JP4561451B2 - 多型検出方法および多型検出用キット - Google Patents
多型検出方法および多型検出用キット Download PDFInfo
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Description
本発明は、ＤＮＡ等の核酸における多型の検出方法および検出キット等に関する。
疾患の診断や、薬物代謝に関する個人差の検出、食品や環境モニタ等の目的で、ＤＮＡ
の変異や多型を検出する種々の方法が開発されている。
の変異や多型を検出する種々の方法が開発されている。
特定の標的ＤＮＡの塩基配列を検出する方法として、標的オリゴヌクレオチドに相補的
な塩基配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドを担持する感知面を有するセンサーデバイス
を用いる方法が提案されている（特許文献１を参照）。
な塩基配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドを担持する感知面を有するセンサーデバイス
を用いる方法が提案されている（特許文献１を参照）。
また、多型の中でも、１塩基の置換により生じるいわゆる一塩基多型（single nucleot
ide polymorphism(s)；ＳＮＰ(s)）を検出する方法が数多く提案されている。一塩基多型
は、特定の疾患への罹りやすさや薬物の代謝に関する個人差の原因となりうるものであり
、感度および精度の高い検出方法が必要とされている。
特開２００２−５３１１００号公報
ide polymorphism(s)；ＳＮＰ(s)）を検出する方法が数多く提案されている。一塩基多型
は、特定の疾患への罹りやすさや薬物の代謝に関する個人差の原因となりうるものであり
、感度および精度の高い検出方法が必要とされている。
しかしながら、いわゆる一塩基多型を、プローブ分子と標的分子とがハイブリダイズし
た際に生じるミスマッチ（塩基配列が相補的でない部分に生じる不完全な結合）をモニタ
することによって検出する方法は、高い感度を得るのが困難であり、再現性の良い結果を
得るのは難しい。また、プローブ分子の合成はコストが高いという問題もある。
た際に生じるミスマッチ（塩基配列が相補的でない部分に生じる不完全な結合）をモニタ
することによって検出する方法は、高い感度を得るのが困難であり、再現性の良い結果を
得るのは難しい。また、プローブ分子の合成はコストが高いという問題もある。
そこで、本発明は、試料である核酸中に、特定の多型（変異を含む）が存在するか否か
を簡便な方法によって精度良く検出することができる技術を提供することを目的とする。
を簡便な方法によって精度良く検出することができる技術を提供することを目的とする。
本発明の一態様の多型検出方法は、核酸における多型を検出する方法であって、一端に測定用基板に結合可能な基板結合部位が付加されたプライマーであって、前記核酸の前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリング可能な前記プライマーを使用する方法であり、前記核酸と、前記プライマーとを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う第１工程と、前記ポリメラーゼ連鎖反応の産物の前記基板結合部位と前記測定用基板とを結合させる第２工程と、前記測定用基板に結合しうる官能基を含む低分子化合物および／または極性液体を含む液体で、前記測定用基板表面を洗浄する第３工程と、表面プラズモン共鳴法、水晶振動子法、または電気化学検出法により前記測定用基板に結合した前記プライマーの伸長反応の有無を測定することによって、多型の有無を検出する第４工程と、を含み、前記基板結合部位は、チオール基、ジスルフィド基またはモノスルフィド基であり、前記官能基は、チオール基、ジスルフィド基またはモノスルフィド基であり、前記極性液体は、アルコール、尿素、グアニジン、ＤＭＳＯ、およびＤＭＦからなる群の少なくとも１種であることを特徴とする。
また、上記課題を解決するために、本発明に係る多型検出方法は、核酸における多型を検出する方法であって、一端に測定用基板に結合可能な基板結合部位を有するプライマーであって、前記核酸の前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリング可能なプライマーを使用する方法であり、前記核酸と、前記プライマーとを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う第１工程と、前記ポリメラーゼ連鎖反応産物の基板結合部位と前記測定用基板とを結合させる第２工程と、前記測定用基板に結合しうる官能基を有する低分子化合物および／または極性液体を含む液体で、前記測定用基板表面を洗浄する第３工程と、前記測定用基板に結合した前記プライマーの伸長反応の有無を測定することによって、多型の有無を検出する第４工程と、を含む。
また、上記課題を解決するために、本発明に係る多型検出方法は、核酸における多型を検出する方法であって、一端に測定用基板に結合可能な基板結合部位を有するプライマーであって、前記核酸の前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリング可能なプライマーを使用する方法であり、前記核酸と、前記プライマーとを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う第１工程と、前記ポリメラーゼ連鎖反応産物の基板結合部位と前記測定用基板とを結合させる第２工程と、前記測定用基板に結合しうる官能基を有する低分子化合物および／または極性液体を含む液体で、前記測定用基板表面を洗浄する第３工程と、前記測定用基板に結合した前記プライマーの伸長反応の有無を測定することによって、多型の有無を検出する第４工程と、を含む。
