CN103267785B - 一种检测药物包裹或释放过程的单分子分析方法 - Google Patents
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Abstract
本专利公开了一种检测药物包裹或释放过程的单分子分析方法，本发明在电解池顺式加入α-溶血素蛋白质双突变体(M113F/K147N)7，双突变体(M113F/K147N)7插于脂双层形成蛋白质纳米单通道；在电解池反式依次加入环糊精和药物分子，记录加入药物分子前后单通道电流的变化，当在环糊精造成的电流阻塞基础上出现二次电流阻塞水平台即证明药物包裹体的形成。本发明可定量同时动态检测环糊精载体分子和药物分子，还可动态仿真模拟药物分子在体内的释放机理和作用机制。本专利方法简单、经济、分析速度快、灵敏度高、过程中无需标记和固定，不受生物大分子蛋白质、酶、DNA等的影响，具有良好的选择性。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测药物包裹或释放过程的单分子分析方法，属于单分子分析技术领域。
背景技术
环糊精分子呈环形笼状结构，外表面具有很强的亲水性，内部空腔具有很强的疏水性，这种特殊结构和性质使它在医药等领域具有广泛的应用，主要包括改善药物的水溶性，作为药物载体或赋型剂通过主-客体相互作用包裹疏水性药物分子等。客体药物活性分子能够通过疏水作用力、范德华力和氢键等嵌入β-环糊精疏水内腔，形成单分子包合体分子胶囊。因为大多数药物难溶于水，所以环糊精作为药物分子载体在临床医学上应用较广。目前，已经有大量的环糊精类药物包裹体问世，例如广谱抗菌剂甲氧苄氨嘧啶溶解度较低，且伴有苦味，这阻碍了其在临床医学应用方面的推广和研究，经β-环糊精包裹后有效地去除了苦味，改善了气味，并且溶解度显著增大。又例如α、β受体阻断剂卡维地洛(1-(9H-咔唑-4-氧基)-3-[2-(2-甲氧基苯氧基)乙基氨基]-2-丙醇)具有舒张血管的作用，可用于治疗肾功能不全、糖尿病患者的高血压等症状，但其溶解度低，严重影响了药效的发挥。卡维地洛/β-CD药物包裹体溶解度大幅增加，从而药效显著提高。
传统研究药物包裹或释放过程的方法主要采用紫外-可见分光光度法和荧光分光光度法。但上述方法灵敏度低，检测分析中易受光散射等因素的影响，只能在宏观层面上研究药物的包裹或释放，分析速度慢，药物包裹体的制备、表征以及药物释放动力学的研究所需时间较长，不能对环糊精和药物分子同时进行原位实时分析，检测范围小，受限于药物分子的光学吸收特征，因此急需发展一种单分子水平的检测手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测灵敏度高，并可对药物分子同时进行原位实时分析的检测药物包裹或释放过程的单分子分析方法，可动态仿真模拟药物在体内的释放机理和作用机制。
本发明的实现过程如下：
一种检测药物包裹或释放过程的单分子分析方法，包括以下步骤：
（1）在电解池顺式加入α-溶血素蛋白质双突变体(M113F/K147N)7，双突变体(M113F/K147N)7插于脂双层形成蛋白质纳米单通道；
（2）在电解池反式依次加入环糊精和药物分子，记录加入药物分子前后单通道电流的变化，当在环糊精造成的电流阻塞基础上出现二次电流阻塞水平台即证明药物包裹体的形成，电流变化呈三态P-Drug、P-βCD和P-βCD-Drug。
一种检测药物包裹或释放过程的单分子分析方法，包括以下步骤：
（1）在电解池顺式加入α-溶血素蛋白质双突变体(M113F/K147N)7，双突变体(M113F/K147N)7插于脂双层形成蛋白质纳米单通道；
（2）在电解池反式加入环糊精药物包裹体，记录蛋白质纳米单通道电流的变化，当环糊精药物包裹体释放的自由药物分子和环糊精分子在蛋白质纳米单通道内发生单分子键合再次形成环糊精药物包裹体时，单通道电流出现二次电流阻塞水平台即证明药物包裹体的再次形成，电流变化呈三态P-Drug、P-βCD和P-βCD-Drug。
根据上述方法，可将天然α-溶血素蛋白质双突变体(M113F/K147N)7用于药物分子包裹或释放过程的原位动力学过程分析以及用于药物分子包裹或释放过程机理研究，所述的药物分子包括合成药物或天然药物、气味剂、食品添加剂或化妆品成份。
