパク質と脂質二重層の間の相互作用を媒介し、従って、これらも使用されうる。

一実施形態では、柔軟親水性リンカーのアミノ酸の少なくとも５０％は、Ｓｅｒおよび／またはＴｈｒ残基である。場合により、アミノ酸の少なくとも５０％はＳｅｒ残基である。ＴＭスパニング領域のＣ－およびＮ－末端側で隣接する柔軟リンカーは、同じまたは異なる（例えば、逆にされた）配列を有することができる。例えば、Ｎ－末端リンカーは、配列ＧＳＳを含み、またはそれからなり、一方、Ｃ－末端リンカーは、配列ＳＳＧからなる。

本発明は、トロイダル構造を有するタンパク質を脂質二重層に挿入するための一般的な方法を提供する。ナノポアの電気的特性に対するリンカーの化学組成の影響を研究するために、いくつかの異なる親水性アミノ酸をスクリーニングした。Ｎ－末端側（β１）およびＣ－末端側（β２）のリンカーの長さは５残基に固定されたままだった。β１はほとんどの突然変異を許容するように見えた。対照的に、β２へのわずかな変化でさえ、両電位での電気的記録のノイズを増加させた（データ不示）。しかし、興味深いことに、両方のリンカーの５つのアミノ酸すべてがセリンに置換された構造は、高い安定性を示し、均一単位電流とともにナノポアを形成した。

（プロテアソーム・アルファ－サブユニットへの融合）
単分子タンパク質分析用の本発明の人工ナノポアの応用を可能にするために、それは、２０Ｓプロテアソーム、特にそのアルファ－サブユニットに、気密に（すなわち、遺伝子融合によって）有利に接続される。有利なことに、サーモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）由来のＳ２０プロテアソームが使用され、これは、生理学的条件および極端な条件（高塩分、高温、および低ｐＨ）でポリペプチドを分解するマルチ－サブユニットプロテアーゼである。

一実施形態では、本発明は、上記のような人工ナノポアを提供し、ここで、（挿入置換によって）隣接するＴＭ配列を含む環形成（多量体）タンパク質のサブユニットのＣ－末端は、プロテアソームαサブユニットのＮ末端に遺伝的に融合している。好ましくは、それは、プロテアソームゲートがナノポアに向かって開いたままであるように、Ｎ－末端の先端が切断されたプロテアソームα－サブユニットに融合される。一実施形態では、プロテアソームα－サブユニットは少なくとも１５個のＮ－末端アミノ酸（例えば、残基１－１５、１－１７、１－１９、１－２０、１－２１、１－２２または１－２５）を欠いている。好ましくは、少なくとも２０個のＮ－末端残基が除去される（αΔ２０）。例えば、隣接するＴＭ領域を含む環形成多量体タンパク質のＣ－末端は、プロテアソームα－サブユニットの残基Ｌ２１に遺伝的に融合している。プロテアソーム機能を守るため、約３０残基を超える欠失は推奨されない。

特定の態様では、本発明は、人工ナノポアを提供し、ここで、炭疽菌保護抗原（ＰＡ）の、隣接するＴＭ領域を含むＰＡ２８のＣ－末端は、プロテアソームα－サブユニット、好ましくはαΔ２０、より好ましくはＴ．アシドフィルムαΔ２０、のＮ－末端に遺伝的に融合している。

（Ｃｌｐプロテアーゼ－サブユニットへの融合）
別の実施形態において、単分子タンパク質分析用の本発明の人工ナノポアの応用を可能にするために、それは、Ｃｌｐプロテアーゼ（ＣｌｐＰ）ファミリーのメンバーに気密に（すなわち、遺伝子融合によって）有利に接続される。

Ｃｌｐプロテアーゼファミリーは、ＭＥＲＯＰＳペプチダーゼファミリーＳ１４（ＣｌｐＰエンドペプチダーゼファミリー、ＳＫ族）に属するセリンペプチダーゼを含む。ＣｌｐＰは、カゼインおよびアルブミンなどの多くのタンパク質を切断する、ＡＴＰ－依存性プロテアーゼである。ＡＴＰ－結合制御Ａのヘテロ二量体および触媒Ｐサブユニットとして存在し、これらは両方とも、ＡＴＰ存在下でのプロテアーゼ活性の有効レベルに必要であるが、Ｐサブユニット単独で、いくらかの触媒活性を有する。

ＣｌｐＰに非常に類似したプロテアーゼは、細菌、後生動物、いくつかのウイルスのゲノム中、および植物の葉緑体中にコードされていることが見出されている。このファミリーの多くのタンパク質は、ペプチダーゼ活性がないか、触媒活性に必須であると考えられているアミノ酸残基がないことが実験的にわかっているので、非ペプチダーゼ相同体として分類される。

以下に示されるように、ＴＭ配列を含む環形成多量体タンパク質のサブユニットのＮ－末端が、Ｃｌｐプロテアーゼ（ＣｌｐＰ）サブユニットのＣ－末端に遺伝的に融合された場合、単タンパク質分析が可能な人工ナノポアが得られた。より具体的には、本発明は、上記のような人工ＰＡ２８ナノポアに基づく人工ナノポアを提供し、ここで、ＣｌｐＰのサブユニット（ＰＤＢＩＤ：１ＴＹＦ）は、ＰＡ２８－ナノポアのＮ－末端で融合される（実施例７参照）。

（マルチ－タンパク質ナノポアセンサー集合／複合体）
さらなる態様は、２０Ｓプロテアソームの構成要素を含む安定なマルチ－タンパク質集合またはサブ複合体に関するものであり、このサブ複合体は、人工膜貫通プロテアソームとして機能することができる。サーモプラズマ・アシドフィルム由来の２０Ｓプロテアソームは、１４個のαおよび１４個のβサブユニットから構成される４つの積み重ねられたリングからなる円筒形の構造を有する（図１ｅ）（非特許文献１２）。２つの隣接する外側のα－環は、２０Ｓプロテアソームといくつかの制御複合体との会合を可能にし（非特許文献１３）、当該複合体の例は、触媒空洞の中への基質の転移を制御するプロテアソーム活性化因子ＰＡ２８（図１ａ）である（非特許文献１４）。

一実施形態では、本発明は、（ｉ）上記の人工ナノポアと共に、（ｉｉ）プロテアソームα－サブユニットから構成される環、および任意に（ｉｉｉ）プロテアソームβ－サブユニットから構成される環、を含み、ここで、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、別個のタンパク質性成分として存在する、すなわち、融合されていないか、さもなければナノポアに接続されていない、マルチ－タンパク質ナノポアセンサー集合／複合体を提供する。

一実施形態では、マルチ－タンパク質複合体は、プロテアソームαサブユニットの「遊離」環に複合化される人工ナノポアを含む。例えば、この設計は、制御された速度でポリペプチドを、プロテアソームのペプチダーゼによって処理する必要なしに、移動させるために適切に用いられる。

好ましくは、本発明は、（ｉ）上記の人工ナノポアと共に、（ｉｉ）プロテアソームα－サブユニットから構成される、１つまたは２つの環、および任意に（ｉｉｉ）プロテアソームβ－サブユニットから構成される、１つまたは２つの環、を含む、マルチ－タンパク質ナノポアセンサー集合／複合体を提供する。このような複合体は、本明細書では「膜貫通プロテアソーム」または「プロテアソームナノポア」とも呼ばれる。例えば、複合体は、（ｉ）人工ナノポア（例えば、ＴＭ－ＰＡ２８－α－サブユニット）、（ｉｉ）プロテアソームα－サブユニットから構成される１つの環、および（ｉｉｉ）プロテアソームβ－サブユニットから構成される２つの環、を含み得る。

マルチ－タンパク質集合に含まれるプロテアソームα－サブユニットのＮ－末端は、プロテアソーム活性化因子を必要とせずに、展開されたタンパク質基質の迅速な分解を可能にするために、先端が切り取られ得る。例えば、少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個のＮ－末端アミノ酸を欠くプロテアソームα－サブユニットが使用される。

プロテアソームβ－サブユニットは、それ自体で、マルチ－タンパク質集合中で用いられ得る。３つの天然に存在するβ型サブユニットは、触媒的に活性なスレオニン残基を、それらのＮ－末端に含み、かつＮ－末端求核（Ｎｔｎ）ヒドロラーゼ活性を示し、プロテアソームが、既知のセリル、チオール、カルボキシルおよび金属プロテアーゼファミリーに分類されない、スレオニンプロテアーゼであることを示している。βサブユニットは、それぞれカスパーゼ様／ＰＧＰＨ（ペプチジルグルタミルペプチド加水分解）、トリプシン様およびキモトリプシン様の活性に関連しており、それぞれ、酸性、塩基性および疎水性アミノ酸残基のＣ－末端側でペプチド結合を切断する能力を付与する。

あるいは、複合体は、異なるタイプのプロテアーゼ活性を提供するように操作されたプロテアソーム・β－サブユニットの環を含み、固有の基質特異性を可能にする。例えば、改変されたプロテアソーム・β－サブユニットは、トリプシン型またはキモトリプシン型の活性を有し得る。例えば、トリプシンの活性をキモトリプシン様プロテアーゼに、トリプシンの２個の環をキモトリプシンのそれらに置き換えることによって変換できることを示している、非特許文献４２を参照されたい。

複合体は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを、ナノポアセンサー複合体を介して順次、結合、展開、および移動させることができるタンパク質トランスロカーゼをさらに含み得る。例えば、タンパク質トランスロカーゼは、ＮＴＰ駆動アンフォールダーゼ、好ましくはＡＡＡ＋アンフォールダーゼである。例えば特許文献３および非特許文献４３を参照されたい。

