JP2022046503A - 修飾ナノポア、それを含む組成物およびその使用 - Google Patents

修飾ナノポア、それを含む組成物およびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】低いまたは生理学的イオン強度で、標的の負に荷電した分子またはポリマーの効率的な捕捉および／または移行を可能にするナノポア、それを含む組成物およびその使用を提供する。【解決手段】ｃｉｓ開口部、中間部、およびｔｒａｎｓ開口部を含む修飾ＣｌｙＡナノポアであって、前記ｃｉｓ開口部の内部表面は第１の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記中間部の内部表面は第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記ｔｒａｎｓ開口部は負に帯電したくびれを含む、修飾ＣｌｙＡナノポアを提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１５年１２月８日に出願された米国仮出願第６２／２６４，７０９号
の米国特許法第１１９（ｅ）条に基づく利益を主張し、この仮出願の内容は、その全体が
参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書では、細胞溶解素Ａ（ＣｌｙＡ）の修飾または変異形態およびそれを含む組成
物が提供される。例えば、標的分析物、例えば標的ポリヌクレオチドを特徴付けるために
ＣｌｙＡの修飾または変異形態および組成物を使用するための方法も提供される。
膜貫通ポア（例えば、ナノポア）は、低分子または折り畳まれたタンパク質を同定する
ために、および単分子レベルで化学的または酵素的反応をモニターするために使用されて
きた。人工膜に再構成されたナノポアを横切るＤＮＡの電気泳動的移行は、ＤＮＡシーケ
ンシングおよびバイオマーカー認識などの実用的用途のために大きな期待が持たれている
。しかしながら、負に荷電したアミノ酸に面する内部表面を有するナノポアを通じた二本
鎖または一本鎖ＤＮＡの移行は非効率的である。特に、負の内部表面電荷および溶液のデ
バイ長に匹敵する半径を有するナノポアにおいて、内側ナノポア壁上の電気二重層（ＥＤ
Ｌ）によって生じる表面電位が重なり、ナノポアへのＤＮＡの進入に対して大きな静電障
壁をもたらす。結果として、そのようなナノポアを横切るＤＮＡの移行は、大きなナノポ
ア（例えば、１０ｎｍ）を使用してまたは高イオン強度溶液もしくは非対称塩濃度下で小
さいナノポア（例えば、約３．５ｎｍ）を使用して観察されたにすぎない。
本開示は、ある特定のタンパク質ナノポア、例えば細胞溶解素Ａ（ＣｌｙＡ）ナノポア
が、負に荷電した狭いくびれ（または移行を阻害するかもしくはその効率を減少させる領
域）を有する一方、そのような負に荷電した狭いくびれを有するタンパク質ナノポアを通
じた負に荷電した分子またはポリマー（例えば、二本鎖または一本鎖ＤＮＡ）の低イオン
強度溶液での捕捉および移行を、正電荷、例えば、正に荷電したアミノ酸（例えば、アル
ギニン）をタンパク質ナノポア（例えば、ＣｌｙＡナノポア）の内腔表面内に導入してナ
ノポア内に負に荷電した分子またはポリマー（例えば、二本鎖または一本鎖ＤＮＡ）を捕
捉または配向させることによって、上手く達成することができるという、予期されなかっ
た発見に少なくとも部分的に基づく。例えば、正電荷、例えば正に荷電したアミノ酸（例
えば、アルギニン）を、負に荷電した狭いくびれを有するタンパク質ナノポア（例えば、
ＣｌｙＡナノポア）の内腔表面に、開口部（例えば、負に荷電した分子またはポリマーの
進入のための開口部）の近傍および中間部内で導入してもよい。
ある特定の例では、平面脂質二重層における有利な特性のために選択した改変ＣｌｙＡ
バージョンであるＣｌｙＡ－ＡＳを使用して、本明細書に記載される修飾ＣｌｙＡナノポ
アを作製した。ＣｌｙＡ－ＡＳの内部電荷を再配置して、生理学的イオン強度でのナノポ
アによるＤＮＡの捕捉を誘導した。例えば、修飾ＣｌｙＡナノポアは、ｃｉｓ開口部、中
間部、およびｔｒａｎｓ開口部を含み、ここでｃｉｓ開口部の内部表面は第１の正に荷電
したアミノ酸の置換を含み、中間部の内部表面は第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含
み、ｔｒａｎｓ開口部は負に帯電したくびれを含む。一部の例では、第１の正に荷電した
アミノ酸の置換（例えば、アルギニンによる置換）はｃｉｓ開口部に配置され、修飾Ｃｌ
ｙＡナノポアへのＤＮＡの捕捉を可能にしてもよく、および／または第２の正に荷電した
アミノ酸の置換（例えば、アルギニンによる置換）は中間部に配置され、修飾ＣｌｙＡナ
ノポアを通じたＤＮＡの移行を可能にしてもよい。例えば、第１の正に荷電したアミノ酸
の置換は、ＣｌｙＡ－ＡＳのアミノ酸配列のＳ１１０Ｒ変異に対応してもよく、および／
または第２の正に荷電したアミノ酸の置換は、ＣｌｙＡ－ＡＳのアミノ酸配列のＤ６４Ｒ
変異に対応してもよい。
したがって、本開示の一態様は、例えば、修飾ＣｌｙＡナノポアへの負に荷電したポリ
マーの捕捉、および／または修飾ＣｌｙＡナノポアを通じた負に荷電したポリマーの移行
を可能にする、修飾ＣｌｙＡナノポアを特色とする。修飾ＣｌｙＡナノポアは、第１の開
口部と、中間部と、第２の開口部と、第１の開口部から中間部を通じて第２の開口部に延
びる内腔とを含み、ここで第１の開口部の内腔表面は第１の正電荷修飾（例えば、第１の
正に荷電したアミノ酸の置換）を含み、中間部の内腔表面は第２の正電荷修飾（例えば、
第２の正に荷電したアミノ酸の置換）を含む。第２の開口部の内腔表面は負に帯電したく
びれを画定する。
本明細書に記載のいずれかの修飾ＣｌｙＡナノポアでは、第１の正電荷修飾（例えば、
第１の正に荷電したアミノ酸の置換）から第２の正電荷修飾（例えば、第２の正に荷電し
たアミノ酸の置換）までの内腔内の距離は、約０．５ｎｍから約１０ｎｍの範囲内で変動
しうる。一部の実施形態では、第１の正電荷修飾（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸
の置換）から第１の開口部表面までの内腔内の距離は、約３ｎｍから約７ｎｍの範囲内で
変動しうる。
任意の形態のＣｌｙＡを、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアを製造するために使
用することができる。例えば、野生型ＣｌｙＡ（ＣｌｙＡ－ＷＴ）およびＣｌｙＡ－ＡＳ
のアミノ酸配列ならびにそれをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である
。したがって、一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアは、野生型ＣｌｙＡに対応す
る配列番号１に示すアミノ酸配列と、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％
、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上など）同一であるアミノ酸配
列を有するサブユニットポリペプチドを含みうる。代替的に、修飾ＣｌｙＡナノポアは、
ＣｌｙＡ－ＡＳに対応する配列番号２に示すアミノ酸配列と、少なくとも約８０％（例え
ば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上など
）同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含みうる。一部の実施形
態では、修飾ＣｌｙＡナノポアは、配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列と比
較して、第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含む、最大１５個の置換を含み
うる。
本明細書に記載のいずれかの修飾ＣｌｙＡナノポアでは、第１の正電荷修飾（例えば、
第１の正に荷電したアミノ酸の置換）は、第１の開口部に曝露された溶液内の負に荷電し
たポリマー（例えば、限定されないが、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡなどのデオキシ
リボ核酸（ＤＮＡ））の捕捉を可能にするように、第１の開口部に配置されてもよい。例
えば、正電荷（例えば、正に荷電したアミノ酸）による置換は、次の位置：配列番号１ま
たは配列番号２のＥ１０６、Ｄ１１４、Ｄ１２１、Ｄ１２２、Ｅ１２９、Ｅ８５、Ｅ７８
、Ｄ２６８、Ｄ２６７、Ｄ２６５、Ｅ２５８の１つまたは複数で行われてもよい。
本明細書に記載のいずれかの修飾ＣｌｙＡナノポアでは、第２の正電荷修飾（例えば、
第２の正に荷電したアミノ酸の置換）は、ポアの内腔を通じた負に荷電したポリマー（例
えば、限定されないが、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡなどのデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ））の移行を可能にするように、中間部に配置されてもよい。例えば、正電荷（例えば
、正に荷電したアミノ酸）による置換は、次の位置：配列番号１または配列番号２のＤ７
４、Ｄ７１、Ｄ６４、Ｅ５３、Ｅ１６１、Ｄ１５８、Ｅ４６、Ｅ４２、Ｄ４１の１つまた
は複数で行われてもよい。
第１と第２の正電荷修飾（例えば、第１と第２の正に荷電した置換）の間の距離は、好
ましくは、約０．５ｎｍから約１０ｎｍである。距離は、約３ｎｍから約７ｎｍの間であ
りうる。
修飾ＣｌｙＡナノポアは、ホモ多量体（例えば、ナノポア内の全てのサブユニットが同
じである）またはヘテロ多量体（例えば、少なくとも１つのサブユニットがナノポア内の
他のサブユニットと異なる）でありうる。修飾ＣｌｙＡナノポアは、標的ポリマー（例え
ば、ポリヌクレオチド）が通り抜けるのを可能にするために十分な内腔の大きさの形成を
充足する任意の数のサブユニットポリペプチドを含みうる。一部の実施形態では、修飾Ｃ
ｌｙＡナノポアは、１２個以上のサブユニットポリペプチド、例えば、１３個のサブユニ
ットポリペプチドおよび１４個のサブユニットポリペプチドを含んでもよく、ここでサブ
ユニットポリペプチドの少なくとも１つまたは複数は、本明細書に記載される第１および
第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含む。
第１および第２の正電荷修飾（例えば、第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換
）は、ナノポアの全てのサブユニットで行われてもよい。
したがって、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド、ならびに修飾ＣｌｙＡ
ナノポアサブユニットポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチ
ドも本明細書で提供される。例えば、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは
、配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列と、少なくとも約８０％（例えば、少
なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上など）同一
であるアミノ酸配列を含み、ここでアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２の１０
６～７８の範囲内の位置に第１の正電荷修飾（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸の置
換）を含み、配列番号１または配列番号２の４１～７４の範囲内の位置に第２の正電荷修
飾（例えば、第２の正に荷電したアミノ酸の置換）を含む。一例では、第１の正電荷修飾
（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸の置換）は、配列番号１もしくは配列番号２の１
１０位に配置されうる；および／または第２の正電荷修飾（例えば、第２の正に荷電した
アミノ酸の置換）は、配列番号１もしくは配列番号２の６４位に配置されうる。第１のお
よび／または第２の正に荷電したアミノ酸の置換の例としては、限定されないが、アルギ
ニン、ヒスチジンおよびリジンのうちの１つによる置換が挙げられる。
また、標的ポリマー、例えば標的ポリヌクレオチドなどの標的の負に荷電したポリマー
の特徴付けに使用するための組成物も本開示の範囲内に含まれる。組成物は、本明細書に
記載のいずれかの修飾ＣｌｙＡナノポアを含む。組成物は、修飾ＣｌｙＡナノポアが配置
される膜（例えば、人工膜）をさらに含んでもよい。組成物は、低イオン強度溶液、例え
ば、約１００ｍＭから約３００ｍＭまたは約１５０ｍＭから約３００ｍＭのイオン強度を
有する塩溶液をさらに含んでもよい。より一般的には、塩溶液は、約５０ｍＭから約１Ｍ
のイオン強度を有しうる。一部の実施形態では、組成物は、修飾ＣｌｙＡナノポアに任意
選択的に結合することができるポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含んでもよい。
本明細書に記載される修飾ＣｌｙＡナノポアおよび組成物は、様々なバイオセンサーま
たは分析物検出用途、限定されないがポリヌクレオチドシーケンシングのために使用する
ことができる。分析物は、タンパク質でありうる。一態様では、低イオン強度でＤＮＡを
移行する方法が本明細書に記載される。方法は、（ａ）低イオン強度溶液に、本明細書に
記載のいずれか１つの修飾ＣｌｙＡナノポアと膜（例えば、人工膜）とを供給するステッ
プであり、ここで修飾ＣｌｙＡナノポアは、修飾ＣｌｙＡナノポアのｃｉｓ開口部が低イ
オン強度溶液のｃｉｓ側に存在し、修飾ＣｌｙＡナノポアのｔｒａｎｓ開口部が低イオン
強度溶液のｔｒａｎｓ側に存在するように、膜に存在する、ステップと、（ｂ）低イオン
強度溶液のｃｉｓ側にＤＮＡを供給するステップと、（ｃ）ＤＮＡが、修飾ＣｌｙＡナノ
ポアを通じてｃｉｓ側からｔｒａｎｓ側へ移行するように、修飾ＣｌｙＡナノポアにわた
り電位を印加するステップとを含む。一例では、低イオン強度溶液は、約１５０ｍＭから
約３００ｍＭのイオン強度を有する塩溶液（例えば、塩化ナトリウム溶液）でありうる。
そのような方法は、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を特徴付けるため
に使用することができる。
したがって、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法も本明細書に提供される。方法は
、（ａ）低イオン強度溶液（例えば、約１５０ｍＭから約３００ｍＭの）に、本明細書に
記載のいずれか１つの修飾ＣｌｙＡナノポアと膜とを供給するステップであり、ここで修
飾ＣｌｙＡナノポアは膜に存在する、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の低イオン強度
溶液に標的ポリヌクレオチドを添加するステップと、（ｃ）ナノポアにわたり電位を印加
する間に、修飾ＣｌｙＡナノポアを流れるイオン流を測定するステップであり、ここでイ
オン流の測定は、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴の指標となる、ステップ
とを含む。本明細書に記載の方法を使用して決定することができる標的ポリヌクレオチド
の特徴の非限定的な例としては、（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリ
ヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌク
レオチドの二次構造、（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、およびそれ
による標的ポリヌクレオチドの特徴付け、ならびにそれらの任意の組合せが挙げられる。
本明細書に記載のいずれかの態様では、標的ポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡまたは
二本鎖ＤＮＡでありうる。
本明細書に記載のいずれかの態様では、方法は、ポリヌクレオチド結合タンパク質が標
的ポリヌクレオチドに結合し、修飾ＣｌｙＡナノポアを通じた標的ポリヌクレオチドの移
動を制御するように、ポリヌクレオチド結合タンパク質を低イオン強度溶液に添加するス
テップをさらに含むことができる。
本開示の１つまたは複数の実施形態の詳細は、下記の詳細な説明で示される。本開示の
他の特色または利点は、以下の図面およびいくつかの実施形態の詳細な説明、さらに添付
の特許請求の範囲から明らかである。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の態様をさらに実証するた
めに含まれ、本開示のある特定の態様は、本明細書に示される特定の実施形態の詳細な説
明と組み合わせてこれらの図面の１つまたは複数を参照することによって、より良く理解
することができる。
ＤＮＡ移行のためのＣｌｙＡナノポアの改変を示す図である。パネルＡ）大腸菌（E. coli）ＣｌｙＡ構造（ＰＤＢ：２ＷＣＤ、９０％配列同一性）からホモロジーモデリングによって構築した脂質二重層に埋め込まれたＣｌｙＡ－ＡＳおよびＣｌｙＡ－ＲＲナノポアの断面。内側ポア内腔は、表面描写で示され、「真空内（in vacuo）」静電に従って影を付している（濃い影は負の領域を示し、薄い影は正の領域を示す。Ｐｙｍｏｌ）。試験したアミノ酸置換は、ＣｌｙＡ－ＡＳに示している（左）。ＣｌｙＡ－ＲＲポアは、１１０位および６４位にプロテオマーごとに２個の追加のアルギニン残基を含有する（右）。パネルＢ）ＣｌｙＡ－ＡＳおよびＣｌｙＡ－ＲＲについての電流対電圧の関係。生理学的イオン強度で＋７０ｍＶでのＣｌｙＡ－ＲＲナノポアを通じたパネルＣ）ｓｓＤＮＡ（１ａ、１μＭ）および（パネルＤ）ｄｓＤＮＡ（１、１７０ｎＭ）移行。下の電流トレースは、ＤＮＡ移行イベントの規模を示す。電流信号は、２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用して１０ｋＨｚで取得した。緩衝液は、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５であり、温度は２２℃であった。 １５０ｍＭのＮａＣｌ溶液におけるＤＮＡロタキサン形成を示す図である。パネルＡ）ｄｓＤＮＡロタキサンは、ニュートラアビジン（１．２μＭ、モノマー）で複合体化したハイブリッドｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮＡスレッド１ａ／１ｃ（１．０μＭ）をｃｉｓコンパートメントへ添加することによって＋５０ｍＶで形成された。１ａ／１ｃは３１塩基一本鎖オーバーハングを５’に含有し、これを使用して、１ａ／１ｃのｓｓＤＮＡオーバーハングに相補的なビオチン化ｓｓＤＮＡ分子である１ｄ（１．０μＭ）とハイブリダイズさせた。したがって、ナノポア／ＤＮＡロタキサンは、１ａ／１ｃがナノポアを移行する場合にのみ形成される。ＤＮＡがＣｌｙＡの内腔を占めたとき、開口ポア電流は、正に印加された電位（ＩＲＥＳ＋５０＝８４±７、平均±Ｓ．Ｄ．、Ｎ＝３）で減少し、負に印加された電位（ＩＲＥＳ－５０＝１．１１±０．０６、平均±Ｓ．Ｄ．、Ｎ＝３）で増加した。パネルＢ）ｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡハイブリッドロタキサンは、＋５０ｍＶで、ニュートラアビジン（１．２μＭ、モノマー）で複合体化した５’ビオチン化ｓｓＤＮＡスレッド２ａ（１．０μＭ、黒線）を、ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアのｃｉｓコンパートメントへ添加することによって形成された。２ａの３’端と相補的であり、ニュートラアビジン（１．２μＭ、モノマー）と複合体化した第２の５’ビオチン化ｓｓＤＮＡ分子２ｂ（１．０μＭ）をｔｒａｎｓコンパートメントへ添加した。ロタキサン形成時に、－５０ｍＶへの印加電位の逆転により、電流増加が誘導され（ＩＲＥＳ－５０＝１．１６±０．０３、平均±Ｓ．Ｄ．、Ｎ＝３）、ハイブリッドｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡが構築されていることが示された。右側の電流トレースは、ロタキサン構成における遊離ＣｌｙＡ－ＲＲおよびＣｌｙＡ－ＲＲについての電圧関係（ＩＶ曲線）を示す。図２のパネルＡおよびＢにおける黒線および灰色線は、２つのロタキサンのＤＮＡ構成を示す。使用した緩衝液は、１５ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５であり、温度は２２℃であった。ＤＮＡ配列を表３に示す。 ＤＮＡ移行および通過のイオン強度依存性を示す図である。パネルＡ）ｄｓＤＮＡ（丸）およびｓｓＤＮＡ（三角）についての移行頻度のデバイ強度依存性。ｄｓＤＮＡ移行イベントの頻度は直線回帰（Ｒ２＝０．９８）に良くフィットしたが、ｓｓＤＮＡの頻度は直線回帰（Ｒ２＝０．７８）よりも単一指数回帰（Ｒ２＝０．９９）に良くフィットした。パネルＢ）ｄｓＤＮＡ（三角）およびニュートラアビジン：ｄｓＤＮＡ複合体（丸）封鎖の残留電流の、溶液デバイ長に対する依存性。線は直線回帰を表す。パネルＣ）ｓｓＤＮＡについてであること以外、パネルＢと同じ。パネルＤ）ＤＮＡ通過のイオン強度依存性。＋７０ｍＶの印加電位下で、ＣｌｙＡ－ＲＲのｃｉｓ側へのｓｓＤＮＡの最初の添加（１ａ、１μＭ）は、ＣｌｙＡ－ＲＲ開口ポア電流への高速電流封鎖を誘導した。その後のニュートラアビジンの添加（１．２μＭ、ｃｉｓ）は、１５０および３００ｍＭのＮａＣｌ溶液における長く続く電流封鎖を誘導し、これはおそらくｓｓＤＮＡの通過による。これは１Ｍの（またはより高い）ＮａＣｌ溶液では観察されず、封鎖は一過性のままであった。相補的（complimentary）ｓｓＤＮＡ（１ａ、１μＭ、ｃｉｓ）のさらなる添加は、全てのイオン強度でｄｓＤＮＡの通過による永続性封鎖を誘導した。それぞれの永続性ＤＮＡ捕捉イベントの後、電位を手動で－７０ｍＶへ逆転することによって開口ポアが再生した。開口ポア電流レベルを上回るおよび下回るスパイクは、電位逆転後の容量過渡を表す。電気的記録は１５ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。データは１０ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、２０μｓ（５０ｋＨｚ）サンプリングレートを使用して記録し、表７に示す。１５０ｍＭのＮａＣｌで、追加のデジタル２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを電流トレースに適用した。 ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアを通じた一方向性ＤＮＡ移行を示す図である。パネルＡ）１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液では、ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアのｃｉｓおよびｔｒａｎｓ側の両方への３μＭのｄｓＤＮＡ１の添加は、正に印加された電位下でのみ一過性の電流封鎖（灰色の垂直線）を誘導した。パネルＢ）１．０ＭのＮａＣｌ溶液では、ＤＮＡ封鎖は、両方の印加電位下で観察される。ＤＮＡ誘導封鎖は、灰色の垂直線として示す。印加電位は、２１秒間で＋７０から－７０ｍＶへ（パネルＡ）または＋１００から－１００ｍＶへ（パネルＢ）自動的に変化した。電気的記録は１５ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。データは２ｋＨｚ（パネルＡ）および１０ｋＨｚ（パネルＢ）ローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、１００μｓ（１０ｋＨｚ、パネルＡ）および５０ｋＨｚ（パネルＢ）のサンプリングレートを使用して記録した。 ＣｌｙＡナノポアを通じたｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ移行の機構を示す図である。パネルＡ）ｄｓＤＮＡ移行。（１）ｄｓＤＮＡは、最初にナノポアのｃｉｓ入り口で電荷と相互作用する。（２）ｄｓＤＮＡは、ナノポア内部に入り込み、そこで第２の改変電荷と相互作用する。両方の電荷が、負荷電ｔｒａｎｓ型くびれを通じた移行を生じさせるために、ＤＮＡを整列させるために重要である。その後、（３）ｄｓＤＮＡは移行することができ、その後、（４）ポアを出ることができる。パネルＢ）（１）ｃｉｓ入り口での追加的電荷は、ナノポアの内部へのＤＮＡの効率的な捕捉を媒介する。（２）ｓｓＤＮＡはおそらくコイル構造としてｃｉｓ内腔に入る。（３）ｔｒａｎｓ型くびれを移行するために、ｓｓＤＮＡは解け、その後、ナノポアの外で再コイル化する必要がある。（４）ＤＮＡはナノポアを出る。ＤＮＡ分子およびナノポアは所定の縮尺で描かれている。Ｒｇは、ｓｓＤＮＡの回転半径を示す。実験条件下で、ｄｓＤＮＡは剛性ロッドであり、ｓｓＤＮＡは約６ｎｍの回転半径を有するコイル構造である。 ０．１５ＭのＮａＣｌ溶液中のＣｌｙＡナノポアのｃｉｓ側からのＤＮＡ移行を示す図である。示された各変異体（パネルＡ～Ｇ）について、次のことが報告される：１μＭのビオチン化ｓｓＤＮＡ（１ａ、表３）のｃｉｓコンパートメントへの添加前および後の正のＶＧ印加電位下でのＩＶ関係（２１秒および１０ｍＶ電圧ステップにおける＋１００から－１００ｍＶへの電圧ランプ）および代表的電流トレース（表５）。またその後に１．２μＭのニュートラアビジン（モノマー）および１μＭの相補的ｓｓＤＮＡ（１ｂ、表１）をｃｉｓ溶液に添加した後の様々な電流トレースも示している。電気的記録は０．１５ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。データは、２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、１００μｓ（１０ｋＨｚ）サンプリングレートを使用して記録した。 ｓｓＤＮＡ移行のイオン強度依存性を示す図である。パネルＡ～Ｆは、様々な塩濃度またはイオン強度についてのデータを示す。（左側）様々なＮａＣｌ濃度で＋７０ｍＶ下で１μＭのビオチン化ｓｓＤＮＡ（１ａ、表３）のポアのｃｉｓ側への添加前および後のＣｌｙＡ－ＲＲナノポアの開口ポア電流を示す代表的電流トレース。右側のヒストグラムは、個々のｓｓＤＮＡ移行イベントの滞留時間（ｔＯＦＦ、左のヒストグラム）およびイベント間時間（inter-event time）（ｔＯＮ、右のヒストグラム）を表す。個々のｔｏｆｆおよびイベント間時間ｔｏｎイベントは、Ｃｌａｍｐｆｉｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）の「単一チャネル検索」関数を使用し、０．０５ｍｓのデータ獲得閾値を使用して、独立的に収集した。平均ＤＮＡ移行滞留時間ｔＯ ＦＦは、累積ヒストグラムから単一指数フィットにより計算した。イベント間時間ｔＯＮは、対数ビン（底１０）を使用してヒストグラムから指数対数確率フィッティングにより計算した。電気的記録は１５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。データは１０ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、２０μｓ（５０ｋＨｚ）サンプリングレートを使用して記録した。追加の２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを使用して、データを０．１５ＭのＮａＣｌ溶液で収集した。 ｄｓＤＮＡ移行のイオン強度依存性を示す図である。パネルＡ～Ｅは、様々な塩濃度またはイオン強度についてのデータを示す。電流トレースは、＋７０ｍＶ下および示されたＮａＣｌ濃度でポアのｃｉｓ側への１７０ｎＭのｄｓＤＮＡ（１、表３）の添加前（左）および後（右）のＣｌｙＡ－ＲＲナノポアの開口ポア電流を示す。右側のヒストグラムは、個々のｓｓＤＮＡ移行イベントの滞留時間（ｔＯＦＦ、左のヒストグラム）およびイベント間時間（ｔＯＮ、右のヒストグラム）を表す。個々のｔＯＦＦおよびイベント間時間ｔＯＮイベントは、Ｃｌａｍｐｆｉｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）の「単一チャネル検索」関数を使用し、０．０５ｍｓのデータ獲得閾値を使用して、独立的に収集した。平均ＤＮＡ移行滞留時間τｏｆｆを累積ヒストグラムから単一指数フィットにより計算した。イベント間時間τｏｎを、対数ビン（底１０）を使用してヒストグラムから指数対数確率フィッティングにより計算した。電気的記録は１５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。データは１０ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、２０μｓ（５０ｋＨｚ）サンプリングレートを使用して記録した。追加の２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを使用して、データを０．１５ＭのＮａＣｌ溶液で収集した。 １ＭのＮａＣｌでのｔｒａｎｓ側からのＤＮＡロタキサンの形成を示す図である。パネルＡ）ｄｓＤＮＡロタキサンを、－７０ｍＶの印加電位下で、ニュートラアビジン（１．２μＭ、モノマー）と複合体化したハイブリッドｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮＡスレッドＴ１ｄ（１ａおよび１ｃ、１．０μＭ、表３、電流トレースの上の黒線として表示）を、ｔｒａｎｓナノポアコンパートメントに添加することにより形成した。Ｔ１ｄのオーバーハングに相補的な３’ビオチン化ｓｓＤＮＡ分子、１ｄ（１．０μＭ、表３、電流トレースの上の灰色線に相当）をｃｉｓコンパートメントに添加した。ナノポア／ＤＮＡロタキサンは、Ｔ１ｄがナノポアを通じて移行されて１とハイブリダイズした場合にのみ形成されるので、この実験により、ｃｉｓからｔｒａｎｓへのＣｌｙＡを通じたＤＮＡの移行が証明される。－７０ｍＶで通過したＤＮＡの封鎖ポア電流は６４±２．０、平均±Ｓ．Ｄ．、Ｎ＝３）であった。ロタキサン形成後、＋７０ｍＶへの印加電位の逆転は、封鎖ポア電流（ＩＲＥＳ＋７０＝７３±０．５、平均±Ｓ．Ｄ．、Ｎ＝３）を示し、ｄｓＤＮＡがナノポアを占有していることを示している。