JP2019525911A - 長寿命アルファ溶血素ナノポア - Google Patents
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Abstract
Description
[0002]溶血素は、非常に多様な生物によって産生されるタンパク質毒素ファミリーのメンバーである。いくつかの溶血素、例えばアルファ溶血素は、膜中に孔またはチャネルを形成することによって、細胞膜(例えば宿主細胞膜)の完全性を破壊しうる。孔形成タンパク質によって膜中に形成される孔またはチャネルを用いて、膜の片側から反対側に、特定のポリマー(例えばポリペプチドまたはポリヌクレオチド)を輸送することも可能である。
[0006]本明細書に提供するのは、ナノポアに取り込まれた際、DNA配列決定反応中のナノポアの寿命を改善する突然変異体ブドウ球菌アルファ溶血素(αHL)ポリペプチドである。例えば、本明細書記載の1またはそれより多い変異体を含むナノポアは、野生型アルファ溶血素からなるナノポアよりも、より長く持続し、そしてしたがってより多くの配列決定データを提供する。
[0025]本明細書に提供する見出しは、本発明の多様な側面または態様の限定ではなく、こうした側面または態様は、本明細書を全体として参照することによって得られうる。したがって、直後に定義する用語は、本明細書を全体として参照することによって、より完全に定義される。
[0026]アルファ溶血素:本明細書において、「アルファ溶血素」、「α−溶血素」、「a−HL」および「α−HL」は、交換可能に用いられ、そして七量体の水充填膜貫通チャネル(すなわちナノポア)に自己集合する単量体タンパク質を指す。文脈に応じて、該用語はまた、7つの単量体タンパク質によって形成される膜貫通チャネルを指すことも可能である。
[0044]変異体:本明細書において、用語「変異体」は、親タンパク質に比較した際、改変された特性、例えば改変されたイオン電導度を示す修飾タンパク質を指す。
[0048]パーセント相同性:用語「%相同性」は、本明細書において、本明細書の用語「%同一性」と交換可能に用いられ、そして配列整列プログラムを用いて整列された際、本発明のポリペプチドのいずれか1つをコードする核酸配列または本発明のポリペプチドのアミノ酸配列間の核酸またはアミノ酸配列同一性の度合いを指す。例えば、本明細書において、80%相同性は、定義されるアルゴリズムによって決定される80%配列同一性と同じことを意味し、そしてしたがって、所定の配列の相同体は、所定の配列の全長に渡って、80%より高い配列同一性を有する。配列同一性の例示的レベルには、限定されるわけではないが、所定の配列、例えば本明細書に記載するような、本発明のポリペプチドの任意の1つに関するコード配列に対する、80、85、90、95、98%またはそれより高い配列同一性が含まれる。
[0052]本明細書および請求項において、アミノ酸残基の慣用的な1文字および3文字暗号を用いる。
Glu111AsnまたはE111N
と示される。
多数の突然変異は、プラス記号によって分離され、例えば:
His35Gly+Glu111AsnまたはH35G+E111N
は、それぞれ、ヒスチジンに対してグリシンおよびグルタミン酸に対してアスパラギンを置換する、35位および149位の突然変異を示す。アミノ酸置換のスパンおよび/または残基のスパンは、ダッシュ記号によって示され、例えば残基126から131のグリシンのスパンは:126−131Glyまたは126−131Gである。特異的置換における変動は、フォワードスラッシュによって示される。例えば、E111N/E111Sは、111位のE残基が、それぞれ、N残基またはS残基のいずれに置換されてもよいことを意味する。
[0054]黄色ブドウ球菌アルファ溶血素野生型配列は、本明細書に提供され(配列番号1、核酸コード領域;配列番号14、タンパク質配列)そして別の箇所で入手可能である(National Center for BioinformaticsまたはGenBank寄託番号M90536およびAAA26598)。
アルファ溶血素変異体
[0057]本明細書に提供するアルファ溶血素には、核酸配列決定反応中、変異体を取り込んだナノポアが、安定な開口チャネルを伴い、改善されたナノポア寿命を有する、特定の置換、あるいは1またはそれより多い組み合わせの置換が含まれる。ナノポア寿命を改善することによって、こうした長寿命ナノポアを用いた配列決定反応は、より長い配列決定反応の経過に渡って、より安定な配列決定データを生成可能である。
E111N+126−131G+H144A+K147N;
H35G+E111N+H144A+K147N;
H35G+E111N+M113A+126−131G+H144A+K147N;
E111N+M113A+127−131G+K147N;または
E111S+M113S+T145S+K147S+L135I。