天然α-溶血素纳米通道传感器对环糊精分子以及奥美拉唑和盐酸阿霉素等无响应或响应很弱，为此本发明设计并制备了113位和147位的双突变体(M113F/K147N)7纳米通道传感器(蛋氨酸M突变为苯丙氨酸F，赖氨酸K突变为天冬氨酸N，见图1)。双突变不仅可极大地增强环糊精分子在纳米通道中的键合和药物分子在纳米通道中的直接键合，且允许自由药物分子、β环糊精分子和药物/环糊精复合物的同时检测，可方便地实现单分子水平药物包裹和释放过程的动力学研究。
本发明的创新点和积极效果为：
（1）本发明检测环糊精/药物体系的方法是单分子方法，与现有基于宏观层面分子聚集行为的药物检测方法(如紫外-可见分光光度法，荧光分光光度法等)不同，具有很高的检测灵敏度；
（2）本发明可同时检测环糊精载体和药物分子二者及其动态变化，这是其它技术很难达到的；
（3）基因工程化制备的蛋白质纳米通道传感器可显著增强环糊精分子和药物分子在其中的键合，从而有灵敏的检测信号；
（4）在本发明的蛋白质纳米通道分析中，环糊精能够键合在蛋白质通道中，同时药物分子可键合在蛋白质通道或环糊精/蛋白质通道中，但环糊精/药物包裹体不能直接进入蛋白质通道，这一过程与环糊精/药物在体内的过程相同。因此本发明的分析检测过程可动态仿真模拟相关药物在体内的释放机理和作用机制；
（5）本发明不受体内生物大分子蛋白质、酶、DNA和其它物质的影响，具有良好的选择性；
（6）本发明不依赖药物分子光学等性质(如紫外可见吸收，荧光性等)，具有较大的广普适用性；
（7）本发明方法简单、经济，分析速度快，研究分析过程中无需药物的标记和固定。
附图说明
图1是功能化蛋白质(M113F/K147N)7的结构示意图；
图2是包裹及释放过程中环糊精和药物分子的单分子检测原理示意图：
P代表蛋白质纳米通道；药物的包裹及释放过程(图2A)；β-环糊精与蛋白纳米通道的键合模式(图2B-a)；药物分子与蛋白纳米通道的键合模式(图2B-b)；β-环糊精和药物分子共同存在下与蛋白纳米通道的键合模式(图2B-c)；药物包裹体与纳米通道的键合模式(图2B-d)；
图3是药物分子与病理组织的作用框图：a.游离药物分子(活性药物分子)可自由进入病理组织；b.药物包裹体到达病理组织表面释放活性药物分子，然后进入病理组织；c.药物包裹体是非活性分子，不能直接进入病理组织；
图4是蛋白纳米传感器对药物分子和βCD的响应：a.蛋白质纳米通道对βCD、Dox和βCD-Dox响应的I-t曲线；b.蛋白质纳米通道对βCD、Omeprazol和βCD-Omeprazol响应的I-t曲线；
图5是稀释效应导致药物分子从环糊精-药物包裹体系的释放：图中展示为三种稀释浓度药物包裹体的I-t曲线，每种浓度的检测记录时间均为1s。
具体实施方式
以下实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例所涉及的仪器为单分子电子检测系统(主要包括Axon200B放大器，数-模转化器和函数发生器)。
本发明涉及的蛋白质纳米通道传感器是一种单分子分析技术，它已经应用于无机离子、有机小分子、DNA、RNA、蛋白质和高分子聚合物等检测，还应用于DNA测序和化学反应研究等。然而在药物包裹和控制释放动力学研究方面未见报道，本发明实施例以奥美拉唑和盐酸阿霉素为代表性药物，β-环糊精为药物载体，设计并制备了新的蛋白质纳米通道传感器并应用于药物包裹体(药物/β-环糊精分子胶囊)的形成和释放过程动力学分析。
环糊精和药物分子的单分子检测：包裹及释放过程中环糊精和药物分子的单分子检测原理见图2。图2A展示了药物的包裹过程和释放过程。增加环糊精和药物分子浓度(浓缩环糊精和药物分子)导致更多的环糊精-药物分子复合物(药物分子胶囊)的形成。相反，稀释效应导致药物分子的释放。图2B-a和2B-b是环糊精和药物分子分别存在下的键合模式和检测信号；在环糊精和药物分子同时存在下(图2B-c)，蛋白质通道的键合呈现三态(P-Drug，P-βCD和P-βCD-Drug，P表示蛋白纳米通道，βCD表示β环糊精，Drug表示药物分子)；然而溶液中的βCD-Drug复合物不能直接进入蛋白质纳米通道(图2B-d)。本发明通过功能化蛋白质纳米通道(M113F/K147N)7对上述原理的实施，可实现在单分子水平检测药物/β-环糊精包裹体的形成和释放过程动力学。
