KR20210045361A - 효소 활성의 직접 전기적 측정을 위한 장치, 시스템 및 방법 - Google Patents

효소 활성의 직접 전기적 측정을 위한 장치, 시스템 및 방법 Download PDF

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레커그니션 어낼러틱스 엘엘씨
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Abstract

본 개시내용은 분자에 대한 하나 이상의 전극의 직접 부착을 통한 단일 단백질 분자의 기능적 동작을 감지하기 위한 장치, 시스템 및 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 어레이, 어레이를 포함하는 시스템 및 어레이를 사용한 생체중합체의 시퀀싱 방법에 관한 것이다.

Description

효소 활성의 직접 전기적 측정을 위한 장치, 시스템 및 방법
연방 지원 연구 또는 개발
본 발명은 미국 국립 보건원에서 수여하는 HG910080 하에 정부 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에서의 특정 권리를 갖다.
배경
네이티브 단백질의 기능의 기초가 되는 동작의 전기적 판독은 표지 없이 많은 새로운 유형의 분석 측정을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 효소의 기능적 변동의 모니터링은 후보 약물 분자의 스크리닝의 빠르고 간단한 방식을 제공할 것이다. 생체중합체를 프로세싱하는 단백질의 변동의 모니터링은 이들의 조성 및 형태에 대한 정보를 밝힐 것이다.
효소 기능의 전기적 판독은, 탄소 나노튜브 전계 효과 트랜지스터에서 유도된 텔레그래프 잡음이 그의 기질, 펩티도글리칸에서 작용시 효소 리소자임의 기능적 동작을 반영한다는 것을 보여준 최(Choi) 등에 의해 입증되었다 (Choi, Moody et al. 2012). 그에 따라 진행성 효소, 예컨대 DNA 폴리머라제의 변동의 모니터링은 DNA의 시퀀싱 방법을 제공할 수 있는 것으로 인식되었다. 일례가 논란이 되는 논문에 제공되어 있고, 여기서 후앙(Huang) 그룹 (Chen, Lee et al. 2013)은 뉴클레오티드가 연장 사슬에 혼입될 때 폴리머라제에서의 전기적 변동을 측정하는 것을 주장하였고, 여기서 신호는 높은 정확도로 연장되고 있는 템플레이트의 서열을 보고한다. 이어서, 논문은 철회되었지만 (Nature Nanotechnology 8, 452-458 (2013); 2013년 5월 5일 온라인 공개됨; 2013년 7월 11일 및 2013년 8월 28일 인쇄 후 수정됨; 2015년 6월 3일 인쇄 후 철회됨), 이는 단백질의 구조 변동이 전기적 판독에 의해 모니터링될 수 있다면 무엇이 가능할 수 있는지를 보여준다. 보다 중요하게, 이 제안의 작업 실현은, 폴리머라제가 테더링된 탄소 나노튜브 전계 효과 트랜지스터를 사용한 콜린스(Collins) 그룹에 의해 거의 동시에 입증되었다 (Olsen, Choi et al. 2013). 신호는 뉴클레오티드가 혼입될 때 폴리머라제의 개방 및 폐쇄와 관련되는 것으로 나타난 텔레그래프 잡음으로 이루어졌다. 중요하게, 잡음의 특징은 혼입되고 있는 특정 뉴클레오티드를 반영하였고, 이는 DNA 서열의 전기적 단일-분자 판독을 위한 길을 열었다.
문헌 [Olsen, Choi et al. 2013]에서는, 단백질의 변동을 이들이 생성하는 전계 변동을 통해 간접적으로 검출하였고, 여기서 전계 변동은 폴리머라제 또는 리소자임에 근접한 전계 효과 트랜지스터 채널에 의해 감지된다. 도 1은 첸(Chen) 등의 제안을 나타낸다. 용액 중의 뉴클레오티드 트리포스페이트(3)의 존재 하에 프라이밍된 DNA 템플레이트(2)와 결합된 폴리머라제(1)는 항체(4)에 의해 전계 효과 트랜지스터의 소스(6)와 드레인(7) 사이의 갭에 걸쳐진 금 비드(5)에 결합되고, 여기서 그의 채널(8)은 게이트 전극(9) 상에 형성된다. 원래의 보고의 철회를 고려하여, 이 발명이 실제로 작업되었는지는 명확하지 않지만, 이는 콜린스 그룹의 성공적인 발명의 많은 요소를 함유한다. 이는 도 2a에 나타나 있고, 여기서는 전계 효과 트랜지스터의 소스(21) 및 드레인(22)이 트랜지스터의 채널을 형성하는 탄소 나노튜브(23)에 의해 연합된다. 효소 (이 경우 리소자임)(24)는 탄소 나노튜브에 부착된다. 반도체 백-게이트(25)를 사용하여 트랜지스터를 턴온(turn-on)과 턴오프(turn off) 사이의 중간인 그의 가장 민감한 작동점으로 셋팅하고, FET 전류의 변동을 통해 효소 활성을 검출한다. 이후 논문에서, 동일한 그룹은 탄소 나노튜브 채널(23)에 부착되고 프라이밍된 DNA 템플레이트(27)에 의해 결합된 폴리머라제(26)가 잡음 스파이크를 생성하고, 이들 각각이 폴리머라제에 의한 뉴클레오티드의 혼입과 관련되는 방식을 보여주었다 (도 2b). 얻어진 신호열의 두가지 예가 폴리(dA)(28) 및 폴리(dC)(29)에 대해 도 2c에 제공되어 있다. 신호의 명백한 차이는, CNT FET로부터의 잡음 배경(30)이 신호 수준(31)에 비해 현저하지만 시퀀싱이 가능함을 보여준다. 다소 유사한 방법이 메리만(Merriman) 및 몰라(Mola)에 의해 제안되었다 (Merriman and Mola, 2016). 이는 도 2c에 나타나 있다. 폴리머라제(436)는 전계 효과 트랜지스터의 소스(438) 및 드레인(439)에 연결된 분자 와이어(433)에 링커(437)를 통해 화학적으로 연결된다. 게이트 전극(440)이 분자 와이어의 하부에 위치한다. 이들의 특허 출원에 제시된 데이터는 올센(Olsen) 등의 장치에서 얻어진 것들보다 훨씬 더 낮은 신호 수준을 나타내는 것으로 보인다.
명백히, 시험 하에 있는 효소에 대한 보다 직접 전기적 연결을 제공하는 것이 바람직할 것이다. 본 발명자들은 인식 터널링이라 불리는 기술을 개발하였고, 인식 분자를 사용하여 단백질을 가까운 간격을 갖는 전극의 쌍 중 적어도 하나에 결합시켰다 (Zhang, Song et al. 2017). 이 접근은 도 3에 나타나 있다. 장치는 얇은 유전체 층(43)에 의해 분리된 제1 전극(41) 및 제2 전극(42)으로 이루어진다. 인식 분자(44)는, 예를 들어, 티올-금속 결합에 의해, 각각의 전극에 강하게 부착된다. 분자는 표적 단백질(45)에 의해 특이적으로 인식되고 결합되도록 선택된다. 이들 인식 이벤트는 일반적으로 가역적이고, 따라서 관심 단백질을 그의 기능의 연구를 위해 갭 내에서 유지하기에는 적합하지 않다. 따라서, 여기서 본 발명자들은 미지의 단백질의 도착을 검출하기 위해 측정 장치를 사용하기보다는, 측정 장치에 연결된 기지의 단백질을 유지하여야 함에 따라, 본 발명자들의 이전 인식 터널링 기술은 현재의 문제에 적용불가능하고 그와 관련이 없다. 더욱 제한적인 것은, 바이어스 자체가 단백질을 전류의 텔레그래프 잡음 변동 (47)이 생성되는 방식으로 구동시키도록 이들 장치가 충분히 높은 바이어스 (Vt, 46)에서 작동되어야 하는 요건이다. 단백질이 인테그린이고 인식 분자가 RGD 펩티드인 이 공개된 작업의 경우, 비교적 높은 바이어스 (>100 mV)에서 장치를 작동시키고 적용된 바이어스에 의해 유도된 변동을 관찰함으로써 단백질 결합이 검출된다. 단백질 결합의 검출자로서의 전압-유도 변동의 사용은, 이들 전압-유도 변동이 기능적 동작과 관계 없이 충분히 높은 전위차에 노출된 모든 단백질에서 나타나기 때문에, 단백질의 중요한 생분자 기능을 가능하게 하는 단백질의 구조 및 형태에서의 변동을 측정하기 위한 이 장치의 사용을 전적으로 배제한다. 따라서, 이전에 논의된 기술에서, 이들 중요한 기능적 동작으로부터의 신호는 전압-유도 변동과 구별될 수 없다. 따라서, 전압-유도 전도도 변동을 제거하고 단백질을 이것이 핵심적인 측정가능한 기능적 변동을 생성하는 화학적 자극에 노출되는 동안 제자리에서 유지하는 조건에서 한 쌍의 전극을 가로질러 단백질 분자의 결합을 검출하기 위한 시스템 및 방법을 찾고, 다른 화학 물질, 예컨대 후보 약물 또는 생체중합체에 대한 이들 변동의 반응을 측정하는 것이 요망된다.
이 섹션에서 임의의 참조문헌의 인용은 이러한 참조문헌이 본 개시내용의 선행 기술임을 인정하는 것으로 해석되어선 안 된다.
요약
본 개시내용은 단백질 활성의 직접 전기적 측정을 위한 장치, 시스템 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서는, 갭에 의해 분리된 제1 및 제2 전극; 전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 단백질을 포함하며; 여기서 제1 전극 및 제2 전극은 분석될 샘플과 접촉되도록 구성된 것인 장치가 제공된다.
일부 실시양태에서, 단백질은 하나의 전극에 부착된다. 다른 실시양태에서, 단백질은 두 전극에 부착된다.
일부 실시양태에서, 장치는 갭 내에 배치된 절연 유전체 층을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질은 폴리머라제, 뉴클레아제, 프로테아솜, 글리코펩티다제, 글리코시다제, 키나제, 및 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 단백질은 하나의 전극에 부착된다. 다른 실시양태에서, 단백질은 두 전극 모두에 부착된다.
일부 실시양태에서, 단백질은 링커를 통해 전극에 부착된다.
일부 실시양태에서, 장치는 갭에 의해 분리된 제1 및 제2 전극; 전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 단백질을 포함하며; 여기서는 단백질이 화학 물질(chemical entity)과 상호작용할 때 전류 변동이 생성된다.
일부 실시양태에서,
(a) 유전체 기판;
(b) 유전체 기판 상에 배치된 제1 전극;
(c) 제1 전극 상에 배치된 절연 유전체 층;
(d) 절연 유전체 층 상에 배치된 제2 전극;
(e) 제2 전극 상에 배치된 패시베이션(passivation) 층;
(f) 전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 단백질
을 포함하며; 여기서 제1 전극, 절연 유전체 층, 제2 전극 및 패시베이션 층은 이를 통해 형성된 개구를 갖는 것인 장치가 제공된다.
일부 실시양태에서, 장치는 갭에 의해 분리된 제1 및 제2 전극; 전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 단백질을 포함하며; 여기서 제1 전극 및 제2 전극은 이를 통해 형성된 개구를 갖는다.
일부 실시양태에서, 장치는 동일 평면 상에 있고 갭에 의해 분리된 제1 및 제2 전극; 전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 단백질을 포함하며; 여기서 제1 전극 및 제2 전극은 분석될 샘플과 접촉되도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 장치는 갭 내에 배치된 절연 유전체 층을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질은 하나의 전극에 부착된다. 본 실시양태의 일부 측면에서, 단백질은 폴리머라제이다. 본 실시양태의 일부 측면에서, 폴리머라제는 링커를 통해 전극에 부착된다. 일부 측면에서, 폴리머라제는 비오티닐화된 폴리머라제이다. 일부 측면에서, 폴리머라제는 비오티닐화된 폴리머라제이고, 스트렙타비딘을 통해 전극에 부착된다.
장치의 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 전극은 금, 백금, 팔라듐, 및 루테늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 금속을 포함한다. 일부 실시양태에서, 금속은 팔라듐이다.
일부 실시양태에서, 갭은 약 1.0 nm 내지 약 20.0 nm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 갭은 약 1.0 nm 내지 약 10.0 nm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 갭은 약 2.0 nm 내지 약 10.0 nm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 갭은 약 1.0 nm 내지 약 7.5 nm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 갭은 약 1.0 nm 내지 약 5.0 nm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 갭은 약 4.0 nm 내지 약 5.0 nm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 갭은 약 5.0 nm 내지 약 6.0 nm의 폭을 갖는다.