ＡＡＡ＋上科に属するものは、これまでに研究されたすべての生物において同定されている。それらは広範囲の細胞的事象に関与している。細菌において、この上科の典型は、転写およびタンパク質分解と同程度に多様な機能に関与し、タンパク質の品質の制御ネットワークにおいて重要な役割を果たす。多くの場合、それらは、タンパク質－タンパク質またはＤＮＡ－タンパク質複合体の、ＡＴＰ依存の展開／分解を媒介するために共通のメカニズムを採用している。ますます多くの例において、これらのＡＡＡ＋タンパク質の活性は、アダプタータンパク質と呼ばれる、他の点では無関係なタンパク質の群によって調節され得るように見える。

例えば、本発明の複合体は、原核生物のＡＡＡ＋アンフォールダーゼＣｌｐＸを含む。ＣｌｐＸは、基質タンパク質を、その六量体集合の中央のポアを通るポリペプチド鎖のＡＴＰ－駆動転移によって展開する。ＣｌｐＰペプチダーゼとの複合体中で、ＣｌｐＸは、展開された基質を直接ＣｌｐＰタンパク質分解チャンバー中に移動させることによってタンパク質分解を行なう（非特許文献４４）。特定の態様では、本発明は、人工ＣｌｐＰナノポアを含むマルチ－タンパク質ナノポアセンサー複合体を、例えば、センサー複合体がＣｌｐＸまたは相同タンパク質アンフォールダーゼをさらに含むＰＡへの融合によって提供する。以下の実施例７を参照されたい。

別の実施形態において、タンパク質トランスロカーゼは、サーモプラズマ・アシドフィルム（ＶＡＴ）由来のサーモプラズマＶＣＰ様ＡＴＰアーゼ、２－ドメインＡＡＡＡＴＰアーゼに属するもの、および哺乳類のｐ９７／ＶＣＰおよびＮＳＦタンパク質の相同体である。別の実施形態では、メタノココックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）由来のプロテアソーム－活性化ヌクレオチダーゼ（ＰＡＮ）が使用され、それは、真核生物の２６Ｓプロテアソーム中のＡＴＰアーゼの相同体である、相対分子量６５０，０００の複合体である。他の例には、ＡＭＡ、アルカエオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）由来のＡＡＡタンパク質、およびメタン生成古細菌が含まれる。

さらに別の実施形態では、トランスロカーゼは、Ｍ．マゼイ・ゲノム（Ｍ．ｍａｚｅｉｇｅｎｏｍｅ）中のオープンリーディングフレーム番号８５４である（非特許文献４５）。本発明で使用するための他の適切なトランスロカーゼには、ＭＢＡ（膜－結合ＡＡＡ；非特許文献４６）およびＳＡＭＰ（非特許文献４７）が含まれる。

好ましいポリヌクレオチド・トランスロカーゼには、ヘリカーゼ（例えば、ｇｐ４）、エキソヌクレアーゼ（ラムダ・エキソヌクレアーゼ）、プロテアーゼ・トランスロカーゼ（例えば、Ｆｔｓｋ）、およびトポイソメラーゼ（例えば、トポイソメラーゼＩＩ）が含まれる。

以下に例示するように、膜貫通プロテアソームは脂質二重層に効率的に挿入され、低ノイズの電流記録を示した。活性アッセイは、プロテアソームナノポアが活性であり、タンパク質分解活性が温度とともに増加し、塩濃度とともに減少することを明らかにした。１ＭＮａＣｌ溶液中のプロテアソーム－ナノポアの電流－電圧（Ｉ－Ｖ）曲線は、ＰＡ－ナノポアのそれと類似しており、膜貫通領域が変化せず、α－サブユニットのゲートが開いていることを示唆している。したがって、本発明のさらなる態様は、本発明に係る人工ナノポアまたはマルチ－タンパク質ナノポア複合体を含む分析システムに関する。典型的には、そのＴＭ領域のおかげで、ナノポアは、前記システムの流体チャンバーをシス側とトランス側に分離する疎水性膜に挿入される。例えば、膜は、脂質二重層であり得、またはそれは、ブロックコポリマーまたは他のタイプの人工膜などの非脂質系であり得る。

本発明に係る分析システムを介して、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを移動させるための方法も提供される。特定の態様では、本発明は、単分子分析のための、好ましくは生体高分子の同定および／または配列決定のための、より好ましくは単分子ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列決定のための、生体高分子が（プロテアソーム）ナノポアに接触および接近できるように分析される生体高分子を分析システムのチャンバーに加えることを含む方法に関する。

使用される条件によって、例えば、ＡＴＰ濃度、バッファーの種類、分析の種類は、必要に応じて選択できる。例えば、ＶＡＴは、ＡＴＰの濃度によって調整することができる速度で、ナノポアを通してポリペプチドを供給することができる。膜貫通プロテアソームが、異なるタンパク質基質を同時に処理および同定することができることを示す（図１ｈ）。したがって、一実施形態では、システムは、移動したペプチドがタンパク質分解的に分解される、いわゆる「分解モード」で使用される。あるいは、不活化されたプロテアソームは、タンパク質を、それらが線形化され、制御された速度でナノポアを横切って輸送されると認識する（図１ｉ）。このシステムは、プロテアソームの活性を単分子レベルでモニターすることを可能にし、例えば、実時間処理でのタンパク質配列決定用途のような用途を有する。したがって、別の実施形態では、システムは、いわゆる「転移モード」で使用される。

同様に、単分子分析のため、好ましくは、生体高分子の同定および／または配列決定のため、より好ましくは、単分子ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列決定のための、本発明に係る人工ナノポアまたはマルチタンパク質ナノポア複合体を含むシステムの使用も本明細書で提供される。タンパク質を配列決定するための２つの方法を想定している。（活性）ペプチド－モードでは、プロテアソームは、タンパク質を認識し、それを断片に切断し、個々の断片を認識するであろう。不活性ストランド－モードでは、タンパク質は、それらが、ナノポアチャネルを横切って無傷の基質を通すアンフォールダーゼ（例えばＶＡＴ）によって、線形化され、かつ制御された速度でナノポアを横切って輸送されると認識され得る。個々のペプチドは、プロテアソームナノチャネルを介して電気浸透流によってナノポアに向けられ、そこで、それらは特定の電流遮断によって認識される。これにより、本発明は、実時間処理での単分子タンパク質配列決定用途のためのマルチ－タンパク質プロテアソーム－ナノポアを提供する。これは、ナノポアを横切るポリペプチドの輸送を制御する最初の多成分系タンパク質分解ナノポアである。特に、プロテアソーム－ナノポアは、生理学的条件だけでなく、高塩分、高温および／または低ｐＨを含む、より極端な条件下でもポリペプチドを分解する。重要なことに、タンパク質はまた、上記の条件下で識別され得ることが示されている。

本発明はまた、本発明の人工ナノポアを提供するための手段および方法を提供する。一実施形態では、それは、本明細書に開示されるように、人工ナノポアのサブユニットをコードする核酸分子を提供する。核酸分子は、（ｉｉ）集合のＴＭ領域を横切るポリペプチドまたはポリヌクレオチドの輸送を制御することができる環形成（多量体）タンパク質のサブユニットの（ｉ）アミノ酸配列に融合した、β－バレルまたはα－ヘリカルポア形成タンパク質の膜貫通（ＴＭ）配列、を含む融合タンパク質をコードする。

一実施形態では、核酸分子は、（ｉ）β－バレルまたはα－ヘリカルポア形成タンパク質のＴＭ配列であって、Ｎ－およびＣ－末端側で（ｉｉ）少なくとも３個のアミノ酸の柔軟なリンカーが隣接し、隣接されたＴＭ配列は（ｉｉｉ）ＴＭ領域を横切るポリペプチドまたはポリヌクレオチドの輸送を制御することができる環形成（多量体）タンパク質のサブユニット、のアミノ酸配列中に挿入されている、ＴＭ配列、を含む融合タンパク質をコードする。好ましい実施形態において、核酸分子は、上記の融合タンパク質をコードし、隣接するＴＭ配列を含む環形成多量体タンパク質のＣ－末端は、任意で少なくとも１５個のＮ－末端アミノ酸を欠いている、プロテアソームα－サブユニットのＮ－末端に遺伝的に融合される。別の好ましい実施形態において、核酸分子は、上記の融合タンパク質をコードし、隣接するＴＭ配列を含む環形成多量体タンパク質のＮ－末端は、ＣｌｐＰ科に属するもののサブユニットのＣ－末端に遺伝的に融合している。

本発明で使用するための他の核酸分子は、（Ｎ－末端の先端が切断された）プロテアソームα－サブユニットまたはプロテアソームβ－サブユニットをコードし得る。本発明の核酸分子によってコードされる任意のタンパク質は、例えばそのＮ－またはＣ－末端において、タンパク質の精製および／または単離を可能にするタンパク質タグを含み得る。例えば、Ｈｉｓ－タグまたはＳｔｒｅｐ－タグを追加することができる。他の好ましい核酸分子には、上記のような好ましい人工ナノポアをコードするものが含まれる。

本発明に係る核酸分子を含む発現ベクター、およびその発現ベクターを含む、宿主細胞、例えば細菌または酵母宿主細胞、が提供される。宿主細胞は、さらにプロテアソーム・ベータ－サブユニットおよび／またはプロテアソーム・アルファ－サブユニットをコードする独特な発現ベクターを含み得る（すなわち、同時遺伝子導入され得る）。特定の態様では、宿主細胞は２つの別個のベクターを含み、一方はプロテアソーム・α－サブユニットを融合した（Ｈｉｓ－タグ付き）人工ナノポアサブユニットをコードし、他方はプロテアソーム・β－サブユニットおよび第２の（Ｓｔｒｅｐ－タグ付き）プロテアソーム・α－サブユニットをコードする。そのような宿主細胞の発現は、マルチ－タンパク質人工プロテアソーム－ナノポア複合体のすべての成分の、組換え生産および共集合を可能にする。タンパク質は、当技術分野で知られている方法に従って、例えば、１つまたはそれより多くのタンパク質タグの存在を利用する親和性クロマトグラフィーおよび／またはタンパク質の相互の自然な親和性に基づく共精製を使用して単離することができる。特に図４ｂを参照されたい。