このような構成によれば、例えば、多型を有する核酸に対して相補的な塩基配列を有す
るプライマーを用いると、当該多型を有する核酸に対しては完全なアニーリングをし、Ｐ
ＣＲ法によりプライマーが伸長される。一方、多型を有しない核酸に対してはアニーリン
グが不完全となって、ＰＣＲ法を行ってもプライマーが伸長されない。従って、多型を含
む可能性を有する領域にアニーリングするプライマーを用いてＰＣＲ法を行えば、伸長反
応の有無を検出することによって、多型の有無を知ることができる。また、予めプライマ
ーに所定の測定用基板に結合可能な基板結合部位を設けておくことによって、ＰＣＲ後に
プライマーを当該基板表面に固定し各種測定によって、伸長の有無を検出することが可能
である。
るプライマーを用いると、当該多型を有する核酸に対しては完全なアニーリングをし、Ｐ
ＣＲ法によりプライマーが伸長される。一方、多型を有しない核酸に対してはアニーリン
グが不完全となって、ＰＣＲ法を行ってもプライマーが伸長されない。従って、多型を含
む可能性を有する領域にアニーリングするプライマーを用いてＰＣＲ法を行えば、伸長反
応の有無を検出することによって、多型の有無を知ることができる。また、予めプライマ
ーに所定の測定用基板に結合可能な基板結合部位を設けておくことによって、ＰＣＲ後に
プライマーを当該基板表面に固定し各種測定によって、伸長の有無を検出することが可能
である。
ここで、「測定用基板」とは、プライマーの伸長反応の有無を測定することができる測
定方法に使用可能な基板を意味し、その材料、構成は特に限定されない。例えば、表面プ
ラズモン共鳴法、水晶振動子法、電気化学検出法等、各種の測定方法に応じて、光透過性
を有するものや、電極基板、表面に金薄膜が形成された基板等が用いられる。
定方法に使用可能な基板を意味し、その材料、構成は特に限定されない。例えば、表面プ
ラズモン共鳴法、水晶振動子法、電気化学検出法等、各種の測定方法に応じて、光透過性
を有するものや、電極基板、表面に金薄膜が形成された基板等が用いられる。
一方、ＰＣＲでは、１の領域を増幅するために２本のプライマーペアを使用するため、
プライマーペアのうち基板結合部位を有しない方のプライマーも伸長される。したがって
、ＰＣＲ産物には、検出の対象とならない基板結合部位を有しない一本鎖ＤＮＡも含まれ
ている。ＤＮＡのアミノ基やリン酸基は、電極表面を構成する金属と静電的な吸着を起こ
しやすく、このような非特異的なＤＮＡの付着は、電気的測定等の感度または精度を下げ
る原因となる。しかしながら、本発明の構成によれば、第３工程における洗浄によって、
電極表面に親和性を有する低分子化合物が共有結合するか、あるいはＤＮＡの水素結合を
切断するので、弱い静電作用によって測定基板表面に非特異的に吸着したＤＮＡを除去す
ることができる。また、当該低分子化合物は既知の化合物であるため、電気化学検出法、
表面プラズモン共鳴法や水晶振動子法による測定に与える影響も予測または測定可能であ
り、測定結果を用いて多型の検出を精度よく行うことができる。
プライマーペアのうち基板結合部位を有しない方のプライマーも伸長される。したがって
、ＰＣＲ産物には、検出の対象とならない基板結合部位を有しない一本鎖ＤＮＡも含まれ
ている。ＤＮＡのアミノ基やリン酸基は、電極表面を構成する金属と静電的な吸着を起こ
しやすく、このような非特異的なＤＮＡの付着は、電気的測定等の感度または精度を下げ
る原因となる。しかしながら、本発明の構成によれば、第３工程における洗浄によって、
電極表面に親和性を有する低分子化合物が共有結合するか、あるいはＤＮＡの水素結合を
切断するので、弱い静電作用によって測定基板表面に非特異的に吸着したＤＮＡを除去す
ることができる。また、当該低分子化合物は既知の化合物であるため、電気化学検出法、
表面プラズモン共鳴法や水晶振動子法による測定に与える影響も予測または測定可能であ
り、測定結果を用いて多型の検出を精度よく行うことができる。
本発明に係る多型検出方法では、上記電極結合部位が、チオール基、ジスルフィド基ま
たはモノスルフィド基であることが好ましい。チオール基、ジスルフィド基またはモノス
ルフィド基を有するプライマーを用いれば、伸長された／またはされなかったプライマー
からなる自己組織化単分子膜（Self Assembled monolayer; ＳＡＭ）を、金属からなる電
極表面に極めて短時間で形成することができる。
たはモノスルフィド基であることが好ましい。チオール基、ジスルフィド基またはモノス
ルフィド基を有するプライマーを用いれば、伸長された／またはされなかったプライマー
からなる自己組織化単分子膜（Self Assembled monolayer; ＳＡＭ）を、金属からなる電
極表面に極めて短時間で形成することができる。
また、第３工程で用いられる低分子化合物は、測定用基板に共有結合しうる官能基とし
て、チオール基、ジスルフィド基またはモノスルフィド基を有することが好ましい。チオ
ール基、アミノ基は、金、銀、銅、白金等の金属からなる表面に共有結合し、弱い非特異
的結合により吸着されたＤＮＡ等の汚染物質を除去することが可能である。
