CN112384296A - 用于直接电测量酶活性的装置、系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于通过一个或多个电极直接附着至分子来感测单个蛋白质分子的功能性运动的装置、系统和方法。本公开还涉及阵列、包括阵列的系统以及使用阵列对生物聚合物测序的方法。

Description

用于直接电测量酶活性的装置、系统和方法
联邦赞助的研究或开发
本发明是在美国国立卫生研究院授予的HG910080的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
发明背景
电读出构成天然蛋白质功能基础的运动可以无需标记即可实现许多新型分析测量。例如，监测酶的功能波动将提供筛选候选药物分子的快速简便的方法。监测加工生物聚合物的蛋白质的波动将揭示有关其组成和构象的信息。
Choi等人证明了酶功能的电读出(Choi，Moody等，2012)，指出碳纳米管场效应晶体管中产生的电报噪声反映了溶菌酶在作用于其底物肽聚糖时的功能运动。已经认识到，监测诸如DNA聚合酶之类的进行性酶(precessive enzyme)的波动可以因此提供了一种测序DNA方法。在一篇有争议的论文中给出了一个实例，其中Huang小组(Chen，Lee等，2013)声称在延伸链中掺入核苷酸时测量聚合酶的电波动，信号报告了模板序列的高精度延伸。该论文随后被撤回(Nature Nanotechnology 8，452-458(2013)；2013年5月5日在线发布；2013年7月11日和2013年8月28日印刷后更正；2015年6月3日印刷后撤回)，但说明了如果可以通过电读数来监测蛋白质的结构波动什么是可能的。更重要的是，Collins小组在大约同一时间证明了该建议的可行实现，该小组使用了碳纳米管场效应晶体管，其上拴系有聚合酶(Olsen，Choi等，2013)。该信号由电报噪声组成，当掺入核苷酸时，该信号显示与聚合酶的开启和关闭有关。重要的是，噪声的特征反映了所掺入的特定核苷酸，从而为DNA序列的电单分子读出开辟了道路。
Olsen、Choi等，2013中，通过蛋白质产生的电场波动间接检测到蛋白质的波动，由紧邻聚合酶或溶菌酶的场效应晶体管通道检测到该场波动。图1说明了Chen等人的建议。在溶液3中存在核苷三磷酸的情况下，与引物引发的(primed)DNA模板2结合的聚合酶1通过抗体4与金珠5结合，所述金珠5跨越场效应晶体管的源极6和漏极7之间的间隙，其中通道8在栅电极9上形成。鉴于原始报道的撤回，不清楚本发明是否实际可行，但它包含了Collins小组成功发明的许多要素。这在图2A中示出，场效应晶体管的源极21和漏极22通过形成晶体管的通道的碳纳米管23接合。酶(在这种情况下为溶菌酶)24附着于碳纳米管。半导体背栅25用于将晶体管设置在导通和关断中间的最敏感操作点，并且通过FET电流中的波动来检测酶活性。在随后的论文中，同一小组显示了(图2B)附着于碳纳米管通道23并与引物引发的DNA模板27结合的聚合酶26如何产生噪声尖峰，每个噪声尖峰都与聚合酶掺入核苷酸有关。对于poly(dA)28和poly(dC)29在图2C中给出了所获得的信号串的两个实例。信号之间的明显差异表明，尽管与信号水平31相比，CNT FET的噪声背景30明显，但仍可以进行测序。Merriman和Mola提出了一种相当相似的方法(Merriman和Mola，2016)。这在图2C中示出。聚合酶436经由接头437化学连接至分子线433，该分子线433连接至场效应晶体管的源极438和漏极439。栅电极440位于分子线的下方。他们的专利申请中呈现的数据似乎表明信号水平甚至低于Olsen等人的装置中获得的信号水平。
显然，期望与被测的酶建立更直接的电连接。我们开发了一种称为识别隧穿(recognition tunneling)的技术，并已使用识别分子将蛋白质与一对紧密间隔的电极中的至少一个结合(Zhang，Song等，2017)。图3中示出了该方法。该装置由被薄的介电层43隔开的第一电极41和第二电极42组成。识别分子44通过例如硫醇-金属键牢固地附着在每个电极上。选择这些分子以使其被靶蛋白45特异性识别并结合。这些识别事件通常是可逆的，因此不适合将感兴趣的蛋白质保持在间隙中以研究其功能。因此，我们先前的识别隧穿技术不适用于当前问题，并且与之无关，因为此处我们需要将已知蛋白质保持与测量装置连接，而不是使用测量装置来检测未知蛋白质的到达。仍更受限的是，这些装置必须在足够高的偏压(Vt，46)下运行，以使偏压本身将蛋白质驱动到其中生成电流的电报噪声波动的模式(47)。在此发表的工作中，在蛋白质是整合素且识别分子是RGD肽的情况下，通过在相对较高的偏压(>100mV)下操作装置并观察施加的偏压引起的波动来检测蛋白质结合。使用电压引起的波动作为蛋白质结合的检测器完全排除了使用此装置来测量使蛋白质具有关键的生物分子功能的蛋白质结构和构象的波动，因为这些电压引起的波动发生在暴露于足够高的电位差的所有蛋白质中，与功能性运动无关。因此，在先前讨论的技术中，来自这些临界功能性运动的信号不能与电压引起的波动区分开。因此，期望找到一种系统和方法，用于在消除电压引起的电导波动并在蛋白质暴露于产生关键的和可测量的功能波动的化学刺激的同时将蛋白质保持在适当位置的条件下检测跨一对电极的蛋白质分子的结合，并测量这些波动对其他化学物质(例如候选药物或生物聚合物)的响应。
本部分中任何参考文献的引用均不应解释为承认此类参考文献是本公开的现有技术。
发明内容
本公开涉及用于直接电测量蛋白质活性的装置、系统和方法。在一些实施方案中，提供了一种装置，该装置包含：第一和第二电极，所述第一和第二电极由间隙隔开；附着于一个或两个电极的蛋白质；其中第一电极和第二电极配置为与待分析的样品接触。
在一些实施方案中，蛋白质附着于一个电极。在其他实施方案中，蛋白质附着于两个电极。
在一些实施方案中，装置进一步包含设置在间隙内的绝缘介电层。
在一些实施方案中，蛋白质选自由聚合酶、核酸酶、蛋白酶体、糖肽酶、糖苷酶、激酶和核酸内切酶组成的组。
在一些实施方案中，蛋白质附着于一个电极。在其他实施方案中，蛋白质附着于两个电极。
在一些实施方案中，蛋白质经由接头附着于电极。
在一些实施方案中，装置包含：第一和第二电极，所述第一和第二电极由间隙隔开；附着于一个或两个电极的蛋白质；其中当蛋白质与化学实体相互作用时产生电流波动。
在一些实施方案中，提供了一种装置，所述装置包含：
(a)介电基底；
(b)设置在介电基底上的第一电极；
(c)设置在第一电极上的绝缘介电层；
(d)设置在绝缘介电层上的第二电极；
(e)设置在第二电极上的钝化层；
(f)附着于一个或两个电极的蛋白质；
其中第一电极、绝缘介电层、第二电极和钝化层具有穿过其形成的开口。
在一些实施方案中，装置包含：第一和第二电极，所述第一和第二电极由间隙隔开；附着于一个或两个电极的蛋白质；其中第一电极和第二电极具有穿过其形成的开口。
在一些实施方案中，装置包含：第一和第二电极，所述第一和第二电极共平面并且由间隙隔开；附着于一个或两个电极的蛋白质；其中第一电极和第二电极配置为与待分析的样品接触。
在一些实施方案中，装置进一步包含设置在间隙内的绝缘介电层。
在一些实施方案中，蛋白质附着于一个电极。在该实施方案的一些方面，蛋白质是聚合酶。在该实施方案的一些方面，聚合酶经由接头附着于电极。在一些方面，聚合酶是生物素化的聚合酶。在一些方面，聚合酶是生物素化的聚合酶，并经由链霉抗生物素蛋白附着于电极。
在装置的一些实施方案中，第一和/或第二电极包含选自由金、铂、钯和钌组成的组的金属。在一些实施方案中，金属是钯。