일부 실시양태에서, 장치는 단일 분자를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 장치; 단백질과 상호작용할 수 있는 화학 물질을 도입하기 위한 수단; 가치있는 제1 전극과 제2 전극 사이에 바이어스를 적용하기 위한 수단; 및 화학 물질이 단백질과 상호작용함에 따라 발생하는 변동을 모니터링하기 위한 수단을 포함하는 시스템이 제공된다.
일부 실시양태에서, 바이어스는 1 mV 내지 50 mV이다.
일부 실시양태에서, 바이어스는 1 mV 내지 100 mV이다.
일부 실시양태에서, (a) 본원에 기재된 바와 같은 시스템을 제공하는 단계; (b) 단백질을 화학 물질과 접촉시키는 단계; (c) 전극들 사이에 전류의 자발적 변동이 발생하지 않도록 가치있는 제1 전극과 제2 전극 사이에 바이어스를 적용하는 단계; (d) 화학 물질이 단백질과 상호작용함에 따라 발생하는 변동을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 개시내용의 방법은 단일 단백질 분자의 활성을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 방법은 또한 생체중합체를 시퀀싱하기 위해 사용될 수 있다. 방법은 또한 약물 스크리닝 검정에서 사용될 수 있다. 유리하게, 방법은 표지 또는 특수 화학 물질을 필요로 하지 않는다.
생체중합체의 시퀀싱 방법은 긴 판독을 제공하고 (>10kB), 폴리머라제는 네이티브 폴리머라제의 속도로 진행된다 (100nt/s).
본 개시내용의 장치는 간단한 장치 기하구조를 갖고, 이는 용이한 스케일 업(scale up)을 가능하게 한다.
본 개시내용은 단일 진행성 단백질에 대한 직접 전기적 측정에 의한 생체중합체의 시퀀싱을 위한 어레이, 시스템 및 방법에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 복수의 장치의 배열을 포함하는 생체중합체의 시퀀싱을 위한 어레이를 제공한다. 본 실시양태의 하나의 측면에서, 어레이는 DNA의 시퀀싱을 위한 것이다.
본 개시내용은 단백질 활성의 직접 측정을 위한 시스템을 제공한다. 시스템은 (a) 본원에 기재된 바와 같은 어레이; (b) 임의로 어레이에 용액을 도입하고 제거하기 위한 수단; (c) 제1 전극과 제2 전극 사이에 바이어스를 적용하기 위한 수단; 및 (d) 제1 전극과 제2 전극 사이에서 생성된 전류를 모니터링하기 위한 수단을 포함한다. 본 실시양태의 하나의 측면에서, 시스템은 폴리머라제 활성의 직접 측정을 위한 것이다.
본 개시내용은 또한 생체중합체의 시퀀싱 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 방법은 DNA의 시퀀싱을 위한 것이고, 방법은 (a) 본원에 기재된 바와 같은 시스템에 DNA 템플레이트를 포함하는 용액을 도입하는 단계; (b) 바이어스가 본원에 기재된 바와 같은 시스템에 적용될 때 생성된 제1 전류를 측정하는 단계; (b) DNA 템플레이트에 대해 상보적인 dNTP의 혼입을 가능하게 하는 조건 하에 시스템에 dNTP를 포함하는 용액을 도입하는 단계; (c) 단계 (b)에서 생성된 제2 전류를 측정하는 단계; (d) 혼입되지 않은 dNTP를 포함하는 용액을 제거하는 단계; (e) 단계 (b)에서 사용되지 않은 남아 있는 세가지 유형의 dNTP 각각으로 단계 (b) 내지 (d)를 반복하는 단계; (f) 단계 (b) 내지 (e)를 반복하는 단계를 포함하며; 여기서 DNA가 생성된 전류 신호로부터 시퀀싱된다.
또 다른 실시양태에서, 방법은 (a) 본원에 기재된 바와 같은 시스템에 DNA 템플레이트를 포함하는 용액을 도입하는 단계; (b) 바이어스가 본원에 기재된 바와 같은 시스템에 적용될 때 생성된 제1 전류를 측정하는 단계; (b) DNA 템플레이트에 대해 상보적인 dNTP의 혼입을 가능하게 하는 조건 하에 시스템에 적어도 두가지 유형의 dNTP를 포함하는 용액을 도입하는 단계이며, 여기서 dNTP의 유형은 상이한 농도로 용액 중에 존재하는 것인 단계; (c) 단계 (b)에서 생성된 제2 전류를 측정하는 단계; (d) 혼입되지 않은 dNTP를 포함하는 용액을 제거하는 단계; (e) 단계 (b)에서 사용되지 않은 남아 있는 dNTP의 유형으로 단계 (b) 내지 (d)를 반복하는 단계; (f) 단계 (b) 내지 (e)를 반복하는 단계를 포함하며; 여기서 DNA가 생성된 전류 신호로부터 시퀀싱된다.
도 1은 첸 등에 따른 폴리머라제 변동에 대한 공지된 검출 시스템을 나타낸다.
도 2a는 최 등에 따른 리소자임 변동에 대한 공지된 검출 시스템을 나타낸다. 도 2b는 올센 등에 따른 폴리머라제 변동에 대한 공지된 검출 시스템을 나타낸다. 도 2c는 올센 등에 따른 뉴클레오티드 서열 의존적 데이터를 나타낸다. 도 2d는 메리만 및 몰라에 따른 폴리머라제 변동에 대한 공지된 검출 시스템을 나타낸다.
도 3은 단백질 검출을 위한 공지된 장치를 나타낸다.
도 4는 본 개시내용의 실시양태의 개략도를 나타낸다.
도 5a는 도 4에 나타낸 바와 같은 2개 지점에서 단백질이 결합될 때 얻어진 선형 전류 전압 특징을 나타낸다. 도 5b는 다수의 단일 분자 측정에 대한 선형 영역의 기울기의 분포를 나타낸다.
도 6은 단백질 변동을 나타내는 신호를 나타낸다.
도 7은 단백질이 폴리머라제인 본 개시내용의 실시양태의 개략도를 나타낸다.
도 8a는 폴리머라제 활성을 측정하기 위해 사용되는 형광 활성 검정의 원리를 나타낸다. 폴리머라제 활성이 존재하지 않는다면 FAM (F) 형광이 켄칭된다. 도 8b는 야생형, 엑소뉴클레아제-무함유 (D12A, E14A) 또는 스트렙타비딘에 부착된 엑소뉴클레아제-무함유 효소와의 60분 인큐베이션 후 기질 상에서의 FAM의 형광 강도를 나타낸다.
도 9는 (좌측) 티올화된 스트렙타비딘 및 (우측) 비오티닐화된 phi29 폴리머라제의 부착 후의 것에 대해 측정된 전도도의 분포를 나타낸다. 스트렙타비딘 측정은 2.5 nm의 갭에서 수행되었고, 스트렙타비딘 플러스 phi29 측정은 3.5 nm의 갭에서 수행되었다.
도 10은 형태에 따른 전도도 변화를 나타낸다. 좌측 패널은 티오-스트렙타비딘에 대한 것이고, 우측 패널은 비오틴이 첨가된 후 분자의 동일한 필름으로부터 얻은 데이터이다. 전도도 변화는 이것이 비오틴 결합에 의해 유도된 형태 변화에 민감함을 보여준다.
도 11은 (좌측) STM 갭 및 (우측) 고체-상태 칩에서의 단백질 변동의 고 대비, 고 시간-분해능 기록을 나타낸다. 샘플은 전극 상의 DNP를 갖는 항-DNP IgE이다. 장치는 4.6 nm의 갭으로 200 mV로 작동된다.
도 12는, 템플레이트 DNA 및 dNTP의 부재 하에 단지 접촉 변동 (a,b,c) 및 템플레이트 DNA 및 dNTP가 첨가된 경우에 나타나는 추가의 텔레그래프 잡음 (d,e,f)을 보여주는 phi29-스트렙타비딘 복합체에 대한 일정한 갭 (각각의 패널에서 좌측 하부에 표시됨) 및 50 mV 바이어스에서 수집된 전류를 나타낸다. 우측의 삽입도는 20 내지 40s 지속기간에 걸친 전체 진행을 나타낸다. 적색 원은 좌측 트레이스에서 확대된 고전류 지점을 나타낸다.
도 13은, 데이터를 약 2.5 nm의 갭에서 얻은 전극에 티올 결합에 의해 커플링된 스트렙타비딘에 대한 데이터를 제외하고, 약 4.5 nm의 갭으로 Pd 전극 상의 펩티드 리간드에 결합된 3종의 항체 및 인테그린 (표 1에 기재됨)에 대하여 측정된 전도도의 분포 (log 스케일)를 나타낸다. 분포는 명확성을 위해 수직으로 임의로 변위되어 있다. 삽입도는, 전극에 부착된 펩티드에 대하여 2개의 결합 부위를 갖는 항체가 어떻게 갭을 브릿징하여 전도도의 제2의 보다 높은 피크 ("2"로 라벨링됨)를 형성할 수 있는지를 보여준다. 단일 연결이 또한 나타날 수 있다 ("1"). 이들 데이터는, 단백질과 전극 사이에, 각각의 전극에 대하여 하나씩, 2개의 화학적 연결이 이루어지면, 장거리 (항체의 결합 부위 사이의 13 nm)에 걸쳐 어떻게 높은 전도도 (약 2 nS)가 얻어질 수 있는지를 보여준다.
도 14는 표시된 바와 같은 상이한 갭 크기에서 얻어진 (좌측) 스트렙타비딘 및 우측의 스트렙타비딘-폴리머라제 복합체에 대한 전도도 분포의 갭 거리-의존성을 나타낸다. 전도도 분포는 갭 크기에 따라 거의 변하지 않으며, 이는 이들 단백질에서의 전도성이 비편재화 수송 메커니즘에 의한 것임을 보여준다. 삽입도는 단백질 높이의 추정을 나타내며, 스트렙타비딘은 약 4 nm의 높이를 갖고, 스트렙타비딘에 결합된 phi29의 복합체는 약 9 nm의 높이를 갖는다. 신호는 5.5 nm만큼 큰 갭으로부터 얻어졌고, 이는, 이들 데이터 세트에서 프로브가 거의 확실히 폴리머라제 내부와 접촉되지만, 전도성 경로가 부분적으로 phi29를 통한 것이어야 함을 보여준다.
도 15는 전극 상의 2개의 스트렙타비딘 분자에 대한 5 nm만큼 분리된 폴리머라제 상의 2개의 비오티닐화 부위를 통한 폴리머라제의 부착을 나타낸다. 스트렙타비딘 분자는 티올 모이어티를 통해 전극에 커플링된다.
도 16은, 각각의 폴리머라제가 개별적으로 어드레싱된 전극의 쌍으로 배선된, DNA 템플레이트와 결합된 폴리머라제 분자의 어레이를 나타낸다.
도 17은 각각의 부위에서 각각의 템플레이트 분자의 서열을 결정하기 위한 뉴클레오티드 트리포스페이트에 대한 노출 및 세정의 순서를 나타낸다.
도 18은 동일한 염기를 함유하는 부위에서의 2개의 동일한 뉴클레오티드의 순차적 혼입의 2개의 텔레그래프 잡음 버스트(burst) 특징을 나타낸다.
상세한 설명
본 개시내용은 적어도 하기의 것들을 포함한다:
(1.) 실질적으로 나타낸 및 기재된 바와 같은 장치.
(2.) 나타낸 및 기재된 바와 같은 단백질 활성의 직접 전기적 측정을 위한 시스템.
(3.) 나타낸 및 기재된 바와 같은 단백질 활성의 검출 방법.
(4.) 나타낸 및 기재된 바와 같은 생체중합체의 시퀀싱 방법.
(5.) 갭에 의해 분리된 제1 및 제2 전극; 및 전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 단백질을 포함하며; 여기서 제1 전극 및 제2 전극은 이를 통해 형성된 개구를 갖는 것인, 단백질 활성의 직접 측정을 위한 장치.
(6.) 갭이 약 1.0 nm 내지 약 20.0 nm의 폭을 갖는 것인, 상기 (5.)의 장치.
(7.) (a) 유전체 기판;
(b) 유전체 기판 상에 배치된 제1 전극;
(c) 제1 전극 상에 배치된 절연 유전체 층;
(d) 절연 유전체 층 상에 배치된 제2 전극;
(e) 제2 전극 상에 배치된 패시베이션 층;
(f) 전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 단백질
을 포함하며; 여기서 제1 전극, 절연 유전체 층, 제2 전극 및 패시베이션 층은 이를 통해 형성된 개구를 갖는 것인, 단백질 활성의 직접 측정을 위한 장치.