て、チオール基、ジスルフィド基またはモノスルフィド基を有することが好ましい。チオ
ール基、アミノ基は、金、銀、銅、白金等の金属からなる表面に共有結合し、弱い非特異
的結合により吸着されたＤＮＡ等の汚染物質を除去することが可能である。
また、第３工程で用いられる極性液体としては、アルコール、尿素、グアニジン、ＤＭ
ＳＯ、およびＤＭＦからなる群のいずれか少なくとも１種が好ましい。これらの物質は、
ＤＮＡの水素結合を切断する効果を有するため、電極表面に非特異的に付着したＤＮＡを
除去しやすくする。
ＳＯ、およびＤＭＦからなる群のいずれか少なくとも１種が好ましい。これらの物質は、
ＤＮＡの水素結合を切断する効果を有するため、電極表面に非特異的に付着したＤＮＡを
除去しやすくする。
ここで、本発明に係る多型検出方法の第４工程における測定は、表面プラズモン共鳴法
、水晶振動子法、または電気化学検出法等とすることが好ましい。電気化学検出法では、
具体的には、測定基板表面に形成された膜のインピーダンス、電流、または電荷量等が測
定される。これらの方法によれば、プライマーの伸長の有無を高感度かつ簡易に検出する
ことが可能である。
、水晶振動子法、または電気化学検出法等とすることが好ましい。電気化学検出法では、
具体的には、測定基板表面に形成された膜のインピーダンス、電流、または電荷量等が測
定される。これらの方法によれば、プライマーの伸長の有無を高感度かつ簡易に検出する
ことが可能である。
本発明の一態様におけるキットは、核酸における多型を検出するためのキットであって、一端に測定用基板に結合可能な基板結合部位が付加されたプライマーであって、前記核酸の前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリング可能なプライマーと、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬と、表面プラズモン共鳴法、水晶振動子法、または電気化学検出法による測定に使用可能な前記測定用基板と、前記測定用基板に結合しうる官能基を含む低分子化合物および／または極性液体と、を含み、前記基板結合部位は、チオール基、ジスルフィド基またはモノスルフィド基であり、前記官能基は、チオール基、ジスルフィド基またはモノスルフィド基であり、前記極性液体は、アルコール、尿素、グアニジン、ＤＭＳＯ、およびＤＭＦからなる群の少なくとも１種であることを特徴とする。
上記の本発明の態様は、核酸における多型を検出するためのキットであって、一端に測定用基板に結合可能な基板結合部位を有するプライマーであって、前記核酸の前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリング可能なプライマーと、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬と、測定用基板と、前記測定用基板に結合しうる官能基を有する低分子化合物および／または極性溶液と、を含むキットをも提供する。
上記の本発明の態様は、核酸における多型を検出するためのキットであって、一端に測定用基板に結合可能な基板結合部位を有するプライマーであって、前記核酸の前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリング可能なプライマーと、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬と、測定用基板と、前記測定用基板に結合しうる官能基を有する低分子化合物および／または極性溶液と、を含むキットをも提供する。
このような構成によれば、ユーザにおいて、上述した本発明に係る多型検出方法を、高
感度に再現性良く行うことができる。
感度に再現性良く行うことができる。
以下に、図面を参照して本発明の好ましい実施形態を詳細に説明する。
（第１の実施形態）
（第１の実施形態）
本実施形態では、試料中のＤＮＡにおける多型としてＳＮＰｓを検出する場合について
説明する。また、本実施形態では、プライマーの伸長反応の有無を電気化学検出法によっ
て測定し、測定用基板として、金電極基板を用いる方法を例に挙げて説明する。
［ＰＣＲ工程］
説明する。また、本実施形態では、プライマーの伸長反応の有無を電気化学検出法によっ
て測定し、測定用基板として、金電極基板を用いる方法を例に挙げて説明する。
［ＰＣＲ工程］
ＳＮＰｓを検出するためには、まず、ＳＮＰが存在するかどうかを検出すべきゲノムＤ
ＮＡと、上流プライマー及び下流プライマーからなる一対のプライマーと、Ｔａｑポリメ
ラーゼと、バッファーと、ｄＮＴＰｓ（デオキシヌクレオチド三リン酸）を含む試料溶液
を調製する（詳細は下記参照）。この試料溶液に含まれる上流プライマー及び下流プライ
マーのいずれか１種類のプライマーの末端には基板結合部位としてチオール基が付加され
ている。チオール基が付されたプライマーは、公知の方法またはそれに準ずる方法によっ
て当業者であれば容易に作製することが可能である。
ＮＡと、上流プライマー及び下流プライマーからなる一対のプライマーと、Ｔａｑポリメ
ラーゼと、バッファーと、ｄＮＴＰｓ（デオキシヌクレオチド三リン酸）を含む試料溶液
を調製する（詳細は下記参照）。この試料溶液に含まれる上流プライマー及び下流プライ
マーのいずれか１種類のプライマーの末端には基板結合部位としてチオール基が付加され
ている。チオール基が付されたプライマーは、公知の方法またはそれに準ずる方法によっ
て当業者であれば容易に作製することが可能である。