在一些实施方案中，间隙具有约1.0nm至约20.0nm的宽度。在一些实施方案中，间隙具有约1.0nm至约10.0nm的宽度。在一些实施方案中，间隙具有约2.0nm至约10.0nm的宽度。在一些实施方案中，间隙具有约1.0nm至约7.5nm的宽度。在一些实施方案中，间隙具有约1.0nm至约5.0nm的宽度。在一些实施方案中，间隙具有约4.0nm至约5.0nm的宽度。在一些实施方案中，间隙具有约5.0nm至约6.0nm的宽度。
在一些实施方案中，该装置可以用于检测单个分子。
在一些实施方案中，提供了一种系统，该系统包含如本文所述的装置；用于引入能够与蛋白质相互作用的化学实体的设备；用于在有价值的第一和第二电极之间施加偏压的设备；和用于监测在化学实体与蛋白质相互作用时发生的波动的设备。
在一些实施方案中，偏压在1mV与50mV之间。
在一些实施方案中，偏压在1mV与100mV之间。
在一些实施方案中，提供了一种方法，该方法包括：(a)提供如本文所述的系统；(b)使蛋白质与化学实体接触；(c)在有价值的第一和第二电极之间施加偏压，使得电极之间电流的自发波动不发生；(d)检测在化学实体与蛋白质相互作用时发生的波动。
本公开的方法可以用于检测单个蛋白质分子的活性。该方法也可以用于对生物聚合物进行测序。该方法也可以用于药物筛选测定。有利地，该方法不需要标记物或特殊化学物质。
对生物聚合物进行测序的方法提供长读段(>10kB)，且聚合酶以天然聚合酶的速度(100nt/s)运行。
本公开的装置具有简单的装置几何形状，这允许容易地按比例放大。
本公开涉及通过对单个进行性蛋白质(processive protein)进行直接电测量来对生物聚合物进行测序的阵列、系统和方法。
在一个实施方案中，本公开提供了用于对生物聚合物进行测序的阵列，所述阵列包含：布置的如本文所述的多个装置。在该实施方案的一方面，该阵列用于测序DNA。
本公开提供了用于直接测量蛋白质活性的系统。该系统包含：(a)如本文所述的阵列；(b)任选地，用于向阵列中引入和除去溶液的设备；(c)用于在第一和第二电极之间施加偏压的设备；以及(d)用于监测在第一和第二电极之间产生的电流的设备。在该实施方案的一方面，该系统用于直接测量聚合酶活性。
本公开还提供了用于测序生物聚合物的方法。在一个实施方案中，该方法用于测序DNA，该方法包括：(a)将包含DNA模板的溶液引入如本文所述的系统；(b)测量当向如本文所述的系统施加偏压时产生的第一电流；(b)在允许掺入与DNA模板互补的dNTP的条件下，将包含dNTP的溶液引入系统；(c)测量步骤(b)中产生的第二电流；(d)除去包含未掺入的dNTP的溶液；(e)用步骤(b)中未使用的其余三种类型dNTP的每一种重复步骤(b)至(d)；(f)重复步骤(b)至(e)；其中根据产生的电流信号测序DNA。
在另一个实施方案中，该方法包括：(a)将包含DNA模板的溶液引入如本文所述的系统；(b)测量当向如本文所述的系统施加偏压时产生的第一电流；(b)在允许掺入与DNA模板互补的dNTP的条件下，将包含至少两种类型的dNTP的溶液引入系统，其中所述类型的dNTP以不同的浓度存在于溶液中；(c)测量在步骤(b)中产生的第二电流；(d)除去包含未掺入的dNTP的溶液；(e)用步骤(b)中未使用的其余类型的dNTP重复步骤(b)至(d)；(f)重复步骤(b)至(e)；其中根据产生的电流信号测序DNA。
附图简要说明
图1示出了根据Chen等人的已知的用于聚合酶波动的检测系统。
图2A示出了根据Choi等人的已知的用于溶菌酶波动的检测系统。图2B示出了根据Olsen等人的已知的用于聚合酶波动的检测系统。图2C示出了根据Olson等人的核苷酸序列依赖性数据。图2D示出了根据Merriman和Mola的已知的用于聚合酶波动的检测系统。
图3示出了已知的用于蛋白质检测的装置。
图4示出了本公开的实施方案的示意图。
图5A示出了当蛋白质如图4中所示在两个点结合时获得的线性电流电压特性。图5B示出了针对大量单分子测量的线性区域的斜率的分布。
图6示出了代表蛋白质波动的信号。
图7示出了本公开的实施方案的示意图，其中蛋白质是聚合酶。
图8A示出了用于测量聚合酶活性的荧光活性测定的原理。除非存在聚合酶活性，否则FAM(F)荧光淬灭。图8B示出了用野生型、无核酸外切酶(D12A，E14A)或附着于链霉抗生物素蛋白的无核酸外切酶的酶温育60分钟后，基底上FAM的荧光强度。
图9示出了对于硫醇化的链霉抗生物素蛋白(左)及附着生物素化的phi29聚合酶之后(右)测量的电导的分布。在2.5nm的间隙处进行链霉抗生物素蛋白测定，且在3.5nm的间隙处进行链霉抗生物素蛋白加phi29测定。
图10示出了电导随构象的变化。左图是针对硫代链霉抗生物素蛋白，且右图是添加生物素后从同一分子膜中获取的数据。电导变化表明其对生物素结合诱导的构象变化敏感。
图11示出了(左)STM间隙和(右)固态芯片中蛋白质波动的高对比度、高时间分辨率记录。样品为抗DNP IgE，电极上带有DNP。装置以200mV的电压运行，间隙为4.6nm。
图12示出了在恒定间隙(如每个图的左下角所标记)和phi29-链霉抗生物素蛋白复合物上的50mV偏压下收集的电流，显示在没有模板DNA和dNTP的情况下仅发生接触波动(A、B、C)，并且当添加模板DNA和dNTP时出现了额外的电报噪声(D、E、F)。右边的插图显示了20至40秒持续时间的完整运行。红色圆圈表示在左侧轨迹(traces)中扩展的高电流点。
图13示出了对于约4.5nm的间隙，在Pd电极上结合肽配体的三种抗体和整合素(如表1中所列)的测量电导的分布(对数标度)，排除链霉抗生物素蛋白通过硫醇键偶联至电极的数据(其在约2.5nm的间隙处采集)。为了清楚起见，这些分布在垂直方向上任意移动。插图说明了具有两个用于肽与电极附着的结合位点的抗体如何桥连间隙，从而导致第二个更高的电导峰(标记为“2”)。也可以发生单连接(“1”)。这些数据表明，如果在蛋白质和电极之间建立两个化学连接(一个至每个电极)，如何在长距离(抗体结合位点之间的13nm)上可以获得高电导(约2nS)。
图14示出了对于(左)链霉抗生物素蛋白和右，链霉抗生物素蛋白-聚合酶复合物，在如所标记的不同的间隙大小处获得的电导分布的间隙距离依赖性。电导分布随间隙大小变化很小，表明这些蛋白质中的传导是通过离域转运机制实现的。插图显示了蛋白质高度的估计值—链霉抗生物素蛋白高约4nm，与链霉抗生物素蛋白结合的phi29的复合物高约9nm。从大至5.5nm的间隙中获得的信号表明传导路径必须部分通过phi29，尽管在这些数据集中几乎可以肯定探针与聚合酶内部接触。
图15示出了聚合酶经由聚合酶上的两个生物素化位点(相隔5nm)与电极上的两个链霉抗生物素蛋白分子的附着。链霉抗生物素蛋白分子经由硫醇部分与电极偶联。
图16示出了与DNA模板结合的聚合酶分子的阵列，每个聚合酶都连接到单独寻址的一对电极中。
图17示出了暴露于核苷三磷酸和冲洗的序列，以确定在每个位点的每个模板分子的序列。
图18示出了两个电报噪声爆发，其是在包含相同碱基的位点处顺序掺入两个相同核苷酸的特征。
发明详述
本公开至少包括以下内容：
(1.)基本上如所示和所述的装置。
(2.)如所示和所述的用于直接电测量蛋白质活性的系统。
(3.)如所示和所述的用于检测蛋白质活性的方法。
(4.)如所示和所述的测序生物聚合物的方法。
(5.)用于直接测量蛋白质活性的装置，该装置包含第一和第二电极，所述第一和第二电极由间隙隔开；和附着于一个或两个电极的蛋白质；其中第一电极和第二电极具有穿过其形成的开口。
(6.)如以上(5.)的装置，其中间隙具有约1.0nm至约20.0nm的宽度。
(7.)用于直接测量蛋白质活性的装置，该装置包含：
(a)介电基底；
(b)设置在介电基底上的第一电极；
(c)设置在第一电极上的绝缘介电层；
(d)设置在绝缘介电层上的第二电极；
(e)设置在第二电极上的钝化层；
(f)附着于一个或两个电极的蛋白质；