単分子タンパク質分析用の膜貫通型タンパク質デバイスの設計。ａ、マウスＰＡ２８αの構造（ＰＤＢＩＤ：５ＭＳＪ）。ｂ、セリン－セリン－グリシンリンカーの構造のスティック線図。ｃ、炭疽菌防御抗原（ＰＤＢＩＤ：３Ｊ９Ｃ）の構造のリボン線図。防御抗原の膜貫通領域はマゼンタである。脂質分子は、円形の極性頭部領域および２つの柔軟なアシル鎖によって概略的に示されている。ｄ、分子動力学シミュレーションによって生成された人工ナノポアの構造。ＰＡ２８（ａ）は、短いリンカー（ｂ）を介して保護抗原（ｃ）の膜貫通領域に遺伝子的に融合された。ｅ、Ｔ．アシドフィルム（Ｔ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）プロテアソームαおよびβサブユニットの構造（ＰＤＢＩＤ：１ＹＡ７）。ｆ、設計されたプロテアソームナノポアの構造。ｇ、サーモプラズマ・アシドフィルム（ＶＡＴ）由来のサーモプラズマＶＣＰ様ＡＴＰアーゼの構造（ＰＤＢＩＤ：５Ｇ４Ｇ）。ｈおよびｉ、人工ナノポアに結合したＶＡＴ。次に、転移されたタンパク質は、ペプチドに分解され（ｈ）、または放出される（ｉ）。ナノポアの製造と電気的最適化。ａ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中のナノポア発現、挿入効率およびナノポア安定性におけるリンカー長の影響。膜貫通領域は、短いリンカー（ＳＳＧ、赤）を介してＰＡ２８の中央に挿入された。３個のフェニルアラニンおよび１個のバリン残基は、脂質－水の境界を定義し、緑色の四角で強調表示されている。バレルの外側および内側を指す側鎖は、それぞれ灰色および黒色の線で強調表示されている。７個のサブユニットのそれぞれは、ターン（黒い線）によって分離された２個のβ－鎖に寄与する。最初に設計されたナノポアは、より広い矢印で強調表示されている。１つの欠失変異体（Δ２）および５つの挿入変異体（∇２、∇４、∇８、∇１２、および∇１６）を、防御抗原の天然配列に基づいて調製した。明確にするために、ＰＡ２８はシアンの正方形として示されている。ｂ、∇４変異体の電気的性質。左：∇４変異体のリンカー配列。中央：±３５ｍＶでの単ナノポアの電気的波形。右：－３５ｍＶにおける５９個のナノポアの単位コンダクタンス値の柱状グラフ。ｃ、∇２変異体の電気的特性。左：∇２変異体のリンカー配列。中央：＋３５ｍＶにおける脂質膜への個々のポアの挿入に対応する、典型的な電流波形および電流柱状グラフ。右：－３５ｍＶにおける５９個の人工ナノポアの単位コンダクタンス値の柱状グラフ。データは、１ＭＮａＣｌ、１５ｍＭトリス、ｐＨ７．５で、１０ｋＨｚのサンプリングレートおよび２ｋＨｚのローパスベッセルフィルタを使用して±３５ｍＶで収集された。ｄ、分子動力学シミュレーションによって生成された、人工膜貫通ポアとＤＰｈＰＣとの相互作用。最適化された人工ポア（∇２）の電気的特性と基質の識別。ａ、イオン－電流測定の配置の概略図。人工ポアをシス側に設け、浮遊脂質膜に挿入する。電位が２個のＡｇ／ＡｇＣｌ電極を介して印加され、ナノポア（１ＭＮａＣｌ、１５ｍＭトリス、ｐＨ７．５）を通ってＮａ^＋およびＣｌ^－イオンの電流が誘導される。ＰｙＭＯＬで計算された真空静電ポテンシャルに応じて、ポアは青（正）と赤（負）に着色される。ｂ、±３５ｍＶにおける最適化後に有効な単ポアを通して記録された典型的な電流波形。平均電流値は、－３５ｍＶにおいて４１．２４±０．０２ｐＡであり、＋３５ｍＶにおいて４５．４３±０．０６ｐＡである。ｃ、３個の異なるナノポアの平均電流－電圧（Ｉ－Ｖ）特性。エラーバーは、平均曲線からの標準偏差を表す。ｄ、ナノポアのイオン選択性。逆転電位の決定は、ポアがカチオン選択的であることを、それらの狭窄部での静電ポテンシャルから予想されるように、示している（ａ）。電流信号は２ｋＨｚでフィルターにかけられ、１０ｋＨｚでサンプリングされた。ｅ、β－ＣＤの化学構造、滞留時間に対するＩ_ｒｅｓ％の散布図、および代表的波形。ｆ、γ－ＣＤの化学構造、Ｉ_ｒｅｓ％対滞留時間の散布図、および代表的波形。ｇ、アンジオテンシンＩのペプチド配列、Ｉ_ｒｅｓ％対滞留時間の散布図、および代表的波形。ｈ、ダイノルフィンＡのペプチド配列、Ｉ_ｒｅｓ％対滞留時間の散布図、および代表的波形。人工プロテアソーム－ナノポアの設計。ａ、Ｔ．アシドフィルムプロテアソーム－ＰＡ２６の構造。ＰＡ２６、プロテアソームαサブユニット、およびβサブユニットは、それぞれオレンジ／マゼンタ、および緑に着色されている。ＰＡ２６（Ｓ２３１）のＣ－末端は、αサブユニットのＬ２１に近接している。ｂ、人工プロテアソーム－ナノポアの再構成。サブ複合体３を得るために、２個の分かれたベクターを使用して、４個のタンパク質を発現させた。ＰＡポアは、Ｎ－末端Ｈｉｓ－タグでプロテアソームαサブユニット（α△２０）に融合され、ｐＥＴ－２８ａベクターにクローン化された。タグ無しβサブユニットおよびＣ－末端Ｓｔｒｅｐ－タグを有する第２のαサブユニット（α△１２）をｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクターにクローン化した。まず、Ｈｉｓ－タグアフィニティークロマトグラフィーで複合体１および３を共精製した。次に、Ｓｔｒｅｐ－タグアフィニティークロマトグラフィーで３を精製した。ｃ、精製された複合体３の、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（左）およびネイティブＰＡＧＥ（右）分析。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、分子量がそれぞれ５２．７、２５．８、および２２．３ｋＤａである、ＰＡα△２０（上）、α△１２（中）、およびβ（下）の３つの独特のバンドの存在を明らかにした。これらの結果は、ＰＡα△２０、β、およびα△１２が安定なサブ複合体３を形成することを示唆している。ネイティブＰＡＧＥは、複合体が安定していることを示す１つのバンドのみを示した。ｄ、１ＭＮａＣｌ、１５ｍＭトリス、ｐＨ７．５における±３５ｍＶでの単ポアの挙動。サブ複合体３は、正電位でいくつかの速いゲート挙動を示した。ｅ、ＰｙＭＯＬによって計算された真空静電ポテンシャルに従って着色された人工膜貫通プロテアソーム（青、正；赤、負）の表面表現の切断。サブ複合体３の加水分解活性のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。ａ、β－カゼイン（１ｍｇ／Ｌ）を、緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ）中、５３℃でサブ複合体３と共にインキュベートした。ｂ、β－カゼイン（１ｍｇ／ｍＬ）をサブ複合体３と共にバッファーＡ中で２時間インキュベートした。ｃ、β－カゼイン（１ｍｇ／ｍＬ）を、緩衝液Ｂ（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、０．３－１．０ＭＮａＣｌ）中、５３℃で０．５時間、サブ複合体３と共にインキュベートした。β－カゼイン／サブ複合体３の濃度比は４２であった。プロテアソームのナノポアによる基質の識別。ａ、不活性なプロテアソーム－ナノポアを用いている基質１（Ｓ１）によって引き起こされる典型的な電流波形。ｂ、ＶＡＴ（２０．０μＭ）およびＡＴＰ（２．０ｍＭ）によって媒介される不活性なプロテアソーム－ナノポアを介したＳ１（２０μＭ）の転移。ｃ、ＡＴＰおよびＶＡＴの存在下で不活性なプロテアソームが使用される場合、ＧＦＰ－ｓｓｒＡは、展開され、プロテアソームチャンバーおよびナノポアを通って無傷で移動される。ｄ、活性プロテアソーム－ナノポアを使用してＳ１によって引き起こされる典型的な電流波形。ｅ、活性プロテアソームが使用される場合、ＶＡＴおよびＡＴＰの存在下で、まれで速い事象のみが観察され、活性プロテアソーム－ナノポアがＳ１を効率的に切断して小さな断片を生成することを示唆している。ｆ、活性プロテアソームがＡＴＰおよびＶＡＴの存在下で使用される場合、折り畳まれていないＧＦＰ－ｓｓｒＡがプロテアソームのチャンバー内で切断され、分解されたペプチドは短すぎてナノポアによって検出されない。データは、１ＭＮａＣｌ、１５ｍＭトリス、ｐＨ７．５において４０℃かつ－３０ｍＶで収集された。プロテアソームのナノポアによる基質の識別。ａ、基質１および２の配列比較。ｂ、１ＭＮａＣｌ、１５ｍＭトリス、ｐＨ７．５における４０℃かつ－３０ｍＶでの、画分遮断対時間の散布図および切断されたＳ１およびＳ２によって引き起こされた代表的な遮断。ＰＡ２６人工ナノポアの設計および膜挿入。ａ、炭疽菌防御抗原（ＰＤＢＩＤ：３Ｊ９Ｃ）の構造のリボン図。膜貫通領域は青色で強調表示されている。ｂ、ＰＡ２６の構造（ＰＤＢＩＤ：１ＹＡ７）。ｃ、人工ＰＡ２６－ナノポアの構造。ｄ、典型的な電流波形は、個々のポアの挿入を示している。データは、１ＭＮａＣｌ、１５ｍＭトリス、２０ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．５において±３５ｍＶで収集された。ＡＴＰアーゼ人工ナノポアの設計および挿入。ａ、炭疽菌防御抗原（ＰＤＢＩＤ：３Ｊ９Ｃ）の構造のリボン図。膜貫通領域は青で強調表示されている。ｂ、アクウィフェクス・アエオリカスＡＴＰアーゼ（ＰＤＢＩＤ：３Ｍ０Ｅ）の構造。ｃ、人工ＡＴＰアーゼ膜貫通ポアの構造。ｄ、典型的な電流波形は、個々のポアの挿入およびＡＴＰ加水分解を示している。ＡＴＰアーゼナノポアは、正電位で開閉を示した。電流波形は、ＡＴＰ（２ｍＭ）が溶液に加えられた場合に、ノイズが多く、かつ大きくなった。データは、１ＭＮａＣｌ、１５ｍＭトリス、２０ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．５において±３５ｍＶで収集された。単分子タンパク質分析用ＣｌｐＰ－人工ナノポアの設計。ａ、ＰＡ－ナノポアの構造。ｂおよびｃ、ＣｌｐＰ（ＰＤＢＩＤ：１ＴＹＦ）の構造のリボン図。ｄ、ＰＡ－ナノポアは、ＣｌｐＰに遺伝子的に融合された。ｅ、設計されたＣｌｐＰ－ナノポアの構造。ｆ、アンフォールダーゼＣｌｐＸの構造（ＰＤＢＩＤ：３ＨＷＳ）。３つの異なるナノポアの電流－電圧（Ｉ－Ｖ）特性。人工的に開閉されたＣｌｐＰ－ナノポアは、ナノポアのコンダクタンスを変化させなかった。電流信号は、０．５ＭＫＣｌ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で記録され、２ｋＨｚでフィルタリングされ、そして１０ｋＨｚでサンプリングされた。ＣｌｐＰナノポアを通る制御された転移。ＣｌｐＸは、２．０ｍＭＡＴＰの存在下で、開かれたＣｌｐＰ－ナノポアを横切るＧＦＰの輸送を支援した。ＣｌｐＰ－ナノポア、ＣｌｐＸおよびＧＦＰはシス側に加えられた。データは、０．１ＭＫＣｌ、０．３ＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、１５ｍＭトリス、ｐＨ７．５において２２℃かつ－５０ｍＶで、５０ｋＨｚのサンプリングレートを有する１０ｋＨｚのローパスベッセルフィルタを使用して収集された。次に、波形は、５ｋＨｚのカットオフを備えたガウシアンローパスフィルタを用いてデジタル的にフィルタリングされた。