以下の説明では、下流プライマーがハイブリダイズする領域に、多型を含む可能性を有
する領域が含まれており、下流プライマーの末端にチオール基が付加されているものとす
る。
＜試料溶液の組成＞
ｄＮＴＰｓ （終濃度０．２ｍＭ）
上流プライマー （終濃度１．０μＭ）
下流プライマー（２０塩基） （終濃度１．０μＭ）
１０×バッファー （終濃度１×バッファー）
Ｔａｑポリメラーゼ （終濃度２ｕｎｉｔ）
ゲノムＤＮＡ （終濃度０．１〜０．２μｇ）
する領域が含まれており、下流プライマーの末端にチオール基が付加されているものとす
る。
＜試料溶液の組成＞
ｄＮＴＰｓ （終濃度０．２ｍＭ）
上流プライマー （終濃度１．０μＭ）
下流プライマー（２０塩基） （終濃度１．０μＭ）
１０×バッファー （終濃度１×バッファー）
Ｔａｑポリメラーゼ （終濃度２ｕｎｉｔ）
ゲノムＤＮＡ （終濃度０．１〜０．２μｇ）
試料溶液を調製した後、当該試料溶液を用いてＰＣＲ反応を行う。
図１は、ゲノムＤＮＡと各プライマーが相補的な場合（即ち、部位１０にＳＮＰが存在
しない場合）のＰＣＲ反応を説明するための図である。ＰＣＲ反応を生じさせるためには
、以下に示す３段階の温度変化をｎ（例えば３０〜３５）サイクル繰り返し実行する必要
がある。具体的には、まず、図１（Ａ）および（Ｂ）に示すように、第１段階（熱変性）
の温度変化（例えば９４〜９６℃）によってＳＮＰが存在する可能性のある部位１０を有
するゲノムＤＮＡ１００を熱変性し、一本鎖ＤＮＡ１１０、１２０を得る。ここで、一本
鎖ＤＮＡ１１０、１２０のうち、遺伝子情報を有するものをターゲットＤＮＡ１１０と呼
び、遺伝子情報を有しないものを相補鎖ＤＮＡ１２０と呼ぶ。
しない場合）のＰＣＲ反応を説明するための図である。ＰＣＲ反応を生じさせるためには
、以下に示す３段階の温度変化をｎ（例えば３０〜３５）サイクル繰り返し実行する必要
がある。具体的には、まず、図１（Ａ）および（Ｂ）に示すように、第１段階（熱変性）
の温度変化（例えば９４〜９６℃）によってＳＮＰが存在する可能性のある部位１０を有
するゲノムＤＮＡ１００を熱変性し、一本鎖ＤＮＡ１１０、１２０を得る。ここで、一本
鎖ＤＮＡ１１０、１２０のうち、遺伝子情報を有するものをターゲットＤＮＡ１１０と呼
び、遺伝子情報を有しないものを相補鎖ＤＮＡ１２０と呼ぶ。
次に、図１（Ｃ）に示すように、第２段階（アニーリング）の温度変化（例えば５５〜
６０℃）によって上流プライマー１３０をターゲットＤＮＡ１１０に、末端にチオール基
１５０が付加された下流プライマー１４０は相補鎖ＤＮＡ１２０に、それぞれアニーリン
グさせる。図示されたように、ゲノムＤＮＡ１００は、ＳＮＰを有しないため、いずれの
プライマーも完全なアニーリングをする。
６０℃）によって上流プライマー１３０をターゲットＤＮＡ１１０に、末端にチオール基
１５０が付加された下流プライマー１４０は相補鎖ＤＮＡ１２０に、それぞれアニーリン
グさせる。図示されたように、ゲノムＤＮＡ１００は、ＳＮＰを有しないため、いずれの
プライマーも完全なアニーリングをする。
そして、図１（Ｄ）に示すように、第３段階（伸長反応）の温度変化（例えば７２〜７
４℃）によって上流プライマー１３０、下流プライマー１４０は共に伸長される。このよ
うなサイクルがｎサイクル繰り返されることにより、プライマーに挟まれたターゲットＤ
ＮＡ１１０および相補鎖ＤＮＡ１２０の領域は、共に２n倍に増幅される。
４℃）によって上流プライマー１３０、下流プライマー１４０は共に伸長される。このよ
うなサイクルがｎサイクル繰り返されることにより、プライマーに挟まれたターゲットＤ
ＮＡ１１０および相補鎖ＤＮＡ１２０の領域は、共に２n倍に増幅される。
一方、図２は、ゲノムＤＮＡと両プライマーの少なくともいずれか一方が非相補的な場
合（即ち、部位１０にＳＮＰが存在する場合）のＰＣＲ反応を説明するための図である。
なお、本実施形態では、ゲノムＤＮＡと下流プライマーが非相補的な場合を説明するが、
ゲノムＤＮＡと上流プライマーが非相補的な場合も同様である。
合（即ち、部位１０にＳＮＰが存在する場合）のＰＣＲ反応を説明するための図である。
なお、本実施形態では、ゲノムＤＮＡと下流プライマーが非相補的な場合を説明するが、
ゲノムＤＮＡと上流プライマーが非相補的な場合も同様である。
まず、図２（Ａ）および（Ｂ）に示すように、上記と同様、第１段階の温度変化によっ
てＳＮＰが存在する可能性のある部位１０を有するゲノムＤＮＡ１００を熱変性し、ター
ゲットＤＮＡ１１０、相補鎖ＤＮＡ１２０を得る。次に、図２（Ｃ）に示すように、第２
段階の温度変化によって上流プライマー１２０はターゲットＤＮＡ１１０に、下流プライ
マー１４０は相補鎖ＤＮＡ１２０にそれぞれアニーリングさせる。しかしながら、下流プ
ライマーと相補鎖ＤＮＡ１２０では、端部においてミスマッチ（具体的には、図２（Ｃ）
に示す下流プライマー１４０の塩基「Ｇ」と相補鎖ＤＮＡ１２０の塩基「Ｔ」）が生じる
ため、アニーリングが不完全となる。
てＳＮＰが存在する可能性のある部位１０を有するゲノムＤＮＡ１００を熱変性し、ター
ゲットＤＮＡ１１０、相補鎖ＤＮＡ１２０を得る。次に、図２（Ｃ）に示すように、第２
段階の温度変化によって上流プライマー１２０はターゲットＤＮＡ１１０に、下流プライ
マー１４０は相補鎖ＤＮＡ１２０にそれぞれアニーリングさせる。しかしながら、下流プ
ライマーと相補鎖ＤＮＡ１２０では、端部においてミスマッチ（具体的には、図２（Ｃ）
に示す下流プライマー１４０の塩基「Ｇ」と相補鎖ＤＮＡ１２０の塩基「Ｔ」）が生じる