其中第一电极、绝缘介电层、第二电极和钝化层具有穿过其形成的开口。
(8)用于直接测量蛋白质活性的装置，该装置包含：
(a)第一和第二电极，所述第一电极和第二电极共平面并且由间隙隔开；
(b)附着于至少一个电极的蛋白质；
其中第一电极和第二电极配置为与待分析的样品接触。
(9.)以上(5.)至(8.)中任一项的装置，其中蛋白质选自由聚合酶、核酸酶、蛋白酶体、糖肽酶、糖苷酶、激酶和核酸内切酶组成的组。
(10.)以上(9.)的装置，其中蛋白质是聚合酶。
(11.)以上(10.)的装置，其中聚合酶附着于一个电极。
(12.)以上(10.)或(11.)的装置，其中聚合酶经由接头附着于电极。
(13.)以上(10.)至(12.)中任一项的装置，其中蛋白质是生物素化的聚合酶。
(14.)以上(13.)的装置，其中生物素化的聚合酶经由硫代链霉抗生物素蛋白接头附着于电极。
(15.)以上(5.)至(14.)中任一项的装置，其中第一和/或第二电极包含选自由金、铂、钯和钌组成的组的金属。
(16.)以上(15.)的装置，其中第一和/或第二电极包含钯。
(17.)用于直接测量蛋白质活性的装置，该装置包含：
(a)介电基底；
(b)设置在介电基底上的第一电极；
(c)设置在介电基底上的第二电极，其中第一和第二电极由1nm和10nm之间的间隙隔开；
(d)设置在电极顶部的钝化层；以及
(e)附着于一个或两个电极的蛋白质；
其中钝化层具有穿过其形成的开口，该开口被定位成允许样品穿过第一和第二电极之间的间隙。
(18.)用于直接电测量蛋白质活性的系统，该系统包含
(a)以上(5.)至(17.)中任一项的装置；
(b)用于引入能够与蛋白质相互作用的化学实体的设备；
(c)用于在第一和第二电极之间施加偏压的设备；以及
(d)用于监测化学实体与蛋白质相互作用时发生的波动的设备。
(19.)以上(18.)的系统，其中蛋白质是聚合酶。
(20.)以上(18.)的系统，其中蛋白质是核酸外切酶、蛋白酶体或聚糖。
(21.)以上(18.)的系统，其中蛋白质是激酶。
(22.)检测单个蛋白质分子的活性的方法，该方法包括
(a)将能够与蛋白质分子相互作用的化学实体引入以上(18.)的系统；
(b)在两个电极之间施加选择的偏压，使得观察到稳定的DC电流；以及
(c)观察当化学实体与蛋白质相互作用时在两个电极之间产生的电流波动。
(23.)以上(22.)的方法，其中蛋白质选自由聚合酶、核酸酶、蛋白酶体、糖肽酶、糖苷酶、激酶和核酸内切酶组成的组。
(24.)以上(22.)或(23.)的方法，其中化学实体选自由核苷三磷酸、核酸、肽、聚糖和激酶组成的组。
(25.)测序DNA的方法，所述方法包括
(a)将引物引发的DNA模板引入以上(18.)的系统；
(b)引入包含四种dNTP的溶液；
(c)在两个电极之间施加选择的偏压，使得观察到稳定的DC电流；
(d)检测当每个新核苷酸掺入引物时在两个电极之间产生的电流波动；以及
(e)确定所掺入的每个核苷酸的身份。
(26.)以上(25.)的方法，其中溶液包含相对于彼此处于大约相同浓度的四种dNTP。
(27.)以上(25.)或(26.)的方法，其中dNTP的浓度约等于或高于模板结合的聚合酶的饱和浓度。
(28.)以上(25.)至(27.)中任一项的方法，其中步骤(d)包括检测一个或多个电流尖峰的存在。
(29.)以上(25.)至(27.)中任一项的方法，其中步骤(e)包括使用每个尖峰的特性。
(30.)测序生物聚合物的方法，所述方法包括
(a)将生物聚合物引入以上(18.)的系统；
(b)在两个电极之间施加选择的偏压，使得观察到稳定的DC电流；
(c)检测当从生物聚合物的末端除去单体时在两个电极之间产生的电流波动；以及
(d)测定从生物聚合物除去的每个单体的身份。
(31.)以上(30.)的方法，其中生物聚合物是DNA、肽或聚糖。
(32.)检测激酶活性的方法，该方法包括
(a)将候选激酶抑制剂分子引入以上(20.)的系统；
(b)在两个电极之间施加选择的偏压，使得观察到稳定的DC电流；
(c)检测当激酶与候选激酶抑制剂分子相互作用时在两个电极之间产生的电流波动；以及
(d)测定在存在候选激酶抑制剂分子的情况下该激酶是否具有活性。
(33.)如本文所述的用于测序生物聚合物的阵列。
(34.)如本文所述的用于测序DNA的阵列。
(35.)用于测序DNA的阵列，其包含：
布置的多个装置，其中每个装置包含：
(a)介电基底；
(b)设置在介电基底上的第一电极；
(c)设置在第一电极上的绝缘介电层；
(d)设置在绝缘介电层上的第二电极；
(e)设置在第二电极上的钝化层；以及
(f)附着于第一和第二电极的聚合酶分子，
其中第一电极、绝缘介电层、第二电极和钝化层具有穿过其形成的开口。
(36.)用于测序DNA的阵列，其包含：
布置的多个装置，其中该装置包含：
(a)介电基底；
(b)设置在介电基底上的第一电极；
(c)设置在介电基底上的第二电极；
(d)设置在电极顶部的钝化层；以及
(e)附着于一个或两个电极的聚合酶分子；
其中钝化层具有穿过其形成的开口。
(37.)用于测序DNA的阵列，其包含：
布置的多个装置，其中该装置包含：
(a)第一和第二电极，所述第一和第二电极由间隙隔开并且与第二电极一起位于一个平面中；
(b)附着于至少一个电极的聚合酶；
其中第一电极和第二电极配置为与待分析的样品接触。
(38.)以上(33.)至(37.)中任一项的阵列，其中布置是栅格(grid)。
(39.)用于直接测量聚合酶活性的系统，其包含：
(a)如本文所述的阵列；
(b)任选地，用于向阵列中引入和除去溶液的设备；
(c)用于在第一和第二电极之间施加偏压的设备；以及
(d)用于监测在第一和第二电极之间产生的电流的设备。
(40.)用于测序DNA的方法，该方法包括：
(a)将包含DNA模板的溶液引入如本文所述的系统；
(b)测量当向如本文所述的系统施加偏压时产生的第一电流；
(c)在允许掺入与DNA模板互补的dNTP的条件下，将包含dNTP的溶液引入系统；
(d)测量步骤(c)中产生的第二电流；
(e)除去包含未掺入的dNTP的溶液；
(f)用步骤(c)中未使用的其余三种类型的dNTP重复步骤(c)至(e)；以及
(g)重复步骤(c)至(f)；
其中根据产生的电流信号测序DNA。
(41.)用于测序DNA的方法，该方法包括：
(a)将包含DNA模板的溶液引入如本文所述的系统；
(b)测量当向如本文所述的系统施加偏压时产生的第一电流；
(c)在允许掺入与DNA模板互补的dNTP的条件下，将包含至少两种类型的dNTP的溶液引入系统，其中所述类型的dNTP以不同的浓度存在于溶液中；
(d)测量步骤(b)中产生的第二电流；
(e)除去包含未掺入的dNTP的溶液；
(f)用步骤(c)中未使用的其余类型的dNTP重复步骤(c)至(e)；以及
(g)重复步骤(c)至(f)；
其中根据产生的电流信号测序DNA。
(42.)以上(41.)的方法，其中步骤(c)中的溶液包含四种类型的dNTP。
(43.)以上(41.)的方法，其中步骤(c)中的溶液包含至少两种类型的dNTP。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本公开的实践或测试中，但是在下面描述了合适的方法和材料。材料、方法和实施例仅是说明性的，并不意图是限制性的。本文提及的所有出版物、专利和其他文件通过引用整体并入本文。
在整个说明书中，词语“包含(comprise)”或变型如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为暗示包括陈述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
术语“一个”或“一”可以表示一个以上的项目。