（実施例）
（材料および方法）
（一般的材料。）オリゴヌクレオチドおよびｇブロック遺伝子フラグメントは、インテグレーテッドディーエヌエーテクノロジーズ（ＩＤＴ）から入手した。ＰｈｉｒｅホットスタートＩＩＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、およびＤｐｎＩは、フィッシャーサイエンティフィックから購入した。アンジオテンシンＩ、ダイノルフィンＡ、ペンタン、ヘキサデカン、およびトリズマ塩基は、シグマ－アルドリッチから入手した。１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）は、アバンティポーラーリピッドから購入した。塩化ナトリウムおよびトリトンＸ－１００は、カール・ロスから購入した。

（タンパク質用プラスミド構築。）ｇブロック遺伝子フラグメントを、ＩＤＴによる合成のために発注し、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限消化部位を使用して、ｐＴ７－ＳＣ１プラスミドにクローン化した（非特許文献３３）。プラスミドおよび遺伝子は、Ｔ４リガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して一緒に連結された。０．５μＬの連結反応混合物を、電気穿孔法によって５０μＬのＥ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）１０Ｇ（ルシジェン）コンピテントセルに組み込んだ。形質転換体を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）で補充したＬＢ寒天プレート上で、３７℃で一晩増殖させた。アンピシリン耐性コロニーを採取し、プラスミドＤＮＡ調製のためにアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）で補充した５ｍＬのＬＢ培地に接種した。プラスミドを、遺伝子ＪＥＴ抽出キット（フィッシャーサイエンティフィック）で抽出した。クローンの同一性を、マクロジェンでの配列決定によって確認した。

（配列決定プロテアソーム機構を作り上げるためのプラスミド構築。）サーモプラズマ・アシドフィルムαおよびβのｇブロック遺伝子フラグメントを、ＩＤＴによる合成のために発注した。αサブユニットをコードする遺伝子を、Ｃ－末端にＳｔｒｅｐ－タグの遺伝子でＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位との間のｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）の上流にクローン化した。続いて、タグなしβサブユニットをコードする遺伝子を、ＮｄｅＩとＫｐｎＩ部位との間の下流にクローン化した。ＰＡ－ナノポアを、αサブユニット遺伝子に、重複伸長によるＰＣＲスプライシングを介して融合し（非特許文献３４）、Ｎ末端にＨｉｓタグを有する、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限消化部位を使用して、ｐＥＴ－２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローン化した。

（変異体の構築。）すべての変異体を、ＰｈｉｒｅホットスタートＩＩポリメラーゼを用いた環状プラスミドテンプレートＤＮＡにおける、部位特異的突然変異誘発法のためのクイックチェンジプロトコル（非特許文献３５）を使用して構築した。部分的に重複するプライマーを、プライマーの自己伸長を回避するために使用した。ＰＣＲ増幅は以下の通りであった：９８℃で３分間の変性、続いて９８℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で３分間の３０サイクル、および７２℃で５分間の最終伸長サイクル。ＰＣＲ反応後、親ＤＮＡテンプレートを３７℃で１時間、ＤｐｎＩ酵素で消化した。ＰＣＲ増幅プラスミドを１％アガロースゲルで分離し、遺伝子ＪＥＴゲル抽出キット（フィッシャーサイエンティフィック）で抽出し、電気穿孔法によって５０μＬのＥ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）１０Ｇ（ルシジェン）コンピテントセルに組み込んだ。プラスミドを含む形質転換体を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）で補充したＬＢ寒天プレート上で、３７℃で一晩増殖させた。アンピシリン耐性コロニーを採取し、プラスミドＤＮＡ調製のためにアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）で補充した５ｍＬのＬＢ培地に接種した。プラスミドを遺伝子ＪＥＴ抽出キット（フィッシャーサイエンティフィック）で抽出し、変異を確認するためにマクロジェンで配列決定した。

（発現および精製。）ＰＡナノポアの遺伝子を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ化学コンピテントセルの中に形質転換した。形質転換体を、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）で補充した溶原性培養液（ＬＢ）寒天プレート上で、３７℃で一晩増殖させた後に選択した。得られたコロニーを、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む２００ｍＬのＬＢ培地に接種した。細胞を３７℃で増殖させた（１８０ｒｐｍで振とう）。光学密度が６００ｎｍで０．６の吸光度に達した後、発現を、０．５ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導した。温度を２５℃に下げ、細胞培養物をさらに一晩増殖させた。細胞を、４℃で２０分間（４０００×ｇ）の遠心分離によって収集し、ペレットを－８０℃で保存した。約１００ｍＬの細胞培養ペレットを解凍し、～２０ｍＬの溶解緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭＭｇＣｌ_２、０．１単位／ｍＬＤＮａｓｅＩ、１０μｇ／ｍＬリゾチーム、１％ｖ／ｖトリトンＸ－１００）で可溶化し、ボルテックス攪拌機で、１時間２２℃で撹拌した。次に、細菌を超音波処理によって溶解した（負荷サイクル１０％、出力制御３、ブランソンソニファイア４５０）。続いて、溶解物を６０００×ｇで、４℃で２０分間遠心分離し、細胞破片を廃棄した。上澄みを１００μＬのＳｔｒｅｐ－タクチン樹脂（ＩＢＡ）と混合して５０ｍＬのファルコンチューブに移し、これを洗浄緩衝液（１％ｖ／ｖトリトンＸ－１００、１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で事前に平衡化した。１時間後、樹脂をカラム（マイクロバイオスピン、バイオ・ラッド）に載せ、これを５ｍＬの洗浄緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１％ｖ／ｖトリトンＸ－１００）で前洗浄した。合計で、１０ｍＬの洗浄緩衝液（１％ｖ／ｖトリトンＸ－１００、１５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、２０ｍＭイミダゾール）を使用してビーズを洗浄した。タンパク質を、約１００μＬの溶出緩衝液（２．５ｍＭデスチオビオチン、１５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．２％ｖ／ｖトリトンＸ－１００）で溶出した。

試験ペプチドＳ１およびＳ２をコードする遺伝子を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）電気コンピテントセルの中に別々に形質転換した。形質転換体を、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）で補充した溶原性培養液（ＬＢ）寒天プレート上で、３７℃で一晩増殖させた後に選択した。得られたコロニーを、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む２００ｍＬのＬＢ培地に接種した。細胞を３７℃で増殖させた（１８０ｒｐｍで振とう）。光学密度が６００ｎｍで０．６の吸光度に達した後、３７℃で０．５ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって発現を誘導した。そして、細胞培養物をさらに４時間増殖させた。細胞を４℃で２０分間（４０００×ｇ）の遠心分離によって収集し、ペレットを－８０℃で保存した。約１００ｍＬの細胞培養ペレットを解凍し、～２０ｍＬの溶解緩衝液（３００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭＭｇＣｌ２、０．１ユニット／ｍＬＤＮａｓｅＩ、１０μｇ／ｍＬリゾチーム、０．２％ｖ／ｖトリトンＸ－１００）で可溶化し、ボルテックス攪拌機で、４℃で１時間撹拌した。次に、細菌を超音波処理によって溶解した（負荷サイクル１０％、出力制御３、ブランソンソニファイア４５０）。続いて、溶解物を６０００×ｇで、４℃で２０分間遠心分離し、細胞破片を廃棄した。上澄みを１００μＬのＮｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）と混合して５０ｍＬのファルコンチューブに移し、これを洗浄緩衝液（３００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．２％ｖ／ｖトリトンＸ－１００）で事前に平衡化した。４℃で１時間後、樹脂をカラム（マイクロバイオスピン、バイオ・ラッド）に載せ、これを５ｍＬの洗浄緩衝液（３００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．２％ｖ／ｖトリトンＸ－１００）で前洗浄した。合計で、１０ｍＬの洗浄緩衝液（３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、２０ｍＭのイミダゾール）を使用して、ビーズを洗浄した。タンパク質を、約２００μＬの溶出緩衝液（５００ｍＭのイミダゾール、３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で溶出した。