ため、アニーリングが不完全となる。
この結果、図２（Ｄ）に示すように、第３段階の温度変化によって上流プライマー１３
０は伸長されるものの、下流プライマー１４０は伸長されない。このようなサイクルがｎ
サイクル繰り返されることにより、ターゲットＤＮＡ１１０は２n倍に増幅される一方、
相補鎖ＤＮＡ１２０は増幅されない。
０は伸長されるものの、下流プライマー１４０は伸長されない。このようなサイクルがｎ
サイクル繰り返されることにより、ターゲットＤＮＡ１１０は２n倍に増幅される一方、
相補鎖ＤＮＡ１２０は増幅されない。
以上の説明から明らかなように、試料となるゲノムＤＮＡにＳＮＰが存在する場合は、
チオール基を有する下流プライマーは伸長されず、ＳＮＰが存在しない場合は、下流プラ
イマーが伸長される。従って、チオール基を有するプライマーの鎖長を検出することがで
きれば、ＳＮＰの有無を知ることができる。
［結合工程］
チオール基を有する下流プライマーは伸長されず、ＳＮＰが存在しない場合は、下流プラ
イマーが伸長される。従って、チオール基を有するプライマーの鎖長を検出することがで
きれば、ＳＮＰの有無を知ることができる。
［結合工程］
そこで、次に、下流プライマーのチオール基を、電極基板表面に結合させる。以下図３
は、図１に対応するＳＮＰが存在しない場合、図４は図２に対応するＳＮＰが存在する場
合を示すものとする。
は、図１に対応するＳＮＰが存在しない場合、図４は図２に対応するＳＮＰが存在する場
合を示すものとする。
図３（Ａ）に、ＳＮＰが存在しない場合のＰＣＲの反応後溶液Ａの模式図を、図３（Ｂ
）にＳＮＰが存在する場合のＰＣＲの反応後溶液Ａの模式図を示す。溶液Ａ中には、伸長
された上流プライマー１３０と下流プライマー１４０が略同数含まれている。
）にＳＮＰが存在する場合のＰＣＲの反応後溶液Ａの模式図を示す。溶液Ａ中には、伸長
された上流プライマー１３０と下流プライマー１４０が略同数含まれている。
ここに、図３（Ｂ）および図４（Ｂ）に示すように、電極基板５００（本実施形態では
、電極面積３ｍｍ程度の金電極基板）を浸漬させると、下流プライマー１４０のチオール
基１５０が電極基板５００表面に吸着結合される。一方、伸長された上流プライマーもそ
のリン酸基やアミノ基による静電作用の結果、電極基板５００表面に非特異的に吸着する
。このままの状態で電気的測定を行うと、非特異的に吸着した上流プライマーが、予測不
可能な影響を与え、正確な測定結果を得られない。
［洗浄工程］
、電極面積３ｍｍ程度の金電極基板）を浸漬させると、下流プライマー１４０のチオール
基１５０が電極基板５００表面に吸着結合される。一方、伸長された上流プライマーもそ
のリン酸基やアミノ基による静電作用の結果、電極基板５００表面に非特異的に吸着する
。このままの状態で電気的測定を行うと、非特異的に吸着した上流プライマーが、予測不
可能な影響を与え、正確な測定結果を得られない。
［洗浄工程］
そこで、図３（Ｃ）および図４（Ｃ）に示すように、電極基板５００を、チオール基を
有する低分子化合物を含む溶液Ｂに浸漬させる。その結果、低分子化合物のチオール基が
電極基板５００の表面に共有結合し、弱い静電結合で吸着していた上流プライマー１３０
は電極基板５００表面から除去される。また、チオール基に代えて、ジスルフィド基やモ
ノスルフィド基を有する低分子化合物も用いることができる。吸着速度の大きさはチオー
ル基の方がジスルフィド基やモノスルフィド基よりも大きいことが知られている。したが
って、プライマーにチオール基を導入し、洗浄液に含まれる低分子化合物をジスルフィド
基またはモノスルフィド基をもつ化合物にすることで、プライマー分子膜を排除すること
なく、より確実に洗浄を行うことができる。
有する低分子化合物を含む溶液Ｂに浸漬させる。その結果、低分子化合物のチオール基が
電極基板５００の表面に共有結合し、弱い静電結合で吸着していた上流プライマー１３０
は電極基板５００表面から除去される。また、チオール基に代えて、ジスルフィド基やモ
ノスルフィド基を有する低分子化合物も用いることができる。吸着速度の大きさはチオー
ル基の方がジスルフィド基やモノスルフィド基よりも大きいことが知られている。したが
って、プライマーにチオール基を導入し、洗浄液に含まれる低分子化合物をジスルフィド
基またはモノスルフィド基をもつ化合物にすることで、プライマー分子膜を排除すること
なく、より確実に洗浄を行うことができる。
洗浄に用いられる低分子化合物としては、例えば以下のものが挙げられる。
水酸基を有するチオール化合物としては、一般式、ＨＳ−ＣnＨ2n−ＯＨで表される、
３−メルカプトプロパノール（分子量９２．１６）、６−メルカプトヘキサノール（分子
量１３４．２４）等；一般式ＨＳ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）n−ＯＨで表さ
れるＰＥＧチオール等が挙げられる。
３−メルカプトプロパノール（分子量９２．１６）、６−メルカプトヘキサノール（分子
量１３４．２４）等；一般式ＨＳ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）n−ＯＨで表さ
れるＰＥＧチオール等が挙げられる。
また、アミノ基を有するチオール化合物としては、一般式、ＨＳ−ＣnＨ2n−ＮＨ2で表
されるアミノエタンチオール（分子量７７．１５）等；カルボキシル基を有するチオール
化合物として一般式、ＨＳ−ＣnＨ2n−ＣＯＯＨで表される３−メルカプトプロピオン酸