术语“和”和“或”可以指合取或析取且表示“和/或”。
术语“约”是指在设定值的正或负10％之内。例如，“约100”将表示90到110之间的任何数字。
术语“核苷酸”是指碱基-糖-磷酸酯的组合，并且包括核糖核苷三磷酸ATP、UTP、CTG、GTP和脱氧核糖核苷三磷酸，如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。
用于直接测量蛋白质活性的装置和系统
本公开提供了用于直接测量蛋白质活性的装置。在一个实施方案中，该装置包含第一和第二电极，该第一和第二电极由间隙隔开；和附着于一个或两个电极的蛋白质；其中第一电极和第二电极具有穿过其形成的开口。
在另一个实施方案中，该装置包含第一和第二电极，该第一和第二电极由间隙隔开；和附着于一个或两个电极的蛋白质。
在一些实施方案中，该装置包含：
(a)介电基底；
(b)设置在介电基底上的第一电极；
(c)设置在第一电极上的绝缘介电层；
(d)设置在绝缘介电层上的第二电极；
(e)设置在第二电极上的钝化层；
(f)附着于一个或两个电极的蛋白质；
其中第一电极、绝缘介电层、第二电极和钝化层具有穿过其形成的开口。
在一些实施方案中，该装置包含：
(a)介电基底；
(b)设置在介电基底上的第一电极；
(c)设置在绝缘电介质层上的第二电极；
(d)设置在电极顶部的钝化层；和
(e)附着于一个或两个电极的蛋白质；
其中钝化层具有穿过其形成的开口。
在一些实施方案中，该装置包含：
(a)第一和第二电极，该第一电极和第二电极共平面且由间隙隔开，并且与第二电极一起位于一个平面中；
(b)附着于至少一个电极的蛋白质；
其中第一电极和第二电极配置为与待分析的样品接触。
在电极是平面的实施方案中，装置有利地不需要介电层。需要介电层的装置会遭受弊端。介电层需要粘附层以粘附到电极。这些粘附层在暴露于空气时会氧化，这实际上增加了电极之间间隙的大小。为了补偿这种影响，可以使介电层更薄。然而，薄的介电层容易产生针孔，其可能难以消除。
在本文所述的每个装置实施方案中，蛋白质选自由聚合酶、核酸酶、蛋白酶体、糖肽酶、糖苷酶、激酶和核酸内切酶组成的组。
蛋白质可以直接或间接附着于一个电极。在一些实施方案中，蛋白质经由接头附着于电极。在一些实施方案中，蛋白质经由与附着于电极的配体的相互作用而间接附着于电极。在一些实施方案中，蛋白质经修饰以掺入配体结合位点。
在一个实施方案中，该装置包含：第一和第二电极，该第一和第二电极由间隙隔开；附着于一个或两个电极的聚合酶；其中第一电极和第二电极具有穿过其形成的开口。
在一些实施方案中，聚合酶附着于一个电极。在该实施方案的一些方面，聚合酶经由接头附着于电极。在一些方面，聚合酶是生物素化的聚合酶。在一些方面，聚合酶是生物素化的聚合酶，并经由链霉抗生物素蛋白附着于电极。
在本文所述的每个装置实施方案中，第一和/或第二电极包含选自由金、铂、钯和钌组成的组的金属。在一些实施方案中，金属是钯。
在一些实施方案中，间隙具有约1.0nm至约20.0nm的宽度。在一些实施方案中，间隙具有约1.0nm至约10.0nm的宽度。在一些实施方案中，间隙具有约1.0nm至约7.5nm的宽度。在一些实施方案中，间隙具有约1.0nm至约5.0nm的宽度。在一些实施方案中，间隙具有约4.0nm至约5.0nm的宽度。
在一些实施方案中，该装置可以用于检测单个分子。
本公开还提供了用于直接测量蛋白质活性的系统。该系统包含如本文所述的装置；用于引入能够与蛋白质相互作用的化学实体的设备；用于在第一和第二电极之间施加偏压的设备；以及用于监测当化学实体与蛋白质相互作用时在第一和第二电极之间产生的电流的设备。
在本文所述的每个系统实施方案中，蛋白质选自由聚合酶、核酸酶、蛋白酶体、糖肽酶、糖苷酶、激酶和核酸内切酶组成的组。在一个实施方案中，蛋白质是聚合酶。
当蛋白质是聚合酶时，该聚合酶附着于一个电极，或优选两个电极。在该实施方案的一些方面，聚合酶经由一个或多个接头附着于电极。在一些方面，聚合酶是生物素化的聚合酶。在一些方面，聚合酶是生物素化的聚合酶，并经由链霉抗生物素蛋白附着于电极。
在本文所述的每个系统实施方案中，第一和/或第二电极包含选自由金、铂、钯和钌组成的组的金属。在一些实施方案中，金属是钯。
在一些实施方案中，间隙具有约1.0nm至约20.0nm的宽度。在一些实施方案中，间隙具有约1.0nm至约10.0nm的宽度。在一些实施方案中，间隙具有约1.0nm至约7.5nm的宽度。在一些实施方案中，间隙具有约1.0nm至约5.0nm的宽度。在一些实施方案中，间隙具有约4.0nm至约5.0nm的宽度。
图4示出了根据本公开实施方案的系统的示意图。蛋白质分子51在某些位点53和54处被共价修饰。此类位点可以是通过与马来酰亚胺反应而修饰的表面半胱氨酸残基，通过NHS酯或在蛋白质的N或C端插入组氨酸标签以结合次氮基三乙酸而修饰的赖氨酸残基，或者通过蛋白质的生物素化和经由附着于电极的硫醇化链霉抗生物素蛋白分子的附着。如本领域所公知的，可以使用诸如Myc标签或GST标签的其他附接方式。该实施方案的关键和独特的设计方面是蛋白质本身被用作检测器，为此目的，使用强而持久的化学拴系以将蛋白质附着到电极上。修饰的位点与柔性接头偶联，所述柔性接头可以是短的(1至10个重复)烷烃寡聚物或聚乙二醇寡聚物或重组地掺入蛋白质的短肽链。这些继而被将接头分子拴系至金属电极57和58的反应性基团56终止。虽然多种连接均是可能的，但硫醇连接是优选的，并且也可以使用胺，生物素-链霉抗生物素蛋白连接也可以。在两个电极之间施加偏压59，并监测电极之间通过的电流60。将系统浸入含有酶功能所必需的离子的缓冲溶液中，并记录引入化学实体61(如酶的底物和/或药物)的作用。
本公开的基础在于，当如上所述将蛋白质牢固地拴系在两个电极上时，关于蛋白质在大(约4.5nm)间隙中的行为的显著地出乎意料且非常新近的观察结果。我们发现，在先前报告的电报噪声信号出现的临界偏置电压以下，可以找到简单的线性(欧姆)响应。这是完全出乎意料的，因为蛋白质被认为是分子固体，其中电子传输的模式应只是隧穿的。然而，隧穿不能解释当蛋白质以图4中所示的方式拴系时，观察到的具有线性电流-电压的大电流。在图5中示出了在单个蛋白质分子上测量的典型电流-电压曲线的实例。如先前报道，观察到约±100mV以上的较大噪声波动，但在±100mV以下(图5A中标记为71的方框区域)存在一个线性区域，其意味着即使在如此大的(4.5nm)距离，蛋白质的DC电导率也非常高。当拟合该线性区域并且获得拟合电导的分布时，电导分布可以通过如图5B中所示的指数分布来拟合(实线是拟合)。请注意，在这种情况下，平均电导K的值为1.5nS。
如图13中所示，测量的较大集合揭示了电导的更复杂的分布。该图绘制了给定电导的频率对通过各种方式偶联到电极的一系列蛋白质的电导的直方图。电导刻度为对数(以10为底)，并且如线所示拟合的峰为高斯，因此这些电导按照对数正态分布进行分布。(为了清楚起见，这些分布在垂直方向上任意移动)。通过与特定蛋白质的特异性配体结合，或者在经由硫醇连接的链霉抗生物素蛋白的情况下，将蛋白质拴系在电极上。配体经由硫醇(半胱氨酸)连接化学附着于电极。表1中列出了各种蛋白质、它们的配体、蛋白质-配体复合物的解离常数、用于验证特异性结合的对照以及通过拟合分布获得的电导的峰值。
Figure BDA0002887405480000161
表1：电导研究中使用的蛋白质
当电极暴露于所列的对照分子时未观察到电导，表明蛋白质与电极的特异性化学拴系对于待观察的电子电导是必需的。
在这三种抗体的情况下，两个结合位点可用，两个结合域的每一个处有一个，相隔13nm。结果，在这三个分子的分布中观察到第二个更高的电导峰。这产生了表1中列出的这些分子的第二电导峰。因此，如果将蛋白质化学拴系在两个电极上，则可以在长距离(13nm)上获得高电导。