パネルＢ）ロタキサン構成におけるＣｌｙＡ－ＲＲおよびＣｌｙＡ－ＲＲについてのＩＶ関係。 ０．１５ＭのＮａＣｌ溶液中でのｔｒａｎｓ側からのＤＮＡの移行を観察するためのポア改変を示す図である。パネルＡ～Ｉに示した各変異体について、次のことが報告される：１μＭのビオチン化ｓｓＤＮＡ（１ａ、表３）のｔｒａｎｓコンパートメントへの添加前および後の正のＶＧ印加電位下でのＩＶ関係（２１秒および１０ｍＶ電圧ステップで＋１００から－１００ｍＶへの電圧ランプ）および代表的電流トレース。またその後に１．２μＭのニュートラアビジン（モノマー）および１μＭの相補的ｓｓＤＮＡ（１ｂ、表１）をｔｒａｎｓ溶液に添加した後の様々な電流トレースも示している。ＤＮＡのｔｒａｎｓチャンバーへの添加後にＣｌｙＡ－３Ｒ－Ｅ７Ｓは電流封鎖を示したが、ロタキサンを形成することはできず、封鎖がＤＮＡの移行によるものではないことが示唆された。電気的記録は０．１５ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。データは、２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、１００μｓ（１０ｋＨｚ）サンプリングレートを使用して記録した。 ＤＮＡ移行のためのＣｌｙＡナノポアの改変を示す図である。パネルＡ）ＶＭＤおよびＮＡＭＤを使用して大腸菌（Escherichia coli）ＣｌｙＡ構造（ＰＤＢ：２ＷＣＤ、９０％配列同一性）からホモロジーモデリングによって構築された脂質二重層に埋め込まれたＣｌｙＡ－ＡＳ（左）およびＣｌｙＡ－ＲＲ（右）ナノポアの断面。内側ポア内腔は、ＰｙＭＯＬ（バージョン１．８、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）によって計算される溶媒が接近可能な表面積を使用して示し、アダプティブポアソンボルツマンソルバ（adaptive Poisson-Boltzmann solver、ＡＰＢＳ）によって計算される１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液中の静電電位に従って影を付している。影を付した領域は負および正の電位（－２から＋２ｋＢＴ／ｅまたは－５１．４から＋５１．４ｍＶの範囲）に対応する。パネルＢ）１５０ｍＭのＮａＣｌ濃度でのＣｌｙＡ－ＡＳおよびＣｌｙＡ－ＲＲナノポアの中心の静電電位。 １５０ｍＭのＮａＣｌ溶液における＋５０ｍＶでのＤＮＡロタキサン形成を示す図である。パネルＡ）１ａ／１ｃ（１．０μＭ、黒線）および１ｄ（１．０μＭ、灰色線）を、それぞれｃｉｓおよびｔｒａｎｓコンパートメントに添加することによってｄｓＤＮＡロタキサンを形成した。ニュートラアビジン（ＮＡ、０．３μＭ、四量体）も両方の溶液に添加した。パネルＢ）ｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡハイブリッドロタキサンは、５’－ビオチン化ｓｓＤＮＡスレッド２ａ（１．０μＭ、黒線）のｃｉｓコンパートメントへの添加および２ａの３’端に相補的な５’－ビオチン化ｓｓＤＮＡ分子（２ｂ、１．０μＭ、灰色線）のｔｒａｎｓコンパートメントへの添加によって形成された。ＮＡ（０．３μＭ、四量体）は両側に存在した。電流トレースの右側のグラフは、ロタキサン構成におけるＣｌｙＡ－ＲＲおよびＣｌｙＡ－ＲＲについての電圧関係（Ｉ－Ｖ曲線）を示す。実験は、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含有する緩衝液中で、２２℃で実施した。ＤＮＡ配列を表３に示す。 ＋７０ｍＶ下でのＤＮＡ移行および通過のイオン強度依存性を示す図である。パネルＡ～Ｂ）１μＭのＤＮＡあたりのｄｓＤＮＡ（パネルＡ）およびｓｓＤＮＡ（パネルＢ）移行の頻度の、デバイ長依存性。（パネルＡ）の点線は、拡散律速プロセスに対する移行頻度の理論的予測を示す。（パネルＢ）の線は、障壁律速プロセスを示す指数的回帰である。 ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアを通じたｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ移行の機構を示す図である。パネルＡ）ｄｓＤＮＡ移行は、拡散律速である。（ｉ）実験条件下、剛性ロッドであるｄｓＤＮＡは、電場線によって整列され、規定の方向でナノポアに入る。（ｉｉ）ｄｓＤＮＡはナノポア内に入り込み、ここで第２の改変された電荷の層と相互作用する。その後、（ｉｉｉ）ｄｓＤＮＡはくびれを移行することができ、（ｉｖ）ポアを出ることができる。ナノポアのｃｉｓ側入口における電荷は最初の捕捉を援助する。パネルＢ）ｓｓＤＮＡ移行は反応律速である。（ｉ）ｓｓＤＮＡは、ナノポアの半径の約２倍である回転半径（Ｒｇ≒６ｎｍ）を有するコイル構造を有する。（ｉｉ）ｓｓＤＮＡはまだポア内にいないが、入口を捜し求めている。（ｉｉｉ）ｓｓＤＮＡの一端は、ｃｉｓ内腔の入口を見つけ、解け始める。ナノポアに入るためにはエントロピーエネルギー障壁があるので、移行イベントを成功させるために数回の試みがなされうる。（ｉｖ）くびれを移行するために、ｓｓＤＮＡは完全に解ける必要がある。（ｖ）ＤＮＡはナノポアを出て、その後、再コイル化する。ｃｉｓ側入口での追加的電荷は、ナノポア内部のＤＮＡの効率的な捕捉をおそらく媒介する。ＤＮＡ分子およびナノポアは所定の縮尺で描かれている。 ＤＮＡ通過のイオン強度依存性を示す図である。ｓｓＤＮＡ（１ａ、１．０μＭ）を、ＣｌｙＡ－ＲＲのｃｉｓ側に最初に添加し、次いでニュートラアビジン（ＮＡ、０．３μＭ、ｃｉｓ）、最後に相補的ｓｓＤＮＡ（１ｂ、１μＭ、ｃｉｓ）を添加した。１５０および５００ｍＭのＮａＣｌ溶液では、ｓｓＤＮＡ：ＮＡ複合体は、長く続く電流封鎖を誘導し、これはおそらくｓｓＤＮＡの通過による。１．０Ｍ（またはより高い）のＮａＣｌ溶液では、ｓｓＤＮＡ：ＮＡ封鎖は一過性であり、ｓｓＤＮＡがポアを完全に通過できなかったことを示唆した。ｄｓＤＮＡ：ＮＡ複合体は、全てのイオン強度で永続性封鎖を誘導した。開口ポア電流レベルを上回るおよび下回るスパイクは、ＤＮＡからナノポアを自由にするために使用した手動の電位逆転後の容量過渡を表す。電気的記録は１５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。 ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアを通じたｓｓＤＮＡ移行のイオン強度依存性を示す図である。パネルＡ～Ｆは、様々な塩濃度またはイオン強度についてのデータを示す。電流トレースは、＋７０ｍＶ下で様々なＮａＣｌ濃度でポアのｃｉｓ側への１．０μＭのビオチン化ｓｓＤＮＡ（１ａ、表３）の添加前または後のＣｌｙＡ－ＲＲの開口ポア電流を示す。トレースの右側のヒストグラムは、ｄｓＤＮＡ移行イベントの滞留時間（左のヒストグラム、従来のビニング単一指数フィット）およびイベント間時間（右のヒストグラム、対数の底１０、指数対数確率フィット）を表す。散乱プロットは、電流対滞留時間を表す。電気的記録は１５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。データは、１０ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、２０μｓ（５０ｋＨｚ）サンプリングレートを使用して記録した。追加の２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを使用して、データを０．１５ＭのＮａＣｌ溶液で収集した。 ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアを通じたｄｓＤＮＡ移行のイオン強度依存性を示す図である。パネルＡ～Ｅは、様々な塩濃度またはイオン強度についてのデータを示す。電流トレースは、＋７０ｍＶ下で様々なＮａＣｌ濃度でのポアのｃｉｓ側への１４０～１７０ｎＭのビオチン化ｄｓＤＮＡ（１、表３）の添加前または後のＣｌｙＡ－ＲＲの開口ポア電流を示す。トレースの右側のヒストグラムは、ｄｓＤＮＡ移行イベントの滞留時間（左のヒストグラム、従来のビニング単一指数フィット）およびイベント間時間（右のヒストグラム、対数の底１０、指数対数確率フィット）を表す。散乱プロットは、電流対滞留時間を表す。電気的記録は１５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。データは、１０ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、５０ｋＨｚサンプリングレートを使用して記録した。追加の２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを使用して、データを０．１５ＭのＮａＣｌ溶液で収集した。 １ｋＨｚでフィルタリングしたＤＮＡ移行頻度のイオン強度依存性を示す図である。１ｋＨｚのデジタルＧａｕｓｓｉａｎフィルター（Ｃｌａｍｐｆｉｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してフィルタリングした電流トレースから決定される、（パネルＡ）ｄｓＤＮＡおよび（パネルＢ）ｓｓＤＮＡについてのイベント頻度の塩依存性。線は、直線的（パネルＡ）および指数的（パネルＢ）回帰フィットを示す。 ナノポア近傍のｓｓＤＮＡに作用するエントロピーおよび電気泳動力を示す図である。ｓｓＤＮＡはコイル形状を有し、障壁横断を介してポアによって捕捉されると予測される（反応律速プロセス）。障壁は、電気泳動引力の上面に作用するポアの周辺におけるエントロピー起源の反発力に由来する。これらの２つの寄与についての自由エネルギーは細線で示され、一方で太線は２つの合計である（式（１５））。図の上部は、反応座標γａおよびγｂによって特徴付けられるｓｓＤＮＡの２つの特徴的構成をそれぞれ示す。構成（ｂ）は低いエントロピーを有し、障壁の頂部に近い状態に相当する。 ＣｌｙＡの構造を示す図であり、ｃｉｓ部はＡとして示され、中間部はＢとして示され、ｔｒａｎｓ部はＣとして示される。負に荷電したアミノ酸ＤおよびＥは、（極性、非荷電アミノ酸ＳおよびＱと共に）図の左側に示される。極性非荷電アミノ酸または負に荷電したアミノ酸の１つまたは複数の置換がＡで行われてもよく、負に荷電したアミノ酸の１つまたは複数の置換がＢで行われてもよい。いくつかの負に荷電したアミノ酸を含有する領域Ｃは、中性または正に荷電したアミノ酸の置換がなく、そのままでありうる。
膜貫通ポア（例えば、タンパク質ナノポアまたは固体ナノポア）はバイオポリマーを検
出または特徴付けるためのセンサーとして有用であるが、低イオン強度（例えば、約１５
０ｍＭから約３００ｍＭ）である特定のナノポアを通じた、バイオポリマー、例えば、ポ
リヌクレオチドの移行は難題である場合があった。特に負の内部表面電荷を有する部分と
、負に荷電したバイオポリマーの大きさと匹敵する半径（例えばｄｓＤＮＡのＢフォーム
について約２．２ｎｍおよびｓｓＤＮＡについて約１ｎｍ）を有するナノポアは、低イオ
ン強度での負に荷電したバイオポリマーのナノポアへの進入に対して大きな静電障壁を生
じうる。したがって、ナノポアにわたる負に荷電したバイオポリマー、例えばポリヌクレ
オチドのより効率的な捕捉および／または移行を可能にする膜貫通ナノポアを設計する必
要がある。そのナノポアは、ポリヌクレオチドマッピングまたはシーケンシングなどの実
用的用途のために有用でありうる。
本開示は、正電荷を膜貫通ナノポア、例えば細胞溶解素Ａ（ＣｌｙＡ）の内腔表面へ、
ある特定の位置で導入して、負に荷電した狭いくびれ（例えば、約３．３ｎｍの寸法を有
する）を通じたＤＮＡ移行のエントロピーおよび静電障壁を克服することができるという
、予期されなかった発見に少なくとも部分的に基づく。例えば、ＣｌｙＡナノポアの広い
方の入口（ｃｉｓ側）および中間部での正電荷（例えばアルギニンなどの正に荷電したア
ミノ酸）の導入が、負に荷電したｔｒａｎｓ型くびれ自体に何らの修飾が存在しない場合
でも、狭く負に荷電したｔｒａｎｓ型くびれを通じた有効な電気泳動駆動スライディング
のためにＤＮＡ（例えば、二本鎖または一本鎖）を「把持（grab）」し、配向させるため
に十分であることが発見された。さらに、そのような修飾が、例えば５０ｍＭ程度の低イ
オン強度でのＤＮＡ移行を可能にすることが発見された。原理的に、修飾は、本明細書に
記載のいずれかの態様の方法を、５０ｍＭより低いイオン強度でさえも実施することを可
能にする。しかしながら、低いイオン強度は対応して低いイオン電流を生じさせる可能性
があるため、いくつかの状況では、望ましくない場合がある。そのような修飾なしでは、
ナノポアを通じた一本鎖または二本鎖ＤＮＡの移行は、２．０Ｍを超えるイオン強度での
み観察された。
したがって、一部の態様では、本開示は、（例えば、修飾ＣｌｙＡナノポアを形成する
ための）修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドおよびそれを含むナノポアを提
供する。本明細書に記載される修飾ＣｌｙＡナノポアは、ポリヌクレオチドの特徴付けな
どの様々な実用的用途のために使用することができる。したがって、二本鎖または一本鎖
ポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドを特徴付けるための方法および組成物も本明細
書に記載される。本明細書に記載の方法および組成物は、生理学的イオン強度（例えば５
０ｍＭ～３００ｍＭ）または低イオン強度（例えば、２Ｍ未満、または１Ｍ未満）での二
本鎖または一本鎖ポリヌクレオチドの効率的な移行を提供する。
本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアおよび方法は、ポリヌクレオチドの一方向の移
行を可能にする、つまりポリヌクレオチドがナノポアにｔｒａｎｓからｃｉｓ方向へ入る
および通過することができない。これにより、例えば、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮ
Ａ）のｃｉｓからｔｒａｎｓ方向へのフィルタリングが可能になる。
またＣｌｙＡナノポアのナノポア構造と同様のナノポア構造（例えば、ｃｉｓ開口部で
より大きな直径（例えば、５～７ｎｍ）を有し、ｔｒａｎｓ開口部で負に荷電したより狭
いくびれ（例えば、直径３～４ｎｍ）を有する円筒形の内腔）を有する他のナノ構造も、
低イオン強度溶液でＤＮＡ移行を可能にする同様の修飾ストラテジーをとりうると考えら
れる。
修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド
本開示の一態様は、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを提供する。修飾
ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、その配列が参照ＣｌｙＡアミノ酸配列と
は異なっているポリペプチドである。修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの
アミノ酸配列は、（ｉ）ｃｉｓ開口部形成アミノ酸配列、（ｉｉ）中間部形成アミノ酸配
列、および（ｉｉｉ）ｔｒａｎｓ開口部形成アミノ酸配列を含む。ｃｉｓ開口部形成アミ
ノ酸配列は、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドが他のサブユニットポリペ
プチドと相互作用して、膜にナノポアを形成するときの、ナノポアのｃｉｓ開口部の部位
を形成するアミノ酸配列の一部である。中間部形成アミノ酸配列は、修飾ＣｌｙＡナノポ
アサブユニットポリペプチドが他のサブユニットポリペプチドと相互作用して膜にナノポ
アを形成するときのナノポアの中間部の部位を形成するアミノ酸配列の部分である。ｔｒ
ａｎｓ開口部形成アミノ酸配列は、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドが他
のサブユニットポリペプチドと相互作用して、膜にナノポアを形成するときのナノポアの
ｔｒａｎｓ開口部の部位を形成するアミノ酸配列の部分である。ＣｌｙＡナノポアのｃｉ
ｓ部分、中間部およびｔｒａｎｓ部分に対応するＣｌｙＡアミノ酸配列の部分を同定する
方法は、当技術分野で公知であり、実施例にも記載されている。例えば、部分が膜に埋め
込まれたナノポアは、例えば、Humphrey et al., "VMD: Visual Molecular Dynamics" J.
Mol. Graphics (1996) 14: 33-38に記載のＶＭＤ、および例えばPhillips et al., "Sca
lable Molecular Dynamics with NAMD" J. Comput. Chem. (2005) 26: 1781-1802に記載
のＮＡＭＤを使用して、公知のＣｌｙＡ構造からホモロジーモデリングによって構築する
ことができる。例えば、図１Ａを参照。
本明細書で使用されるとき、用語「参照ＣｌｙＡアミノ酸配列」は、ＣｌｙＡナノポア
サブユニットの公知のアミノ酸配列を指す。ＣｌｙＡナノポアサブユニットの様々な形態
は、当技術分野で公知であり、例えば、限定されないが、ＣｌｙＡ野生型（ＣｌｙＡ－Ｗ
Ｔ）、ＣｌｙＡ－ＳＳ、ＣｌｙＡ－ＣＳおよびＣｌｙＡ－ＡＳが挙げられる。例えば、Ｃ
ｌｙＡ－ＳＳ、ＣｌｙＡ－ＣＳおよびＣｌｙＡ－ＡＳにおけるＣｌｙＡ－ＷＴに対する様
々な変異ならびにそれらの作製方法を記載するSoskine et al. "Tuning the size and pr
operties of ClyA nanopores assisted by directed evolution" J Am Chem Soc. (2013)
135: 13456-13463を参照。国際公開第２０１６／１６６２３２号パンフレットおよび国
際公開第２０１４／１５３６２５号パンフレットに記載の任意のＣｌｙＡアミノ酸配列を
、参照ＣｌｙＡアミノ酸配列として使用することもできる。一実施形態では、参照Ｃｌｙ
Ａアミノ酸配列は、配列番号１に示すＣｌｙＡ－ＷＴのアミノ酸配列である。一実施形態
では、参照アミノ酸は、配列番号１に示すＣｌｙＡ－ＷＴのアミノ酸配列（amino sequen
ce）と比較して、以下の変異：Ｃ８７Ａ、Ｌ９９Ｑ、Ｅ１０３Ｇ、Ｆ１６６Ｙ、Ｉ２０３
Ｖ、Ｃ２８５Ｓ、Ｋ２９４Ｒを含有する、配列番号２に示すＣｌｙＡ－ＡＳのアミノ酸配
列である。一部の実施形態では、ＣｌｙＡ－ＡＳのアミノ酸配列は、ＣｌｙＡ－ＷＴのア
ミノ酸配列と比較して、さらにＨ３０７Ｙを含むことができる。
一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、参照Ｃｌｙ
Ａアミノ酸配列と、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９
０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９
８％、少なくとも約９９％またはそれ以上など）同一であるアミノ酸配列を含む。当技術
分野の標準的方法を使用してホモロジーを決定してもよい。例えば、ＵＷＧＣＧパッケー
ジは、例えばデフォルト設定で使用されるホモロジーを計算するために使用することがで
きるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Rese
arch 12, p387-395）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えば、Altschu
l S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300、Altschul, S.F et al (1990) J Mol Biol 215:
403-10に記載されているように、ホモロジーを計算するまたは配列を並べる（例えば、（
通常、デフォルト設定での）等価な残基または対応する配列を同定する）ために使用する
ことができる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃ
ｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ
：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。
修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドのアミノ酸配列は、ｃｉｓ開口部形成
アミノ酸配列内の位置に（ｉ）第１の正電荷修飾（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸
の置換）、および中間部形成アミノ酸配列内の位置に（ｉｉ）第２の正電荷修飾（例えば
、第２の正に荷電したアミノ酸の置換）を含む。第１および第２の正電荷修飾（例えば、
第１および第２の正に荷電した置換）は、参照ＣｌｙＡアミノ酸配列と比較して、ナノポ
アを通じた負に荷電したポリマー（例えば、二本鎖または一本鎖ＤＮＡなどのポリヌクレ
オチド）の捕捉および／または移行のより高い頻度を提供するように選択される。
一実施形態では、第１の正電荷修飾（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸の置換）は
、配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列の１１０位でありうる。一部の実施形
態では、正電荷（例えば、正に荷電したアミノ酸）による置換は、以下の位置：配列番号
１または配列番号２のＥ１０６、Ｄ１１４、Ｄ１２１、Ｄ１２２、Ｅ１２９、Ｅ８５、Ｅ
７８、Ｄ２６８、Ｄ２６７、Ｄ２６５、Ｅ２５８の１つまたは複数で行われてもよい。一
部の実施形態では、ＣｌｙＡアミノ酸配列（例えば、配列番号１または２に示す）は、そ
のＮ末端にさらなるアミノ酸「ＭＩ」を含むように修飾または改変されていてもよい。
一実施形態では、第１の正電荷修飾（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸の置換）は
、配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列の６４位でありうる。一部の実施形態
では、正電荷（例えば、正に荷電したアミノ酸）による置換は、以下の位置：配列番号１
または配列番号２のＤ７４、Ｄ７１、Ｄ６４、Ｅ５３、Ｅ１６１、Ｄ１５８、Ｅ４６、Ｅ
４２、Ｄ４１の１つまたは複数で行われてもよい。
用語「正に荷電したアミノ酸の置換」は、本明細書で使用されるとき、参照アミノ酸の
、例えばｐＨ７．０～８．０（例えば、ｐＨ８．０）および室温、例えば２０～２５℃で
検出される正味の正電荷を増加させるまたは正味の負電荷を減少させる参照アミノ酸への
修飾を指す。例えば、正に荷電したアミノ酸の置換には、限定されないが、（ｉ）負に荷
電したアミノ酸を、それほど負に荷電していないアミノ酸、中性アミノ酸もしくは正に荷
電したアミノ酸で置き換えること、（ｉｉ）中性アミノ酸を正に荷電したアミノ酸で置き
換えること、または（ｉｉｉ）正に荷電したアミノ酸をより正に荷電したアミノ酸で置き
換えることを含むことができる。一部の実施形態では、正に荷電したアミノ酸の置換は、
負に荷電したアミノ酸の欠失または正に荷電したアミノ酸の付加を含みうる。一部の実施
形態では、正に荷電したアミノ酸の置換は、１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸の、
それらの負電荷を中和する１つまたは複数の化学修飾を含みうる。例えば、１つまたは複
数の負に荷電したアミノ酸をカルボジイミドと反応させてもよい。
正に荷電したアミノ酸は、溶液のｐＨより高い等電点（ｐＩ）を有し、したがって溶液
中でアミノ酸が正味の正電荷を保有する、アミノ酸である。例えば、ｐＨ７．０～８．０
（例えば、ｐＨ８．０）および室温、例えば２０～２５℃で検出される正に荷電したアミ
ノ酸の例としては、限定されないが、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）およびリジン
（Ｋ）が挙げられる。負に荷電したアミノ酸は、溶液のｐＨより低いｐＩを有し、したが
って溶液中でアミノ酸が正味の負電荷を保有する、アミノ酸である。ｐＨ７．０～８．０
（例えば、ｐＨ８．０）および室温、例えば２０～２５℃で検出される負に荷電したアミ
ノ酸の例としては、限定されないが、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリ
ン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）が挙げられる。中性アミノ酸は、溶液のｐＨと同じ等電点（
ｐＩ）を有し、したがって溶液中でアミノ酸が正味の電荷を保有しない、アミノ酸である
。アミノ酸のｐＩ値は、当技術分野で公知である。目的のアミノ酸のｐＩ値を溶液のｐＨ
と比較することにより、当業者は、溶液中に存在するアミノ酸が正に荷電したアミノ酸で
あるか、中性アミノ酸であるか、または負に荷電したアミノ酸であるかを容易に決定する
ことができる。本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸または合
成アミノ酸でありうる。
一部の実施形態では、例えばｐＨ７．０～８．０（例えば、ｐＨ８．０）および室温、
例えば２０～２５℃で検出される第１および／または第２の正に荷電したアミノ酸の置換
には、限定されないが、参照アミノ酸をアルギニン、ヒスチジンおよびリジンのうちの１
つで置換することが含まれる。
一部の実施形態では、第１の正に荷電したアミノ酸の置換はＳ１１０Ｒであり、ここで
１１０位は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１１０に対応する。
一部の実施形態では、第２の正に荷電したアミノ酸の置換はＤ６４Ｒであり、ここで６
４位は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸６４に対応する。
本明細書に記載の第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換に加えて、アミノ酸の
置換、例えば、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または３０
個の置換を参照ＣｌｙＡアミノ酸配列に行いうる。保存的置換は、アミノ酸を、類似の化
学構造、類似の化学的特性、または類似の側鎖体積を有する他のアミノ酸で置き換える。
導入されるアミノ酸は、置き換えられるアミノ酸と、類似の極性、親水性、疎水性、塩基
性、酸性、中性または電荷を有しうる。代替的に、保存的置換は、既存の芳香族または脂
肪族アミノ酸の代わりに、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入してもよい。保
存的アミノ酸変化は当技術分野で周知であり、下記表Ａに定義される２０種の主要なアミ
ノ酸の特性に従って選択しうる。これは、アミノ酸が同様の極性を有する場合、表Ａに示
すアミノ酸側鎖のハイドロパシースケールを参照することによって決定することもできる
。
Figure 2022046503000001
Figure 2022046503000002
配列番号１または２のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基が、上記のポリペ
プチドからさらに欠失してもよい。最大１、２、３、４、５、１０、２０または３０個の
残基が欠失してもよく、またはそれ以上が欠失してもよい。
１つまたは複数のアミノ酸が、代替的にまたは付加的に上記のポリペプチドに付加され
てもよい。配列番号１もしくは２のアミノ酸配列またはそのポリペプチドバリアントもし
くはそのフラグメントのアミノ末端またはカルボキシ末端に伸長が与えられてもよい。伸
長は非常に短く、例えば１から１０アミノ酸の長さであってもよい。代替的に、伸長はよ
り長く、例えば最大５０または１００アミノ酸であってもよい。キャリアタンパク質は、
アミノ酸配列、例えば、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドのアミノ酸配列
に融合されていてもよい。他の融合タンパク質は、以下により詳細に説明されている。
アミノ酸を（例えば、置換、付加または欠失により）修飾するための方法は、当技術分
野で周知である。例えば、参照アミノ酸は、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに関連する位置で、参照アミノ酸についてのコドンを
標的アミノ酸についてのコドンで置き換えることによって、標的アミノ酸で置換してもよ
い。次いでポリヌクレオチドは、以下で説明されるように発現されうる。アミノ酸が非天
然アミノ酸である場合、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを発現するため
に使用されるＩＶＴＴ系に、合成アミノアシル－ｔＲＮＡを含めることによって導入して
もよい。代替的に、特定のアミノ酸の合成（つまり非天然）アナログの存在下で特定のア
ミノ酸に対して栄養要求性である大腸菌（E. coli）で、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニ
ットポリペプチドを発現することによって導入してもよい。また、修飾ＣｌｙＡナノポア
サブユニットポリペプチドが部分ペプチド合成を使用して製造される場合、ネイキッドラ
イゲーション（naked ligation）によって製造してもよい。
一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドのｔｒａｎｓ開
口部形成アミノ酸配列は、例えば、ｐＨ７．０～８．０（例えば、ｐＨ８．０）および室
温（例えば、２０～２５℃）で検出される正味の負電荷を保有してもよく、これは参照Ｃ
ｌｙＡアミノ酸配列の対応するｔｒａｎｓ開口部形成部分の正味の負電荷と（例えば、１
０％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内またはそれ未満で）匹敵
する。例えば、一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの
ｔｒａｎｓ開口部形成アミノ酸配列は、例えば、配列番号１または配列番号２に示す参照
ＣｌｙＡアミノ酸配列の対応するｔｒａｎｓ開口部形成部分と、少なくとも約９５％以上
（例えば、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも
