BRPI0413294B1 - dispositivo, método e sistema - Google Patents

Abstract

"dispositivo, método e sistema". mudanças físicas resultantes de uma associação entre uma molécula de gabarito e uma molécula alvo são detectadas por monitoração das mudanças na molécula de gabarito. as mudanças exemplares incluem uma mudança em uma dimensão física ou rigidez da molécula de gabarito, uma mudança na condutividade elétrica da molécula de gabarito e uma mudança na energia requerida para dissociar a molécula alvo e a molécula de gabarito. a grandeza da mudança é indicativa da identidade específica da molécula alvo.

Description

“DISPOSITIVO, MÉTODO E SISTEMA”

Referência cruzada a pedidos relacionados

Este documento reivindica o benefício de prioridade, sob 35 U.S.C. Seção 199(e) para o pedido de patente provisório número 60/ 493 142, 5 intitulado “METHOD AND BIO-ELECTRONIC DEVICE FOR RAPID DETECTION OF ANALYTES SUCH AS BIOLOGICAL AGENTS”, por Fred G. Albert et al, depositado em 6 de agosto de 2003, que se incorpora aqui por referência.

Campo Técnico

Este documento pertence geralmente a dispositivos sensores e mais particularmente, mas não a título de limitação, a detecção e análise de uma substância alvo.

Antecedentes

Esforços anteriores para detectar analitos, como agentes biológicos, patógenos, bactérias, vírus, fungos, moléculas e toxinas são relativamente incômodos, consumidores de tempo e requerem uma especialidade técnica signifícante para serem operados. Por exemplo, uma técnica geralmente requer a incubação de amostras em placas de Petri durante um período prolongado de vários dias. Outra técnica envolve o uso de 20 anticorpos tingidos selecionados para identificar a presença de bactérias patogênicas específicas.

Além disso, alguns sistemas requerem que as moléculas biológicas alvo soffam um procedimento de amplificação que é passível de erros e requer um nível técnico de especialidade técnica. Além disso, a 25 amplificação às vezes não pode determinar a concentração de um agente biológico alvo e não é prática de usar no campo.

Alguns sistemas falham em detectar mudanças naturais ou engenheiradas em agentes biológicos, são conhecidos como gerando erros positivos falsos e são sensíveis a condições de teste. Alguns dispositivos para

a detecção de moléculas biológicas (como proteínas ou sequências de DNA) requerem um grande número de moléculas alvo para operar de modo eficaz.

Consequentemente, as moléculas alvo devem ser amplificadas, e em alguns casos etiquetadas o que evita outro uso das moléculas de gabarito.

Breve descrição dos desenhos

Nos desenhos, que não são necessariamente desenhados em escala, números semelhantes descrevem substancialmente componentes similares em todas as várias vistas. Números semelhantes tendo diferentes sufixos de letras representam casos diferentes de componentes 10 substancialmente similares. Os desenhos ilustram geralmente, a título de exemplo, mas não de limitação, várias formas de realização discutidas no presente documento.

A figura 1 ilustra um fluxograma para um método de detecção de uma molécula alvo.

A figura 2 ilustra um detector de cantiléver.

A figura 3 ilustra uma porção de uma estrutura de cantiléver.

A figura 4 ilustra um gráfico do deslocamento como uma função de tempo.

As figuras 5 A e 5B ilustram um sistema detector de cantiléver.

A figura 6 ilustra um gráfico de corrente como uma função de voltagem.

A figura 7A e 7B ilustram parâmetros medidos como uma função de tempo.

A figura 8 ilustra um deslocamento em ressonância.

A figura 9 ilustra um fluxograma para um método de preparação de uma molécula de gabarito.

As figuras 10 e 11 ilustram fluxogramas para métodos de detecção de uma molécula alvo.

A figura 12 ilustra em esquema um conjunto de cantiléveres em um sistema.

A figura 13 ilustra um exemplo de um detector portátil.

Descrição Detalhada

A seguinte descrição detalhada inclui referências aos desenhos anexos, que formam uma parte da descrição detalhada. Os desenhos mostram, a título de ilustração, formas de realização específicas em que a invenção pode ser praticada. Estas formas de realização, que também são referidas como aqui como “exemplos”, são descritas em detalhes suficientes para permitir aos versados na arte praticar a invenção. As formas de realização Φ 10 podem ser combinadas, outras formas de realização podem ser usadas, ou mudanças estruturais, lógicas e elétricas podem ser feitas sem sair do escopo da presente invenção. A seguinte descrição detalhada é, assim, não tomada em um sentido limitativo, e o escopo da presente invenção é definido pelas reivindicações anexas e seus equivalentes.

Neste documento, os termos “o” ou “um” são usados, como é comum em documentos de patente, para incluir um ou mais de um. Neste documento, o termo “ou” é usado para se referir a um não exclusivo ou, salvo indicado em contrário. Além disso, todas as publicações, patentes, e documentos de patentes referidos neste documento são aqui incorporados por 20 referência em sua totalidade, como se fossem incorporados por referência individualmente. No evento de usos inconsistentes entre este documento e os documentos assim incorporados por referência, o uso na(s) referência (s) incorporada deve ser considerado suplementar ao deste documento; para inconsistências irreconciliáveis, o uso neste documento controla.

Os desenhos anexos que formam uma parte do mesmo mostram, a título de ilustração, e não de limitação, formas de realização específicas em que o assunto pode ser praticado. As formas de realização ilustradas são descritas em detalhes suficientes para permitir aos versados praticar os ensinamentos aqui descritos. Outras formas de realização podem ser usadas e derivadas dai, de modo que substituições estruturais e lógicas e mudanças podem ser feitas sem sair do escopo desta descrição. A descrição detalhada, assim, não deve ser tomada em um sentido limitativo, e o escopo das várias formas de realização é definido somente pelas reivindicações 5 anexas, junto com uma faixa completa de equivalentes aos quais estas reivindicações são destinadas.

Estas formas de realização do assunto inventivo podem ser referidas aqui, individualmente ou coletivamente, pelo termo “invenção” apenas por conveniência e sem pretender limitar voluntariamente o escopo φ 10 deste pedido a qualquer invenção única ou conceito inventivo se mais de um for de fato descrito. Assim, apesar de formas de realização específicas serem ilustradas e descritas aqui, deve-se notar que qualquer disposição calculada para obter o mesmo fim pode ser substituída por formas de realização específicas mostradas. Este documento se destina a cobrir qualquer uma e 15 todas as adaptações, ou variações ou combinações de várias formas de realização. As combinações das formas de realização acima, e outras formas de realização não especificamente aqui descritas, serão evidentes para os versados na arte ao estudar a descrição acima.

Introdução

As moléculas são afetadas por mudanças em seu meio. Por exemplo, um ácido deoxirribonucleico de filamento único (ssDNA) irá responder à introdução de seu ssDNA complementar. A hibridização de um filamento de DNA com seu filamento complementar resulta em uma redução de seu comprimento global, assim como uma mudança nas propriedades condutivas do DNA. As mudanças são diretamente proporcionais à fidelidade da equiparação entre os dois filamentos de DNA com mesmo um desacordo de nucleotídeo único tendo um efeito mensurável. A análise das mudanças permite a identificação de vários patógenos e permite a diferenciação entre cepas específicas.

Em um exemplo, uma estrutura microeletromecânica (MEMS) z / η j é usada para medir as mudanças moleculares associadas com a hibridização.

Por exemplo, um elemento móvel em um chip MEMS é unido em ponte por um fragmento de DNA de filamento único selecionado. Um fragmento complementar é detectado e identificado com base em uma medida da deflexão do elemento e uma medida da condutividade resultante da hibridização. Em um exemplo, o processamento de sinal é usado para interpretar os eventos de hibridização como detecção e identificação. A correlação de comprimento e mudança de condutividade para a homologia de 10 filamento de DNA é usada para discriminar entre patógenos conhecidos e variantes, e entre cepas benignas e virulentas.

Além disso, uma voltagem aplicada após hibridização leva o filamento de DNA do patógeno, ou molécula alvo, a ser liberado da molécula de gabarito. A corrente em que a molécula alvo libera também pode prover 15 informação para identificar a molécula alvo. Além disso, ao liberar a molécula alvo, o sensor pode ser preparado para um evento de detecção adicional. Além disso, a integridade do sensor é testada por condução de uma corrente de nível baixo através da molécula de gabarito antes de um evento sensor para verificar a continuidade. Em um exemplo, um conjunto de 20 sensores MEMS ligados em ponte a DNA permite uma detecção multiplexada simultânea de numerosos patógenos virais ou bacterianos, ou permite a medida da concentração de um patógeno único.

Além disso, mudanças na ressonância da molécula de gabarito são usadas para identificar uma amostra que se liga à molécula de gabarito. 25 Em um exemplo, uma extremidade móvel de um cantiléver é ligada em ponte a uma estrutura por uma molécula de gabarito. A frequência de ressonância do sistema de cantiléver (com a ponte de molécula de gabarito) irá mudar quando da hibridização da amostra com a molécula de gabarito. O grau de homologia pode ser determinado pela grandeza e direção do deslocamento na amplitude ou freqüência.

Método exemplar

A figura 1 ilustra procedimento exemplar 100 para a detecção e a identificação de uma substância alvo. A substância alvo, em um exemplo, 5 inclui um fragmento de DNA de filamento único.

Como usado aqui, a molécula alvo e a molécula de gabarito são termos cunhados e as moléculas estão relacionadas em um modo de sua ligação junta. Consequentemente, um sensor particular usa um primeiro filamento de ssDNA como uma molécula de gabarito e um segundo filamento φ 10 de ssDNA é uma molécula alvo, outro sensor pode usar o primeiro filamento de ssDNA como a molécula alvo e o segundo filamento de ssDNA como a molécula de gabarito.

Outras combinações de parceiros de ligação são também contempladas. Por exemplo, ou a molécula de gabarito ou a molécula alvo 15 pode incluir moléculas de ácido nucleico (por exemplo oligonucleotídeos, incluindo ss-DNA ou RNA referidos com ss-RNA), proteínas e carboidratos, Uma molécula de gabarito compreendendo um filamento único de DNA pode hibridizar com um filamento complementar de DNA para formar um DNA de filamento duplo (ds-DNA). Além disso, uma molécula de gabarito incluindo 20 uma proteína pode se ligar a uma molécula alvo que também inclui uma proteína (através de um reconhecimento proteína -proteína), um ácido nucleico (através de um reconhecimento proteína - ácido nucleico) ou um carboidrato (através de um reconhecimento proteína - carboidrato). Além disso, uma molécula de gabarito incluindo ácido nucleico pode se ligar a uma 25 molécula alvo incluindo um ácido nucleico usando DNA (através de reconhecimento ácido nucleico - ácido nucleico) ou um carboidrato (através de reconhecimento ácido nucleico - carboidrato). Além disso, uma molécula de gabarito incluindo um carboidrato pode se ligar a uma molécula alvo incluindo um carboidrato (através de reconhecimento carboidrato -

carboidrato). Em geral, as combinações de molécula de gabarito - molécula alvo podem ser descritas como mecanismo de trava-e-chave que permite que algumas moléculas se liguem somente com outras moléculas.

Em 105, a amostra a ser analisada é coletada. A amostra, que potencialmente inclui a molécula alvo, pode ser um gás, forma sólida ou líquido. Em 110, a amostra é preparada para análise, que, em um exemplo inclui filtrar a amostra. Em 115, a amostra é liberada ao sensor para análise. A liberação da amostra, em um exemplo inclui acompanhar a amostra usando uma bomba microfluídica, válvula, canal, reservatório ou outra estrutura. Em 10 120, a amostra é introduzida em um ou mais sensores para possível detecção e identificação. Em vários exemplos, a detecção e identificação incluem monitoração para uma mudança em comprimento ou posição, uma mudança em uma força, uma mudança em condutividade elétrica ou resistividade, determinação de um nível de sinal para dissociar uma amostra da molécula de 15 gabarito e determinar uma mudança em ressonância. Em 125, os dados coletados são processados para detectar e identificar a amostra. O processamento de dados, em vários exemplos, inclui a comparação de um sinal de saída com dados armazenados onde os dados armazenados incluem uma tabela de verificação que correlaciona uma molécula alvo com uma 20 molécula de gabarito.

Outros procedimentos também são contemplados. Por exemplo, um teste de integridade de sensor pode ser realizado antes de expor o sensor à amostra por monitoração de vários parâmetros.

Sensor de cantiléver exemplar

A figura 2 ilustra o sensor 200 de acordo com um exemplo. O substrato 215 provê uma estrutura ou platina de referência sobre o qual o cantiléver é fabricado. A base 210 é fixada em uma extremidade do cantiléver 205A e eleva o cantiléver 205A acima do substrato 215. Em um exemplo, o cantiléver 205A tem dimensões de aproximadamente 200 pm em

comprimento por 20 pm em largura e 1 pm de espessura. Uma porção da molécula de gabarito 220 é fixada para uma extremidade livre do cantiléver 205A.

A figura ilustra molécula de gabarito 220 como um elemento linear tendo uma extremidade ligada a uma extremidade livre do cantiléver 205A e outra extremidade ligada a uma porção do substrato 215. O espaço entre o cantiléver 205A e o substrato 215 é unido em ponte por molécula de gabarito 220.

Na figura, a molécula de gabarito 220 é mostrada em um 10 tempo onde o parceiro de ligação complementar não foi ligado e o cantiléver 205A é mostrado em um estado relaxado ou não carregado. As posições alternativas para cantiléver 205A são ilustradas em linhas pontilhadas. O cantiléver 205B por exemplo é ilustrado em um momento quando um parceiro de ligação foi associado com o gabarito 220. O cantiléver 205B foi deslocado 15 pela distância Dl abaixo da posição mostrada pelo cantiléver 205A. A molécula de gabarito 220 é associada com um parceiro de ligação de baixa afinidade. O cantiléver 205C ilustra um tempo quando um parceiro de ligação diferente foi associado com o gabarito 220. O cantiléver 205C foi deslocado por uma distância D2 abaixo da posição mostrada pelo cantiléver 205A. O 20 cantiléver 205C representa o caso quando uma molécula de gabarito 220 é associada com um parceiro de ligação com maior afinidade do que o parceiro de ligação representado com cantiléver 220B.

O deslocamento do cantiléver 205A é detectado, em um exemplo por um sistema de detecção óptico. Na figura, a fonte óptica 230 25 projeta um feixe de luz 250 sobre uma superfície do cantiléver 205A que é refletida, como mostrado pelo raio 245A, e detectado pela célula 240 A de sensor óptico 235. O cantiléver 205B reflete luz, como mostrado pelo raio 245B, que é detectado pela célula 240C. O sensor 235 é ilustrado como tendo três células, no entanto, mais ou menos também são contempladas. Em um exemplo, a fonte óptica 230 inclui um laser ou outra fonte de luz colimada.

Outros meios para detectar o deslocamento ou ressonância de cantiléver 205A são também contemplados. Em um exemplo, um elemento piezoelétrico provê um sinal elétrico como uma função da deflexão do 5 cantiléver 205A. O elemento piezoelétrico inclui um material piezoelétrico que é ligado a, ou integrado com, uma superfície de cantiléver 205A, base 210 ou outra estrutura.

Em um exemplo, uma medida de capacitância é usada para determinar o deslocamento ou ressonância. Por exemplo, uma camada Φ 10 condutora de uma estrutura de cantiléver serve como uma placa de capacitor.

A capacitância entre a camada condutora do cantiléver e outro condutor varia com a distância entre os condutores. Assim, uma medida da capacitância pode fornecer dados de deslocamento e ressonância. Em vários exemplos, a camada condutora do cantiléver é eletricamente isolada de outras camadas condutoras 15 do cantiléver.

Em um exemplo, um campo magnético ou elétrico é usado para determinar o deslocamento ou ressonância de uma estrutura de cantiléver. O movimento relativo entre um imã e um condutor provê um sinal φ usado para determinar o deslocamento ou ressonância. Além disso, um calibre de força fixado a um cantiléver provê informação sobre o deslocamento e ressonância.

Estrutura de cantiléver exemplar

A figura 3 ilustra um exemplo de uma estrutura de sensor fabricada usando construção de circuitagem de gabarito dirigida (DiTC). A 25 circuitagem de gabarito dirigida usa sistemas microeletromecânicos, monocamadas auto-montada (SAMs) e hibridização de DNA. Usando litografia, as películas finas de vários materiais, incluindo metais como prata (Ag), cromo (Cr), ouro (Au) e carbono, são padronizada em dimensões de tamanho micrônico. As monocamadas auto-montadas permitem imobilizar

seletivamente as moléculas de gabarito em uma superfície MEMS. Além disso, proteínas e outras biomoléculas podem ser imobilizadas sobre superfícies como ouro usando SAMs. Além disso, analitos alvo podem ser detectados usando métodos amperométricos e SAMs em eletrodos.

Em uma forma de realização do circuito de gabarito dirigido, a tecnologia SAMs é usada para aplicar uma monocamada da proteína estreptavidina em ouro que é depositada em camadas sobre cromo. Estreptavidina é imobilizada sobre a superfície de eletrodo de ouro com base na ligação da proteína a uma monocamada de dissulfeto biotinilado sobre a φ 10 superfície de ouro.

A mesma química à base de biotina é então usada para ligar entre aproximadamente 20 e 100 iniciadores de oligonucleotídeos de base especificamente projetados e sintetizados para hibridizar a ponte de gabarito de DNA de filamento único como mostrado na figura 8. Os iniciadores de 15 circuitagem de gabarito dirigido dirigem a orientação e o posicionamento da ponte de gabarito de ssDNA, isto é, o iniciador à esquerda.

Em um exemplo, um gabarito de DNA de filamento único (ssDNA) é ligado usando iniciadores de oligonucleotídeos em um modo que liga em ponte um circuito à base de MEMS eletrônico. A hibridização para o 20 DNA alvo derivado de microorganismo sendo identificado causa uma redução na distância entre os braços do cantiléver.

A fabricação de dispositivos de micro chip MEMS usando circuitagem de gabarito dirigida requer, brevemente, uma técnica de fotopolimerização de gel par produzir micromatrizes de almofadas de gel 25 poliacrilamida por uma superfície de vidro hidrofóbico. Em um exemplo, os oligonucleotídeos de DNA são aplicados às almofadas de gel e testados para um posicionamento correto e orientação por microscopia de fluorescência e digestão de exonuclease.

Outros métodos podem ser usados para fixar a molécula de

gabarito aos pontos de contato em um modo que alinha a molécula de gabarito para detecção e identificação de uma molécula alvo. Por exemplo, as ligações estabelecidas usando ouro-estreptavidina e grupo de enxofre/ biotina também são contempladas.