(8.) (a) 동일 평면 상에 있고 갭에 의해 분리된 제1 및 제2 전극;
(b) 적어도 하나의 전극에 부착된 단백질
을 포함하며; 여기서 제1 전극 및 제2 전극은 분석될 샘플과 접촉되도록 구성된 것인, 단백질 활성의 직접 측정을 위한 장치.
(9.) 단백질이 폴리머라제, 뉴클레아제, 프로테아솜, 글리코펩티다제, 글리코시다제, 키나제 및 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 상기 (5.) 내지 (8.) 중 어느 하나의 장치.
(10.) 단백질이 폴리머라제인, 상기 (9.)의 장치.
(11.) 폴리머라제가 하나의 전극에 부착된 것인, 상기 (10.)의 장치.
(12.) 폴리머라제가 링커를 통해 전극에 부착된 것인, 상기 (10.) 또는 (11.)의 장치.
(13.) 단백질이 비오티닐화된 폴리머라제인, 상기 (10.) 내지 (12.) 중 어느 하나의 장치.
(14.) 비오티닐화된 폴리머라제가 티오-스트렙타비딘 링커를 통해 전극에 부착된 것인, 상기 (13.)의 장치.
(15.) 제1 및/또는 제2 전극이 금, 백금, 팔라듐, 및 루테늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 금속을 포함하는 것인, 상기 (5.) 내지 (14.) 중 어느 하나의 장치.
(16.) 제1 및/또는 제2 전극이 팔라듐을 포함하는 것인, 상기 (15.)의 장치.
(17.) (a) 유전체 기판;
(b) 유전체 기판 상에 배치된 제1 전극;
(c) 유전체 기판 상에 배치된 제2 전극;
(d) 전극의 상단에 배치된 패시베이션 층; 및
(e) 전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 단백질
을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 전극은 1 내지 10 nm의 갭에 의해 분리되어 있고,
패시베이션 층은 샘플이 제1 전극과 제2 전극 사이의 갭으로 통과할 수 있도록 배치된 이를 통해 형성된 개구를 갖는 것인, 단백질 활성의 직접 측정을 위한 장치.
(18.) (a) 상기 (5.) 내지 (17.) 중 어느 하나의 장치;
(b) 단백질과 상호작용할 수 있는 화학 물질을 도입하기 위한 수단;
(c) 제1 전극과 제2 전극 사이에 바이어스를 적용하기 위한 수단; 및
(d) 화학 물질이 단백질과 상호작용함에 따라 발생하는 변동을 모니터링하기 위한 수단
을 포함하는, 단백질 활성의 직접 전기적 측정을 위한 시스템.
(19.) 단백질이 폴리머라제인, 상기 (18.)의 시스템.
(20.) 단백질이 엑소뉴클레아제, 프로테아솜, 또는 글리칸인, 상기 (18.)의 시스템.
(21.) 단백질이 키나제인, 상기 (18.)의 시스템.
(22.) (a) 상기 (18.)의 시스템에 단백질 분자와 상호작용할 수 있는 화학 물질을 도입하는 단계;
(b) 정상(steady) DC 전류가 관찰되도록 선택된 2개의 전극 사이에 바이어스를 적용하는 단계; 및
(c) 화학 물질이 단백질과 상호작용할 때 나타나는 2개의 전극 사이의 전류 변동을 관찰하는 단계
를 포함하는, 단일 단백질 분자의 활성의 검출 방법.
(23.) 단백질이 폴리머라제, 뉴클레아제, 프로테아솜, 글리코펩티다제, 글리코시다제, 키나제 및 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 상기 (22.)의 방법.
(24.) 화학 물질이 뉴클레오티드 트리포스페이트, 핵산, 펩티드, 글리칸 및 키나제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 상기 (22.) 또는 (23.)의 방법.
(25.) (a) 상기 (18.)의 시스템에 프라이밍된 DNA 템플레이트를 도입하는 단계;
(b) 4종의 dNTP를 포함하는 용액을 도입하는 단계;
(c) 정상 DC 전류가 관찰되도록 선택된 2개의 전극 사이에 바이어스를 적용하는 단계;
(d) 프라이머에 각각의 새로운 뉴클레오티드가 혼입될 때 나타나는 2개의 전극 사이의 전류 변동을 검출하는 단계; 및
(e) 혼입되는 뉴클레오티드 각각의 정체를 결정하는 단계
를 포함하는, DNA의 시퀀싱 방법.
(26.) 용액이 서로에 대하여 대략 동일한 농도로 4종의 dNTP를 포함하는 것인, 상기 (25.)의 방법.
(27.) dNTP의 농도가 템플레이트-결합된 폴리머라제의 포화 농도와 대략 동일하거나 그보다 높은 것인, 상기 (25.) 또는 (26.)의 방법.
(28.) 단계 (d)가 하나 이상의 전류 스파이크(들)의 존재를 검출하는 것을 포함하는 것인, 상기 (25.) 내지 (27.) 중 어느 하나의 방법.
(29.) 단계 (e)가 각각의 스파이크의 특징을 사용하는 것을 포함하는 것인, 상기 (25.) 내지 (27.) 중 어느 하나의 방법.
(30.) (a) 상기 (18.)의 시스템에 생체중합체를 도입하는 단계;
(b) 정상 DC 전류가 관찰되도록 선택된 2개의 전극 사이에 바이어스를 적용하는 단계;
(c) 생체중합체의 말단으로부터 단량체가 제거될 때 나타나는 2개의 전극 사이의 전류 변동을 검출하는 단계; 및
(d) 생체중합체로부터 제거된 각각의 단량체의 정체를 결정하는 단계
를 포함하는, 생체중합체의 시퀀싱 방법.
(31.) 생체중합체가 DNA, 펩티드, 또는 글리칸인, 상기 (30.)의 방법.
(32.) (a) 상기 (20.)의 시스템에 후보 키나제 억제제 분자를 도입하는 단계;
(b) 정상 DC 전류가 관찰되도록 선택된 2개의 전극 사이에 바이어스를 적용하는 단계;
(c) 키나제가 후보 키나제 억제제 분자와 상호작용할 때 나타나는 2개의 전극 사이의 전류 변동을 검출하는 단계; 및
(d) 키나제가 후보 키나제 억제제 분자의 존재 하에 활성을 갖는지의 여부를 결정하는 단계
를 포함하는, 키나제의 활성의 검출 방법.
(33.) 본원에 기재된 바와 같은 생체중합체의 시퀀싱을 위한 어레이.
(34.) 본원에 기재된 바와 같은 DNA의 시퀀싱을 위한 어레이.
(35.) 복수의 장치의 배열을 포함하며, 여기서 각각의 장치는
(a) 유전체 기판;
(b) 유전체 기판 상에 배치된 제1 전극;
(c) 제1 전극 상에 배치된 절연 유전체 층;
(d) 절연 유전체 층 상에 배치된 제2 전극;
(e) 제2 전극 상에 배치된 패시베이션 층; 및
(f) 제1 및 제2 전극에 부착된 폴리머라제 분자
를 포함하며, 여기서 제1 전극, 절연 유전체 층, 제2 전극 및 패시베이션 층은 이를 통해 형성된 개구를 갖는 것인, DNA의 시퀀싱을 위한 어레이.
(36.) 복수의 장치의 배열을 포함하며, 여기서 장치는
(a) 유전체 기판;
(b) 유전체 기판 상에 배치된 제1 전극;
(c) 유전체 기판 상에 배치된 제2 전극;
(d) 전극의 상단에 배치된 패시베이션 층; 및
(e) 전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 폴리머라제 분자
를 포함하며; 여기서 패시베이션 층은 이를 통해 형성된 개구를 갖는 것인, DNA의 시퀀싱을 위한 어레이.
(37.) 복수의 장치의 배열을 포함하며, 여기서 장치는
(a) 갭에 의해 분리되고 제2 전극과 함께 하나의 평면 내에 놓인 제1 및 제2 전극;
(b) 적어도 하나의 전극에 부착된 폴리머라제
를 포함하며; 여기서 제1 전극 및 제2 전극은 분석될 샘플과 접촉되도록 구성된 것인, DNA의 시퀀싱을 위한 어레이.
(38.) 배열이 그리드인, 상기 (33.) 내지 (37.) 중 어느 하나의 어레이.
(39.) (a) 본원에 기재된 바와 같은 어레이;
(b) 임의로 어레이에 용액을 도입하고 제거하기 위한 수단;
(c) 제1 전극과 제2 전극 사이에 바이어스를 적용하기 위한 수단; 및
(d) 제1 전극과 제2 전극 사이에서 생성된 전류를 모니터링하기 위한 수단
을 포함하는, 폴리머라제 활성의 직접 측정을 위한 시스템.
(40.) (a) 본원에 기재된 바와 같은 시스템에 DNA 템플레이트를 포함하는 용액을 도입하는 단계;
(b) 바이어스가 본원에 기재된 바와 같은 시스템에 적용될 때 생성된 제1 전류를 측정하는 단계;
(c) DNA 템플레이트에 대해 상보적인 dNTP의 혼입을 가능하게 하는 조건 하에 시스템에 dNTP를 포함하는 용액을 도입하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 생성된 제2 전류를 측정하는 단계;
(e) 혼입되지 않은 dNTP를 포함하는 용액을 제거하는 단계;
(f) 단계 (c)에서 사용되지 않은 남아 있는 세가지 유형의 dNTP 각각으로 단계 (c) 내지 (e)를 반복하는 단계; 및
(g) 단계 (c) 내지 (f)를 반복하는 단계
를 포함하며; 여기서 DNA가 생성된 전류 신호로부터 시퀀싱되는 것인, DNA의 시퀀싱 방법.
(41.) (a) 본원에 기재된 바와 같은 시스템에 DNA 템플레이트를 포함하는 용액을 도입하는 단계;
(b) 바이어스가 본원에 기재된 바와 같은 시스템에 적용될 때 생성된 제1 전류를 측정하는 단계;
(c) DNA 템플레이트에 대해 상보적인 dNTP의 혼입을 가능하게 하는 조건 하에 시스템에 적어도 두가지 유형의 dNTP를 포함하는 용액을 도입하는 단계이며, 여기서 dNTP의 유형은 상이한 농도로 용액 중에 존재하는 것인 단계;
(d) 단계 (b)에서 생성된 제2 전류를 측정하는 단계;
(e) 혼입되지 않은 dNTP를 포함하는 용액을 제거하는 단계;
(f) 단계 (c)에서 사용되지 않은 남아 있는 dNTP의 유형으로 단계 (c) 내지 (e)를 반복하는 단계; 및
(g) 단계 (c) 내지 (f)를 반복하는 단계
를 포함하며; 여기서 DNA가 생성된 전류 신호로부터 시퀀싱되는 것인, DNA의 시퀀싱 방법.
(42.) 단계 (c)에서의 용액이 네가지 유형의 dNTP를 포함하는 것인, 상기 (41.)의 방법.
(43.) 단계 (c)에서의 용액이 적어도 두가지 유형의 dNTP를 포함하는 것인, 상기 (41.)의 방법.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것들과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사한 또는 동등한 방법 및 물질이 본 개시내용의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 물질, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이며, 제한되도록 의도되지 않는다. 본원에서 언급된 모든 공개 문헌, 특허 및 다른 문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 용어 "포함하다" 또는 "포함함" 또는 "포함하는" 등의 변형어는 언급된 정수 또는 정수들의 그룹의 포함을 의미하며, 임의의 다른 정수 또는 정수들의 그룹의 배제를 의미하지는 않는 것으로 이해될 것이다.
용어 "하나"는 하나 초과의 항목을 의미할 수 있다.
용어 "및" 및 "또는"은 접속적 또는 비접속적인 것을 지칭할 수 있으며, "및/또는"을 의미한다.
용어 "약"은 언급된 값의 플러스 또는 마이너스 10% 이내를 의미한다. 예를 들어, "약 100"은 90 내지 110의 임의의 수를 지칭할 것이다.
용어 "뉴클레오티드"는 염기-당-포스페이트 조합을 지칭하고, 리보뉴클레오시드 트리포스페이트 ATP, UTP, CTG, GTP 및 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트, 예컨대 dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP, 또는 이들의 유도체를 포함한다.