ＶＡＴおよびＧＦＰをコードする遺伝子を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）電気コンピテントセルの中に別々に形質転換した。形質転換体を、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）で補充した溶原性培養液（ＬＢ）寒天プレート上で、３７℃で一晩増殖させた後に選択した。得られたコロニーを、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む２００ｍＬのＬＢ培地に接種した。細胞を３７℃で増殖させた（１８０ｒｐｍで振とう）。光学密度が６００ｎｍで０．６の吸光度に達した後、２５℃で０．５ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって発現を誘導した。そして、細胞培養物をさらに一晩増殖させた。細胞を４℃で２０分間（４０００×ｇ）の遠心分離によって収集し、ペレットを－８０℃で保存した。約１００ｍＬの細胞培養ペレットを解凍し、～２０ｍＬの溶解緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭＭｇＣｌ_２、０．１ユニット／ｍＬＤＮａｓｅＩ、１０μｇ／ｍＬリゾチーム）で可溶化し、ボルテックス攪拌機で、４℃で１時間撹拌した。次に、細菌を超音波処理によって溶解した（負荷サイクル１０％、出力制御３、ブランソンソニファイア４５０）。続いて、溶解物を６０００×ｇで、４℃で２０分間遠心分離し、細胞破片を廃棄した。上澄みを１００μＬのＮｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）と混合して５０ｍＬのファルコンチューブに移し、これを洗浄緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で事前に平衡化した。４℃で１時間後、樹脂をカラム（マイクロバイオスピン、バイオ・ラッド）に載せ、これを５ｍＬの洗浄緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で前洗浄した。合計で、１０ｍＬの洗浄緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、２０ｍＭイミダゾール）を使用して、ビーズを洗浄した。タンパク質を、約２００μＬの溶出緩衝液（５００ｍＭのイミダゾール、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で溶出した。

（プロテアソームの共発現および精製）プロテアソーム－ナノポアの集合のために、プロテアソームのαおよびβサブユニットをコードする遺伝子を含むｐＥＴＤｕｅｔ－１およびＰＡ２８－α△２０ナノポアプラスミドをコードする遺伝子を含むｐＥＴ２８ａを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）電気コンピテントセルに同時形質転換した。形質転換体を、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）およびカナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）で補充したＬＢ寒天プレート上で、３７℃で一晩増殖させた後に選択した。得られたコロニーを、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよびカナマイシンを含む２００ｍＬのＬＢ培地に接種した。Ａ６００が約０．６に達したとき、タンパク質発現を、０．５ｍＭのβ－ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導した。温度を２５℃に下げた。１２時間の誘導後、細胞を収集し、ペレットを－８０℃で保存した。

約１００ｍＬの細胞培養ペレットを解凍し、約２０ｍＬの溶解緩衝液（１５０－１０００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭＭｇＣｌ_２、２０ｍＭイミダゾール、０．１ユニット／ｍＬＤＮａｓｅＩ、１０μｇ／ｍＬリゾチーム、１％ｖ／ｖトリトンＸ－１００）で可溶化し、ボルテックス攪拌機で、２２℃で１時間撹拌した。次に、細菌を超音波処理によって溶解した（負荷サイクル１０％、出力制御３、ブランソンソニファイア４５０）。続いて、溶解物を６０００×ｇで、４℃で２０分間遠心分離し、細胞破片を廃棄した。上澄みを１００μＬのＮｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）と混合して５０ｍＬのファルコンチューブに移し、これを洗浄緩衝液（１％ｖ／ｖトリトンＸ－１００、１５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で事前に平衡化した。１時間後、樹脂をカラム（マイクロバイオスピン、バイオ・ラッド）に載せ、これを５ｍＬの洗浄緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１％ｖ／ｖトリトンＸ－１００）で前洗浄した。タンパク質を、約２００μＬの溶出緩衝液（５００ｍＭのイミダゾール、１５０～１０００ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１％ｖ／ｖのトリトンＸ－１００）で溶出した。続いて、溶出されたタンパク質を５０μＬのストレプトタクチン樹脂（ＩＢＡ）と混合して２ｍＬのチューブに移し、これを洗浄緩衝液（１％ｖ／ｖトリトンＸ－１００、１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で事前に平衡化した。３０分後、樹脂をカラム（マイクロバイオスピン、バイオ・ラッド）に載せ、これを５ｍＬの洗浄緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１％ｖ／ｖトリトンＸ－１００）で前洗浄した。合計で、１０ｍＬの洗浄緩衝液（１５０－１０００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、２０ｍＭのイミダゾール、０．２％ｖ／ｖのトリトンＸ－１００）を使用してビーズを洗浄した。タンパク質を、約１００μＬの溶出緩衝液（２．５ｍＭデスチオビオチン、１５０－１０００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．２％ｖ／ｖトリトンＸ－１００）で溶出した。

（人工プロテアソーム－ナノポア（複合体３）のタンパク質分解活性。）人工プロテアソーム－ナノポアのタンパク質分解活性を決定するために、β－カゼインを、様々な培養時間、温度、および塩濃度の下で、精製された複合体３と共に培養した（図５）。最初に、０．１ｍＬのβ－カゼイン（１ｍｇ／ｍＬ）の一定分量を、緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ）中、５３℃で複合体３と共に培養した。最終的なβ－カゼイン／複合体３の濃度比は４２であった（図５ａ）。プロテアーゼの非存在下では、β－カゼインの分解は観察されなかった。複合体３と共に５３℃での１５分間の培養後、ほとんどすべてのβ－カゼインが消化され、最初に観察されたタンパク質の約４分の３は、もはやＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出できなかった。３０分の培養後、すべてのβ－カゼインを消化した。次に、β－カゼインの分解のための様々な温度および塩濃度を試験した。図５ｂおよび図５ｃに示すように、タンパク質分解活性は温度とともに増加し、塩濃度の増加とともに減少した。

（平面脂質二重層における電気的記録。）セットアップは、高電圧スパークを印加することによって形成された直径約１００μｍの開口を含む、２５μｍ厚のポリテトラフルオロエチレンフィルム（グッドフェロー・ケンブリッジ・リミテッド）によって分離された２つのチャンバーから構成された。脂質二重層を形成するために、開口部を１滴の５％ヘキサデカン／ペンタン溶液で前処理した。ペンタンを蒸発させるために約１－５分待った後、５００μＬの緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を各区画に加えた。次に、ペンタン（～１０ｍｇ／ｍＬ）中の１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）の一滴を各区画に加えた。ペンタンの蒸発後、脂質単層が、開口部上で溶液を上下にピペット操作することによって自発的に形成された。銀／塩化銀電極を各区画の溶液に沈めた。ナノポアをトランス側に加えた。すべての実験は～２３℃で実施された（非特許文献３６）。

（データの記録および分析。）電子信号を、Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ｂ（アクソンインスツルメンツ）を使用することによって記録し、デジタル化を、Ｄｉｇｉｄａｔａ１４４０（アクソンインスツルメンツ）で行った。Ｃｌａｍｐｅｘ１０．７ソフトウェアおよびＣｌａｍｐｆｉｔ１０．７ソフトウェア（モレキュラーデバイス）を、それぞれ、電子信号記録およびその後のデータ分析のために使用した。ｃｌａｍｐｆｉｔの単チャネル検索機能を使用してイベントを収集し、０．０５ｍｓより短いイベントは無視した。

（イオン選択性。）電流－電圧（Ｉ－Ｖ）電流波形を、各電位を、１ｍＶステップで－３０から＋３０ｍＶまで０．４秒間、印加する自動電圧プロトコルで記録した。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を、２．５ＭＮａＣｌを含む２．５％アガロースブリッジで囲んだ。逆転電位を、非対称塩濃度条件下で収集したＩ－Ｖ曲線からの外挿から測定した。実験を以下のように進めた：最初に、個々のナノポアを、両方のチャンバー（１ＭＮａＣｌ、１５ｍＭトリス、ｐＨ７．５、５００μＬ）において同じ緩衝液を使用して再構成した。これにより、ナノポアの配向を評価することが可能になり、電極のバランスをとることが可能になった。次に、４ＭＮａＣｌ、１５ｍＭトリス、ｐＨ７．５を含む５００μＬの溶液をシス側にゆっくりと加え、ＮａＣｌを含まない５００μＬの緩衝溶液（１５ｍＭトリス、ｐＨ７．５）をトランス側に加えた（トランス：シス、２．０ＭＮａＣｌ：０．５ＭＮａＣｌ）。

（実施例１：人工ナノポアの設計）
サーモプラズマ・アシドフィルム由来の２０Ｓプロテアソームは、１４個のα－および１４個のβ－サブユニットから構成される４つの積み重ねられたリングからなる円筒形構造を有する（図１ｅ）（非特許文献１２）。２つの隣接する外側α環は、２０Ｓプロテアソームといくつかの調節複合体との会合を可能にし（非特許文献１３）、当該複合体の例は、基質の触媒空洞への転移を制御するプロテアソーム活性化因子ＰＡ２８（図１ａ）がある（非特許文献１４）。ＰＡ２８ナノポアを、ＰＡ２８のサブユニット（Ｉ６３からＰ１００まで）の無秩序領域を、両側に短い可撓性リンカー（ＳＳＧ）が隣接する炭疽菌保護抗原（非特許文献１５）の膜貫通領域（ＶＨＧＮＡＥＶＨＡＳＦＦＤＩＧＧＳＶＳＡＧＦ）で置き換えることによって、設計した（図１ａ－ｄ、図２ａ）。この膜貫通（ＴＭ）領域の２２残基は、脂質二重層の疎水性コアにまたがるのに十分である。

