KR101214179B1 - 표적 물질 검출용 가교 부재 - Google Patents

Abstract

주형 분자와 표적 분자 사이의 결합에 의한 물리적 변화는 주형 분자의 변화를 모니터함으로써 검출된다. 그 변화의 예에는 주형 분자의 물리적 크기 또는 강직성, 주형 분자의 전기 전도율의 변화 및 표적 분자와 주형 분자를 해리시키는 데 필요한 에너지 변화가 있다. 이러한 변화의 크기는 표적 분자의 특이적 동일성의 지표이다.

센서 장치, 가교 부재, 표적 물질, 주형 물질

Description

표적 물질 검출용 가교 부재{BRIDGED ELEMENT FOR DETECTION OF A TARGET SUBSTANCE}

관련 출원에 대한 참조 정보

본 출원은 35 U.S.C 119(e)에 의거하여 2003년 8월 6일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 60/493,142(발명의 명칭: "METHOD AND BIO-ELECTRONIC DEVICE FOR RAPID DETECTION OF ANALYTES SUCH AS BIOLOGICAL AGENTS"; Fred G. Albert et al.)를 우선권 주장하는 출원이다.

본 출원은 일반적으로 센서 장치에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 표적 물질의 검출 및 분석에 관한 것이지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

분석물, 예컨대 생물학적 인자, 병원균, 박테리아, 바이러스, 진균, 분자 및 독소 등을 검출하기 위한 종래의 노력들은 비교적 까다롭고, 시간 소모적이며 작업에 상당한 기술적 전문 지식을 필요로 한다. 그 예로서, 일반적으로 수 일의 장기간 걸쳐 페트리 평판에서 시료를 항온배양할 것을 필요로 하는 기술이 있다. 또 다른 기술에서는 특정 병원성 박테리아의 존재를 검출하기 위해 선택된 염색 항체의 사용을 수반하기도 한다.

또한, 일부 시스템에서는 실패하기 쉽고 고도의 기술적 숙련이 요구되는 증폭 절차로 처리되는 표적 생물 분자가 사용되기도 한다. 더구나, 증폭은 때로 표적 생물 인자의 농도를 측정할 수 없어서 당해 기술분야에 실용적으로 사용되지 않는다.

일부 시스템은 생물 인자의 천연 또는 조작된 변화를 검출하지 못하고, 잘못된 양성 오류를 발생하는 것으로 알려져 있고, 시험 조건에 민감하다. 생물 분자(예컨대, DNA 서열 또는 단백질)를 검출하는 몇몇 장치는 효과적인 작업을 위해 표적 분자를 다량으로 필요로 한다. 따라서, 표적 분자는 증폭되어야 하고, 몇몇 경우에는 주형 분자의 추가 사용을 방지하기 위하여 테그(tagged)되어야 한다.

첨부도면의 그림은 실제 치수의 비율을 반드시 그대로 반영한 것은 아니다. 동일한 참조 번호는 실질적으로 유사한 부품을 나타낸다. 다름 첨자가 붙여지는 동일한 참조번호는 실질적으로 동일한 부품의 다른 예를 나타낸다. 이러한 도면들은 본 발명에서 논의되는 각종 양태들을 한정하는 것이 아닌 예시하기 위해 일반적으로 설명한 것이다.

도 1은 표적 분자를 검출하는 방법의 흐름도이다.

도 2는 캔틸레버 검출기를 도시한 것이다.

도 3은 캔틸레버 구조의 일부를 도시한 것이다.

도 4는 시간의 함수로서 치환을 나타낸 그래프이다.

도 5A 및 도 5B는 캔틸레버 검출기 시스템을 도시한 것이다.

도 6은 전압의 함수로서 전류를 나타낸 그래프이다.

도 7A 및 도 7B는 시간의 함수로서 측정된 변수를 예시한다.

도 8은 공진의 이동을 도시한 것이다.

도 9는 주형 분자의 제조방법을 흐름도로 도시한 것이다.

도 10 및 도 11은 표적 분자의 검출방법을 흐름도로 도시한 것이다.

도 12는 시스템의 캔틸레버 배열을 개략적으로 도시한 것이다.

도 13은 휴대용 검출기의 일 예를 도시한 것이다.

이하의 상세한 설명은 이러한 상세한 설명의 일부를 구성하는 첨부 도면에 대한 설명을 포함한다. 도면은 본 발명이 수행될 수 있는 특정 양태를 예시적으로 보여준다. 본 명세서에서 "실시예"로 언급하기도 한 이러한 양태들은 당해 기술분야의 숙련된 자들이 본 발명을 실행하기에 충분히 상세하게 기술했다. 이러한 양태들은 조합되거나, 다른 양태들이 이용되거나, 또는 본 발명의 영역을 벗어나지 않는 범위 내에서 구조적 변화, 논리적 변화 및 전기적 변화가 이루어질 수 있다. 따라서, 다음의 상세한 설명은 제한적인 의미로 간주되어서는 안되며, 본 발명의 영역은 첨부되는 청구의 범위 및 이의 등가물에 의해 한정된다.

본 명세서에서, 단수적 표현은 특허 명세서에서 흔히 사용되듯이 하나 또는 그 이상의 의미를 포함하는 것이다. 본 명세서에서, "또는"이란 용어는 다른 표시가 없는 한 비독점물을 나타내는 데 사용된다. 더욱이, 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 명세서들은 개별적으로 참고 원용되고 있지만, 그 전문이 참고 원용된 것이다. 본 명세서와 여기에 참고 원용된 명세서에서 불일치하는 용어들이 있는 경우, 원용된 참고 문헌의 용어는 본 명세서에의 용어에 부수적인 용어로 간주되어야 하며; 서로 상충되는 모순인 경우, 본 명세서의 용어로 해석되어야 한다.

본 발명의 일부를 구성하는 첨부 도면은 본 발명의 주제가 수행될 수 있는 특정 양태를 제한이 아닌 예시의 수단으로 나타낸 것이다. 예시된 양태들은 당업자가 본 명세서에 개시된 교시들을 수행할 수 있기에 충분히 상세하게 기술되고 있다. 이러한 양태로부터 다른 양태들이 유도되어 이용될 수 있지만, 이러한 구조적, 논리적 치환 및 변화는 본 명세서의 영역을 벗어나지 않는 범위에서 이루어질 수 있다. 따라서, 상세한 설명은 제한적인 의미로 간주되어서는 안 되며, 각종 양태의 범위는 첨부되는 청구항들의 자격이 되는 등가물의 전 범위와 함께 첨부된 청구항들에 의해서만 한정되어진다.

본 발명의 주제가 되는 이러한 양태들은 본 명세서에서 각각 또는 함께 편의상 "본 발명"이라고 언급하였고, 이는 실제 하나 이상의 발명이 개시된 경우 본 출원의 범위를 어느 한 발명 또는 발명의 개념에 임의로 제한하기 위한 것이 아니다. 즉, 특정 양태들이 본 명세서에 예시되어 설명되었지만, 동일 목적을 달성하는 것으로 추정된 어떠한 배열도 예시된 특정 양태 대신에 사용될 수 있음은 자명하다. 본 출원은 각종 양태들의 임의의 모든 개조 또는 변형 또는 조합을 포함하는 것이다. 전술한 양태들과 본 명세서에 구체적으로 설명되지 않은 다른 양태들의 조합은 상기 상세한 설명을 검토를 바탕으로 할 때 당업자에게는 명백한 것이다.

개요

분자는 환경 변화에 따라 영향을 받는다. 예컨대, 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA)은 이의 상보적 ssDNA의 도입에 반응한다. 한 DNA 가닥과 이의 상보적 가닥의 하이브리드화는 DNA 전도성의 변화는 물론 총 길이의 감소를 초래한다. 이러한 변화는 측정가능한 영향이 있는 단일 뉴클레오타이드 부정합(mismatch)이 있을지라도 두 DNA 가닥 사이의 정합(match)의 충실도에 정비례한다. 이러한 변화를 분석하면 각종 병원균을 식별할 수 있고 특정 균주 사이의 차이를 구분할 수 있다.

일 예로서, 미세전자기계(MEMS) 구조는 하이브리드화와 관련된 분자 변화를 측정하는 데 사용된다. 예를 들어, MEMS 칩(chip) 안의 이동 부재는 선택된 단일 가닥 DNA 구조에 의해 가교결합된다. 이 부재의 편향 및 하이브리드화 후 전도성의 측정에 기초하여 상보성 단편이 검출되고 식별된다. 일 예로, 하이브리드화 반응을 검출 및 식별의 수단으로 해석하기 위하여 시그널 처리가 사용된다. 공지 병원균과 변종 병원균 사이, 그리고 양성과 악성 균주를 구별하는 데에는 길이 및 전도성 변화 대 DNA 가닥 상동성 간의 상관관계가 사용된다.

또한, 하이브리드화 후 가해지는 전압은 병원균 DNA 가닥 또는 표적 분자가 주형 분자에서 해리되게 한다. 표적 분자 해리 시의 전류는 또한 표적 분자의 식별을 위한 정보를 제공할 수 있다. 또한, 표적 분자를 해리시키면 또 다른 검출 반응을 위한 센서가 준비될 수 있다. 더욱이, 센서의 완전성은 감지 반응 전에 주형 분자를 통해 소량의 전류를 전도시켜 연속성을 확인함으로써 검사될 수 있다. 일 예로, DNA-가교결합된 MEMS 센서 배열은 다수의 바이러스 또는 박테리아 병원균을 동시에 다중 검출할 수 있게 하거나, 단일 병원균의 농도를 측정할 수 있게 해준다.

또한, 주형 분자의 공진은 그 변화가 주형 분자에 결합하는 시료의 식별에 사용된다. 일 예로, 캔틸레버의 이동성 말단은 주형 분자를 통해 구조에 가교결합된다. 캔틸레버 시스템(주형 분자가 가교결합된 것)의 공진 진동수는 주형 분자와 시료의 하이브리드화 시 변화할 것이다. 이러한 진폭 또는 진동수 이동의 크기 및 방향을 이용하면 상동성의 정도를 측정할 수 있다.

예시적 방법

도 1은 표적 물질을 검출 및 식별하는 절차(100)의 일 예를 도시한 것이다. 일 예로서, 표적 물질에는 단일 가닥 DNA 단편이 포함된다.