約９９％または最大１００％など）同一でありうる。一実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノ
ポアサブユニットポリペプチドのｔｒａｎｓ開口部形成アミノ酸配列は、配列番号２に示
すアミノ酸配列の対応するｔｒａｎｓ開口部形成部分と１００％同一である。
本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを使用して、本明細
書に記載されるホモ多量体ナノポアまたはヘテロ多量体ナノポアを形成してもよい。した
がって、一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、他の
サブユニットポリペプチドを有するナノポアを形成する能力を保持する。修飾モノマーの
ナノポア形成能力を評価するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、修飾Ｃｌ
ｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを、他の適切なサブユニットと共に両親媒性層に
挿入して、オリゴマー化してポアを形成する能力を調べてもよい。サブユニットを、膜、
例えば両親媒性層に挿入するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、サブユニ
ットが膜に拡散し、膜に結合することにより挿入され、機能的な状態に構築されるように
、サブユニットは、トリブロックコポリマー膜を含有する溶液中に精製された形態で懸濁
されてもよい。代替的に、サブユニットは、M.A. Holden, H. Bayley. J. Am. Chem. Soc
. 2005, 127, 6502-6503および国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７（国際
公開第２００６／１００４８４号パンフレットとして公開）に記載の「ピックアンドプレ
ース（pick and place）」方法を使用して、膜に直接挿入されてもよい。
修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、ナノポア形成に干渉しない限り、
非特異的修飾を含有してもよい。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野で公知であり、ア
ミノ酸の側鎖に対してなされてもよい。そのような修飾としては、例えば、アルデヒドと
の反応とその後のＮａＢＨ４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセト
イミデートを用いたアミド化、または無水酢酸を用いたアシル化が挙げられる。
修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、当技術分野で公知の標準的方法を
使用して製造されうる。修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、合成的にま
たは組換え手段によって作製されうる。例えば、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリ
ペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成してもよい。ポ
アおよび修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを製造するための適切な方法は
、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０（国際公開第２０１０／００４２７３号
パンフレットとして公開）、ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９（国際公開第２０１０／０
０４２６５号パンフレットとして公開）またはＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３（国際公
開第２０１０／０８６６０３号パンフレットとして公開）で説明されている。
本明細書に記載される修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、Ｄ－アミノ
酸を使用して製造されうる。例えば、本明細書に記載される修飾ＣｌｙＡナノポアサブユ
ニットポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸とＤ－アミノ酸との混合物を含みうる。このことは
、そのようなタンパク質またはペプチドの製造について当技術分野において一般的である
。
一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、化学的に修
飾されてもよい。修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、任意の方法でおよ
び任意の部位で化学的に修飾されうる。例えば、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリ
ペプチドは、染料または蛍光体の結合によって化学的に修飾されてもよい。一部の実施形
態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、１つもしくは複数のシステ
イン（システイン結合）への分子の結合、１つもしくは複数のリジンへの分子の結合、１
つもしくは複数の非天然アミノ酸への分子の結合、エピトープの酵素修飾または末端の修
飾によって化学的に修飾されてもよい。そのような修飾を実施するための適切な方法は、
当技術分野で周知である。
一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、修飾Ｃｌｙ
Ａナノポアサブユニットポリペプチドを含むナノポアと標的ヌクレオチドまたは標的ポリ
ヌクレオチド配列との間の相互作用を促進する分子アダプターで化学的に修飾されていて
もよい。アダプターの存在は、ナノポアおよびヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列
のホスト－ゲスト化学を改善し、それによって修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペ
プチドから形成されたポアのシーケンシング能力を改善する。ホスト－ゲスト化学の原理
は、当技術分野で周知である。アダプターは、ナノポアとヌクレオチドまたはポリヌクレ
オチド配列との相互作用を向上させるナノポアの物理的または化学的特性に影響を与える
。アダプターは、ポアのバレルもしくはチャネルの電荷を変化させ、またはヌクレオチド
もしくはポリヌクレオチド配列と特異的に相互作用もしくは結合し、それによってポアと
の相互作用を促進することができる。
一部の実施形態では、分子アダプターは、環状分子、シクロデキストリン、ハイブリダ
イゼーションが可能な種、ＤＮＡ結合剤もしくはインターカレータ（interchelator）、
ペプチドもしくはペプチドアナログ、合成ポリマー、芳香族平面分子、正に荷電した小分
子また水素結合可能な小分子でありうる。
一部の実施形態では、分子アダプターは、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプ
チドに共有結合的に結合していてもよい。アダプターは、当技術分野で公知の任意の方法
を使用して、ナノポアに共有結合的に結合することができる。アダプターは、通常、化学
結合を介して結合する。分子アダプターがシステイン結合を介して結合する場合、１つま
たは複数のシステインが、置換によって修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド
に導入されてもよい。
他の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、ポリヌクレオ
チド結合タンパク質、例えば、ヘリカーゼ、エキソヌクレアーゼ、およびポリメラーゼに
結合または連結されてもよい。一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニット
ポリペプチドは、ヘリカーゼ、例えばＤＮＡヘリカーゼに結合または連結されてもよい。
ナノポアシーケンシングの使用に適したヘリカーゼ、エキソヌクレアーゼ、およびポリメ
ラーゼの例は、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサ
ブユニットポリペプチドは、ヘリカーゼ、例えば、ＤＮＡヘリカーゼ、Ｈｅｌ３０８ヘリ
カーゼ（例えば、国際公開第２０１３／０５７４９５号パンフレットに記載）、ＲｅｃＤ
ヘリカーゼ（例えば、国際公開第２０１３／０９８５６２号パンフレットに記載）、ＸＰ
Ｄヘリカーゼ（例えば、国際公開第２０１／０９８５６１号パンフレットに記載）または
Ｄｄａヘリカーゼ（例えば、国際公開第２０１５／０５５９８１号パンフレットに記載）
に結合または連結されうる。これは標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法に使用しうる
モジュール型シーケンシングシステムを形成する。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、
以下で説明される。移行の速度制御は、システムに添加されるポリヌクレオチド結合タン
パク質の種類および／または燃料（ＡＴＰ）の量によって決定されうる。例えば、二本鎖
ＤＮＡ分析物の移行の速度は、ＦｔｓＫなどの二本鎖ＤＮＡトランスロカーゼによって制
御することができる。システムに添加された燃料（ＡＴＰ）に依存して、標的ポリヌクレ
オチドの移行速度は、約３０Ｂ／秒～１０００Ｂ／秒の間でありうる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド結合タンパク質は、修飾ＣｌｙＡナノポアサブ
ユニットポリペプチドに共有結合的に結合させることができる。ポリヌクレオチド結合タ
ンパク質は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニ
ットポリペプチドに共有結合的に結合させることができる。修飾ＣｌｙＡナノポアサブユ
ニットポリペプチドおよびポリヌクレオチド結合タンパク質は、化学的に融合または遺伝
的に融合されてもよい。修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドおよびポリヌク
レオチド結合タンパク質は、全構築物が単一のポリヌクレオチド配列から発現される場合
、遺伝的に融合される。修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドのポリヌクレオ
チド結合タンパク質への遺伝的融合は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９（
国際公開第２０１０／００４２６５号パンフレットとして公開）で説明されている。
修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、分子アダプターおよびポリヌクレ
オチド結合タンパク質で化学的に修飾されてもよい。
本明細書に記載のいずれかのタンパク質、例えば本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポ
アサブユニットポリペプチドおよびナノポアは、ヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）、アスパ
ラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ＳＵＭＯタグ、
ＧＳＴタグもしくはＭＢＰタグの付加によって、またはポリペプチドが天然にそのような
配列を含有していない細胞からそれらのタンパク質の分泌を促進するためのシグナル配列
を付加することによって修飾してそれらの同定または精製が支援されてもよい。遺伝子タ
グを導入するための代替手段は、タンパク質の天然または改変された位置にタグを化学的
に反応させることである。この例は、タンパク質の外側の改変されたシステインにゲルシ
フト試薬を反応させることである。これは、ヘモシジンヘテロオリゴマー（Chem Biol. 1
997 Jul;4(7):497-505）を分離するための方法として実証されている。
本明細書に記載のいずれかのタンパク質、例えば、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノ
ポアサブユニットポリペプチドおよびナノポアは、検出可能な標識で標識されてもよい。
検出可能な標識は、タンパク質を検出することを可能にする任意の適切な標識でありうる
。適切な標識としては、限定されないが、蛍光分子、放射性同位元素、例えば、１２５Ｉ
、３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびビオチンなどのリガンドが挙げら
れる。
本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含む、本明細書に
記載のいずれかのタンパク質は、当技術分野で公知の標準的方法を使用して製造すること
ができる。タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的
方法を使用して、誘導および複製することができる。タンパク質をコードするポリヌクレ
オチド配列は、当技術分野における標準的技術を使用して、細菌宿主細胞で発現すること
ができる。タンパク質は、組換え発現ベクターからポリペプチドのｉｎ ｓｉｔｕ発現に
より細胞で産生することができる。発現ベクターは、任意選択的に、ポリペプチドの発現
を制御する誘導型プロモーターを保有する。これらの方法は、Sambrook, J. and Russell
, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記載されている。
タンパク質は、タンパク質産生生物からまたは組換え発現後に任意のタンパク質液体ク
ロマトグラフィーシステムによる精製後、大規模に製造しうる。典型的なタンパク質液体
クロマトグラフィーシステムとしては、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡシステム、Ｂｉｏ－Ｃａｄシ
ステム、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＢｉｏＬｏｇｉｃシステムおよびＧｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣシス
テムが挙げられる。
修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本明細書において、本明細書に記載される修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプ
チドのいずれか１つをコードするポリヌクレオチド配列も提供される。
ポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を使用して、誘導および複製
することができる。野生型ＣｌｙＡをコードする染色体ＤＮＡは、ポア産生生物、例えば
チフス菌（Salmonella typhi）から抽出してもよい。ポアサブユニットをコードする遺伝
子は、特定のプライマーを含むＰＣＲを使用して増幅してもよい。増幅された配列は、次
いで、部位特異的変異誘発を受けうる。部位特異的突然変異誘発の適切な方法は、当技術
分野で公知であり、例えば、連鎖反応の組合せが挙げられる。修飾ＣｌｙＡナノポアサブ
ユニットポリペプチドのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドは、周知の技術、例
えば、Sambrook, J. and Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manua
l, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記
載の技術を使用して作製しうる。
得られたポリヌクレオチド配列を、次いで、組換え複製ベクター、例えばクローニング
ベクターに組み込んでもよい。ベクターを使用して、適合する宿主細胞でポリヌクレオチ
ドを複製してもよい。そのように、ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドを複製可
能なベクターに導入し、ベクターを適合する宿主細胞に導入し、ベクターの複製をもたら
す条件下で宿主細胞を増殖させることによって作製することができる。ベクターは宿主細
胞から回収されうる。ポリヌクレオチドをクローニングするための適切な宿主細胞は、当
技術分野で公知である。
本開示の別の態様には、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプ
チドまたは構築物を製造する方法が含まれる。方法は、適切な宿主細胞で修飾ＣｌｙＡナ
ノポアサブユニットポリペプチドのいずれかの実施形態をコードするポリヌクレオチドを
発現するステップを含む。ポリヌクレオチドは、好ましくはベクターの一部であり、好ま
しくはプロモーターに作動可能に連結されている。
修飾ＣｌｙＡナノポア
本開示の一態様は、例えば、修飾ＣｌｙＡナノポアへの負に荷電したポリマー（例えば
、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチド）の捕捉および／または修飾ＣｌｙＡナノ
ポアを通じた負に荷電したポリマーの移行を可能にする修飾ＣｌｙＡナノポアを特色とす
る。修飾ＣｌｙＡナノポアは、第１の開口部と、中間部と、第２の開口部と、第１の開口
部から中間部を通じて第２の開口部に延びる内腔とを含み、ここで第１の開口部の内腔表
面は第１の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、中間部の内腔表面は第２の正に荷電した
アミノ酸の置換を含む。第２の開口部の内腔表面は負に帯電したくびれを画定する。第１
の正に荷電したアミノ酸の置換および第２の荷電アミノ酸の置換は、上記の「修飾Ｃｌｙ
Ａナノポアサブユニットポリペプチド」の項目に詳細に記載されている。
説明の目的のためのみに、図１（パネルＡ）に、本明細書に記載の一実施形態による修
飾ＣｌｙＡナノポアを示す。修飾ＣｌｙＡナノポアは、第１の開口部１０２、中間部１０
４、および第２の開口部１０６を含む。内腔１０８は、第１の開口部１０２から中間部１
０４を通じて第２の開口部１０６に延び、約１３ｎｍから約１５ｎｍの全長を有する。第
１の開口部１０２および中間部１０４は、約５ｎｍから約７ｎｍの直径を有する。第２の
開口部１０６の内腔表面は負に帯電したくびれ１１２を画定し、ここで最も狭い断面は約
３ｎｍから約４ｎｍの直径を有する。修飾ＣｌｙＡナノポアの第２の開口部１０６（約３
ｎｍから約５ｎｍの長さ）は、修飾ＣｌｙＡナノポアの存在する溶液が２つの側に分かれ
、第１の開口部１０２が溶液の１つの側に存在し、負に帯電したくびれ１１２が溶液の別
の側に存在するように、膜（例えば、二重層）１１０に挿入される。標的ポリマー（例え
ば、標的ポリヌクレオチド）が第１の開口部１０２と同じ側に添加されるとき、第１の開
口部１０２はｃｉｓ開口部であり、第２の開口部１０６はｔｒａｎｓ開口部である。
本明細書で使用されるとき、用語「内腔表面」は、溶液に曝露される内腔の内部表面を
指す。
本明細書で相互に交換可能に使用されるとき、用語「負に帯電したくびれ」または「負
に荷電したくびれ」は、正味の負の表面電荷を有するくびれを指す。例えば、負に帯電し
たくびれを画定する第２の開口部の内腔表面は、図１（パネルＡ）に示すような正味の負
の表面電荷を有する。
本明細書に記載のいずれかの修飾ＣｌｙＡナノポアでは、第１の正電荷修飾（例えば、
第１の正に荷電したアミノ酸の置換）から第２の正電荷修飾（例えば、第２の正に荷電し
たアミノ酸の置換）までの内腔内の距離は、約０．５ｎｍから約１０ｎｍ、または約３ｎ
ｍから約７ｎｍの範囲内で変動しうる。一部の実施形態では、第１の正電荷修飾（例えば
、第１の正に荷電したアミノ酸の置換）から第２の正電荷修飾（例えば、第２の正に荷電
したアミノ酸の置換）までの内腔内の距離は、約１ｎｍ、約２ｎｍ、約３ｎｍ、約４ｎｍ
、約５ｎｍ、約６ｎｍ、約７ｎｍ、約８ｎｍ、または約９ｎｍでありうる。
任意の形態のＣｌｙＡを、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアを製造するために使
用することができる。例えば、上記のように、ＣｌｙＡの様々な形態、例えば、限定され
ないが、野生型ＣｌｙＡ（ＣｌｙＡ－ＷＴ）およびＣｌｙＡ－ＡＳのアミノ酸配列ならび
にそれをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。したがって、一部の
実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアは、本明細書に記載される参照ＣｌｙＡアミノ酸配
列と、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なく
とも約９５％またはそれ以上など）同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペ
プチドを含みうる。一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアは、野生型ＣｌｙＡに対
応する配列番号１に示すアミノ酸配列と、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８
５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上など）同一であるアミノ
酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含みうる。代替的に、修飾ＣｌｙＡナノポア
は、ＣｌｙＡ－ＡＳのアミノ酸配列に対応する配列番号２に示すアミノ酸配列と、少なく
とも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％
またはそれ以上など）同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含み
うる。一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアは、配列番号１または配列番号２に示
すアミノ酸配列と比較して、第１および第２の正電荷修飾（例えば、第１および第２の正
に荷電したアミノ酸の置換）を含む、最大１５個の置換（例えば、２、３、４、５、６、
７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の置換）を含みうる。
本明細書に記載のいずれかの修飾ＣｌｙＡナノポアでは、第１の正電荷修飾（例えば、
第１の正に荷電したアミノ酸の置換）は、第１の開口部に曝露された溶液内の負に荷電し
たポリマー（例えば、限定されないが、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡなどのデオキシ
リボ核酸（ＤＮＡ））の捕捉を可能にするように、第１の開口部に配置されてもよい。例
えば、第１の正電荷修飾（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸の置換）は、配列番号１
または配列番号２に示すアミノ酸配列のＥ１０６、Ｓ１１０、Ｄ１１４、Ｄ１２１、Ｄ１
２２、Ｅ１２９、Ｅ８５、Ｅ７８、Ｄ２６８、Ｄ２６７、Ｄ２６５、Ｅ２５８位またはそ
の組合せに配置されてもよい。
本明細書に記載のいずれかの修飾ＣｌｙＡナノポアでは、第２の正電荷修飾（例えば、
第２の正に荷電したアミノ酸の置換）は、負に荷電したポリマー（例えば、限定されない
が、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡなどのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の、ポアの内腔
を通じた移行を可能にするように、中間部に配置されてもよい。例えば、第２の正電荷修
飾（例えば、第２の正に荷電したアミノ酸の置換）は、配列番号１または配列番号２に示
すアミノ酸配列のＤ７４、Ｄ７１、Ｄ６４、Ｅ５３、Ｅ１６１、Ｄ１５８、Ｅ４６、Ｅ４
２、Ｄ４１位またはその組合せに配置されてもよい。
修飾ＣｌｙＡナノポアは、ホモ多量体（例えば、ナノポア内の全てのサブユニットが同
じである）またはヘテロ多量体（例えば、少なくとも１つのサブユニットがナノポア内の
他のサブユニットと異なる）でありうる。修飾ＣｌｙＡナノポアは、標的ポリマー（例え
ば、ポリヌクレオチド）が通り抜けるのを可能にするために十分な内腔の大きさの形成を
充足する任意の数のサブユニットポリペプチドを含みうる。一部の実施形態では、修飾Ｃ
ｌｙＡナノポアは、１２個以上のサブユニットポリペプチド、例えば、１３個のサブユニ
ットポリペプチドおよび１４個のサブユニットポリペプチドを含む可能性があり、ここで
サブユニットポリペプチドの少なくとも１つまたは複数は、本明細書に記載される第１お
よび第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含む。
修飾ＣｌｙＡナノポアは、例えば、ナノポアにおける滞留時間およびポアを流れる電流
に基づいて、一本鎖ポリヌクレオチドから二本鎖ポリヌクレオチドを区別するために使用
することができる。さらに、修飾ＣｌｙＡナノポアは、ポリヌクレオチド配列を特徴付け
るために、例えばシーケンシングのために、使用することができる。修飾ＣｌｙＡナノポ
アは、修飾塩基を区別するために、例えば、メチル化ヌクレオチドと非メチル化ヌクレオ
チドとを区別するために使用することもできる。
本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアは、本明細書に記載の第１および第２の正に荷
電した置換なしのＣｌｙＡナノポアと比較して、低イオン強度溶液でのナノポアを通じた
ポリヌクレオチドの捕捉および／または移行の頻度がより高い。
本明細書で使用されるとき、用語「低イオン強度溶液」は、２Ｍ未満、例えば１Ｍ未満
、９００ｍＭ未満、８００ｍＭ未満、７００ｍＭ未満、６００ｍＭ未満、５００ｍＭ未満
、４００ｍＭ未満、３００ｍＭ未満、２００ｍＭ未満、１５０ｍＭ未満、またはより低い
イオン強度を有する溶液を指す。一部の実施形態では、より低いイオン強度溶液は、少な
くとも約５０ｍＭ、少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約１５０ｍＭ、少なくとも約２
００ｍＭ、少なくとも約３００ｍＭ、少なくとも約４００ｍＭ、少なくとも約５００ｍＭ
、少なくとも約６００ｍＭ、少なくとも約７００ｍＭ、少なくとも約８００ｍＭ、少なく
とも約９００ｍＭ、少なくとも約１Ｍまたはより高いイオン強度を有する。上記の参照範
囲の組合せも包含される。例えば、低イオン強度溶液は、約１００ｍＭから約６００ｍＭ
、または約１５０ｍＭから約３００ｍＭのイオン強度を有しうる。任意の塩を使用して、
適切なイオン強度を有する溶液を得ることができる。一部の実施形態では、アルカリ塩（
例えば、限定されないが、塩化カリウムまたは塩化ナトリウム）を低イオン強度溶液で使
用することができる。
修飾ＣｌｙＡナノポアは、一定の範囲の条件下で異なるヌクレオチドを識別することが
できる。特に、ポアは、シーケンシングなどの核酸の特徴付けに有利な条件下で、ヌクレ
オチド同士を識別することができる。修飾ＣｌｙＡナノポアが異なるヌクレオチドを識別
することができる程度は、印加電位、塩濃度、緩衝液、温度、ならびに尿素、ベタイン、
およびＤＴＴなどの添加剤の存在を変えることによって制御できる。これにより、特にシ
ーケンシングのときのポアの機能の微調整が可能になる。これについては以下により詳細
に説明する。また修飾ＣｌｙＡナノポアは、ヌクレオチドごとではなく１つまたは複数の
モノマーとの相互作用からポリヌクレオチドポリマーを同定するために使用することもで
きる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される修飾ＣｌｙＡナノポアは、核酸－タンパク
質相互作用を特徴付けるために使用することができる。一部の実施形態では、ナノポアは
、異なるセンシングモードを使用して、例えば、核酸に従って結合部位の位置をスキャン
およびマッピングすることによって、ならびに／またはタンパク質と核酸との間の相互作
用の強度を探査することによって、タンパク質－核酸を調べることができる。一部の実施
形態では、核酸の天然電荷が、核酸－タンパク質複合体に電気泳動力を印加するために利
用されてもよい。例えば、一部の実施形態では、ＤＮＡ－タンパク質相互作用が、タンパ
ク質ナノポアを通じた単一ＤＮＡ分子の電圧駆動通過を使用して評価されうる。このよう
な実施形態では、個々のＤＮＡタンパク質複合体（例えば、ＤＮＡ－エキソヌクレアーゼ
Ｉ複合体、ＤＮＡ－ヘリカーゼ複合体、ＤＮＡ－クランプ複合体）に印加された電気的な
力は、２つの分子を引き離すことができ、一方で同時に、イオン電流変化を使用して、複
合体の解離速度を評価することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される修
飾ＣｌｙＡナノポアは、核酸および他の核酸結合タンパク質、例えば、転写因子、酵素、
ＤＮＡパッケージングタンパク質などが関与する核酸－タンパク質相互作用の検出および
特徴付けのために使用することができる。
修飾ＣｌｙＡナノポアは、単離されてもよく、実質的に単離されてもよく、精製されて
もよく、または実質的に精製されてもよい。修飾ＣｌｙＡナノポアは、任意の他の成分、
例えば、脂質または他のポアから完全に遊離されていれば、単離または精製されうる。ポ
アは、その使用目的を妨げないキャリアまたは希釈剤と混合される場合、実質的に単離さ
れる。例えば、ポアは、他の成分、例えば、トリブロックコポリマー、脂質または他のポ
アを１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満しか含まない形態で存在する場合、
実質的に単離または実質的に精製されている。代替的に、修飾ＣｌｙＡナノポアの１つま
たは複数は膜に存在しうる。適切な膜は、以下に説明される。
修飾ＣｌｙＡナノポアは、個々のまたは単一のポアとして存在しうる。代替的に、修飾
ＣｌｙＡナノポアは、２つ以上のポアの同種または異種集団で存在しうる。一部の実施形
態では、修飾ＣｌｙＡナノポアは、マイクロウェルのアレイに配置されてもよく、ここで