[0066]α−溶血素変異体には、本明細書に記載するような置換の多様な組み合わせが含まれてもよいが、特定の例示的態様において、α−溶血素変異体には、通過時間を改善するための置換の特定の組み合わせが含まれる。例えば、α−溶血素変異体には、配列番号14に示す配列のアミノ酸置換の以下の組み合わせが含まれてもよい:
H35G+V149K;
V149K+E287R+H35G;
V149K+E287R;
T109K+H35G;
P151K+H35G;
V149K+P151K+H35G;
T109K+V149K+H35G;
V149K+K147N+E111N+127−131G+M113A+H35G;
V149K+K147N+E111N+127−131G+M113A;または、
T109K+V149K+P151K+H35G。
[0072]本明細書記載のアルファ溶血素ペプチドは、多量体タンパク質集合体(すなわちナノポア)に組み立て可能である。したがって、生じるナノポアには、複数のアルファ溶血素サブユニットが含まれるであろう。例えば、七量体アルファ溶血素ナノポアには7つのサブユニットが含まれる。
100Pm=100[n!/m!(n−m)!]・fmut m・fwt n−m、式中、
Pm=mの数の突然変異体サブユニットを有する孔の可能性
n=サブユニット総数(例えばaHLに関して7)
m=「突然変異体」サブユニットの数
fmut=ともに混合された突然変異体サブユニットの割合または比
fwt=ともに混合された野生型サブユニットの割合または比
[0081]該方法は、第一のサブユニット対第二のサブユニットを有するタンパク質2725の第二の比を濃縮するため、複数のタンパク質を分画する工程をさらに含んでもよい。例えば、1つのそして1つのみの修飾サブユニット(例えば1:6の第二の比)を有するナノポアタンパク質を単離してもよい。しかし、任意の第二の比が適切である。第二の比の分布はまた、例えば、1または2のいずれかの修飾サブユニットを有するタンパク質を濃縮するよう分画されてもよい。タンパク質を形成するサブユニットの総数は、WO2014/074727の図27に示されるように、常に7というわけではない(例えば異なるナノポアを用いてもよいし、または6つのサブユニットを有するアルファ溶血素ナノポアを形成してもよい)。いくつかの態様において、1つの修飾サブユニットのみを有するタンパク質を濃縮する。こうした場合、第二の比は、(n−1)の第一のサブユニットあたり1つの第二のサブユニットであり、式中、nはタンパク質を構成するサブユニットの数である。
[0086]本明細書に記載するように、ポリメラーゼ(例えばDNAポリメラーゼ)をナノポアに付着させ、そして/またはその近傍に配置する。DNA合成反応中にDNAを合成可能な任意のDNAポリメラーゼを、本明細書記載の方法および組成物にしたがって用いてもよい。例示的なDNAポリメラーゼには、限定されるわけではないが、ファイ29(バチルス属(Bacillus)バクテリオファージφ29)、pоl6(クロストリジウム属(Clostridium)ファージ・ファイCPV4;GenBank:AFH27113.1)またはpоl7(アクチノミセス属(Actinomyces)ファージAv−1;GenBank:ABR67671.1)が含まれる。特定の例示的態様において、ナノポア集合体に付着するのは、DNA操作または修飾酵素、例えばリガーゼ、ヌクレアーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、トランスフェラーゼ、またはトポイソメラーゼである。
[0100]本明細書記載のナノポアを、検出回路、例えば集積回路の検出電極に隣接して配置された膜中に形成するかまたは別の方式で包埋してもよい。集積回路は、特定用途向け集積回路(ASIC)であってもよい。いくつかの例において、集積回路は電界効果トランジスタまたは相補型金属酸化膜半導体(CMOS)である。検出回路は、チップまたはナノポアを有する他のデバイス中に配置されてもよいし、あるいはチップまたはデバイスから離れて、例えばオフチップ配置であってもよい。半導体は、限定されるわけではないが、IV族(例えばケイ素)およびIII−V族半導体(例えばガリウムヒ素)を含む、任意の半導体であってもよい。ヌクレオチドまたはタグを検出するための装置およびデバイスセットアップに関しては、例えばWO2013/123450を参照されたい。
発現および回収
[0107]本実施例は、細菌宿主細胞、例えば大腸菌(E. coli)からのタンパク質の発現および回収を例示する。
[0109]プラスミド構築。野生型または変異体α−溶血素のいずれかをコードする遺伝子を、T7プロモーターの調節下、pPR−IBA2プラスミド(IBA Life Sciences、ドイツ)内に挿入した。
実施例2
アルファ溶血素変異体
[0114]以下の実施例は、所望の残基での突然変異の導入を詳述する。
変異体を含むナノポアの組み立て
[0116]本実施例は、続くポリメラーゼ付着のためのSpyTag配列を有する1つのサブユニット(「α−HL変異体−SpyTag」サブユニット)およびSpyTagを含まない6つのα−HL変異体サブユニット(「α−HL変異体」サブユニット)を含む、1:6七量体ナノポアの組み立てを記載する。