본 명세서에 사용된 표적 분자 및 주형 분자는 신조어로서, 이러한 분자들이 함께 결합하는 방식에 따라 상대적이다. 즉, 특정 센서가 주형 분자로서 제1 ssDNA 가닥을 사용하면 제2 ssDNA 가닥은 표적 분자이고, 또 다른 센서는 표적 분자로서 제1 ssDNA 가닥을 사용하고 주형 분자로서 제2 ssDNA 가닥을 사용할 수 있다.

또한, 결합 파트너의 다른 조합도 가능하다. 예컨대, 주형 분자 또는 표적 분자 중 어느 하나는 핵산 분자(예컨대, 이하 ssRNA로 불리는 RNA 또는 ssDNA를 비롯한 올리고뉴클레오타이드), 단백질 및 탄수화물을 포함할 수 있다. 단일 가닥 DNA를 함유하는 주형 분자는 이의 상보적인 DNA 가닥에 하이브리드하여 이중 가닥 DNA(ds-DNA)를 형성할 수 있다. 또한, 단백질을 포함하는 주형 분자는 또한 단백질(단백질-단백질 인식을 통해), 핵산(단백질-핵산 인식을 통해) 또는 탄수화물(단백질-탄수화물 인식을 통해)을 포함하는 주형 분자에 결합할 수 있다. 또한, 핵산을 포함하는 주형 분자는 DNA(핵산-핵산 인식을 통해) 또는 탄수화물(핵산-탄수화물 인식을 통해)을 사용하여 핵산을 포함하는 표적 분자에 결합할 수 있다. 또한, 탄수화물을 포함하는 주형 분자는 탄수화물을 포함하는 표적 분자(탄수화물-탄수화물 인식을 통해)에 결합할 수 있다. 일반적으로, 주형 분자-표적 분자 조합은 특정 분자가 다른 분자와 유일하게 결합하게 하는 자물쇠와 열쇠 기구로 설명될 수 있다.

105에서는 분석될 시료가 수집된다. 이러한 시료는 잠재적으로 표적 분자를 포함하는 것으로서, 기체, 액체 또는 고체 형태일 수 있다. 110에서는 시료가 분석을 위해 준비되며, 일 예로 시료의 여과가 포함된다. 115에서는 시료가 분석을 위해 센서로 전달된다. 시료 전달은 일 예로서 미량유동성 펌프, 밸브, 채널, 저장기 또는 다른 구조를 이용하여 시료를 전달하는 것을 포함한다. 120에서, 시료는 가능한 검출 및 식별을 위하여 하나 이상의 센서로 도입된다. 다양한 예에서, 검출 및 식별은 길이 또는 위치의 변화, 힘의 변화, 전기전도성 또는 저항의 변화에 대해 모니터하는 단계, 주형 분자에서 시료의 절단에 대한 시그널 수준을 측정하는 단계 및 공진 이동을 측정하는 단계를 포함한다. 125에서, 수집된 데이터는 시료의 검출 및 식별을 위해 조사 분석된다. 데이터의 조사 분석은 다양한 예에서 주형 분자와 표적 분자의 상관관계를 나타내는 룩업 표를 포함하는 저장 데이터와 출력 시그널을 비교하는 단계를 포함한다.

다른 절차도 사용할 수 있다. 예컨대, 다양한 변수를 모니터하여 시료를 센서에 노출시키기에 앞서서 센서 완전성 시험을 수행할 수 있다.

예시적 캔틸레버 센서

도 2는 일 예에 따른 센서(200)를 도시한 것이다. 기재(215)는 캔틸레버가 조립되는 구조 또는 대조 제물대 역할을 한다. 베이스(210)는 캔틸레버(205A)의 한쪽 말단에 부착되어 캔틸레버(205A)를 기재(215) 위로 상승시킨다. 일 예로서, 캔틸레버(205A)의 크기는 길이 약 200㎛ x 폭 20㎛ x 두께 1㎛이다. 이 캔틸레버의 자유 말단에 주형 분자(220)의 일부가 부착된다.

이 도면은 한쪽 말단이 캔틸레버(205A)의 자유 말단에 결합되어 있고 다른쪽 말단이 기재(251)의 일부에 결합되어 있는 주형 분자(220)를 선형 부재로서 나타내고 있다. 즉, 캔틸레버(205A)와 기재(215) 사이의 공간이 주형 분자(220)에 의해 가교결합되어 있다.

이 도면에서, 주형 분자(220)는 상보성 결합 파트너가 결합되어 있지 않은 시점의 주형 분자를 나타낸 것이며, 캔틸레버(205A)는 이완 상태 또는 무적재 상태의 캔틸레버를 나타낸다. 캔틸레버(205A)의 대체 위치는 점선으로 표시했다. 예컨대, 캔틸레버(205B)는 결합 파트너가 주형(220)과 결합한 시점의 캔틸레버를 도시한 것이다. 캔틸레버(205B)는 캔틸레버(205A)가 표시된 위치에서 거리 D1만큼 아래로 이동되어 있다. 주형 분자(220)는 낮은 친화성의 결합 파트너와 결합된 것이다. 캔틸레버(205C)는 다른 결합 파트너가 주형(220)과 결합되어 있는 시점의 캔틸레버를 도시한 것이다. 캔틸레버(205C)는 캔틸레버(205A)가 표시된 위치보다 거리 D2만큼 아래로 이동되어 있다. 즉, 캔틸레버(205C)는 캔틸레버(205B)로 표시한 결합 파트너보다 더 큰 친화성으로 결합 파트너와 결합되어 있다.

캔틸레버(205A)의 이동은 일 예로 광학 검출 시스템에 의해 검출된다. 이 도면에서, 광학원(230)은 캔틸레버(205A)의 표면에 광선빔(250)을 투사하고, 이는 광선(245A)으로 표시된 바와 같이 반사하여 광학 센서(235)의 셀(240A)에 의해 검출된다. 캔틸레버(205B)는 광선(245B)으로 표시된 바와 같이 광을 반사하여 셀(240B)에 의해 검출되며, 캔틸레버(205C)는 광선(245C)로 표시된 바와 같이 광을 반사하여 셀(240C)에 의해 검출된다. 센서(235)는 3개의 셀을 갖는 것으로 예시되어 있지만, 그 이상 또는 그 이하인 것도 생각될 수 있다. 일 예로서, 광학원(230)에는 레이저 또는 다른 조준된 광원이 포함될 수 있다.

캔틸레버(205A)의 이동이나 공진을 검출하는 다른 수단도 생각될 수 있다. 일 예로서, 압전기 부재는 캔틸레버(205A) 편향의 함수로서 전기 시그널을 제공한다. 압전기 부재는 캔틸레버(205A)의 표면, 베이스(210) 또는 다른 구조에 결합되거나 통합된 압전기 물질을 포함한다.

일 예로서, 이동이나 공진을 측정하기 위하여 정전용량의 측정값이 사용되기도 한다. 예컨대, 캔틸레버 구조의 전도성 층이 축전기 판으로 작용한다. 캔틸레버의 전도성 층과 다른 전도체 사이의 정전용량은 전도체들 간의 거리에 따라 달라진다. 즉, 정전용량의 측정값은 이동 및 공진 데이터를 제공할 수 있다. 다양한 예에서, 캔틸레버의 전도성 층은 캔틸레버의 다른 전도성 층으로부터 전기적으로 절연되어 있다.

일 예에 따르면, 캔틸레버 구조의 이동 또는 공진의 측정에 자기장 또는 전기장이 사용된다. 여기서는 자석과 전도체 사이의 상대적 이동이 이동 또는 공진의 측정에 사용되는 시그널을 제공한다. 또한, 캔틸레버에 부착된 변형 게이지가 이동 및 공진 정보를 제공하기도 한다.

예시적 캔틸레버 구조

도 3은 지향성 주형 회로(DiTC) 구조를 이용하여 조립된 센서 구조의 일 예를 도시한 것이다. 지향성 주형 회로는 미세전자기계 시스템, 자기 조립식 단층(SAM) 및 DNA 하이브리드화를 이용한다. 석판술을 이용하면 은(Ag), 크롬(Cr), 금(Au) 및 탄소와 같은 금속을 비롯한 다양한 물질의 박막이 마이크론 크기 치수로 패턴화된다. 자기 조립식 단층은 MEMS 표면에 주형 분자를 선택적으로 고정시킨다. 또한, 단백질 및 다른 생체분자는 SAM을 사용하여 금과 같은 표면 위에 고정될 수 있다. 또한, 표적 분석물은 전극 상의 SAM 및 전류법을 사용하여 검출할 수 있다.

지향성 주형 회로의 일 양태에 따르면, SAM 기술은 크롬 위에 도금된 금 위에 단백질 스트렙트아비딘의 단층을 적용하는 데 사용된다. 스트렙트아비딘은 금 표면에 존재하는 비오틴화된 이황화 단층에 단백질의 결합 시, 금 전극 표면에 고정된다.

이와 같은 비오틴계 약품은 도 8에 도시된 바와 같은 단일 가닥 DNA 주형 가교에 하이브리드하도록 특이적으로 설계 및 합성된 약 20 내지 100 염기의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 결합시키는 데 사용된다. 이러한 지향성 주형 회로 프라이머는 ssDNA 주형 가교의 배향 및 위치 제어를 유도한다(즉, 좌선성 프라이머).

일 예로서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 주형은 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 전자 MEMS 계 회로를 가교결합시키는 방식으로 결합된다. 식별되는 미생물 유래의 표적 DNA에 대한 하이브리드화는 캔틸레버 아암(arm) 사이의 거리를 감소시킨다.

지향성 주형 회로를 이용한 MEMS 마이크로칩 장치의 제조는 간단히 설명하면 소수성 유리 표면에 의해 분리되어 있는 폴리아크릴아마이드 겔 패드의 마이크로매트릭스를 제조하기 위하여 겔 광중합 기술을 필요로 한다. 일 예에 따르면, 이러한 겔 패드에 DNA 올리고뉴클레오타이드가 적용되어 형광 현미경검사 및 엑소뉴클레아제 분해에 의해 적절한 위치 제어 및 배향에 대해 검사된다.

표적 분자를 검출 및 식별하기 위해 주형 분자를 정렬하는 방식에서 접촉 점들에 주형 분자를 부착시키기 위하여 다른 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 금-스트렙트아비딘 및 황 기/비오틴을 이용하여 만들어진 결합이 사용될 수 있다.