단백질 활성의 직접 측정을 위한 장치 및 시스템
본 개시내용은 단백질 활성의 직접 측정을 위한 장치를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 장치는 갭에 의해 분리된 제1 및 제2 전극; 및 전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 단백질을 포함하며; 여기서 제1 전극 및 제2 전극은 이를 통해 형성된 개구를 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 장치는 갭에 의해 분리된 제1 및 제2 전극; 및 전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 장치는
(a) 유전체 기판;
(b) 유전체 기판 상에 배치된 제1 전극;
(c) 제1 전극 상에 배치된 절연 유전체 층;
(d) 절연 유전체 층 상에 배치된 제2 전극;
(e) 제2 전극 상에 배치된 패시베이션 층;
(f) 전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 단백질
을 포함하며; 여기서 제1 전극, 절연 유전체 층, 제2 전극 및 패시베이션 층은 이를 통해 형성된 개구를 갖는다.
일부 실시양태에서, 장치는
(a) 유전체 기판;
(b) 유전체 기판 상에 배치된 제1 전극;
(c) 절연 유전체 층 상에 배치된 제2 전극;
(d) 전극의 상단에 배치된 패시베이션 층; 및
(e) 전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 단백질
을 포함하며; 여기서 패시베이션 층은 이를 통해 형성된 개구를 갖는다.
일부 실시양태에서, 장치는
(a) 동일 평면 상에 있고 갭에 의해 분리되고 제2 전극과 함께 하나의 평면 내에 놓인 제1 및 제2 전극;
(b) 적어도 하나의 전극에 부착된 단백질
을 포함하며; 여기서 제1 전극 및 제2 전극은 분석될 샘플과 접촉되도록 구성된다.
전극이 평면형인 실시양태에서, 장치는 유리하게는 유전체 층을 필요로 하지 않는다. 유전체 층을 필요로 하는 장치는 결점을 가질 수 있다. 유전체 층은 전극에 접착되도록 접착 층을 필요로 한다. 이들 접착 층은 공기로의 노출시 산화될 수 있고, 이는 사실상 전극 사이의 갭의 크기를 증가시킨다. 이러한 영향을 보상하기 위해, 유전체 층은 보다 얇게 형성될 수 있다. 그러나, 얇은 유전체 층은 핀홀에 민감하고, 이는 제거하기가 어려울 수 있다.
본원에 기재된 장치 실시양태 각각에서, 단백질은 폴리머라제, 뉴클레아제, 프로테아솜, 글리코펩티다제, 글리코시다제, 키나제 및 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
단백질은 직접적으로 또는 간접적으로 하나의 전극에 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 링커를 통해 전극에 부착된다. 일부 실시양태에서, 단백질은 전극에 부착된 리간드와의 상호작용을 통해 간접적으로 전극에 부착된다. 일부 실시양태에서, 단백질은 리간드-결합 부위를 혼입하도록 변형될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 장치는 갭에 의해 분리된 제1 및 제2 전극; 전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 폴리머라제를 포함하며; 여기서 제1 전극 및 제2 전극은 이를 통해 형성된 개구를 갖는다.
일부 실시양태에서, 폴리머라제는 하나의 전극에 부착된다. 본 실시양태의 일부 측면에서, 폴리머라제는 링커를 통해 전극에 부착된다. 일부 측면에서, 폴리머라제는 비오티닐화된 폴리머라제이다. 일부 측면에서, 폴리머라제는 비오티닐화된 폴리머라제이고 스트렙타비딘을 통해 전극에 부착된다.
본원에 기재된 장치 실시양태 각각에서, 제1 및/또는 제2 전극은 금, 백금, 팔라듐, 및 루테늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 금속을 갖는다. 일부 실시양태에서, 금속은 팔라듐이다.
일부 실시양태에서, 갭은 약 1.0 nm 내지 약 20.0 nm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 갭은 약 1.0 nm 내지 약 10.0 nm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 갭은 약 1.0 nm 내지 약 7.5 nm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 갭은 약 1.0 nm 내지 약 5.0 nm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 갭은 약 4.0 nm 내지 약 5.0 nm의 폭을 갖는다.
일부 실시양태에서, 장치는 단일 분자를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용은 또한, 단백질 활성의 직접 측정을 위한 시스템을 제공한다. 시스템은 본원에 기재된 바와 같은 장치; 단백질과 상호작용할 수 있는 화학 물질을 도입하기 위한 수단; 제1 전극과 제2 전극 사이에 바이어스를 적용하기 위한 수단; 및 화학 물질이 단백질과 상호작용함에 따라 제1 전극과 제2 전극 사이에서 생성된 전류를 모니터링하기 위한 수단을 포함한다.
본원에 기재된 시스템 실시양태 각각에서, 단백질은 폴리머라제, 뉴클레아제, 프로테아솜, 글리코펩티다제, 글리코시다제, 키나제 및 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 실시양태에서, 단백질은 폴리머라제이다.
단백질이 폴리머라제인 경우, 폴리머라제는 하나의 전극, 또는 바람직하게는 두 전극 모두에 부착된다. 본 실시양태의 일부 측면에서, 폴리머라제는 하나 이상의 링커를 통해 전극에 부착된다. 일부 측면에서, 폴리머라제는 비오티닐화된 폴리머라제이다. 일부 측면에서, 폴리머라제는 비오티닐화된 폴리머라제이고 스트렙타비딘을 통해 전극에 부착된다.
본원에 기재된 시스템 실시양태 각각에서, 제1 및/또는 제2 전극은 금, 백금, 팔라듐, 및 루테늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 금속을 포함한다. 일부 실시양태에서, 금속은 팔라듐이다.
일부 실시양태에서, 갭은 약 1.0 nm 내지 약 20.0 nm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 갭은 약 1.0 nm 내지 약 10.0 nm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 갭은 약 1.0 nm 내지 약 7.5 nm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 갭은 약 1.0 nm 내지 약 5.0 nm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 갭은 약 4.0 nm 내지 약 5.0 nm의 폭을 갖는다.
도 4는 본 개시내용의 실시양태에 따른 시스템의 개략도를 나타낸다. 단백질 분자(51)는 특정 부위(53 및 54)에서 공유 변형된다. 이러한 부위는, 단백질의 비오티닐화 및 전극에 부착된 티올화된 스트렙타비딘 분자를 통한 부착에 의해, 또는 니트릴로트리아세트산에 결합하기 위한 단백질의 N 또는 C 말단에서의 히스티딘 태그의 삽입 또는 NHS 에스테르에 의해 변형된 리신 잔기, 말레이미드와의 반응에 의해 변형된 표면 시스테인 잔기일 수 있다. 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이 Myc 태그 또는 GST 태그 등의 다른 부착 수단이 사용될 수 있다. 본 실시양태의 중요한 독특한 디자인 측면은, 단백질 자체가 검출자로서 활용되고, 이를 위해 전극에 단백질을 부착시키기 위해 강하고 영구적인 화학적 테더가 사용된다는 점이다. 변형된 부위는 가요성 링커에 커플링되고, 이는 짧은 (1 내지 10개 반복) 알칸 올리고머 또는 폴리에틸렌 글리콜 올리고머 또는 단백질 내로 재조합 혼입된 짧은 펩티드 사슬일 수 있다. 이들은 또한 금속 전극 (57 및 58)에 링커 분자를 테더링하는 반응성 기(56)에 의해 종결된다. 다양한 연결기가 가능하지만, 티올 연결기가 바람직하고, 비오틴-스트렙타비딘 연결기와 같이, 아민이 사용될 수도 있다. 두 전극 사이에 바이어스(59)가 적용되고, 전극 사이를 통과하는 전류가 모니터링된다(60). 시스템을 효소 기능을 위해 필요한 이온을 함유하는 완충액 중에 담그고, 화학 물질(61) (예컨대 효소에 대한 기질, 및/또는 약물) 도입의 영향을 기록한다.
본 개시내용의 기초는, 단백질이 상기에 기재된 바와 같이 두 전극에 강하게 테더링될 때 큰 (대략 4.5 nm) 갭에서의 단백질의 거동에 대한 놀랍도록 예상외의 매우 최근의 관찰에 있다. 본 발명자들은, 텔레그래프 잡음 신호의 개시에 대해 이전에 보고된 임계 바이어스 전압 미만에서, 단순 선형 (옴(Ohmic)) 응답이 나타남을 발견한다. 단백질은 전자 수송 방식이 단지 터널링이어야 하는 분자 고체인 것으로 믿어지기 때문에, 이는 완전히 예상외의 것이다. 그러나, 터널링은, 단백질이 도 4에 기재된 방식으로 테더링될 때 관찰되는 선형 전류-전압으로 큰 전류를 설명할 수 없다. 단일 단백질 분자에서 측정된 전형적인 전류-전압 곡선의 일례가 도 5에 나타나 있다. 큰 잡음 변동이 이전에 보고된 바와 같이 약 ±100 mV 초과에서 관찰되지만, ±100 mV 미만에서는 (도 5a에서 (71)로 라벨링된 박스 영역), 이러한 큰 (4.5 nm) 거리에서도 단백질에 대한 현저히 높은 DC 전도도를 의미하는 선형 영역이 존재한다. 이 선형 영역을 핏팅하고 핏팅된 전도도의 분포를 얻으면, 전도도 분포는 도 5b에 나타낸 바와 같이 지수 분포에 의해 핏팅될 수 있다 (실선이 핏팅임). 이 경우 평균 전도도, K는 1.5 nS의 값을 가짐을 주목한다.
측정의 보다 많은 수집은 도 13에 나타낸 바와 같이 보다 복잡한 전도도의 분포를 드러낸다. 이 도면은 다양한 수단에 의해 전극에 커플링된 일련의 단백질에 대한 주어진 전도도의 빈도수 대 전도도의 히스토그램을 플롯팅한 것이다. 전도도 스케일은 로그 스케일 (베이스 10)이고, 선으로 나타낸 바와 같이 핏팅되는 피크는 가우스(Gaussian)이고, 따라서 이들 전도도는 로그-정규 분포에 따라 분포된다. (분포는 명확성을 위해 수직으로 임의로 변위되었다.) 단백질은 특정 단백질에 대한 특이적 리간드에 결합함으로써, 또는 스트렙타비딘의 경우에는 티올 연결기를 통해 전극에 테더링된다. 리간드는 티올 (시스테인) 연결기를 통해 전극에 화학적으로 부착되었다. 다양한 단백질, 이들의 리간드, 단백질-리간드 복합체에 대한 해리 상수, 특이적 결합을 확인하기 위해 사용되는 대조군 및 분포의 핏팅에 의해 얻어진 전도도의 피크 값이 표 1에 기재되어 있다.
Figure pct00001
표 1: 전도도 연구에 사용되는 단백질
전극이 기재된 대조군 분자에 노출되었을 때 전도도는 나타나지 않았고, 이는 전자 전도도가 나타나기 위해서는 전극에 대한 단백질의 특이적 화학적 테더링이 요구됨을 보여준다.
3종의 항체의 경우, 13 nm만큼 분리된, 2개의 결합 도메인 각각에서 하나씩, 2개의 결합 부위가 이용가능하다. 그 결과, 이들 3개 분자에 대한 분포에서 제2의 보다 높은 전도도 피크가 관찰된다. 이는 표 1에서 이들 분자에 대하여 기재된 제2 피크 전도도를 제공한다. 그 결과, 단백질이 두 전극 모두에 화학적으로 테더링되면 장거리 (13 nm)에 걸쳐 높은 전도도가 얻어질 수 있다.
약 100 mV의 전압-구동 변동의 개시를 위한 이러한 역치가 지금까지 연구된 많은 단백질에 대해 확인되었다. 따라서, 자발적 변동의 개시를 위한 이러한 역치 미만으로 접합을 작동시킴으로써 (즉, 도 4에서 V<VC, 여기서 VC는 약 100 mV임), DC 전류는 단백질이 그의 정지 상태에 트랩핑되어 있음을 나타내도록 제공된다. 이 신호는 다소 크고 (위에 주어진 예에서 50 mV 바이어스에서 평균적으로 75 pA임), 단백질이 화학적으로 테더링되어 전극 갭을 브릿징하면 상당히 더 많다.