Em um exemplo, os iniciadores são projetados e sintetizados para hibridizar a uma molécula de gabarito compreendendo uma molécula de DNA de filamento único. Além disso, os iniciadores são dispostos e orientados de modo que a molécula de gabarito terá a orientação e posição desejadas. Mais particularmente, os iniciadores asseguram que uma porção Φ 10 selecionada (em ou para uma extremidade final) da molécula de gabarito é ligada a uma superfície do cantiléver e que uma porção selecionada (em ou para uma segunda extremidade) da molécula de gabarito é ligada a outra superfície do cantiléver. Em vários exemplos, as extremidades da molécula de gabarito são ajustadas a uma porção específica da estrutura do cantiléver (um alinhamento de uma fia) ou não ajustadas (alinhamento de duas vias). Desempenho - Deslocamento

Em um exemplo, a resistência de um filamento de DNA, e o comprimento, é dependente da composição de base, seqüência e meio ambiente. Um fenômeno biofísico mensurável ocorre quando um filamento 20 único de DNA interage com seu filamento complementar. Particularmente, a redução livre média no comprimento de DNA quando da hibridização com seus complementos é de aproximadamente 40%. A seqüência de nucleotídeos de DNA e a composição podem ser correlacionadas com parâmetros estruturais e outros biofísicos.

A figura 4 ilustra uma relação entre amplitude de força e deslocamento de uma superfície de cantiléver 205A. Para um cantiléver em particular, o desempenho medido pode ser usado para identificar um parceiro de ligação complementar. Se um cantiléver for exposto a uma molécula de amostra que não é completamente complementar, então os resultados serão diferentes.

A figura 4 ilustra em gráfico a resistência de uma molécula biológica para um exemplo. A partir dos dados apresentados, uma molécula é amarrada entre a ponta do cantiléver e um substrato. O limite é obtido por 5 adição de um grupo funcional às extremidades do ssDNA de gabarito para fixação ao cantiléver em uma extremidade da seqüência e ao substrato na outra extremidade. As combinações exemplares incluem ligações ouro-tiol e ligações biotina- estreptavidina.

A análise de dados para estabelecer uma resistência à tração φ 10 molecular é apresentada na figura. Em um exemplo, a estrutura do sensor é fabricada de modo que a molécula de gabarito é mantida em tensão leve, no entanto, uma tensão neutra ou quase zero é também contemplada. Com a molécula de gabarito mantida de tal modo, um parceiro de ligação é introduzido. Para uma molécula de gabarito de ssDNA, um parceiro de 15 ligação apropriado é o filamento de ssDNA complementar. A ligação subsequente (ou hibridização) da molécula de gabarito com a molécula alvo provê uma mudança mensurável em um parâmetro físico ou característica. O cantiléver é capaz de detectar (e medir) o deslocamento e a mudança no comprimento da molécula devido à hibridização.

A figura ilustra deslocamento de cantiléver com relação à hibridização de um ssDNA de gabarito com um ssDNA alvo. Como notado, o cantiléver deformado por aproximadamente 10,2 nm após exposição do ssDNA de gabarito com um ssDNA alvo geneticamente equiparado (ou complementar). Esta abordagem experimental foi repetida em mais do que

100 diferentes moléculas biológicas.

Na figura, a marcação padrão representa um filamento de ssDNA complementar com 100% de homologia com a molécula de gabarito (filamento). Outras marcações são ilustradas em 2%, 19% e 38% variante do filamento de ssDNA complementar 100% homólogo. Como usado aqui, o termo variante denota um ssDNA alvo contendo substituições de pares de bases aleatórias com relação a filamento de ssDNA complementar, 100% homólogo. As gradações notadas na figura ilustram que várias moléculas de ssDNA variantes são também detectáveis e identificáveis usando o presente 5 sistema.

Detector de cantiléver duplo exemplar

As figuras 5A e 5B ilustram vistas do sensor 500 à base de cantiléver. A figura 5A ilustra molécula de gabarito 545 unindo em ponte, ou ligando, as extremidades livres dos cantiléveres duplos 505A. Os cantiléveres Φ 10 505A são eletricamente acoplados a um circuito detector 530 via condutores

550 e placas de conexão 535 dispostas em extremidades estabilizadas de cantiléveres 505A. As placas de conexão 535 são unidas à camada 510 que é disposta no topo das camadas 515 e camada 520. As camadas 510, 515 e 520, em um exemplo, são compostas de SÍ3N4, Si, SÍ3N4, cada tendo uma 15 espessura de aproximadamente 50 nm, 150 nm e 250 nm, respectivamente. Os cantiléveres 505A são colocados em suspensão acima do canal de amostra 540 formado na camada 515. Os cantiléveres 505A, em um exemplo, são formados de camada 555 (ouro) e camada 560 (cromo) tendo espessuras de aproximadamente 40 nm e 5 nm, respectivamente.

Na figura 5A, os cantiléveres 5O5A são unidos em ponte por uma molécula de gabarito de ssDNA 545 sob poucas ou sem forças de tração O circuito detector 530, em um exemplo, provê uma corrente elétrica para detectar o nível de condutividade. Será notado que a condutividade é a recíproca da resistência e em um exemplo uma resistência é determinada. Em um exemplo, um valor de impedância é determinado. Na figura 5B, a ponte 565 representa um dsDNA hibridizado formado pela combinação da molécula de gabarito (ssDNA) e a molécula alvo (ssDNA). Como ilustrado na figura 5B, os cantiléveres 505A são deflexionados de modo convergente. O circuito detector 530 gera uma medida de condutividade e quando da hibridização do filamento de dsDNA, reflete um aumento medido na condutividade.

Em vários exemplos, um circuito de teste e um circuito de reinicialização são providos no circuito detector 530. O circuito de teste é configurado para prover uma corrente para a molécula de gabarito 545 para 5 estabelecer que a molécula de gabarito é fixada de modo apropriado nos braços do cantiléver. Por exemplo, uma combinação em série de uma fonte de corrente, sensor e um resistor irá indicar um fluxo de corrente esperado se o sensor e a molécula de gabarito são configuradas de modo apropriado. Os desvios de um nível de corrente esperado podem indicar que a molécula de Φ 10 gabarito ou o sensor não é configurado de modo apropriado para teste da amostra.

Um circuito de reinicialização do circuito detector inclui um circuito de acionamento para dissociar a molécula alvo da molécula de gabarito na preparação para outro evento de detecção e identificação. Em um 15 exemplo, isto acarreta prover uma voltagem de rampa para a molécula de gabarito e monitorar para uma corrente de pico. Em um exemplo, isto acarreta prover uma corrente de rampa para a molécula de gabarito e monitorar para uma voltagem de pico. A voltagem de pico, ou corrente, irá coincidir com um evento de desnaturação ou dissociação da molécula de gabarito e da molécula 20 alvo.

A figura 6 ilustra um exemplo da corrente requerida para induzir a desnaturação de DNA amarrado de um filamento complementar. O circuito de reinicialização, ou outro meio de prover uma corrente de desnaturação, pode remover o filamento complementar de um sítio de sensor, 25 assim o aprontando para um novo evento sensor. Em um exemplo, um sensor disposto em uma corrente de fluxo pode ser usado para eventos sensores sucessivos e separados assim permitindo a operação contínua do sensor.

Na figura, a corrente de desnaturação é indicada na ordenada e a voltagem aplicada aparece na abscissa. A diferença em grandeza de corrente, como ilustrado, provê um meio para discernir variações de uma molécula alvo complementar.

Um elevado grau de proporcionalidade é notado entre a quantidade de corrente requerida para a força de desnaturação e o grau de desacordo dos filamentos de ssDNA de gabarito e alvo sem levar em conta se a variação ocorreu em uma região da seqüência genética ou foi espalhada sobre vários diferentes locais ao longo da seqüência alvo.

As figuras 7A e 7B ilustram um processo manual de aumento da voltagem para formar a desnaturação seguido por uma redução na voltagem de volta a níveis sensores para permitir a ocorrência de outra hibridização. Como ilustrado na figura 7A, vários eventos sensores são notados. Os sinais de reinicialização são ilustrados na figura 7B, como correspondendo a estes eventos sensores. Uma corrente de desnaturação provê um meio de reinicialização do sensor. A corrente de desnaturação parece consistente, tanto durante os estados de ssDNA como após a hibridização (dsDNA).

Na figura, um filamento complementar foi introduzido em aproximadamente 15 segundos desde o início da aquisição de dados seguido por um evento sensor imediato. Após vários segundos, a voltagem foi manualmente aumentada a aproximadamente 4 volts, resultando na desnaturação do DNA de filamento duplo. A voltagem foi manualmente reduzida a 3 volts, e o sistema foi assim reinicializado para outro evento

sensor.

Exemplo de ressonância

A figura 8 inclui dados gráficos 800 ilustrando como a ressonância pode ser usada para identificar e detectar uma molécula alvo usando uma molécula de gabarito ligada em ponte.

Na figura, a freqüência é traçada em gráfico na abscissa e amplitude na ordenada. A estrutura de cantiléver, ou outra estrutura suspensa, é acionada para oscilar usando um sinal de excitação. Em vários exemplos, o sinal de excitação é provido por um membro magnético, piezoelétrico ou acústico disposto próximo da estrutura móvel. Na figura, a curva 805 ilustra um exemplo em que a molécula de gabarito ressona em uma freqüência inicial 5 de F₂ e com uma amplitude inicial de A₂. Após expor a molécula de gabarito à molécula alvo, a estrutura ressona com uma freqüência de Fi e uma amplitude de Ai. A diferença de freqüência A_F e a diferença de amplitude Δ_Α são indicativos do grau de homologia e, assim, permitem a detecção e a identificação da molécula alvo. Por exemplo, acredita-se que uma molécula φ 10 alvo com uma maior porcentagem de equiparação com a molécula de gabarito irá demonstrar uma maior mudança em um ou ambos dentre amplitude e freqüência.

A figura ilustra uma redução em tanto a amplitude como a freqüência. No entanto, em outros exemplos, ou um ou ambos dentre 15 amplitude e freqüência podem demonstrar um aumento ou uma diminuição.

Em um exemplo, ressonância da porção móvel do dispositivo MEMS permite a detecção e a identificação. Em um exemplo, uma extremidade do cantiléver inclui um material magnético e uma corrente alternada passada através de uma bobina disposta sob o cantiléver leva o 20 cantiléver a vibrar na freqüência da corrente alternada. Em um exemplo, as dimensões do cantiléver e a corrente alternada são selecionados para maximizar a saída. Por exemplo, se a corrente alternada estiver próxima da freqüência natural do cantiléver, a resposta do sistema estrutural será maximizada. A rigidez do sistema estrutural é mudada quando do ssDNA, ou 25 outra molécula de gabarito, é amarrada entre a extremidade do cantiléver e a

base do substrato. Uma ou ambas dentre a amplitude do deslocamento do sistema oscilante e a freqüência de oscilação irão diferir da do sistema com a extremidade de cantiléver livre. Quando da introdução de uma molécula alvo (como um analito ou o ssDNA complementar ao ssDNA de gabarito), a

	amplitude do deslocamento e a freqüência do sistema oscilante irão mudar. A quantidade da mudança será proporcional ao grau de homologia entre as moléculas de gabarito e marcação porque a rigidez de um filamento de	ÍC
	5	dsDNA é maior do que a soma da rigidez de dois independentes ssDNA. Assim, além da detecção da presença do analito, a mudança na amplitude e
•	10	freqüência pode ser usada para medir o grau de homologia das moléculas de ssDNA quando comparadas com as de uma equiparação complementar. Preparação exemplar A figura 9 ilustra um fluxograma do método 900 de acordo com um exemplo. Na figura, um cantiléver é formado na base em 905. As
	15	estruturas diferentes de um cantiléver também são contempladas, incluindo, por exemplo, uma estrutura circular ou helicoidal tendo uma extremidade suportada e uma extremidade livre. Além disso, uma estrutura em forma de disco ou retangular é também contemplada com uma região central móvel e um perímetro fixado a uma estrutura de base no modo de uma parte superior
•	20	de um tambor. Em um exemplo, as técnicas de fabricação de semi-condutores são usadas para a formação do cantiléver sobre a base. Em 910, um material de ligação, ou iniciador, é aplicado ao cantiléver e à estrutura de base ou substrato. O iniciador é selecionado para assegurar que a molécula de gabarito seja afixada com alinhamento e
	25	orientação apropriadas. Em vários exemplos, o iniciador inclui ouro e estreptavidina. Em 915, a molécula de gabarito é unida em ponte entre o substrato e o cantiléver. Em um exemplo, o método 900 é realizado por um fabricante
		na preparação de um sensor para uma aplicação em particular. Detecção e identificação exemplares As figuras 10 e 11 ilustram métodos de teste 1000 e método 1100, respectivamente. Os métodos ilustrados, assim como outros métodos,

podem ser implementados usando um computador, ou outro circuito de controle, acoplado a um sensor. Em um exemplo, o método é realizado usando controle manual do sensor.

Na figura 10, a amostra é preparada a 1005. A preparação da 5 amostra, em vários exemplos, acarreta filtração, purificação, amplificação e outros procedimentos para aprontar a amostra para análise.

Em 1010, a molécula de gabarito é analisada para estabelecer um ou mais parâmetros para servir como uma linha de base. Em um exemplo, isto acarreta verificar que a molécula de gabarito é alinhada e posicionada de φ 10 modo apropriado por verificação do nível de corrente através da molécula de gabarito. Além disso, a condutividade ou resistividade, amplitude de ressonância e freqüência para a molécula de gabarito sozinha são medidas. Em um exemplo, a posição física da molécula de gabarito é medida.

Em 1015, a amostra é exposta ao gabarito. Em um exemplo, 15 isto acarreta a injeção de uma amostra, que possivelmente inclui a molécula alvo, em um canal ou cavidade do aparelho de teste. O canal ou cavidade está em comunicação com a molécula de gabarito.

Em 1020, a molécula de gabarito é analisada para gerar um parâmetro físico correspondendo à molécula de gabarito exposta. O parâmetro 20 exposto, em vários exemplos, inclui medir uma mudança em uma posição, ou deslocamento, medindo uma mudança em alinhamento, medindo a condutividade, ou resistência, medindo uma corrente desnaturante e medindo mudanças em ressonância. Outros parâmetros físicos são também contemplados, incluindo os baseados em uma propriedade óptica ou cor da 25 combinação das moléculas de gabarito e alvo.

Em 1025, uma consulta é apresentada para determinar se uma diferença é notada entre a linha de base e o parâmetro após exposição do sensor à molécula alvo. SE uma mudança no parâmetro físico, ou uma diferença, for notada, então o processamento continua a 1030 onde a amostra é identificada. A existência de uma diferença é indicativa de detecção da molécula de gabarito.

Como também notado neste documento, o grau de homologia é indicativo da equiparação entre a molécula de gabarito e a molécula alvo.

Outros pares de ligação também são contemplados e a proximidade em uma equiparação completa pode estar correlacionada à diferença notada nos parâmetros físicos.

Em um exemplo, uma memória acoplada a um processador do presente assunto inclui dados armazenados na forma de uma tabela de 10 verificação. Os dados armazenados fornecem uma correlação entre as diferenças ou mudanças notadas em um parâmetro físico e o grau de homologia.

Se a consulta em 1025 der uma resposta negativa, então o processamento continua a 1035 quando um sinal de saída é gerado. O sinal de 15 saída, em várias formas de realização, inclui uma medida da diferença ou mudança notada, o grau de homologia ou a identificação da molécula alvo.

Em 1040, a molécula de gabarito é limpa de qualquer molécula alvo restante ou material de amostra, ou reinicialização, por aplicação de uma excitação elétrica à molécula de gabarito e induzindo a desnaturação ou 20 dissociação.

Em um exemplo, após 1040o método retoma a 1005 para detecção e identificação de uma amostra adicional.

A figura 11 ilustra o método 1100 que inclui um teste em série de uma amostra. Será notado que as outras ordens de teste são também 25 contempladas assim como testes paralelos. Por exemplo, a medida de uma mudança em freqüência de ressonância, amplitude de ressonância e condutividade pode ser realizada de modo concorrente. No método 1100, as condições iniciais, ou linha de base, são estabelecidas em 1105.

Em 1110, o deslocamento do sensor, devido à molécula de gabarito hibridizar com a molécula alvo, é determinado. Em 1115, uma mudança na ressonância é determinada. A mudança pode corresponder a uma alteração na freqüência de ressonância ou a amplitude de ressonância. Em 1120, a condutividade da molécula de gabarito com a molécula alvo é determinada. Em 1125, uma corrente de dissociação, ou nível de calor, é determinada por monitoração de um sinal de pico.

A figura 12 ilustra um conjunto de sensores de cantiléver fabricados em substrato 1205 tendo uma base comum 1210. Os cantiléveres,

alguns dos quais são rotulados 1240A, 1240B, 1240C e 1240D são fixados a 10 uma base 1210 em uma extremidade e amarrados por moléculas de gabarito a pontos de contato 1245A, 1245B, 1245C e 1245D, respectivamente, em uma superfície do substrato 1205. As moléculas de gabarito, em um exemplo, são de composição idêntica e provêem um nível de redundância para teste. Em um exemplo, pelo menos duas moléculas de gabarito são diferentes e são 15 dimensionadas para detectar e identificar diferentes moléculas alvo.

Cada cantiléver, como 1240A, é acoplado ao controlador 1215 por condutores elétricos 1235A e 1245B usando multiplexador 1220. O controlador 1215 seletivamente aplica corrente de teste, voltagem, sinais de acionamento ou outros sinais para permitir que cada cantiléver detecte e 20 identifique uma molécula alvo. A fonte de energia 1225, de controlador 1215 provê uma voltagem ou corrente constante ou em rampa para excitação. Em um exemplo, a fonte de energia 1225 provê uma corrente de desnaturação ou voltagem. Em um exemplo, a fonte de energia 1225 provê um sinal de acionamento para excitar ressonância em cada cantiléver.

A interface 1230 é acoplada ao controlador 1215 e provê entrada de dados e saída de dados. Em vários exemplos, a interface 1230 inclui um monitor, uma tela sensível a toque, um teclado, um teclado para funções especiais, um mouse ou outro controle posicionador, um transdutor de áudio, um dispositivo de armazenamento, uma impressora, uma conexão de rede (por exemplo, uma rede de banda larga como Internet, ou uma rede de área local como uma intranet), um conector elétrico ou um transreceptor sem fio.

A figura 13 ilustra dispositivo portátil exemplar 1300 de acordo com uma forma de realização. Na figura, o monitor 1305 provê um aviso visual e dados correspondendo à análise de uma molécula alvo e condição do dispositivo. Os controles acessíveis pelo usuário e pontos de entrada de dados incluem um botão de força 1310, um corte de reagente 1315, uma entrada de amostra 1320 e controles 1325. Outros controles e φ 10 dispositivos de entrada de dados são também contemplados. Em um exemplo, uma superfície permeável no dispositivo 1300 permite ao usuário liberar uma amostra usando uma seringa ou outro dispositivo de injeção. Em um exemplo, uma abertura em uma superfície de 1300 inclui uma cavidade para receber uma amostra.