各マイクロウェルは、膜にある少なくとも１つのナノポアを含有している。
ホモ多量体ＣｌｙＡナノポア
同一の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含むホモ多量体ナノポアも本
明細書で提供される。ホモ多量体ナノポアは、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサ
ブユニットポリペプチドのいずれかの実施形態を含みうる。ホモ多量体ナノポアは、ポリ
ヌクレオチドを特徴付けるために、例えばシーケンシングのために、および／または一本
鎖ポリヌクレオチド対二本鎖ポリヌクレオチドの存在もしくは非存在を検出するために使
用することができる。本明細書に記載のホモ多量体ナノポアは、上記に説明した利点のい
ずれかを有しうる。
ホモ多量体ポアは、任意の数の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含有
しうる。ポアは、通常、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少な
くとも１３個、または少なくとも１４個の同一の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリ
ペプチド、例えば、１２、１３または１４個の同一の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニット
ポリペプチドを含む。
ポアを作製するための方法は、以下により詳細に説明される。
ヘテロ多量体ＣｌｙＡナノポア
少なくとも１つの修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含むヘテロ多量体
ナノポアも本明細書で提供される。ヘテロ多量体ナノポアは、ポリヌクレオチドを特徴付
けるために、例えばシーケンシングのために、および／または一本鎖ポリヌクレオチド対
二本鎖ポリヌクレオチドの存在もしくは非存在を検出するために、使用することができる
。ヘテロ多量体ナノポアは、当技術分野で公知の方法（例えば、Protein Sci. 2002 Jul;
11(7):1813-24）を使用して作製することができる。
ヘテロ多量体ポアは、ポアを形成するために十分なサブユニットポリペプチドを含有す
る。サブユニットポリペプチドは、任意の種類でありうる。ポアは、通常、少なくとも１
０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、または少なくとも１４
個のサブユニットポリペプチド、例えば、１２、１３または１４個のサブユニットポリペ
プチドを含む。
一部の実施形態では、サブユニットポリペプチドの全て（例えば、１２、１３、または
１４個のサブユニットポリペプチド）が、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチ
ドであり、それらの少なくとも１つが他と異なっている。一部の実施形態では、ポアは、
１２または１３個の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含み、それらの少
なくとも１つが他と異なっている。それらは全てが互いに異なっていてもよい。
一部の実施形態では、サブユニットポリペプチドの少なくとも１つが、本明細書に記載
される修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドではない。この実施形態では、残
りのモノマーは、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドのい
ずれか１つでありうる。したがって、ポアは、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、
４、３、２、または１個の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含みうる。
ナノポアを形成する修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは同じでも異なって
もよい。
ポアを作製するための方法は、以下により詳細に説明される。
ポリヌクレオチドの特徴付け
本開示の別の態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法を提供する。方法は、（
ａ）約５０ｍＭから約１Ｍの低イオン強度溶液に、本明細書に記載のいずれかの実施形態
による修飾ＣｌｙＡナノポアと、膜とを供給するステップであり、ここで修飾ＣｌｙＡナ
ノポアは膜に存在する、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の低イオン強度溶液に標的ポ
リヌクレオチドを添加するステップと、（ｃ）ナノポアにわたり電位を印加する間に、修
飾ＣｌｙＡナノポアを流れるイオン流を測定するステップであり、ここでイオン流の測定
は、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴の指標となる、ステップとを含む。一
部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、低イオン強度溶液のｃｉｓ側に添加される
。
一部の実施形態では、低イオン強度溶液は、約５０ｍＭから約３００ｍＭ、または約１
５０ｍＭから約３００ｍＭのイオン強度を有しうる。
標的ポリヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドまたは目的のポリヌクレオチドと称さ
れる場合もある。
ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチド、例えば核酸は、２つ以上のヌクレオチドを含む巨大分子である。ポ
リヌクレオチドまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組合せを含みうる。ヌクレオ
チドは、天然のものであっても人工的なものであってもよい。ポリヌクレオチドにおける
１つまたは複数のヌクレオチドは、酸化またはメチル化されてもよい。ポリヌクレオチド
における１つまたは複数のヌクレオチドは、損傷していてもよい。例えば、ポリヌクレオ
チドは、ピリミジン二量体を含みうる。そのような二量体は、通常、紫外線による損傷と
関連しており、皮膚の黒色腫の主因である。ポリヌクレオチドにおける１つまたは複数の
ヌクレオチドは、例えば、標識またはタグで修飾されていてもよい。適切な標識は、以下
に記載されている。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のスペーサーを含んでもよい。
ヌクレオチドは、通常、核酸塩基、糖、および少なくとも１つのリン酸基を含有してい
る。核酸塩基と糖とでヌクレオシドが形成される。
核酸塩基は、通常、複素環である。核酸塩基には、限定されないが、プリンとピリミジ
ンとが含まれ、より詳細には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシ
ル（Ｕ）およびシトシン（Ｃ）が含まれる。
糖は、通常、五炭糖である。ヌクレオチド糖には、限定されないが、リボースおよびデ
オキシリボースが含まれる。糖は、好ましくは、デオキシリボースである。
ポリヌクレオチドには、好ましくは、以下のヌクレオシド：デオキシアデノシン（ｄＡ
）、デオキシウリジン（ｄＵ）および／またはチミジン（ｄＴ）、デオキシグアノシン（
ｄＧ）およびデオキシシチジン（ｄＣ）が含まれる。
ヌクレオチドは、通常、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌ
クレオチドは、通常、一リン酸、二リン酸または三リン酸を含有する。ヌクレオチドが、
３つを超えるリン酸、例えば、４または５つのリン酸を含む場合がある。リン酸は、ヌク
レオチドの５’側または３’側に結合しうる。ヌクレオチドとしては、限定されないが、
アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（Ｔ
ＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、５－メチルシチジン一リン酸、５－ヒドロキシメ
チルシチジン一リン酸、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭ
Ｐ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）
、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、
デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）および
デオキシメチルシチジン一リン酸が挙げられる。ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、
ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＵ
ＭＰから選択される。
ヌクレオチドは、脱塩基性（つまり、核酸塩基を欠く）であってもよい。ヌクレオチド
は、また、核酸塩基および糖を欠いてもよい。
ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドは任意の様式で互いに結合していてもよい。ヌ
クレオチドは、通常、核酸と同様に糖およびリン酸基によって結合している。ヌクレオチ
ドは、ピリミジン二量体と同様に、核酸塩基を介して接続されてもよい。
ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖でありうる。ポリヌクレオチドの少なくとも
一部は好ましくは二本鎖である。
ポリヌクレオチドは、核酸、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮ
Ａ）でありうる。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの一本鎖とハイブリダイズされたＲＮＡの
一本鎖を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の合成核酸、例え
ば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）
、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーであって
もよい。ＰＮＡ骨格は、ペプチド結合によって連結されたＮ－（２－アミノエチル）－グ
リシン繰り返し単位で構成されている。ＧＮＡ骨格は、ホスホジエステル結合によって連
結されたグリコール繰り返し単位で構成されている。ＴＮＡ骨格は、ホスホジエステル結
合によって一緒に連結された繰り返しのトレオース糖で構成されている。ＬＮＡは、リボ
ース部分の２’酸素と４’炭素を接続する追加のブリッジを有する、上記に説明したリボ
ヌクレオチドから形成される。
ポリヌクレオチドは、最も好ましくは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（
ＤＮＡ）である。
ポリヌクレオチドは任意の長さであってよい。例えば、ポリヌクレオチドは、少なくと
も１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少
なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００のヌクレ
オチドまたはヌクレオチド対の長さでありうる。ポリヌクレオチドは、１０００以上のヌ
クレオチドもしくはヌクレオチド対、５０００以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド
対の長さ、または１０００００以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対の長さであり
うる。
任意の数のポリヌクレオチドを調べることができる。例えば、本明細書に記載の方法は
、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、１００個またはより多く
のポリヌクレオチドの特徴付けに関しうる。２個以上のポリヌクレオチドが特徴付けられ
る場合、それらは異なるポリヌクレオチドであってもよく、または同じポリヌクレオチド
の２つの特徴付けであってもよい。
ポリヌクレオチドは、天然のものであっても人工的なものであってもよい。例えば、方
法は、製造されたオリゴヌクレオチドの配列を確認するために使用されてもよい。方法は
、通常、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
ポリヌクレオチドは、タンパク質または分析物などの結合された種を含んでもよい。ポ
リヌクレオチドは、ハイブリダイズされたプローブを含んでもよい。
試料
各分析物は、通常、任意の適切な試料中に存在する。方法は、分析物を含有することが
既知のまたは分析物を含有する疑いのある２つ以上の試料に対して実施してもよい。代替
的に、方法は、試料中の存在が既知のまたは予測される２つ以上の分析物の同一性を確認
するために、２つ以上の試料に対して実施されてもよい。一部の実施形態では、方法は、
一本鎖ポリヌクレオチドから二本鎖ポリヌクレオチドを区別するために、試料に対して実
施してもよい。
第１の試料および／または第２の試料は、生物学的試料であってもよい。本明細書に記
載の方法は、任意の生物または微生物から取得されたまたは抽出された少なくとも１つの
試料を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで実施してもよい。第１の試料および／または第２の試
料は、非生物学的試料であってもよい。非生物学的試料は、流体試料であってもよい。非
生物学的試料の例としては、外科的流体、飲料水、海水または河川水などの水、および臨
床検査のための試薬が挙げられる。
第１の試料および／または第２の試料は、通常、本明細書に記載の方法で使用される前
に、例えば遠心分離によって、または不要な分子もしくは赤血球などの細胞を取り除く濾
過膜に通して処理される。第１の試料および／または第２の試料は、取得してすぐに測定
されてもよい。第１の試料および／または第２の試料は、また、通常、アッセイ前に保存
、好ましくは－７０℃未満で保存されてもよい。
特徴付け
方法は、ポリヌクレオチドの２つ、３つ、４つ、または５つ以上の特徴を測定すること
を含んでもよい。１つまたは複数の特徴は、好ましくは（ｉ）ポリヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）ポリ
ヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選
択される。（ｉ）から（ｖ）の任意の組合せ、例えば、｛ｉ｝、｛ｉｉ｝、｛ｉｉｉ｝、
｛ｉｖ｝、｛ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ｝、｛ｉ，ｉｉｉ｝、｛ｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｖ｝、｛ｉｉ
，ｉｉｉ｝、｛ｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉ，ｖ｝、｛ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉ
ｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ
ｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉ
，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉ
ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝
、｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝または｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝が、本明細書に記
載の方法に従って測定されうる。上記の組合せのいずれかを含め、（ｉ）から（ｖ）の様
々な組合せが、第１のポリヌクレオチドに対して、第２のポリヌクレオチドと比較して測
定されてもよい。
（ｉ）について、ポリヌクレオチドの長さは、例えば、ポリヌクレオチドとポアとの間
の相互作用の数またはポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の持続時間を決定するこ
とによって測定されうる。
（ｉｉ）について、ポリヌクレオチドの同一性は、いくつかの方法で測定されうる。ポ
リヌクレオチドの同一性は、ポリヌクレオチドの配列測定と組み合わせて、またはポリヌ
クレオチドの配列測定なしに、測定されうる。前者は直接的であり、ポリヌクレオチドを
配列決定し、それにより同定する。後者は、いくつかの方法で行われうる。例えば、ポリ
ヌクレオチドの特定のモチーフの存在を（ポリヌクレオチドの残りの配列の測定なしに）
測定しうる。代替的に、方法における特定の電気的および／または光学的信号の測定は、
特定の出所に由来するものとしてポリヌクレオチドを同定しうる。
（ｉｉｉ）について、ポリヌクレオチドの配列は前記のように決定することができる。
適切なシーケンシング方法、特に電気的測定を使用する方法は、Stoddart D et al., Pro
c Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7、Lieberman KR et al, J Am Chem Soc. 2010;132(
50):17961-72および国際公開第２０００／２８３１２号パンフレットに記載されている。
（ｉｖ）について、二次構造は、種々の方法で測定されうる。例えば、方法が電気的測
定を含む場合、二次構造は、滞留時間の変化またはポアを流れる電流の変化を使用して測
定しうる。これにより、一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドの領域を区別することがで
きる。
（ｖ）について、任意の修飾の存在または非存在を測定してもよい。方法は、好ましく
は、ポリヌクレオチドが、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つもしく
は複数のタンパク質を用いて、または１つもしくは複数の標識、タグもしくはスペーサー
を用いて修飾されているか否かを決定するステップを含む。特定の修飾は、以下に記載の
方法を使用して測定されうる、ポアとの特定の相互作用をもたらす。例えば、メチルシト
シンは、各ヌクレオチドとの相互作用の間にポアを通じて流れる電流に基づいてシトシン
から区別することができる。
標的ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアのいずれか１つと接
触される。ポアは、通常、膜に存在する。適切な膜は以下に説明される。方法は、ポアが
膜に存在する膜／ポア系を調べるために適切な任意の装置を使用して実施することができ
る。方法は、膜貫通ポアの検知に適切な任意の装置を使用して実施されうる。例えば、装
置は、水溶液を含むチャンバーと、チャンバーを２つの部分に分ける障壁とを含む。障壁
は、通常、ポアを含有する膜が形成されるアパーチャを有する。代替的に、障壁は、ポア
が存在する膜を形成する。
方法は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２（国際公開第２００８／１０２
１２０号パンフレット）に記載の装置を使用して実施してもよい。
様々な異なる種類の測定を行うことができる。これには、限定されないが、電気的測定
および光学的測定が含まれる。可能な電気的測定としては、電流測定、インピーダンス測
定、トンネル測定（Ivanov AP et al., Nano Lett. 2011 Jan 12;11(1):279-85）および
ＦＥＴ測定（国際公開第２００５／１２４８８８号パンフレット）が挙げられる。光学的
測定を電気的測定と組み合わせてもよい（Soni GV et al., Rev Sci Instrum. 2010 Jan;
81(1):014301）。測定は、膜貫通電流測定、例えばポアを流れるイオン電流の測定であり
うる。代替的に、測定は、チャネルを流れるイオン流を示す蛍光測定、例えば、Heron et
al, J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (5), 1652-1653によって開示される測定またはＦＥ
Ｔを使用する膜間電圧の測定でありうる。
電気的測定は、Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7、Lieber
man KR et al, J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72および国際公開第２０００／２８
３１２号パンフレットに記載される標準的な単一チャネル記録装置を使用して行ってもよ
い。代替的に、電気的測定は、例えば国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレット
および国際公開第２０１１／０６７５５９号パンフレットに記載されるマルチチャネルシ
ステムを使用して行ってもよい。
方法は、膜にわたり印加された電位を用いて実施することができる。印加電位は、電圧
電位でありうる。代替的に、印加電位は、化学電位でありうる。この例は、両親媒性層な
どの膜を横切る塩勾配を使用している。塩勾配は、Holden et al., J Am Chem Soc. 2007
Jul 11; 129(27):8650-5に開示されている。一部の例では、ポリヌクレオチドがポアに
対して移動するときのポアを通過する電流を使用して、ポリヌクレオチドの配列を評価ま
たは決定する。これは、ストランドシーケンシングとして記載される場合がある。
方法は、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときの、ポアを通過する電流を測定
することを含みうる。したがって方法で使用される装置は、電位を印加することができ、
膜およびポアを横切る電気信号を測定することができる電流回路も含んでもよい。方法は
、パッチクランプまたは電圧クランプを使用して実施しうる。方法は、好ましくは、電圧
クランプの使用を含む。
方法は、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときの、ポアを通過する電流を測定
することを含んでもよい。膜貫通タンパク質ポアを通ってイオン電流を測定するための適
切な条件は、当技術分野で公知であり、実施例に開示されている。方法は、通常、膜およ
びポアにわたり印加された電圧を用いて実施される。使用電圧は、通常、＋５Ｖから－５
Ｖ、例えば、＋４Ｖから－４Ｖ、＋３Ｖから－３Ｖまたは＋２Ｖから－２Ｖである。使用
電圧は、通常、－６００ｍＶから＋６００ｍＶまたは－４００ｍＶから＋４００ｍＶであ
る。使用電圧は、好ましくは、－４００ｍＶ、－３００ｍＶ、－２００ｍＶ、－１５０ｍ
Ｖ、－１００ｍＶ、－５０ｍＶ、－２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限と、＋１０
ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００
ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立して選択される上限とを有する範囲にある。使用電圧は
、より好ましくは１００ｍＶから２４０ｍＶの範囲であり、最も好ましくは１２０ｍＶか
ら２２０ｍＶの範囲である。印加電位の増加によって、ポアによる異なるヌクレオチドの
識別を向上させることができる。
方法は、通常、任意の電荷キャリア、例えばアルカリ金属塩などの金属塩、ハロゲン化
物塩、例えばアルカリ金属塩化物塩などの塩化物塩の存在下で実施される。電荷キャリア
は、イオン液体または有機塩、例えば、テトラメチルアンモニウムクロリド、トリメチル
フェニルアンモニウムクロリド、フェニルトリメチルアンモニウムクロリド、または１－
エチル－３－メチルイミダゾリウムクロリドを含んでもよい。上記に説明した例示的な装
置では、塩はチャンバー内の水溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリ
ウム（ＮａＣｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）またはフェロシアン化カリウムとフェリシ
アン化カリウムとの混合物が通常、使用される。ＫＣｌ、ＮａＣｌおよびフェロシアン化
カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物が好ましい。電荷キャリアは、膜を横切っ
て非対称であってもよい。例えば、電荷キャリアの種類および／または濃度は、膜の各側
で異なってもよい。
塩濃度は、飽和状態であってもよい。塩濃度は、３Ｍ以下であってもよく、通常０．１
から２．５Ｍ、０．３から１．９Ｍ、０．５から１．８Ｍ、０．７から１．７Ｍ、０．９
から１．６Ｍまたは１Ｍから１．４Ｍである。塩濃度は、好ましくは、１５０ｍＭから１
Ｍである。方法は、好ましくは、少なくとも０．３Ｍ、例えば、少なくとも０．４Ｍ、少
なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少
なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍまたは少なくとも３．０Ｍ
の塩濃度を使用して実施される。高塩濃度は高いシグナルノイズ比をもたらし、通常電流
変動のバックグラウンドに対して同定されるヌクレオチドの存在を電流が示すことを可能
にする。本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアはポリヌクレオチドを高塩溶液で特徴付
けるために使用することができる一方、修飾ＣｌｙＡナノポアは、上記のように、低イオ
ン強度溶液においてでさえ、ナノポアを通じたポリヌクレオチド（例えば、二本鎖ＤＮＡ
または一本鎖ＤＮＡ）の効率的な捕捉および／または移行を可能にすることができる。
方法は、通常、緩衝液の存在下で実施される。上記に説明した例示的な装置では、緩衝
液はチャンバー内の水溶液中に存在する。任意の緩衝液が、本明細書に記載の方法で使用
されうる。通常、緩衝液は、リン酸緩衝液である。他の適切な緩衝液は、ＨＥＰＥＳおよ
びＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液である。方法は、通常、４．０から１２．０、４．５から１０
．０、５．０から９．０、５．５から８．８、６．０から８．７、７．０から８．８また
は７．５から８．５のｐＨで実施される。使用ｐＨは、好ましくは、約７．５または８．
０である。
方法は、０℃から１００℃、１５℃から９５℃、１６℃から９０℃、１７℃から８５℃
、１８℃から８０℃、１９℃から７０℃、または２０℃から６０℃で実施されうる。方法
は、通常、室温で実施される。方法は、任意選択的に、酵素機能を支える温度、例えば約
３７℃で実施される。
ポリヌクレオチド結合タンパク質
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための方法は、ポリヌクレオ
チド結合タンパク質が標的ポリヌクレオチドに結合し、修飾ＣｌｙＡナノポアを通じた標
的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、ポリヌクレオチド結合タンパク質を低イオ
ン強度溶液に添加するステップを含むことができる。
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ポリヌクレオチドに結合することができ、ポアを
通じたその移動を制御することができる任意のタンパク質でありうる。ポリヌクレオチド
結合タンパク質の例としては、限定されないが、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、エキソヌク
レオーゼ、ＤＮＡクランプなどが挙げられる。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド結
合タンパク質およびポアと任意の順序で接触させることができる。ポリヌクレオチドが、
ポリヌクレオチド結合タンパク質、例えばヘリカーゼ、およびポアと接触するとき、ポリ
ヌクレオチドは最初にタンパク質と複合体を形成することが好ましい。ポアにわたり電圧
が印加されるとき、ポリヌクレオチド／タンパク質複合体は、次いでポアと複合体を形成
し、ポアを通じたポリヌクレオチドの移動を制御する。
ポリヌクレオチド結合タンパク質を使用する方法の任意のステップが、通常、遊離ヌク
レオチドまたは遊離ヌクレオチドアナログおよびポリヌクレオチド結合タンパク質の作用
を容易にする酵素補因子の存在下で実施される。
ヘリカーゼおよび分子ブレーキ
一実施形態では、方法は、
（ａ）ポリヌクレオチドに、ポリヌクレオチドに結合する１つまたは複数のヘリカーゼと
１つまたは複数の分子ブレーキとを供給するステップと、
（ｂ）１つまたは複数のヘリカーゼと１つまたは複数の分子ブレーキとが一緒になり、両
方ともポリヌクレオチドのポアを通じた移動を制御するように、膜に存在する修飾Ｃｌｙ
Ａナノポアを含む低イオン強度溶液に、ポリヌクレオチドを添加し、ポアにわたり電位を
印加するステップと、
（ｃ）ナノポアにわたり電位を印加する間、ポリヌクレオチドがポアに対して移動すると
きの修飾ＣｌｙＡナノポアを流れるイオン流を測定するステップであり、ここでイオン流
の測定は、ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴の指標であり、それによってポリヌ
クレオチドが特徴付けられる、ステップとを含む。この種の方法は、国際出願番号ＰＣＴ
／ＧＢ２０１４／０５２７３７に詳細に説明されている。
膜
本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアは、膜に存在しうる。ポリヌクレオチドを特徴
付ける方法では、ポリヌクレオチドは、通常、膜にある修飾ＣｌｙＡナノポアと接触する
。任意の膜が使用されうる。適切な膜は、当技術分野で周知である。膜は、好ましくは、