단백질 변동은 전자 수송을 위한 추가의 채널을 개방한다. 따라서, 단백질이 VC 미만으로 바이어싱되지만 기질 분자 도입에 의해 자극되는 경우, 큰 전류 변동이 발생할 수 있다. 단백질 변동에 의해 유도되는 전류 신호의 일례가 도 6에 나타나 있다. 도 2c에 나타낸 것에 비해 크게 향상된 신호(82) 대 잡음(81)을 주목한다. 유도된 단백질 변동의 추가의 예가 도 12에 제공되어 있다. 이는, STM 프로브에 의해 수집된 데이터가 전극 표면 상에 결합된 비오티닐화된 N-말단 결합 티올화된 스트렙타비딘 분자를 통해 팔라듐 전극에 커플링된 phi29 폴리머라제의 단층 상에서 일정한 3.5 또는 4.5 nm 높이에서 유지됨을 보여준다. 패널 a, b 및 c는 폴리머라제와의 접촉점에서의 변동의 결과로서 나타나는 전류 변동을 나타낸다. 시간에 따라 (우측의 삽입도) 이는 큰 전류 변화를 초래할 수 있지만, 바이어스가 VC 미만이면 ms-시간스케일 텔레그래프 잡음이 관찰되지 않는다. 좌측 상의 확대된 전류-시간 트레이스는 피크 전류 영역으로부터 얻어진다 (우측의 장시간 스케일 플롯 삽입도에 적색 원으로 표시됨). 프라이밍시, 단일-가닥 DNA 템플레이트 및 dNTP가 첨가되고, ms-시간스케일 텔레그래프 잡음이 유도된다 (패널 d, e 및 f에 나타냄).
도 12에 나타낸 신호는 폴리머라제에 대한 단일 화학 부착점에서 얻어졌다. 결과적으로, 제2 전극에 대한 연결은, 도 12a, 12b 및 12c에서 전류 변동에 의해 나타난 바와 같이, 매우 가변적이다. 단일 화학적 접촉의 또 다른 중요한 결점은 단백질과 제2 전극 사이의 물리적 접촉의 낮은 성능이다. 이는 도 14에 나타나 있다. 이는, 표시된 갭 값으로 전극 갭이 1 nm 증분으로 증가함에 따라 스트렙타비딘 단층 상에서 (좌측), 또한 비오티닐화된 phi29 폴리머라제 결합 후 동일한 단층 상에서 (우측) 측정된 전도도 분포를 나타낸다 (분포 곡선은 명확성을 위해 수직으로 변위됨). 스트렙타비딘의 경우, 3.5 nm의 갭 거리에서 매우 적은 곡선이 기록되어 있다. phi29가 스트렙타비딘에 결합된 경우, 곡선은 4.5 nm까지 기록되어 있다 (5.5 nm에서의 몇몇 기록 - 나타내지 않음). 그러나, 이는 약 9 nm의 폴리머라제-스트렙타비딘 복합체의 전체 높이 (삽입도에 나타냄)보다 상당히 작다. 이는, 2개의 결합 도메인을 분리하는 13 nm 경로 상에서 높은 전도도가 얻어진 도 13에 나타낸 항체 데이터와 뚜렷한 대조를 이룬다. 이는, 2개의 화학적으로 잘 정의된 접촉을, 쌍을 이룬 각각의 전극에 하나씩 형성하는 것이 바람직함을 입증한다.
본 개시내용의 장치의 제조 방법
본 개시내용의 장치는, 귀금속, 예컨대 Au, Pt 또는 Pd의 층을 규소, 유리 또는 사파이어 웨이퍼 (또는 다른 유전체 기판) 상에 침착시키고, 이어서 접착을 위한 반응성 금속 (예컨대 크롬 또는 티타늄)의 얇은 (전형적으로 1 nm) 층, 이어서 귀금속의 1 내지 10, 또는 1 내지 20 또는 1 내지 50 nm의 층을 침착시킴으로써 용이하게 제작될 수 있다. 이어서 이 저부 전극을 절연 유전체 층, 바람직하게는 알루미나로 덮지만, 다른 산화물, 예컨대 SiO2 또는 산화하프늄이 사용될 수 있다. 층은 2 내지 10 nm의 두께를 가질 것이다. 저부 귀금속 전극을 1 내지 1.5 nm의 알루미늄으로 코팅하고, 이를 공기 중에서 산화시켜, Al2O3의 2 내지 3 nm 두께의 층을 생성함으로써, 2 nm 층을 침착시킬 수 있다. 보다 큰 두께의 유전체가 필요한 경우, 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이 물/트리메틸알루미늄 사이클로의 원자 층 침착에 의해 추가의 Al2O3이 첨가될 수 있다.
이어서, 제2 귀금속 전극을 다시 얇은 접착 층 (크롬 또는 티타늄)을 사용하여 침착시키되, 이 접착 층이 산화되는 장치의 연부에 존재하는 갭을 현저히 변경시키지 않도록 최대 1 nm의 층을 사용한다.
마지막으로, 패시베이션 층을 상단 전극의 상단에 배치한다. 이는 알루미나, SiO2, 산화하프늄 또는 레지스트 물질, 예컨대 PMMA 또는 SU8일 수 있다.
이어서, 노출된 전극 영역이 단지 하나의 폴리머라제가 부착되는 영역이 되도록 보장하기에 충분히 작은 공동을 형성하기 위해, 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같은 반응성 이온 에칭 (RIE)을 사용하여 작은 개구를 형성한다. 이 개구는 10 내지 500 nm의 직경을 가질 수 있으며, 약 50 nm가 바람직하다. 개구의 깊이는 이것이 패시베이션 층, 상단 전극, 전극을 분리하는 유전체 층을 통해, 또한 저부 전극 내로 절단되도록 충분히 커야 한다.
노출된 전극 영역의 양을 제한하기 위한 두번째 방식은 전극 중 하나 (상단 또는 저부, 상단이 바람직함)를 50 내지 100 nm의 폭을 갖는 얇은 와이어로 만드는 것이다. 이에 따라, 노출된 전극이 전극의 작은 폭에 의해 제한될 것이기 때문에, RIE 개구가 훨씬 더 클 수 있다 (예를 들어, 종래의 리소그래피를 가능하게 하는 마이크로미터 크기).
세번째 방식은 접합이 폴리머라제 분자에 노출되는 시간의 양 및/또는 폴리머라제의 농도를 제어함으로써 관능화 화학을 제어하는 것이다. 각각의 접합의 로딩은, 적용된 바이어스가 100 mV 초과일 때 접촉 변동에 의해 유도된 텔레그래프 잡음을 모니터링함으로써 시험할 수 있다. 2개의 신호 수준의 존재는 단지 단일 분자가 트랩핑되어 있음을 나타낸다. 3개 수준의 존재는 2개의 분자가 트랩핑되어 있음을 나타내는 등이다. 이러한 방식으로 농도 및 노출 시간은, 부위의 약 30%가 단독으로 점유되는 이상적 프아종(Poisson) 로딩으로 조정될 수 있다.
산소 플라즈마로의 세정 후, 개구 내의 전극의 노출 영역을 단백질로 관능화할 수 있다. 이는, 직접적으로, 단백질의 표면 상의 네이티브 티올을 사용하여, 또는 단백질에 술프히드릴 기를 부착시키는 화학적 변형을 통해, 또는 간접적으로, 티올화된 스트렙타비딘을 부착시키고 이어서 비오티닐화된 단백질을 포획함으로써 수행될 수 있다.
장치를 제조하는 제2 접근은, 2개의 전극을 이들 사이의 작은 갭을 가지며 동일한 평면 내에서 형성하는 것이다. 이는 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이 e-빔 리소그래피 및 리프트-오프 또는 반응성 이온 에칭 (RIE)을 사용하여 단일 와이어를 가로질러 트렌치를 개방함으로써 수행될 수 있다. 다른 접근은 헬륨 이온 밀링, 또는 갭이 자연적으로 형성되도록 하는 단계 연부 상의 금속의 각진 침착을 사용하는 것이다. 이어서, 전극 쌍을 패시베이션 층으로 덮고, 전극 갭이 노출되도록 RIE에 의해 개구를 형성한다. 이어서, 전극을 상기에 기재된 바와 같이 관능화할 수 있다.
본원에 기재된 장치는 일반적으로 단지 하나의 분자에 대한 연결에 의존하기 때문에, 노출된 전극의 폭이 중요하다. 서열 정보를 추출하는 경우, 단일 분자 신호의 이러한 요건이 특히 중요하다. 전극이 단일 분자 (5 내지 15 nm)에 비해 훨씬 더 폭이 넓지 않은 경우, 갭을 가로지르는 다수의 분자의 부착이 가능하지 않다. 그러나, 이러한 작은 전극의 신뢰성 있는 관능화 및 제작은 매우 어렵다. 실제로, 본 발명자들은, 100 nm 이하의 폭의 전극은 하나 초과의 단백질 분자를 포획할 가능성이 낮음을 확인하였다. 특히, 요망되는 (브릿징) 구성으로의 결합 가능성이 작은 경우, 심지어 200, 300, 400, 500 또는 심지어 1000 nm 폭의 훨씬 더 넓은 전극을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 전극의 쌍을 브릿징하기보다는 단지 하나의 전극에 결합된 단백질 분자는 비교적 소량의 전류에 기여할 것이다.
전극에 대한 폴리머라제의 부착 방법
단백질이 폴리머라제인 경우, 이는 높은 진행성을 갖는 폴리머라제, 예컨대 phi29 폴리머라제여야 하고, 그의 엑소뉴클레아제 기능은 하기에 기재된 바와 같이 불능화되어야 한다.
야생형 (WT) 폴리머라제는 (a) 그의 엑소뉴클레아제 활성을 제거하고 (b) 요망되는 경우 화학적 부착점을 첨가하기 위해 변형을 필요로 한다. 이러한 변형은 변형된 폴리머라제를 생성하는 이. 콜라이(E. Coli) 발현 시스템을 사용한 재조합 DNA에 의해 달성된다.
phi29의 엑소뉴클레아제 활성은 하기 산성 아미노산을 필요로 한다: D12, E14, D66 및 D169. 이들 중 어느 하나의 돌연변이는 엑소뉴클레아제 활성을 제거할 것이고, 본 발명자들은 D12 및 E14를 알라닌으로 돌연변이시켰다.
본 발명자들이 사용한 클론은 N-말단에 his-태그 및 avi태그 (비오티닐화에 대한 것) 둘 다를 갖는다 (즉, His-Avi태그-Phi29). 그 결과, 하기 서열이 효소의 N-말단에 첨가되었다:
Figure pct00002
6개의 히스티딘 잔기는 his 태그 (요망되는 효소 생성물의 정제에 사용됨)이고, GLNDIFEAQKIEWHE는 Avi태그이다. 비오틴은 비오틴 리가제 BirA (아비디티(Avidity), 미국 미시간주 랜싱)에 의해 avi태그 내의 K에 부착된다. 활성 검정은, 스트렙타비딘에 부착된 비오티닐화된 효소가 여전히 활성임을 보여준다 (도 8b).
본 개시내용의 또 다른 유용한 예상외의 특징은, 스트렙타비딘 및 폴리머라제 둘 다 전도성 단백질이고, 따라서, 본 발명자들이 하기에서 나타내는 바와 같이, 폴리머라제가 전극에 간접적으로 부착될 수 있다는 점이다. 먼저, 티올로 변형된 스트렙타비딘이 전극에 부착되고, 이어서 비오티닐화된 폴리머라제가 도입된다. 이는 스트렙타비딘에 결합하여, 전극에 대한 전도성 경로를 제공한다.
폴리머라제는 또한 동일한 제조합 방법에 의해 C-말단에서 변형될 수 있다. avi태그에 추가로, 다른 펩티드 기재의 결합 태그, 예컨대 GST 태그, Myc 태그 및 His 태그가 사용될 수 있다. 이들 태그는 모두 폴리머라제의 N- 또는 C-말단에 혼입될 수 있다. C 말단에서의 혼입은 태그 부위를 프라이밍된 템플레이트가 포획되는 부위에 가깝게 배치하고, 따라서 올리고알라닌 또는 글리신-글리신-세린 스페이서 서열을 C 말단과 태그 사이에 혼입하여 폴리머라제의 템플레이트 포획 활성의 방해를 감소시킬 수 있다.
본 개시내용의 방법을 사용하여 활성이 모니터링되어야 하는 다른 단백질 (예컨대 키나제, 프로테아제 또는 글리칸을 프로세싱하는 분자)을 부착시키기 위해 동일한 기술이 사용될 수도 있다.
N- 또는 C-말단에서의 변형에 추가로, phi29에는 7개의 시스테인이 존재한다. 디술피드 결합된 것은 없으며, 따라서 모두 디술피드 결합을 형성하여, 전극에 대한 부착을 위한 추가의 부위를 제공할 가능성을 갖는다. 템플레이트 및 프라이머를 갖는 phi29의 구조에 기초하여, C448, C106 및 C22가 가장 표면 노출되어 있고 말레이미드를 통한 비오티닐화 또는 술프히드릴 기에 결합하는 중금속에 대한 직접 부착에 대한 우수한 후보로 보인다. 문제는 특이성을 제어하는 방식이다. 본 발명자들은 한번에 하나를 제외한 모든 시스테인의 돌연변이를 시도하였지만, 결과는 불용성 단백질이다. 그러나, 용해도에 영향을 주지 않으면서 최대 4개를 제거하여, C448, C106 및 C22를 부착점에 대한 표적으로서 남길 수 있다.