O dispositivo 1300 é ilustrado como um dispositivo portátil, operado por batería, no entanto, outras formas de realização são contempladas, incluindo por exemplo uma unidade de mesa com acomodações para receber uma amostra e prover uma saída.

Exemplo φ

Além das mudanças mensuráveis em comprimento ou força, a capacidade das estruturas de DNA para conduzir uma corrente elétrica está relacionada com o conteúdo, seqüência, comprimento e meio químico do circuito ligado em ponte. Em um exemplo, a condutividade está relacionada com níveis de guanina/ citosina.

Em um exemplo, uma seqüência de DNA genômico de

Bacillus de 121 pares de base (pb) foi isolada de DNA genômico, plasmídeo, e lambda viral. Os dado sindicam resultados consistentes com numerosas variáveis com relação às propriedades de DNA (comprimento, composição da seqüência ) e condições de análise (redox, pH, sal, desnaturante, e controles acelerantes de hibridização) e outros DNA (de filamento único e duplo), moléculas e variantes genéticos isolados de Bacillus, assim como DNA de E. coli.

O fragmento em questão foi isolado de DNA genômico de

Bacillus por digesto de endonuclease de restrição e ligado em um vetor de clonagem de plasmídeo pUC 13 que foi transformado em um hospedeiro de E. coli como a cepa parental. Uma biblioteca de mutações em pontos genéticos aleatória foi criada ao longo do comprimento do inserto de plasmídeo e isolados com insertos que variaram do parental em 2%, 19% e 10 35% foram seqüenciados e usados para outra análise. Tanto os insertos parentais como variantes foram excisados do plasmídeo hospedeiro nas extremidades 5’ e 3’ foram quimicamente modificados com grupos tiol e biotina. O DNA de filamento único foi isolado usando cromatografia de afinidade (com base nas modificações de biotina) e fixado entre pontas e 15 platinas de microscopia de potência atômica condutiva (AFM) revestidas com estreptavidina e ouro. A ponta AFM não é inicialmente defletida. Em um exemplo, a mudança no comprimento eficaz de um filamento único de DNA como ele hibridiza em seu filamento complementar é uma redução de 40%.

O deslocamento da ponta do AFM foi observado em segundos de introdução do DNA complemento (em solução de hibridização) ou variantes genéticas ao gabarito de DNA amarrado. Os resultados experimentais indicaram um deslocamento de ponta consistente (< 0,5% COV) como uma função do grau de desacordo entre o gabarito e o complemento. Postula-se que os desacordos base-par não contribuem para a 25 formação helicoidal de estrutura global, assim reduzindo a redução do comprimento da molécula.

A condutividade elétrica foi determinada usando pontas de AFM condutivas. O mesmo fragmento de 121 pb foi amarrado entre a ponta e platina de AFM e o complemento de DNA foi introduzido. A corrente elétrica (em nanoamps) foi medida como uma função de tempo em uma voltagem fíxa.

Antes da introdução do DNA complementar, a voltagem aplicada resultou em uma corrente consistente, ou de linha de base (de 5 aproximadamente 0,3 nA) passando através do ssDNA amarrado. O tratamento do ssDNA amarrado com a DNA nuclease resultou em uma perda desta corrente de linha de base. A nuclease tratada com calor não resulta em uma perda de corrente.

A corrente mensurável através de um sensor provê uma 10 verificação da função do sensor (auto-teste do sensor) porque a corrente elétrica irá fluir se ssDNA permanecer amarrado aos elementos móveis MEMS. Após hibridização entre o ssDNA amarrado e seu filamento complementar, um aumento na corrente aparece como notado nas figuras. Além disso, as figuras ilustram uma relação entre a corrente medida e o grau 15 de equiparação entre os filamentos. Após a hibridização, a corrente conduzida permanece relativamente consistente desde que a voltagem seja aplicada ao sítio do sensor.

Após a hibridização, a voltagem aplicada foi aumentada e a corrente conduzida aumentada de modo correspondente a um nível de pico. A 20 desnaturação do ssDNA amarrado e o filamento complementar ocorreu em um potencial de aproximadamente 4,1 volts para este fragmento de 21 pb particular. A quantidade de corrente associada com a desnaturação variou com o grau de equiparação entre o ssDNA amarrado e o filamento complementar. Concorrente com a queda em corrente, a ponta de AFM 25 retomou à posição não defletida. Postula-se que o nível maior de corrente infunde energia suficiente nos filamentos hibridizados de modo que eles não podem mais permanecer hibridizados apesar de outros mecanismos ou fatores poderem ser responsáveis por este fenômeno. Os desacordos dos pares de bases nas variantes parecem introduzir isolamento de locais ao longo dos filamentos, assim reduzindo, de modo proporcional, a condutância.

Em um exemplo, a seleção de uma molécula de gabarito, como

DNA particular, para ligar em ponte um circuito ou estrutura de cantiléver afeta a especificidade do DNA, comprimento, sequência, composição e 5 condutividade. Em um exemplo, a especificidade da detecção e identificação é melhorada por seleção de ssDNA de regiões genéticas múltiplas de um patógeno para amarração. Em um exemplo, um segmento de DNA mais longo provê aumentada especificidade (seqüência de DNA que é singular à marcação de agente biológico específico). Em um exemplo, um segmento de 10 DNA mais curto permite a seleção de regiões de elevado teor em guanina (G) e citosina (C). A composição global GC e seqüência provê características isolantes de adenina (A) e timina (T). O elevado teor de AT em DNA leva a uma inflexibilidade e curvatura molecular global dependendo do posicionamento relativo de regiões ricas em AT (isto é, em fase com a rotação 15 helicoidal). Em várias formas de realização, os segmentos de DNA selecionados são maiores do que 40% GC, ou maiores do que 60% GC. O comprimento de segmento de DNA foi assim menor do que 500 pares de base (pb), ou menores do que 150-200 pares de base (pb). A determinação da composição de GC DNA, seqüência, e especificidade foram determinadas 20 usando software publicamente e comercialmente disponível como PubMed

BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Outro software é disponível para correlacionar parâmetros moleculares de primeira ordem para aspectos de ordem superior (isto é, flexibilidade, curvatura). Em um exemplo, a molécula de gabarito é selecionada usando um algoritmo de software.

Exemplos adicionais

Em um exemplo, o sensor inclui um membro suspenso que inclui um cantiléver. A molécula de gabarito é fixada a um ponto de contato, pelo menos uma estando localizada em um membro suspenso. O cantiléver, em vários exemplos, é curvado, circular ou em forma de rede. Em um

exemplo, o membro suspenso é um membro giratório que gira em tomo de um eixo. Como um membro giratório, o ponto de contato é deslocado ao longo de um arco quando a molécula de gabarito se liga à molécula alvo. Em um exemplo, uma extremidade do membro giratório gira enquanto outra 5 permanece estacionária ou gira em uma direção oposta ou através de uma faixa menor e a diferença de fase entre as duas extremidades do membro giratório provê um sinal de diferença que é usado para discernir a molécula alvo.

Em um exemplo, a molécula de gabarito tem mais do que um 10 sítio de ligação específico para uma molécula alvo. Em um exemplo, a molécula alvo tem sítios de ligação múltiplos, cada um sendo específico a uma molécula alvo diferente. Em um exemplo, a molécula alvo tem sítios de ligação múltiplos, cada um sendo específico a uma molécula alvo única.

Em um exemplo, os pontos de contato múltiplos são providos 15 em um sensor e a molécula de gabarito liga a dois ou mais pontos de contato múltiplos. Por exemplo, uma molécula de gabarito de extremidade dupla pode se ligar a um sensor tendo dois, três ou mais pontos de contato. Como outro exemplo, uma molécula de gabarito de três extremidades pode se ligar a um sensor tendo dois, três, quatro ou mais pontos de contato.

Em um exemplo, um sinal de saída é gerado como uma função de uma mudança em uma medida de um parâmetro físico. Os parâmetros físicos incluem parâmetros estruturais assim como elétricos. Os parâmetros estruturais exemplares incluem mudanças posicionais como deslocamento físico, ffeqüência de ressonância, amplitude de ressonância, alinhamento físico ou orientação de um ponto de contato e um ponto de referência, uma força exercida em um eixo geométrico, mudanças ópticas e geradas por calor incluindo cor. Outros parâmetros físicos são também contemplados.

Em um exemplo, um sinal de saída é gerado como uma função de uma mudança em uma medida de um parâmetro elétrico. Os parâmetros

elétricos exemplares incluem impedância, condutividade, resistividade, indutância, capacitância. Além disso, um parâmetro elétrico pode ser descrito como um sinal de saída na presença de um sinal de entrada. Por exemplo, uma mudança em corrente conduzida em uma molécula de gabarito pode resultar 5 em uma mudança na voltagem. Além disso, uma mudança na voltagem aplicada à molécula de gabarito pode resultar em uma mudança em uma corrente. Outros sinais de acionamento podem também ser aplicados e as respostas medidas podem ser usadas para gerar um sinal de saída. Outros parâmetros elétricos também são contemplados.

Em um exemplo, um parâmetro físico inclui uma medida de condutividade elétrica. A condutividade elétrica é uma medida do fluxo de elétrons em um material. A condutividade elétrica é a recíproca da resistividade, ou resistência, e em um exemplo, o parâmetro físico monitorado inclui resistividade.

Em um exemplo, uma molécula de gabarito ssDNA, ligada via iniciadores de oligonucleotídeos, liga em ponte um circuito à base de MEMS eletrônico. A hibridização é uma molécula alvo (como DNA) é derivada de microorganismos sendo identificados e provoca uma redução na distância entre os elementos de cantiléver.

Em várias formas de realização, um comparador ou ponte

Wheatstone é usada para detectar, identificar e comparar níveis de voltagem, níveis de corrente, condutividade ou outros parâmetros.

Em um exemplo, a desnaturação da molécula de gabarito é realizada por aplicação de calor às moléculas de gabarito e alvo. Um nível de 25 calor é quantificado por medida de uma corrente, voltagem, ou wattagem. Em um exemplo, uma diferença no nível de calor está correlacionada com a identidade da molécula alvo.

Em um exemplo, um sítio de sensor único inclui um DNA de filamento único, amarrado, (ssDNA), ligando em ponte um elemento móvel em um chip do sistema microeletromecânico (MEMS). Em um exemplo, centenas ou milhares destes sítios são colocados em um chip único. O ssDNA amarrado é selecionado para hibridizar com um filamento complementar extraído de um bioagente de interesse.A hibridização resultante tanto muda o 5 comprimento físico da molécula amarrada, como muda a condutividade da molécula amarrada. As mudanças são medidas em um sistema MEMS em

uma elevada relação sinal-para-ruído. O grau de mudança está relacionado ao grau de equiparação entre os filamentos de DNA amarrados e bioagentes. Assim, o grau de variância (especificidade) do bioagente pode ser medido. 10 Após detecção, a identificação e discriminação são confirmadas, o filamento de DNA bioagente é expelido do filamento amarrado por aumento do fluxo de corrente através da molécula, assim reinicializando o sensor para subseqüentes eventos de sensor. A viabilidade do sensor é verificada através de um auto-teste porque um ssDNA amarrado (ausente seu complemento) é 15 capaz de conduzir uma quantidade mensurável de corrente.

As mudanças de parâmetro físico são proporcionais à fidelidade da equiparação entre a molécula de gabarito e a molécula alvo (ou filamentos de DNA). Um desacordo do nucleotídeo único dá uma mudança mensurável, assim permitindo a identificação de vários patógenos e 20 diferenciação de variações sutis entre cepas específicas.

Em um exemplo, a molécula de gabarito inclui ssDNA. Em um exemplo, as regiões de DNA específicas de B. anthracis são propagadas e funcionalizadas. O sensor pode ser ligado em ponte por DNA de qualquer agente biológico (bactérias, vírus ou fungos).

Em um exemplo, quatro (4) segmentos de 150-200 pares de bases (pb) de Bacillus anthracis (Ames) são selecionados para uso como gabaritos de ponte de DNA. Em um exemplo, para o fim de testar a capacidade do sistema de discriminar entre cepas, seqüências alternativas para um dos gabaritos foram projetadas. As variantes diferem da molécula parental por substituições de nucleotídeos aleatórias para gerar variantes de 2%, 10% e 20%. A seleção da molécula de gabarito é baseada em especificidade calculada, parâmetros de condutividade e flexibilidade. As espécies e segmentos específicos para cepas foram escolhidos dentre uma impressão 5 digital de rRNA 16S e genes de virulência.

Em um exemplo, os quatro gabaritos e variantes de 150-200 pb selecionados foram sintetizados através de instalações de síntese de DNA comercialmente disponíveis. Os gabaritos e variantes de DNA de 150- 200 pb foram sintetizados em fragmentos de ssDNA de aproximadamente 50 pb. As 10 etapas de hibridização e ligação foram usadas para criar gabaritos de 150-200 pb de comprimento completo. Os gabaritos foram ligados em um vetor de clonagem de plasmídeo apropriado e uma biblioteca dos gabaritos de ponte de DNA foi gerada na preparação da produção de plasmídeos de escala grande. Opcionalmente, os candidatos de gabarito de 150-200 pb selecionados foram 15 excisados por digestos de endonuclease de restrição ou PCR amplificado e subclonado de DNA de Bacillus anthracis (Ames).

Em um exemplo, os gabaritos de ponte de DNA foram covalentemente fixados a superfícies de AFM e MEMS via ligações de biotina- estreptavidina e tiol-ouro. Os gabaritos de origem em plasmídeo 20 foram excisados com endonuclease de restrição, e rotulados extremidade de 5- iniciador /3- iniciador biotina/ tiol com kits comercialmente disponíveis. Em um exemplo, os gabaritos foram amplificados por PCR usando iniciadores rotulados com biotina e tiol.

Em um exemplo, os gabaritos e variantes de DNA foram verificados para integridade de seqüência através de serviços de seqüenciamento de DNA subcontratados comercialmente disponíveis. A especificidade de cada uma das moléculas foi verificada através de triagem Southem padrão contra DNA genômico de cepas de Bacillus anthracis (isto é, Ames, Steme, A2012, 1055, Vollum, Kruger) e estimulantes de anthrax (isto é, B. globiglii, B. cereus, B. subtilis, B. thuringiensis) adquiridos comercialmente de American Type Culture collection ou adquiridos através de um acordo de tratamento de material ou outros colaboradores.

Em um exemplo, microscopia de potência atômica (AFM) foi usada para medir propriedades físicas específicas (isto, deslocamento e condutividade) de fragmentos de ssDNA variante e B. anthracis. As pontas e platinas de AFM foram revestidas com ouro e estreptavidina e os gabaritos de ponte de DNA rotulados na extremidade com tiol/ biotina foram fixados. AS propriedades elétricas do material e deslocamento da ponta de AFM foram φ 10 medidas antes, durante e após a hibridização com moléculas de ssDNA variante e complementar e usadas como entrada em projeto do dispositivo MEMS. Em um exemplo, reagentes para controlar hibridização (tampões de pH, sais), desnaturação, hidrólise, e oxidação de nucleotídeos foram selecionados.

Em um exemplo, as técnicas de fabricação de MEMS são usadas para a construção dos chips sensores. Em um exemplo, a fabricação acarreta a deposição de películas finas de material sobre um substrato, aplicação de um máscara padronizada sobre o material usando métodos fotolitográficos e ataque químico seletivo do filme usando a máscara revelada 20 resultante. A deposição do material sobre o substrato (pastilhas de silício) é obtida por abordagens com base em reação química (deposição de vapor químico, epitaxia, eletro-deposição ou oxidação térmica) ou por abordagens à base de reação física (evaporação, borrifo ou moldagem). A remoção de materiais é obtida através de técnicas de ataque químico. Assim, a 25 circuitagem para o dispositivo, usando a aplicação de máscaras fotolitográficas padronizadas é construída usando aplicação apropriada de camadas de material isolante e condutor. A instalação de fabricação incorpora o chip na embalagem que, em um exemplo, inclui um alojamento de cerâmica ou plástico para o chip que inclui a superfície em pinos para fixação a uma placa de circuito impresso (PCB).

Em um exemplo, quando da fabricação de chips MEMS, os gabaritos de ponte de DNA são gerados e testados. Em um exemplo, os elementos móveis MEMS (extremidade de cantiléver) incluem ligações 5 covalentes de tiol/ ouro e biotina / estreptavidina. Uma fixação de molécula única foi obtida por atração eletrostática. Em um exemplo, o dispositivo aplica um potencial elétrico de 5 volts através do intervalo entre os elementos MEMS móveis onde se desejada um ssDNA amarrado, em série com um resistor de 10 ΜΩ. A molécula de ssDNA é fixada ao campo elétrico 10 resultante. Quando em proximidade íntima, as ligações biotina/ estreptavidina sobre a base do substrato são formadas, e as ligações ouro-tiol são formadas na extremidade livre do cantiléver. Quando uma molécula se fixa deste modo, o potencial através do intervalo é reduzido devido à resistência em série no circuito. Assim, uma única molécula de ssDNA se fixa em cada sítio. O DNA

em excesso que não se liga em ponte através dos circuitos MEMS é removido por digestos de exonuclease de DNA. O circuito é armazenado em tampões estabilizando DNA (isto é, 300 mM NaCl, 10 mM citrato de Na e EDTA 5 mM).

Em um exemplo, a medida de corrente na faixa de nano-amp é 20 realizada usando amplificadores de circuito integrado. Um amplificador de circuito integrado de multiplexação (IC) e outros eletrônicos e processamento são usados para mostrar os resultados dos eventos sensores. Os sinais analógicos tomados do chips MEMS são amplificados e convertidos em sinais digitais.

Em um exemplo, uma placa de circuito impresso inclui acomodações para a fixação do chip MEMS e chip IC. A placa também inclui um chip de processamento principal dedicado usado para realizar cálculos e operações elétricas de controle no PCB. O PCB contém interfaces elétricas para a exibição e a batería, assim como botões de menu. Em um exemplo, um programa executado pelo processador principal usa a saída de sinais digitais do IC para prover um monitor. A interface do usuário inclui controles para exibir e para configurar parâmetros que determinam as características do monitor, os valores de detecção de limiar, o nível da batería, liga/desliga e o 5 controle da purga da molécula de patógeno.

Em um exemplo, um alojamento plástico contém a placa de circuito impresso (e chips bio- e IC fixados), vias de fluxo de amostras, monitor LCD e botões de controle. Em um exemplo, as paredes internas do alojamento contém bordas e ranhuras para conter os componentes eletrônicos 10 e excluir o deslocamento dentro do alojamento. Em um exemplo, o alojamento inclui uma ou mais vias de fluxo para a introdução e remoção dos

reagentes e amostra.