人工ＰＡ２８－ナノポアのサブユニットのアミノ酸配列は以下の通りであった：

２つの短いリンカー（ＳＳＧ）（太字で示されている）に隣接する保護抗原の膜貫通領域を、ＰＡ２８αのポリペプチド配列に挿入し、この挿入は、イタリック体で示されているＰＡ２８のアミノ酸の伸長の欠失も含んでいた。

融合ナノポアを最適化するために、リンカーの長さを、膜貫通領域の両側で残基を追加することまたは除去することによって変化させた。１つの欠失変異体（Δ２）と５つの挿入変異体（∇２、∇４、∇８、∇１２、および∇１６）を、防御抗原ナノポアの配列（非特許文献１５）に基づいて、調製した（図２ａ）。Δ２を除いて、すべての変異体を脂質二重層に挿入することができた。ただし、挿入効率とその後の二重層の安定性は変異体間で異なっていた。∇８、∇１２、および∇１６は大きな電流変動を示し、ナノポア分析を妨げたが、これは、リンカーがナノポアに大きなコンフォメーションの柔軟性をもたらすことを示唆している。∇４は、時折、正の印加電位で全電流ブロックを伴う低ノイズコンダクタンスを示した。ただし、ナノポアは不均一な単コンダクタンスを示し、負の印加電位で頻繁に閉じた（図２ｂ）。すべての構造の中で、効率的に発現されおよび精製された∇２は、脂質二重層で最も均一なポアを生成した（－３５ｍＶ、１ＭＮａＣｌ、１５ｍＭトリス、ｐＨ７．５、ｎ＝５９で、１．１７±０．１４ｎＳの平均単位コンダクタンス、図２ｃ）。

注目すべきことに、∇２は、自然界に見られる他のナノポア（例えば、アルファ溶血素（非特許文献１６））と同じくらい効率的かつ均一に挿入された。炭疽菌保護抗原のＴＭ領域に対応する個々のペプチドは、ナノポアを形成することができず、脂質二重層中でナノポアを安定化するために可溶性足場が必要であることを示している。

分子動力学（ＭＤ）シミュレーションは、ナノポアと脂質二重層との間の静電的および疎水性相互作用をよりよく理解するために、∇２ＰＡ－ナノポア（以下、ＰＡ－ナノポア）で実施された。図２ｄに示されるように、疎水性残基の２つのリングは、ＴＭ領域を二重層の疎水性端に固定し、一方、脂肪族側鎖を有する交互の残基は、二重層の芯と相互作用する。ポアの内腔は、親水性残基によって水和された状態に保たれている。予想通り、リンカー残基の親水性側鎖は、膜脂質の荷電した頭部基と相互作用している。

（実施例２：最適化された人工ポアの電気的および機能的特性）
αＨＬ（非特許文献１８）およびエアロリシン（非特許文献１９）ナノポアなどの他のβ－バレルナノポアと同様に、人工ＰＡナノポアは、非対称の電流－電圧（Ｉ－Ｖ）関係を示し（図３ｃ）、これは、脂質二重層中のポアの配向を特定することを可能にした。非対称ＮａＣｌ濃度（０．５Ｍ／シスおよび２Ｍ／トランス）を使用するイオン選択性測定は、カチオン選択性ナノポア（ＰＫ^＋／ＰＣｌ^－＝１．７６±０．２０、図３ｄ）を明らかにした。本明細書および原稿全体を通して、誤差は、３回の実験から得られた標準偏差を示している。ＰＡナノポアの正確な折り畳みは、β－バレルナノポアに結合する環状分子であるシクロデキストリン（ＣＤ）を使用して特徴付けられた（非特許文献２０）。α－ＣＤ、β－ＣＤおよびγ－ＣＤを人工ナノポアのシス側に加え、遮断（Ｉ_Ｂ）に関連するイオン電流の大きさを測定した。遮断を特徴づけるために、［（Ｉ_Ｏ－Ｉ_Ｂ）／Ｉ_Ｏ］×１００として定義される除外電流のパーセンテージ（Ｉ_ｒｅｓ％）を使用し、ここで、Ｉ_Ｏは開ポア電流を表す。α－ＣＤは、電流遮断が観察されない位あまりにも速く、ナノポアを横切って移動した可能性が最も高い。対照的に、β－ＣＤおよびγ－ＣＤは、特徴的な遮断を示した（図３ｅおよび図３ｆ）。最後に、ペプチドを同定するナノポアの能力を、アンジオテンシンＩおよびダイノルフィンＡを用いて試験した。本発明者らは、２つのペプチドが、残留電流および電流遮断の持続時間を含むいくつかのパラメータを用いて容易に区別できる、遮断を誘発することを見出した（図３ｇおよび図３ｈ）。

（実施例３：人工膜貫通プロテアソームの設計）
細胞において、ＰＡ２８は、２０Ｓプロテアソームに連結し、触媒空洞への基質の転移を制御する（非特許文献２１）。しかしながら、本発明者らは、プロテアソームが１ＭＮａＣｌ溶液中の個々のＰＡ２８ナノポアのシス側に添加された場合、明確な相互作用が観察されなかったことを発見した。用いられる高いイオン強度は、そのような相互作用を可能にしない可能性が最も高い（非特許文献２２）。ＰＡ２８の相同体である、トリパノソーマ・ブルセイ（非特許文献２３）由来のＰＡ２６との複合体中で、サーモプラズマ・アシドフィルムプロテアソームの結晶構造は、ＰＡ２６のカルボキシ－末端尾部がαサブユニットのアミノ末端近くの２０Ｓプロテアソームのポケットに滑り込むことを示している（図４ａ）。したがって、本発明者らは、ＰＡ２８（Ｓ２３１）のＣ－末端をプロテアソームαサブユニットのＬ２１と融合させた。設計されたタンパク質複合体において、αサブユニットの最初の２０残基が除去され、プロテアソームゲートがＰＡ２８ナノポアに向かって開いたままである。プロテアソームの適切な集合は、αおよびβサブユニットの共集合を必要とする。このように、Ｎ末端Ｈｉｓタグを含むプロテアソーム△２０－αサブユニット（ＰＡ２８－α△２０ナノポア）に融合したＰＡ２８を、カナマイシン耐性の遺伝子を持つｐＥＴ－２８ａベクターにクローニングした。Ｃ－末端Ｓｔｒｅｐ－タグを含むプロテアソームα△１２、およびβサブユニットは両方とも、カナマイシン耐性の遺伝子を持つｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクターにクローン化した（図４ｂ）。α△１２では、αサブユニットの最初の１２残基が除去され、プロテアソーム活性化因子を必要としない、折り畳まれていない基質の迅速な分解を、可能にした（非特許文献２４）。次に、共集合したプロテアソーム－ナノポアを、１ＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５溶液を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって２段階で精製した（図４ｂ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび天然ＰＡＧＥは、マルチ－タンパク質複合体の成功した集合を確認した（図４ｃ）。活性アッセイは、プロテアソームナノポアが活性であり、タンパク質分解活性が温度とともに増加し、塩濃度とともに減少することを明らかにした（図５）。膜貫通プロテアソームは、脂質二重層に効率的に挿入され、正の電位である程度の高速通門が観察されたが、低ノイズ電流記録を示した（図４ｄ）。１ＭＮａＣｌ溶液中のプロテアソーム－ナノポアのＩ－Ｖ曲線は、ＰＡ－ナノポアのそれと類似しており（データ不示）、膜貫通領域は変化せず、αサブユニットのゲートが開いていたことを示している。これらの結果は、共発現および２段階精製手順を使用して、１ＭＮａＣｌを含む溶液中で大腸菌に形成され、安定した副複合体３（ＰＡαΔ２０－ββ－αΔ１２ナノポア）を効果的に分離できることを示唆している。

（実施例４：リアルタイムのタンパク質処理）
膜貫通プロテアソームの活性を、基質タンパク質をプロテアソームチャンバーに通すアンフォールダーゼであるＶＡＴ（サーモプラズマ・アシドフィルムのバロシン含有タンパク質様ＡＴＰアーゼ）（非特許文献２５）との相互作用を媒介する、Ｃ－末端ｓｓｒＡタグを含む基質を用いて試験した。Ｓ１と名付けられた最初の基質は、１２３アミノ酸長であり、構造化されておらず、１０個のアルギニンおよび３個の疎水性残基のグループに隣接した１５個のセリン残基の４つの伸張を含むように設計された。２番目の基質はＳ２、２１０個のアミノ酸のより長いポリペプチドであった。３番目の基質は、１０個のアルギニンとＣ－末端にｓｓｒＡタグ（ＡＡＮＤＥＮＹＡＬＡＡ）を運ぶ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（非特許文献２５）であった。