본 개시내용은 하나의 전극에 대한 단지 하나의 화학적 부착 부위로 작업하는 것이며, 제2 접촉이 단백질과 금속 사이의 물리적 접촉에 의해 이루어지지만, 두 전극 사이의 갭에 걸쳐지는 방식으로 2개의 화학적으로 잘 한정된 접촉을 이루는 것이 바람직하다. C 말단은 ~ 5 nm의 거리만큼 N 말단으로부터 분리되고, avi태그를 통한 비오티닐화가 사용되는 경우, 동일한 폴리머라제의 N- 및 C-말단 둘 다에 의한 동일한 스트렙타비딘 분자에 대한 부착은 불가능하다. 따라서, 티오-스트렙타비딘으로 관능화된 두 전극으로, N 말단이 하나의 전극에 연결되고 C 말단이 제2 전극에 연결되는 브릿징 구조가 형성될 기회가 존재한다.
또 다른 접근은 폭넓은 간격을 갖는, 그러나 단백질의 비활성 영역에 있는 2개의 부착점을 사용하는 것이다. 엑소뉴클레아제 도메인이 D12 및 E14의 돌연변이에 의해 불능화된 phi29 폴리머라제의 경우, > 5 nm만큼의 간격을 갖는 엑소뉴클레아제 도메인 내의 2개 지점이 G111과 K112, 또한 E279와 D280 사이에서 나타난다. 따라서, 이들 2개 지점에 삽입된 Avi태그 서열 GLNDIFEAQKIEWHE, 또한 BirA에 의해 비오티닐화된 Avi태그 리신으로, 폴리머라제가 도 15에 나타낸 바와 같이 한 쌍의 전극을 가로질러 결합될 수 있다. 이는 G111과 K112 사이, 또한 E279와 D280 사이의 Avi태그 위치 (1502 및 1503)를 사용하여 비오티닐화된 phi29 폴리머라제(1501)를 나타낸다. 이들 비오틴은 황 연결기(1506 및 1507)를 통해 전극(1508 및 1509)에 부착된 티올화된 스트렙타비딘 분자(1504 및 1505)에 결합한다. 이들 부착점 사이의 갭 (도 15에서 양방향 화살표)은 5 nm를 약간 넘기 때문에, 이 부착 기하구조는 5 nm 약간 미만의 갭(1510)을 필요로 한다.
폴리머라제에 '전도성 위스커'를 첨가함으로써 폴리머라제와 전극 사이의 결정적 접촉을 형성함.
N 말단에서 재조합 첨가됨:
Figure pct00003
말단 C는 제1 전극에 대한 부착을 위한 시스테인이다.
his 태그는 단백질 추출 및 정제를 위한 것이다.
SS에 이어지는 61-아미노산 서열은, 금속성 와이어로서 작용하는, 지오박터 술퍼리덕탄스(geobacter sulferreductans)로부터의 필루스(pilus) 단백질의 서열이다.
C 말단에서 재조합 첨가됨:
Figure pct00004
AA에 이어지는 61-아미노산 서열은 지오박터 술퍼리덕탄스로부터의 필루스 단백질의 서열이다.
말단 C는 제1 전극에 대한 부착을 위한 시스테인이다.
복합체의 전도성
본 개시내용의 핵심은, 폴리머라제를 통해 우수한 전자 전도도가 얻어질 수 있다는 점이다. 도 9는 (좌측 패널) 티올 결합을 통해 기판에 연결된 스트렙타비딘을 통한 전도도의 분포를 나타낸다. 이들 데이터는 2.5 nm의 전극 갭으로 얻어졌다. 갭이 3.5 nm로 증가하면, 매우 적은 판독이 나타난다. 갭이 4.5 nm로 더욱 증가하면, 판독이 전혀 얻어지지 않는다. 이는 표면 상에 평평하게 놓인 스트렙타비딘 분자가 약 4 nm의 높이를 갖는다는 사실과 일치한다. 도 9의 우측은 Pd 전극 상의 스트렙타비딘과 비오티닐화된 phi29 폴리머라제의 복합체에 대한 데이터를 나타낸다. 이들 데이터는 3.5 nm의 갭 크기에서 얻어졌다. 유사한 데이터가 복합체에 대하여 4.5 nm의 갭 크기 (스트렙타비딘에서 전도도가 기록되지 않았던 갭)에서 기록되었다. 이들 거리는 스트렙타비딘 단독이 강력한 신호를 제공하였던 갭보다 크기 때문에, 이들은 전도성이 스트렙타비딘과 직렬로 배선된 폴리머라제를 통해 나타나고 있음을 보여준다. 전도도의 분포가 스트렙타비딘 단독과 비교하여 복합체에서 어떻게 변경되는지를 주목한다.
형태에 따른 전도성 변화
도 10은 스트렙타비딘 단독 (좌측 패널) 및 비오틴에 대한 노출 후 스트렙타비딘에 대한 전도도의 측정 분포를 나타낸다. 스트렙타비딘이 비오틴에 결합한 후의 측정된 전도도 변화의 분포는 단백질의 전도도가 단백질 형태 변화에 민감함을 보여준다.
단백질 형태의 동적 모니터링
도 11은 4.5 nm의 갭을 사용한 (좌측 패널) 스캐닝 터널링 현미경으로, 또한 (우측 패널) 고체-상태 칩으로 기록된 전압-유도 형태 변동의 기록을 나타낸다. 바이어스는 VC 초과 100 mV, 200 mV였다. 단백질은 전극에 부착된 항-디니트로페놀 분자 결합 디니트로페놀 (DNP)이다. 밀리초 시간스케일에서 매우 큰 전도도 변화가 탁월한 신호 대 잡음 비율로 용이하게 기록된다. 도 12d, 12e 및 12f는, 바이어스가 VC 미만으로 (이 경우 50 mV로) 감소하고 단백질이 기질 첨가에 의해 활성화될 때 나타나는 전류 변동을 나타낸다. 텔레그래프 잡음이 매우 높은 신호-대-잡음 비율로 ms 시간스케일에서 생성된다.
장치 및 시스템의 사용 방법
본 개시내용은 생체중합체의 시퀀싱 방법을 제공한다. 본 발명자들은 도 7에서 폴리머라제에 의해 연장되고 있는 핵산 사슬의 특정 경우에 대해 이를 보여준다. 여기서, 폴리머라제(96)는 2개 지점(53, 52)에서 변형된다. 구체적 예는 phi29 폴리머라제에서 이용가능한 2개의 표면-노출 시스테인일 것이다. 또 다른 예는 도 15에 나타낸 비오틴 관능화이다. 말레이미드 변형된 알칸 또는 PEG 링커 (54, 55)를 사용하여 (예를 들어) 강한 티올 결합(56)을 통해 전극(57, 58)에 폴리머라제를 부착시킨다. 전극 갭에서의 폴리머라제의 결합은 V<VC(59)일 때 정상 DC 전류(60)에 의해 확인된다. 폴리머라제(96)가 프라이밍된 템플레이트(91)와 복합체화되고 4종의 뉴클레오티드 트리포스페이트(92 93 94 95) 각각을 포함하는 용액에 노출되면, 특징적 전류 변동이 주어진 뉴클레오티드의 혼입 신호를 줄 것이다. 대안적 실시양태에서는, 표면 시스테인을 사용하여 직접적으로 부착 중 하나를 형성할 수 있다.
사용시, 장치가 준비되면, 이를 세정하고 이어서 시퀀싱될 프라이밍된 템플레이트 DNA에 노출시켜야 한다. 이 DNA는 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이 헤어핀 프라이머를 라이게이션시킴으로써 시퀀싱될 샘플로부터 제조된다. 4종의 dNTP 및 Mg2+를 포함하는 완충액을 장치에 도입하여야 한다. dNTP는 대략 동일한 농도로 완충액 중에 존재한다. 하나의 실시양태에서는, dNTP의 농도가 템플레이트-결합된 폴리머라제의 포화 농도와 대략 동일하고, 제2 실시양태에서는 템플레이트-결합된 폴리머라제의 포화 농도이고, 제3 실시양태에서는 포화 농도 초과이다. dNTP의 농도가 포화 농도이거나 그 초과인 경우, 폴리머라제가 빠르게 진행된다 (즉, 초 당 100개의 뉴클레오티드 혼입).
dNTP를 포함하는 완충액이 장치에 도입되면, 중합 반응이 개시될 것이고, 포획된 템플레이트가 프라이머로 카피되어, 일련의 전류 스파이크를 생성할 것이다. 각각의 스파이크 (스파이크의 클러스터)는 각각의 새로운 뉴클레오티드가 프라이머에 혼입됨에 따라 발생하고, 각각의 스파이크의 특징 (지속기간, 진폭, 형상)이 혼입되는 뉴클레오티드의 정체를 해독하는 데 사용된다. 뉴클레오티드의 포화 농도 (>30 μM)에서 전형적인 시퀀싱 속도는 초 당 약 100개의 뉴클레오티드이다. 이전 템플레이트의 완료 거의 직후에 혼입된 새로운 템플레이트에서 템플레이트의 포화 농도는 약 10 nM이다. 각각의 분자는 용액 중에서 이용가능한 템플레이트가 존재하는 한 템플레이트를 계속해서 전환시킬 것이다. 따라서, 장치가 작동되는 한 하나의 분자가 연속적으로 시퀀싱할 수 있다.
장치 기하구조는 각각의 접합에 대하여 유체 구획을 분리할 필요 없이 극히 간단하고, 그에 따라 하나의 접합은 단지 약 1 마이크로미터2를 차지할 것이다. 상호연결, 격리, 및 온-칩 프로세싱 전자장치를 허용하며, 단일 판독 장치가 100 마이크로미터 × 100 마이크로미터의 영역 내로 용이하게 핏팅될 수 있고, 따라서, 1 cm2의 활성 칩 영역은 10,000개의 장치를 수용할 것이다. 1시간 동안 작동되는 칩 상의 10,000개의 접합을 갖는 칩은 전체 인간 게놈 (10000 x 3600 x 100=3.6x109)을 시퀀싱할 것이다. 보다 조밀한 장치 기하구조 또는 보다 큰 칩은 심지어 상당한 비율의 비활성 장치를 수용할 것이며, 1시간 이하의 시간 내에 하나의 소형 장치 상에서 게놈-스케일 시퀀싱을 또한 가능하게 할 것이다.
상기 예는 핵산 중합체의 시퀀싱을 나타내지만, 이는 중합체를 프로세싱하는 다른 효소가 사용될 수 있도록 적용될 수도 있다. 예를 들어, 엑소뉴클레아제에서의 전류 변동은 그들이 분해하고 있는 핵산의 조성을 반영할 것이다. 이는 펩티드를 소화하는 프로테아솜의 경우도 동일하다. 일례는 프로테아솜 20S CP이고, 이와 같은 프로테아솜은, 이들을 도 4의 시스템으로 혼입하고 펩티드 분자가 공급되고 VC 미만으로 바이어싱될 때 생성되는 전기적 신호를 모니터링함으로써 단일 분자 펩티드 시퀀싱에 사용될 수 있다.
글리칸 소화를 위한 글리코시다제라 불리는 유사한 효소가 존재한다. 도 4의 장치로의 글리코시다제의 혼입은 글리칸의 전자 시퀀싱을 가능하게 할 것이다. 글리칸 결합의 변화는 서열의 직접적 선형 판독을 불가능하게 할 수 있지만, 시간에 따른 절단 이벤트의 조직화는 글리칸의 식별을 가능하게 할 수 있다.
또한 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 키나제 활성의 검출 방법을 제공한다. 본 실시양태에서는, 키나제를 도 4의 장치에 혼입하고, 그의 기질에 노출시키고, VC 미만으로 바이어싱될 때 큰 전류 변동의 생성에 의해 키나제 활성 신호를 얻는다. 이어서, 시스템을 후보 키나제 억제제 약물에 노출시키고, 변동을 모니터링함에 따라, 약물이 키나제의 활성을 "죽이는지"를 확인할 수 있다. 현 기술에서는, 형광 표지 방법의 사용이 단백질 효소가 그의 기질과 상호작용하는 것을 방해할 수 있고, 본 개시내용은 단백질의 표지 요건을 제거한다.