ポリメラーゼの付着
[0126]本実施例は、ナノポアへのポリメラーゼの付着を提供する。
変異体の活性
[0130]本実施例は、実施例1〜4に提供されるようなナノポア(付着したポリメラーゼを含むナノポア)の活性を示す。
[0133]このアッセイは、ナノポアが、交流電圧、すなわち方形波の影響下で、脂質二重層中で適切に機能可能である時間を測定するように設計された。
[0137]このアッセイは、交流電圧、すなわち方形波を用いて、ナノポアに付着したDNAポリメラーゼによってタグ化分子が捕捉されるためにかかる時間を測定するように設計された。
[0142]引用リスト
特許文献
Claims (15)
- 配列番号14に示すアミノ酸配列のα−溶血素(α−HL)変異体であって、配列番号14に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%、90%、95%、98%、またはそれより高い配列同一性を有し、そして配列番号14のE111N/E111S、M113A/M113S、K147N/K147S、T145S、L135I、またはその組み合わせのいずれか1つに対応する位のアミノ酸置換を含む、前記α−溶血素変異体。
- 配列番号14に示すアミノ酸配列のH144Aに対応するアミノ酸置換をさらに含む、請求項1のα−溶血素変異体。
- 配列番号14に示すアミノ酸配列のH35Gに対応する置換をさらに含む、請求項1または2のα−溶血素変異体。
- 配列番号14に示すアミノ酸配列のアミノ酸127〜129に対応するポリG置換をさらに含む、請求項1〜3のいずれかのα−溶血素変異体。
- 配列番号14に示すアミノ酸配列のK131Gに対応する置換をさらに含む、請求項1〜4のいずれかのα−溶血素変異体。
- 配列番号14に示すアミノ酸配列のV149K、E287R、T109K、またはP151Kの任意の1つに対応する位、あるいはその組み合わせでのアミノ酸置換をさらに含む、請求項1〜5のいずれかのα−溶血素変異体。
- 配列番号17、18、19、20、または22に示す配列に対して、少なくとも80%、90%、95%、98%、またはそれより高い配列同一性を有する配列を有する、請求項1〜6のいずれか記載のα−溶血素変異体。
- 請求項1〜7のいずれか一項記載の少なくとも1つのα−溶血素(α−HL)変異体を含む、七量体ナノポア集合体。
- アルファ溶血素変異体の1つに結合しているDNAポリメラーゼをさらに含む、請求項8のいずれかの七量体ナノポア集合体。
- 変異体が、イソペプチド結合を通じてDNAポリメラーゼに結合している、請求項9の七量体ナノポア集合体。
- 天然アルファ溶血素からなるナノポア集合体に比較して、増加した寿命を有する、請求項9または10記載の七量体ナノポア集合体。
- 天然アルファ溶血素からなる七量体ナノポア集合体に比較して、寿命が、約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%またはそれより多く増加する、請求項11記載の七量体ナノポア集合体。
- ターゲット分子を検出するための方法であって:
(a)膜において、検出電極に隣接してまたはその近傍に配置される、請求項8〜12記載の七量体ナノポアを含むチップを提供し;
(b)該ナノポアを通じて核酸分子を導き、ここで該核酸分子はレポーター分子と会合し、該核酸分子はアドレス領域およびプローブ領域を含み、該レポーター分子は該プローブ領域で該核酸分子と会合し、そして該レポーター分子はターゲット分子とカップリングする;
(c)該核酸分子が該ナノポアを通じて導かれる間に、該アドレス領域を配列決定して、該アドレス領域の核酸配列を決定し;そして
(d)コンピュータプロセッサの補助で、(c)で決定した該アドレス領域の核酸配列に基づいて、該ターゲット分子を同定する
工程を含む、前記方法。 - 核酸配列決定のための七量体ナノポア集合体であって:
7つのアルファ溶血素単量体であって、各単量体が、配列番号17、18、19、20、または22に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%、90%、95%、98%、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単量体;
該7つのアルファ溶血素単量体の少なくとも1つに結合している、DNAポリメラーゼ
を含む;
該ナノポア集合体は、天然アルファ溶血素からなるナノポアに比較して、増加した寿命を有する、
前記ナノポア集合体。 - 配列番号17、18、19、20、または22に示すアミノ酸配列のV149K置換をさらに含み、該V149K置換が通過時間(Time−To−Thread)を減少させる、請求項14の七量体ナノポア集合体。
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