医学研究普遍认为，在体内生物可降解的天然多糖分子环糊精是非活性成分，药物分子是活性成分，环糊精/药物包裹体是非活性成分。当环糊精/药物包裹体到达病理组织时，释放活性药物分子，而环糊精/药物包裹体不能直接进入病理组织(图3)。如果活性药物分子能够到达病理组织表面，便可自由进入病理组织(框图a)；然而药物包裹体无法直接进入病理组织(框图c)；通常环糊精药物包裹体键合在病理组织表面释放药物分子，随后药物分子进入病理组织(框图b)。本发明中药物包裹体不能进入纳米通道，只有当药物包裹体将药物分子释放，自由的药物分子和环糊精分子才能竞争键合在纳米通道中，然后药物分子可能进一步在通道中与环糊精分子发生单分子键合，因此可同时测定游离的药物分子和环糊精分子，实现药物分子释放过程的动力学检测。本发明的分析检测过程可动态仿真模拟相关药物在体内的释放机理和作用机制。
蛋白质双突变体(M113F/K147N)7的制备：突变的α-HL基因由已组建的α-HLT7基因(PT7-α-HL-RL2)通过盒式诱变获得。首先，pT7-αHL-RL2经限制性内切酶AflII和XhoI消化，得到的小片段由5’TTAATTATGTTCAACCTGATTTCAAAACAATTC和5’TCGAGAATTGTTTTGAAATCAGGTTGAACATAA制备的双链DNA取代，从而得到单突变体pT7-αHL-K147N。然后，pT7-αHL-K147N经限制性内切酶HpaI和HindIII消化，得到的小片段插入经相同的酶切割所得的pT7-αHL-M113F中，从而得到双突变体αHL-M113F/K147N。所得双突变单体经离子交换色谱法进行纯化，然后用兔血红细胞膜对其进行组装，最后七聚体用SDS聚丙烯酰胺凝胶进行纯化，从而得到蛋白质双突变体(M113F/K147N)7。
本发明以代表性药物奥美拉唑和盐酸阿霉素为实施例，说明环糊精包裹过程中药物和环糊精分子的同时检测过程。双突变蛋白质加于电解池顺式端(零电位接地端)，待单通道形成后加环糊精和药物分子在反式端(施加电位端)，记录单通道电流的变化。如图4所示，在pH=7.4的10mMPBS(含1MKCl)缓冲液中，+40mV电压下单通道电流为30pA。在β-CD(40μM)和药物分子(40μM)存在下，通道电流呈现不同电流的四态：I P=30pA；I P-β-CD=14.5pA；I P-Dox=5pA，I P-Omeprazol=8pA；I P-βCD-Dox=19.5pA和I P-βCD-Omeprazol=22.5pA。P为蛋白纳米通道；P-βCD为蛋白纳米通道与βCD的键合；P-Omeprazol和P-Dox为蛋白纳米通道与药物分子的键合；P-βCD-Omeprazol和P-βCD-Dox为蛋白纳米通道-βCD-药物分子三者的键合。药物分子可直接键合于纳米通道中(P-药物分子)，同时βCD也可竞争键合于纳米通道中(P-βCD)，并进一步与药物分子通过主-客体作用形成单分子P-βCD-药物复合物，其相应的形成常数分别为K f(P-Omeprazol)=6.6×104[M-1]，K f(P-βCD)=1.0×105[M-1]，K f(P-βCD-Omeprazol)=6.0×103[M-1]；K f(P-Dox)=9.3×104[M-1]，K f(P-βCD)=1.2×105[M-1]，K f(P-βCD-Dox)=5.8×103[M-1]。在溶液中，环糊精和药物分子能够主-客体键合形成药物胶囊，同时药物复合物可以离解释放药物分子，在一定条件下这种键合和离解处于一种平衡状态，溶液中有三种化合物状态存在，据此可对药物包裹体形成动力学过程进行研究。
稀释效应可导致药物从环糊精分子中的释放，本发明以代表性药物奥美拉唑和盐酸阿霉素为例，使用双突变蛋白质(M113F/K147N)7传感器实施对药物释放过程的动力学检测(结果见图5)。从图5的数据分析结果(表1)可见，随药物包裹体浓度降低，τ on值和K on减小，而τ off和K off基本不变，因此在通道中复合物形成常数K f增大，即相同时间内蛋白质-环糊精纳米通道检测到的P-βCD-Drug事件数增加(ν[counts/s]=K on×[c])。这一结果说明溶液中的游离的药物分子浓度增加，即稀释效应导致了更多的药物分子被释放。