이들 방법 모두에서, (FET 구조와 달리) 간단한 접합의 사용은 제조를 크게 간소화시키고 또한 장치의 큰 병렬 어레이로의 스케일 업을 가능하게 한다. 본 개시내용의 장치는, 하기에 기재되는 바와 같이, 접합 장치의 스케일러블(scalable) 제작 방법을 사용하여 대량 병렬 제작으로 제조될 수 있다.
DNA 또는 다른 중합체의 시퀀싱을 위한 어레이 및 시스템
본 개시내용은, 뉴클레아제, 프로테아솜, 글리코펩티다제, 글리코시다제, 키나제 및 엔도뉴클레아제와 같은 분자 템플레이트와 진행성으로 상호작용하는 임의의 효소를 사용한 생체중합체의 시퀀싱을 위한 어레이를 제공한다. 하기 실시양태는 폴리머라제를 사용한 DNA의 시퀀싱을 위한 어레이를 나타낸다. 임의의 진행성 효소가 어레이에서 폴리머라제를 대체할 수 있음을 이해하여야 한다.
어레이는 복수의 장치의 배열을 포함한다. 본 개시내용의 어레이에 사용되는 장치는 하기의 것들을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 장치는 갭에 의해 분리된 제1 및 제2 전극; 및 전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 폴리머라제를 포함하며; 여기서 제1 전극 및 제2 전극은 이를 통해 형성된 개구를 갖는다.
또 다른 실시양태에서 장치는 갭에 의해 분리된 제1 및 제2 전극; 및 제1 및 제2 전극 둘 다에 부착된 폴리머라제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 장치는
(a) 유전체 기판;
(b) 유전체 기판 상에 배치된 제1 전극;
(c) 제1 전극 상에 배치된 절연 유전체 층;
(d) 절연 유전체 층 상에 배치된 제2 전극;
(e) 제2 전극 상에 배치된 패시베이션 층;
(f) 제1 및 제2 전극에 부착된 폴리머라제 분자
를 포함하며; 여기서 제1 전극, 절연 유전체 층, 제2 전극 및 패시베이션 층은 이를 통해 형성된 개구를 갖는다.
일부 실시양태에서, 장치는
(a) 유전체 기판;
(b) 유전체 기판 상에 배치된 제1 전극;
(c) 유전체 기판 상에 배치된 제2 전극;
(d) 전극의 상단에 배치된 패시베이션 층; 및
(e) 전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 폴리머라제 분자
를 포함하며; 여기서 패시베이션 층은 이를 통해 형성된 개구를 갖는다.
일부 실시양태에서, 장치는
(a) 동일 평면 상에 있고 갭에 의해 분리된 제1 및 제2 전극;
(b) 적어도 하나의 전극에 부착된 단백질
을 포함하며; 여기서 제1 전극 및 제2 전극은 분석될 샘플과 접촉되도록 구성된다.
본원에 기재된 장치 실시양태 각각에서, 제1 및/또는 제2 전극은 금, 백금, 팔라듐, 및 루테늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 금속을 포함한다. 일부 실시양태에서, 금속은 팔라듐이다.
일부 실시양태에서, 갭은 약 1.0 nm 내지 약 20.0 nm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 갭은 약 1.0 nm 내지 약 10.0 nm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 갭은 약 1.0 nm 내지 약 7.5 nm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 갭은 약 1.0 nm 내지 약 5.0 nm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 갭은 약 4.0 nm 내지 약 5.0 nm의 폭을 갖는다.
장치의 어레이는 임의의 적합한 방식으로, 예를 들어 그리드로 배열될 수 있다.
일부 실시양태에서, 어레이는 템플레이트 DNA와 결합된 폴리머라제 분자를 포함한다. 이러한 템플레이트는, 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, 폴리머라제에 의한 결합을 위한 닉(nick)을 함유하는 프라이머 서열과 게놈 DNA 단편 (예를 들어 음파처리에 의해 생성됨)을 라이게이션시킴으로써 형성될 수 있다. 결과는 필요한 경우 전체 게놈에 걸쳐진 템플레이트의 라이브러리이다. 이어서, 각각의 템플레이트가 어레이에서 하나의 폴리머라제에 결합할 것이다.
이제 도 16을 참조하면, 접촉의 그리드(101, 102)를 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이 유전체에 의해 분리된 접촉 금속의 2개 층으로부터 형성하고, 이어서 패시베이션 층에 의해 덮는다. 이어서, 패시베이션을 선택적으로 제거함으로써 각각의 교차점을 노출시키고, 폴리머라제 분자(103)를 각각의 접합에서 결합시킨다. 이들 생분자 접합은 이전 섹션에서 논의된 방법에 의해 제조될 수 있다. 전극을 충분히 좁게 (약 1 마이크로미터의 폭) 형성함으로써, 통상적으로 단지 하나의 (또는 0개의) 폴리머라제가 결합할 것이다. 2개 또는 추가의 몇개가 결합하는 경우, 신호가 하나의 분자에 대해서는 2개, 2개 분자에 대해서는 3개 등의 전류 수준으로 이루어지기 때문에, 이들이 여전히 디콘볼루션될 수 있다.
본 개시내용은 또한 폴리머라제 활성의 직접 측정을 위한 어레이의 시스템을 제공한다. 시스템은 본원에 기재된 바와 같은 어레이; 임의로 어레이에 용액을 도입하고 제거하기 위한 수단; 제1 전극과 제2 전극 사이에 바이어스를 적용하기 위한 수단; 및 제1 전극과 제2 전극 사이에서 생성된 전류를 모니터링하기 위한 수단을 포함한다.
다시 도 16을 참조하면, 작은 바이어스 (전형적으로 50 mV)를 적용하고 각각의 접합으로부터 전류를 판독하고 그에 따라 이것이 컴퓨터 저장 시스템에 의해 기록될 수 있도록 하기 위한 수단(106)이 제공된다.
어레이의 시스템을 사용한 DNA 시퀀싱 방법
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 바와 같은 어레이의 시스템을 사용한 DNA 시퀀싱 방법을 제공한다.
시퀀싱은, 어레이에 마그네슘과 함께 하나의 뉴클레오티드 모노포스페이트 (예를 들어, dATP, dGTP, dCTP, dTTP 중 하나)를 포함하는 용액을 도입함으로써 진행된다. 상보적 뉴클레오티드와 결합된 각각의 폴리머라제가 신호를 생성할 것이고, 이는 각각의 폴리머라제가 결합된 고유의 전극 쌍에 의해 판독된다. 예를 들어, 첨가된 뉴클레오티드가 dCTP인 경우, G 염기에 결합된 모든 템플레이트가 C를 연장 사슬로 혼입하여 신호를 생성할 것이지만, 다른 서열은 뚜렷하게 상이한 신호를 생성할 것이다. 예를 들어, 비-매칭 염기와 함께 존재하는 폴리머라제는 미스-매칭된 염기가 포획됨에 따라 짧은 신호 버스트를 생성할 것이지만, 미스매치가 거부되고 중합 및 전좌의 과정이 중단됨에 따라 신호열이 조기에 종결될 것이다. 반면, 매칭 염기의 혼입은 혼입 및 전좌의 과정이 완료됨에 따라 훨씬 더 긴 펄스의 열을 생성한다. 제2 단계로서, 어레이를 세정하여 과량의 뉴클레오티드를 제거하고, 다음 뉴클레오티드를 포함하는 용액을 도입한다 (예를 들어 dATP, 그에 따라 이제 T를 갖는 모든 부위가 신호를 생성함). 모든 4종의 dNTP가 장치를 통해 사이클링될 때까지 사이클이 계속되고, 그 후 사이클이 반복된다. 이 사이클링은 모든 템플레이트 DNA가 소진될 때까지 반복될 수 있고, 그에 따라 단편의 전체 라이브러리에 대한 서열 데이터를 생성한다.
도 17은 DNA의 시퀀싱 방법을 나타낸다. 어레이(201)에 dATP 첨가시, 나타낸 분자는 A가 연장 사슬로 혼입됨에 따라 신호(204)를 생성할 것이다. 이어서, 어레이를 세정하여 dATP(202)를 제거하고, 다음 뉴클레오티드 (여기서는 dTTP로 나타냄)를 첨가한다(203). 나타낸 바와 같이 사이클을 계속한다. dATP, 이어서 dCTP, 또한 이어서 dATP의 첨가는 모두 염기 혼입 신호(204)를 제공하지만, 다른 뉴클레오티드의 존재는 그렇지 않다(205). 따라서, 그 특정 위치에서의 서열이 TGT로서 기록될 것이다.
이 접근은 dNTP의 사이클링을 사용하는 현재의 시퀀싱 전략에 비해 두가지 주요 이점을 갖는다는 것이 인식될 것이다. 하나는, 폴리머라제의 염기-혼입 속도보다 빠른 시간-스케일로 단일 분자 판독을 활용함으로써, 이제 동일한 염기의 반복을 카운팅하는 것이 간단해진다. 따라서 서열 AAAAA는 dTTP의 존재 하에 5개의 뚜렷한 신호 버스트를 제공할 것인 등이다. 두번째는, 공지된 광학 판독 체계와 대조적으로, 판독되는 템플레이트의 길이가 마운팅 기판으로부터의 거리에 의해 제한되지 않고, 따라서 가능한 판독 길이가 폴리머라제의 진행성 (phi29의 경우 10kB)만큼 높다.
도 18은 개개의 순차적 혼입을 판독하고, 그에 따라 서열의 단독중합체 진행을 판독하는 능력을 나타낸다. 전류 대 시간 기록(300)은 2개의 순차적 염기의 혼입을 나타낸다 (여기서는, dTTP가 2개의 순차적 A 부위에서 혼입되는 것에 대한 전기적 데이터가 나타나 있음). 각각의 신호는, 버스트 사이의 갭에 의해 분리된, 약 20 ms, 또한 마이크로몰 농도의 뉴클레오티드 트리포스페이트에서 평균적으로 약 10 내지 20 ms의 지속기간의 텔레그래프 잡음의 버스트(301)로 이루어진다. 따라서, 도 17에 나타낸 화학적 사이클링의 임의의 주어진 단계에서, 단지 하나의 뉴클레오티드 트리포스페이트가 존재하는 경우, 텔레그래프 잡음의 이러한 버스트의 수를 기록함으로써 템플레이트 가닥 내의 그의 상보물의 반복 염기의 수가 간단히 카운팅될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 용액은 상이한 농도로 존재하는 하나 초과의 dNTP를 포함한다. 예를 들어, 용액은 1 mM dATP, 100 μM dGTP 10 μM dCTP 및 0.1 μM dTTP를 포함한다. 본 실시양태에서, 어레이 내의 폴리머라제는 각각의 템플레이트가 연장됨에 따라 연속적으로 신호를 생성할 것이다. T가 템플레이트 DNA 내에 존재하는 지점에서는, 혼입 신호가 텔레그래프 잡음의 이전 버스트를 빠르게 (일반적으로 10 ms 내에) 뒤따를 것이다. 다음 염기가 C인 템플레이트 DNA는, dGTP의 보다 낮은 농도에 기인하는 그의 보다 느린 도착으로 인해, 텔레그래프 잡음의 보다 지연된 버스트를 나타낼 것이다. 유사하게, G를 함유하는 템플레이트는 dCTP의 훨씬 더 낮은 농도로 인해 보다 긴 지연이 선행될 것이다. dTTP의 농도가 최저이기 때문에 가장 긴 지연은 A 염기에 선행될 것이다.
또한 또 다른 실시양태에서는, 2 사이클의 세정 사용, 제1 사이클에서 동일하지 않은 농도의 한 쌍의 뉴클레오티드의 사용, 및 이어서 제2 사이클에서 또한 동일하지 않은 농도의 다른 둘의 사용으로 두가지 접근이 조합될 수 있다.
상기 섹션은 폴리머라제를 포함하는 어레이의 시스템을 사용한 DNA의 시퀀싱 방법을 기재하지만, 어레이의 시스템은 또한 다른 중합체의 시퀀싱을 위해 용이하게 변형될 수 있다.