일 예에 따르면, 프라이머는 단일 가닥 DNA 분자를 함유하는 주형 분자에 하이브리드하도록 설계 및 합성된다. 또한, 프라이머는 주형 분자가 바람직한 배향 및 위치를 이루도록 배열 및 배향된다. 더욱 구체적으로, 프라이머는 확실하게 주형 분자의 선택된 부위(제1 말단이나 그 말단 방향)가 캔틸레버의 한쪽 표면에 결합되고 주형 분자의 선택된 부위(제2 말단이나 그 말단 방향)가 캔틸레버의 다른쪽 표면에 결합되도록 한다. 다양한 예에서, 주형 분자의 말단들은 캔틸레버 구조의 특정 부위에 조율되거나(일 방향 정렬) 또는 조율되지 않는다(양방향 정렬).

성능 - 이동

일 예에서, DNA 가닥의 강도 및 길이는 염기 조성, 서열 및 환경에 따라 달라진다. 단일 가닥 DNA가 상보성 가닥과 상호작용하는 경우, 측정할 수 있는 생물물리적 현상이 일어난다. 구체적으로, 보체와 하이브리드화 시 DNA 길이의 평균 자유 감소는 약 40%이다. DNA 뉴클레오타이드 서열 및 조성은 구조 및 다른 생물물리적 변수와 상관성이 있을 수 있다.

도 4는 캔틸레버(205A) 표면의 진폭 힘과 이동 사이의 관계를 도시한 것이다. 특정 캔틸레버마다, 측정된 성능은 상보성 결합 파트너를 식별하는 데 사용될 수 있다. 캔틸레버가 완전 상보성이 아닌 시료 분자에 노출된다면 결과는 달라질 것이다.

도 4는 일 예인 생물 분자의 강도를 그래프로 도시한 것이다. 제시된 데이터에서 캔틸레버 팁과 기재 사이에는 분자가 테터링되어 있다. 테터링(tethering)은 서열의 한쪽 말단을 캔틸레버에 부착하고 다른쪽 말단을 기재에 부착하기 위하여 주형 ssDNA의 양 말단에 작용기를 첨가함으로써 수행될 수 있다. 그 조합의 예로는 금-티올 결합 및 비오틴-스트렙트아비딘 결합이 있다.

상기 도면에는 분자 인장 강도가 형성되는 데이터 분석결과가 제시되어 있다. 일 예에 따르면, 센서 구조는 주형 분자가 약한 장력 하에 유지되도록 조립되지만, 중립 장력 또는 거의 0의 장력도 이용될 수 있다. 주형 분자가 이러한 방식으로 유지되는 동안, 결합 파트너가 도입된다. 주형 분자가 ssDNA인 경우, 적합한 결합 파트너는 상보성 ssDNA 가닥이다. 이에 따라 주형 분자가 표적 분자와 결합(또는 하이브리드화)하면 물리적 변수 또는 특징의 측정가능한 변화가 제공된다. 캔틸레버는 이러한 하이브리드에 의한 분자 길이의 변화 및 이동을 검출( 및 측정)할 수 있다.

이 도면에는 주형 ssDNA와 표적 ssDNA의 하이브리드화에 상대적인 캔틸레버 이동을 예시했다. 예시된 바와 같이, 주형 ssDNA가 유전자적으로 정합성(또는 상보성)인 표적 ssDNA에 노출된 후, 캔틸레버는 약 10.2nm 정도 변형되었다. 이러한 실험 접근을 100개 이상의 다른 생물 분자에 대하여 반복했다.

이 도면에서, 표준 표적은 주형 분자(가닥)와 100% 상동성인 상보성 ssDNA 가닥을 나타낸다. 다른 표적들은 100% 상동성의 상보적 ssDNA 가닥과 2%, 19% 및 38% 변형이 있는 변형체들이다. 여기서 사용된 바와 같은 변형체란 용어는 100% 상동성의 상보적 ssDNA 가닥에 상대적으로 무작위 염기쌍 치환을 함유하는 표적 ssDNA를 의미한다. 이 도면에 표시된 단계적 변화는 ssDNA 분자의 변형체도 본 시스템에 의해 검출 및 식별 가능하다는 것을 예증한다.

예시적 이중 캔틸레버 검출기

도 5A 및 도 5B는 센서(500)를 기반으로 하는 캔틸레버를 도시한 것이다. 도 5A는 이중 캔틸레버(505A)의 자유 말단을 가교 또는 결합시키는 주형 분자(545)를 예시한다. 캔틸레버(505A)는 이 캔틸레버의 안정된 말단에 배치된 접속판(535)과 전도체(550)를 통해 검출기 회로에 전기적으로 연결되어 있다. 접속판(535)은 층(515) 및 층(520)의 상층에 배치되어 있는 층(510)에 결합되어 있다. 층 (510), (515) 및 (520)은 일 예에 따르면 각각 두께가 약 50nm, 150nm 및 250nm인 Si3N4, Si, Si3N4로 구성될 수 있다. 캔틸레버(505A)는 층(515)에 형성된 시료 채널(540) 위에 달려 있다. 캔틸레버(505A)는 일 예에 따르면 두께가 각각 약 40nm 및 5nm인 층(555)(금) 및 층(560)(크롬)으로 형성될 수 있다.

도 5A에서, 캔틸레버(505A)는 장력이 거의 없거나 전혀 없는 상태 하에서 ssDNA의 표적 분자(545)에 의해 가교결합된다. 검출기 회로(530)는 일 예로서 전도율의 수준을 검출하는 전기 전류를 제공한다. 이러한 전도율은 저항의 역수로서, 일 예에 따르면 저항이 측정되기도 한다는 것은 자명한 일이다. 일 예에 따르면, 임피던스가 측정된다. 도 5B에서, 가교(565)는 주형 분자(ssDNA)와 표적 분자(ssDNA)의 결합으로 형성된 하이브리드화된 dsDNA를 나타낸다. 도 5B에 예시된 바와 같이, 캔틸레버(505A)는 점차 집중적으로 편향된다. 검출기 회로(530)는 전도율을 측정하는 것으로서, dsDNA 가닥의 하이브리드화 시, 전도율 증가의 측정값을 나타낸다.

다양한 예에서, 검사 회로 및 복귀 회로는 검출기 회로(530)에 구비되어 있다. 검사 회로는 주형 분자가 캔틸레버 아암에 적당하게 부착되도록 주형 분자(545)에 전류를 제공하도록 배열된다. 예를 들어, 전류 급원, 센서 및 저항기의 연속 조합은 센서 및 주형 분자가 적절하게 배열된다면 예상 전류 흐름을 나타낼 것이다. 이러한 예상 전류 수준과 다른 편차는 주형 분자 또는 센서가 시료 검사에 적절하게 배열되어 있지 않음을 표시하는 것일 수 있다.

검출기 회로의 복귀 회로는 다른 검출 및 식별 반응에 준비하기 위해 주형 분자로부터 표적 분자를 절단하는 유도 회로를 포함한다. 일 예에 따르면, 이 회로는 필수적으로 주형 분자에 경사 전압을 제공하고 피크 전류를 모니터한다. 일 예에 따르면, 이 회로는 필수적으로 주형 분자에 경사 전류를 제공하고 피크 전압을 모니터한다. 이러한 피크 전압 또는 전류는 주형 분자와 표적 분자의 변성 또는 해리 반응과 동시에 일어날 것이다.

도 6은 상보성 가닥으로부터 테터링된 DNA의 변성을 유도하는 데 필요한 전류의 예를 예시한 것이다. 복귀 회로, 또는 변성 전류를 제공하는 다른 수단은 센서 부위로부터 상보성 가닥을 제거하여 새로운 감지 반응에 사용될 준비를 시킬 수 있다. 일 예에 따르면, 유동 스트림으로 처리된 센서는 연속적으로 별도의 감지 반응에 사용될 수 있어, 센서의 연속 작동을 가능케 한다.

이 도면에서, 변성 전류는 세로좌표에 나타내고, 적용된 전압은 가로좌표에 나타냈다. 도시된 바와 같은 전류 크기의 차이는 상보성 표적 분자와의 편차를 구별할 수 있는 수단을 제공한다.

변성을 가하는 데 필요한 전류의 양과 주형 및 표적 ssDNA 가닥의 부정합 정도 사이에는, 변화가 유전자 서열의 한 영역에 발생되어 있는지 또는 표적 서열을 따라 다수의 여러 위치에 걸쳐서 분산되어 있는지의 여부를 불문하고 고도의 비례성을 나타냈다.

도 7A 및 도 7B는 전압을 증가시켜 변성을 가한 뒤, 전압을 다시 감지 수준으로 감소시켜 다른 하이브리드화가 발생하도록 하는 수동 방법을 예시한 것이다. 도 7A에 예시된 바와 같이, 다수의 감지 반응이 표시되어 있다. 도 7B에는 이러한 감지 반응에 상응하는 복귀 시그널이 도시되어 있다. 변성 전류는 센서를 복귀시키는 수단을 제공한다. 변성 전류는 ssDNA 동안은 물론 하이브리드화(dsDNA) 상태 후에도 일관되게 나타난다.

이 도면에서, 상보성 가닥은 데이터 수득 개시 후 약 15초 경에 첨가된 다음 즉시 감지 반응을 일으켰다. 수 초 후에 전압을 약 4볼트로 수동으로 증가시킨 결과, 이중 가닥 DNA가 변성되었다. 이후, 전압을 3볼트로 수동으로 감소시키고, 다른 감지 반응을 위해 시스템을 복귀시켰다.

공진 예

도 8은 가교된 주형 분자를 사용하여 표적 분자를 식별 및 검출하는데 있어서 공진이 사용될 수 있는 방식을 예시하는 그래프 데이터(800)이다.

이 도면에서, 진동수는 가로좌표에 플롯팅하고 진폭은 가로좌표에 플롯팅했다. 캔틸레버 구조 또는 다른 현수 구조는 여기 시그널을 사용하여 진동하게 했다. 다양한 예에 따르면, 여기 시그널은 이동성 구조 부근에 배치된 자기, 압전기 또는 음향적 부재에 의해 제공된다. 이 도면에서, 곡선(805)은 주형 분자가 초기 진동수 F₂ 및 초기 진폭 A₂에서 공진하는 일 예를 예시한다. 주형 분자를 표적 분자에 노출시킨 후, 상기 구조는 진동수 F₁ 및 진폭 A₁에서 공진했다. 진동수 차 △_F 및 진폭 차 △_A는 상동성의 정도를 나타내며, 따라서 표적 분자의 검출 및 식별에 사용될 수 있다. 예컨대, 주형 분자와 정합율이 더 높은 표적 분자는 진폭 및 진동수 중 어느 하나 또는 그 둘 모두가 더 크게 변화할 것으로 추정된다.