迄今为止，对于许多研究的蛋白质而言，已经发现了该开始电压驱动波动的阈值约为100mV。因此，通过在低于该开始自发波动的阈值操作结点(即图4中的V＜VC，其中VC为约100mV)，DC电流用于表明蛋白质以其静止状态被捕获。该信号非常大：对于刚刚给出的示例，在50mV偏压下平均为75pA，且如果蛋白质通过化学方式拴系以桥连电极间隙，则该信号会更大。
蛋白质波动为电子传输开辟了更多通道。因此，当蛋白质偏向VC以下，但由于引入底物分子而受到刺激时，会发生大电流波动。图6中示出由蛋白质波动引起的电流信号的实例。注意，与图2C中所示相比，信号82比噪声81大大改善了。图12中给出了诱导的蛋白质波动的另一个实例。这显示了通过STM探针收集的数据，该STM探针保持在经由结合在电极表面上的生物素化N端结合硫醇化链霉抗生物素蛋白分子与钯电极偶联的phi29聚合酶单层上方恒定3.5或4.5nm的高度上。图A、B和C显示了由于与聚合酶的接触点的波动而发生的电流波动。随着时间的流逝(右侧插图)，这可能导致电流发生较大变化，但是如果偏压低于VC，则不会观察到毫秒时间尺度的电报噪声。左边的扩展的电流时间轨迹来自电流峰区域(在右侧的长时间刻度图上用红色圆圈圈出)。如图D、E和F中所示，当添加引物引发的单链DNA模板和dNTP时，诱发毫秒时间尺度的电报噪声。
以聚合酶的单个化学附接点获取图12中所示的信号。结果，与第二电极的连接高度可变，如图12A、B和C的电流波动所示。单个化学接触的另一个重要缺点是蛋白质与第二电极之间的物理接触性能差。这在图14中示出。这显示了当电极间隙对于标记的间隙以1nm的增量增加时，在链霉抗生物素蛋白单层上(左侧)和在结合生物素化的phi29聚合酶之后，同一单层上(右侧)测量的电导分布(为了清楚起见，分布曲线垂直移动)。对于链霉抗生物素蛋白的情况，在3.5nm的间隙距离处记录的曲线很少。对于phi29与链霉抗生物素蛋白结合的情况，曲线记录到4.5nm(一些记录在5.5nm处-未显示)。然而，这实际上小于约9nm的聚合酶-链霉抗生物素蛋白复合物的总高度(如插图中所示)。这与图13(其中在将两个结合域隔开的13nm路径上获得了高电导)中所示的抗体数据形成鲜明对比。这证明了形成两个化学上明确定义的接触(一对的每个电极有一个)的可取性。
制造本公开装置的方法
通过将贵金属如Au、Pt或Pd的层沉积到硅、玻璃或蓝宝石晶片(或其他介电基底)上，然后沉积反应性金属的薄层(通常为1nm)用于粘附(如铬或钛)，然后是1至10或1至20或1至50nm的贵金属层，可以容易地制造本公开的装置。然后，该底部电极覆盖有绝缘介电层，优选氧化铝，尽管可以使用其他氧化物，如SiO2或氧化铪。该层的厚度应在2到10nm之间。可以通过用1至1.5nm的铝包被底部贵金属电极并允许其在空气中氧化，从而生成2至3nm厚的Al2O3层，来沉积2nm的层。如本领域所公知的，如果需要更大厚度的电介质，可以通过具有水/三甲基铝循环的原子层沉积来进一步添加Al2O3。
然后沉积第二贵金属电极，再次使用薄的粘附层(铬或钛)，但最大厚度为1nm，以便不显著改变在该粘附层将被氧化的装置边缘处出现的间隙。
最后，将钝化层放置在顶部电极的顶部。这可以是氧化铝、SiO2、氧化铪或抗蚀剂材料，如PMMA或SU8。
为了使腔足够小以确保暴露的电极区域使得仅附着一个聚合酶，然后使用本领域众所周知的反应性离子蚀刻(RIE)制成小的开口。该开口的直径可以在10至500nm之间，优选约50nm。开口的深度应足够大，以使其穿过钝化层、顶部电极、隔开电极的介电层并进入底部电极。
限制暴露的电极区域的量的第二种方式是使电极之一(顶部或底部，优选顶部)为宽度50至100nm的细线。然后RIE开口可以大得多(例如微米尺寸，允许常规光刻)，因为暴露的电极将受到电极的小宽度的限制。
第三种方式是通过控制结点暴露于聚合酶分子的时间的量和/或聚合酶的浓度来控制功能化化学。当施加的偏压高于100mV时，可以通过监视由接触波动引起的电报噪声来测试每个结点的负荷。2个信号水平的存在表明仅捕获了单个分子。三个水平的存在表明捕获了两个分子，依此类推。这样，可以将浓度和暴露时间调整为理想的泊松负荷(Poissonloading)，其中约30％的位点被单独占据。
用氧等离子体清洗后，可以用蛋白质功能化开口中电极的暴露区域。这可以是直接使用蛋白质表面上的天然硫醇，或经由将巯基附接到蛋白质上的化学修饰，或者间接通过附接硫醇化的链霉抗生物素蛋白，然后捕获生物素化的蛋白质。
制造该装置的第二种方法是在同一平面上形成两个电极，两个电极之间的间隙很小。如本领域所公知的，这可以通过使用电子束光刻和剥离或反应性离子蚀刻(RIE)在单条线上开一条沟槽来完成。其他方法是使用氦离子铣削或在阶跃边缘上成角度地沉积金属，以便自然地形成间隙。然后用钝化层和由RIE形成的开口覆盖电极对，从而暴露出电极间隙。然后可以如上所述将电极功能化。
暴露电极的宽度很重要，因为此处描述的装置通常依赖于仅与一个分子连接。在提取序列信息的情况下，单分子信号的这一要求特别重要。如果电极的宽度不比单个分子(5至15nm)宽得多，则无法跨间隙附接多个分子。然而，此类小电极的可靠功能化和制造非常困难。在实践中，我们发现宽度达100nm的电极不太可能捕获超过一个蛋白质分子。特别地，当在期望的(桥连)构型中结合的可能性较小时，甚至可以期望具有甚至更宽的电极，其宽度为200、300、400、500或甚至1000nm。与仅一个电极结合而不是桥连一对电极的蛋白质分子将贡献相对较小量的电流。
将聚合酶附着至电极的方法
当蛋白质是聚合酶时，它应该是具有高进行性的聚合酶，如phi29聚合酶，并且应如下所述使其核酸外切酶功能失去能力。
若期望，野生型(WT)聚合酶需要进行修饰以(a)除去其核酸外切酶活性，并且(b)添加化学附接点。通过使用大肠杆菌表达系统的重组DNA来实现这种修饰以产生修饰的聚合酶。
phi29的核酸外切酶活性需要以下酸性氨基酸：D12、E14、D66和D169。突变其中任何一种都将消除核酸外切酶活性，我们已经将D12和E14突变为丙氨酸。
我们使用的克隆在N端处同时具有his标签和avitag(用于生物素化)，即His-Avitag-Phi29。结果，以下序列被添加到酶的N端：
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSGLNDIFEAQKIEWHEGASS。
六个组氨酸残基是组氨酸标签(用于纯化所期望的酶产物)，并且GLNDIFEAQKIEWHE是Avitag。生物素通过生物素连接酶BirA(Avidity，Lansing，MI)附着于avitag中的K。活性测定表明，附着于链霉抗生物素蛋白的生物素化酶仍具有活性(图8B)。
本公开的另一个有用且出乎意料的特征是链霉抗生物素蛋白和聚合酶两者都是导电蛋白，因此，如我们下文所示，聚合酶可以间接附着于电极。首先将用硫醇修饰的链霉抗生物素蛋白附着至电极，然后引入生物素化的聚合酶。这与链霉抗生物素蛋白结合，为电极提供了导电路径。
也可以通过相同的重组方法在C端修饰聚合酶。除了avitag外，还可以使用其他基于肽的结合标签，如GST标签、Myc标签和His标签。这些标签都可以在聚合酶的N或C端掺入。在C端的掺入将标签位点置于靠近捕获有引物引发的模板的位点，因此可以在C端和标签之间掺入低聚丙氨酸或甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸间隔区序列，以减少对聚合酶模板捕获活性的干扰。
相同的技术也可以用于附着其他待使用本公开的方法检测其活性的蛋白质(如激酶、蛋白酶或加工聚糖的分子)。