両親媒性層である。両親媒性層は、親水性および親油性特性の両方を有する、リン脂質な
どの両親媒性分子から形成される層である。両親媒性分子は、合成されたものでも天然に
存在するものであってもよい。単層を形成する非天然両親媒性物質および両親媒性物質は
、当技術分野において公知であり、例えば、ブロックコポリマー（Gonzalez-Perez et al
., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450）が挙げられる。ブロックコポリマーは、一緒に重
合化される２つ以上のモノマーサブユニットが単一のポリマー鎖を生成するポリマー材料
である。ブロックコポリマーは、通常、各モノマーサブユニットが寄与する特性を有する
。しかしながら、ブロックコポリマーは、個々のサブユニットから形成されるポリマーが
有しない固有の特性を有しうる。ブロックコポリマーは、モノマーサブユニットの１つが
疎水性または親油性である一方、他のサブユニットが水溶性媒体にいるとき親水性である
ように、改変されていてもよい。この場合に、ブロックコポリマーは、両親媒性特性を有
することができ、生体膜を模倣する構造を形成しうる。ブロックコポリマーは、ジブロッ
ク（２つのモノマーサブユニットからなる）でありうるが、また、両親媒性物質（amphip
iles）のように挙動する、より複雑な構成を形成するために、２つを超えるモノマーサブ
ユニットから構築されてもよい。コポリマーは、トリブロック、テトラブロックまたはペ
ンタブロックコポリマーでありうる。膜は、好ましくは、トリブロックコポリマー膜であ
る。
古細菌二極性テトラエーテル脂質は、脂質が単層膜を形成するように構築されている天
然脂質である。これらの脂質は、一般的に、過酷な生物学的環境で生き残る好極限性細菌
、好熱菌、好塩菌、および好酸菌で見出される。それらの安定性は最終的二重層の融合性
質から誘導されると考えられる。直接的には、親水性－疎水性－親水性の一般的なモチー
フを有するトリブロックポリマーを作製することによって、これらの生物学的実体を模倣
するブロックコポリマー材料を構築する。この材料は、脂質二重層と同様に挙動し、小胞
から積層膜に至る一定範囲の相挙動を包含する単量体膜を形成しうる。これらのトリブロ
ックコポリマーから形成された膜は、生体脂質膜を上回るいくつかの利点を有する。トリ
ブロックコポリマーは合成されるため、的確な構築を慎重に制御して、膜を形成し、ポア
および他のタンパク質を相互作用するための正確な鎖長および特性をもたらすことができ
る。
またブロックコポリマーは、脂質副材料として分類されないサブユニットから構築され
てもよく、例えば疎水性ポリマーは、シロキサンまたは他の非炭化水素系モノマーから作
製されてもよい。またブロックコポリマーの親水性サブセクションは、低タンパク質結合
特性を有することができ、これにより、未処理の生物学的試料に曝露されたとき、非常に
耐性がある膜を作製することが可能である。また、この頭部基ユニットは、非古典的脂質
頭部基から誘導されてもよい。
またトリブロックコポリマー膜は、生物学的な脂質膜と比較して機械的および環境的安
定性が向上しており、例えば操作温度またはｐＨ範囲が非常に高い。ブロックコポリマー
の合成的性質は、広範囲の用途のためのポリマーベース膜をカスタマイズするためのプラ
ットフォームを提供する。
膜は、最も好ましくは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５２７６６またはＰＣ
Ｔ／ＧＢ２０１３／０５２７６７に開示されている膜の１つである。
両親媒性分子は、ポリヌクレオチドの結合を促進するために化学的に修飾または官能化
されていてもよい。
両親媒性層は、単層または二重層でありうる。両親媒性層は、通常、平面状である。両
親媒性層は、湾曲していてもよい。両親媒性層は、支持されていてもよい。
両親媒性膜は、通常、本来的に移動性であり、脂質拡散率が約１０－８ｃｍ ｓ－１の
二次元流体として本質的に作用する。これは、ポアおよび結合ポリヌクレオチドが、通常
、両親媒性膜内を移動することができることを意味する。
膜は、脂質二重層でありうる。脂質二重層は、細胞膜のモデルであり、一定範囲の実験
的研究のための優れたプラットフォームとして役立つ。例えば、脂質二重層は、単一チャ
ネル記録による膜タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究のために使用することができる。代
替的に、脂質二重層は、一定範囲の物質の存在を検出するためのバイオセンサーとして使
用されうる。脂質二重層は、任意の脂質二重層でありうる。適切な脂質二重層としては、
限定されないが、平面脂質二重層、支持二重層、またはリポソームが挙げられる。脂質二
重層は、好ましくは、平面脂質二重層である。適切な脂質二重層は、国際出願番号ＰＣＴ
／ＧＢ０８／０００５６３（国際公開第２００８／１０２１２１号パンフレットとして公
開）、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７（国際公開第２００９／０７７７３
４号パンフレットとして公開）および国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７
（国際公開第２００６／１００４８４号パンフレットとして公開）に開示されている。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアの
いずれか一つを含む膜に結合することができる。方法は、ポリヌクレオチドを、本明細書
に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアのいずれか一つを含む膜に結合させるステップを含んでも
よい。ポリヌクレオチドは、好ましくは、１つまたは複数のアンカーを使用して膜に結合
されている。ポリヌクレオチドは、任意の公知の方法を使用して膜に結合されてもよい。
二本鎖ポリヌクレオチドシーケンシング
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、二本鎖でありうる。ポリヌクレオチドが二
本鎖である場合、方法は、接触ステップの前に、ポリヌクレオチドの一端にヘアピンアダ
プターを連結するステップをさらに含んでもよい。次いでポリヌクレオチドの二本鎖は、
ポリヌクレオチドが本明細書に記載される修飾ＣｌｙＡナノポアと接触するまたは相互作
用するときまたはその前に分離されてもよい。二本鎖は、ポアを通じたポリヌクレオチド
の移動が、ポリヌクレオチド結合タンパク質、例えばヘリカーゼまたは分子ブレーキによ
って制御されるときに分離されてもよい。このことは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１
２／０５１７８６（国際公開第２０１３／０１４４５１号パンフレットとして公開）に記
載されている。このように二本鎖構築物の両方の鎖を結びつけ、調べることは、特徴付け
の効率および精度を向上させる。
ラウンドザコーナーシーケンシング（Round the corner sequencing）
好ましい実施形態では、標的二本鎖ポリヌクレオチドは一端にヘアピンループアダプタ
ーを有し、方法は、ポリヌクレオチドの両方の鎖がポアを通じて移動するように、ポリヌ
クレオチドと本明細書に記載のいずれか１つの修飾ＣｌｙＡナノポアとを接触させるステ
ップと、ポリヌクレオチドの両方の鎖がポアに対して移動するとき１つまたは複数の測定
を行うステップであり、ここで測定は、ポリヌクレオチドの鎖の１つまたは複数の特徴の
指標であり、それによって標的二本鎖ポリヌクレオチドを特徴付ける、ステップとを含む
。上記に説明した実施形態のいずれかは、同様に、本実施形態に適用される。
リーダー配列
接触ステップの前に、好ましくは、方法は、ポア内を優先的に通過するリーダー配列を
、ポリヌクレオチドに結合させるステップを含む。リーダー配列は、本明細書に記載のい
ずれの方法も促進させる。リーダー配列は、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアのい
ずれか１つを優先的に通過し、それによってナノポアを通じたポリヌクレオチドの移動を
促進させるように設計される。またリーダー配列を使用して、ポリヌクレオチドを上記に
説明した１つまたは複数のアンカーに連結させてもよい。
修飾ポリヌクレオチド
特徴付けの前に、標的ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと、ポリメラーゼおよび
遊離ヌクレオチドの集団とを、ポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用し
て修飾ポリヌクレオチドを形成する条件下で接触させることによって修飾されてもよく、
ここでポリメラーゼは、修飾ポリヌクレオチドを形成するとき、標的ポリヌクレオチドの
１つまたは複数のヌクレオチド種を異なるヌクレオチド種と置き換える。次いで修飾ポリ
ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに結合された１つまたは複数のヘリカーゼおよびポリ
ヌクレオチドに結合された１つまたは複数の分子ブレーキを含んでもよい。この種の修飾
は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５０４８３に記載されている。本明細書に説
明のいずれかのポリメラーゼが使用されうる。
鋳型ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼが鋳型ポリヌクレオチドを鋳型として使用して
修飾ポリヌクレオチドを形成する条件下で、ポリメラーゼと接触される。そのような条件
は当技術分野で公知である。例えば、ポリヌクレオチドは、通常、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）の緩衝液など市販のポリメラーゼ緩衝液でポリメラーゼ
と接触する。プライマーまたは３’ヘアピンは、通常、ポリメラーゼ伸長のための核形成
点として使用される。
膜貫通ポアを使用するポリヌクレオチドの特徴付け、例えばシーケンシングは、通常、
ｋ個（ここで、ｋは正の整数である）のヌクレオチドからなるポリマー単位（つまり、「
ｋマー」）を分析することを含む。このことは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０
５２３４３（国際公開第２０１３／０４１８７８号パンフレットとして公開）で説明され
ている。異なるｋマーについて電流測定値間に明確な区別があることが望ましいが、これ
らの測定値の一部が重複することが一般的である。特に、ｋマーにおけるポリマー単位の
高い数、つまりｋが高値の場合では、異なるｋマーによって生じる測定値を解明すること
が困難になり、ポリヌクレオチドについての情報の導出、例えばポリヌクレオチドの基礎
となる配列の推定に不利益をもたらす可能性がある。
標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のヌクレオチド種を修飾ポリヌクレオチドの異
なるヌクレオチド種と置き換えることによって、修飾ポリヌクレオチドは、標的ポリヌク
レオチドとは異なるｋマーを含有する。修飾ポリヌクレオチドの異なるｋマーは、標的ポ
リヌクレオチドのｋマーとは異なる電流測定値を生じることができ、したがって、修飾ポ
リヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドとは異なる情報を提供する。修飾ポリヌクレオチ
ドからの追加情報は、標的ポリヌクレオチドを特徴付けることをより容易にすることがで
きる。一部の例では、修飾ポリヌクレオチド自体が、特徴付けが容易でありうる。例えば
、修飾ポリヌクレオチドは、電流測定値間の分離増加もしくは明確な分離を有するｋマー
またはノイズを減少させるｋマーを含むように設計してもよい。
好ましくは、ポリメラーゼは、修飾ポリヌクレオチドを形成するとき、標的ポリヌクレ
オチドの２つ以上のヌクレオチド種を異なるヌクレオチド種と置き換える。ポリメラーゼ
は、標的ポリヌクレオチドの２つ以上のヌクレオチド種のそれぞれを別個のヌクレオチド
種と置き換えうる。ポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドの２つ以上のヌクレオチド種
のそれぞれを同じヌクレオチド種と置き換えうる。
標的ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、修飾体における異なるヌクレオチド種は、
通常、アデニン、グアニン、チミン、シトシンもしくはメチルシトシンとは異なる核酸塩
基および／またはデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシシチジ
ンもしくはデオキシメチルシチジンと異なるヌクレオシドを含む。標的ポリヌクレオチド
がＲＮＡである場合、修飾ポリヌクレオチドにおける異なるヌクレオチド種は、通常、ア
デニン、グアニン、ウラシル、シトシンもしくはメチルシトシンとは異なる核酸塩基およ
び／またはアデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンもしくはメチルシチジンとは異
なるヌクレオシドを含む。異なるヌクレオチド種は、上記に説明した普遍的ヌクレオチド
のいずれであってもよい。
ポリメラーゼは、１つまたは複数のヌクレオチド種を、１つまたは複数のヌクレオチド
種に存在しない化学基または原子を含む異なるヌクレオチド種と置き換えることができる
。化学基は、プロピニル基、チオ基、オキソ基、メチル基、ヒドロキシメチル基、ホルミ
ル基、カルボキシ基、カルボニル基、ベンジル基、プロパルギル基またはプロパルギルア
ミン基でありうる。
ポリメラーゼは、１つまたは複数のヌクレオチド種を、１つまたは複数のヌクレオチド
種に存在する化学基または原子を欠く異なるヌクレオチド種と置き換えることができる。
ポリメラーゼは、１つまたは複数のヌクレオチド種を、負への帯電が変化した異なるヌク
レオチド種と置き換えることができる。負への帯電が変化した異なるヌクレオチド種は、
好ましくはハロゲン原子を含む。
方法は、好ましくは、修飾ポリヌクレオチドにおける１つまたは複数の異なるヌクレオ
チド種から核酸塩基を選択的に除去するステップをさらに含む。
他の特徴付けの方法
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼがヌクレオチドをポリヌクレオ
チドに組み入れるときに放出される標識された種を検出することによって特徴付けられる
。ポリメラーゼはポリヌクレオチドを鋳型として使用する。標識された種はそれぞれ各ヌ
クレオチドに対して特異的である。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡ
ナノポア、ポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドと、ポリメラーゼによってヌクレ
オチドがポリヌクレオチドに添加されたときにリン酸標識された種が順次放出されるよう
に接触され、ここでリン酸種はそれぞれのヌクレオチドに対して特異的な標識を含有する
。ポリメラーゼは、上記に説明したポリメラーゼのいずれであってもよい。リン酸標識さ
れた種は、ポアを使用して検出され、それによってポリヌクレオチドが特徴付けされる。
この種の方法は、欧州出願番号１３１８７１４９．３（欧州特許出願公開第２６８２４６
０号明細書として公開）に開示されている。上記に説明した実施形態のいずれも、本方法
に同様に適用される。
キット
本開示の別の態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットも提供する。キ
ットは、本明細書に記載のいずれか１つの修飾ＣｌｙＡナノポアおよび膜の成分を含む。
膜は、好ましくは成分から形成されている。ポアは、好ましくは膜に存在する。キットは
、両親媒性層またはトリブロックコポリマー膜などの上記に開示した膜のいずれかの成分
を含みうる。
キットは、ポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含んでもよい。
キットは、ポリヌクレオチドを膜に結合するための１つまたは複数のアンカーをさらに
含んでもよい。
キットは、さらに、上述の実施形態のいずれかを実施することを可能にする１つまたは
複数の他の試薬または機器を含んでもよい。そのような試薬または機器としては、以下の
１つまたは複数が挙げられる：適切な緩衝液（水溶液）、対象から試料を取得するための
手段（例えば、針を含む容器または機器）、ポリヌクレオチドを増幅および／もしくは発
現するための手段、または電圧もしくはパッチクランプ装置。試薬は、流体試料により試
薬が再懸濁されるように、乾燥状態でキットに存在してもよい。またキットは、任意選択
的に、キットを本明細書に記載のいずれか１つの方法で使用することを可能にする指示書
、または方法を使用することができる生物についての詳細を含んでもよい。
装置
本明細書に記載の別の態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための装置も提供す
る。装置は、複数の本明細書に記載される修飾ＣｌｙＡナノポアと、複数の膜とを含む。
一部の実施形態では、複数の修飾ＣｌｙＡナノポアは、複数の膜に存在する。一部の実施
形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアの数と膜の数は等しい。一実施形態では、単一の修飾Ｃ
ｌｙＡナノポアが、それぞれの膜に存在する。
装置は、さらに、本明細書に記載されるいずれかの方法を実施するための指示書を含ん
でもよい。装置は、ポリヌクレオチド分析のための任意の従来の装置、例えばアレイまた
はチップを含んでもよい。例えば、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための方法を参照
して上記に説明した実施形態のいずれも、本明細書に記載の装置に同様に適用可能である
。装置は、本明細書に記載のキットに存在するいずれかの特色をさらに含んでもよい。
一部の実施形態では、装置は、例えば、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための、本
明細書に記載のいずれかの方法を実施するように設定される。
一実施形態では、装置は、（ａ）複数の修飾ＣｌｙＡナノポアおよび膜を支持すること
ができ、ナノポアおよび膜を使用するポリヌクレオチドの特徴付けの実施を操作可能であ
るセンサーデバイス、ならびに（ｂ）特徴付けを実施するための材料の送達のための少な
くとも１つのポートを含む。
代替的に、装置は、（ａ）複数の修飾ＣｌｙＡナノポアおよび膜を支持することができ
、ナノポアおよび膜を使用するポリヌクレオチドの特徴付けの実施を操作可能であるセン
サーデバイス、ならびに（ｂ）特徴付けを実施するための材料を保持するための少なくと
も１つのリザーバを含んでもよい。
別の実施形態では、装置は、（ａ）膜および複数の修飾ＣｌｙＡナノポアおよび膜を支
持することができ、ポアおよび膜を使用するポリヌクレオチドの特徴付けの実施を操作可
能であるセンサーデバイス、（ｂ）特徴付けを実施するための材料を保持するための少な
くとも１つのリザーバ、（ｃ）少なくとも１つのリザーバからセンサーデバイスへ材料を
制御可能に供給するように構成された流体システム、ならびに（ｄ）各試料を受けとるた
めの１つまたは複数の容器を含んでもよく、流体システムは、１つまたは複数の容器から
センサーデバイスへ試料を選択的に供給するように構成されている。
装置は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７（国際公開第２００９／０７７
７３４号パンフレットとして公開）、ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９（国際公開第２０
１０／１２２２９３号パンフレットとして公開）、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ１０／００
２２０６（国際公開第２０１１／０６７５５９号パンフレットとして公開）または国際出
願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９（国際公開第００／２８３１２号パンフレットとし
て公開）に記載の装置のいずれかであってもよい。
さらなる労作を要せずに、当業者は、上記の記載に基づいて、十分に本開示を利用する
ことができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示にすぎず
、いかなる方法においても本開示の残部を限定するものではないと解釈される。本明細書
で引用された全ての刊行物は、本明細書で言及される目的や主題を参照して組み込まれら
れる。
＜実施例１＞
生理学的イオン強度でのＤＮＡ移行を可能にするナノポアの正確なナノスケール改変
生物学における重要なプロセスの多くには、ナノメートルスケールのポアを通じたバイ
オポリマーの移行が関与しており、例えば、核ポアを横切る核酸輸送、膜チャネルを通じ
たタンパク質移行、および標的細胞へのウイルスＤＮＡの注入などがある。さらに隔離膜
に埋め込まれた生物学的および人工的ナノポアは、このプロセスを調査するための有用な
ツールを提供し、迅速なＤＮＡまたはタンパク質シーケンシング、単一分子ＤＮＡシーケ
ンシングおよび分析、ならびにバイオマーカーセンシングにおける適用を見出しうる。ナ
ノポアを横切るＤＮＡ移行の機構が、特に調査されてきた。いくつかのポータルバクテリ
オファージタンパク質の結晶構造は、ＤＮＡ詰め込みおよび注入の間に、ｄｓＤＮＡが、
正電荷の環で飾られた強い負の表面を有する狭いナノポア（約３．５ｎｍ）を横切って移
行することを明らかにした。ナノポアの負に帯電した内側表面は、負に荷電したＤＮＡの
スライディングを容易にすることが提唱されており、一方で正電荷の役割は、このプロセ
スを促進することと考えられている。この実施例では、生理学的イオン強度で、ポータル
タンパク質と同じ折り畳み、大きさおよび全体的内部電荷を有するＣｌｙＡナノポアを横
切るＤＮＡの電気泳動的移行が、正電荷の２つの環がナノポアの広い入り口および中間部
で改変されている場合にのみ観察することができることが見出される。驚いたことに、ナ
ノポアの強い負に帯電した３．３ｎｍの内部くびれは、修飾を必要としなかった。この知
見は、正電荷の改変が、狭いくびれを通じたＤＮＡ移行のためのエントロピーおよび静電
障壁克服のために、ＤＮＡを整列させるために重要であることを示す。理論に制限される
ことは望まないが、負電荷密度を有する狭いナノポアを通じて移行するために、ＤＮＡ分
子は配向される必要がある。
脂質膜に再構成された生物学的ナノポアを流れるイオン電流は、低分子または折り畳ま
れたタンパク質を同定し、単分子レベルでの化学的または酵素的反応をモニターするため
に使用されてきた。人工膜に再構成されたナノポアを横切るＤＮＡの電気泳動的移行は、
ＤＮＡシーケンシングおよびバイオマーカー認識などの実用的用途のために大きな期待が
持たれる。それ自体膜タンパク質ではないφ２９のポータルタンパク質は、黒い脂質二重
層に挿入されることが見出され、そのようなナノポアは１．０／０．５ｍＭのＮａＣｌで
ｄｓＤＮＡを電気泳動的に移行した。しかしながら、膜挿入を可能にするナノポアの正確
な疎水性修飾は分からなかった。実際、φ２９ナノポアは、時に脂質膜から放出され、し
たがって実用的用途には制限が課される。ｄｓＤＮＡは、グラフェンまたは二硫化モリブ
デンの二重層などの原子層材料を除いて大抵が負の内部表面電荷を有する固体膜上に調製
した人工ナノポアを通って移行することが示されている。溶液のデバイ長に匹敵する半径
を有するそのようなナノポアにおいて、内側ナノポア壁上の電気二重層（ＥＤＬ）によっ
て生じる表面電位が重なり、ＤＮＡのナノポアへの進入に対して大きな静電障壁をもたら
す。結果として、固体ナノポアを横切るＤＮＡの移行は、生理学的イオン強度で大きなナ
ノポア（１０ｎｍ）を使用してまたは３４０ｎＭの塩もしくは非対称塩濃度下で小さいナ
ノポア（約３．５ｎｍ）を使用する。さらにＤＮＡの大きさに匹敵する直径（ｄｓＤＮＡ
のＢ形態について約２．２ｎｍおよびｓｓＤＮＡについて約１ｎｍ）を有する固体ナノポ
アを横切るＤＮＡの移行は、生理学的イオン強度でまだ観察されていない。
約３．３ｎｍの内部くびれを有する１２量体タンパク質であるＣｌｙＡナノポア（図１
、パネルＡ）は、折り畳まれたタンパク質を調査するためのツールとして使用されてきた
。ナノポアを横切るｄｓＤＮＡ移行が２．５ＭのＮａＣｌ溶液で観察されたが、ポアの強
力な負の内側（図１、パネルＡ）により、より低いイオン強度でのＤＮＡ移行は防止され
た。この実施例では、ＣｌｙＡナノポアが改変され、生理学的イオン強度でのＤＮＡの移
行が可能となった。これは、分子とＤＮＡとの間の静電相互作用が重要である多くの用途
で有用であり、例えば、ナノポアを横切るＤＮＡの移行を制御したりまたはＤＮＡ－タン
パク質相互作用を研究したりするのに酵素が使用される、ＤＮＡシーケンシングまたはマ
ッピングにおいて有用である。ＤＮＡ移行は、正電荷の２つの環がナノポアのより広いｃ
ｉｓ側に添加された後に観察され、一方、ナノポアのｔｒａｎｓ側入口をよりくびれさせ
る修飾は、ＤＮＡ移行の効率を改善しなかった。さらに、修飾はナノポアのイオン選択性
を変化させず、φ２９ポータルタンパク質の電荷分布を反映していた。さらに、改変され
たポアは、ナノポアの広い側からのみＤＮＡの移行を可能にした。興味深いことに、ＤＮ
Ａ上をスライディングする多くのタンパク質が、改変されたＣｌｙＡナノポアと類似の表
面電荷を示し、正および負電荷の改変が、ナノスケールの両端を横切るＤＮＡ移行を改善
するための全体的機構を提供しうることが示される。この実施例は、ナノポアの形状およ
び内部表面電荷の正確な改変が、ＤＮＡと同様の直径を有するナノスケールポアを横切る
ＤＮＡの移行およびスライディングのために重要であることを示す。
結果
ＤＮＡを捕捉するためのＣｌｙＡナノポアの改変
ＣｌｙＡ－ＡＳ（図１、パネルＡ；図１１、パネルＡ）は、平面脂質二重層におけるそ
の有利な特性のために選択された、チフス菌（Salmonella typhi）由来の細胞溶解素Ａの
改変バージョンであり、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの移行が、２．０Ｍを超えるＮａＣ
ｌイオン強度でのみ観察される。おそらく、低イオン強度ではナノポア内部の強い負の静
電電位（図１１、パネルＢ）がＤＮＡ進入および移行を防止し、一方で高イオン強度では
ナノポア表面の電荷が効果的に遮蔽される。生理学的イオン強度でのナノポアによるＤＮ
Ａの捕捉を誘導するために、ＣｌｙＡ－ＡＳナノポアの内部電荷を修飾した（表１および
２ならびに図１、パネルＡ；図１１、パネルＡ）。ＣｌｙＡバリアントは、時折、開口ポ
アコンダクタンス（ゲーティング）の一時的な減少を示した。ゲーティングの測定値とし
て、典型的ナノポアを３０秒のタイムスパンで開口のままとする印加電圧として定義され
るゲーティング電圧（ＶＧ）（表１）を使用した。修飾ナノポアを通じたＤＮＡの移行は
、１μＭの９０量体３’－ビオチン化ｓｓＤＮＡ分子（図１、パネルＡ；表３）、次いで
等モル濃度のその相補鎖（図１、パネルＢ；表３）、そして最後にニュートラアビジン（
１．２μＭ、モノマー）を添加することによって、ＶＧで試験した。
アルギニン残基の形態での正電荷の単一環をＣｌｙＡ－ＡＳのｃｉｓ側入口（Ｓ１１０
Ｒ、ＣｌｙＡ－Ｒ、図１、パネルＡ；図１１、パネルＡ）に導入し、次いでナノポアの３
つの部分：ｃｉｓ側入口、中間部およびｔｒａｎｓ型くびれを修飾した（図１、パネルＡ
；図１１、パネルＡ）。ＣｌｙＡ－Ｒのｃｉｓ開口部での陽性残基を用いた中性残基の置
換は、１５０ｍＭのＮａＣｌでＤＮＡ移行を示さなかった（表１、表２）。ｃｉｓ開口部
での追加的正電荷は、平面脂質二重層へのチャネル挿入なし（ＣｌｙＡ－Ｒ－Ｅ１０６Ｒ
およびＣｌｙＡ－Ｒ－Ｄ１１４Ｒ）、または１５０ｍＭのＮａＣｌでのＤＮＡ移行なし（
ＣｌｙＡ－Ｒ－Ｄ１２２ＲおよびＣｌｙＡ－Ｒ－Ｄ１２９Ｒ）のいずれかを示した。Ｃｌ
ｙＡ－Ｒナノポアの中間部のアルギニン環は、６４位の負に荷電したグルタミン酸残基が
アルギニンで置き換えられたとき（Ｄ６４Ｒ、ＣｌｙＡ－ＲＲ）、ｓｓＤＮＡ（図１、パ
ネルＣ）およびｄｓＤＮＡ（図１、パネルＤ）の移行を誘導したが、近い位置の中性側鎖
がアルギニンで置換されたとき（Ｑ５６Ｒ）は誘導しなかった。アルギニンでの近い位置
での中性側鎖の置換（Ｑ５６Ｒ）、膜貫通領域における負に荷電した残基の除去（Ｃｌｙ
Ａ－Ｒ－Ｅ１１Ｓ）または正に荷電した残基の付加（ＣｌｙＡ－Ｒ－Ｑ８Ｋ）のいずれも
、１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液でＤＮＡ移行イベントを誘導しなかった（図６）。驚いたこ
とに、ＣｌｙＡ－Ｒの中間部およびｔｒａｎｓ側入口の両方における中性残基の正に荷電
した残基での置換（ＣｌｙＡ－Ｒ－Ｑ５６Ｒ－Ｑ８Ｋ）もＤＮＡ移行イベントを誘導しな
かった（図６）。ＣｌｙＡ－Ｒ－Ｄ１２９Ｒを除いて、試験した全ての変異はゲーティン
グ電圧を減少させた（表１）。ＣｌｙＡ－ＲＲは、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡのいずれ
かをナノポアのｃｉｓ側に添加した後、ＤＮＡ誘導電流イベントを示した唯一のＣｌｙＡ
変異体であった（＋７０ｍＶ、図１Ｃ～Ｄおよび６）。ＣｌｙＡ－ＲＲのみがＤＮＡ移行
を可能にしたという観察にもかかわらず、ＣｌｙＡ－ＲＲ、ＣｌｙＡ－ＲおよびＣｌｙＡ
－ＡＳは全て同じイオン選択性を示し（それぞれＰＮａ＋／ＰＣｌ－＝１．９±０．７、
２．０±１．６、１．９±０．９、表４）、ナノポアのイオン選択性は、ナノポアの膜貫
通領域の電荷分布によって支配され、ナノポアを通じた増強電気浸透流によって誘導され
ないことが示された。
より一般的には、領域Ａ（図２０に示される）における第１のアミノ酸の置換は、少な
くともデルタ１のさらなる正電荷（つまり、正に荷電したアミノ酸による中性アミノ酸の
置換）を有することができ、領域Ｂにおける置換は、少なくともデルタ２のさらなる正電
荷（つまり、正に荷電したアミノ酸による負に荷電したアミノ酸の置換）を有することが
できる。
２つの追加のアルギニン環によって生じる静電電位の変化へのさらなる洞察を得るため
に、ＣｌｙＡ－ＡＳおよびＣｌｙＡ－ＲＲの全原子ホモロジーモデルを、ＶＭＤ（Humphr
ey et al. J. Mol. Graphics (1996) 14: 33-38）およびＮＡＭＤ（Phillips et al., J.