이 도면은 진폭 및 진동수 모두의 감소를 보여준다. 하지만, 다른 예에 따르면 진폭 및 진동수 중 어느 하나 또는 둘 모두의 증가 또는 감소를 나타낼 수도 있다.

일 예에서, MEMS 장치의 이동성 부위의 공진은 검출 및 식별에 사용할 수 있다. 일 예에 따르면, 캔틸레버의 한쪽 말단은 자기 물질을 포함하고, 이러한 캔틸레버 아래에 배치된 코일을 통해 흐르는 교류 전류는 이 교류 전류의 진동수에서 캔틸레버를 진동시킨다. 일 예에 따르면, 캔틸레버 및 교류 전류의 크기는 출력 정보를 최대화하도록 선택한다. 예컨대, 교류 전류가 캔틸레버의 고유 진동수 부근이면 구조 시스템의 반응은 최대화될 것이다. 구조 시스템의 강성도는 ssDNA 또는 다른 주형 분자가 캔틸레버의 말단과 기재 베이스 사이에 테터링되는 경우 변화한다. 진동 시스템의 이동에 대한 진폭 및 진동의 진동수 중 어느 하나 또는 둘 모두는 자유 캔틸레버 말단을 가진 시스템에 대한 것과 다를 것이다. 표적 분자(예컨대 주형 ssDNA에 대한 ssDNA 보체 또는 분석물)의 첨가 시, 진동 시스템의 이동 진폭 및 진동수는 변화할 것이다. 변화 양은 주형 분자와 표적 분자 사이의 상동성 정도에 비례할 것인데, 그 이유는 dsDNA 가닥의 강성도가 2개의 독립 ssDNA의 강성도의 합 보다 더 크기 때문이다. 즉, 진폭 및 진동수의 변화는 분석물의 존재에 대한 검출 외에, 상보성 정합 분자와 비교하여, ssDNA 분자의 상동성 정도를 측정하는 데에도 사용될 수 있다.

예시적 제조

도 9는 일 예에 따른 방법(900)의 흐름도를 도시한 것이다. 이 도면에서, 캔틸레버는 905에서 베이스 상에 형성된다. 캔틸레버 외의 다른 구조도 사용될 수 있는데, 그 예에는 하나의지지 말단과 자유 말단을 보유한 원형 또는 나선형 구조 등이 있다. 또한, 이동성 중심 영역 및 베이스 구조에 드럼 헤드 방식으로 부착된 주변을 보유하는 원반형 또는 직사각형 구조도 사용될 수 있다. 일 예에 따르면, 베이스에 캔틸레버를 형성시키는 기술로서 반도체 제작술이 이용되기도 한다.

910에서는 캔틸레버 및 베이스 구조 또는 기재에 결합 물질 또는 프라이머가 적용된다. 프라이머는 주형 분자가 적절한 정렬 및 배향으로 부착될 수 있도록 선택한다. 다양한 예에 따르면, 프라이머는 금 및 스트렙트아비딘을 포함한다.

915에서, 주형 분자는 기재와 캔틸레버 사이에서 가교결합된다.

일 예에 따르면, 방법(900)은 특정 분야의 센서를 제조하는 제조업자에 의해 수행되는 것이다.

예시적 검출 및 식별

도 10 및 11은 검사 방법(1000) 및 (1100)을 각각 도시한 것이다. 예시된 이 방법들은 물론 기타 다른 방법들도 센서에 연결된 컴퓨터 또는 다른 제어 회로 소자를 이용하여 수행될 수 있다. 일 예에 따르면, 이러한 방법은 센서의 수동 제어에 의해 실행될 수 있다.

도 10에서, 시료는 1005에서 제조된다. 시료 제조는 다양한 예에서와 같이 여과, 정제, 증폭 및 기타 다른 분석 시료 준비를 위한 절차를 수반한다.

1010에서, 주형 분자는 기준선이 될 하나 이상의 변수를 제공하기 위해 분석된다. 일 예에 따르면, 이 단계는 주형 분자를 통한 전류 수준을 확인하여 주형 분자가 적절하게 정렬되고 위치되었는 지를 확인하는 단계를 수반한다. 또한, 주형 분자만의 전도율 또는 저항, 공진 진폭 및 진동수가 측정되기도 한다. 일 예에 따르면, 주형 분자의 물리적 위치가 측정되기도 한다.

1015에서, 시료는 주형에 노출된다. 일 예에 따르면, 이 단계는 시료, 표적 분자를 포함할 것 같은 시료를 검사 장치의 채널 또는 저장기로 주입하는 단계를 수반한다. 상기 채널 또는 저장기는 주형 분자와 연속되어 있다.

1020에서, 주형 분자는 분석되어, 노출된 주형 분자에 상응하는 물리적 변수를 생성한다. 다양한 예에 따르면, 노출된 변수로는 위치의 변화 또는 이동의 측정값, 정렬 변화의 측정값, 전도율 또는 저항의 측정값, 변성 전류의 측정값 및 공진 변화의 측정값이 있다. 또한 다른 물리적 변수로서, 주형과 표적 분자의 결합에 의한 색 또는 광학 성질에 기초한 측정값도 사용될 수 있다.

1025에서, 센서가 표적 분자에 노출된 후의 변수와 기준선 사이의 차이가 있는 지를 측정하는 질의가 제시된다. 물리적 변수의 변화 또는 차이가 있다면 그 시료를 식별하는 1030에서 처리가 계속될 것이다. 차이의 존재는 주형 분자의 검출을 표시한다.

본 명세서의 다른 부분에서 지적한 바와 같이, 상동성의 정도는 주형 분자와 표적 분자 사이의 정합의 표시이다. 다른 결합 쌍도 사용될 수 있으며, 완전한 정합에 대한 근접은 물리적 변수로 표시된 차이와 상관성이 있을 수 있다.

일 예에 따르면, 본 발명의 주제에 대한 프로세서에 연결된 메모리는 룩업 표 형태의 저장 데이터를 포함한다. 저장 데이터는 물리적 변수의 표시된 차이 또는 변화와 상동성 정도 사이의 상관성을 제공한다.

1025에서의 질의의 답이 아니오 이면, 처리는 출력 시그널이 생성되는 1035로 진행된다. 출력 시그널은 다양한 양태에 따르면 표시된 차이 또는 변화, 상동성 정도 또는 표적 분자의 식별의 측정값을 포함한다.

1040에서, 주형 분자는 여기에 전기적 여기를 적용하고 변성 또는 절단을 유도하여 남아있는 임의의 표적 분자 또는 시료 물질을 제거하거나 또는 복귀된다.

일 예에 따르면, 1040 이후 이 방법은 다른 시료의 검출 및 식별을 위해 1005로 다시 돌아간다.

도 11은 연속 시료 검사를 포함하는 방법(1100)을 예시한 것이다. 잘 알다시피, 다른 검사 순서 뿐만 아니라 병행 검사도 가능하다. 예를 들어, 공진 진동수, 공진 진폭 및 전도율의 변화를 동시에 측정할 수 있다. 방법(1100)에서, 초기 조건 또는 기준선은 1105에서 형성되었다.

1110에서는 주형 분자와 표적 분자의 하이브리드화에 의한 센서의 이동이 측정된다. 1115에서는 공진의 이동이 측정된다. 이러한 이동은 공진 진동수 또는 공진 진폭의 변화에 상응할 수 있다. 1120에서는 표적 분자와 주형 분자의 전도율이 측정된다. 1125에서는 절단 잔류 또는 열 수준이 피크 시그널의 모니터링을 통해 측정된다.

도 12는 공통 베이스(1210)가 있는 기재(1205) 상에 제작된 캔틸레버 센서의 배열을 예시한 것이다. 일부가 1240A, 1240B, 1240C 및 1240D로 표시된 캔틸레버는 한쪽 말단이 베이스(1210)에 부착되어 있고, 주형 분자를 통해 기재(1205) 표면 상의 접촉점(1245A, 1245B, 1245C 및 1245D)에 각각 테터링되어 있다. 일 예에 따르면, 주형 분자는 동일한 조성이고, 검사에 과잉 수준으로 제공된다. 일 예에 따르면, 적어도 2종의 주형 분자가 상이한 것으로서, 다른 표적 분자의 검출 및 식별에 맞춰질 수 있다.

1240A 등의 각 캔틸레버는 다중장치(1220)를 이용하여 제어기(1215)에 전기 전도체(1235A) 및 (1235B)를 통해 연결된다. 제어기(1215)는 검사 전류, 전압, 유도 시그널 또는 다른 시그널을 선택적으로 적용하여 각 캔틸레버가 표적 분자를 검출 및 식별할 수 있게 한다. 제어기(1215)의 전력원(1225)은 여기를 위한 일정 또는 경사 전압 또는 전류를 제공한다. 일 예에서, 전력원(1225)은 변성 전류 또는 전압을 제공한다. 일 예에서, 전력원(1225)는 각 캔틸레버에서 공진을 여기시키기 위한 유도 시그널을 제공한다.

제어기(1215)에는 인터페이스(1230)가 연결되어, 데이터 입력 및 데이터 출력을 담당한다. 다양한 예에 따르면, 인터페이스(1230)는 디스플레이, 터치 감응성 스크린, 키보드, 키패드, 마우스 또는 다른 포인터 제어기, 음성 변환기, 저장 장치, 프린터, 네트웍 접속장치(예컨대, 인터넷과 같은 광역 네트웍 또는 인트라넷과 같은 지역내 네트웍), 전기 커넥터 또는 무선 송수신기를 포함한다.

도 13은 일 양태에 따른 예시적인 휴대용 장치(1300)를 도시한 것이다. 이 도면에서, 디스플레이(1305)는 표적 분자의 분석 및 장치 조건에 상응하는 데이터 및 가시 프롬프트를 제공한다. 사용자 접속 제어 및 데이터 입력 지점에는 전력 버튼(1310), 시약 분획(1315), 시료 주입(1320) 및 콘트롤(1325)이 있다. 다른 콘트롤 및 데이터 입력 장치들도 사용될 수 있다. 일 예에 따르면, 장치(1300) 상의 투과성 표면은 사용자가 시료를 주사기 또는 다른 주입 기구를 이용하여 전달할 수 있게 한다. 일 예에 따르면, 1300 표면 상의 포트는 시료를 공급받는 저장기를 포함한다.