膜貫通プロテアソームを用いて初期試験を実施し、活性部位中のアミノ－末端スレオニン１をアラニンで置換することによってタンパク質分解活性を除去した（非特許文献２６）。反応を、１ＭＮａＣｌ、１５ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭＭｇＣｌ_２溶液中で実施した。不活性なプロテアソーム－ナノポアのシス区画への２０．０μＭのＳ１の添加は、短い（平均滞留時間は０．６２±０．１１ｍｓ）および２番目に長い電流遮断の両方を誘発した（図６ａ）。おそらく、短い事象は、基質がナノポアを横切って一方の移動をすること、および長い事象は、基質がプロテアソームチャンバー内で遮断されたままであることを表す。両方の遮断は、ゼロに近い残留電流を示し（Ｉ_ｒｅｓ％＝１１．５６±０．１３）、転移中に、構造化されていない基質がナノポアの大部分を閉塞したことを示唆している。２．０ｍＭＡＴＰの存在下で溶液中にＶＡＴ（２０．０μＭ）を添加した場合、２番目に長い遮断はもはや観察されなかった（図６ｂ）。さらに、非補助転移事象と比較して、ＶＡＴ補助転移事象中に、より多くのイオン電流が観察され（Ｉ_ｒｅｓ％＝８３．８１±０．１１）、ＶＡＴが基質を展開している間に基質が伸張されたことを示唆している。転移中にいくつかの繰り返し電流サインが観察され（平均滞留時間は５．８±３．９ｍｓ）、基質の異なる特徴がイオン信号に反映されていることを示唆している（図６ｂ）。

Ｓ１の代わりにＧＦＰを用いた場合、電流遮断はより長くなり（平均滞留時間は２２．１±２０．２ｍｓ）、電流サインはＳ１と比較して著しく異なり（図６ｂ、図６ｃ）、２つの基質を、それらのイオン電流信号に基づいて区別できることを示している。ＡＴＰ濃度を６．０ｍＭに増加した場合、ＧＦＰ遮断の平均滞留時間は、１０分の１に減少して２．４±１．７ｍｓになった（データ不示）。したがって、ＶＡＴは、ＡＴＰの濃度によって調整できる速度でナノポアを介してポリペプチドを供給することができる。

活性プロテアソームが、Ｓ１が存在しＶＡＴおよびＡＴＰが存在しない条件下で用いられた場合、均一で短い遮断が観測された（図６ｄ）。それらの平均滞留時間（０．５１±０．０３ｍｓ）は、不活性なプロテアソームで記録された類似の事象について観察されたものよりも短く、プロテアソームが転移中に少なくとも部分的に基質を処理したことを示唆している。Ｓ１と比較して、より長い、折り畳まれていない基質が試験された場合（Ｓ２）、観察された事象の平均滞留時間は、より長く（２．２６±０．２６ｍｓ）、より深い残留電流が観察され、より大きなポリペプチドフラグメントが形成されることを示した。Ｓ１とＳ２との混合物は、イオン電流遮断によって容易に区別することができた。興味深いことに、Ｓ１をＶＡＴ（２０．０μＭ）およびＡＴＰ（２．０ｍＭ）で試験した場合、より間隔が空いて短い遮断が観測され（図６ｅ）、これは、プロテアソームチャンバーを横切るポリペプチドの通り抜けの速度の低下が、ポリペプチドの、ナノポアを横切って迅速に輸送される小さなペプチドへのより効率的な分解を可能にしたことを示唆している。その結果、ＧＦＰが同じ条件下で試験された場合、遮断は観察されなかったが、非構造化Ｓ１と比較してＧＦＰの展開が遅いため、基質をさらに効率的にタンパク質分解してさらに小さなペプチドにすることができたことが示唆された。これらのペプチドは、観察するには速すぎる速度でナノポアを横切って輸送される（非特許文献２７）。

（実施例５：ＰＡ２６－人工ナノポア）
この実施例は、ＰＡ２８の相同体である、環形成多量体プロテアソーム活性化因子タンパク質ＰＡ２６を含む人工ナノポアの設計および特徴付けを説明する。

炭疽菌防御抗原（ＰＤＢＩＤ：３Ｊ９Ｃ）の膜貫通配列（太字）を、ＰＡ２６（ＰＤＢＩＤ：１ＹＡ７）のサブユニットの中央に融合させ、そこからイタリック体で示した１２－アミノ酸配列を、２個のリンカー（ＧＳＳＳＥ－－－－ＳＮＳＳＧ）を介して削除した。

人工ＰＡ２６ナノポアのＮ－末端にＳｔｒｅｐ－タグが付けられたサブユニットの完全な配列は以下の通りである：

図８は、得られた人工ＰＡ２６－ナノポアの構造、および個々のポアの挿入を実証している典型的な電流波形を示している。

（実施例６：ＡＴＰアーゼ－人工ナノポア）
この実施例は、ポリヌクレオチドを輸送することができるタンパク質の例として、環形成多量体アクウィフェクス・アエオリカスＡＴＰアーゼ（ＰＤＢＩＤ：３Ｍ０Ｅ）を含む人工ナノポアの設計および特徴付けを説明する。

炭疽菌防御抗原（ＰＤＢＩＤ：３Ｊ９Ｃ）の膜貫通配列（太字）をＡＴＰアーゼのサブユニットの中央に挿入し、そこからイタリック体で示したアミノ酸配列を削除した（挿入置換）。挿入されたＴＭ配列は、太字で示されているように、リンカー（ＳＳＳＳＳ）が両側に隣接していた。人工ＡＴＰアーゼナノポアのＮ－末端にＳｔｒｅｐ－タグが付けられたサブユニットの完全な配列は以下の通りである：

図９は、人工ＡＴＰアーゼ膜貫通ナノポアを提供するために集合させられたサブユニットの構造を示している。有意義に、人工ＡＴＰアーゼナノポアは、効率的に発現され、脂質二重層中に再構成されて、ナノポアを形成することができた。溶液へのＡＴＰの添加は、ベースラインナノポアのノイズを増加させ、タンパク質が活性であることを示した。ここに、ベータバレルのトロイダルタンパク質への融合に基づく人工ナノポアの別の例が提供される。

（実施例７：ＣｌｐＰ－人工ナノポア）
この実施例では、単分子タンパク質分析用の人工ナノポアの設計について説明する。それは、実施例１に記載の人工ＰＡ２８－ナノポアに基づいており、そのＮ－末端でＣｌｐＰのサブユニットに融合している。ＣｌｐＰ（ＰＤＢＩＤ：１ＴＹＦ）は、大腸菌由来のカゼイン分解性Ｃｌｐプロテアーゼ（ＣｌｐＰ）であり（非特許文献４８）、２．３Åの分解能でＣｌｐＰの構造が決定される。活性プロテアーゼは、連続して積み重ねられた２つの７回折り対称リングから構成される、中空の固体壁シリンダーに似ている。その１４のタンパク質分解活性部位は、直径約５１Åの中央のほぼ球形のチャンバー内に位置している。タンパク質分解チャンバーへの接近は、それぞれが約１０Åの最小直径を有する２つの軸方向のポアによって制御される。

人工ＣｌｐＰ－ナノポアのＣ－末端にＳｔｒｅｐ－タグが付けられたサブユニットの完全な配列は次のとおりである：

残基１－２０８（イタリック）は大腸菌由来のＣｌｐＰの一次配列を表し、残基２０９－４６２はＣ－末端Ｓｔｒｅｐ－タグペプチドＷＳＨＰＱＦＥＫを含むＰＡ－ナノポアであり、下線が引かれた残基２７１－２７３と３００－３０２はリンカーであり、そして残基２７４－２９９（太字）はＴＭ領域を表す。

図１０は、人工ＣｌｐＰ－ナノポアの概略設計を示している。

精製されたＣｌｐＰ－ナノポアのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。活性ＣｌｐＰ－ＰＡポア、活性ＣｌｐＰ、不活性ＣｌｐＰ－ＰＡポア、および不活性ＣｌｐＰＰＡαΔ２０の分子量によく対応する２つの固有のバンドの存在（データ不示）。

図１１は、３つの異なるナノポアの電流－電圧（Ｉ－Ｖ）特性を示している。人工的に開閉されたＣｌｐＰ－ナノポアは、ナノポアのコンダクタンスを変化させなかった。電流信号を、０．５ＭＫＣｌ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で記録し、２ｋＨｚでフィルターし、そして１０ｋＨｚでサンプリングした。

図１２は、ＣｌｐＰナノポアを介したタンパク質（ＧＦＰ）の制御された転移を示している。ＡＴＰの存在下で開かれたＣｌｐＰナノポアを横切るＧＦＰのＣｌｐＸ支援輸送。ＣｌｐＰ－ナノポア、ＣｌｐＸおよびＧＦＰをシス側に加えた。

（付記）
（付記１）
サブユニットの多量体集合を含み、各前記サブユニットは、
（ｉｉ）前記集合のＴＭ領域を横切るポリペプチドまたはポリヌクレオチドの輸送を制御する環形成タンパク質のサブユニットの（ｉ）アミノ酸配列に融合したβ－バレルまたはα－ヘリカルポア形成タンパク質の膜貫通（ＴＭ）配列、
を含む、人工ナノポア。

（付記２）
α－ヘリカルポア形成タンパク質のＴＭ配列、好ましくはＦｒａＣ、ＣｌｙＡ、ＡｈｌＢまたはＷｚａ（大腸菌莢膜多糖のトランスロコン）のＴＭ配列、を含む付記１に記載の人工ナノポア。

（付記３）
β－バレルポア形成タンパク質のＴＭ配列、好ましくはα－溶血素、アエロリジンまたは炭疽菌保護抗原（ＰＡ）のＴＭ配列を含む、付記１に記載の人工ナノポア。

（付記４）
ＴＭ配列は、アミノ酸配列ＶＨＧＮＡＥＶＨＡＳＦＦＤＩＧＧＳＶＳＡＧＦを含む、または、それのみからなる、付記３に記載の人工ナノポア。

（付記５）
ＴＭ配列は、環形成タンパク質の前記サブユニットにＮ－またはＣ－末端で融合されている、付記１～４のいずれか一つに記載の人工ナノポア。

（付記６）
ＴＭ配列は、環形成タンパク質の前記サブユニットの配列内に挿入される、付記１～４のいずれか一つに記載の人工ナノポア。

（付記７）
ＴＭ配列は、少なくとも３個、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸の柔軟なリンカーによってＮ－および／またはＣ－末端側で隣接し、より好ましくは、Ｎ－末端リンカーは、配列ＧＳＳを含みまたはのみからなり、および／または、Ｃ－末端リンカーは、配列ＳＳＧを含みまたはのみからなる、付記１～５のいずれか一つに記載の人工ナノポア。