Claims (5)
1.一种检测药物包裹或释放过程的单分子分析方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）在电解池顺式加入α-溶血素蛋白质双突变体(M113F/K147N)7，双突变体(M113F/K147N)7插于脂双层形成蛋白质纳米单通道；
蛋白质双突变体(M113F/K147N)7的制备：突变的α-HL基因由已组建的α-HLT7基因(PT7-α-HL-RL2)通过盒式诱变获得；首先，pT7-αHL-RL2经限制性内切酶AflII和XhoI消化，得到的小片段由5’TTAATTATGTTCAACCTGATTTCAAAACAATTC和5’TCGAGAATTGTTTTGAAATCAGGTTGAACATAA制备的双链DNA取代，从而得到单突变体pT7-αHL-K147N；然后，pT7-αHL-K147N经限制性内切酶HpaI和HindIII消化，得到的小片段插入经相同的酶切割所得的pT7-αHL-M113F中，从而得到双突变体αHL-M113F/K147N；所得双突变单体经离子交换色谱法进行纯化，然后用兔血红细胞膜对其进行组装，最后七聚体用SDS聚丙烯酰胺凝胶进行纯化，从而得到蛋白质双突变体(M113F/K147N)7；
（2）在电解池反式依次加入环糊精和药物分子，记录加入药物分子前后单通道电流的变化，当在环糊精造成的电流阻塞基础上出现二次电流阻塞水平台即证明药物包裹体的形成，电流变化呈三态P-Drug、P-βCD和P-βCD-Drug。
2.一种检测药物包裹或释放过程的单分子分析方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）在电解池顺式加入α-溶血素蛋白质双突变体(M113F/K147N)7，双突变体(M113F/K147N)7插于脂双层形成蛋白质纳米单通道；
蛋白质双突变体(M113F/K147N)7的制备：突变的α-HL基因由已组建的α-HLT7基因(PT7-α-HL-RL2)通过盒式诱变获得；首先，pT7-αHL-RL2经限制性内切酶AflII和XhoI消化，得到的小片段由5’TTAATTATGTTCAACCTGATTTCAAAACAATTC和5’TCGAGAATTGTTTTGAAATCAGGTTGAACATAA制备的双链DNA取代，从而得到单突变体pT7-αHL-K147N；然后，pT7-αHL-K147N经限制性内切酶HpaI和HindIII消化，得到的小片段插入经相同的酶切割所得的pT7-αHL-M113F中，从而得到双突变体αHL-M113F/K147N；所得双突变单体经离子交换色谱法进行纯化，然后用兔血红细胞膜对其进行组装，最后七聚体用SDS聚丙烯酰胺凝胶进行纯化，从而得到蛋白质双突变体(M113F/K147N)7；
（2）在电解池反式加入环糊精药物包裹体，记录蛋白质纳米单通道电流的变化，当环糊精药物包裹体释放的自由药物分子和环糊精分子在蛋白质纳米单通道内发生单分子键合再次形成环糊精药物包裹体时，单通道电流出现二次电流阻塞水平台即证明药物包裹体的再次形成，电流变化呈三态P-Drug、P-βCD和P-βCD-Drug。
3.根据权利要求1或2所述的检测药物包裹或释放过程的单分子分析方法，其特征在于：天然α-溶血素蛋白质双突变体(M113F/K147N)7用于药物分子包裹或释放过程的原位动力学过程分析。
4.根据权利要求1或2所述的检测药物包裹或释放过程的单分子分析方法，其特征在于：
将α-溶血素蛋白质双突变体(M113F/K147N)7用于药物分子包裹或释放过程机理研究。
5.根据权利要求1或2所述的检测药物包裹或释放过程的单分子分析方法，其特征在于：所述的药物分子包括合成药物或天然药物、气味剂、食品添加剂或化妆品成份。
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