장치(1300)는 휴대용 전지 작동식 장치로 예시하였지만, 다른 양태도 사용될 수 있으며, 그 예에는 시료를 공급받고 결과를 제공하는 수용 설비가 구비된 데스크탑 장치가 있다.

실시예

길이 또는 힘의 측정가능한 변화 외에도, 전기 전류를 전도하는 DNA 구조물의 수행력은 함량, 서열, 길이 및 가교결합된 회로 약품 환경과 관련이 있다. 일 예에 따르면, 전도율은 구아닌/사이토신의 농도와 관련이 있다.

일 예로서, 121 염기쌍(bp)의 바실러스 게놈 DNA 서열을 게놈, 플라스미드 및 람다 바이러스 DNA로부터 분리했다. 데이터는 DNA 성질(길이, 서열 조성) 및 분석 조건(산화환원, pH, 염, 변성제 및 하이브리드화 가속화제 제어) 및 대장균 DNA 뿐만 아니라 바실러스 유래의 다른 DNA(단일 가닥 및 이중 가닥), 분자 및 유전자 변형체에 관한 다수의 변수를 이용 시, 일관된 결과를 보여준다.

당해 단편은 제한효소 분해로 바실러스 게놈 DNA로부터 분리하고 pUC13 플라스미드 클론이 벡터에 결찰시킨 뒤, 이를 이용하여 모균주인 대장균 숙주를 형질전환시켰다. 이러한 플라스미드 삽입체의 길이를 따라 무작위 유전자 점 돌연변이의 라이브러리를 작제한 뒤, 모균주와 2%, 19% 및 35% 상이한 삽입체를 보유한 분리물을 서열분석하고 추가 분석에 사용했다. 모균주 및 변형체의 삽입체 모두를 숙주 플라스미드로부터 절단해 낸 뒤, 티올 기와 비오틴 기를 이용하여 5' 및 3' 말단을 화학적으로 변형시켰다. 단일 가닥 DNA는 친화성 크로마토그래피(비오틴 변형에 근거하여)로 분리한 뒤, 스트렙트아비딘 및 금 코팅된 전도성 원자간 힘 검경법(AFM) 팁 및 제물대 사이에 부착시켰다. AFM 팁은 처음에는 편향되지 않았다. 일 예에 따르면, 단일 가닥 DNA는 이의 상보성 가닥에 하이브리드할 때 유효 길이가 40% 감소 변화한다.

AFM 팁 이동은 테터링된 DNA 주형에 DNA 보체(하이브리드화 용액에서) 또는 유전자 변형체를 첨가한 후 수초 내에 관찰되었다. 실험 결과는 주형과 보체 사이에 부정합 정도의 함수로서 일관된 팁 이동(<0.5% COV)을 나타냈다. 염기쌍 부정합은 전체 나선 구조 형성에 기여하지 않아서, 분자 길이의 감소를 축소시키는 것으로 가정된다.

전기 전도율은 전도성 AFM 팁을 이용하여 측정했다. 동일한 121bp 단편을 AFM 팁과 제물대 사이에 테터링하고, DNA 보체를 첨가했다. 고정 전압에서 시간의 함수로서 전기 전류(나노앰프 단위)를 측정했다.

상보성 DNA 첨가 전에, 적용된 전압은 테터링된 ssDNA를 통해 흐르는 일관된 또는 기준선 전류(약 0.3nA)를 생산했다. 이러한 테터링된 ssDNA를 DNA 뉴클레아제로 처리한 결과, 상기 기준선 전류가 상실되었다. 열 처리된 뉴클레아제는 전류 상실을 초래하지 않았다.

센서를 통해 측정가능한 전류는, ssDNA가 MEMS 이동성 부재에 테터링된 상태를 유지한다면 전기 전류는 계속 흐를 것이기 때문에, 센서의 기능(센서 자가 검사)을 확인시켜 준다. 테터링된 ssDNA와 이의 상보성 가닥 사이의 하이브리드화 후, 도면에 표시된 바와 같이 전류의 증가가 나타난다. 또한, 이 도면은 측정된 전류와 가닥 간의 정합 정도 사이의 관계를 보여준다. 하이브리드화 후, 전도된 전류는 전압이 센서 부위에 적용되는 한 비교적 일정한 상태를 유지한다.

하이브리드화 후, 적용 전압은 증가하며, 이에 상응하게 전도된 전류도 피크 수준까지 증가했다. 테터링된 ssDNA와 상보성 가닥의 변성은 상기 특정 121 bp 단편의 경우 약 4.1 볼트의 전위에서 일어났다. 변성과 관련된 전류의 양은 테터링된 ssDNA와 상보성 가닥 사이의 정합 정도에 따라 달라졌다. 전류 강하와 동시에 AFM 팁은 비편향 위치로 복귀되었다. 더 높은 전류량은 하이브리드화된 가닥에 충분한 에너지를 주입하여 하이브리드 상태를 더 이상 유지할 수 없게 하는 것으로 생각되기는 하지만, 다른 기작이나 요인이 이러한 현상에 관여할 수도 있다. 변형체에 존재하는 염기쌍 부정합은 가닥을 따라 절연 위치를 형성시키고, 이에 따라 전도력을 비례적으로 감소시키는 것으로 보인다.

일 예에 따르면, 회로 또는 캔틸레버 구조를 가교결합시키는 특정 DNA와 같은 주형 분자의 선택은 DNA 특이성, 길이, 서열, 조성 및 전도율에 영향을 미친다. 일 예에 따르면, 검출 및 식별 특이성은 병원균의 복수 유전자 영역으로부터 ssDNA를 선발하여 테터링에 사용함으로써 향상되었다. 일 예에 따르면, 더욱 긴 DNA 분절은 특이성 증가(특정 생물 인자 표적에 고유한 DNA 서열)를 제공했다. 일 예에 따르면, 더욱 짧은 DNA 분절은 구아닌(G) 및 사이토신(C) 함량이 높은 영역을 선발하게 한다. GC 총 조성과 서열은 아데닌(A)과 티민(T)의 절연 특성을 제공한다. DNA 내의 높은 AT 함량은 AT 고밀도 영역(즉, 나선 회전과 같은 위상에서)의 상대적 위치에 따라 불요성 및 전체 분자 만곡을 유도한다. 다양한 양태에 따르면, 선택된 DNA 분절은 GC가 40% 초과이거나 또는 GC가 60% 초과인 것이다. 따라서, DNA 분절 길이는 500염기쌍(bp) 미만, 또는 150 내지 200bp 미만이었다. DNA GC 조성, 서열 및 특이성의 측정은 PubMed BLAST와 같은 시중에서 입수용이한 소프트웨어(www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 사용하여 측정했다. 다른 소프트웨어도 1차 분자 변수를 고차 특징(즉, 유연성, 만곡)과 상호 관련시키는 데 이용할 수 있다. 일 예에 따르면, 주형 분자는 소프트웨어 알고리듬을 사용하여 선택한다.

추가 실시예

일 예에 따르면, 센서는 캔틸레버를 비롯한 현수형 부재를 포함한다. 주형 분자는 현수형 부재에 하나 이상 위치해 있는 접촉 지점에 부착된다. 다양한 예에 따르면, 캔틸레버는 곡선형, 원형 또는 망형이다. 일 예에서, 현수형 부재는 한 축에 대해 회전하는 회전형 부재이다. 회전형 부재일 때 접촉 지점은 주형 분자가 표적 분자에 결합할 때 접촉 지점은 원호를 따라 배치된다. 일 예에서, 회전형 부재의 한쪽 말단은 회전하는 동안, 다른쪽 말단은 정지 상이거나 반대 방향으로 회전하거나 또는 더 적은 범위 안에서 회전하며, 회전상 부재의 양 말단 사이의 위상 차이는 표적 분자 구별에 사용되는 차등 시그널을 제공한다.

일 예에 따르면, 주형 분자는 표적 분자에 특이적인 하나 이상의 결합 부위가 있는 경우도 있다. 일 예에 따르면, 표적 분자는 각각 다른 표적 분자에 특이적인 복수의 결합 부위가 있는 경우도 있다. 다른 일 예에 따르면, 표적 분자는 각각 단일 표적 분자에 특이적인 복수의 결합 부위가 있는 경우도 있다.

일 예에서, 센서에는 복수의 접촉 지점이 있어서, 주형 분자는 2개 이상의 복수의 접촉 지점에 결합할 수 있다. 예컨대, 이중 말단 주형 분자는 2개, 3개 또는 그 이상의 접촉 지점이 있는 센서에 결합할 수 있다. 또 다른 예로서, 3중 말단 주형 분자는 접촉 지점이 2개, 3개, 4개 또는 그 이상인 센서에 결합할 수 있다.

일 예에서, 출력 시그널은 물리적 변수의 측정값의 변화의 함수로서 제공된다. 물리적 변수에는 구조적 뿐만 아니라 전기적 변수도 포함된다. 구조적 변수의 예에는 물리적 이동, 공진 진동수, 공진 진폭, 접촉 지점 및 기준 지점의 물리적 정렬 또는 배향과 같은 위치 변화, 축에 발휘되는 힘, 발생된 열 및 색을 비롯한 광학 변화를 포함한다. 다른 물리적 변수도 사용될 수 있다.

일 예에서, 출력 시그널은 전기적 변수의 측정값의 변화의 함수로서 제공된다. 전기적 변수의 예에는 임피던스, 전도율, 비저항, 인덕턴스, 정전용량이 있다. 또한, 전기적 변수는 입력 시그널의 존재 하에 출력 시그널로서 표시될 수 있다. 예를 들어, 주형 분자에서 전도된 전류의 변화는 전압의 변화를 초래할 수 있다. 또한, 주형 분자에 적용된 전압의 변화는 전류의 변화를 초래할 수 있다. 다른 유도 시그널도 적용될 수 있고, 측정되는 반응을 사용하여 출력 시그널을 제공할 수 있다. 다른 전기적 변수도 사용될 수 있다.

일 예에서, 물리적 변수에는 전기 전도율의 측정값이 포함된다. 전기 전도율은 한 물질에서 흐르는 전자 흐름의 척도이다. 전기 전도율은 비저항 또는 저항의 역수로서, 일 예에 따르면 모니터된 물리적 변수로는 비저항을 포함한다.