Em um exemplo, a condução elétrica através dos sítios do sensor é maior do que 0,2 nA usando aparelho eletrônico AFM. Em um 15 exemplo, o circuito integrado provê amplificação de sinal analógico > 10 mV pico-a-pico.

Em um exemplo, o sensor é configurado para detectar e identificar DNA genômico preparado de cepas de Bacillus anthracis e simuladores de antrax (isto é, B. globigii, B. cereus, B. subtilis, B.

thuríngiensis), célula completa inativada rompida quimicamente e/ou mecanicamente (sonicada) e esporos das cepas e simuladores de antrax previamente mencionados, DNA e células completas / esporos na presença de contaminantes comuns e interferentes como poeira postal, componentes de solos, outras misturas químicas, e consórcios mistos de microorganismos.

Em um exemplo, o sistema inclui amplificação, processamento e exibição de sinais suficientes para detectar e identificar uma molécula alvo. Em um exemplo, os controles eletrônicos incluem liga/desliga, modo, controle de monitor, vida útil da batería, auto-teste e funções de reinicialização. Em um exemplo, o sistema inclui uma ou mais passagens de fluxo para liberar uma amostra preparada para a superfície de um sensor configurado para identificar um patógeno pré-determinado único, simuladores ou variantes alvo de DNA em uma solução de ruptura.

Em um exemplo, a amostra é coletada dentro do sistema 5 usando uma esfregadela superficial ou um coletor de ar de batelada.

O presente sistema inclui um método e aparelho para a determinação de presença, a identidade ou quantidade de uma substância alvo compreendendo analitos biológicos ou químicos. Em um exemplo, um circuito eletrônico incluindo pelo menos um braço dobrável de um cantiléver 10 bio-eletrônico é tratado na superfície para facilitar a ligação a uma molécula de polímero de gabarito que sofre uma mudança mensurável em um parâmetro físico em resposta a mudanças ambientais, como a presença de uma molécula alvo associada com uma substância alvo a ser detectada. Por exemplo, uma mudança na configuração física ou dimensões da molécula de 15 gabarito é traduzida em uma deflexão de um braço de cantiléver. Em um exemplo, uma mudança nas características elétricas através da molécula de gabarito é detectada por hibridização de um gabarito de ponte de DNA de filamento único para seu filamento complementar. Estas mudanças em propriedades ou parâmetros físicos são medidas para prover informação 20 relacionada com a presença e identidade de uma substância de interesse. Em um exemplo, vários destes circuitos unidos em ponte por moléculas de gabarito similares são providos e a informação relacionada à concentração ou quantidade da substância alvo pode ser obtida.

Em um exemplo, um microcircuito com uma geometria 25 dimensionada para uso dentro de um dispositivo de detecção de agente biológico é provido para a detecção da presença de substâncias ou agentes biológicos alvo e relacionados.

Como usado aqui, uma molécula de gabarito pode ser qualquer molécula que irá ligar, ou provavelmente responder à presença ou ligar a um

agente biológico ou um componente de um agente biológico.

Conseqüentemente, uma molécula de gabarito pode compreender uma molécula biológica de ocorrência natural ou formada sinteticamente que irá, ou é capaz de, responder seletivamente a, ou ligar, a uma molécula alvo associada com a substância alvo a ser detectada. Em um exemplo, a molécula de gabarito inclui um anticorpo, proteína, ácido nucleico, carboidrato, glicoproteína ou um polímero. Em um exemplo, a molécula de gabarito específica selecionada para detectar a presença de uma molécula alvo particular (ou espécie ou gênero de molécula alvo) é selecionada de modo que 10 a molécula de gabarito responde a ou se liga somente com a molécula alvo exata ou uma molécula alvo relacionada. Em um exemplo, uma corrente elétrica diferencial ou deslocamento físico resulta de um reconhecimento biomolécula - biomolécula entre o gabarito e marcação. Conseqüentemente, a relação entre uma molécula de gabarito e uma molécula alvo pode ser que os 15 filamentos complementares de ácidos nucleicos, incluindo ácido ribonucleicos (RNA) e ácidos deoxirribonucleicos (DNA) e moléculas derivadas. Outros exemplos da relação entre a molécula de gabarito e a molécula alvo incluem reconhecimento ácido nucleico - ácido nucleico, reconhecimento proteína proteína, reconhecimento proteína - ácido nucleico, reconhecimento proteína 20 carboidrato, reconhecimento ácido nucleico - carboidrato, e reconhecimento carboidrato - carboidrato.

Em um exemplo, um dispositivo de bio-detecção contendo o circuito descrito incluindo uma molécula de gabarito se estendendo em um intervalo entre as duas superfícies é provido. Em um exemplo, as duas 25 superfícies são móveis uma com relação à outra. Quando a molécula de gabarito é exposta a, ou ligada a uma molécula alvo, a molécula de gabarito sofre uma mudança dimensional, alterando a distância entre as duas superfícies. Conseqüentemente, um dispositivo de bio-detecção de acordo com esta forma de realização da presente invenção pode assinalar a presença de uma marcação ou agente biológico relacionado ou substância quando uma mudança na distância entre as duas superfícies é detectada.

Em um exemplo, a quantidade pela qual a distância entre as superfícies é alterada é indicativa da molécula exposta a ou ligada à molécula 5 de gabarito. Por exemplo, uma molécula alvo que está em uma equiparação exata para a molécula de gabarito (isto é, “uma molécula alvo exata”) pode resultar no encurtamento da distância entre os pontos da molécula de gabarito interconectada com as duas superfícies por uma quantidade que é maior do que o encurtamento que ocorre quando a molécula de gabarito é ligada a uma 10 molécula que está relacionada com mas não em equiparação exata para a molécula de gabarito. Conseqüentemente, ao medir a quantidade pela qual a distância entre as duas superfícies foi mudada, a informação relacionada com a identidade da molécula ligada à molécula de gabarito é obtida.

Em um exemplo, um dispositivo de bio-detecção contendo o circuito descrito capaz de medir a condutividade através de uma molécula de gabarito é provido. Em particular, uma molécula de gabarito é interconectada a um primeiro e segundo eletrodos, de modo que se estende no intervalo entre os dois eletrodos. Quando a molécula de gabarito é ligada a uma molécula alvo, a condutividade entre os eletrodos é alterada. Conseqüentemente, ao 20 detectar uma mudança na condutividade entre os eletrodos, a presença de uma molécula alvo ou molécula relacionada pode ser detectada. Além disso, a quantidade pela qual a condutividade entre os eletrodos muda é indicativa da molécula ligada à molécula de gabarito. Por exemplo, uma molécula alvo exata irá causar uma maior mudança na condutividade observada entre os 25 eletrodos do que irá uma molécula alvo ligada à molécula de gabarito que está relacionada mas não idêntica à molécula alvo exata.

De acordo com uma forma de realização da presente invenção, um dispositivo de detecção pode ser re-usado, sem requerer a substituição de componentes, é provido. Particularmente, ao aquecer a molécula de gabarito, a molécula alvo ou relacionada pode ser dissociada da molécula de gabarito. De acordo com uma forma de realização da presente invenção, o aquecimento da molécula de gabarito é obtido por passagem de uma corrente através da molécula de gabarito (e a molécula ligada). Além disso, o processo de 5 dissociação da molécula alvo da molécula de gabarito pode ser usado para obter informação relacionada com a identidade da molécula alvo. Particularmente, a corrente aplicada através da molécula de gabarito (e molécula alvo) pode ser aumentada uniformemente ou aumentada em etapas, até se observar uma mudança súbita na condutividade, que indica que a 10 molécula alvo foi dissociada da molécula de gabarito. Porque a corrente, e assim calor, necessária para desprender a molécula alvo está relacionada em como está a molécula alvo intimamente equiparada com a molécula de gabarito, a quantidade de corrente requerida para desprender a molécula alvo é uma indicação da proximidade da equiparação entre a molécula ligada e a 15 molécula alvo. Por exemplo, uma molécula alvo exata seria esperada como requerendo mais energia para se desprender da molécula de gabarito do que seria uma molécula que não é idêntica à molécula alvo.

Em um exemplo, um dispositivo de detecção de agente biológico contendo o circuito descrito combinando vários mecanismos ou 20 técnicas de detecção é provido. Por exemplo, um dispositivo de detecção pode determinar a presença de um agente biológico alvo por detecção de uma mudança dimensional experimentada por uma molécula de gabarito, por detecção de uma mudança na condutividade através de uma molécula de gabarito ou por determinação da quantidade de corrente requerida para 25 desprender uma molécula alvo da molécula de gabarito. Além disso, a informação para a identificação da molécula alvo pode ser provida usando mecanismos ou técnicas.

De acordo com uma forma de realização da presente invenção, um método para detectar substâncias alvo ou analitos por detecção de uma mudança em uma dimensão física associada com a molécula de gabarito é provido. De acordo com este método, uma molécula de gabarito que sofre uma mudança na dimensão física quando ligada a uma molécula alvo é exposta a um agente biológico suspeito ou substância alvo (isto é, uma 5 substância que se suspeita contenha a molécula alvo). O agente biológico suspeito pode ser derivado de meio gasoso, líquido ou sólido. SE a molécula alvo exata ou molécula relacionada se ligar à molécula de gabarito, a mudança dimensional resultante na molécula de gabarito é detectada, e a mudança registrada. De acordo com uma outra forma de realização, o método 10 inclui medir a quantidade pela qual a dimensão física da molécula de gabarito foi mudada.

Em um exemplo, um método para detectar uma substância alvo por sentir uma mudança na condutividade associada com a molécula de gabarito na presença do analito é provido. Uma molécula de gabarito capaz de 15 ligar seletivamente a uma molécula alvo exata ou molécula alvo relacionada é exposta a um agente biológico suspeito. De acordo com o método, a condutividade através da molécula de gabarito é monitorada. Ao se tomar ligada a uma molécula alvo, a mudança resultante na condutividade através da molécula de gabarito é detectada, e esta mudança é registrada. Em um 20 exemplo, a mudança em condutividade é medida.

Em um exemplo, um método para detectar a presença de um agente biológico suspeito por determinação da quantidade de energia requerida para desprender uma molécula alvo de uma molécula de gabarito é provido. Uma corrente elétrica é passada através do par de molécula de 25 gabarito - molécula alvo. Além disso, a amplitude da corrente pode ser aumentada até uma mudança súbita na condutividade através a molécula de gabarito ser observada, indicando que a molécula alvo se tomou desprendida da molécula de gabarito. Além disso, a corrente em que a molécula alvo é desprendida da molécula de gabarito é usada para caracterizar ou identificar a

molécula alvo que estava ligada à molécula de gabarito.

O presente sistema refere-se à detecção e identificação de analitos biológicos. De acordo com a presente invenção, as moléculas biológicas alvo são detectadas ao se sentir uma mudança na molécula de 5 gabarito biológica. A mudança na molécula de gabarito biológica pode incluir uma mudança em uma dimensão física da molécula de gabarito, uma mudança na condutividade elétrica observada através da molécula de gabarito e/ou a energia requerida para dissociar uma molécula alvo da molécula de gabarito. A grandeza da mudança em uma dimensão física, mudança na 10 condutividade, ou quantidade de energia requerida para dissociar uma molécula alvo de uma molécula de gabarito, podem ser medidas para determinar o grau de homologia entre a molécula alvo e a molécula de gabarito. Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método de detecção e aparelho que não requer a substituição de componentes a fim de 15 fazer leituras múltiplas.

Em um exemplo, um circuito eletrônico é ligado em ponte por uma molécula de gabarito incluindo um componente biológico ou uma representação do componente biológico. Em um exemplo, o circuito inclui uma estrutura à base de MEMS unida em ponte por uma molécula de ácido 20 nucleico, como uma molécula de DNA, ou uma molécula que fisicamente e quimicamente representa uma molécula de DNA de filamento único. Em um exemplo, o circuito MEMS sente e responde ao movimento e condutividade de uma molécula de DNA ligada em ponte à medida que hibridiza com um filamento de DNA complementar ou quase complementar.

O seguinte descreve a seleção e projeto de componentes biológicos do circuito bio-eletrônico.

Como usado aqui, a especificidade do dispositivo de detecção e identificação biológica se refere à capacidade de um sistema de identificar especificamente e precisamente um gênero, espécie e cepa particulares de um agente biológico alvo. No caso de detectores/ identificadores biológicos à base de DNA, o termo especificidade se refere às vezes com a capacidade dos componentes de DNA do sistema de especificamente complementar e hibridizar no DNA isolado do agente biológico. A fim de melhorar a 5 especificidade de detecção e identificação, aqui, segmentos de DNA do agente biológico múltiplos (em um exemplo, mais do que três) são selecionados. A seleção do segmento de DNA é baseada nos parâmetros de comprimento, especificidade, condutividade calculados e flexibilidade da molécula para se unir em ponte ao circuito MEMS. Segmentos de DNA mais 10 longos tendem a reter uma maior especificidade (seqüência de DNA que é singular para a marcação do agente biológico específico) e ainda os segmentos de DNA mais curtos permitem a seleção de regiões de elevado teor de guanina (G) e citosina (C). A composição e seqüência global de GC estão relacionadas com as características de isolamento de adenina (A) e timina (T). 15 Além disso, um elevado teor de AT em DNA leva a uma falta de flexibilidade

e curvatura molecular global, dependendo do posicionamento relativo de regiões ricas em AT (isto é, fase com a rotação helicoidal). Assim, segmentos de DNA selecionados podem ser maiores do que 40% GC, ou maiores do que 60% GC. Em um exemplo, o comprimento do segmento de DNA é menor do 20 que 500 pares de base (pb), ou menos que 150- 200 pares de bases (pb). A determinação da composição de GC, DNA, seqüência, flexibilidade, curvatura e especificidade é determinada através do número de software privado, comercial ou público, como PubMed BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Em um exemplo, quatro segmentos de gabarito de DNA são 100% homólogos 25 para Bacillus anthracis (Ames) e mostram uma menor homologia para outras espécies e cepas de Bacillus. Os segmentos específicos para espécies e cepa foram escolhidos dentre os genes de virulência de impressão digital 16S rRNA. Nesta forma de realização, os microorganismos fora do gênero Bacillus estão abaixo de limites de detecção e identificação precisas. Em um exemplo, uma matriz inclui MEMS unido em ponte a DNA tendo componentes de DNA que tem uma especificidade para outros agentes biológicos e, em um exemplo, é capaz de monitorar continuamente para a presença de agentes simultaneamente.

O seguinte descreve a produção dos componentes biológicos do circuito bio-eletrônico.

Em um exemplo, regiões de DNA específicas do agente biológico marcado são selecionadas, geradas, produzidas em massa e quimicamente modificadas para fins de aderência a um circuito MEMS. Além 10 disso, variantes das regiões de DNA são também geradas e produzidas para o fim de testar o circuito proposto para capacidades de discriminação. Em um exemplo, uma variante é uma molécula de DNA que difere de um gabarito de DNA selecionado em composição de nucleotídeos e seqüência em 2% a 30%. Em um exemplo, quatro segmentos de 150-200 pb selecionados são ou 15 sintetizados, ampliados por PCR, ou subclonados de um agente biológico marcado real. Síntese de DNA de alta fidelidade é geralmente limitada a fragmentos de ssDNA de aproximadamente 50 pb que então requerem etapas de hibridização e ligação a fim de criar os gabaritos de DNA de 150-200 pb de comprimento completo desejado. Os gabaritos de DNA completados são 20 então fixados diretamente a superfícies de condutores de MEMS se os fragmentos sintetizados de iniciador 5 e iniciador 3 de aproximadamente 50 pb foram especificamente rotulados com ligandos de fixação. Altemativamente, os gabaritos de 150-200 pb completados são ligados em um vetor de clonagem de plasmídeo e uma biblioteca dos gabaritos de ponte de 25 DNA é gerada em preparação para a produção em massa. Em um exemplo, as regiões de DNA selecionadas escolhidas para ligar em ponte os condutores do circuito MEMS podem ser excisadas por digestos de endonuclease de restrição ou amplificados por PCR, e subclonados do agente biológico marcado.

O seguinte descreve a verificação de integridade do componente biológico.

Em um exemplo, as variantes e gabaritos de ponte do circuito de DNA são verificados para integridade da seqüência. A integridade da seqüência refere-se à seqüência de nucleotídeo real como comparada com a seqüência desejada. Os métodos de seqüenciamento de DNA irão revelar a seqüência de nucleotídeos exata das moléculas destinadas a serem rotuladas e fixadas às superfícies de condutores de MEMS. O presente assunto é sensível a desacordos do par de base único, assim, qualquer variação de seqüência 10 deve ser considerado.

O seguinte descreve teste e análise de aspectos bioquímicos e físicos do componente biológico.

Em um exemplo, moléculas de ssDNA específicas são selecionadas, produzidas em massa, e usadas para ligar em ponte os 15 elementos móveis de um circuito MEMS. A seleção das moléculas de ssDNA específicas é baseada em vários aspectos biofísicos como comprimento, composição de nucleotídeo e seqüência, flexibilidade e movimento mecânico e parâmetros de condutividade. O movimento calculado e parâmetros de condutividade são verificados por microscopia de potência atômica (AFM) 20 que pode medir as propriedades físicas específicas (isto é movimento molecular como determinado por deslocamento da ponta e condutividade) do gabarito de ponte de ssDNA e fragmentos de ssDNA variante. As pontas e platinas de AFM com ouro e estreptavidina de acordo com os procedimentos publicados são ligados em ponte por gabaritos de ligação em ponte de DNA 25 rotulado na extremidade com tiol/ biotina. O deslocamento da ponta de AFM e as propriedades elétricas do material são medidas antes, durante e subseqüente à hibridização com moléculas de ssDNA complementares e variantes como entrada no projeto do dispositivo MEMS.

Os meios operacional, químico e de temperatura podem ser considerados para gabaritos de ponte de ssDNA específicos. Por exemplo, reagentes para controlar os efeitos do meio operacional definido pelo usuário, temperatura operacional, e hibridização específica para DNA (tampões de pH, sais), desnaturação, hidrólise e oxidação de nucleotídeos podem ter um efeito.

Em um exemplo, reagentes operacionais incluem:

a. Sais, pH, temperatura

b. controle de hidrólise: condutividade através de meios aquosos pode induzir hidrólise que poderia afetar a condutividade através dos meios. Controle deste efeito através da adição de reagentes apropriados.