除了在N或C端进行修饰外，phi29中还有七个半胱氨酸。没有一个是二硫键合的，因此都具有形成二硫键的潜力，从而提供了另外的附着于电极的位点。基于具有模板和引物C448的phi29的结构，C106和C22是大部分表面暴露的，并且看起来是通过马来酰亚胺进行生物素化或直接附着在结合巯基的重金属上的良好候选物。问题是如何控制特异性。我们试图一次突变掉除一个半胱氨酸以外的所有半胱氨酸，但结果是不溶性蛋白质。然而，最多可以除去四个，而不影响溶解度，从而将C448、106和C22用作附着点的目标。
尽管本公开仅对一个电极的一个化学附着位点起作用，第二接触通过蛋白质和金属之间的物理接触进行，但是期望以跨越两个电极间的间隙的方式进行两个化学上明确定义的接触。C端与N端相距约5nm，并且如果使用经由avitag的生物素化，则不可能通过同一聚合酶的N和C端两者附接同一链霉抗生物素蛋白分子。因此，在两个电极都被硫代链霉抗生物素蛋白功能化的情况下，有可能形成桥连结构，其中N端连接到一个电极，且C端连接到第二电极。
另一种方法是使用间隔较宽但在蛋白质的无活性区域中的两个附接点。在phi29聚合酶(其中核酸外切酶结构域因D12和E14突变而失去能力)的情况下，发现核酸外切酶结构域中的两个点G111和K112之间以及E279和D280之间间隔>5nm。因此，用在这两个点插入的Avitag序列GLNDIFEAQKIEWHE，以及通过BirA生物素化的Avitag赖氨酸，如图15中所示，聚合酶可以结合在一对电极上。这显示了phi29聚合酶1501，使用G111和K112之间以及E279和D280之间的Avitag位置(1502和1503)对该酶进行生物素化。这些生物素结合经由硫连接1506和1507附着于电极1508和1509的硫醇化链霉抗生物素蛋白分子1504和1505。由于这些连接点之间的间隙(图15中的双箭头)略大于5nm，该附接几何形状需要略小于5nm的间隙1510。
通过向聚合酶添加“导电晶须(conducting whisker)”在聚合酶和电极之间建立确定的接触。
在N端处重组地添加：
CGSSHHHHHHSSFTLIELLIVVAIIGILAAIAIPQFSAYRVKAYNSAASSDRLNLKTALESAFADDQTYPPESGLVPRGSGASS-f29
末端C是用于附接到第一电极的半胱氨酸。
his标签用于蛋白质提取和纯化。
SS后的61个氨基酸的序列是来自geobacter sulferreductans的菌毛蛋白的序列，其充当金属线。
在C端处重组地添加：
f29-AAFTLIELLIVVAIIGILAAIAIPQFSAYRVKAYNSAASSDRLNLKTALESAFADDQTYPPESC
AA后的61个氨基酸的序列是来自geobacter sulferreductans的菌毛蛋白的序列。
末端C是用于附接到第一电极的半胱氨酸。
复合物的电导率
本公开的关键是可以通过聚合酶获得良好的电子电导。图9示出了(左图)通过经由巯基键连接至底物的链霉抗生物素蛋白的电导分布。这些数据是在电极间隙为2.5nm的情况下获得的。如果将间隙增加到3.5nm，几乎不发生读取。如果间隙进一步增加到4.5nm，则根本不能获得读数。这与位于平整表面上的链霉抗生物素蛋白分子高约4nm的事实是一致的。图9的右侧显示了在Pd电极上生物素化的phi29聚合酶与链霉抗生物素蛋白的复合物的数据。这些数据是在3.5nm的间隙大小下获得的。在复合物的间隙大小为4.5nm处记录了相似的数据(该间隙中未记录链霉抗生物素蛋白的电导)。由于这些距离大于链霉抗生物素蛋白单独发出强信号的间隙，因此它们表明通过与链霉抗生物素蛋白串联连接的聚合酶发生了传导。请注意，与单独的链霉抗生物素蛋白相比，复合物中电导的分布如何改变。
电导率随构象变化
图10示出了单独的链霉抗生物素蛋白(左图)和暴露于生物素后的链霉抗生物素蛋白的测量的电导分布。链霉抗生物素蛋白结合生物素后，测得的电导的分布发生变化，这表明蛋白质的电导对蛋白质构象的变化敏感。
蛋白质构象的动态监测
图11示出了(左图)用扫描隧道显微镜记录和(右图)使用间隙为4.5nm的固态芯片记录的电压诱导的构象波动的记录。偏压为200mV，比VC高100mV。该蛋白质是结合附着于电极的二硝基苯酚(DNP)的抗二硝基苯酚分子。很容易记录到毫秒时间尺度上电导的非常大的变化，并具有出色的信噪比。图12D、E和F示出了当偏压减小到低于VC(在这种情况下为50mV)并且通过添加底物激活蛋白质时发生的电流波动。毫秒时间尺度上产生电报噪声，并具有很高的信噪比。
装置和系统的使用方法
本公开提供了用于测序生物聚合物的方法。我们针对图7中通过聚合酶延伸的核酸链的特定情况对此进行说明。此处，聚合酶96在两个点53、52被修饰。一个具体的实例是phi29聚合酶中可用的两个表面暴露的半胱氨酸。另一个实例是图15中所示的生物素功能化。马来酰亚胺修饰的烷烃或PEG接头54、55用于经由强硫醇键(例如)56将聚合酶附接至电极57、58。当V＜VC 59时，通过稳定的DC电流60验证了聚合酶在电极间隙中的结合。当聚合酶96与引物引发的模板91复合并暴露于包含四种核苷三磷酸92 93 94 95的每一种的溶液时，特征性的电流波动将用信号指示给定核苷酸的掺入。在一个替代实施方案中，表面半胱氨酸可以用于直接制备附接之一。
在使用中，一旦准备好装置，就应进行冲洗，然后将其暴露于待测序的引物引发的模板DNA。如本领域所公知的，通过连接发夹引物，从待测序的样品中制备该DNA。包含四种dNTP和Mg2+的缓冲溶液应引入装置中。dNTP以大约等同的浓度存在于缓冲溶液中。在一个实施方案中，dNTP的浓度大约等于模板结合的聚合酶的饱和浓度，在第二实施方案中处于模板结合的聚合酶的浓度饱和，并且在第三实施方案中高于饱和浓度。当dNTP的浓度处于或高于饱和浓度时，聚合酶快速运行(即每秒100个核苷酸掺入)。
当将包含dNTP的缓冲溶液引入装置时，将引发聚合反应，并将捕获的模板复制到引物上，从而产生一系列电流尖峰。每个尖峰(或尖峰的簇)在将每个新核苷酸掺入引物时发生，并且每个尖峰的特征(持续时间、幅度、形状)用于解码所掺入核苷酸的身份。在核苷酸的饱和浓度(>30μM)下，典型的测序速度约为每秒100个核苷酸。模板的饱和浓度约为10nM，并且在完成前一个模板后几乎立即掺入一个新模板。只要溶液中有可用的模板，每个分子将继续移交模板。因此，只要操作该装置，就可以连续测序一个分子。
装置的几何结构极其简单，无需为每个结点分隔流体隔室，因此一个结点仅占用约微米2的面积。考虑到互连、分离和芯片上处理电子设备，单个读取装置可以很容易地安装在100微米乘100微米的区域中，因此1cm2的有源芯片面积将容纳10,000个装置。运行1小时的具有10,000个结点的芯片将可以对整个人类基因组进行测序(10000x 3600x 100＝3.6x109)。较密的装置几何形状或较大的芯片甚至将容纳很大一部分不活动的装置，并且仍允许在一小时或更短时间内在一个小型装置上进行基因组规模的测序。
前述实施例说明了核酸聚合物的测序，但是也可以应用它，使得可以使用处理聚合物的其他酶。例如，核酸外切酶中的电流波动将反映它们降解的核酸的组成。消化肽的蛋白酶体也是如此。一个实例是蛋白酶体20S CP，并且通过将它们并入图4的系统中，并监测当它们被提供给肽分子并被偏置为低VC时产生的电信号，像这样的蛋白酶体很可能用于单分子肽测序。
存在类似的酶(称为糖苷酶)用于消化聚糖。将糖苷酶掺入图4的装置中将允许对聚糖进行电子测序。聚糖键合的变化可以排除序列的直接线性读出，但是及时地进行切割事件的组织可以允许识别聚糖。
在另一个实施方案中，本公开提供了用于检测激酶活性的方法。在该实施方案中，将激酶掺入图4的装置中，将其暴露于其底物，并且当偏置为VC以下时，通过大电流波动的产生来发出激酶活性的信号。然后可以在监测波动时将该系统暴露于候选激酶抑制剂药物，以发现哪些药物“杀死”了激酶的活性。在本领域中，荧光标记方法的使用可能干扰与其底物相互作用的蛋白酶，并且本公开除去了对蛋白质的标记的要求。