일 예에서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 통해 결합된 ssDNA 주형 분자는 전자 MEMS 기반 회로를 가교결합시킨다. 표적 분자(예, DNA)와의 하이브리드화는 식별되는 미생물에서 유래되는 것으로서, 캔틸레버 부재 사이의 거리를 감소시킨다.

다양한 양태에서, 전압 수준, 전류 수준, 전도율 또는 다른 변수의 검출, 식별 및 비교에는 비교측정기 또는 휘트스톤 브리지(전기저항 측정기)가 사용된다.

일 예에서, 주형 분자의 변성은 주형 및 표적 분자에 열을 가하여 수행한다. 열의 수준은 전류, 전압 또는 와트량을 측정하여 정량한다. 일 예에서, 열 수준의 차이는 표적 분자 식별과 상관성이 있다.

일 예에서, 단일 센서 부위는 미세전자기계 시스템(MEMS) 칩 상의 이동성 부재를 가교결합시키는 테터링된 단일 가닥 DNA(ssDNA)를 포함한다. 일 예에서, 이러한 부위가 수백 또는 수천개가 하나의 칩에 존재하기도 한다. 테터링된 ssDNA는 당해의 생물인자(bioagent)에서 추출된 상보성 가닥과 하이브리드하는 것으로 선택한다. 수득되는 하이브리드화는 테터링된 분자의 물리적 길이 및 테터링된 분자의 전도율을 모두 변화시킨다. 이러한 변화는 높은 시그널 대 잡음 비에서 MEMS 시스템에 의해 측정된다. 변화의 정도는 테터링된 가닥과 생물인자 DNA 가닥 사이의 정합의 정도와 관련이 있다. 즉, 생물인자의 변이(특이성)의 정도를 측정할 수 있다. 검출, 식별 및 식별이 확인된 다음, 생물인자의 DNA 가닥은 이 분자를 통한 전류 흐름의 증가를 통해 테터링된 가닥으로부터 추출되며, 이에 따라 후속 감지 반응을 위하여 센서를 복귀시킨다. 센서 수행력은 테터링된 ssDNA(이의 보체가 없는 상태)가 측정가능한 양의 전류를 전도할 수 있기 때문에 자가 검사를 통해 확인한다.

물리적 변수 변화는 주형 분자 및 표적 분자(또는 DNA 가닥) 사이의 정합 충실도에 비례한다. 단일 뉴클레오타이드 부정합은 측정가능한 변화를 일으키고, 이에 따라 특정 균주 간의 미묘한 변이의 차이와 다양한 병원균의 식별을 가능케한다.

일 예에서, 주형 분자는 ssDNA를 포함한다. 일 예에서, B.안트라시스(B.anthracis)의 특정 DNA 영역이 증폭되고 작용기가 부착된다. 이 센서는 임의의 생물 인자(박테리아, 바이러스 또는 진균) 유래의 DNA에 의해 가교결합될 수 있다.

일 예에 따르면, DNA 가교 주형으로서 바실러스 안트라시스(Ames)의 4개의 150 내지 200염기쌍(bp) 분절이 선택된다. 일 예에 따르면, 균주를 구별하는 시스템의 능력을 검사하기 위하여, 주형중 하나에 대체 서열을 설계했다. 변형체는 무작위 뉴클레오타이드 치환에 의해 모 분자로부터 변이되어 2%, 10% 및 20% 변형체를 생성한다. 주형 분자의 선택은 계산된 특이성, 전도율 변수 및 가요성에 기초한다. 종 및 균주 특이적 분절은 16S rRNA 핑거프린트 및 독성 유전자로부터 선발했다.

일 예에서, 4개의 선택된 150-200bp 주형 및 변형체는 시중에서 입수용이한 DNA 합성 기관을 통해 합성했다. 150-200bp DNA 주형 및 변형체는 ~50bp ssDNA 단편들로 합성했다. 하이브리드화 및 결찰 단계를 이용하여 총 길이 150-200bp의 주형을 수득했다. 이러한 주형을 적당한 플라스미드 클로닝 벡터에 결찰시키고, 대량 플라스미드 생산 제조로 DNA 가교 주형의 라이브러리를 제조했다. 경우에 따라, 선택된 150-200bp 주형 후보는 제한효소 분해로 절단하거나 또는 PCR 증폭시킨 뒤, 바실러스 안트라시스(Ames) DNA에 서브클로닝했다.

일 예에서, DNA 가교결합 주형은 비오틴-스트렙트아비딘 및 티올-금 결합을 통해 AFM 및 MEMS 표면에 공유 결합되었다. 플라스미드 기반 주형은 제한효소로 절제하고, 시중에서 입수용이한 키트를 사용하여 5'/3' 말단을 비오틴/티올로 라벨링시켰다. 일 예에서, 이러한 주형은 비오틴 및 티올 라벨링된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭되었다.

일 예에서, DNA 주형 및 변형체는 통상적인 DNA 서열분석 하청 기관을 통해 서열 보전성을 확인했다. 각 분자의 특이성은 미국 모식균 배양 수집소에서 구입하거나 또는 물질 양도 협정을 통해 또는 다른 동료에게서 입수한 바실러스 안트라시스 균주(즉, Ames, Sterne, A2012, 1055, Vollum, Kruger) 및 탄저 의사균(즉, B. globigii, B.cereus, B.subtilis, B.thuringiensis)의 게놈 DNA에 대한 표준 서던 스크리닝을 통해 확인했다.

일 예에서, 원자간 힘 검경법(AFM)은 B.안트라시스 및 변형체의 ssDNA 단편의 특이적인 물리적 성질(즉, 이동 및 전도율)을 측정하는 데 사용했다. AFM 팁 및 제물대는 금 및 스트렙트아비딘으로 피복하고, 티올/비오틴 말단 라벨링된 DNA 가교 주형을 부착시켰다. AFM 팁 이동 및 물질의 전기적 성질은 상보성 및 변형체 ssDNA 분자와 하이브리드하기 전, 하이브리드 하는 동안 및 하이브리드한 후 측정하고, MEMS 장치 설계에 데이터로 사용했다. 일 예에서, 하이브리드화(pH 완충액, 염), 변성, 가수분해 및 뉴클레오타이드 산화를 조절하는 시약을 선택했다.

일 예에서는, MEMS 제작 기술이 센서 칩의 구축에 사용되었다. 일 예에서는, 이러한 제작에는 기재 상에 물질의 박막을 침착시키는 단계, 사진석판술을 이용하여 상기 물질 상에 패턴형 마스크를 적용하는 단계, 및 최종 현상된 마스크를 사용하여 필름을 선택 에칭하는 단계를 수반한다. 기재(실리콘 웨이퍼) 상에 물질의 침착은 화학 반응 기반 접근법(화학 증착, 적층, 전기침착 또는 열 산화)으로 수행하거나 물리적 반응 기반 접근법(증발, 스퍼터링 또는 캐스팅)으로 수행한다. 물질의 제거는 에칭법으로 수행한다. 즉, 패턴형 사진석판 마스크의 적용을 이용하는 상기 장치에 대한 회로 소자는 절연 및 전도 물질 층의 적당한 적용을 통해 구축했다. 제작 설비는 인쇄 회로판(PCB)에 부착시키기 위해 핀형 인터페이스를 함유하는 칩용의 세라믹 또는 플라스틱 하우징을 일 예로서 포함하는 패키징에 칩을 구비한다.

일 예에 따르면, MEMS 칩의 제작 시 DNA 가교 주형을 제조하여 검사한다. 일 예에 따르면, MEMS 이동성 부재(캔틸레버 말단)는 티올/금 및 비오틴/스트렙트아비딘 공유 결합을 포함한다. 단일 분자 부착은 정전 인력으로 수행했다. 일 예에서, 이 장치는 10MΩ 저항기와 직렬 연결된, 테터링된 ssDNA가 필요한 이동성 MEMS 부재 사이의 갭을 따라 5볼트 전위를 적용한다. 그 결과 수득되는 전기장으로 ssDNA 분자가 끌린다. 가까이 근접했을 때, 기재 베이스 위에 비오틴-스트렙트아비딘 결합이 형성되고, 캔틸레버 자유 말단에 금-티올 결합이 형성된다. 이러한 방식으로 한 분자가 부착하면, 갭을 따라 적용한 전위는 회로와 직렬 연결된 저항으로 인해 감소된다. 즉, 단일 ssDNA 분자가 각 부위에 부착한다. MEMS 회로를 따라 가교결합하지 않은 과량의 DNA는 DNA 엑소뉴클레아제 분해로 제거한다. 이러한 회로는 DNA 안정화 완충액(즉, 300mM NaCl, 10mM Na 시트레이트 및 5mM EDTA)에서 보관한다.

일 예에서, 나노앰프 범위의 전류 측정은 집적 회로 증폭기를 사용하여 수행한다. 다중성 집적 회로(IC) 증폭기 및 다른 전자 장치 및 프로세싱을 이용하여 감지 반응의 결과를 디스플레이한다. MEMS 칩에서 취득되는 아날로그 시그널을 증폭시켜 디지털 시그널로 전환시킨다.

일 예에서, 인쇄 회로판은 MEMS 칩 및 IC 칩의 부착을 위한 수용 설비를 구비한다. 이 회로판은 또한 PCB 상의 전기적 작동을 제어하고 계산을 수행하는 데 사용되는 전용 주 처리 칩을 포함한다. PCB는 디스플레이 및 전지용 전기 인터페이스와 메뉴 버튼을 포함한다. 일 예에 따르면, 주 프로세서에 의해 실행되는 프로그램은 IC로부터 디지털 시그널 출력 데이터를 이용하여 디스플레이를 제공한다. 사용자 인터페이스는 디스플레이 대조군 및 디스플레이 특성, 한계 검출 값, 전지 수준, 온/오프 및 병원균 분자 세척 콘트롤을 측정하는 변수에 대한 제어 장치를 포함한다.

일 예에 따르면, 플라스틱 하우징은 인쇄 회로판( 및 부착된 바이오칩 및 IC 칩), 시료 유동 통로, LCD 디스플레이 및 제어 버튼을 함유한다. 일 예에 따르면, 하우징의 내벽에는 전자 부품을 내장하고 하우징 내에서 이동되지 않게 하기 위한 선반 및 홈이 있다. 일 예에 따르면, 하우징은 시약 및 시료의 도입 및 제거를 위한 하나 이상의 유동 통로를 포함한다.