^10 c. controle de oxidação: condutividade através de DNA pode induzir dano oxidativo, particularmente aos resíduos de guanina. O controle deste dano oxidativo através da adição de antioxidantes (isto é, ácido ascórbico, ácido cítrico).

d. fatores de estabilidade térmica de DNA (isto é, 0,5 - 3 betaínas molares (Ν,Ν,Ν- trimetilglicina, (Rees et al, Biochem. (1993), 32: 137- 144).

e. reagentes de desnaturação (isto é, acetato de tetraetila 2-4 molar, uréia, sais caotrópicos (isto é, tricloroacetato, perclorato, tiocianatos, e fluoroacetatos) ou glicerol, formamida, formaldeído, e dimetilsulfóxido t 20 (DMSO).

£ acelerantes de hibridização para melhorar a hibridização DNA a DNA através do fenômeno de exclusão molecular. Os acelerantes exemplares incluem misturas de sais acetato e álcoois, algumas aminas (espermina, espermidina, polilisina), detergentes 0,1 - 0,5 molares (brometo 25 de dodecil trimetilamônio, e brometo de cetiltrimetil amônio) e proteínas pequenas específicas como proteína de ligação de filamento único.

O seguinte descreve a verificação de especificidade de DNA.

Em um exemplo, os gabaritos e variantes de ponte do circuito de DNA são verificados para especificidade da seqüência. A análise de software do fragmento de DNA selecionado pode demonstrar a especificidade do fragmento para uma região de uma cepa de um agente biológico marcado que pode ser confirmado através da triagem da especificidade do bioagente. Um exemplo destes métodos inclui triagem Southem em que vários 5 fragmentos digeridos por restrição do genoma alvo do bioagente (e qualquer outra espécie relacionada suspeita) são resolvidos de modo eletroforético e transferidos para um substrato sólido (isto é, náilon ou nitrocelulose. Os fragmentos de DNA genômico fixos podem ser então incubados com DNA de gabarito de ponte de DNA rotulado (isto é, com fluorescência ou radioativo).

Sob condições apropriadas, (isto é, temperatura, pH e concentração de sal), o DNA gabarito irá hibridizar em um fragmento único (considerando que os digestos de restrição de DNA genômico não cortem o fragmento). Sítios múltiplos de hibridização do gabarito de DNA para o DNA genômico podem acarretar modificação de condições no dispositivo de bio-detecção ou seleção

de um novo DNA de gabarito.

O seguinte descreve a rotulação da extremidade do gabarito de ligação em ponte de DNA. *

Em um exemplo, fragmentos de DNA sintetizado, amplificado por PCR ou clonado, (selecionado dentre condutores de circuito MEMS de 20 ponte) são fixados a superfícies MEMS por qualquer um dos vários métodos com referência à fixação de DNA em superfícies orgânicas ou inorgânicas. Em um exemplo, a imobilização específica pra orientação é obtida quando porções químicas únicas sobre os términos do gabarito de ponte de DNA e superfície de condutores de MEMS são reticulados. Os reticuladores 25 específicos para porção química comercialmente disponíveis são geralmente baseados em uma química de substituído nucleofilica. Esta química geralmente envolve um deslocamento direto de um grupo de saída por um ataque químico de nucleófilos. Em um exemplo, os condutores de circuito MEMS incluem condutores revestidos com ouro e estreptavidina respectivamente. Em uma forma de realização, os gabaritos de ponte de ssDNA são covalentemente fixados em superfícies de AFM e MEMS via ligações biotina - estreptavidina e tiol - ouro. Os fragmentos de DNA são rotulados na extremidade com 5- iniciador / 3 - iniciador biotina / tiol com

kits comercialmente disponíveis ou por quaisquer outros meios de rotulação ou funcionalização das extremidades 5 ’ e 3 ’ de DNA. As químicas de fixação podem incluir mas não são limitadas a grupos amino (como ésteres de Nhidróxi- succinimidila), polietileno glicóis, carbodiimida, grupos tiol (como maleimida ou a-haloacetila), grupos organo-silano, ou biotina 10 estreptavidina. Em um exemplo, os fragmentos de DNA são sintetizados com nucleotídeos 5’ e 3’ modificados com biotina e estreptavidina, ou amplificados por PCR com iniciadores rotulados com biotina / estreptavidina a partir de marcações de DNA genômico ou de origem em plasmídeo.

O seguinte descreve um exemplo de fabricação de MEMS.

Em um exemplo, os sistemas microeletromecânicos (MEMS) se referem a tecnologia usando estruturas móveis pequenas construídas no milionésimo de uma escala métrica (mícrons). Estas estruturas são feitas através do uso de várias ferramentas e metodologias, similares às usadas na fabricação de circuitos integrados (IC). Os dispositivos MEMS, em um 20 exemplo, incluem combinações de elementos mecânicos e elementos elétricos, e quando da fabricação, são colocados em uma embalagem com pinos que permite a fixação através de um soquete em uma placa de circuito impresso (PCB).

O seguinte descreve a construção em camadas de MEMS.

Em geral, a fabricação de um dispositivo MEMS envolve a deposição de películas finas de material sobre um substrato, a aplicação de uma máscara padronizada sobre o material usando métodos fotolitográficos e o ataque químico seletivo do filme usando a máscara revelada resultante. A deposição do material sobre o substrato (geralmente pastilhas de silício) pode ser obtida por abordagens com base em reação química (deposição de vapor químico, epitaxia, eletro-deposição ou oxidação térmica) ou por abordagens à base de reação física (evaporação, borrifo ou moldagem). Cada uma destas varia em velocidade, precisão e custos do processo; o material aplicado pode 5 ser de vários nanômetros a cerca de 100 mícrons. A aplicação do padrão envolve a colocação de um material fotossensível sobre a superfície, localizando a máscara padronizada sobre a superfície (tipicamente com a ajuda de marcas de alinhamento sobre a superfície e máscara), e exposição do material fotossensível através da máscara. Dependendo do processo usado, ou 10 o positivo ou o negativo do material exposto pode ser removido, deixando o padrão sobre o material substrato. Outros procedimentos incluem a preparação da superfície, revelação do filme fotossensível e limpeza do resultado.

A fabricação do elemento MEMS pode ser realizada usando técnicas de micro-fabricação. Em um exemplo, as técnicas litográficas são empregadas na fabricação usando procedimentos de fabricação de semicondutores, como ataque químico fotolitográfíco, ataque químico de plasma, ou ataque químico úmido, em substratos de vidro, quartzo ou silício.

A remoção de materiais é tipicamente obtida através de um ataque químico úmido, em que o material é dissolvido quando imerso em uma solução química, ou ataque químico a seco, em que o material é removido em um processo essencialmente oposto de deposição à base de uma reação física. Como com relação às várias abordagens para deposição, velocidade, precisão, e custo variam com a abordagem. Em um exemplo, o ataque químico de bolsas “profundas” de um substrato é realizado com relações de aspecto da parede lateral de 50 para 1.

O dispositivo MEMS pode ser fabricado com um ou mais elementos móveis, através dos quais será fixada a molécula de gabarito de ssDNA. O elemento móvel, por exemplo uma viga de cantiléver, pode ser construído de modo que tanto a viga como o substrato abaixo da extremidade livre da viga contém pelo menos uma camada condutora. Assim, a circuitagem para o dispositivo, usando máscaras fotolitográfícas padronizadas, pode ser construída usando uma aplicação apropriada de camadas de material isolante e condutor. Em um exemplo, a geometria permite o fluxo de amostra de um MEMS ligado em ponte a DNA ao próximo e re-circulando para melhorar a probabilidade de contato e para conservar os reagentes. Uma forma de realização inclui um circuito eletrônico construído em um suporte composto de tais materiais como, mas não são limitados a 10 substratos de vidro, quartzo, silício e vários poliméricos, por exemplo plásticos.

Em um exemplo, várias camadas isolantes são providas sobre o substrato. Em um exemplo, o material sólido que conduz ao suporte e resposta às propriedades moleculares descritas (isto é, condutividade e 15 movimento) é usado para construir o dispositivo. Apesar das figuras da presente descrição poderem mostrar um posicionamento plano do circuito, outras formas de realização incluem outra orientação (isto é, vertical, etc).

Um exemplo inclui elemento(s) planar(es) adicionais que se sobrepõem aos canais e cavidades para encerrar e vedar para formar condutos. 20 Esta superfície planar adicional é fixada por adesivos, colagem térmica, ou adesão natural na presença de alguns substratos hidrofílicos ou carregados.

Em um exemplo, a coleta e preparação de amostras é completada fora do dispositivo. As amostras são coletadas das superfícies usando chumaços ou almofadas e coletadas em ar ou líquido por aspiração 25 através de filtros, coletores de líquido ou resmas de cromatografia. As amostras são preparadas pela adição dos reagentes para romper o agente biológico, liberar as moléculas alvo e preparar estas moléculas para serem sentidas pelo dispositivo. A amostra preparada é então introduzida no dispositivo através de um canal de fluxo, cavidade ou duto por seringa, pipeta, conta-gotas ou outro meio manual ou automatizado.

Um exemplo inclui aquisição e preparação de amostras de ar no próprio dispositivo para operação automática através da presença de um sistema de aspiração de ventilador incorporado. Um exemplo inclui coleta de 5 amostra de líquido automatizada e preparação no dispositivo. A ruptura das amostras pode ser provida por meios mecânicos, como técnicas de sonicação.

Em um exemplo, a amostra é liberada através de uma via de fluxo incorporada no dispositivo na superfície do biochip. O dispositivo inclui cavidades de reagentes para a preparação de amostra, assim como para a 10 limpeza do sistema, calibragem do dispositivo e coleta de material de refugo.

Em um exemplo, o dispositivo inclui meios de bombeamento de materiais para dentro e para fora das cavidades. Em um exemplo, o dispositivo recircula os reagentes através do sistema se nenhum evento sensor positivo tiver ocorrido e o reagente permanecer de uma pureza apropriada.

Em um exemplo, as sequências de oligonucleotídeos são colocadas em camadas sobre os condutores para auxiliar no posicionamento e orientação dos gabaritos em ponte de DNA. Geralmente, a hibridização dirigida por oligonucleotídeos de DNA através de um circuito é usada para orientar e posicionar o gabarito de ponte de DNA de filamento único 20 (ssDNA). Em um exemplo, o gabarito de ponte de ssDNA é ligado aos condutores de MEMS via qualquer método de fixação, incluindo ligações mediadas por tiol ou biotina.

Os circuitos MEMS unidos em ponte a DNA múltiplos podem estar posicionados em um chip único em uma geometria de matriz ou 25 ordenada a fim de permitir a detecção e a identificação simultânea de múltiplos patógenos de uma mesma amostra. Em um exemplo, a matriz inclui repetições múltiplas de MEMS ligado em ponte a DNA idêntico a fim de permitir uma medida de concentração de moléculas de DNA alvo como uma função do número de circuitos “estimulados” por volume de amostra.

O seguinte descreve a ligação em ponte dos elementos móveis de MEMS.

Após fabricar o dispositivo MEMS físico contendo os elementos móveis e a circuitagem, a molécula de ssDNA única de interesse (a 5 molécula de gabarito) é fixada ao dispositivo. Em um exemplo com uma viga de cantiléver, o ssDNA é fixado à extremidade livre do cantiléver à base do substrato embaixo do cantiléver. Em um exemplo, as superfícies são preparadas de modo que as extremidades funcionalizadas do ssDNA gabarito irão se fixar na superfície. O ssDNA é funcionalizado com um grupo tiol em ^10 uma extremidade (que tem uma elevada afinidade para a superfície de ouro) e biotina, por outro lado (que tem uma elevada afinidade para uma superfície revestida com estreptavidina). Assim, se ouro for usado sobre o condutor na superfície de fundo do cantiléver, a extremidade funcionalizada com tiol do ssDNA irá se fixar ao mesmo. Uma superfície de ouro sobre o substrato 15 embaixo da extremidade livre do cantiléver também ficará exposta. Antes da introdução do gabarito de ssDNA a ser ligado, biotina é depositada de modo eletrostático sobre a superfície de ouro no substrato. A estreptavidina é introduzido sobre a pastilha, que liga à superfície biotinilada sobre o substrato. Conseqüentemente, as superfícies do dispositivo MEMS são ® 20 preparada para se ligar ao gabarito de ssDNA.

O seguinte descreve a captação eletrostática de um gabarito de molécula ligado em ponte que, em um exemplo, inclui a fixação de uma molécula de ssDNA única através do intervalo entre a extremidade livre do cantiléver e a base do substrato preparado embaixo do mesmo. Em um 25 exemplo, um potencial elétrico é aplicado através do intervalo, em série com um resistor grande. A molécula de ssDNA é atraída ao campo elétrico resultante. Quando em proximidade íntima, as ligações de biotina estreptavidina sobre a base do substrato são formadas, e as ligações de ourotiol são formadas na extremidade livre do cantiléver. Logo que uma molécula se fixa deste modo, o potencial através do intervalo é vastamente reduzido devido à resistência em série no circuito. Assim, somente uma molécula de ssDNA irá se fixar em cada sítio. “Field assisted attraction of ssDNA to

MEMS lead arms - device to aide in single molecule attachment. Electrostatic 5 trapping of single conducting nanoparticles between nanoelectrodes. Appl.

Phys. Lett. 71 (9).

O seguinte descreve a remoção de moléculas de gabarito em excesso.

Em alguns casos, mesmo se somente um filamento for fixado 10 através do intervalo, um número de ssDNA pode ser amarrado ou à superfície de ouro ou à biotinilada. Estes “parasitas” tem o potencial de ligar indesejavelmente seqüências de ssDNA de patógeno alvo. Em um exemplo, o dispositivo é tratado com exonuclease, para remover todo o ssDNA não amarrado em ambas as extremidades, assim eliminando o potencial de 15 eventos de ligação em outros sítios sensores.

Em um exemplo, o sistema incorpora elementos móveis adicionais, unidos em ponte ou com moléculas sintéticas ou biológicas, que atuam como uma referência ou controles de linha de base para a eliminação de efeitos de fundo mecânico, elétrico ou químico, como temperatura, 20 pressão, movimento, voltagem de parasita, campos elétricos induzidos e/ou contaminantes químicos de amostra. Em um exemplo, um dispositivo inclui milhares de sítios de referência e sensores em um chip MEMS. Os sítios sensores podem todos incluir elementos biológicos para detectar a presença de um único bioagente, ou podem incluir vários elementos biológicos para 25 permitir a detecção simultânea de numerosos bioagentes em um único biochip.

O seguinte descreve a integração do circuito MEMS em sistemas de amplificação de sinal, processamento e exibição. A medida da corrente em uma faixa de nanoamp requer amplificadores de circuito integrado. Em um exemplo, amplificadores de multiplexação e de circuito integrado (Cl) e outros dispositivos eletrônicos e de processamento são usados para mostrar os resultados dos eventos sensores. Um circuito integrado é usado para amplificar sinais analógicos do chip MEMS e converter os 5 mesmos em sinais digitais. Em um exemplo, a fabricação de circuito integrado incorpora o circuito integrado no pacote o que permite que a fixação por pinos do circuito integrado a uma placa de circuito impresso (PCB). Além de prover a fixação do MEMS e chips do circuito integrado, a placa PCB inclui um processador principal para realizar os cálculos e operações elétricas 10 de controle na placa PCB. A placa PCB inclui uma interface elétrica para o monitor e a batería, assim como entrada/ saída para os botões do menu. Em um exemplo, o processador é programado para usar a saída dos sinais digitais do circuito integrado para prover o monitor. A interface com o usuário inclui controles diretos do monitor, e controles para configurar parâmetros que 15 determinam as características do monitor, os valores de detecção de limiar, nível de bateria, liga/desliga e controle de purga da molécula de bioagente. Em um exemplo, a placa PCB, monitor, interface do usuário, bateria e entrada/ saída são integrados em um alojamento de plástico ou metal.

O seguinte descreve teste e análise de um sistema de exemplo.

Um exemplo requer coleta de amostra, processamento e liberação para a circuitagem eletrônica.

a. Coleta de amostra: o procedimento para coleta de amostra de ar, líquido ou sólido é baseado na fonte de molécula alvo e o meio de trabalho do instrumento. Por exemplo, partículas de tamanho, massa ou carga 25 apropriados podem ser isoladas e coletadas por filtração e/ou métodos de espectrometria de massa. Os agentes biológicos ou químicos captados nos filtros podem ser eluídos por reagentes de preparação de amostra e liberados ao instrumento. Em um exemplo, a tecnologia de aspiração do instrumento é empregada para arrastar ou forças amostras de ar através dos reagentes de

preparação de amostra que subseqüentemente são entregues ao chip de detecção.

b. Preparação de amostra. Em um exemplo, amostras de ar, líquido ou sólido são preparadas extemamente ao dispositivo de detecção ou intemamente via tecnologias de preparação de amostra automáticas. As etapas

e reagentes específicos para a preparação da amostra dependem das moléculas de fonte e alvo a serem detectadas e identificadas. Os meios químicos, térmicos e/ou mecânicos são usados para romper os conteúdos biológicos das células e liberar as moléculas alvo. Meios similares são usados para preparar fontes orgânicas ou inorgânicas previamente preparadas de moléculas alvo. Geralmente, a ruptura de células biológicas requer detergentes que solubilizam membranas de lipídeos, digestão enzimática de proteínas associadas com membranas de células ou moléculas alvo, e vários desnaturantes que modificam ou de outra forma preparam as moléculas alvo para detecção e identificação. Os meios mecânicos incluem sonicação ou agitação, sozinhos ou na presença de contas de ruptura. Em um exemplo, filtração ou métodos de cromatografia são usados para purificar as moléculas alvo com base em tamanho, hidrofilicidade, carga ou afinidade do ligando. Em um exemplo, o sistema é resistente aos componentes associados à fonte alvo e outros contaminantes ambientais (isto é, sais, poeiras, solventes ou reagentes especificamente adicionados para inibir a detecção ou identificação apropriados. Em um exemplo, o sistema é sensível a quantidades de traço da molécula alvo associada com a amostra. Em um exemplo, o sistema detecta e identifica fragmentos de DNA específicos encontrados em, sobre a superfície de, ou de outra forma associados com a fonte de DNA (isto é, micróbio, célula de animal, vírus). Em um exemplo, o DNA de filamento duplo é fragmentado e desnaturado.

c. Liberação de amostra ao microchip.

d. Detecção, identificação e ocorre discriminação.

e. Resultado exibido no dispositivo.

Exemplos de aplicações para o presente sistema incluem medição de detecção em tempo real, identificação, discriminação e concentração de componentes derivados de fontes incluindo, mas não 5 limitadas a animais, bactérias, vírus, fungos, plantas, arqueas, encontrados no solo, água ou ar. Exemplos de componentes incluem, mas não estão limitados a ácidos orgânicos (isto é, compostos de ácidos nucleicos, aminoácidos ou carboidratos, etc.) ou inorgânicos (isto é, metais, fosfatos inorgânicos, etc.) relacionados a patógenos humanos, de planta ou de animal, componentes e 10 fontes de interesse em segurança de alimentos, componentes e fontes de interesse em doenças médicas, seqüências genéticas associadas com predisposição às doenças, diagnósticos pré-sintomáticos de doenças em plantas e animais, ferramenta de diagnóstico de laboratório de componentes listados ou fontes, uma ferramenta de laboratório para monitorar expressão de 15 gene de RNA específico e identificação de animais específicos ou pessoas através da identidade do polimorfismo.