본 발명을 상기 예시적 실시양태에서 설명하고 예시하였지만, 본 개시내용은 단지 예로서 제공된 것이며, 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본 발명의 실행의 세부사항에서의 수많은 변화가 이루어질 수 있음을 이해한다. 개시된 실시양태의 특징은 다양한 방식으로 조합되고 재배열될 수 있다. 본원에서 언급된 모든 공개 문헌, 특허 및 다른 문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
참조문헌
하기 참조문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다:
Figure pct00005
Figure pct00006
SEQUENCE LISTING <110> LINDSAY, Stuart ZHANG, Peiming <120> DEVICE, SYSTEM AND METHOD FOR DIRECT ELECTRICAL MEASUREMENT OF ENZYME ACTIVITY <130> 1801240.121-WO1 <140> PCT/US2019/032707 <141> 2019-05-16 <150> 62/812,312 <151> 2019-03-01 <150> 62/682,991 <151> 2018-06-10 <150> 62/673,080 <151> 2018-05-17 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Cys His Asn Thr Pro Val Tyr Lys Leu Asp Ile Ser Glu Ala Thr Gln 1 5 10 15 Val <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Cys Ala Leu Asp Arg Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp 20 25 30 His Glu Gly Ala Ser Ser 35 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10 15 <210> 5 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 5 Cys Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Phe Thr Leu Ile 1 5 10 15 Glu Leu Leu Ile Val Val Ala Ile Ile Gly Ile Leu Ala Ala Ile Ala 20 25 30 Ile Pro Gln Phe Ser Ala Tyr Arg Val Lys Ala Tyr Asn Ser Ala Ala 35 40 45 Ser Ser Asp Arg Leu Asn Leu Lys Thr Ala Leu Glu Ser Ala Phe Ala 50 55 60 Asp Asp Gln Thr Tyr Pro Pro Glu Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser 65 70 75 80 Gly Ala Ser Ser <210> 6 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 6 Ala Ala Phe Thr Leu Ile Glu Leu Leu Ile Val Val Ala Ile Ile Gly 1 5 10 15 Ile Leu Ala Ala Ile Ala Ile Pro Gln Phe Ser Ala Tyr Arg Val Lys 20 25 30 Ala Tyr Asn Ser Ala Ala Ser Ser Asp Arg Leu Asn Leu Lys Thr Ala 35 40 45 Leu Glu Ser Ala Phe Ala Asp Asp Gln Thr Tyr Pro Pro Glu Ser Cys 50 55 60

Claims (35)

  1. 동일 평면 상에 있고 갭에 의해 분리된 제1 및 제2 전극; 및
    전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 단백질
    을 포함하며; 여기서 제1 전극 및 제2 전극은 분석될 샘플과 접촉되도록 구성된 것인, 단백질 활성의 직접 측정을 위한 장치.
  2. 제1항에 있어서, 갭이 약 1.0 nm 내지 약 20.0 nm의 폭을 갖는 것인 장치.
  3. (a) 유전체 기판;
    (b) 유전체 기판 상에 배치된 제1 전극;
    (c) 제1 전극 상에 배치된 절연 유전체 층;
    (d) 절연 유전체 층 상에 배치된 제2 전극;
    (e) 제2 전극 상에 배치된 패시베이션 층;
    (f) 전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 단백질
    을 포함하며; 여기서 제1 전극, 절연 유전체 층, 제2 전극 및 패시베이션 층은 이를 통해 형성된 개구를 갖는 것인, 단백질 활성의 직접 측정을 위한 장치.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 단백질이 폴리머라제, 뉴클레아제, 프로테아솜, 글리코펩티다제, 글리코시다제, 키나제 및 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 장치.
  5. 제4항에 있어서, 단백질이 폴리머라제인 장치.
  6. 제5항에 있어서, 폴리머라제가 하나의 전극에 부착된 것인 장치.
  7. 제5항에 있어서, 폴리머라제가 링커를 통해 전극에 부착된 것인 장치.
  8. 제5항에 있어서, 단백질이 비오티닐화된 폴리머라제인 장치.
  9. 제8항에 있어서, 비오티닐화된 폴리머라제가 티오-스트렙타비딘 링커를 통해 전극에 부착된 것인 장치.
  10. 제1항에 있어서, 제1 및/또는 제2 전극이 금, 백금, 팔라듐, 및 루테늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 금속을 포함하는 것인 장치.
  11. 제10항에 있어서, 제1 및/또는 제2 전극이 팔라듐을 포함하는 것인 장치.
  12. (a) 유전체 기판;
    (b) 유전체 기판 상에 배치된 제1 전극;
    (c) 유전체 기판 상에 배치된 제2 전극;
    (d) 전극의 상단에 배치된 패시베이션 층; 및
    (e) 전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 단백질
    을 포함하며; 여기서 제1 및 제2 전극은 1 내지 20 nm의 갭에 의해 분리되어 있고,
    패시베이션 층은 샘플이 제1 전극과 제2 전극 사이의 갭으로 통과할 수 있도록 배치된 이를 통해 형성된 개구를 갖는 것인, 단백질 활성의 직접 측정을 위한 장치.
  13. (a) 제1항의 장치;
    (b) 단백질과 상호작용할 수 있는 화학 물질을 도입하기 위한 수단;
    (c) 제1 전극과 제2 전극 사이에 바이어스를 적용하기 위한 수단; 및
    (d) 화학 물질이 단백질과 상호작용함에 따라 발생하는 변동을 모니터링하기 위한 수단
    을 포함하는, 단백질 활성의 직접 전기적 측정을 위한 시스템.
  14. 제13항에 있어서, 단백질이 폴리머라제인 시스템.
  15. 제13항에 있어서, 단백질이 엑소뉴클레아제, 프로테아솜, 또는 글리칸인 시스템.
  16. 제13항에 있어서, 단백질이 키나제인 시스템.
  17. (a) 제13항의 시스템에 단백질 분자와 상호작용할 수 있는 화학 물질을 도입하는 단계;
    (b) 정상 DC 전류가 관찰되도록 선택된 2개의 전극 사이에 바이어스를 적용하는 단계; 및
    (c) 화학 물질이 단백질과 상호작용할 때 나타나는 2개의 전극 사이의 전류 변동을 관찰하는 단계
    를 포함하는, 단일 단백질 분자의 활성의 검출 방법.
  18. 제17항에 있어서, 단백질이 폴리머라제, 뉴클레아제, 프로테아솜, 글리코펩티다제, 글리코시다제, 키나제 및 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 화학 물질이 뉴클레오티드 트리포스페이트, 핵산, 펩티드, 글리칸 및 키나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. (a) 제13항의 시스템에 프라이밍된 DNA 템플레이트를 도입하는 단계;
    (b) 4종의 dNTP를 포함하는 용액을 도입하는 단계;
    (c) 정상 DC 전류가 관찰되도록 선택된 2개의 전극 사이에 바이어스를 적용하는 단계;
    (d) 프라이머에 각각의 새로운 뉴클레오티드가 혼입될 때 나타나는 2개의 전극 사이의 전류 변동을 검출하는 단계; 및
    (e) 혼입되는 뉴클레오티드 각각의 정체를 결정하는 단계
    를 포함하는, DNA의 시퀀싱 방법.
  21. 제20항에 있어서, 용액이 서로에 대하여 대략 동일한 농도로 4종의 dNTP를 포함하는 것인 방법.
  22. 제20항에 있어서, dNTP의 농도가 템플레이트-결합된 폴리머라제의 포화 농도와 대략 동일하거나 그보다 높은 것인 방법.
  23. 제20항에 있어서, 단계 (d)가 하나 이상의 전류 스파이크(들)의 존재를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  24. 제20항에 있어서, 단계 (e)가 각각의 스파이크의 특징을 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.
  25. (a) 제15항의 시스템에 생체중합체를 도입하는 단계;
    (b) 정상 DC 전류가 관찰되도록 선택된 2개의 전극 사이에 바이어스를 적용하는 단계;
    (c) 생체중합체의 말단으로부터 단량체가 제거될 때 나타나는 2개의 전극 사이의 전류 변동을 검출하는 단계; 및
    (d) 생체중합체로부터 제거된 각각의 단량체의 정체를 결정하는 단계
    를 포함하는, 생체중합체의 시퀀싱 방법.
  26. 제25항에 있어서, 생체중합체가 DNA, 펩티드, 또는 글리칸인 방법.
  27. (a) 제16항의 시스템에 후보 키나제 억제제 분자를 도입하는 단계;
    (b) 정상 DC 전류가 관찰되도록 선택된 2개의 전극 사이에 바이어스를 적용하는 단계;
    (c) 키나제가 후보 키나제 억제제 분자와 상호작용할 때 나타나는 2개의 전극 사이의 전류 변동을 검출하는 단계; 및
    (d) 키나제가 후보 키나제 억제제 분자의 존재 하에 활성을 갖는지의 여부를 결정하는 단계
    를 포함하는, 키나제의 활성의 검출 방법.
  28. 복수의 장치의 배열을 포함하며, 여기서 각각의 장치는
    (a) 유전체 기판;
    (b) 유전체 기판 상에 배치된 제1 전극;
    (c) 제1 전극 상에 배치된 절연 유전체 층;
    (d) 절연 유전체 층 상에 배치된 제2 전극;
    (e) 제2 전극 상에 배치된 패시베이션 층; 및
    (f) 제1 및 제2 전극에 부착된 폴리머라제 분자
    를 포함하며, 여기서 제1 전극, 절연 유전체 층, 제2 전극 및 패시베이션 층은 이를 통해 형성된 개구를 갖는 것인, DNA의 시퀀싱을 위한 어레이.
  29. 복수의 장치의 배열을 포함하며, 여기서 각각의 장치는
    (a) 유전체 기판;
    (b) 유전체 기판 상에 배치된 제1 전극;
    (c) 유전체 기판 상에 배치된 제2 전극;
    (d) 전극의 상단에 배치된 패시베이션 층; 및
    (e) 전극 중 하나 또는 둘 다에 부착된 폴리머라제 분자
    를 포함하며; 여기서 패시베이션 층은 이를 통해 형성된 개구를 갖는 것인, DNA의 시퀀싱을 위한 어레이.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 배열이 그리드인 어레이.
  31. (a) 제28항 또는 제29항의 어레이;
    (b) 임의로 어레이에 용액을 도입하고 제거하기 위한 수단;
    (c) 제1 전극과 제2 전극 사이에 바이어스를 적용하기 위한 수단; 및
    (d) 제1 전극과 제2 전극 사이에서 생성된 전류를 모니터링하기 위한 수단
    을 포함하는, 폴리머라제 활성의 직접 측정을 위한 시스템.
  32. (a) 제31항의 시스템에 DNA 템플레이트를 포함하는 용액을 도입하는 단계;
    (b) 바이어스가 본원에 기재된 바와 같은 시스템에 적용될 때 생성된 제1 전류를 측정하는 단계;
    (c) DNA 템플레이트에 대해 상보적인 dNTP의 혼입을 가능하게 하는 조건 하에 시스템에 dNTP를 포함하는 용액을 도입하는 단계;
    (d) 단계 (c)에서 생성된 제2 전류를 측정하는 단계;
    (e) 혼입되지 않은 dNTP를 포함하는 용액을 제거하는 단계;
    (f) 단계 (c)에서 사용되지 않은 남아 있는 세가지 유형의 dNTP 각각으로 단계 (c) 내지 (e)를 반복하는 단계; 및
    (g) 단계 (c) 내지 (f)를 반복하는 단계
    를 포함하며; 여기서 DNA가 생성된 전류 신호로부터 시퀀싱되는 것인, DNA의 시퀀싱 방법.
  33. (a) 제31항의 시스템에 DNA 템플레이트를 포함하는 용액을 도입하는 단계;
    (b) 바이어스가 본원에 기재된 바와 같은 시스템에 적용될 때 생성된 제1 전류를 측정하는 단계;
    (c) DNA 템플레이트에 대해 상보적인 dNTP의 혼입을 가능하게 하는 조건 하에 시스템에 적어도 두가지 유형의 dNTP를 포함하는 용액을 도입하는 단계이며, 여기서 dNTP의 유형은 상이한 농도로 용액 중에 존재하는 것인 단계;
    (d) 단계 (c)에서 생성된 제2 전류를 측정하는 단계;
    (e) 혼입되지 않은 dNTP를 포함하는 용액을 제거하는 단계;
    (f) 단계 (c)에서 사용되지 않은 남아 있는 dNTP의 유형으로 단계 (c) 내지 (e)를 반복하는 단계; 및
    (g) 단계 (c) 내지 (f)를 반복하는 단계
    를 포함하며; 여기서 DNA가 생성된 전류 신호로부터 시퀀싱되는 것인, DNA의 시퀀싱 방법.
  34. 제33항에 있어서, 단계 (c)에서의 용액이 네가지 유형의 dNTP를 포함하는 것인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 단계 (c)에서의 용액이 적어도 두가지 유형의 dNTP를 포함하는 것인 방법.
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