일 예에 따르면, 센서 부위를 통한 전기 전도는 AFM 전자 장치 이용 시의 0.2nA 보다 훨씬 크다. 일 예에 따르면, 집적 회로는 아날로그 시그널 증폭을 >10mV 피크 대 피크로 제공한다.

일 예에 따르면, 센서는 바실러스 안트라시스 균주 및 탄저균 의사체(즉, B.globigii, B.cereus, B.subtilis, B.thuringiensis)의 준비한 게놈 DNA, 전술한 탄저 균주 및 의사체의 화학적 및/또는 기계적(초음파) 붕괴시킨 불활성화 전세포 및 포자, 일반 불순물 및 방해제, 예컨대 포스트 먼지, 토양 성분, 다른 약물 혼합물 및 혼합된 미생물 조합의 존재 중의 DNA 및 전세포/포자를 검출 및 식별하도록 형성된 것이다.

일 예에 따르면, 시스템은 표적 분자의 검출 및 식별에 충분한 시그널 증폭, 프로세싱 및 디스플레이를 포함한다. 일 예에 따르면, 전자 제어 장치에는 온/오프, 모드, 디스플레이 제어, 배터리 수명, 자가 검사 및 복귀 기능이 포함되어 있다. 일 예에 따르면, 시스템은 붕괴 용액 중의 소정의 단독 병원균, 의사체 또는 DNA 표적 변형체를 식별하도록 형성된 센서 표면으로 제조된 시료를 전달하는 하나 이상의 유동 통로를 포함한다.

일 예에 따르면, 시료는 시스템 외부에서 표면 닦기 또는 배취 공기 수집기에 의해 수집된다.

본 발명의 시스템은 생물학적 또는 화학적 분석물을 함유하는 표적 물질의 존재, 신원 또는 양을 측정하는 방법 및 장치를 포함한다. 일 예에 따르면, 생물 전자 캔틸레버의 편향성 아암을 1개 이상 함유하는 전자 회로는, 검출될 표적 물질과 관련 있는 표적 분자의 존재와 같이 환경 변화에 반응하여 물리적 변수의 측정가능한 변화를 일으키는 주형 중합체 분자에 대한 결합을 촉진시키기 위해 표면 처리된다. 예를 들어, 주형 분자의 물리적 형태 또는 크기의 변화는 캔틸레버 아암의 편향으로 전임된다. 일 예에 따르면, 주형 분자를 따라 형성된 전기 특성의 변화는 단일 가닥 DNA 가교 주형이 이의 상보성 가닥에 하이브리드화함으로써 검출된다. 이러한 물리적 성질 또는 변수의 변화는 측정되어 당해 물질의 존재 및 신원과 관련된 정보를 제공한다. 일 예에 따르면, 이러한 회로들이 유사 주형 분자에 의해 가교결합된 수가 제공되고, 표적 물질의 농도 또는 양과 관련된 정보가 수득될 수 있다.

일 예에 따르면, 표적 및 관련 생물 인자 또는 물질의 존재에 대한 검출을 위해 생물 인자 검출 장치 내부용으로 맞춰진 기하 형태의 미세회로가 제공되기도 한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 주형 분자는 생물 인자 또는 생물 인자의 성분에 결합하거나, 이의 존재에 결합하거나 반응할 가능성이 있는 임의의 분자일 수 있다. 따라서, 주형 분자는 자연 발생 분자 또는 합성된 생물 분자로서, 검출될 표적 물질과 관련 있는 표적 분자에 결합하거나 결합할 수 있거나, 또는 그 표적 분자에 선택적으로 반응하거나 반응할 수 있는 상기 분자를 포함할 수 있다. 일 예에 따르면, 주형 분자는 항체, 단백질, 핵산, 탄수화물, 당단백질 또는 중합체를 포함한다. 일 예에 따르면, 특정 표적 분자(또는 표적 분자의 종 또는 속)의 존재를 검출하기 위해 선택된 특정 주형 분자는, 그 주형 분자가 정확한 표적 분자 또는 관련된 표적 분자와 유일하게 결합하거나 반응하는 것으로 선택한다. 일 예에 따르면, 차등 전기 전류 또는 물리적 이동은 주형과 표적 사이의 생체분자-생체분자 인식에 의해 나타난다. 즉, 주형 분자와 표적 분자 사이의 관계는 리보핵산(RNA) 및 데옥시리보핵산(DNA) 및 유도체 분자를 비롯한 핵산의 상보성 가닥들의 관계일 수 있다. 또 다른 주형 분자와 표적 분자 간의 관계의 예에는 핵산-핵산 인식, 단백질-단백질 인식, 단백질-핵산 인식, 단백질-탄수화물 인식, 핵산-탄수화물 인식 및 탄수화물-탄수화물 인식이 있다.

일 예에 따르면, 두 표면 사이의 갭을 연결하는 주형 분자를 포함하는 전술한 회로를 함유한 생물검출 장치가 제공된다. 일 예에 따르면, 상기 두 표면은 서로 상대적으로 이동 가능하다. 주형 분자가 표적 분자에 노출되거나 결합되었을 때, 주형 분자는 두 표면 사이의 거리를 변화시키는 치수 변화를 일으킨다. 즉, 이러한 양태의 본 발명에 따른 생물검출 장치는 두 표면 사이의 거리의 변화가 검출될 때 표적 또는 관련 생물 인자 또는 물질의 존재를 신호할 수 있다.

일 예에 따르면, 표면 사이의 거리가 변화되는 정도는 주형 분자에 노출되거나 결합된 분자를 표시한다. 예컨대, 주형 분자에 정확한 정합성인 표적 분자(즉, "정확한 표적 분자")는, 주형 분자와 관련은 있지만 정확한 정합성은 아닌 분자에 주형 분자가 결합되었을 때 일어나는 단축 보다 훨씬 큰 정도로, 두 표면에 연결된 주형 분자 지점 간의 거리의 단축을 초래할 수 있다. 따라서, 두 표면 사이의 거리가 변화된 양을 측정하면, 주형 분자에 결합된 분자의 신원과 관련된 정보가 수득된다.

일 예에 따르면, 주형 분자를 따라 형성된 전도율을 측정할 수 있는 전술한 회로를 함유한 생물검출 장치가 제공된다. 상세히 설명하면, 주형 분자는 제1 전극과 제2 전극에 상호 연결되어 두 전극 사이의 갭을 연결하게 된다. 주형 분자가 표적 분자에 결합되면, 전극 사이의 전도율이 변화된다. 따라서, 전극 사이의 전도율의 변화를 검출하면, 표적 분자 또는 관련 분자의 존재를 검출할 수 있다. 또한, 두 전극 사이의 전도율이 변화한 정도는 주형 분자에 결합된 분자를 표시한다. 예컨대, 전극 사이에 관찰된 전도율의 변화에 있어서, 정확한 표적 분자는 이러한 정확한 표적 분자와 관련은 있으나 동일하지는 않은 주형 분자에 결합된 표적 분자보다 훨씬 큰 변화를 일으킬 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 부재의 교환을 필요로 함이 없이 재사용될 수 있는 검출 장치가 제공된다. 상세히 설명하면, 주형 분자를 가열하면, 표적 또는 관련 분자를 주형 분자로부터 해리시킬 수 있다. 본 발명의 일 양태에 따르면, 주형 분자의 가열은 주형 분자( 및 결합된 분자)를 통해 전류를 통과시켜 수행한다. 또한, 주형 분자로부터 표적 분자를 해리시키는 방법은 표적 분자의 신원과 관련된 정보를 수득하기 위해 사용될 수 있다. 상세히 설명하면, 주형 분자( 및 표적 분자)를 따라 적용되는 전류는 전도율의 급격한 변화가 관찰(이는 표적 분자가 주형 분자로부터 해리되었음을 시사한다)될 때까지 일정하게 단계적으로 증가 또는 감소시킬 수 있다. 이와 같이 표적 분자의 해리에 필수적인 전류, 즉 열은 표적 분자가 주형 분자에 대한 정합의 근사 정도와 관련이 있기 때문에, 표적 분자의 해리에 필요로 되는 전류의 양은 결합된 분자와 표적 분자 사이의 정합의 근사도를 표시한다. 예를 들어, 정확한 표적 분자는 이 분자를 주형 분자로부터 해리시키는 데 있어서, 표적 분자와 동일하지 않은 분자를 해리시키는 데 필요한 에너지보다 훨씬 많은 에너지를 필요로 할 것으로 예상된다.

일 예에 따르면, 다수의 검출 기작 또는 기술을 병합한 전술한 회로를 함유하는 생물 인자 검출 장치가 제공된다. 예컨대, 검출 장치는 주형 분자에 의해 일어나는 치수 변화, 주형 분자를 따라 흐르는 전도율의 변화, 또는 주형 분자로부터 표적 분자를 해리시키는 데 필요한 전류의 양을 측정하여 표적 생물 인자의 존재를 측정할 수 있다. 또한, 이러한 기작 또는 기술을 통해 표적 분자를 식별하는 정보도 수득할 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 주형 분자와 관련된 물리적 치수의 변화를 검출하여 표적 물질 또는 분석을 검출하는 방법이 제공된다. 이러한 방법에 따르면, 표적 분자가 결합했을 때 물리적 치수의 변화를 일으키는 주형 분자는 의심되는 생물 인자 또는 표적 물질(즉, 표적 분자를 함유할 것으로 의심되는 물질)에 노출된다. 이러한 의심되는 생물 인자는 기체, 액체 또는 고체 매질에서 유래하는 것일 수 있다. 정확한 표적 분자 또는 관련 분자가 주형 분자에 결합하면, 수득되는 주형 분자의 치수 변화가 검출되고, 그 변화가 기록된다. 또 다른 양태에 따르면, 본 방법은 주형 분자의 물리적 치수가 변화된 정도를 측정하는 것을 포함한다.

일 예에 따르면, 분석물의 존재 하에서 주형 분자와 관련된 전도율의 변화를 감지하여 표적 물질을 검출하는 방법이 제공된다. 정확한 표적 분자 또는 관련 표적 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 주형 분자는 의심되는 생물 인자에 노출된다. 이 방법에 따르면, 주형 분자를 따라 흐르는 전도율이 모니터된다. 표적 분자에 결합되기 시작하자마자, 주형 분자를 따라 나타나는 전도율의 변화가 검출되고, 그 변화가 기록된다. 일 예에 따르면, 전도율의 변화가 측정된다.