（分子量１０６．１４）等；ジスルフィド基を有する化合物としては、一般式、ＨＯＯＣ
−ＣnＨ2n−Ｓ−Ｓ−ＣmＨ2m−ＣＯＯＨで表される３，３'−ジチオジプロピオン酸（分
子量２１０．２７）；一般式、ＨＯ−ＣnＨ2n−Ｓ−Ｓ−ＣmＨ2m−ＯＨで表される３，３
'−ジチオジエタノール（分子量１５４．２５）等；モノスルフィド化合物として、一般
式、ＨＯＯＣ−ＣnＨ2n−Ｓ−ＣmＨ2m−ＣＯＯＨで表される３，３'−チオジプロピオン
酸（分子量１７８．２１）、一般式、ＨＯ−ＣnＨ2n−Ｓ−ＣmＨ2m−ＯＨで表される３，
３'−チオジプロパノール（分子量１５０．２４）等が挙げられる。
されるアミノエタンチオール（分子量７７．１５）等；カルボキシル基を有するチオール
化合物として一般式、ＨＳ−ＣnＨ2n−ＣＯＯＨで表される３−メルカプトプロピオン酸
（分子量１０６．１４）等；ジスルフィド基を有する化合物としては、一般式、ＨＯＯＣ
−ＣnＨ2n−Ｓ−Ｓ−ＣmＨ2m−ＣＯＯＨで表される３，３'−ジチオジプロピオン酸（分
子量２１０．２７）；一般式、ＨＯ−ＣnＨ2n−Ｓ−Ｓ−ＣmＨ2m−ＯＨで表される３，３
'−ジチオジエタノール（分子量１５４．２５）等；モノスルフィド化合物として、一般
式、ＨＯＯＣ−ＣnＨ2n−Ｓ−ＣmＨ2m−ＣＯＯＨで表される３，３'−チオジプロピオン
酸（分子量１７８．２１）、一般式、ＨＯ−ＣnＨ2n−Ｓ−ＣmＨ2m−ＯＨで表される３，
３'−チオジプロパノール（分子量１５０．２４）等が挙げられる。
なお、洗浄工程において、ＰＣＲ反応後のプライマーにも洗浄液に含まれる低分子化合
物にもチオール基、ジスルフィド基またはモノスルフィド基が含まれるため、先に形成し
たプライマーの吸着膜を洗浄液の低分子化合物が除去してしまうことが心配される。しか
しながら、一般的に分子量の小さなチオール基などを含む化合物はより分子量が大きな化
合物よりもエネルギー的に不安定であることが知られている。したがって、先に形成され
たプライマーの吸着膜を第三の工程で用いた洗浄液に含まれる低分子化合物が除去してし
まうことは無い。
物にもチオール基、ジスルフィド基またはモノスルフィド基が含まれるため、先に形成し
たプライマーの吸着膜を洗浄液の低分子化合物が除去してしまうことが心配される。しか
しながら、一般的に分子量の小さなチオール基などを含む化合物はより分子量が大きな化
合物よりもエネルギー的に不安定であることが知られている。したがって、先に形成され
たプライマーの吸着膜を第三の工程で用いた洗浄液に含まれる低分子化合物が除去してし
まうことは無い。
また、さらにここで、ＤＮＡの非特異的吸着を阻害する物質を添加することも効果的で
あり、このような物質として、アルコール、尿素、グアニジン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦなどの
極性溶液が挙げられる。
［電気化学的測定］
あり、このような物質として、アルコール、尿素、グアニジン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦなどの
極性溶液が挙げられる。
［電気化学的測定］
次に図３（Ｄ）および図４（Ｄ）に示すように、電極をインピーダンス測定のための測
定溶液に移し、電極基板５００に、インピーダンス測定装置６００を接続して測定を行う
。測定溶液の組成の一例を以下に示す。
＜測定溶液の組成＞
ＰＢＳ（ｐＨ７．０） （５０ｍＭ）
ＮａＣｌ （１Ｍ）
ＭｇＣｌ2 （１０ｍＭ）
定溶液に移し、電極基板５００に、インピーダンス測定装置６００を接続して測定を行う
。測定溶液の組成の一例を以下に示す。
＜測定溶液の組成＞
ＰＢＳ（ｐＨ７．０） （５０ｍＭ）
ＮａＣｌ （１Ｍ）
ＭｇＣｌ2 （１０ｍＭ）
この場合も、電極基板５００表面には、下流プライマー１４０以外に低分子化合物によ
る単分子膜が形成されることになるが、かかる低分子化合物は既知の化合物であるため、
電気的測定に与える影響も予測可能である。例えば、低分子化合物のみが電極基板表面を
覆っている場合のインピーダンスの測定値を、プライマーを固定した場合の測定結果から
差し引くなどの方法により伸長の有無を正確に判定できる。
る単分子膜が形成されることになるが、かかる低分子化合物は既知の化合物であるため、
電気的測定に与える影響も予測可能である。例えば、低分子化合物のみが電極基板表面を
覆っている場合のインピーダンスの測定値を、プライマーを固定した場合の測定結果から
差し引くなどの方法により伸長の有無を正確に判定できる。
以上説明したように、上記方法によれば、インピーダンスの容量成分を測定するといっ
た簡便な方法によって伸長反応が生じたか否か（本実施形態ではＳＮＰ部位に特定の塩基
配列が存在するか否か）を精度良く検出することができるため、ＳＮＰタイピングに基づ
いた薬の投与といったテーラーメイド医療に活用することができる。
た簡便な方法によって伸長反応が生じたか否か（本実施形態ではＳＮＰ部位に特定の塩基
配列が存在するか否か）を精度良く検出することができるため、ＳＮＰタイピングに基づ
いた薬の投与といったテーラーメイド医療に活用することができる。
また、本実施形態では、測定用基板に結合しうる官能基を有する低分子化合物を含む溶
液で洗浄する例を示したが、極性溶媒のみを含む溶液で洗浄してもよい。
液で洗浄する例を示したが、極性溶媒のみを含む溶液で洗浄してもよい。
また、本実施形態では、標的となるＤＮＡとしてＳＮＰ部位を有するＤＮＡを例示した
が、抽出動物組織、菌体、培養細胞などから抽出したＳＮＰ部位を有していないＤＮＡを