在所有这些方法中，使用简单的结点(相对于FET结构)极大地简化了制造，并且能够按比例放大到大型并行装置阵列。如下所述，可以使用用于结点装置的可缩放制造，以大规模并行制造来制备本公开的装置。
测序DNA或其他聚合物的阵列和系统
本公开提供了用于使用与分子模板进行性地相互作用的任何酶(如核酸酶、蛋白酶体、糖肽酶、糖苷酶、激酶和核酸内切酶)对生物聚合物进行测序的阵列。下面的实施方案说明了用于使用聚合酶测序DNA的阵列。应当理解，任何进行性酶都可以代替阵列中的聚合酶。
该阵列包含布置的多个装置。在本公开的阵列中使用的装置包括以下。
在一个实施方案中，该装置包含第一和第二电极，该第一电极和第二电极由间隙隔开；以及附着于一个或两个电极的聚合酶；其中第一电极和第二电极具有穿过其形成的开口。
在另一个实施方案中，该装置包含第一和第二电极，该第一和第二电极由间隙隔开；以及附着于第一和第二电极两者的聚合酶。
在一些实施方案中，该装置包含：
(a)介电基底；
(b)设置在介电基底上的第一电极；
(c)设置在第一电极上的绝缘介电层；
(d)设置在绝缘介电层上的第二电极；
(e)设置在第二电极上的钝化层；
(f)附着于第一和第二电极的聚合酶分子；
其中第一电极、绝缘介电层、第二电极和钝化层具有穿过其形成的开口。
在一些实施方案中，该装置包含：
(a)介电基底；
(b)设置在介电基底上的第一电极；
(c)设置在介电基底上的第二电极；
(d)设置在电极顶部的钝化层；以及
(e)附着于一个或两个电极的聚合酶分子；
其中钝化层具有穿过其形成的开口。
在一些实施方案中，该装置包含：
(a)第一和第二电极，该第一电极和第二电极共平面并且由间隙隔开；
(b)附着于至少一个电极的蛋白质；
其中第一电极和第二电极配置为与待分析的样品接触。
在本文所述的每个装置的实施方案中，第一和/或第二电极包含选自由金、铂、钯和钌组成的组的金属。在一些实施方案中，金属是钯。
在一些实施方案中，间隙具有约1.0nm至约20.0nm的宽度。在一些实施方案中，间隙具有约1.0nm至约10.0nm的宽度。在一些实施方案中，间隙具有约1.0nm至约7.5nm的宽度。在一些实施方案中，间隙具有约1.0nm至约5.0nm的宽度。在一些实施方案中，间隙具有约4.0nm至约5.0nm的宽度。
可以以任何合适的方式将装置阵列布置在例如栅格中。
在一些实施方案中，阵列包含与模板DNA结合的聚合酶分子。如本领域公知的，可以通过将基因组DNA片段(例如，通过超声处理产生的)与含有用于聚合酶结合的切口的引物序列连接来制备此类模板。如果需要的话，结果是跨越整个基因组的模板文库。然后，每个模板将随机结合阵列中的一哥聚合酶。
现在参考图16，如本领域所公知，接触栅格101、102由两层接触金属形成，该两层接触金属由电介质隔开，然后被钝化层覆盖。然后，通过有选择地除去钝化层而使每个交叉点暴露，并且在每个结点处结合聚合酶分子103。这些生物分子结点可以通过上一节中讨论的方法来制备。通过使电极足够窄(宽度约1微米)，通常只有一个聚合酶(或没有)将结合。在两个或更多几个结合的情况下，信号仍然可以解卷积(deconvolve)，因为它们由一个分子的两个电流水平，两个分子的三个电流水平组成，依此类推。
本公开还提供了用于直接测量聚合酶活性的阵列的系统。该系统包含如本文所述的阵列；任选地用于向阵列引入和除去溶液的设备；用于在第一电极和第二电极之间施加偏压的设备；继而监测第一和第二电极之间产生的电流的设备。
返回参照图16，提供了用于施加小的偏压(通常为50mV)并从每个结点读取电流的设备106，以便可以由计算机存储系统对其进行记录。
使用阵列的系统进行DNA测序的方法
本公开还提供了使用如本文所述的阵列的系统进行DNA测序的方法。
通过将包含一种核苷单磷酸(例如，dATP、dGTP、dCTP、dTTP中的一种)以及镁的溶液引入阵列来进行测序。每个与互补核苷酸结合的聚合酶都会产生信号，该信号由与每个聚合酶结合的唯一一对电极读取。例如，如果添加的核苷酸是dCTP，则每个在G碱基处结合的模板都将C掺入延伸链中，从而产生信号，而其他序列将产生截然不同的信号。例如呈现有不匹配碱基的聚合酶将在捕获错配碱基时产生短暂的信号爆发，但由于错配被拒绝以及聚合和易位过程中止，信号串将过早终止。相反，随着掺入和易位过程的完成，匹配碱基的掺入导致更长的脉冲串。第二步，冲洗阵列以除去多余的核苷酸，并引入包含下一种核苷酸的溶液(例如dATP，使得所有具有T的位点现在都会产生信号)。继续循环，直到所有四种dNTP都循环通过装置，然后重复该循环。可以重复此循环，直到耗尽所有模板DNA，从而生成整个片段文库的序列数据。
图17示出了用于测序DNA的方法。在将dATP添加至阵列201时，所示分子将在A被掺入延伸链中时产生信号204。然后冲洗阵列以除去dATP202，并添加下一种核苷酸203(在此显示为dTTP)。如所示继续循环。添加dATP，然后dCTP，然后dATP，都产生了碱基掺入的信号204，而其他核苷酸的存在则不产生205。因此，该特定位置处的序列将记录为TGT。
将认识到，与使用dNTP循环的当前测序策略相比，该方法具有两个主要优势。一个是，通过利用比聚合酶的碱基掺入速率更快的时间尺度单分子读出，对相同碱基的重复计数现在变得很容易。因此，在存在dTTP的情况下，序列AAAAA将给出5个明显的信号爆发，依此类推。第二个是，与已知的光学读出方案相反，所读取的模板的长度不受与安装基底的距离的限制，因此潜在的读取长度与聚合酶的进行性一样高(对于phi29为10kB)。
图18示出了读取单个顺序掺入并因此读取序列的均聚物运行的能力。电流对时间记录300示出了两个顺序碱基的掺入(此处示出了在两个连续的A位点处掺入的dTTP的电子数据)。每个信号由以下组成：持续时间约为20ms的电报噪声的爆发301，爆发之间由间隙隔开，在微摩尔浓度的核苷三磷酸处，平均约为10至20ms。因此，在图17中所示的化学循环的任何给定步骤上，仅存在一个核苷三磷酸的情况下，可以简单地通过记录此类电报噪声爆发的数目来计算模板链中其互补物的重复碱基的数目。
在另一个实施方案中，溶液包含超过一种dNTP，其中dNTP以不同的浓度存在。例如，溶液包含1mM dATP、100μM dGTP、10μM dCTP和0.1μM dTTP。在该实施方案中，随着每个模板的延伸，阵列中的聚合酶将连续产生信号。在模板DNA中存在T的点，掺入的信号将迅速跟随电报噪声的前一个爆发(通常在10ms内)。下一个碱基为C的模板DNA将显示更延迟的电报噪声的爆发，因为dGTP的浓度较低，因此其到达速度较慢。类似地，由于dCTP的浓度甚至更低，因此含有G的模板之前将有更长的延迟。最长的延迟将在A碱基之前，因为dTTP的浓度最低。
在又一个实施方案中，可以使用两个冲洗循环，在第一循环中使用不同浓度的一对核苷酸，然后在第二循环中使用也处于不同浓度的另外两个核苷酸来组合两种方法。
尽管前面的部分描述了使用包含聚合酶的阵列的系统对DNA进行测序的方法，但可以轻松修改阵列的系统以对其他聚合物也进行测序。
尽管已经在前述说明性实施方案中描述和说明了本发明，但是应该理解，本公开仅是通过示例的方式进行的，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明的实施细节进行多种改变。所公开的实施方案的特征可以以各种方式组合和重新排列。本文提及的所有出版物、专利和其他文件通过引用整体并入本文。
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Claims (35)

1.用于直接测量蛋白质活性的装置，所述装置包含：
第一和第二电极，所述第一和第二电极共平面并由间隙隔开；以及