Além da interação DNA-DNA, outras alternativas são contempladas, incluindo:

Proteína-Proteína

1) Interação prion - proteína com outros prions. Encefalopatia espongiforme bovina (BSE, também conhecida como doença da vaca louca), é uma doença neurodegenerativa em gado, e ingestão de produtos de carne infectados causa a doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD e vCJD) em humanos. Variações de BSE são identificadas em espécies de animais e todas são 25 classificadas como encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs). BSE em gado, ou CJD em humanos, resulta quando uma proteína neural, chamada um prion, muda a forma de sua forma normal para uma forma infecciosa duplicada de modo incorreto. Os prions infecciosos duplicados de modo incorreto então induzem outras proteínas prions também a duplicarem-se de

modo incorreto. O presente sistema pode detectar a conformação física de um prion normal na forma infecciosa. Em um exemplo, uma proteína prion normal é fixada via resíduos de histidina ou cisteína expostos na superfície a superfícies MEMS revestidas com ouro, níquel ou platina.

2) Interação anticorpo-antígeno. Em um exemplo, os elementos móveis de um circuito MEMS são ligados em ponte com uma representação produzida naturalmente ou sintética do sítio de ligação de antígeno de um anticorpo que é específico em um antígeno de um agente inorgânico ou biológico particular. Em um exemplo, a molécula de 10 aminoácidos representando o sítio de ligação de antígeno é fixada às superfícies MEMS móveis via o procedimento químico similar indicado acima para prions. A interação de antígenos de bio-agentes com sítios de ligação de antígeno ligados em ponte induz uma mudança estrutural no elemento ligado em ponte, criando, assim, um sinal mensurável.

Proteína-Carboidrato (formação de glicoproteína)

1) Interações entre epítopos de carboidrato extra celulares e proteínas receptoras podem ser detectadas e analisadas. Exemplos destes processos biológicos incluem infecções virais e bacterianas. Um modelo exemplar é a proteína (Canavalia ensiformis) de feijão Jack, concanavalina A 20 (con A), com açúcares de manose (Acta Crystallogr., Sect. D 50 pp. 847 (1994)). Um exemplo inclui ligação em ponte de elementos móveis de um circuito MEMS com Con A via resíduos de histidina ou cisteína. Amostras

contendo glicose ligam e alteram a configuração dimensional da proteína Con A, gerando, assim, um sinal para o sistema. O presente sistema incluindo este circuito pode detectar a presença e a concentração de resíduos de glicose no caso de controle de diabetes.

2) O glicolipídeo globotriaosil ceramida, expressado em superfícies de células do rim, atua como o receptor para a toxina 1 como Shiga (SLT1), um membro das toxinas bacterianas de dois componentes, através de interações de ligação entre a subunidade de ligação ^ζΒ’ pentamérica da proteína.

Carboidrato-Carboidrato

Interações célula a célula e forças de adesão de célula são 5 algumas vezes associadas com interações de carboidrato com outros carboidratos ou glicoproteínas (J. Cell. Biol., 24 de maio de 2004; 165 (4): 529-37. 17 de maio de 2004). A co-interação de glicosfingolipídeo (GSL) parece desempenhar um papel em adesão de célula de melanoma de camundongo. Um exemplo de sistema inclui a criação de estruturas de 10 glicoproteína com sítios de ligação de GSL para o fim de monitorar o crescimento de células de câncer.

Em um exemplo, um sistema de detecção biológica/ identificação requer a coleta de amostras, liberação e processamento de amostras, tecnologia de análise de amostras e processamento e saída de sinal.

A resistência de um filamento de DNA e comprimento dependem da composição da base, seqüência e ambiente. Em média, o diâmetro de dsDNA é de 20 Angstroms (Â) e a distância entre nucleotídeos adjacentes 3,4 Â ou aproximadamente 34 Â para uma rotação helicoidal total. A hélice de dsDNA demonstra duas ranhuras; a ranhura menor (~ 12 20 Angstroms) e ranhura maior (~ 22 Angstroms). A distância entre nucleotídeos adjacentes de ssDNA, no entanto, é aproximadamente 5,84 angstroms.

CONTRAÇÃO MOLECULAR

O primeiro fenômeno físico está relacionado à forma helicoidal assumida pelo DNA de filamento duplo (dsDNA). Um filamento 25 único de DNA (ssDNA) é geralmente uma estrutura física de um comprimento igual a aproximadamente 5,84 Angstroms por base de nucleotídeo. (os blocos (bases) de construção individuais compreendendo um filamento de DNA são guanina (G), adenina (A), timina (T), e citosina (C)). O alinhamento e ligação de um filamento de DNA com seu filamento complementar (um processo referido como hibridização) resulta em uma

estrutura de dsDNA na forma helicoidal com uma distância reduzida entre bases de nucleotídeo de 3,4 Angstroms. Assim, enquanto 50 bases de ssDNA têm aproximadamente 292 Angstroms, o mesmo número de nucleotídeos de 5 dsDNA tem somente 175 Angstroms (17,5 nm), ou uma redução média esperada no comprimento de DNA de aproximadamente 40% (dependendo da composição da base, seqüência e ambiente). Esta redução no comprimento é um evento consistente e fisicamente mensurável.

Adicionalmente, a quantidade de mudança total no comprimento da molécula está relacionado ao grau de equiparação entre o primeiro filamento de ssDNA (gabarito) e o segundo (complemento ou marcação) de fixação. Em condições apropriadas, filamentos de DNA menos perfeitamente equiparados também irão hibridizar. No entanto, há um efeito proporcionalmente menor na redução de comprimento. Assim, se a mudança no comprimento for medida, e a mudança máxima no comprimento devido a uma equiparação perfeita for conhecida, o grau de variação da seqüência genética entre um ssDNA alvo e um ssDNA introduzido pode ser determinado. Condições ambientais que demandam equiparações exatas incluem condições de baixo teor de sal e temperaturas elevadas (20C A&T, φ 20 40C G&C). Inversamente, em uma hibridização entre filamentos de DNA equiparados inexatos (ou variantes genéticas) é possível aumentar as condições de teor salino e diminuir a temperatura.

A interação de uma molécula de ssDNA com outra e as mudanças resultantes na conformação física é crítica para a função da invenção. A resistência total de filamento-para-filamento e a união da ligação da subunidade é um resultado das forças de atração combinadas entre unidades individuais. Estas forças de atração incluem ligação de hidrogênio, interações de empilhamento de base e interações hidrofóbicas que forçam as bases para o interior e os fosfatos para o exterior. Também é importante compreender que a medida exata de energia de ligação depende de nucleotídeos próximos e da natureza do ambiente (pH, temperatura, resistência iônica, etc.). Ligação de hidrogênio adiciona 4,7 kcal/mol, empilhamento de bases adiciona 3,8 - 14,6 kcal/mol, e as energias de ligação 5 covalentes de uniões fosfodiéster (80 - 100 kcal/mol) (referências). Estudos experimentais e teóricos confirmam que resistência à tração média da composição de base e da seqüência de dsDNA é de aproximadamente 5 χ ΙΟΙ 2 Newtons (kg/sec2) (referências) Esta força corresponde grosseiramente ao peso de uma bactéria única; mesmo assim, as técnicas mencionadas são 10 delicadas o suficiente que se pode aplicar estas forças com segurança.

CONDUTIVIDADE

Um segundo fenômeno fisiológico relacionado à recombinação de dois ssDNA equiparados é que ocorre um aumento marcante na condutividade do ssDNA após a hibridização. Vários estudos de pesquisa 15 provam que ssDNA é capaz de conduzir eletricidade. A condutividade do ssDNA é altamente dependente na composição da seqüência genética, com guanina e citosina (G e C) tendendo a atuarem como condutores enquanto adenina e timina (A e T) tendendo a atuar mais como isolantes (referências).

O aumento em condutividade após hibridização pode ser tanto 20 quanto 100X do ssDNA para seqüências ricas em G-C de modo apropriado. É debatido na literatura como o mecanismo permite este aumento notável, seja ele abrindo túneis de elétrons através da região de pares de bases ou excitando elétrons na estrutura dorsal de fosfato de açúcar; qualquer que seja o mecanismo, o aumento é mensurável e bem acima de quaisquer relações de 25 sinal-para-ruído.

Como com a mudança em comprimento de molécula, o aumento em condutividade é proporcional ao grau de equiparação entre um ssDNA alvo e um ssDNA com equiparação potencial. Quanto maior o desacordo entre as moléculas de ssDNA, menor o aumento em condutividade

À após hibridização.

DESNATURAÇÃO INDUZIDA POR VOLTAGEM

Um terceiro fenômeno fisiológico está relacionado à separação de um dsDNA nos dois ssDNAs complementares. A hibridização southern é 5 uma experiência de laboratório bem comprovada para controlar a hibridização e a desnaturação de moléculas de DNA (referências). Controlando as variáveis ambientais, como salinidade e temperatura, pode-se forçar hibridização ou desnaturação das moléculas de DNA. A desnaturação também pode ser efetuada pela passagem de corrente suficiente através do dsDNA.

Novamente, o mecanismo final não se encontra completamente entendido; no entanto, o fenômeno é repetidamente observado (referências)

Como com as mudanças em condutividade e comprimento molecular, a corrente requerida para forçar a desnaturação do dsDNA nos dois ssDNAs componentes é proporcional ao grau de equiparação entre os ssDNAs 15 componentes. Quanto maior a equiparação, maior a corrente requerida para resultar em desnaturação.

Produção de Gabarito de DNA

Preparação de DNA genômico de Bacillus subtilis\ Cepa Cohn

168 (Ehrenberg) de Bacillus subtilis (American Type Culture Collection • 20 (ATCC) #27370) foi cultivada em 100 ml de meio #265 ATCC esterilizado, composto de 12,5 g de caldo de infusão de coração (BD #238400), 5,4 g de caldo nutriente (BD #234000) e 2,5 g de extrato de levedura (BD #212730) por litro. As culturas foram cultivadas durante 15 h em 30°C com agitação em 140 rpm. DNA genômico foi purificado das culturas de acordo com uma adaptação de um procedimento padrão (Marmur, J. 1961. A procedurefor the isolation of deoxyribonucleic acidfrom microorganisms. J. Mol. Biol. 3: 208218). Brevemente, 100 ml de culturas de bacillus foram centrifugados em 4000xg durante 10 min. As pelotas foram recolocadas em suspensão e incubadas durante 1 h em 37°C, em 9,5 ml de TE (Tris 10 mM (tris hidroxil57 aminometano EM #9210), EDTA ImM (ácido etileno diamido tetra-acético EM #4010)); 0,5 ml de SDS a 10% (dodecil sulfato de sódio EM #DX24902); e 50 microlitros de 20 mg/ml de proteinase K (EM #24568-3). Após incubação, 1,8 ml de NaCl 5M (cloreto de sódio VWR #6430-1) é adicionado 5 e a solução misturada completamente seguido pela adição de 1,5 ml de

CTAB/ solução de NaCl (10% de CTAB (brometo de hexadeciltrimetil amônio VWR 80501-950) em NaCl 0,7 M)) e incubada em 65°C durante 20 min. A solução é extraída com um volume igual de clorofórmio (EM #CX1054-6)/ álcool isoamílico (Calbiochem #80055-544) e girada durante 10 10 min em 6000xg a 22°C. A fase aquosa foi extraída com fenol (EM #PX05111)/ clorofórmio/ isoamila e girada durante 10 min em 6000xg em 22°C. DNA na fase aquosa foi precipitado pela adição de 0,6 volumes de álcool isopropílico (VWR 3424-7) e girado durante 10 min em 6000xg em 4°C. O precipitado foi lavado com 70% (v/v) de etanol e recolocado em suspensão 15 em 4 ml de TE. A concentração foi determinada por absorbância em espectrofotômetro em 260 nm, e ajustada em 100 pg/ml. 200 μΐ de brometo de etídio (EM #4310) e 4,3 g de CsCl (cloreto de césio EM #3030) foram adicionados por 4 ml de DNA. A solução foi girada durante 4 h em 300.000xg em 15 °C. A banda de DNA genômico foi visualizada por luz UV e removida 20 por agulha de seringa. O brometo de etídio foi extraído com isopropanol saturado com CsCl, e o CsCl removido por diálise durante a noite em 2 litros de TE em 4 °C. O DNA foi precipitado com 0,6 volumes de álcool isopropílico e armazenado em -70°C.

Amplificação PCR de rRNA 16S de Bacillus subtilis: o gene 25 de rRNA 16S de B. subtilis foi amplificado por PCR do DNA genômico preparado acima de acordo com os métodos publicados (H.-J. Bach, 1, D. Errampalli, K.T., Leung, H., Lee, A., Hartmann, J., T. Trevors, e J.C. Munch. 1999. Specific Detetion of the Gene for the Extracellular Neutral Protease of bacillus cereus by PCR and Blot Hybridization. Applied and Environmental

Microbiology, p. 3226-3228, vol. 65, n~. 7). A amplificação de DNA foi realizada com o sistema PCR 9600 GeneAmp (Perkin-Elmer, Norwalk,

Conn.). Amostras de 50 μΐ continham 50 ng de DNA genômico de B. subtillis gabarito, 25 picomol de cada iniciador (Dianteiro: 5’-gggtttgatcctggctcag-3’;

Reverso: 5’-acggttaccttgttacgactt-3’)> trifosfatos de deoxinucleotídeo 0,2 mM (Boehringer, Mannheim, Alemanha), 2 unidades de DNA Taq/AmpliTaq® polimerase (Promega), 5 μΐ de lOx tampão de reação (EM) e MgCl₂ 3 mM (EM). O programa PCR foi como a seguir: ciclo de partida de calor de 94°C durante 5 min e 80°C durante 4 min; um ciclo de 94°C durante 2 min, 64°C 10 durante 1 min, e 72°C durante 2 min; 30 ciclos de 94°C durante 30 s, 64°C durante 30 s, e 72°C durante 45 s e uma extensão final em 72°C durante 10 min. Produtos PCR amplificados foram resolvidos por eletroforese de gel com 0,8% de agarose (Promega LMP #V2831) em tampão TAE (Tris 40 mM acetato [pH 7,6], Na₂EDTA 1 mM). O produto PCR de aproximadamente 15 1500 pb foi excisado e extraído de agarose usando o método de digestão de

AgarACE® (Promega). (Nota: os iniciadores indicados acima foram especificamente projetados pelo Dr. Albert como ferramentas para amplificar, por PCR, a seqüência de nucleotídeo de rRNA 16S de numerosas bactérias).

Clonagem de rRNA 16S de Bacillus subtilis'. O produto PCR de rRNA 16S produzido na etapa acima foi ligado no vetor pGem®-T Easy (Promega) de clonagem de plasmídeo de acordo com o procedimento recomendado pelo fabricante. Brevemente, 75 ng de produto PCR foram adicionados a 5 μΐ de 2x tampão de ligação rápida (Promega), 1 μΐ (50 ng) de DNA vetor, e 1 μΐ (3 unidades Weiss) de DNA T4 ligase. A solução de reação foi incubada a 22°C durante uma hora. O produto de reação de ligação foi transformado em células competentes JM109 (Promega) de acordo com o seguinte procedimento: 2 μΐ de reação de ligação resfriada com gelo foram lentamente adicionados a 50 μΐ de células competentes resfriadas com gelo em um tubo de 1,5 ml estéril. O tubo foi incubado em gelo durante 20 min seguidos por 5 s em 42 °C, e retomou ao gelo durante 2 min. 950 μΐ de meio SOC estéril a 22 °C foram adicionados e os tubos incubados em 37 °C durante 1,5 h, agitando em 150 rpm. As células transformadas foram depositadas em placas de LB/ampicilina/IPTG/X-Gal, e as placas incubadas em 37 °C durante 5 20 h. Colônias brancas foram subseqüentemente tríadas para insertos pelo procedimento de minipreparação de plasmídeo, descrito abaixo.

Procedimento de minipreparação de plasmídeo: Plasmídeos contendo insertos de seqüência de nucleotídeos de rRNA 16S de B. subtilis foram rapidamente purificados de hospedeiros E. coli JM109 por uma 10 modificação da técnica de Blin & Doly em Nucleic Acids Research 7: 11531523 (1979). Vinte colônias brancas, representando clones transformados de vetor/ inserto candidatos, foram, cada uma, coletadas por ponta de pipeta estéril em 2 ml de caldo LB/ ampicilina em um tubo de teste tampado estéril e incubadas durante 16 h em 37°C, agitando em 200 rpm. As culturas foram, 15 cada uma, adicionadas a um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, estéril, e centrifugadas em 4000x g durante 5 min em 4°C. As pelotas foram recolocadas em suspensão em 180 μΐ de solução I mais 20 μΐ de lisozima a 5 mg/ml incubadas em 22°C durante 5 min. 400 μΐ de solução II foram adicionados por inversão x 5 e a solução foi incubada em gelo durante 5 min. 20 300 μΐ de solução III resfriada com gelo foram adicionados e os conteúdos do tubo submetidos à vórtice e incubados em gelo durante 10 min. As amostras foram centrifugadas em lO.OOOx g durante 2 min, em 22 °C, e o sobrenadante transferido para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, estéril, novo contendo 500 μΐ (0,6 volumes) de isopropanol para precipitar o DNA. As amostras 25 foram submetidas a vórtice em lO.OOOx g durante 5 min, em 22°C, e as pelotas recolocadas em suspensão em 200 μΐ de TE.

Transformantes de triagem para insertos do gene de rRNA 16S: 5 μΐ da preparação de plasmídeo foram digeridos por restrição por Not I (Promega) de acordo com direção dos fabricantes, e plasmídeo e fragmentos

de inserto excisados foram resolvidos por 1% de eletroforese de agarose para identificar os isolados de colônia contendo as construções de plasmídeo de rRNA de B. subtilis-pGem. Candidatos a clone identificados por análise de eletroforese como abrigando a construção de plasmídeos apropriada foram 5 cultivados em 500 ml de meios LB/ ampicilina, as alíquotas foram armazenadas em 70% de glicerol em -70 °C e as preparações de plasmídeos em grande escala foram conduzidas para estabelecer uma carga de culturas e DNA.

Experiências alternativas para gerar o mesmo gabarito de 10 ligação de ponte 121 pb: Duas alternativas para gerar a seqüência de nucleotídeos de 121 pb idênticos são dadas abaixo.