標的としても良い。これらの検体に適用することで、遺伝病の診断、細菌及びウイルスな
どによる食品の汚染検査、細菌及びウイルスなどの人体への感染検査に活用することがで
きる。
が、抽出動物組織、菌体、培養細胞などから抽出したＳＮＰ部位を有していないＤＮＡを
標的としても良い。これらの検体に適用することで、遺伝病の診断、細菌及びウイルスな
どによる食品の汚染検査、細菌及びウイルスなどの人体への感染検査に活用することがで
きる。
また、本実施形態では、電気化学検出法の一例として、インピーダンスの容量成分を測
定（電気的測定）することで伸長反応が生じたか否か（ＳＮＰ部位に特定の塩基配列が存
在するか否か）を検出する方法を示したが、電気化学検出法は、電流測定や電荷量測定に
よって伸長反応が生じたか否かを検出する方法も含む。また、伸長反応の有無の検出は、
電気化学検出法のほか、表面プラズモン共鳴法や水晶振動子法によっても行うことができ
る。表面プラズモン共鳴法を用いる場合は、測定用基板として、例えば表面に金薄膜が形
成されたガラス基板等を用いることができる。また、水晶振動子法を用いる場合は、両面
に電極が貼り付けられた水晶振動子を測定用基板とすることができる。
定（電気的測定）することで伸長反応が生じたか否か（ＳＮＰ部位に特定の塩基配列が存
在するか否か）を検出する方法を示したが、電気化学検出法は、電流測定や電荷量測定に
よって伸長反応が生じたか否かを検出する方法も含む。また、伸長反応の有無の検出は、
電気化学検出法のほか、表面プラズモン共鳴法や水晶振動子法によっても行うことができ
る。表面プラズモン共鳴法を用いる場合は、測定用基板として、例えば表面に金薄膜が形
成されたガラス基板等を用いることができる。また、水晶振動子法を用いる場合は、両面
に電極が貼り付けられた水晶振動子を測定用基板とすることができる。
また、本実施形態では、特定の塩基配列と相補的に結合する相補結合配列によって構成
されているプライマーを例示したが、例えば東洋紡績（株）によって開発されたＡＳＰ(A
llele Specific Primer)のように、一部に非相補的配列を含むプライマーについても適用
可能である。このＡＳＰは、プライマーの３'末端から２番目の塩基がＳＮＰ部位に対応
しており、さらに３'末端から３番目の塩基が標的となる塩基に対して必ず非相補的にな
るように設計されたプライマーである。かかるＡＳＰの末端に電極結合部位を付加してお
くことで、煩雑な処理作業等を行うことなく、伸長反応が生じたか等を検出することがで
きる。
（第２の実施形態）
されているプライマーを例示したが、例えば東洋紡績（株）によって開発されたＡＳＰ(A
llele Specific Primer)のように、一部に非相補的配列を含むプライマーについても適用
可能である。このＡＳＰは、プライマーの３'末端から２番目の塩基がＳＮＰ部位に対応
しており、さらに３'末端から３番目の塩基が標的となる塩基に対して必ず非相補的にな
るように設計されたプライマーである。かかるＡＳＰの末端に電極結合部位を付加してお
くことで、煩雑な処理作業等を行うことなく、伸長反応が生じたか等を検出することがで
きる。
（第２の実施形態）
本発明の第２の実施形態は、上述した本発明に係る多型検出方法に用いられるキットで
ある。かかるキットには、少なくとも、検出しようとする多型を含む領域にアニーリング
し、その一旦に基板結合部位を有するプライマーと、ＰＣＲ用試薬と、測定用基板と、洗
浄工程で用いられる基板結合部位を有する低分子化合物および／または極性溶液を含む。
ある。かかるキットには、少なくとも、検出しようとする多型を含む領域にアニーリング
し、その一旦に基板結合部位を有するプライマーと、ＰＣＲ用試薬と、測定用基板と、洗
浄工程で用いられる基板結合部位を有する低分子化合物および／または極性溶液を含む。
測定用基板、基板結合部位を有する低分子化合物、極性溶液等については、既に説明し
たので、ここでは説明を省略する。
たので、ここでは説明を省略する。
ＰＣＲ用試薬は上述したＰＣＲ反応溶液に添加される試薬等とすることができ、また上
記キットは、測定に用いられる溶液を構成する試薬等を含んでいてもよい。
記キットは、測定に用いられる溶液を構成する試薬等を含んでいてもよい。
このようなキットは、それぞれの構成要素がユーザにおいて使用しやすい量に小分けさ
れていることが好ましく、必要に応じて取扱説明書等が添付される。
れていることが好ましく、必要に応じて取扱説明書等が添付される。
１０…ＳＮＰ部位、１００…ゲノムＤＮＡ、１１０…ターゲットＤＮＡ、１２０…相補
鎖ＤＮＡ、１３０，１４０…プライマー、１５０…電極結合部位、２００…低分子化合物
、５００…電極基板、６００…インピーダンス測定装置
鎖ＤＮＡ、１３０，１４０…プライマー、１５０…電極結合部位、２００…低分子化合物
、５００…電極基板、６００…インピーダンス測定装置
Claims (2)
- 核酸における多型を検出する方法であって、
一端に測定用基板に結合可能な基板結合部位が付加されたプライマーであって、前記核酸の前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリング可能な前記プライマーを使用する方法であり、
前記核酸と、前記プライマーとを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う第１工程と、
前記ポリメラーゼ連鎖反応の産物の前記基板結合部位と前記測定用基板とを結合させる第２工程と、