Comput. Chem. (2005) 26: 1781-1802）を使用し、大腸菌（E. coli）ＣｌｙＡ結晶構造
から開始して構築した。例えば、Baker et al., PNAS (2001) 98: 10037-10041、Dolinsk
y et al., Nucleic Acids Res. (2004) 32: W665-W667およびDolinsky et al., Nucleic
Acid Res. (2007) 35: W522-W525に記載されているアダプティブポアソンボルツマンソル
バ（ＡＰＢＳ）を使用して、１５０ｍＭのＮａＣｌにおける両方のポアの電位分布を計算
した（図１１、パネルＢ）。ＣｌｙＡ－ＡＳでは、ポアの中心での電位は、ｃｉｓ側入口
から中間部を通じてｔｒａｎｓ側入口へ、負への帯電を増加するように動くことが分かっ
た（それぞれ平均で－２．６、－４．８および－１５．２ｍＶ）。ＣｌｙＡ－ＲＲの場合
には、電位の上昇を、ポアのｃｉｓ側入口および中間部の両方で観察することができた（
それぞれ平均で－０．３および－１．１ｍＶ）。ｔｒａｎｓ型くびれの電位は、平均－１
７．３ｍＶへさらに低下するように見えた。これらの値は外部バイアスが印加されない場
合で計算されていることに留意されたい。
表１：改変されたＣｌｙＡナノポアバリアントの電気的特性。ナノポアの活性を、約０
．１ｎｇのオリゴマータンパク質をｃｉｓチャンバーに添加することによって試験した。
負の活性は、チャネル挿入が観察されなかったことを示す。ＶＧは、ゲーティング電圧で
あり、３０秒のタイムスパン内でゲーティングイベントが観察されなかった最も高い印加
電圧を表す。ＤＮＡ移行は、ｄｓＤＮＡロタキサンを形成できたことを示す。各データ点
は少なくとも３回の実験の平均であり、誤差は標準偏差である。実験は、０．１５ＭのＮ
ａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５溶液中で実施した。
Figure 2022046503000003
ＤＮＡ移行のプルーフとしてのＤＮＡロタキサン
ロタキサンは、２つのストッパーによりロックされたスレッドを取り囲む大環状環によ
って形成されたダンベル形状分子である。この実施例では、２つのナノポア／ＤＮＡロタ
キサンを１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液中で形成し、ナノポアを通じたｓｓＤＮＡおよびｄｓ
ＤＮＡの移行を立証した。第１のロタキサンは、１００マーの５’－ビオチン化ｓｓＤＮ
Ａ分子を、ｃｉｓコンパートメントに添加する最初のスレッド（２ａ、表３）として使用
して形成した。第２のロタキサンは、３１塩基の３’ビオチンオーバーハングで延長した
３’－ビオチン化５９塩基対ｄｓＤＮＡ分子（１ａ／１ｃ、表３）を使用して形成した。
ナノポアの反対側に、２ａまたは１ａ／１ｃのオーバーハングにハイブリダイズするよう
に設計されたそれぞれ別のビオチン化ｓｓＤＮＡ分子２ｂ（５０マー、５’－ビオチン化
）または１ｄ（３１マー、３’－ビオチン化）を添加することによって、ロタキサンをロ
ックした。ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ溶液の両方が、ビオチンと複合体化してナノポアを横
切るＤＮＡ鎖の全移行を防止するニュートラアビジン（ＮＡ、０．３μＭ）を含有してい
た。
１５０ｍＭのＮａＣｌおよび＋５０ｍＶでは、ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮ
Ａの両方がナノポアを通過したが（それぞれＩＲＥＳ＋５０ ９２±０．０２、および０
．８４±０．０７、Ｎ＝３）、印加電位が－５０ｍＶに逆転したときポアから排出された
（図２、パネルＡ～Ｂ）。その後のＤＮＡ：ニュートラアビジンストッパーのｔｒａｎｓ
溶液への添加は、両方の電位で永続性封鎖を誘導し、ＤＮＡロタキサンの構築を示し、両
方のスレッドがナノポアに移行されたことを示した。負の印加電位で、両方のロタキサン
について、封鎖イオン電流は、開口ポア電流より高かった（ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡ
／ｓｓＤＮＡスレッドについてそれぞれＩＲＥＳ－５０＝１．１６±０．０３および１．
１１±０．０６、Ｎ＝３の独立したナノポア実験、図２、パネルＡ～Ｂ；図１２、パネル
Ａ～Ｂ）。この効果は、以前に低イオン強度での１０ｎｍの固体ナノポアを通じたＤＮＡ
の移行について観察され、ＤＮＡ封鎖ポア内部の対イオン蓄積によって説明された。対照
的に、正の印加電位で、開口ポア電流は封鎖電流より高く（図１、パネルＣ～Ｄおよび図
２、パネルＡ～Ｂ；図１２、パネルＡ～Ｂ）、この構成において、ニュートラアビジンが
ナノポアの内腔と相互作用している可能性があり、ＤＮＡ上の対イオンの蓄積はナノポア
のｃｉｓ側とｔｒａｎｓ側とで異なっていることが示された。
ＤＮＡ捕捉／通過および移行は、溶液のイオン強度に依存する
イベント間時間τｏｎの逆数である捕捉率ｋｏｎ（表７、＋７０ｍＶ、１μＭのＤＮＡ
）は、ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡの両方が、溶液のデバイ長（λＤ）と共に増加した（
図３、パネルＢ～Ｃ；図１３、パネルＡ～Ｂ）。しかしながら、ｄｓＤＮＡ捕捉率はλＤ
と共に直線的に増加し（図１３、パネルＡ）、一方でｓｓＤＮＡ捕捉率はλＤと共に指数
的に増加した（図１３、パネルＢ）。したがって、これにより、ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤ
ＮＡについて異なる捕捉機構が示される。ｃｉｓ側に添加されたｄｓＤＮＡ移行の頻度は
溶液のデバイ長と共に直線的に増加し（＋７０ｍＶ、図３Ａ、７および８）、ＤＮＡとナ
ノポアとの間の静電相互作用がＤＮＡ進入および移行のために重要であることが示された
。固体ナノポアを用いて以前に報告されているようにＤＮＡ封鎖ナノポアの残留電流は、
溶液のイオン強度が減少するにつれて増加した（例えば、２．５ＭのＮａＣｌで０．７８
±０．０９から１５０ｍＭのＮａＣｌで０．９２±０．０２へ）。興味深いことに、ＤＮ
Ａ封鎖のＩＲＥＳと溶液のデバイ長との間の直線関係が明らかになった（図３、パネルＢ
～Ｃ）。ニュートラアビジンと複合体化したｄｓＤＮＡでは、残留電流が、遊離のＤＮＡ
移行の間より約１０％低く、ニュートラアビジンが、おそらくはナノポア内腔との相互作
用によって、封鎖の全体的なイオン電流に寄与していることが示された。
ｓｓＤＮＡ移行の頻度は、溶液のデバイ長と共に、直線的（Ｒ２＝０．７８）ではなく
指数的（Ｒ２＝０．９９）に増加し（図３、パネルＣ）、ＣｌｙＡ内腔における改変され
た正電荷とＤＮＡとの間の相互作用以外のさらなる因子が、ナノポア進入および／または
移行のために重要な役割を果たしていることが示された。１５０ｍＭのＮａＣｌでは、ニ
ュートラアビジンと複合体化したｓｓＤＮＡ分子がＣｌｙＡ－ＲＲナノポアに対して永続
性封鎖を示したが、一方で、１Ｍ以上のＮａＣｌでは、封鎖は一過性であった（図３、パ
ネルＤ；図１０）。これらのデータについて考えられる説明は、高イオン強度において、
ｓｓＤＮＡがｃｉｓ側からポアに入ってｃｉｓ側から出るということである。イオン強度
≧１Ｍで、ニュートラアビジンの存在および非存在下でｓｓＤＮＡについてのＩＲＥＳ値
は同じであり（図３、パネルＣ；図１０）、これらの条件下でｓｓＤＮＡが完全にナノポ
アを通過しておらず、ニュートラアビジンがＣｌｙＡの内腔と相互作用することを妨げて
いる可能性があることが示された。
ＤＮＡのＣｌｙＡナノポアへの一方向性進入
１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液および負の印加電位下（最大－１００ｍＶ）では、１μＭの
ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡのＣｌｙＡ－ＲＲのｃｉｓおよびｔｒａｎｓコンパートメン
トへの添加はＤＮＡ封鎖を誘導せず、ＤＮＡがナノポアのｔｒａｎｓ入り口からナノポア
に入ることができないことが示された（図４、パネルＡ）。正の印加バイアス下では、電
流封鎖が約＋５０ｍＶよりも高い電位で現れ、ナノポアのｃｉｓ側からのｓｓＤＮＡの移
行について電圧閾値が存在することが示唆された。しかしながら、ｔｒａｎｓコンパート
メントからのＤＮＡの進入（図４、パネルＢ）および移行（図９）が１ＭのＮａＣｌ溶液
で観察され、１５０ｍＭのＮａＣｌでのｔｒａｎｓコンパートメントからの移行を防止す
るエネルギー障壁が、本質的に静電的であることを示した。
生理学的イオン強度下でのｔｒａｎｓコンパートメントからのＤＮＡの進入を観察する
ために、ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアの膜貫通領域の変化を再モデル化した（表５および図１
０）。ナノポアの膜貫通領域における負に荷電した残基の置換は、負に印加した電位下で
１μＭのｄｓＤＮＡ１をｔｒａｎｓチャンバーに添加したとき電流封鎖を誘導しないこと
が分かり（図１０）、これらの条件下でＣｌｙＡ－ＲＲナノポアのｃｉｓおよびｔｒａｎ
ｓ側からのＤＮＡの移行に対しての比較的大きな非対称障壁が示された。
考察
正確なナノポア改変は、生理学的イオン強度でのＤＮＡ移行を支援する
この実施例では、ＣｌｙＡナノポアを、生理学的イオン強度でＤＮＡの電気泳動的移行
が可能となるように改変した。ＤＮＡ移行は、２組の正電荷をＣｌｙＡナノポアの入口お
よび中間部に導入したときに観察された（図１１、パネルＡ）。驚いたことに、ＤＮＡ移
行について最も高いエントロピーおよび静電障壁を示すナノポアのｔｒａｎｓ側入口（図
１１、パネルＡ～Ｂ）では、修飾を必要としなかった。さらに、ＣｌｙＡのｔｒａｎｓ側
入口の電荷への広範囲の再モデル化（表１～２）にもかかわらず、ＤＮＡ移行は、ナノポ
アの広い方のｃｉｓ側入口から開始したときにのみ観察することができた。さらに、Ｃｌ
ｙＡ－ＲＲナノポアを通じたｄｓＤＮＡ移行の頻度は、溶液のデバイ長と共に増加し（図
１３、パネルＡ）、ｄｓＤＮＡとＣｌｙＡ－ＲＲのｃｉｓ側入口との好ましい静電相互作
用が、ＤＮＡとナノポアくびれとの好ましくない静電反発力を上回ることを示した。ｄｓ
ＤＮＡの剛性が、試験したイオン強度の範囲にわたって顕著に変化していないことに留意
されたい。さらに、イオン強度が低下するときの電気浸透流の増加は、電気浸透流がＤＮ
Ａ進入および移行と対向するものであることから、ＤＮＡ移行の頻度増加を説明すること
はできない。したがって、これらのデータは、ナノポアのｃｉｓ内腔が、ナノポアのくび
れを通じたＤＮＡの移行を開始するために重要であることを示す。
ナノポアを通って移行するＤＮＡ分子は、電気的駆動力を受け、さらにＤＮＡの移行に
対向するナノポア内部の電気浸透流（ＥＯＦ）から生じる流体力学的粘性抵抗力を受ける
。ＣｌｙＡおよびほとんどの固体ナノポアは、通常、電気二重層（ＥＤＬ）と呼ばれる、
表面と直接接触する陽イオンの層によって、静電的に均衡した負の表面電荷を有する。印
加された電場下では、ＥＤＬにおけるイオンの移動は対イオンの優先的移行を誘導し、次
いでＥＯＦを生じ、ナノポアをイオン選択的にする（例えば、ＣｌｙＡ－ＡＳ ＰＮａ／
Ｐｋ＝１．９、表２）。電解質による遮蔽により、ＥＤＬ力は、拡散層にわたって指数的
様式で減衰する。デバイ長および表面電位によるその強度によって、この力には一定の範
囲が与えられる。狭いナノポアでは、特に低塩濃度の状況では、拡散層を含むＥＤＬの厚
さはナノポアの大きさに匹敵する可能性があり、重複したＥＤＬを生じうる。このレジー
ム下では、そのようなナノポアに接近するＤＮＡ分子（直径２．２ｎｍ）は、負の表面電
荷を有するナノポアに対してＤＮＡのナノポアへの進入に対向する強い表面電位を受ける
。
ＣｌｙＡナノポアを通じたｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ移行の機構
ＣｌｙＡは、円筒形のｃｉｓ内腔（５．５ｎｍの直径および１０ｎｍの長さ）とそれに
続く、より小さな負に荷電したｔｒａｎｓ型くびれ（３．３ｎｍの直径および３．０ｎｍ
の長さ、図１）によって近似することができ、このくびれは、ＤＮＡ移行のための主な電
気泳動およびエントロピー障壁に対向すると予測される。驚いたことに、ＣｌｙＡナノポ
アを通じたＤＮＡの移行が、一組の正電荷をナノポア（ＣｌｙＡ－ＲＲ）のｃｉｓ内腔に
添加したときに観察されたが、ナノポアのくびれは何ら修飾を必要としなかった。Ｃｌｙ
Ａのｔｒａｎｓ入り口への広範囲の修飾（表２）にもかかわらず、ＤＮＡ移行は、ナノポ
アの広い方のｃｉｓ側から開始したときにのみ観察される場合があり、ナノポアのｃｉｓ
内腔がナノポアを通じたＤＮＡの移行を開始するために重要であることが示唆された。Ｃ
ｌｙＡ－ＲＲナノポアを通じた二本鎖ＤＮＡの移行の頻度は、溶液のデバイ長と共に直線
的に増加し（図３、パネルＡ）、ｄｓＤＮＡとＣｌｙＡ－ＲＲにおける改変電荷との静電
相互作用は、移行プロセスに対向するのではなく、むしろ好ましいことが示された。生理
学的イオン強度でのｔｒａｎｓ型くびれを通じたｄｓＤＮＡの移行が、ｄｓＤＮＡ鎖がナ
ノポアのｃｉｓ内腔によって予め整列されたときに達成されるというモデルが提唱される
（図５、パネルＡ）。この概念では、ｄｓＤＮＡは、最初にｃｉｓ側入口で電荷と相互作
用し、次いでポアの内腔に入り、内腔でナノポアの中間部のアルギニン残基とさらに相互
作用する（図１、パネルＡ）。これらの静電相互作用は、ＤＮＡのリン酸基を「把持」し
、ＤＮＡがｃｉｓ溶液へ戻って出ていくのを防止する。この構成において、ｄｓＤＮＡは
、電気泳動力が最も強いｔｒａｎｓ型くびれに入るように整列され、これによりナノポア
を横切るＤＮＡの円滑な移行が可能となる（図５、パネルＡ）。
ｓｓＤＮＡ封鎖のデバイ長依存性が、ｄｓＤＮＡについて観察されるような直線関数で
はなく、単一指数関数に良くフィットすることが観察され（図３、パネルＡ）、ｄｓＤＮ
Ａと比較して、ｓｓＤＮＡの移行には、さらなる因子が影響を与えていることが示唆され
た。この実験では、ＤＮＡが完全に引き延ばされたときの全長であるＤＮＡ輪郭長はｄｓ
ＤＮＡの持続長（約５０ｎｍ）よりも小さく、ｄｓＤＮＡ分子が剛性ロッドとして移行す
ることが示される（図５、パネルＡ）。対照的に、ｓｓＤＮＡは、ポリマーコイルにおけ
るその重心からの任意の点の平均２乗距離である回転半径が約６ｎｍであるコイル構造（
持続長約１．５ｎｍ）を有する。回転半径は、ナノポアのｃｉｓ入り口の直径と同様であ
るので（図５、パネルＢ）、ｓｓＤＮＡは、おそらく部分的にコイル構造（図５、パネル
Ｂ）としてナノポアのｃｉｓ側に入る。ｓｓＤＮＡがｃｉｓリザーバからｔｒａｎｓ側へ
移動するとき、次いでナノポアのｔｒａｎｓ型くびれを通じて航行するためには、コイル
が徐々に解かれなければならず、その後、反対側で再コイル化されなければならない（図
５、パネルＢ）。高イオン強度で、印加電位に対してナノポアからの固定化ｓｓＤＮＡの
ｃｉｓ側排出を促進する、移行時のＤＮＡのコンフォメーション変化に関連する、解け、
再コイル化するエントロピー力は（図３、パネルＤ）、溶液のイオン強度の減少と共に低
下し、溶液のイオン強度が減少するときＤＮＡ移行の効率を増強させる。ＤＮＡ封鎖ナノ
ポア内部のイオン濃度およびデバイ長は不明であることに留意されたい。それにもかかわ
らず、両方がナノポア電流と相関し、同様にバルク電解質の濃度に関連する（図３、パネ
ルＢおよびＣ）。
ＤＮＡ移行の機構：ｄｓＤＮＡ捕捉は拡散律速であり、ｓｓＤＮＡ捕捉は反応律速であ
る
異なる塩濃度でのＤＮＡ移行実験は、ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡについて２つの異な
る捕捉機構を示した（それぞれ図１３、パネルＡ～Ｂ、および図１４、パネルＡ～Ｂ）。
ｄｓＤＮＡの挙動は、拡散律速捕捉プロセスと一致する。これは、この実験で使用するｄ
ｓＤＮＡがその持続長（１５０ｂｐ）より短く、剛性の一様な荷電ロッドとして挙動する
ことによる。捕捉半径内（０．５ｎｍのλＤについてナノポア中心から約５０ｎｍ）では
、電場がＤＮＡをポアに向かって引きつけ、一端がポア入口に当たるように電場線に沿っ
て整列させる（図１４、パネルＡ、ｉ）。ポア内に入ると、改変された電荷がＤＮＡと相
互作用し、ｃｉｓ溶液へと引き戻されるのを防止する（図１４、パネルＡ、ｉｉ～ｉｖ）
。したがって、ＤＮＡ捕捉の動力学は、電気泳動に由来する単純な誘引電位での拡散粒子
の動力学と近似されうる。この場合、ｄｓＤＮＡの電気泳動移動度は、溶液のデバイ長と
比例し、対応するドリフト拡散式は、下記でさらに詳細に記載されるように、正確に解明
することができる。ＣｌｙＡナノポアの幾何学的形状を、円筒の長さｌ＝１３ｎｍおよび
捕捉直径ｄ＝６ｎｍ（図１１、パネルＡ）で近似することで、捕捉頻度を、以下：
ｋｏｎ～１４λＤ（ｓ ｎｍ μＭ）－１
によって推定することができる。これは、λＤについての実験データ（高塩濃度、図１３
、パネルＡ）と非常に良く一致する。何らフィッティングパラメータが使用されていない
ので、これは顕著なことである。ただし、ＣｌｙＡの幾何学的形状は完全な円筒から著し
く逸脱しているため、ポアのパラメータの選択は、ある程度任意であることから、この比
較にはいくらか注意が必要である。低塩濃度（０．１５ＭのＮａＣｌ、λＤ＝０．８ｎｍ
）では、捕捉率は、上記式によって予測されるよりも高い（図１３、パネルＡ）。同様に
、モデルで考慮されていないＣｌｙＡ－ＲＲ入口での正電荷は、低塩濃度で捕捉を促進す
る一方、高塩濃度ではこれらの電荷がより有効に遮蔽される。
ｓｓＤＮＡについて、ｋｏｎとλＤとの関係は指数的であり、障壁横断（反応律速プロ
セス）と一致する。溶液では、ｓｓＤＮＡは、ＤＮＡがナノポアに近づくとき、コイル状
のコンフォメーションをとりながら電気泳動力によってナノポアの方へ引っ張られる（図
１４、パネルＢ、ｉ）。しかしながら、ポアの入口周辺では、鎖の一端がポアの入口に向
き（図１４、パネルＢ、ｉｉ）、ｓｓＤＮＡが解かれる（図１４、パネルＢ、ｉｉｉ、ｉ
ｖ）場合にのみ、移行イベントが上手く起こりうる。このエントロピー起源の追加的な反
発力は、実際上、移行の前に横断しなければならないエネルギー障壁を生じさせる。その
ような障壁によって制限される移行に関する理論が議論されてきており、一般的な理論で
は、捕捉率は、
Figure 2022046503000004
 で与えられる。ここでΔＦｂは障壁の高さであり、ωは障壁横断のための特有の試行率（
attempt rate）である。指数因子は、横断イベントの成功確率を与える。モデル入力から
、ΔＦｂの推定を達成しうる。移行の成功確率が、電気泳動移動度に比例し、同様にλＤ
に比例する項を含むことが示された。これによりλＤに対するｋｏｎの指数的依存性が説
明される（図１３、パネルＢ）。ｋｏｎはイベント間時間の逆数から取得されるが、測定
された電流封鎖の全てが必ずしも移行イベントを説明するものでないことに留意されたい
。これらの封鎖の一部はＤＮＡ鎖の進入とその後のｃｉｓ側への引き戻しによるものであ
りうる（図１４、パネルＢ、ｉｉｉからｉ）。それにもかかわらず、ロタキサンの形成は
、少なくとも一部の分子が上手く移行されることを示している。いずれの場合においても
、ｋｏｎのλＤに対する指数的依存性をもたらす引数は有効である。
生物学的意義
興味深いことに、ＣｌｙＡナノポアを通じたＤＮＡの移行を可能にする修飾は、生物学
的機能がＤＮＡに沿ってスライディングすることであるタンパク質においても観察される
。バクテリオファージでは、ＤＮＡは、整列し、同様の寸法、化学量論、内部表面電荷、
およびＣｌｙＡと同様の内部構造サイズを有するポータルタンパク質にＤＮＡを押し込む
タンパク質に詰め込むことによって、前駆型キャプシドに転送される。負の内部表面電荷
が、ポータルタンパク質を横切るＤＮＡの平滑な移行のために重要であるようであり、そ
の理由は、負の内部表面電荷が、ＤＮＡを包囲し、ＤＮＡに沿ってスライディングする、
β－クランプタンパク質などの他のタンパク質で観察されるからである。またポータルタ
ンパク質およびβ－クランプタンパク質は正に荷電した環を有し、この環は、移行するＤ
ＮＡの負荷電リン酸骨格との相互作用によって、ゲノムＤＮＡパッケージングに直接的な
役割を果たすことが提唱されている。ＣｌｙＡナノポアを通じたＤＮＡの電気泳動的移行
が、正電荷残基の２つの環がナノポアのｃｉｓ入り口および中間部に導入され、狭い負に
帯電したくびれを通じた移行のためにＤＮＡを整列させるときに観察することができた。
そのような相互作用がない場合、つまりｔｒａｎｓ側からの通過では、ＤＮＡ移行は観察
できなかった。したがって、本明細書に提示される結果は、接続タンパク質における正電
荷のそのような環がキャプシドを出て感染細胞へ入るＤＮＡの排出を開始するために重要
でありうることを示す。
この実施例では、改変されたＣｌｙＡ１２量体ナノポアＣｌｙＡ－ＲＲが、正電荷の２
つの環が導入されると、生理学的イオン強度でｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡを移行するこ
とが提示される。ＣｌｙＡ－ＲＲは、単一分子レベルでタンパク質－ＤＮＡ相互作用を研
究するために使用することができ、酵素がナノポアを通じた核酸の移行を制御するＤＮＡ
マッピングおよびシーケンシング用途で使用することができる。ナノポアの広い方の入口
（ｃｉｓ側）での誘引的相互作用となる正電荷の環の導入が、狭く負に荷電したｔｒａｎ
ｓ型くびれを通じたＤＮＡ移行を誘導するために重要であることが分かった。驚くべきこ
とに、くびれ自体は修飾を必要としなかった。これらの結果は、ナノポアの入口および中
間での誘引的相互作用が、狭く負に荷電したｔｒａｎｓ型くびれを通じた電気泳動駆動ス
ライディングを有効にするためのＤＮＡの「把持」および配向のために重要であることを
示す。興味深いことに、ＣｌｙＡ－ＲＲの電荷分布は、ウイルスのポータルタンパク質に
反映されており、生物学的ナノポアの正確な改変が、ウイルスキャプシド内外でのＤＮＡ
の効率的な詰め込みおよび排出のために重要であることが示される。さらに、ｄｓＤＮＡ
およびｓｓＤＮＡ移行の頻度の、それぞれ直線的および指数的イオン強度依存性は、ｄｓ
ＤＮＡ捕捉が拡散律速プロセスに従い、一方でｓｓＤＮＡ捕捉が反応律速プロセスに従う
、予想される機構を示す。さらにｓｓＤＮＡは、コイル構造としてナノポアに入り、ナノ
ポアのくびれを通じて移行するために解かれる必要があることも示された。これらの知見
は、固体ナノポアの改変に役立てるために使用することができる。例えば、好ましい表面
電荷と、ナノポア上方に配置されるＤＮＡの回転半径と類似の直径とを有するナノスケー
ルチャンバーは、特に低イオン強度でのＤＮＡの移行に有利であるはずである。さらに、
ＤＮＡ移行を可能にするＣｌｙＡナノポアへの修飾は、ウイルスポータルタンパク質に反
映されていることが分かり、生物学的ナノポアの正確な改変が、ウイルスキャプシド内外