附着于一个或两个电极的蛋白质；
其中所述第一电极和所述第二电极配置为与待分析的样品接触。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述间隙具有约1.0nm至约20.0nm的宽度。
3.一种用于直接测量蛋白质活性的装置，所述装置包含：
(a)介电基底；
(b)设置在所述介电基底上的第一电极；
(c)设置在所述第一电极上的绝缘介电层；
(d)设置在所述绝缘介电层上的第二电极；
(e)设置在所述第二电极上的钝化层；
(f)附着于一个或两个所述电极的蛋白质；
其中所述第一电极、所述绝缘介电层、所述第二电极和所述钝化层具有穿过其形成的开口。
4.根据权利要求1或3所述的装置，其中所述蛋白质选自由聚合酶、核酸酶、蛋白酶体、糖肽酶、糖苷酶、激酶和核酸内切酶组成的组。
5.根据权利要求4所述的装置，其中所述蛋白质是聚合酶。
6.根据权利要求5所述的装置，其中所述聚合酶附着于一个电极。
7.根据权利要求5所述的装置，其中所述聚合酶经由接头附着于所述电极。
8.根据权利要求5所述的装置，其中所述蛋白质是生物素化的聚合酶。
9.根据权利要求8所述的装置，其中所述生物素化的聚合酶经由硫代链霉抗生物素蛋白接头附着于所述电极。
10.根据权利要求1所述的装置，其中所述第一和/或第二电极包含选自由金、铂、钯和钌组成的组的金属。
11.根据权利要求10所述的装置，其中所述第一和/或第二电极包含钯。
12.用于直接测量蛋白质活性的装置，所述装置包含：
(a)介电基底；
(b)设置在所述介电基底上的第一电极；
(c)设置在所述介电基底上的第二电极，其中所述第一和第二电极由1nm和20nm之间的间隙隔开；
(d)设置在所述电极顶部的钝化层；以及
(e)附着于一个或两个所述电极的蛋白质；
其中所述钝化层具有穿过其形成的开口，所述开口被定位成允许样品穿过所述第一和第二电极之间的间隙。
13.用于直接电测量蛋白质活性的系统，所述系统包含
(a)根据权利要求1所述的装置；
(b)用于引入能够与所述蛋白质相互作用的化学实体的设备；
(c)用于在所述第一和第二电极之间施加偏压的设备；以及
(d)用于监测所述化学实体与所述蛋白质相互作用时发生的波动的设备。
14.根据权利要求13所述的系统，其中所述蛋白质是聚合酶。
15.根据权利要求13所述的系统，其中所述蛋白质是核酸外切酶、蛋白酶体或聚糖。
16.根据权利要求13所述的系统，其中所述蛋白质是激酶。
17.检测单个蛋白质分子的活性的方法，所述方法包括：
(a)将能够与所述蛋白质分子相互作用的化学实体引入权利要求13所述的系统；
(b)在所述两个电极之间施加选择的偏压，使得观察到稳定的DC电流；以及
(c)观察当所述化学实体与所述蛋白质相互作用时在所述两个电极之间产生的电流波动。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述蛋白质选自由聚合酶、核酸酶、蛋白酶体、糖肽酶、糖苷酶、激酶和核酸内切酶组成的组。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述化学实体选自由核苷三磷酸、核酸、肽、聚糖和激酶组成的组。
20.测序DNA的方法，所述方法包括
(a)将引物引发的(primed)DNA模板引入权利要求13所述的系统；
(b)引入包含四种dNTP的溶液；
(c)在所述两个电极之间施加选择的偏压，使得观察到稳定的DC电流；
(d)检测当每个新核苷酸掺入所述引物时在所述两个电极之间产生的电流波动；以及
(e)测定所掺入的每个核苷酸的身份。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述溶液包含相对于彼此处于大约相同浓度的四种dNTP。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述dNTP的浓度约等于或高于模板结合的聚合酶的饱和浓度。
23.根据权利要求20所述的方法，其中步骤(d)包括检测一个或多个电流尖峰的存在。
24.根据权利要求20所述的方法，其中步骤(e)包括使用每个尖峰的特性。
25.测序生物聚合物的方法，所述方法包括
(a)将生物聚合物引入权利要求15所述的系统；
(b)在所述两个电极之间施加选择的偏压，使得观察到稳定的DC电流；
(c)检测当从所述生物聚合物的末端除去单体时在所述两个电极之间产生的电流波动；以及
(d)测定从所述生物聚合物除去的每个单体的身份。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述生物聚合物是DNA、肽或聚糖。
27.检测激酶的活性的方法，所述方法包括
(a)将候选激酶抑制剂分子引入权利要求16所述的系统；
(b)在所述两个电极之间施加选择的偏压，使得观察到稳定的DC电流；
(c)检测当所述激酶与所述候选激酶抑制剂分子相互作用时在所述两个电极之间产生的电流波动；以及
(d)测定在存在所述候选激酶抑制剂分子的情况下所述激酶是否具有活性。
28.用于测序DNA的阵列，所述阵列包含：
布置的多个装置，其中每个装置包含：
(a)介电基底；
(b)设置在所述介电基底上的第一电极；
(c)设置在所述第一电极上的绝缘介电层；
(d)设置在所述绝缘介电层上的第二电极；
(e)设置在所述第二电极上的钝化层；以及
(f)附着于所述第一和第二电极的聚合酶分子，
其中所述第一电极、所述绝缘介电层、所述第二电极和所述钝化层具有穿过其形成的开口。
29.用于测序DNA的阵列，所述阵列包含：
布置的多个装置，其中每个装置包含：
(a)介电基底；
(b)设置在所述介电基底上的第一电极；
(c)设置在所述介电基底上的第二电极；
(d)设置在所述电极顶部的钝化层；以及
(e)附着于所述一个或两个电极的聚合酶分子；
其中所述钝化层具有穿过其形成的开口。
30.根据权利要求28或29所述的阵列，其中所述布置是栅格。
31.用于直接测量聚合酶活性的系统，所述系统包含：
(a)权利要求28或29所述的阵列；
(b)任选地，用于向所述阵列引入和除去溶液的设备；
(c)用于在所述第一和第二电极之间施加偏压的设备；以及
(d)用于监测在所述第一和第二电极之间产生的电流的设备。
32.用于测序DNA的方法，所述方法包括：
(a)将包含DNA模板的溶液引入权利要求31所述的系统；
(b)测量当向如本文所述的系统施加偏压时产生的第一电流；
(c)在允许掺入与所述DNA模板互补的dNTP的条件下，将包含所述dNTP的溶液引入所述系统；
(d)测量步骤(c)中产生的第二电流；
(e)除去包含未掺入的dNTP的溶液；
(f)用步骤(c)中未使用的其余三种类型的dNTP重复步骤(c)至(e)；以及
(g)重复步骤(c)至(f)；
其中根据产生的电流信号测序所述DNA。
33.用于测序DNA的方法，所述方法包括：
(a)将包含DNA模板的溶液引入权利要求31所述的系统；
(b)测量当向如本文所述的系统施加偏压时产生的第一电流；
(c)在允许掺入与所述DNA模板互补的dNTP的条件下，将包含至少两种类型的dNTP的溶液引入所述系统，其中所述类型的dNTP以不同的浓度存在于所述溶液中；
(d)测量步骤(c)中产生的第二电流；
(e)除去包含未掺入的dNTP的溶液；
(f)用步骤(c)中未使用的其余类型的dNTP重复步骤(c)至(e)；以及
(g)重复步骤(c)至(f)；
其中根据产生的电流信号测序所述DNA。
34.根据权利要求33所述的方法，其中步骤(c)中的所述溶液包含四种类型的dNTP。
35.根据权利要求33所述的方法，其中步骤(c)中的所述溶液包含至少两种类型的dNTP。
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