1) Subclonagem de DNA de B. subtilis. Com freqüência, fragmentos clonados de DNA microbiano podem ser obtidos a partir de fontes pessoais ou comerciais. Plasmídeos contendo grandes insetos de DNA de B.

subtilis que incluem o fragmento de 121 pb desejado podem ser digeridos com as enzimas de restrição Aat II e Sph I. O digesto pode liberar um fragmento de 171 pb que pode ser clonado em qualquer vetor de clonagem apropriado como os sítios Aat II/ Sph I (Promega) de pGem-T. O fragmento de 121 pb desejado pode ser subclonado de seu plasmídeo de acordo com o procedimento de PCR indicado acima.

2) Síntese dos gabaritos de ligação em ponte desejados. Os gabaritos de ligação em ponte de oligonucleotídeos desejados podem ser sintetizados em qualquer sistema comercialmente disponível como um sintetizador ABI 392 de DNA. Procedimento químico fosforamidita padrão pode ser utilizado, resultando em um grupo de proteção de dimetóxi tritila na extremidade 5’. As moléculas podem ser purificadas por HPLC de fase reversa Cl8 (NH 4 Oac 25 mM, pH 7,5 - 25% de CH 3 CN durante 30 min) seguido por desproteção em 80% de ácido acético durante 15 min. Após desproteção, os oligonucleotídeos podem ser purificados uma segunda vez na mesma coluna Cl8 por HPLC de fase reversa (NH 4 Oac 25 mM, pH 7, 220% de CH 3 CN durante 30 min). As quantidades de DNA sintetizado podem ser determinadas por espectroscopia de absorção visível por UV usando os seguintes coeficientes de extinção para DNA de filamento único:

260 nm, Μ ~ 1 cm - 1) adenina (A) = 15.000; guanina (G) ~ 12.300; citosina (C) = 7.400; timina (T) = 6.700. Uma vez que a maioria dos procedimentos de síntese perde a fidelidade além de 70-90 bases, o gabarito de ligação em ponte de 121 pb aqui discutido pode ser sintetizado em pelo menos dois fragmentos.

Especificamente, como mostrado na etapa 1 do projeto de pesquisa, quatro 10 nucleotídeos de filamento único de -60 bases podem ser sintetizados, e hibridizados e ligados um ao outro no modo apropriado. O produto pode então ser ligado em um vetor de clonagem.

Preparação de gabarito de ligação em ponte de circuito de 121 pb por amplificação PCR: O segmento de 121 pb do gene de rRNA 16S de B.

subtilis foi amplificado por PCR da construção de plasmídeo de rRNA de B. subtilis-pGem. Amostras de 50 μΐ continham 50 ng de DNA de plasmídeo de gabarito digerido por Sal I, 25 picomoles de cada iniciador (Dianteiro: 5’CGAGCGGCCGCCTGGGCTAC AC ACGTGC-3 ’; Reverso: 5 ’ CGACCGCGGCCAGCTTCACGCAGTCG-3’), deoxinucleotídeo trifosfato 20 0,2 mM (Boehringer, Mannheim, Alemanha), 2 unidades de Taq/AmpliTaq®

DNA polimerase (Promega), 5 μΐ de lOx tampão de reação (EM), e MgCl₂ 3 mM (EM). O programa PCR foi como a seguir: ciclo de início de calor de 94°C durante 5 min e 80°C durante 4 min; um ciclo de 94°C durante 2 min, 64°C durante 1 min, e 72°C durante 2 min; 30 ciclos de 94°C durante 30 s, 25 64°C durante 30 s, e 72°C durante 45 s; e uma extensão final em 72°C durante min. Produtos amplificados por PCR foram resolvidos por eletroforese de gel com 1,5% de agarose (Promega LMP #V2831) em tampão TAE (Tris acetato 40 mM [pH 7,6], Na₂EDTA 1 mM). O produto PCR de aproximadamente 121 pb foi excisado, extraído da agarose usando o método

de digestão AgarACE® (Promega). O produto purificado foi ligado ao sítio

Not 1/ Sac II de pGem, transformado em JM109, e plasmídeo contendo inserto de 121 pb foi produzido como descrito acima.

Verificação da especificidade de gabarito de ligação em ponte 5 de DNA: O fragmento de B. subtilis de 121 pb clonado pelo procedimento descrito acima foi verificado para integridade de seqüência através de serviços terceirizados de seqüenciamento de DNA comercialmente disponíveis. Foi determinado que a seqüência de nucleotídeo de inserto de 121 pb foi: 5’ctgggctacacgtgctacaatggacagaacaaaggggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatCccacaa atctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctgg-3 ’, sendo uma equiparação exata em rRNA 16S da cepa 168 de Bacillus subtilis subespécie subtillis (Entrez PubMed acesso #NC000964).

A especificidade do inserto de 121 pb foi verificada através de triagem Southern padrão contra DNA genômico de Bacillus subtilis e outras 15 espécies de Bacillus (isto é, B. cereus, B. subtilis, B. thurigiensis) obtidas comercialmente de American Type Culture Collection. Triagem por hibridizaçao Southern envolveu o seguinte procedimento. DNA genômico de espécie Bacillus, gerado como descrito acima, foi digerido por restrição com enzimas de restrição Hind III, EcoR I e pst I que não digerem o inserto de 121 20 pb. Os fragmentos gerados pelos digestos foram resolvidos em 0,8% de agarose em TAE e coloridos com brometo de etídio. O gel foi tratado com UV em 260 nm durante 5 min em um transiluminador, subseqüentemente embebido em HC1 0,2 M durante 7 min. O gel foi então embebido em solução de base (NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M) durante 45 min, seguido pela solução 25 neutralizante (Tris-HCl 5 M, NaCl 3 M, pH 7,4) durante 90 min. Em configuração Southern padrão (Southern, E.M. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis J. Mol. Biol. 98, 503-517). Brevemente, o gel tratado é ensanduichado entre papel de filtro 3MM Whatman absorvente e uma nitrocelulose de ligação de DNA (SS), de modo que 20x SSPE (NaCl 3 M, NaH2PO4 0,2 M, EDTA 20 mM, pH 7,0) é absorvido como pavio através do papel de filtro, e através do gel à medida que ele transfere o DNA do gel sobre a membrana de ligação. O DNA genômico foi deixado transferir durante 16 h em temperatura ambiente. A 5 membrana foi removida e embebida em 5x SSPE durante 30 min e cozida em um forno a vácuo em 80°C algumas horas até o filtro estar seco. A membrana foi então sondada para fragmentos que podem hibridizar até acima do fragmento de gabarito clonado de 121 pb rotulado de acordo com a direção dos fabricantes AlkPhos®-DIRECT (Pharmacia). A revelação de cor da 10 membrana sondada indicou claramente que a sonda era específica para B.

subtilis, e somente para o único sítio dentro do genoma de B. subtilis.

Geração de variantes mutantes de ponto: Variantes genéticas da seqüência de nucleotídeos de 121 pb foram criadas por métodos publicados (Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends. Eds. A.M.

Griffin e H.G. Griffin. ISBN 1-898486-01-8. 1995 Horizon Scientific Press,

PO Box 1, Wymondham, Norfolk, Reino Unido). Especificamente, DNA de gabarito de plasmídeo de B. subtilis^Gem de 0,5 pmol foi adicionado a um coquetel de PCR contendo, em 25 μΐ de lx tampão de mutagênese: (Tris HC1 20 mM, pH 7,5; MgC12 8 mM; 40 pg/ml de BDA); 20 pmol cada de 20 iniciadores T7 e SP6 (Promega), 250 uM cada de dNTP, 2,5 U de DNA polimerase Taq (Promega), 2,5 U de extensor Taq (Stratagene). Os parâmetros de ciclização de PCR foram 1 ciclo de: 4 min em 94°C; 2 min em 50°C e 2 min em 72°C; seguido por 5-10 ciclos de 1 min em 94°C, 2 min em 54°C e 1 min em 72°C. O DNA do gabarito parental e o DNA linear, 25 sintetizados recentemente incorporando iniciador de mutagênese, foram tratados com Dpnl (10 U) e DNA polimerase Pfu (2,5 U). Isto resultou na digestão de Dpnl do DNA híbrido e de gabarito parental metilado in vivo. DNA polimerase Pfu removeu a(s) base(s) estendidas de DNA polimerase Taq no produto PCR linear. A reação foi incubada em 37°C durante 39 min e

então transferida em 72°C durante mais 30 min. 115 μΐ de tampão de mutagênese contendo ATP 0,5 mM foram adicionados e a solução misturada.

unidades de DNA ligase T4 foram adicionadas a 10 μΐ da solução em um novo tubo de microcentrífuga e incubadas durante 90 min em 37°C. A solução 5 é transformada em E. coli JM109 competente, como indicado acima, e depositada em placa em LB/ ampicilina durante 16 h em 37°C. DNA de plasmídeo foi gerado de isolados individuais e a seqüência de nucleotídeos determinada como indicado acima. Isolados demonstrando 2%, 19% e 35% de

mutação de base foram conservados para outro estudo.

Rotulação de extremidade de gabaritos de 121 pb: Gabaritos de ligação em ponte de DNA serão fixados covalentemente a superfícies de AFM e MEMS via ligações biotina- estreptavidina e tiol- ouro. O plasmídeo contendo o fragmento de B. subtillis rRNA de 16S de 121 pb foi digerido por restrição com Not I e Sac II para liberar o inserto que foi purificado com gel em 0,8% de agarose LMP em tampão TAE, como descrito acima. As extremidades 5’ e as extremidades 3’ das moléculas foram respectivamente rotuladas com química de tiol e biotina usando kits de rotulação de extremidades comercialmente disponíveis (Pierce #89818) e de acordo com procedimentos publicados (B.A. Connolly e P. Rider, Nucleic Acids Res. 13, 20 4485 (1985). AND A. Kumar, S. Dvani, H. Dawar, G.P. Talwar, ibid. 19,

4561 (1991).

Medição de propriedades físicas de DNA: Microscopia de potência atômica (AFM) é tipicamente usada para avaliar a topografia de uma superfície em um nível molecular. O sistema AFM inclui um braço em 25 cantiléver com uma ponta afiada em saliência ortogonal ao eixo longitudinal do braço. O braço é abaixado até a ponta entrar em contato com a superfície, e então é empurrado ao longo das mudanças de medição de superfície nas dimensões da superfície. O movimento da ponta em cantiléver é medido; o processo é repetido de modo suficiente para a superfície da amostra caracterizar a topografia. Mais comumente, a deflexão da ponta é medida usando uma abordagem de laser refletido.

Neste trabalho, AFM foi usado para medir a força requerida para romper as ligações junto dos eixos de uma molécula de DNA de 5 filamento único ou duplo, para medir o deslocamento da ponta de AFM como um resultado do movimento de moléculas de DNA ligadas.

Medições experimentais de resistência para força aplicada a uma molécula amarrada entre uma ponta e platina de AFM: Uma molécula amarrada de modo solto entre a ponta e a platina foi inicialmente comprimida 10 no modo AFM padrão até uma força positiva ser registrada. Como a ponta é subseqüentemente levantada da superfície, a molécula toma-se retesada resultando em um registro de força negativa até a distância entre a ponta e a platina exceder o comprimento molecular máximo, ponto em que se rompe a molécula.

Microscopia de potência atômica (AFM) foi usada para medir com precisão as propriedades físicas específicas (isto é, deslocamento e condutividade) do inserto de 121 pb de B. subtillis e fragmentos de DNA variantes. O AFM foi operado de acordo com morfologia e química prescritas. Pontas e platinas de AFM foram revestidas com ouro e 20 estreptavidina de acordo com procedimentos publicados, e os gabaritos de ligação em ponte de DNA rotulados na extremidade com tiol/ biotina gerados acima foram fixados (RM Zimmermann and EC Cox. 1994. DNA stretching on funcionalized gold surfaces. Nucleic Acids Research, vol. 22, Issue 3 492497). Antes da fixação, o grupo tiol de DNA rotulado na extremidade foi 25 desprotegido durante a noite com DTT 0,04 M. tampão fosfato 0,17 M, pH 8,0. Extrações repetidas com acetato de etila para remover excesso de DTT foram realizadas justamente antes da fixação em HEPES 10 mM, tampão EDTA 5 mM, pH 6,6. Pontas de AFM tratadas com ouro foram submersas na solução de DNA durante 2 h em temperatura ambiente e secadas em uma corrente de nitrogênio. As pontas de AFM ligadas a DNA foram montadas no AFM, e a câmara de reação inundada com SPE (fosfato de sódio O,1M, pH 6,6, EDTA 1 mM e cloreto de sódio 1 M) para permitir a formação de ligações biotina-estreptavidina covalentes.

O deslocamento da ponta do AFM e as propriedades elétricas do material foram medidas antes, durante e após hibridização com moléculas de ssDNA variantes e complementares. Os reagentes que controlaram a hibridização (tampões de pH, sais), desnaturação, hidrólise e oxidação de nucleotídeos foram examinados.

Experiência relativa ao deslocamento da ponta a partir do estado fixo: O comprimento de um filamento único de DNA amarrado é reduzido como um resultado de hibridização com seu filamento complementar. Nestas condições experimentais, a redução do comprimento do ssDNA amarrado resulta em um deslocamento mensurável da ponta do 15 AFM em direção à platina.

RESULTADOS

O trabalho aqui descrito atualmente englobou pesquisa molecular e em AFM de aproximadamente 80 moléculas na faixa de 83 pb a 2854 pb em comprimento. O DNA foi derivado de vetores de plasmídeo, 20 vírus lambda, genoma de E. coli e DNA de genoma de B. subtillis. Embora os estudos mais intensos tenham sido conduzidos no fragmento de 121 pb descrito acima, os resultados foram similares através de todas as moléculas. Estudos iniciais mediram a redução de comprimento do filamento único do fragmento de 121 pb fixado em ambas as extremidades na ponta e platina de 25 AFM de acordo com os métodos discutidos anteriormente. O deslocamento da ponta de AFM foi observado dentro de segundos de pipetagem de 4-5 μΐ de fragmentos de 121 pb de filamento único diluídos (1-2 moléculas por μΐ), ou plasmídeo desnaturado contendo o inserto de 121 pb. A figura 4 mostra como o fragmento de 121 pb reduziu em comprimento em aproximadamente 10 nm.

O comprimento exato de um filamento de DNA depende da composição de base, seqüência e ambiente. Em média, o diâmetro de dsDNA é de 20 Angstroms (Â), e a distância entre nucleotídeos adjacentes é 3,4 Â ou aproximadamente 34 Â para uma rotação helicoidal total. A hélice de dsDNA 5 demonstra duas ranhuras; a ranhura menor (~12 Angstroms) e a ranhura maior (~ 22 Angstroms). A distância entre nucleotídeos adjacentes de ssDNA, no entanto, é aproximadamente 5,84 Angstroms. Conseqüentemente, enquanto 121 bases de ssDNA são aproximadamente 701 Angstroms, o mesmo número de nucleotídeos de dsDNA pode ser aproximadamente 411 10 Angstroms, ou uma redução média esperada em comprimento de DNA de aproximadamente 40%. Conseqüentemente, se o filamento de 121 pb amarrado no AFM foi deixado torcer livremente, a ponta deve ter sido deslocada por tanto quanto 29 nm.

A introdução separada de moléculas de DNA que diferiram da 15 seqüência de nucleotídeos parental em 2%, 19% e 35% (variantes) demonstrou uma diferença mensurável no deslocamento da ponta. Se o deslocamento da ponta de AFM nestes estudos foi devido à formação helicoidal de DNA de filamento duplo com um comprimento menor do que o do DNA de filamento único, então pode-se seguir que as moléculas híbridas 20 compostas de menos filamentos complementares podem demonstrar menos deslocamento de ponta.

A figura 4 ilustra que o gabarito de ligação de DNA de 121 pb foi amarrado, e mantido em tensão leve entre a ponta e a platina de AFM como discutido no texto, durante um tempo anterior de aproximadamente 15 25 s. A ponta, mantida em uma posição no estado estável de aproximadamente 71 nm moveu-se aproximadamente 10 nm quando da introdução do filamento de DNA complementar do gabarito. A introdução separada de moléculas que variaram da parental em 2%, 19% e 35% resultou em uma diferença mensurável no deslocamento da ponta. Linhas gráficas representam menos do que 0,3% de desvio sobre 5 medições cada.

As superfícies de cantiléver de AFM foram revestidas com ouro para permitir a condutância de corrente elétrica através das moléculas do estudo. Aplicando-se um potencial entre o cantiléver e a platina, uma corrente 5 correspondente foi medida através do gabarito de ssDNA de 121 pb ligado em ponte. Para uma voltagem aplicada de aproximadamente um volt, a corrente medida através do gabarito de ssDNA foi de aproximadamente 0,3 nA. Quando um ssDNA alvo perfeitamente complementar foi introduzido, a corrente medida na mesma voltagem aumentou para aproximadamente 2,1 10 nA.

Estes resultados confirmam o comportamento relacionado à condutividade de ssDNA/dsDNA discutida anteriormente. Também foi confirmado que a condutividade da molécula de DNA depende da composição e da seqüência da molécula de DNA. Especificamente, 15 nucleotídeos adenina (A) e timina (T) atuam como isolantes enquanto nucleotídeos guanina (G) e citosina (C) são melhores condutores.

Resultados similares ocorrem quando filamentos de ssDNA alvo são introduzidos, que são uma variante engenheirada com um grau desconhecido de variação do gabarito. As mesmas moléculas de ssDNA alvo 20 variantes, usadas nos estudos de deformação, foram introduzidas, com a resposta de condutividade conseqüentemente medida. Notável é o alto grau de proporcionalidade entre o aumento em condutividade das moléculas quando da hibridização e o grau de desacordo do e filamentos de ssDNA de gabarito e marcação, fornecendo uma prova experimental do fenômeno de 25 especificidade elaborado anteriormente. Os resultados foram consistentes se a variação ocorreu em uma região da seqüência genética, ou foi espalhada sobre um número de diferentes locais junto à seqüência da marcação.

Uma vez que a quantidade de corrente conduzida foi medida através do dsDNA, a voltagem aplicada foi manualmente aumentada através

do cantiléver de AFM e o substrato, resultando em condutância aumentada através do dsDNA. A voltagem foi aumentada até ocorrer desnaturação do dsDNA. Um gráfico de resultados para estas experiências é mostrado na figura 6. No ponto de desnaturação, a corrente conduzida caiu abaixo do nível 5 associado com ssDNA.

Da figura 6, nota-se um grau elevado de proporcionalidade entre a quantidade de corrente requerida para forçar a desnaturação e o grau de desacordo do e filamentos de ssDNA de gabarito e marcação. Como com os estudos anteriores, os resultados foram considerados se a variação ocorreu 10 em uma região da seqüência genética ou se foi espalhada sobre vários diferentes locais junto à seqüência da marcação.