でのＤＮＡの効率的な詰め込みおよび排出のために重要であることが示された。
例示的材料および方法
ＤＮＡはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購
入した。ニュートラアビジンはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから取得し、１，２－ジフィ
タノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンはＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ
ｓから取得した。β－ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）は、ＧＬＹＣＯＮ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ ＧｍｂＨから購入した。酵素はＦｅｒｍｅｎｔａｓから購入し、全ての他の
材料は、特に明記しない限り、Ｓｉｇｍａから購入した。
タンパク質精製。ＣｌｙＡ－ＡＳ遺伝子への単一点突然変異は、Soskine et al., J. A
m. Chem. Soc. (2013) 135: 13456-13463およびMiyazaki et al., Methods Enzymol. (20
11) 498: 399-406に記載される「メガプライマー」方法を使用して実施した。ＣｌｙＡは
、ｐＴ７プラスミドを使用して、Ｅ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）ＥＸＰＲＥＳＳ ＢＬ２１
（ＤＥ３）細胞で発現させた。モノマーは、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフ
ィーを使用して精製し、Waduge et al., ACS Nano (2015) 9: 7352-7359に記載される０
．５％β－ドデシルマルトシド（ＧＬＹＣＯＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＧｍｂＨ）
の存在下でオリゴマー化した。モノマー（Ｃ末端オリゴヒスチジンタグ含有）を大腸菌（
E. coli）ＢＬ２１細胞で発現させ、可溶性画分をＮｉ－ＮＴＡアフィニティー緩衝液（
１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．２％ＤＤＭおよ
び１ｍＭのＥＤＴＡ）を使用して精製し、４℃で保存した。
ＤＮＡ調製。ｄｓＤＮＡ１は、１ａおよび１ｂを等モル濃度で最初に混合することによ
って調製した（表３）。混合物を９５℃に至らせ、温度を一定の間隔で段階的に下げた。
ＤＮＡを、過剰のｓｓＤＮＡから、アガロースビーズに単量体アビジンを固定化したビオ
チン結合カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ア
フィニティークロマトグラフィーによって精製した。次いでｄｓＤＮＡを、製造業者のプ
ロトコルに従って、カラムから溶出した。溶出画分を濃縮し、ＰＣＲ ｑｕｉｃｋ精製キ
ット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してさらに精製した。典型的に０．２μｇ／ｍＬのＤＮＡ濃
度が取得された。１ａ／１ｃデュプレックスは、１について説明したようにアニーリング
したが、精製はしなかった。
イオン透過性。非対称条件下のＩ－Ｖ曲線（表６）を、対称条件下のｃｉｓチャンバー
にＣｌｙＡを添加することによって（ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ溶液の両方で１５０ｍＭの
ＮａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５）収集した。次いで電極の均衡を取
り、５ＭのＮａＣｌストック溶液のアリコートをｃｉｓコンパートメントに添加すること
によってｃｉｓにおける電解質濃度を１Ｍへ増加させた。ｃｉｓ溶液（１５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ）と同じ緩衝液を使用して、ｃｉｓ側への添加と同じ体積を添加することによって、
ｔｒａｎｓチャンバーの体積を調節した。
透過率（ＰＮａ＋／ＰＣｌ－、表４）は、Ｉ－Ｖ曲線から外挿した測定逆電位（Ｖｒ）
値を使用して、ゴールドマン・ホジキン・カッツ（Goldman-Hodgkin-Katz）の式（下記）
を使用して計算した。
Figure 2022046503000005
 Ｒは、普遍気体定数（８．３１４ＪＫ－１ｍｏｌ－１）であり、Ｔは、ケルビン温度であ
り、Ｆはファラデー定数（９６４８５Ｃｍｏｌ－１）であり、ＰＮａ＋およびＰＣｌ－は
イオンＮａ＋またはＣｌ－についての相対的膜透過性であり、ａＮａ＋およびａＣｌ－は
それぞれの活性である。ｃｉｓチャンバーは接地した。２．５ＭのＮａＣｌを含有する２
．５％アガロースブリッジを備えたＡｇ／ＡｇＣｌ電極を使用して全ての実験を実施した
。
電気的記録。イオン電流は、ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ａ
ｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）から形成した平面
二重層から記録することによって測定した。電流は、寒天ブリッジ（２．５ＭのＮａＣｌ
緩衝液中の３％ｗ／ｖ低融点アガロース）に沈めたＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いて、Ho et
al., Sci. Adv. (2015) 1, e1500905およびMaglia et al., Methods Enzymol. (2010) 47
5: 591-623に記載されているように、パッチクランプ増幅器（Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００
Ｂ、Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して測
定した。単一チャネルを、電流対印加電圧関係を測定することによって特徴付けした（Ｉ
－Ｖ曲線、電位は－１００から＋１００ｍＶの１０ｍＶステップで、２１秒で印加した、
図６、１０および表５）。０．１５ＭのＮａＣｌで、イオン電流は、２ｋＨｚのローパス
Ｂｅｓｓｅｌフィルターを適用し、１０ｋＨｚサンプリングレートを使用して記録した。
より高い塩濃度で、イオン電流を５０ｋＨｚでサンプリングし、ローパスＢｅｓｓｅｌフ
ィルターを１０ｋＨｚに設定した。０．３および０．５ＭでのＮａＣｌ電流トレースは、
４ｋＨｚのＢｅｓｓｅｌデジタルフィルターで取得後フィルタリングした（図１６、１７
）。異なるフィルタリング頻度を用いることは、検出されたイベントの総数に影響を与え
る。例えば、５０ｋＨｚでサンプリングしたトレースへ２ｋＨｚのデジタルＧａｕｓｓｉ
ａｎフィルターを適用し、一方で１０ｋＨｚのＢｅｓｓｅｌフィルターを適用することに
より、イベント間時間が約５０％増加する（２２１から３１１ｍｓへ、０．１７μＭのｄ
ｓＤＮＡ、１ＭのＮａＣｌ、０．１２ｍｓの平均滞留時間）。したがって、ＤＮＡ捕捉頻
度のデバイ長依存性に対する過剰なフィルタリングの効果を試験するために、図１３、パ
ネルＡに記載されたデータを、全ての電流トレースに対して１ｋＨｚのＧａｕｓｓｉａｎ
フィルターを適用した後にプロットした（図１８）。ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡ封鎖が
それぞれ指数および直線回帰に良好にフィットすることが分かった（図１８）。
データ分析。電流封鎖イベントは、Ｃｌａｍｐｆｉｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）の「単一チャネル検索」関数を使用し、０．０５ｍｓのデー
タ収集閾値を使用して、個々に収集した。得られた開口および封鎖ポア電流は、全点ヒス
トグラムへのＧａｕｓｓｉａｎフィッティングから計算した。残留電流は、封鎖ポア電流
値を、開口ポア電流値で割ることによって計算した。ＤＮＡ移行滞留時間（τｏｆｆ）値
は、ＤＮＡ封鎖滞留時間のイベントヒストグラムから単一指数フィットにより計算し、一
方で（τｏｎ）値は、イベント間時間の対数ヒストグラムから指数対数確率フィットを使
用して計算した（図１３、表７および図１６、１７）。誤差は、少なくとも３回の独立し
たナノポア実験の平均値からの標準偏差を示し、その回数はＮで示している。
本明細書に記載の一実施形態による修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの
調製に関する追加情報
ＣｌｙＡ－ＡＳ遺伝子への単一点突然変異を、「メガプライマー」方法を使用して実施
した。典型的に、２つのＰＣＲサイクルを実施して、新たなＤＮＡ構築物を調製した。第
１のＰＣＲ反応では、プラスミドＤＮＡは、２つのプライマーで増幅した：フォワードプ
ライマーは、塩基置換を保有する２０～３０塩基長のオリゴヌクレオチドであり、リバー
スプライマーはＴ７プロモーターまたはＴ７ターミネーターのいずれかであった。膜貫通
領域での変異について、リバースプライマーは、タンパク質配列の中間のストレッチに相
補的な２５マーのオリゴであった（表３）。メガプライマー（２００～３００ｂｐ）を含
有するＰＣＲ産物をアガロースゲル（２％アガロース／ＴＡＥおよびクリスタルバイオレ
ット）に装填し、メガプライマーを切り出し、ＰＣＲ ｑｕｉｃｋ精製キット（ＱＩＡＧ
ＥＮ）を使用して精製した。５μＬの精製されたメガプライマーを、２％アガロース／Ｔ
ＡＥゲルに装填して純度を確認し、５～１０μＬのメガプライマーを、第２のＰＣＲ反応
のために使用した。次いで第２のＰＣＲ産物を、最初にＤｐｎＩ（１～２時間、３７℃、
高速消化ＤｐｎＩ、Ｆｅｒｍｅｎｔｈａｓ）で消化してＣｌｙＡ－ＡＳ鋳型ＤＮＡを除去
し、次いで約１μＬを、エレクトロコンピテント細胞Ｅ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）ＥＸＰ
ＲＥＳＳ ＢＬ２１（ＤＥ３）（製造元）を用いての形質転換のために使用した。
ＤＮＡ調製に関する追加情報
ｄｓＤＮＡ１を、１ａ、３’－ビオチン化ｓｓＤＮＡ分子（表３）を２０％過剰の相補
的ｓｓＤＮＡ１ｂ（表３）とインキュベートすることにより形成した。温度を１分間９５
℃にし、次いで室温まで段階的に下げた。７０℃の推定アニーリング温度付近では、温度
を２１℃へ２℃ステップで下げた。各ステップは１分間継続した。次いで、ＤＮＡを、過
剰のｓｓＤＮＡから、アガロースビーズに単量体アビジンを固定化したビオチン結合カラ
ム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、アフィニティー
クロマトグラフィーによって精製した。次いでｄｓＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従
って、ビオチンブロッキング／溶出緩衝液で溶出した。溶出画分を濃縮し、ＰＣＲ ｑｕ
ｉｃｋ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してさらに精製した。典型的に、０．２μｇ／
ｍＬのＤＮＡ濃度が取得された。ｄｓＤＮＡの大きさおよび純度を、ＴＡＥ緩衝液中の２
％アガロースゲルを使用して検査し、分光学的に定量した。精製ｄｓＤＮＡを、１ｍＭの
ＥＤＴＡの存在下、－２０℃で保存した。１ａ：１ｃを、３’－ビオチン化ｓｓＤＮＡ分
子（１ａ、表３）を等モル濃度の１ｃとインキュベートすることによって形成した。温度
を１分間９５℃にし、次いで、室温まで段階的に下げた。７０℃の推定アニーリング温度
付近では、温度を２℃ステップで下げ、各ステップは、１分間維持した。
電気的記録およびデータ分析に関する追加情報
人工平面脂質二重層を上記のように調製した。特に明記しない場合、信号は、１０ｋＨ
ｚのＢｅｓｓｅｌフィルターで処理した後、５０ｋＨｚのサンプリングレートで収集した
。脂質二重層は、１～２μｌのペンタン中の１，２－ジフィタノイルｓｎ－グリセロ－３
－ホスホコリンの１０％溶液でＴｅｆｌｏｎフィルム（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、ＵＫ）の
小さな開口部（約１００μｍ）を前処理することによって形成した。電位は、寒天ブリッ
ジ（２．５ＭのＮａＣｌ緩衝液中の３％ｗ／ｖ低融点アガロース）に沈めたＡｇ／ＡｇＣ
ｌ電極を使用して印加した。印加電位は、装置のｔｒａｎｓコンパートメントに接続され
た作用電極の電位を指す。ＣｌｙＡナノポア溶液（０．０１～０．１ｎｇ／ｍＬ）を、接
地電極に接続されたｃｉｓコンパートメントに添加した。単一ポアの挿入後、過剰のタン
パク質を数サイクルの灌流によって除去した。電気的記録は０．１５～２．５ＭのＮａＣ
ｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０中で、２２℃で実施した。０．１５ＭのＮ
ａＣｌ中で、２ｋＨｚのローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、１０ｋＨｚサンプリ
ングレートを使用してデータを記録した。より高い塩濃度で、データを５０ｋＨｚでサン
プリングし、一方、ローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを１０ｋＨｚに設定した。０．３お
よび０．５ＭでのＮａＣｌ電流トレースを、４ｋＨｚのＢｅｓｓｅｌデジタルフィルター
で取得後フィルタリングした。電流封鎖イベントは、Ｃｌａｍｐｆｉｔ ｓｏｆｔｗａｒ
ｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）の「単一チャネル検索」関数を使用し、０．
０５ｍｓのデータ収集閾値を使用して個々に収集した。ＩＯおよびＩＢ値は、それぞれ開
口および封鎖ポア電流の全点ヒストグラムへのＧａｕｓｓｉａｎフィッティングから計算
した。ＤＮＡ移行滞留時間τｏｆｆを、封鎖ポア電流イベント（ｔｏｆｆ）のイベントヒ
ストグラムから単一指数標準フィットにより計算した。イベント間時間τｏｎは、封鎖ポ
ア電流イベント間のイベント間時間（ｔｏｎ）の対数ヒストグラムから指数対数確率フィ
ットを使用して計算した。誤差は、少なくとも３回の独立した繰り返しの平均値からの標
準偏差を示し、その回数は「ｎ」で示している。
ｃｉｓチャンバーから挿入したポアは、正の印加電位でより高いコンダクタンスを示し
、挿入チャネルの配向の評価を補助した。単一チャネルを、電流対印加電圧関係を測定す
ることによって特徴付けした（Ｉ－Ｖ曲線、電位は２１秒で－１００から＋１００ｍＶの
１０ｍＶステップで印加した）。ポア整流は、＋１００ｍＶおよび－１００ｍＶでの開口
ポア電流の比（Ｉ０＋１００ｍＶ／Ｉ０－１００ｍＶ）から取得した。ナノポアのゲーテ
ィングの傾向は、所与の印加電位での開口ポア電流での連続測定によって評価した。次い
でＶＭＡＸが、３０秒のタイムスパン内でゲーティングイベントが観察されなかった印加
電位によって与えられた。イオン電流の自発的可逆ゲーティングが、ＶＭＡＸより高い印
加電圧で観察された。ポアを通じたＤＮＡ進入および移行は、ＶＭＡＸと同等の印加電位
下で、ｃｉｓチャンバーに、１μＭの３’端ビオチン化ｓｓＤＮＡ１ａを添加し、次いで
相補的ｓｓＤＮＡ１ｂを添加し（表３）、その後ニュートラアビジン（１．２μＭ、モノ
マー）を添加することによって試験した。
イオン透過性に関する追加情報
ＣｌｙＡナノポアについての透過率は、１５０ｍＭのＮａＣｌ ｔｒａｎｓ、１ＭのＮ
ａＣｌ ｃｉｓの非対称塩条件での逆電位の測定によって計算した。タンパク質ナノポア
をｃｉｓチャンバーに添加し、単一チャネルを対称条件（ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ溶液の
両方で１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で最初に特徴
付けした。電極の均衡を取った後、ｃｉｓにおける電解質濃度を、５ＭのＮａＣｌストッ
ク溶液のアリコートをｃｉｓコンパートメントに添加することによって１Ｍへ増加させた
。ｃｉｓ溶液（１５０ｍＭのＮａＣｌ）と同じ緩衝液を使用して、ｃｉｓ側への添加と同
じ体積を添加することによって、ｔｒａｎｓチャンバーの体積を調節した。ゼロ電流を取
得するために使用する電位である逆電位（Ｖｒ、表３）は、電流－電圧（ＩＶ）曲線（表
６）によって取得した。イオン選択性（ＰＮａ＋／ＰＣｌ）は、ゴールドマン・ホジキン
・カッツ（ＧＨＫ）式を使用してＶｒから計算した。両方のＧＨＫ式により、ＣｌｙＡナ
ノポアについて観察されたＶｒの正の値は、ポアを通じた陽イオンの優先的移動を示し、
ポアが陽性選択的チャネルであることを示す。ｃｉｓチャンバーを接地し、２．５ＭのＮ
ａＣｌを含有する２．５％アガロースブリッジを備えたＡｇ／ＡｇＣｌ電極を使用して全
ての実験を実施した。
Figure 2022046503000006
 ここでＶｒは膜電位であり、Ｒは普遍気体定数（８．３１４Ｊ．Ｋ－１．ｍｏｌ－１）で
あり、Ｔはケルビン温度であり、Ｆはファラデー定数（９６４８５Ｃ．ｍｏｌ－１）であ
り、ＰｘはＮａ＋およびＣｌ－についての相対的膜透過性であり、［ａＸ］ｃｉｓはｃｉ
ｓコンパートメントにおけるＮａ＋およびＣｌ－の活性であり、［ａＸ］ｔｒａｎｓは、
ｔｒａｎｓコンパートメントにおけるＮａ＋およびＣｌ－の濃度であり、ａｘはＮａ＋お
よびＣｌ－の活性である（J.F. Zemaitis, Handbook of aqueous electrolyte thermodyn
amics: theory and application, 1986、Ludwig Molecular Microbiology 1999、Li-Qun
Gu PNAS 2000、Petr G. Merzlyak Biophysics 2005）。
詳細は、ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡの捕捉率を記述する、それぞれ式（１）および（
２）の導出に関して提示している。
ｄｓＤＮＡ捕捉
アプローチは、ＧｒｏｓｂｅｒｇおよびＲａｂｉｎによって開発されたアプローチに関
する。ＣｌｙＡナノポア膜は、直径ｄの円筒孔を有する厚さｌの平面誘電体表面として記
載する。ＣｌｙＡポアについての特徴的距離は、ｌ＝１３ｎｍおよびｄ＝６ｎｍである。
ΔＶを使用して膜のｃｉｓ側とｔｒａｎｓ側間の電位差を表すと、ｃｉｓ側の電位は
Figure 2022046503000007
 によって与えられると示すことができ、これは１ｒに従って／ｃｉｓ側のポアから遠くな
るにつれて減衰する（慣例により、ｃｉｓ側の電極での電位はゼロに設定した）。座標の
原点（γ＝０ｎｍ）は、ポアの中央（図１９）である。
ｄｓＤＮＡは、拡散定数Ｄと電気泳動移動度μによって特徴付けられる電気泳動ドリフ
トとを有する拡散運動を行う荷電点粒子として近似される。結果として生じるｄｓＤＮＡ
濃度ｃ（γ，ｔ）についての半径座標でのドリフト拡散式は、
Figure 2022046503000008
 によって与えられる。ここで電気泳動電流の前がマイナス記号であるのは、ＤＮＡが負に
荷電しているためである。この慣例で、移動度係数の正のμ＞０に維持され、したがって
印加電場によるドリフト速度はν＝－μＥである。アインシュタインの関係式はこの系に
ついて保たれないため（つまり、Ｄ≠μｋＢＴ）、単純にＤとμを関連付けることができ
ないことに留意されたい。
式（２）の定常解（∂ｃ∂ｔ／＝０）は、
Figure 2022046503000009
 である。ここで、境界条件は、ｃ（Ｒ）→ｃ０極限およびｃ（Ｒ）＝０であり、Ｒはポア
の大きさの桁数の微小距離である。距離γ＊は、
Figure 2022046503000010
 と定義される。これにより、電気泳動電位（１）は、
Figure 2022046503000011
 のように書き換えることができる。解（３）と前述の関係式から、ラジアル粒子電流密度
が取得される：
Figure 2022046503000012
 さらに速度が、半径γの半球殻（ｃｉｓ側の利用可能な表面を占める）にわたって電流密
度を積分することから得られる：
Figure 2022046503000013
 ここで近似γ＊≫Ｒであり、妥当性を後で検査した。最終結果は、外部電位の非存在下に
おける拡散粒子についてのスモルコフスキー拡散律速反応速度と形式的に似ている。ここ
でγ＊は、ｄｓＤＮＡがポアによって不可逆的に捕捉される距離と解釈することができる
。この捕捉半径は、印加電位が高くなるほど、または電気泳動移動度（４）が増加するほ
ど、長くなる。
（４）と（７）とを組み合わせると、
Figure 2022046503000014
 が得られる。γ＊はＤに反比例するので、前の式からＤが相殺されることに留意されたい
。
さらに発展させるために、μを推定した。長さＬを有するｄｓＤＮＡ分子の総電荷は、
Ｑ＝－２αｅＬａであり、ここでａ＝０．３４ｎｍは２塩基間の距離であり、α＜１は、
全てのリン酸基がイオン化されているわけではないという事実を反映する数値係数である
。ＤＮＡを表面積Ａの円筒として近似すると、抵抗力は（ηＡλＤ／）νと推定され、こ
こでη＝１０－３ｋｇ ｍ－１秒－２は水の粘度であり、λＤはデバイ長である。定義ν
＝－μＥを使用して、次式が得られる：
Figure 2022046503000015
 ここでｂ＝２ｎｍは二重らせん直径である。ζ電位の計算に基づいて、この式の別の導出
が、ＧｒｏｓｂｅｒｇおよびＲａｂｉｎによって与えられる。ここで式（７）および（９
）を組み合わせ、実験に関連する数値（ΔＶ＝＋７０ｍＶ、ｃ０＝１μＭ）を使用し、α
＝１、つまり完全イオン化と設定すると、
Figure 2022046503000016
 が得られる。これは、上述の式（１）である。
最後に捕捉半径γ＊を計算した。この目的のため拡散係数はストークスの法則を使用し
て見積もられる。
Figure 2022046503000017
 ここでＲＨは流体力学的半径である。ｄｓＤＮＡを半径１ｎｍおよび長さ３４ｎｍ（１０
０ｂｐ）の円筒とみなすと、Hansen et al.（J. Chem. Phys. (2004) 121: 9111-9115）
による式を使用してＲＨ≒６ｎｍと推定された。（１１）と（４）とを組み合わせると：
Figure 2022046503000018
 であり、ここでλＤ＝０．５ｎｍであり、ｋＢＴ≒２５ｍｅＶである。捕捉半径は、デバ
イ長より２桁大きく、ポア半径より非常に大きく、したがって式（７）で使用される近似
は正当化される。
ｓｓＤＮＡ捕捉
ｓｓＤＮＡ捕捉の議論は、障壁律速プロセスについてRowghanian et al.（Phys. Rev.