前記測定用基板に結合しうる官能基を含む低分子化合物および／または極性液体を含む液体で、前記測定用基板表面を洗浄する第３工程と、
表面プラズモン共鳴法、水晶振動子法、または電気化学検出法により前記測定用基板に結合した前記プライマーの伸長反応の有無を測定することによって、多型の有無を検出する第４工程と、を含み、
前記基板結合部位は、チオール基、ジスルフィド基またはモノスルフィド基であり、
前記官能基は、チオール基、ジスルフィド基またはモノスルフィド基であり、
前記極性液体は、アルコール、尿素、グアニジン、ＤＭＳＯ、およびＤＭＦからなる群の少なくとも１種であることを特徴とする多型検出方法。 - 核酸における多型を検出するためのキットであって、
一端に測定用基板に結合可能な基板結合部位が付加されたプライマーであって、前記核酸の前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリング可能なプライマーと、
ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬と、
表面プラズモン共鳴法、水晶振動子法、または電気化学検出法による測定に使用可能な前記測定用基板と、
前記測定用基板に結合しうる官能基を含む低分子化合物および／または極性液体と、を含み、
前記基板結合部位は、チオール基、ジスルフィド基またはモノスルフィド基であり、
前記官能基は、チオール基、ジスルフィド基またはモノスルフィド基であり、
前記極性液体は、アルコール、尿素、グアニジン、ＤＭＳＯ、およびＤＭＦからなる群の少なくとも１種であることを特徴とするキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005117864A JP4561451B2 (ja) | 2005-04-15 | 2005-04-15 | 多型検出方法および多型検出用キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005117864A JP4561451B2 (ja) | 2005-04-15 | 2005-04-15 | 多型検出方法および多型検出用キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006296208A JP2006296208A (ja) | 2006-11-02 |
| JP4561451B2 true JP4561451B2 (ja) | 2010-10-13 |
Family
ID=37465077
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005117864A Expired - Fee Related JP4561451B2 (ja) | 2005-04-15 | 2005-04-15 | 多型検出方法および多型検出用キット |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4561451B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5233650B2 (ja) | 2008-12-18 | 2013-07-10 | ソニー株式会社 | タンパク質固定化電極およびその製造方法ならびに機能素子およびその製造方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05199898A (ja) * | 1990-09-28 | 1993-08-10 | Toshiba Corp | 遺伝子検出法 |
| JP2002531100A (ja) * | 1998-12-01 | 2002-09-24 | イッスム・リサーチ・デベロプメント・カムパニー・オブ・ザ・ヘブリュー・ユニバシティー・オブ・エルサレム | 試料中のオリゴヌクレオチドの検出のための方法およびシステム |
| JP2003230386A (ja) * | 2002-02-07 | 2003-08-19 | Shigeori Takenaka | 試料中の標的核酸を定量する方法、及びこれに用いられる装置 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE0301951D0 (sv) * | 2003-06-30 | 2003-06-30 | Pyrosequencing Ab | New method |
-
2005
- 2005-04-15 JP JP2005117864A patent/JP4561451B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05199898A (ja) * | 1990-09-28 | 1993-08-10 | Toshiba Corp | 遺伝子検出法 |
| JP2002531100A (ja) * | 1998-12-01 | 2002-09-24 | イッスム・リサーチ・デベロプメント・カムパニー・オブ・ザ・ヘブリュー・ユニバシティー・オブ・エルサレム | 試料中のオリゴヌクレオチドの検出のための方法およびシステム |
| JP2003230386A (ja) * | 2002-02-07 | 2003-08-19 | Shigeori Takenaka | 試料中の標的核酸を定量する方法、及びこれに用いられる装置 |
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