（付記８）
前記環形成タンパク質は、七量体タンパク質である、付記１～７のいずれか一つに記載の人工ナノポア。

（付記９）
前記環形成七量体タンパク質は、ＴＭ領域を横切るポリヌクレオチドの輸送を制御する、付記８に記載の人工ナノポア。

（付記１０）
前記七量体タンパク質は、ＡＴＰアーゼ、好ましくはＡ．アエオリカスＡＴＰアーゼまたはその相同体もしくは機能的同等物である、付記９に記載の人工ナノポア。

（付記１１）
前記環形成七量体タンパク質は、ＴＭ領域を横切るポリペプチドの輸送を制御する、付記８に記載の人工ナノポア。

（付記１２）
前記七量体タンパク質は、プロテアソーム活性化因子ＰＡ２８、ＰＡ２６、またはそれらの相同体もしくは機能的同等物である、付記１１に記載の人工ナノポア。

（付記１３）
ＴＭ配列を含む前記環形成タンパク質の前記サブユニットのＣ－末端は、プロテアソームα－サブユニットのＮ－末端に遺伝的に融合している、付記１～１２のいずれか一つに記載の人工ナノポア。

（付記１４）
ＴＭ配列を含む前記環形成タンパク質の前記サブユニットのＮ－末端は、Ｃｌｐプロテアーゼ（ＣｌｐＰ）サブユニットのＣ－末端に遺伝的に融合している、付記１～１２のいずれか一つに記載の人工ナノポア。

（付記１５）
（ｉ）付記１～１４のいずれか一つに記載の人工ナノポア、（ｉｉ）プロテアソームα－サブユニットから構成される１個または２個の環、および任意で（ｉｉｉ）プロテアソームβ－サブユニットから構成される１個または２個の環を含む、マルチ－タンパク質ナノポアセンサー複合体。

（付記１６）
前記プロテアソームα－サブユニットは、そのＮ－末端で少なくとも５個のアミノ酸が欠落している、付記１５に記載のマルチ－タンパク質ナノポアセンサー複合体。

（付記１７）
プロテアソームβ－サブユニットから構成される前記環が、固有のタイプのプロテアーゼ活性を提供するように操作されている、付記１５または１６に記載のマルチ－タンパク質ナノポアセンサー複合体。

（付記１８）
前記ナノポアセンサー複合体を介して、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを、順次的に結合、展開、および移動させることができるタンパク質トランスロカーゼをさらに含む、付記１５～１７のいずれか一つに記載のマルチ－タンパク質ナノポアセンサー複合体。

（付記１９）
前記タンパク質トランスロカーゼは、ＮＴＰ－駆動アンフォールダーゼ、好ましくはＡＡＡ＋アンフォールダーゼであり、より好ましくは、前記タンパク質トランスロカーゼは、ＣｌｐＸ、ＶＡＴ、ＰＡＮ、ＡＭＡ、８５４、ＭＢＡおよびＳＡＭＰから選択される、付記１８に記載のマルチ－タンパク質ナノポアセンサー複合体。

（付記２０）
流体チャンバーをシス側とトランス側とに分離している疎水性の膜を含み、前記膜は、付記１～１４のいずれか一つに記載の人工ナノポア、または付記１５～１９のいずれか一つに記載のマルチ－タンパク質ナノポアセンサー複合体を含む、分析システム。

（付記２１）
好ましくは生体高分子の同定および／または配列決定のため、より好ましくは単分子ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列決定のため、付記２０に記載の分析システムのチャンバーに分析される生体高分子を加えること、および前記生体高分子を前記ポアに接触させることを含む、単分子分析のための方法。

（付記２２）
単分子分析のための、好ましくは生体高分子の同定および／または配列決定のための、より好ましくは単分子ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列決定のための、付記２０に記載の分析システムの使用。

（付記２３）
付記１～１４のいずれか一つに記載の人工ナノポアのサブユニットをコードする核酸分子。

（付記２４）
付記２３に記載の核酸分子を含む発現ベクター。

（付記２５）
プロテアソーム・ベータ－サブユニットおよび／またはプロテアソーム・アルファ－サブユニットをコードする固有の発現ベクターを任意でさらに含む、付記２４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。

Claims

サブユニットの多量体集合を含み、各前記サブユニットは、
（ｉｉ）前記集合のＴＭ領域を横切るポリペプチドまたはポリヌクレオチドの輸送を制御する環形成タンパク質のサブユニットの（ｉ）アミノ酸配列に融合したβ－バレルまたはα－ヘリカルポア形成タンパク質の膜貫通（ＴＭ）配列、
を含む、人工ナノポア。
α－ヘリカルポア形成タンパク質のＴＭ配列、好ましくはＦｒａＣ、ＣｌｙＡ、ＡｈｌＢまたはＷｚａ（大腸菌莢膜多糖のトランスロコン）のＴＭ配列、を含む請求項１に記載の人工ナノポア。
β－バレルポア形成タンパク質のＴＭ配列、好ましくはα－溶血素、アエロリジンまたは炭疽菌保護抗原（ＰＡ）のＴＭ配列を含む、請求項１に記載の人工ナノポア。
ＴＭ配列は、アミノ酸配列ＶＨＧＮＡＥＶＨＡＳＦＦＤＩＧＧＳＶＳＡＧＦを含む、または、それのみからなる、請求項３に記載の人工ナノポア。
ＴＭ配列は、環形成タンパク質の前記サブユニットにＮ－またはＣ－末端で融合されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の人工ナノポア。
ＴＭ配列は、環形成タンパク質の前記サブユニットの配列内に挿入される、請求項１～４のいずれか一項に記載の人工ナノポア。
ＴＭ配列は、少なくとも３個、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸の柔軟なリンカーによってＮ－および／またはＣ－末端側で隣接し、より好ましくは、Ｎ－末端リンカーは、配列ＧＳＳを含みまたはのみからなり、および／または、Ｃ－末端リンカーは、配列ＳＳＧを含みまたはのみからなる、請求項１～５のいずれか一項に記載の人工ナノポア。
前記環形成タンパク質は、七量体タンパク質である、請求項１～７のいずれか一項に記載の人工ナノポア。
前記環形成七量体タンパク質は、ＴＭ領域を横切るポリヌクレオチドの輸送を制御する、請求項８に記載の人工ナノポア。
前記七量体タンパク質は、ＡＴＰアーゼ、好ましくはＡ．アエオリカスＡＴＰアーゼまたはその相同体もしくは機能的同等物である、請求項９に記載の人工ナノポア。
前記環形成七量体タンパク質は、ＴＭ領域を横切るポリペプチドの輸送を制御する、請求項８に記載の人工ナノポア。
前記七量体タンパク質は、プロテアソーム活性化因子ＰＡ２８、ＰＡ２６、またはそれらの相同体もしくは機能的同等物である、請求項１１に記載の人工ナノポア。
ＴＭ配列を含む前記環形成タンパク質の前記サブユニットのＣ－末端は、プロテアソームα－サブユニットのＮ－末端に遺伝的に融合している、請求項１～１２のいずれか一項に記載の人工ナノポア。
ＴＭ配列を含む前記環形成タンパク質の前記サブユニットのＮ－末端は、Ｃｌｐプロテアーゼ（ＣｌｐＰ）サブユニットのＣ－末端に遺伝的に融合している、請求項１～１２のいずれか一項に記載の人工ナノポア。
（ｉ）請求項１～１４のいずれか一項に記載の人工ナノポア、（ｉｉ）プロテアソームα－サブユニットから構成される１個または２個の環、および任意で（ｉｉｉ）プロテアソームβ－サブユニットから構成される１個または２個の環を含む、マルチ－タンパク質ナノポアセンサー複合体。
前記プロテアソームα－サブユニットは、そのＮ－末端で少なくとも５個のアミノ酸が欠落している、請求項１５に記載のマルチ－タンパク質ナノポアセンサー複合体。
プロテアソームβ－サブユニットから構成される前記環が、固有のタイプのプロテアーゼ活性を提供するように操作されている、請求項１５または１６に記載のマルチ－タンパク質ナノポアセンサー複合体。
前記ナノポアセンサー複合体を介して、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを、順次的に結合、展開、および移動させることができるタンパク質トランスロカーゼをさらに含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のマルチ－タンパク質ナノポアセンサー複合体。
前記タンパク質トランスロカーゼは、ＮＴＰ－駆動アンフォールダーゼ、好ましくはＡＡＡ＋アンフォールダーゼであり、より好ましくは、前記タンパク質トランスロカーゼは、ＣｌｐＸ、ＶＡＴ、ＰＡＮ、ＡＭＡ、８５４、ＭＢＡおよびＳＡＭＰから選択される、請求項１８に記載のマルチ－タンパク質ナノポアセンサー複合体。
流体チャンバーをシス側とトランス側とに分離している疎水性の膜を含み、前記膜は、請求項１～１４のいずれか一項に記載の人工ナノポア、または請求項１５～１９のいずれか一項に記載のマルチ－タンパク質ナノポアセンサー複合体を含む、分析システム。
好ましくは生体高分子の同定および／または配列決定のため、より好ましくは単分子ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列決定のため、請求項２０に記載の分析システムのチャンバーに分析される生体高分子を加えること、および前記生体高分子を前記ポアに接触させることを含む、単分子分析のための方法。
単分子分析のための、好ましくは生体高分子の同定および／または配列決定のための、より好ましくは単分子ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列決定のための、請求項２０に記載の分析システムの使用。
請求項１～１４のいずれか一項に記載の人工ナノポアのサブユニットをコードする核酸分子。
請求項２３に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
プロテアソーム・ベータ－サブユニットおよび／またはプロテアソーム・アルファ－サブユニットをコードする固有の発現ベクターを任意でさらに含む、請求項２４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。