E (2013) 87: 042723）により発展されたアプローチによって鼓舞される。今回のケース
は、拡散律速の場合よりはるかに複雑であり、理論はほとんど確立されていない。モデル
は、ポア入口からの一端の距離である単一の「反応」座標γを使用するドリフト拡散式に
基づく。ポアから十分に遠いため、ｓｓＤＮＡは、式（１）によって記載される誘引的電
気泳動力のみを受ける。距離≦Ｒｇ（ここでＲｇは回転平衡半径である）のポアの周辺で
は、エントロピー起源の追加的な反発力が存在する：ｓｓＤＮＡコイルは、端部がポア入
口に近づくように強制されるとき、配置エントロピーを減少させる。鎖が十分に長い場合
、エントロピー反発が静電引力を上回り、障壁を生じる（図１９）。
エントロピー電位をＵ（γ）で示すと、以下のラジアル電流密度：
Figure 2022046503000019
 が示され、ここでμは電気泳動移動度であり、一方、μ～は、概念的非電気力に関連する
移動度であり、この場合、エントロピー反発である。μはアインシュタインの関係式を満
たしていないが（Ｄ≠μｋＢＴ）、概念的移動度μ～はこの関係式を充足する（μ～＝Ｄ
／ｋＢＴ）。式（１３）における粒子電流は、
Figure 2022046503000020
 と書き換えることができ、ここで、
Figure 2022046503000021
 である。
したがって問題は電位Ｆｂにおける粒子の拡散運動にある。アインシュタインの関係式
に従わないため、この電位は、電気泳動移動度μおよびμ～からη－１の溶媒粘度ηとし
ての動力学的パラメータも含んでいる。電位は、距離Ｒｇに最小限近接し、障壁高さを画
定するポア入口に最大限近接する：ΔＦｂ≡Ｆｂ ｍａｘ－Ｆｂ ｍｉｎ。クラマース（Kram
ers）理論によると、捕捉率ｋｏｎは指数的に障壁高さに依存する：
Figure 2022046503000022
障壁は、印加電圧Δを増加させることによって低下させることができ、したがってポア
への静電引力を高めることができる。式（１５）は、ｓｓＤＮＡの電気泳動移動度μを増
加させることによって、同様の効果を得ることができることを示唆する。μを修飾するた
めの１つの明白な方法は、デバイ長を修飾するとき溶液のイオン強度の変化を通じたもの
である。式（９）に示すように、電気泳動移動度は、λＤに比例する。塩濃度はｓｓＤＮ
Ａの持続長に対しても効果を有し、したがって障壁Ｕ（γ）に対するエントロピーの寄与
に対しても効果を有するが、この効果は弱いと予測されることに留意されたい。障壁高さ
に対する塩濃度の変化の主な効果は、λＤの直線項を含むと予測される：
ΔＦｂ＝ａ－ｂλＤ （１７）
ここでａ、ｂ＞０であり、（１５）と一緒になって、実験で観察されたλＤに対するｋｏ
ｎの指数的成長を説明する。
表２．ｔｒａｎｓ側からのＤＮＡ移行を改変するポア。各データ点は少なくとも３回の
実験の平均であり、誤差は標準偏差である。実験は、０．１５ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭの
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５溶液中で実施した。ナノポアの活性を、０．０１～０．１
ｎｇのオリゴマータンパク質をｔｒａｎｓチャンバーに添加することによって試験した。
負の活性は、チャネル挿入が観察されなかったことを示す。ＶＧは、ゲーティングイベン
トが３０秒以内に観察されなかった最大印加電圧を表す。ＤＮＡ捕捉は、ニュートラアビ
ジンと複合体化したビオチン化ｄｓＤＮＡの添加により、一過性の電流封鎖のみが観察さ
れたことを示す。ＤＮＡ移行は、ｄｓＤＮＡロタキサンを形成することができたことを示
す。
Figure 2022046503000023
表３：この実験で使用したＤＮＡ分子。１は、１ａを２０％過剰の１ｂとインキュベー
トすることによって形成し、方法に記載されるアフィニティークロマトグラフィーによっ
て精製した。１＊は、１ａを２０％過剰の１ｂとインキュベートすることによって形成し
、さらなる精製は行わなかった。２つのＤＮＡ鎖の相補的配列を斜体で示す。接尾辞ｂｉ
ｏはビオチン部分を示している。
Figure 2022046503000024
表４：選択されたＣｌｙＡナノポアのイオン選択性。ＣｌｙＡバリアントナノポアにつ
いての透過率（ＰＮａ＋／ＰＣｌ－）および逆電位（Ｖｒ）は、平均±標準偏差として報
告される。４つ以上の単一チャネルをバリアントごとに測定した。使用した緩衝液は１５
ｍＭのＴＲＩＳ．ＨＣｌ ｐＨ７．５であり、ｃｉｓチャンバーでは１ＭのＮａＣｌ、ｔ
ｒａｎｓチャンバーでは１５０ｍＭであった。
Figure 2022046503000025
表５：ＣｌｙＡ変異体についてのＩＶ曲線。電気的記録は０．１５ＭのＮａＣｌ、１５
ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。各データ点は少なくとも
３回の実験の平均であり、誤差は標準偏差である。
Figure 2022046503000026
Figure 2022046503000027
Figure 2022046503000028
Figure 2022046503000029
表６：非対称塩濃度下でのＣｌｙＡバリアントのＩＶ曲線。４つ以上の単一チャネルを
バリアントごとに測定した。各データは、平均±標準偏差として報告する。使用した緩衝
液は１５ｍＭのＴＲＩＳ．ＨＣｌ ｐＨ７．５であり、同時にｃｉｓチャンバーは１Ｍの
ＮａＣｌを含有し、ｔｒａｎｓチャンバーは１５０ｍＭを含有した。電気的記録は０．１
５ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。デ
ータは、２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、１００μｓ（１０ｋＨｚ）
サンプリングレートを使用して記録した。
Figure 2022046503000030
Figure 2022046503000031
表７：ＣｌｙＡ－ＲＲナノポアを通じたｓｓＤＮＡ（１ａ）およびｄｓＤＮＡ（１）の
移行。３つ以上の単一チャネルを、条件ごとに測定した。データは、平均±標準偏差とし
て報告する。電気的記録は１５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施
した。データは、１０ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、２０μｓ（５０
ｋＨｚ）サンプリングレートを使用して記録した。
Figure 2022046503000032
配列表
Figure 2022046503000033
他の実施形態
本明細書に開示された特色の全ては、任意の組合せで組み合わせることができる。本明
細書で開示された各特色は、同じ、同等または類似の目的を果たす代替の特色によって置
き換えられてもよい。したがって、特に断らない限り、開示される各特色は、同等または
類似の特色の一般的な系列の一例としてのみ開示される。上記の説明から、当業者は、本
開示の本質的な特徴を、本開示の精神および範囲から逸脱することなく容易に確認するこ
とができ、種々の用途および条件に適合させるために、本開示の種々の変更および修正を
行うことができる。したがって、他の実施形態も、特許請求の範囲内である。
均等論
いくつかの本発明の実施形態を本明細書に記載および例示してきたが、当業者は、機能
を実施するならびに／あるいは結果および／または本明細書に記載の１つもしくは複数の
効果を得るために種々の他の手段および／または構造を容易に想定し、そのような変形お
よび／または修正の各々は、本明細書に記載した本発明の実施形態の範囲内であるとみな
される。より一般的に、当業者は、本明細書に記載の全てのパラメータ、寸法、材料、お
よび構成が例示を意図していること、ならびに実際のパラメータ、寸法、材料、および／
または構成が、本発明の教示が使用される特定の用途に依存することを、容易に理解する
。当業者は、本明細書に記載された特定の本発明の実施形態に対する多くの均等物を認識
し、または通例にすぎない実験を使用して確認することができる。したがって、前述の実
施形態が単に一例として提示されており、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲
内で、本発明の実施形態が、具体的に説明した以外の方法で実施され請求されうることが
理解される。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載の個々の特色、システム、物品
、材料、キット、および／または方法に向けられている。さらに、そのような特色、シス
テム、物品、材料、キット、および／または方法の２つ以上の任意の組合せが、そのよう
な特色、システム、物品、材料、キット、および／または方法が互いに矛盾しない場合、
本開示の発明の範囲内に含まれる。
本明細書で定義され、使用される全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる
文書における定義および／または定義された用語の通常の意味より優先すると理解される
ものとする。
本明細書で開示されている全ての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用さ
れている主題に対する参考として組み込まれ、一部の場合には、文献全体を包含しうる。
本明細書および特許請求の範囲で使用されるとき、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、
反対のことが明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるものと
する。
句「および／または」は、本明細書および特許請求の範囲で使用されるとき、そのよう
に結合される要素の「いずれかまたは両方」を意味し、つまり、ある場合には結合的に存
在し、他の場合には分離的に存在する要素を意味すると理解されるものとする。「および
／または」で列挙される複数の要素は、同じ様式で解釈されるものとし、つまり要素の「
１つまたは複数」が同様に結合する。「および／または」の節によって具体的に特定され
る要素以外の他の要素が、それらの具体的に特定された要素に関連するまたは関連しない
かどうかにかかわらず、任意選択的に存在しうる。したがって、非限定的な例として、「
Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む」などのオープンエンドの言語と組み合わせて
使用されるとき、一実施形態では、Ａのみ（任意選択的にＢ以外の要素も含む）、別の実
施形態では、Ｂのみ（任意選択的にＡ以外の要素も含む）、さらに別の実施形態では、Ａ
およびＢの両方（任意選択的に他の要素を含む）などを指すことができる。
本明細書および特許請求の範囲で使用されるとき、「または」は、上記で定義される「
および／または」と同じ意味を有すると理解されるものとする。例えば、リスト中の項目
を分離するとき、「または」または「および／または」は、包括的であると解釈され、つ
まり、要素のいくつかまたはリストの少なくとも１つを含むだけでなく、２つ以上も含み
、任意選択的に、列挙されていない追加的項目も含むと解釈されるものとする。逆のこと
を明確に示す用語、例えば「の１つのみ」もしくは「まさに１つの」または特許請求の範
囲で使用される「からなる」のみが、要素のいくつかまたはリストのまさに１つの要素を
含むことを指す。一般に、本明細書で使用されるとき、用語「または」は、排他性の用語
、例えば、「いずれか」「１つの」「１つのみの」または「まさに１つの」が先行すると
き、排他的選択肢（つまり「一方または他方であるが両方でない」）を示すものとしての
み解釈されるものとする。特許請求の範囲で使用されるとき、「から本質的になる」は、
特許法の分野で使用される通常の意味を有する。
本明細書および特許請求の範囲で使用されるとき、１つまたは複数の要素のリストを参
照する句「少なくとも１つ」は、要素のリスト内の任意の１つまたは複数の要素から選択
される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙されたそれぞ
れおよび各要素の必ずしも少なくとも１つを含むものではなく、要素のリスト内の要素の
任意の組合せを排除するものではないと理解されるものとする。またこの定義は、句「少
なくとも１つ」が指す要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が、それらの
具体的に特定された要素に関連するまたは関連しないかどうかにかかわらず、任意選択的
に存在しうることを許可する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なく
とも１つ」（または同等に「ＡまたはＢの少なくとも１つ」または同等に「Ａおよび／ま
たはＢの少なくとも１つ」は）は、一実施形態では、少なくとも１つの、任意選択的に１
つを超える、Ａを含むがＢは存在しない（および任意選択的にＢ以外の要素を含む）こと
を指すことができ、別の実施形態では、少なくとも１つの、任意選択的に１つを超える、
Ｂを含むがＡは存在しない（および任意選択的にＡ以外の要素を含む）ことを指すことが
でき、さらに別の実施形態では、少なくとも１つの、任意選択的に１つを超える、Ａ、お
よび少なくとも１つの、任意選択的に１つを超える、Ｂ（および任意選択的に他の要素を
含む）などを指すことができる。
逆のことを明記しない限り、１つを超えるステップまたは行為を含む、本明細書に特許
請求される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、方法のステップま
たは行為が列挙された順序に必ずしも限定されないことも理解されるものとする。
１０２ 第１の開口部
１０４ 中間部
１０６ 第２の開口部
１０８ 内腔
１１０ 膜
１１２ 負に帯電したくびれ
逆のことを明記しない限り、１つを超えるステップまたは行為を含む、本明細書に特許請求される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、方法のステップまたは行為が列挙された順序に必ずしも限定されないことも理解されるものとする。

また、本発明は以下を提供する。
[１]
ｃｉｓ開口部、中間部、およびｔｒａｎｓ開口部を含む修飾ＣｌｙＡナノポアであって、前記ｃｉｓ開口部の内部表面は第１の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記中間部の内部表面は第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記ｔｒａｎｓ開口部は負に帯電したくびれを含む、修飾ＣｌｙＡナノポア。
[２]
前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記修飾ＣｌｙＡナノポアへのデオキシリボ核酸の捕捉を可能にするように前記ｃｉｓ開口部に配置されている、上記[１]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３]
前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記修飾ＣｌｙＡナノポアを通じた前記デオキシリボ核酸の移行を可能にするように前記中間部に配置されている、上記[２]記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[４]
前記第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換がそれぞれアルギニンを含む、上記 [１]～[３]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[５]
前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、ＣｌｙＡ－ＡＳのアミノ酸配列のＳ１１０Ｒ変異に対応する、上記[１]～[４]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[６]
前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、ＣｌｙＡ－ＡＳのアミノ酸配列のＤ６４Ｒ変異に対応する、上記[１]～[５]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[７]
１２量体ポアである、上記[１]～[６]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。 [８]
上記[１]～[７]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポアを含む組成物。
[９]
人工膜をさらに含み、前記修飾ＣｌｙＡナノポアが前記人工膜に存在する、上記[８]に記載の組成物。
[１０]
低イオン強度溶液をさらに含む、上記[８]または[９]に記載の組成物。
[１１]
前記低イオン強度溶液が、約５０ｍＭから約１Ｍのイオン強度を有する塩溶液である、上記[１０]に記載の組成物。
[１２]
前記イオン強度が約１５０ｍＭである、上記[１１]に記載の組成物。
[１３]
前記塩溶液が塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む、上記[１１]または[１２]に記載の組成物。
[１４]
ＣｌｙＡナノポアを通じてＤＮＡを移行する方法であって、
ａ．低イオン強度溶液に、上記[１]～[１３]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポアと人工膜とを供給するステップであり、ここで前記修飾ＣｌｙＡナノポアは、前記修飾ＣｌｙＡナノポアのｃｉｓ開口部が前記低イオン強度溶液のｃｉｓ側に存在し、前記修飾ＣｌｙＡナノポアのｔｒａｎｓ開口部が前記低イオン強度溶液のｔｒａｎｓ側に存在するように、前記人工膜に存在する、ステップと、
ｂ．前記低イオン強度溶液の前記ｃｉｓ側にＤＮＡを供給するステップと、
ｃ．前記修飾ＣｌｙＡナノポアにわたり電位を印加して、前記ＤＮＡを、前記修飾ＣｌｙＡナノポアを通じて前記ｃｉｓ側から前記ｔｒａｎｓ側へ移行させるステップと
を含む、方法。
[１５]
前記低イオン強度溶液が、約１５０ｍＭから約３００ｍＭのイオン強度を有する塩溶液である、上記[１４に記載の方法。
[１６]
前記イオン強度が約１５０ｍＭである、上記[１５]に記載の方法。
[１７]
前記塩溶液が塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む、上記[１５]または[１６]に記載の方法。
[１８]
前記ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡである、上記[１４]～[１７]のいずれかに記載の方法。 [１９]
前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである、上記[１４]～[１７]のいずれかに記載の方法。 [２０]
ＤＮＡシーケンシングのために使用される、上記[１４]～[１９]のいずれかに記載の方法。
[２１]
配列番号１（野生型ＣｌｙＡのアミノ酸配列に対応）または配列番号２（ＣｌｙＡ－ＡＳのアミノ酸配列に対応）に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドであって、前記アミノ酸配列は配列番号１または配列番号２の１０６～７８の範囲内の位置に第１の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、配列番号１または配列番号２の４１～７４の範囲内の位置に第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含む、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド。
[２２]
配列番号１または配列番号２の１～３２位のアミノ酸が正味の負電荷をもたらす、上記 [２１]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド。
[２３]
前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号１または配列番号２の１１０位に配置されている、上記[２１]または[２２]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド。
[２４]
前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号１または配列番号２の６４位に配置されている、上記[２１]～[２３]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド。
[２５]
前記第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換がそれぞれ独立してアルギニン、ヒスチジンまたはリジンを含む、上記[２１]～[２４]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド。
[２６]
上記[２１]～[２５]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
[２７]
複数の、上記[２１]～[２５]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含むホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
[２８]
１２～１４個の前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含む、上記[２７]に記載のホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
[２９]
前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記ホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポアの第１の開口部に曝露された溶液内の負に荷電したポリマーの捕捉を可能にするように、前記第１の開口部に配置されている、上記 [２７]または[２８]に記載のホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３０]
前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記ナノポアを通じた前記負に荷電したポリマーの移行を可能にするように、前記ホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポアの中間部に配置されている、上記[２９]に記載のホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３１]
少なくとも１つの、上記[２１]～[２５]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含むヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３２]
前記少なくとも１つの修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含む、１２～１４個のＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含む、上記[３１]に記載のヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３３]
前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記ヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポアの第１の開口部に曝露された溶液内の負に荷電したポリマーの捕捉を可能にするように、前記第１の開口部に配置されている、上記[３１]または[３２]に記載のヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３４]
前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記ナノポアを通じた前記負に荷電したポリマーの移行を可能にするように、前記ヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポアの中間部に配置されている、上記[３３]に記載のヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３５]
第１の開口部と、中間部と、第２の開口部と、前記第１の開口部から前記中間部を通じて前記第２の開口部に延びる内腔とを含む修飾ＣｌｙＡナノポアであって、前記第１の開口部の内腔表面は第１の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記中間部の内腔表面は第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記第２の開口部の内腔表面は負に帯電したくびれを画定する、修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３６]
前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換から前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換までの前記内腔内の距離が０．５ｎｍから１０ｎｍの範囲である、上記[３５]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３７]
配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含む、上記[３５]または[３６]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３８]
配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列と比較して、前記第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含む最大１０個の置換を有するサブユニットポリペプチドを含む、上記[３５]または[３６]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３９]
前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１１０、１０６、１１４、１２１、１２２、１２９、８５、７８、２６８、２６７、２６５および２５８からなる群から選択されるアミノ酸の置換である、上記[３５]～[３８]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[４０]
前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号１または配列番号２のアミノ酸７４、７１、６４、５３、１６１、１５８、４６、４２、４１からなる群から選択されるアミノ酸の置換である、上記[３５]～[３９]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。 [４１]
第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記第１の開口部に曝露された溶液内の負に荷電したポリマーの捕捉を可能にするように、前記第１の開口部に配置されている、上記[３５]～[４０]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[４２]
前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、ポアの前記内腔を通じた前記負に荷電したポリマーの移行を可能にするように、前記中間部に配置されている、上記[４１]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[４３]
前記負に荷電したポリマーが核酸である、上記[４１]または[４２]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[４４]
前記核酸がデオキシリボ核酸である、上記[４３]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。[４５]
前記デオキシリボ核酸が二本鎖である、上記[４４]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。[４６]
前記デオキシリボ核酸が一本鎖である、上記[４４]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。[４７]
１２量体ポアである、上記[３５]～[４６]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。 [４８]
１３マーのポアである、上記[３５]～[４６]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[４９]
上記[２７]～[４８]のいずれかに記載の少なくとも１つの修飾ＣｌｙＡナノポアを含む組成物。
[５０]
膜をさらに含み、前記修飾ＣｌｙＡナノポアが前記膜に存在する、上記[４９]に記載の組成物。
[５１]
ポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含む、上記[４９]または[５０]に記載の組成物。
[５２]
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記修飾ＣｌｙＡナノポアに結合している、上記[５１]に記載の組成物。
[５３]
低イオン強度溶液をさらに含む、上記[４９]～[５２]のいずれかに記載の組成物。 [５４]
前記低イオン強度溶液が、約１５０ｍＭから約３００ｍＭのイオン強度を有する塩溶液である、上記[５２]に記載の組成物。
[５５]
前記塩溶液が塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む、上記[５２]または[５３]に記載の組成物。
[５６]
標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
（ａ）約１５０ｍＭから約３００ｍＭの低イオン強度溶液に、上記[２７]～[４８]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポアと膜とを供給するステップであり、ここで前記修飾ＣｌｙＡナノポアは前記膜に存在する、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記低イオン強度溶液に前記標的ポリヌクレオチドを添加するステップと、
（ｃ）前記ナノポアにわたり電位を印加する間に、前記修飾ＣｌｙＡナノポアを流れるイオン流を測定するステップであり、ここでイオン流の測定は、前記標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴の指標となる、ステップと
を含む、方法。
[５７]
前記１つまたは複数の特徴が、（ｉ）前記標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記標的ポリヌクレオチドの二次構造、ならびに（ｖ）前記標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、およびそれによる前記標的ポリヌクレオチドの特徴付けから選択される、上記[５６]に記載の方法。
[５８]
ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記標的ポリヌクレオチドに結合し、前記修飾ＣｌｙＡナノポアを通じた前記標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、前記ポリヌクレオチド結合タンパク質をステップ（ｂ）の前記低イオン強度溶液に添加するステップをさらに含む、上記[５６]または[５７]に記載の方法。
[５９]
前記標的ポリヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡである、上記[５６]～[５８]のいずれかに記載の方法。
[６０]
前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡである、上記[５６]～[５８]のいずれかに記載の方法。
[６１]
前記イオン流の測定が、電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定を含む、上記[５６]～[６０]のいずれかに記載の方法。 [６２]
前記低イオン強度溶液が塩化ナトリウムを含む、上記[５６]～[６１]のいずれかに記載の方法。

Claims (62)

  1. ｃｉｓ開口部、中間部、およびｔｒａｎｓ開口部を含む修飾ＣｌｙＡナノポアであって
    、前記ｃｉｓ開口部の内部表面は第１の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記中間部
    の内部表面は第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記ｔｒａｎｓ開口部は負に帯
    電したくびれを含む、修飾ＣｌｙＡナノポア。
  2. 前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記修飾ＣｌｙＡナノポアへのデオキシリ
    ボ核酸の捕捉を可能にするように前記ｃｉｓ開口部に配置されている、請求項１に記載の
    修飾ＣｌｙＡナノポア。
  3. 前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記修飾ＣｌｙＡナノポアを通じた前記デ
    オキシリボ核酸の移行を可能にするように前記中間部に配置されている、請求項２記載の
    修飾ＣｌｙＡナノポア。
  4. 前記第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換がそれぞれアルギニンを含む、請求
    項１～３のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
  5. 前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、ＣｌｙＡ－ＡＳのアミノ酸配列のＳ１１０
    Ｒ変異に対応する、請求項１～４のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
  6. 前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、ＣｌｙＡ－ＡＳのアミノ酸配列のＤ６４Ｒ
    変異に対応する、請求項１～５のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
  7. １２量体ポアである、請求項１～６のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
  8. 請求項１～７のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアを含む組成物。
  9. 人工膜をさらに含み、前記修飾ＣｌｙＡナノポアが前記人工膜に存在する、請求項８に
    記載の組成物。
  10. 低イオン強度溶液をさらに含む、請求項８または９に記載の組成物。
  11. 前記低イオン強度溶液が、約５０ｍＭから約１Ｍのイオン強度を有する塩溶液である、
    請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記イオン強度が約１５０ｍＭである、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記塩溶液が塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む、請求項１１または１２に記載の組成
    物。
  14. ＣｌｙＡナノポアを通じてＤＮＡを移行する方法であって、
    ａ．低イオン強度溶液に、請求項１～１３のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア
    と人工膜とを供給するステップであり、ここで前記修飾ＣｌｙＡナノポアは、前記修飾Ｃ
    ｌｙＡナノポアのｃｉｓ開口部が前記低イオン強度溶液のｃｉｓ側に存在し、前記修飾Ｃ
    ｌｙＡナノポアのｔｒａｎｓ開口部が前記低イオン強度溶液のｔｒａｎｓ側に存在するよ
    うに、前記人工膜に存在する、ステップと、
    ｂ．前記低イオン強度溶液の前記ｃｉｓ側にＤＮＡを供給するステップと、
    ｃ．前記修飾ＣｌｙＡナノポアにわたり電位を印加して、前記ＤＮＡを、前記修飾Ｃｌｙ
    Ａナノポアを通じて前記ｃｉｓ側から前記ｔｒａｎｓ側へ移行させるステップと
    を含む、方法。
  15. 前記低イオン強度溶液が、約１５０ｍＭから約３００ｍＭのイオン強度を有する塩溶液
    である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記イオン強度が約１５０ｍＭである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記塩溶液が塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む、請求項１５または１６に記載の方法
    。
  18. 前記ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡである、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
  20. ＤＮＡシーケンシングのために使用される、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の
    方法。
  21. 配列番号１（野生型ＣｌｙＡのアミノ酸配列に対応）または配列番号２（ＣｌｙＡ－Ａ
    Ｓのアミノ酸配列に対応）に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配
    列を含む修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドであって、前記アミノ酸配列は
    配列番号１または配列番号２の１０６～７８の範囲内の位置に第１の正に荷電したアミノ
    酸の置換を含み、配列番号１または配列番号２の４１～７４の範囲内の位置に第２の正に
    荷電したアミノ酸の置換を含む、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド。
  22. 配列番号１または配列番号２の１～３２位のアミノ酸が正味の負電荷をもたらす、請求
    項２１に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド。
  23. 前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号１または配列番号２の１１０位に
    配置されている、請求項２１または２２に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリ
    ペプチド。
  24. 前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号１または配列番号２の６４位に配
    置されている、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニ
    ットポリペプチド。
  25. 前記第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換がそれぞれ独立してアルギニン、ヒ
    スチジンまたはリジンを含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナ
    ノポアサブユニットポリペプチド。
  26. 請求項２１～２５のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプ
    チドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
  27. 複数の、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニット
    ポリペプチドを含むホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
  28. １２～１４個の前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含む、請求項２
    ７に記載のホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
  29. 前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの第１の正に荷電したアミノ酸の
    置換が、前記ホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポアの第１の開口部に曝露された溶液内の負に
    荷電したポリマーの捕捉を可能にするように、前記第１の開口部に配置されている、請求
    項２７または２８に記載のホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
  30. 前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの第２の正に荷電したアミノ酸の
    置換が、前記ナノポアを通じた前記負に荷電したポリマーの移行を可能にするように、前
    記ホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポアの中間部に配置されている、請求項２９に記載のホモ
    多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
  31. 少なくとも１つの、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサ
    ブユニットポリペプチドを含むヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
  32. 前記少なくとも１つの修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含む、１２～
    １４個のＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含む、請求項３１に記載のヘテロ
    多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
  33. 前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの第１の正に荷電したアミノ酸の
    置換が、前記ヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポアの第１の開口部に曝露された溶液内の負
    に荷電したポリマーの捕捉を可能にするように、前記第１の開口部に配置されている、請
    求項３１または３２に記載のヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
  34. 前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの第２の正に荷電したアミノ酸の
    置換が、前記ナノポアを通じた前記負に荷電したポリマーの移行を可能にするように、前
    記ヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポアの中間部に配置されている、請求項３３に記載のヘ
    テロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
  35. 第１の開口部と、中間部と、第２の開口部と、前記第１の開口部から前記中間部を通じ
    て前記第２の開口部に延びる内腔とを含む修飾ＣｌｙＡナノポアであって、前記第１の開
    口部の内腔表面は第１の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記中間部の内腔表面は第
    ２の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記第２の開口部の内腔表面は負に帯電したく
    びれを画定する、修飾ＣｌｙＡナノポア。
  36. 前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換から前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換ま
    での前記内腔内の距離が０．５ｎｍから１０ｎｍの範囲である、請求項３５に記載の修飾
    ＣｌｙＡナノポア。
  37. 配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ
    酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含む、請求項３５または３６に記載の修飾Ｃ
    ｌｙＡナノポア。
  38. 配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列と比較して、前記第１および第２の正
    に荷電したアミノ酸の置換を含む最大１０個の置換を有するサブユニットポリペプチドを
    含む、請求項３５または３６に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
  39. 前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１
    １０、１０６、１１４、１２１、１２２、１２９、８５、７８、２６８、２６７、２６５
    および２５８からなる群から選択されるアミノ酸の置換である、請求項３５～３８のいず
    れか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
  40. 前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号１または配列番号２のアミノ酸７
    ４、７１、６４、５３、１６１、１５８、４６、４２、４１からなる群から選択されるア
    ミノ酸の置換である、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
  41. 第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記第１の開口部に曝露された溶液内の負に荷
    電したポリマーの捕捉を可能にするように、前記第１の開口部に配置されている、請求項
    ３５～４０のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
  42. 前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、ポアの前記内腔を通じた前記負に荷電した
    ポリマーの移行を可能にするように、前記中間部に配置されている、請求項４１に記載の
    修飾ＣｌｙＡナノポア。
  43. 前記負に荷電したポリマーが核酸である、請求項４１または４２に記載の修飾ＣｌｙＡ
    ナノポア。
  44. 前記核酸がデオキシリボ核酸である、請求項４３に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
  45. 前記デオキシリボ核酸が二本鎖である、請求項４４に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
  46. 前記デオキシリボ核酸が一本鎖である、請求項４４に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
  47. １２量体ポアである、請求項３５～４６のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア
    。
  48. １３マーのポアである、請求項３５～４６のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポ
    ア。
  49. 請求項２７～４８のいずれか一項に記載の少なくとも１つの修飾ＣｌｙＡナノポアを含
    む組成物。
  50. 膜をさらに含み、前記修飾ＣｌｙＡナノポアが前記膜に存在する、請求項４９に記載の
    組成物。
  51. ポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含む、請求項４９または５０に記載の組成物
    。
  52. 前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記修飾ＣｌｙＡナノポアに結合している、
    請求項５１に記載の組成物。
  53. 低イオン強度溶液をさらに含む、請求項４９～５２のいずれか一項に記載の組成物。
  54. 前記低イオン強度溶液が、約１５０ｍＭから約３００ｍＭのイオン強度を有する塩溶液
    である、請求項５２に記載の組成物。
  55. 前記塩溶液が塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む、請求項５２または５３に記載の組成
    物。
  56. 標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
    （ａ）約１５０ｍＭから約３００ｍＭの低イオン強度溶液に、請求項２７～４８のいずれ
    か一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアと膜とを供給するステップであり、ここで前記修飾
    ＣｌｙＡナノポアは前記膜に存在する、ステップと、
    （ｂ）ステップ（ａ）の前記低イオン強度溶液に前記標的ポリヌクレオチドを添加するス
    テップと、
    （ｃ）前記ナノポアにわたり電位を印加する間に、前記修飾ＣｌｙＡナノポアを流れるイ
    オン流を測定するステップであり、ここでイオン流の測定は、前記標的ポリヌクレオチド
    の１つまたは複数の特徴の指標となる、ステップと
    を含む、方法。
  57. 前記１つまたは複数の特徴が、（ｉ）前記標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記
    標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）
    前記標的ポリヌクレオチドの二次構造、ならびに（ｖ）前記標的ポリヌクレオチドが修飾
    されているか否か、およびそれによる前記標的ポリヌクレオチドの特徴付けから選択され
    る、請求項５６に記載の方法。
  58. ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記標的ポリヌクレオチドに結合し、前記修飾Ｃｌ
    ｙＡナノポアを通じた前記標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、前記ポリヌク
    レオチド結合タンパク質をステップ（ｂ）の前記低イオン強度溶液に添加するステップを
    さらに含む、請求項５６または５７に記載の方法。
  59. 前記標的ポリヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡである、請求項５６～５８のいずれか一項に
    記載の方法。
  60. 前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡである、請求項５６～５８のいずれか一項に
    記載の方法。
  61. 前記イオン流の測定が、電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定または電界効果
    トランジスタ（ＦＥＴ）測定を含む、請求項５６～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記低イオン強度溶液が塩化ナトリウムを含む、請求項５６～６１のいずれか一項に記
    載の方法。
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