Uma outra experiência conduzida com AFM envolveu o aumento de voltagem para forçar a desnaturação, e então reduzindo a voltagem de volta a níveis sensores para permitir que ocorra uma outra 15 hibridização. Como pode ser visto da figura 7, o AFM realizou com sucesso vários eventos sensores, e validou o uso da monitoração sensora de corrente de hibridização/ desnaturação forçada pela corrente aumentada como um meio de reinicializar o biossensor. Nota-se na figura 7 a consistência da corrente medida, tanto durante os estados de ssDNA como após hibridização 20 (dsDNA), através de eventos sensores múltiplos. Apesar da experiência representada na figura 7 mostrar quatro eventos sensores discretos, várias experiências foram conduzidas realmente através de centenas de eventos sensores, sem degradação notável do sinal e sem mudança significativa nas correntes medidas antes e após a monitoração sensora.

O AFM permitiu a investigação e a verificação dos fenômenos descritos na seção anterior. Os eventos sensores envolvidos selecionaram atributos de um dispositivo de biodetecção reservado para uso especial. Por exemplo, pontas em cantiléver do AFM foram construídas usando a mesma abordagem e técnicas, como usadas na fabricação do dispositivo, o dispositivo sensor envolvendo o AFM utilizou um ssDNA como um sítio sensor.

Projeto de pesquisa para sintetizar um gabarito de ligação em ponte de

DNA de 121 pb:

Etapa 1. Síntese de fragmentos de molécula (A+, A-, B+ e B-) com ligadores (caso pequeno)

(A+)=5’-CTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGA

GGTTAAGCCAATCC (B+) = 5 ’-CACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGgcatg (A-) = 3’-tgcaGACCCGATGTGCACGATGTTACCTGTCTTGTTTCCCGTCGCTTTGGCGCT (B-) = 3’-CCAATTCGGTTAGGGTGTTTAGACAAGAGTCAAGCCTAGCGTCAGACGTTGAGCTGA

CGCACTTCGACC

Etapa 2. Hibridização de fragmentos de moléculas (A+ para A-, e B+ para B-) (A+/A-) - Aquecer a 95 Celsius, resfriar lentamente em temperatura ambiente

CTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCC

TgcaGACCCGATGTGTGCACGATGTTACCTGTCTTGTTTCCCGTCGCTTTGGCGCT (B+/B-) - Aquecer a 95 Celsius, resfriar lentamente em temperatura ambiente

CACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTGCGTGAAGCTGGgcatg CCAATTCGGTTAGGGTGTTTAGACAAGAGTCAAGCCTAGCGTCAGACGTTGAGCTGACGCACTTCGACC Etapa 3. Ligar fragmentos A+/A- em B+/B20 (A+/A-) - Em lx tampão de ligação mais DNA ligase T4 em temperatura ambiente

CTGGGCTACA—ACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCJGTT—GTGAAGCTGGgcatg

TgcaGACCCGATGT—TGGCGCTCCAATTCGGTTAGGGTGTTTAGACAA—CACTTCGACC

As moléculas de 121 pb resultantes podem então ser ligadas nos sítios de clonagem Aat II/ Sph I de pGem-T.

Soluções:

Solução I: Glicose 50 mM (0,9% p/v); Tris 25 mM pH 8, EDTA 10 mM, pH 7,5

Solução II: NaOH 0,2 N, 1% de SDS

Solução III: Acetato de potássio 2,7 M em pH 4,8 com ácido acético glacial. Meio SOC = (por 100 ml: 2 g de Bacto®-triptona (BD), 0,5 g de extrato de levedura (BD), 1 ml de NaCl 1 molar, 0,25 ml de KC1 1 molar, 1 ml de carga de Mg⁺² 2 molar, 1 ml de glicose 2 molar)

Carga de Mg⁺² = MgCl₂1 molar, MgSO₄ 1 molar

Placas de LB/ampicilina/ IPTG/X-Gal = por litro, adicionar 5 g de ágar (BD), 10 g de Bacto®-triptona (BD), 5 g de extrato de levedura (BD), e 5 g de NaCl; ajustar o pH com NaOH; autoclavar, resfriar em 50°C; adicionar ampicilina em 10 microgramas por ml, IPTG em 0,5 milimolar, e 80 10 microgramas por mililitro de X-Gal. Despejar 30-35 ml do meio por 85 mm de placa, deixar o ágar endurecer em 22°C e armazenar em 4°C.

Abreviaturas:

ml: mililitro, μΐ; microlitro, g: grama, mg: miligrama, ng: nanograma, M: molar (moles/ litro), mM: milimolar, (BD = Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) (EM) = EMD Chemical Inc., Gibbstown, NJ) (VWR = VWR Intemational, West Chester, PA) (Calbiochem/Novabiochm Corp., San Diego, CA) (Promega = Promega Corporation Madison, WI) (Pierce = Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL)

Todos os sistemas de identificação/detecção biológicos e químicos devem incorporar (A) coleta de amostra, (B) liberação e processamento de amostra, (C) tecnologia de análise de amostra, e (D) processamento e saída de sinais (figura 1). Em um exemplo, um microchip, 25 ou série de microchips, é composto de milhares de cantiléveres sensíveis a DNA chamados sistemas micro-eletromecânicos (MEMS) dispostos de um modo a permitir a detecção, identificação e o fluxo de concentração de múltiplos patógenos (multiplex).

Cada cavidade em um microchip pode conter uma amostra ou

centenas de circuitos baseados em cantiléver. Cada circuito é composto de alguma forma de elemento móvel ligado em ponte por preferivelmente uma molécula biológica, de modo que quando a molécula interage com outras moléculas, o movimento associado faz com que os cantiléveres movam-se.

Numerosas geometrias são possíveis, como um cantiléver único suspenso sobre uma platina, como representado nos desenhos de AFM, um disco de rotação único ou outra forma, ou dois braços em cantiléver que se movem um com relação ao outro, como representado na figura 10. Uma matriz destes cantiléveres ligados em ponte, ou cavidades destes cantiléveres, pode ser 10 construída de modo que circuitos idênticos redundantes do eixo medem a concentração de um agente biológico único dependendo do número de circuitos que respondem na presença do bio-agente. Cada fileira destes cantiléveres, ou cavidades destes cantiléveres, pode ser dedicada a um agente biológico diferente. Cada chip também pode conter um número significativo 15 de cantiléveres de referência para responder a níveis de fundo de “ruído” químico, mecânico ou outro “ruído” ambiental. Um dispositivo de biodetecção/identifícação pode incluir chips que são dedicados a um conjunto particular de agentes biológicos. Por exemplo, um dispositivo pode conter um chip com cantiléveres ligados em ponte por moléculas que podem reagir 20 somente com agentes associados com a segurança da pátria. Outros dispositivos podem conter cantiléveres ligados em ponte que somente respondem a segurança de alimentos, ou agentes importantes nas indústrias médicas ou agrícolas.

Uma vez que a molécula biológica responde a mudanças em 25 seu ambiente, os elementos móveis irão defletir, e esta deflexão subseqüente é medida. A medição de movimento em dispositivos MEMS é bem documentada. Um modo para medir a deformação é refletir o feixe de laser fora de uma superfície no elemento deformável. À medida que a molécula responde, o elemento move-se, e o feixe de laser é subseqüentemente

defletido em diferentes locais receptores. A mudança no feixe refletido é medida pelos diferentes locais receptores e correlacionada à quantidade de resposta física demonstrada pela molécula.

As presentes sensibilidades são cerca de 10 angstroms para deslocamento e 5 pico-Newtons para força, mas melhoras no tamanho dos encolhimentos do dispositivo são esperadas. A menor estrutura transistorsonda descrita tem dimensões de 3x2 mícrons x 140 nm. Thomas Kenny de Stanford descreve o uso de cantiléveres leves em microscópios de potência atômica para medir forças no nível de attonewton (10- 18 newton).

Vários métodos alternativos para medir a deformação dos elementos MEMS móveis também existem. Um método consiste em incluir uma camada de material piezoelétrico nos elementos deformáveis propriamente ditos. Outro, envolve adicionar uma massa de material magnético na extremidade de um elemento MEMS móvel e medir a mudança 15 no campo magnético à medida que o elemento móvel é movimentado pelas respostas do elemento biológico. Ainda outro envolve medir mudanças na capacitância através do intervalo ligado em ponte pelo elemento biológico à medida que é movimentado pelo elemento biológico.

Os elementos móveis do dispositivo MEMS também devem 20 compreender um circuito, incluindo a molécula de gabarito. Assim, uma voltagem pode ser aplicada através dos elementos móveis, e uma corrente resultante passará através do ssDNA. O aumento na condutividade através do circuito após hibridização será medido sentindo-se o aumento em fluxo de corrente, amplificando o sinal e convertendo o resultado em saída digital para 25 processamento.

Durante operação normal, quando um sítio sensor está em seu estado pronto (um evento de detecção ainda não ocorreu), a voltagem através dos elementos móveis será fixada em um nível “sensor”. Este nível é elevado o bastante para permitir uma corrente mensurável, mas muito baixo para estar próximo ao limite de desnaturação. Esta corrente parece ter o benefício adicional de arrastar o ssDNA alvo no sítio sensor, mais provavelmente através de eletroforese.

A passagem da corrente através do ssDNA tem um benefício adicional. Uma vez que ssDNA é capaz de passar uma quantidade pequena de corrente sozinho (antes de hibridização), o dispositivo tem um auto-teste inerente. Se o gabarito de ssDNA for danificado, rompido, ou se tomar solto dos elementos MEMS móveis, o circuito não está mais completo. Assim, a capacidade de cada sítio sensor de estar em um estado pronto para um evento sensor é capaz de ser validada. Se se verificar que um sítio específico é inoperável, os sinais a partir deste sítio podem ser removidos em software de inclusão em cálculos futuros para cálculos de concentração e presença de patógenos.

Tendo sido o circuito completado pelo ssDNA de gabarito, isto também irá permitir a capacidade de medir o terceiro fenômeno indicado anteriormente: efetuar desnaturação usando corrente elétrica. A voltagem aplicada pode ser aumentada a um nível que resulta em corrente suficiente para desnaturar o dsDNA. Isto provê o sensor com a capacidade de se autoreiniciar, em que após o evento sensor ocorrer, o patógeno fixado à porção do gabarito do dispositivo pode ser repelido. A marcação de ssDNA repelida é varrida do material fluindo através do sensor, a voltagem é diminuída abaixo de seu nível sensor, e o sítio sensor está então pronto para outro evento sensor.

O tamanho destes elementos é extremamente pequeno, de modo que, potencialmente, milhares de sítios sensores podem estar localizados em um chip MEMS do tamanho de uma moeda de um centavo. Assim, várias regiões de genes virulentos podem ser incluídas em um dado chip para um patógeno específico, e, além disso, vários patógenos podem ser também incluídos em um dado chip.

Em vários exemplos, o sensor do presente assunto é acoplado a um detector. Em um exemplo, o detector inclui um circuito elétrico e é referido como um circuito detector. Em um exemplo, o detector utiliza meios não elétricos para discernir um deslocamento físico ou condição de 5 ressonância. Na ausência de um modifícador, o termo detector inclui ambos os detectores elétrico e não elétrico.

Deve-se compreender que a descrição acima pretende ser ilustrativa, e não restritiva. Por exemplo, as formas de realização descritas acima ou aspectos das mesmas, podem ser usadas em combinação umas com 10 as outras. Muitas outras formas de realização serão evidentes aos versados na arte quando estudando a descrição acima. O escopo da invenção deve, consequentemente, ser determinado com referência às reivindicações anexas, junto com o escopo total de equivalentes ao qual estas reivindicações são designadas. Nas reivindicações anexas, os termos “incluindo” e “no qual” são 15 usados como os equivalentes em inglês dos respectivos termos “compreendendo” e “em que.” Também, nas seguintes reivindicações, os termos “incluindo” e “compreendendo” são abertos, isto é, um sistema, dispositivo, artigo, ou processo que inclui elementos além dos listados após este termo em uma reivindicação são ainda considerados como estando dentro 20 do escopo desta reivindicação. Além disso, nas seguintes reivindicações, os termos “primeiro”, “segundo” e “terceiro”, etc., são usados simplesmente como rótulos, e não pretendem impor exigências numéricas aos seus objetos.

Claims (23)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Dispositivo, caracterizado pelo fato de compreender:

   uma molécula de gabarito (220, 545) ligada entre pelo menos dois pontos de contato incluindo um primeiro ponto de contato disposto em uma primeira superfície (205A, 505A, 1245A, 1245B, 1245C, 1245D) e um segundo ponto de contato disposto em uma segunda superfície, em que a primeira superfície é independente da segunda superfície, em que a molécula de gabarito (220, 545) é selecionada de ssDNA ou ssRNA e inclui pelo menos um pelo menos um sítio de ligação para uma molécula alvo; e um detector (530, 1215) acoplado ao primeiro ponto de contato e ao segundo ponto de contato, o detector (530, 1215) configurado para gerar um sinal de saída com base em uma mudança em um parâmetro elétrico, o dito parâmetro elétrico sendo selecionado de condutância, resistência e impedância, em que a mudança no parâmetro elétrico corresponde a uma associação da molécula alvo e da molécula de gabarito (220, 545), o detector ainda compreendendo um circuito de acionamento para dissociar a molécula alvo da molécula de gabarito.
2. 2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula gabarito (220, 545) é um ácido nucleico que é ligado ao primeiro ponto de contato em sua extremidade 3’ e ao segundo ponto de contato em sua extremidade 5’.
3. 3. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de gabarito (220, 545) é um análogo sintético de uma sequência de ácido nucleico.
4. 4. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira superfície inclui uma estrutura em suspensão (205A, 505A, 1245A, 1245B, 1245C, 1245D) e o sinal de saída é uma função de um deslocamento da estrutura em suspensão.
5. 5. Dispositivo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado

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   2/5 pelo fato de que a estrutura em suspensão inclui um cantiléver (205A, 505A, 1245A, 1245B, 1245C, 1245D).
6. 6. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira superfície (205A, 505A, 1245A, 1245B, 1245C, 1245D) inclui uma superfície móvel.
7. 7. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o detector (530, 1215) inclui um sensor de resistência.
8. 8. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o detector (530, 1215) inclui pelo menos um dentre um comparador e um circuito de ponte.
9. 9. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o detector (530, 1215) inclui uma fonte de voltagem acoplada ao primeiro ponto de contato e ao segundo ponto de contato e em que o parâmetro elétrico inclui uma medida de uma corrente.
10. 10. Dispositivo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a fonte de voltagem é configurada para suprir um potencial crescente.
11. 11. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o detector inclui uma fonte de corrente acoplada ao primeiro ponto de contato e ao segundo ponto de contato e em que o parâmetro elétrico indicativo de condução elétrica através da molécula gabarito (220, 545) inclui uma medida de uma voltagem.
12. 12. Dispositivo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a fonte de corrente é configurada para suprir uma corrente crescente.
13. 13. Dispositivo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma da primeira superfície e segunda superfície inclui pelo menos uma de vidro, quartzo, silício e um polímero.

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14. 14. Método, caracterizado pelo fato de compreender:

    expor uma molécula alvo a uma molécula de gabarito (220, 545), a molécula de gabarito (220, 545) ligada entre pelo menos dois pontos de contato incluindo um primeiro ponto de contato disposto em uma primeira superfície (205A, 505A, 1245A, 1245B, 1245C, 1245D) e um segundo ponto de contato disposto em uma segunda superfície, em que a molécula de gabarito (220, 545) inclui pelo menos um sítio de ligação para uma molécula alvo, e sendo selecionada de ssDNA ou ssRNA; e gerar um sinal de saída como uma função de uma mudança em um parâmetro elétrico selecionado de condutância, resistência e impedância, em que a mudança no parâmetro elétrico corresponde a uma associação da molécula alvo e da molécula de gabarito (220, 545), o método ainda incluindo aplicar um sinal elétrico à molécula gabarito para dissociar a molécula alvo.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de ainda incluir:

    conduzir uma corrente crescente usando a molécula de gabarito (220, 545) antes de expor a uma molécula alvo.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de ainda incluir:

    conduzir uma corrente crescente usando a molécula de gabarito (220, 545);

    monitorar para um pico de voltagem correspondendo a uma dissociação da molécula alvo e da molécula de gabarito (220, 545); e gerar a saída como uma função da corrente no pico de voltagem.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de ainda incluir:

    aplicar uma voltagem crescente à molécula de gabarito (220,

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    545);

    monitorar para um pico de corrente correspondendo à dissociação da molécula alvo e da molécula de gabarito (220, 545); e gerar a saída como uma função da voltagem no pico de corrente.
18. 18. Sistema, caracterizado pelo fato de compreender:

    uma abertura de introdução da molécula alvo para receber uma amostra;

    um sensor tendo uma molécula de gabarito (220, 545) em comunicação com a abertura de introdução da molécula alvo, a molécula de gabarito (220, 545) sendo selecionada de ssDNA ou ssRNA e disposta entre um primeiro ponto sobre uma primeira superfície (205A, 505A, 1245A, 1245B, 1245C, 1245D) e um segundo ponto em uma segunda superfície, a primeira superfície (205A, 505A, 1245A, 1245B, 1245C, 1245D) independente da segunda superfície e em que a molécula de gabarito (220, 545) tem pelo menos um sítio de ligação específico para uma molécula alvo;

    um detector (530, 1215) acoplado ao primeiro ponto e ao segundo ponto e configurado para gerar um sinal de saída com base em uma mudança em um parâmetro elétrico medido correspondendo a uma associação da molécula de gabarito (220, 545) com a molécula alvo, o parâmetro elétrico sendo selecionado de condutância, resistência e impedância;

    o sistema ainda compreendendo um circuito de saída que fornece um resultado com base no sinal de saída, o detector ainda compreendendo um circuito de reinicialização acoplado à molécula de gabarito (220, 545) para dissociar uma molécula alvo da molécula de gabarito.
19. 19. Sistema de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de ainda incluir uma pluralidade de sensores, em que cada sensor é acoplado ao detector (530, 1215) por um multiplexador.

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20. 20. Sistema de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um processador acoplado ao detector (530, 1215) e tendo acesso a uma memória, a dita memória compreendendo dados para identificar uma molécula alvo com base na mudança no parâmetro medido.
21. 21. Sistema de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o circuito de saída inclui, pelo menos, um dentre uma interface, um mostrador e um transceptor sem fio.
22. 22. Sistema de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de ainda incluir um circuito de teste acoplado à molécula de gabarito (220, 545) adaptado para determinar a condutividade da molécula de gabarito (220, 545).
23. 23. Sistema de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de ainda incluir um alojamento para contenção de pelo menos um dentre a abertura de introdução da molécula alvo, o sensor, o detector (530, 1215) e o circuito de saída.