일 예에 따르면, 주형 분자로부터 표적 분자를 해리시키는 데 필요한 에너지의 양을 측정하여 의심되는 생물 인자의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 전기 전류는 주형 분자-표적 분자 쌍을 따라 흐른다. 또한, 전류의 진폭은 주형 분자를 따라 흐르는 전도율의 급속 변화가 관찰될 때까지 증가시킬 수 있다. 이러한 급속 변화는 표적 분자가 주형 분자로부터 해리되기 시작했음을 시사한다. 또한, 표적 분자가 주형 분자로부터 해리될 때의 전류는 주형 분자에 결합된 표적 분자의 특성 규명 또는 식별에 사용된다.

본 시스템은 생물학적 분석물의 검출 및 식별에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 표적 생물 분자는 주형 생물 분자의 변화를 감지하여 측정한다. 주형 생물 분자의 변화에는 주형 분자의 물리적 치수의 변화, 주형 분자를 따라 관찰되는 전기 전도율의 변화, 및/또는 주형 분자로부터 표적 분자를 해리시키는 데 필요한 에너지가 포함될 수 있다. 이러한 물리적 치수 변화, 전도율의 변화 또는 주형 분자로부터 표적 분자를 해리시키는 데 필요한 에너지 양의 크기는 측정되어, 표적 분자와 주형 분자 사이의 상동성 정도를 나타낼 수 있다. 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다수의 판독을 수행하기 위하여 구성 부재의 교체를 필요로 하지 않는 검출 방법 및 장치를 제공한다.

일 예에 따르면, 전자 회로는 생물 성분 또는 이 생물 성분의 대표를 포함하는 주형 분자에 의해 가교결합된다. 일 예에 따르면, 회로는 핵산 분자(예컨대, DNA 분자), 또는 단일 가닥 DNA 분자를 물리적 및 화학적으로 나타내는 분자에 의해 가교결합된 MEMS계 구조를 포함한다. 일 예에 따르면, MEMS 회로는 가교된 DNA 분자가 이의 상보성 가닥 또는 거의 상보성인 DNA 가닥에 하이브리드할 때 가교된 DNA 분자의 이동 및 전도율을 감지하여 반응한다.

다음은 생물전자 회로의 생물학적 부재의 선택 및 설계에 관하여 설명한 것이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 생물학적 검출 및 식별 장치의 특이성은 표적 생물 인자의 특정 속, 종 및 균주를 구체적이며 정확하게 식별하기 위는 시스템의 능력을 의미한다. DNA계 생물 검출기/식별 장치인 경우, 특이성이란 용어는 때로 시스템의 DNA 부재가 생물 인자 유래의 DNA와 특이적으로 보체를 형성하여 하이브리드하는 능력을 의미한다. 검출 및 식별 특이성을 증가시키기 위하여, 여기서는 다수(예컨대, 3가지 이상)의 생물 인자 DNA 분절이 선택된다. DNA 분절 선택은 MEMS 회로를 가교결합시키는 분자의 계산된 길이, 특이성, 전도율 변수 및 가요성에 기초한다. DNA 분절은 길수록 더 큰 특이성을 보유하는 경향이 있고(특정 생물 인자 표적에 특이적인 DNA 서열), 짧을수록 구아닌(G) 및 사이토신(C) 함량이 많은 영역을 선발하게 된다. GC 총 조성 및 서열은 아데닌(A) 및 티민(T)의 절연 특성과 관련이 있다. 또한, DNA 중의 높은 AT 함량은 AT 고밀도 영역(즉, 나선 회전과 같은 위상에서)의 상대적 위치에 따라 불요성 및 전체 분자 만곡을 유도한다. 즉, 선택된 DNA 분절은 GC가 40% 초과이거나 또는 GC가 60% 초과인 것일 수 있다. 일 예에 따르면, DNA 분절 길이는 500 염기쌍(bp) 미만, 또는 150 내지 200bp 미만이다. DNA GC 조성, 서열, 가요성, 만곡성 및 특이성의 측정은 다수의 개인적, 상업적 및 대중적으로 입수용이한 소프트웨어, 예컨대 PubMed BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 사용하여 측정한다. 일 예에 따르면, 4개의 DNA 주형 분절은 바실러스 안트라시스(Ames)와 100% 상동성이고, 다른 바실러스 종 및 균주와 보다 낮은 상동성을 나타내는 것이다. 종 및 균주 특이적 분절은 16S rRNA 핑거프린터 및 독성 유전자로부터 선택했다. 이 양태에서, 바실러스 속 외의 미생물은 정확한 검출 및 식별 한계치 이하에 속하게 된다. 일 예에 따르면, 매트릭스에는 다른 생물 인자와 특이성이 있는 DNA 부재를 보유한 DNA 가교결합된 MEMS가 포함되고, 일 예에서는 동시적으로 인자의 존재를 연속적으로 모니터할 수 있다.

이하에는 생물전자 회로의 생물학적 부재의 생산에 대하여 설명될 것이다.

일 예에 따르면, 표적 생물 인자의 특정 DNA 영역은 선택, 제조, 대량 생산된 후, MEMS 회로에 부착시키기 위하여 화학적으로 변형된다. 또한, DNA 영역의 변형체가 제조되어, 제안된 회로의 구별 능력을 검사하는 목적을 위해 생산되기도 한다. 일 예에 따르면, 변형체는 선택된 DNA 주형과 뉴클레오타이드 조성 및 서열이 2% 내지 30% 상이한 DNA 분자이다. 일 예에 따르면, 4개의 tjsoxr된 150-200bp 분절은 합성되거나, PCR 증폭되거나, 실제 표적 생물 인자로부터 서브클로닝된다. 충실도가 높은 DNA 합성은 일반적으로 약 50bp까지의 ssDNA 단편으로 제한되는 바, 원하는 총 길이 150 내지 200bp DNA 주형을 만들기 위해서는 하이브리드화 및 결찰 단계가 필요로 된다. 그 다음 완전한 DNA 주형은 5' 및 3' 약 50bp의 합성 단편이 리간드 부착으로 특이적으로 라벨링되면 EMMS 납 표면에 직접 부착한다. 또는, 완전한 150 내지 200bp 주형을 플라스미드 클로닝 벡터에 결합시킨 다음, 대량 생산을 위해 DNA 가교 주형의 라이브러리를 제조한다. 일 예에 따르면, MEMS 회로 납에 가교결합하기 위해 선택된 DNA 영역은 제한효소 분해로 절제하거나 또는 PCR 증폭한 뒤, 표적 생물 인자로부터 서브클로닝될 수 있다.

이하에는 생물 부재 보전성의 확인에 대하여 설명될 것이다.

일 예에 따르면, DNA 회로 가교 주형 및 변형체는 서열 보전성에 대한 확인한다. 서열 보전성은 원하는 서열과 비교했을 때의 실제 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. DNA 서열분석 방법은 라벨링되고 MEMS 납 표면에 부착하고자 하는 분자의 정확한 뉴클레오타이드 서열을 보여줄 것이다. 본 주제는 단일 염기쌍 부정합에 민감한 바, 모든 서열 변화가 확인되어야만 한다.

이하에는 생물 부재의 생화학적 및 물리적 특징에 대한 검사 및 분석에 대하여 설명될 것이다.

일 예에 따르면, 특정 ssDNA 분자는 선택된 뒤, 대량 생산된 다음, MEMS 회로의 이동성 부재를 가교결합시키는 데 사용된다. 특정 ssDNA 분자의 선택은 다수의 생물물리학적 특성, 예컨대 길이, 뉴클레오타이드 조성 및 서열, 가요성 및 기계적 이동성 및 전도율 변수에 근거한다. 계산된 이동성 및 전도율 변수는 ssDNA 가교 주형 및 변형체 ssDNA 단편의 특이적인 물리적 성질(즉, 팁 이동 및 전도율에 의해 측정되는 바와 같은 분자 이동성)을 측정할 수 있는 원자간 힘 현미경(AFM)으로 확인한다. 공개된 절차에 따라 금 및 스트렙트아비딘으로 피막된 AFM 팁 및 제물대는 티올/비오틴을 말단에 라벨링시킨 DNA 가교 주형에 의해 가교결합된다. 이러한 AFM 팁 이동 및 물질 전기적 성질은 MEMS 장치 설계에 투입물로서 상보성 및 변형체 ssDNA 분자의 투입에 의한 하이브리드화 전, 하이브리드화 동안 및 하이브리드화 후에 측정한다.

작업 상의 화학적 및 온도 환경은 특이적인 ssDNA 가교 주형에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 사용자-한정의 작업 상의 환경, 작업 온도 및 DNA 특이적 하이브리드화(pH 완충액, 염), 변성, 가수분해 및 뉴클레오타이드 산화의 효과를 조절하는 시약은 영향을 미칠 수 있다. 일 예에 따르면, 작업 시약에는 다음과 같은 것이 있다:

a. 염, pH, 온도

b. 가수분해 조절: 수성 환경을 통한 전도율은 매질을 통해 전도율에 영향을 미칠 수 있는 가수분해를 유도할 수 있다. 이러한 효과는 적당한 시약의 첨가를 통해 조절한다.

c. 산화 조절: DNA를 통한 전도율은 산화적 손상, 특히 구아닌 잔기에 대한 손상을 유도할 수 있다. 이러한 산화적 손상은 항산화제(즉, 아스코르브산, 구연산)의 첨가를 통해 조절한다.

d. DNA 열 안정성 인자(즉, 0.5 내지 3몰의 베타인(N,N,N-트리메틸글리신;(Rees et al., Biochem., (1993) 32:137-144).

e. 변성 시약(즉, 2 내지 4몰의 테트라에틸 아세테이트, 우레아, 무질서유발 염(즉, 트리클로로아세테이트, 퍼클로레이트, 티오시아네이트 및 플루오로아세테이트), 또는 글리세롤, 포름아마이드, 포름알데하이드 및 디메틸설폭사이드(MDSO)).

f. 분자 배제 현상을 통한 DNA 대 DNA 하이브리드화를 증가시키는 하이브리드화 촉진제. 이러한 촉진제의 예에는 아세테이트 염 및 알코올의 혼합물, 특정 아민(스퍼민, 스퍼미딘, 폴리리신) 0.1 내지 0.5몰 세정제(도데실 트리메틸암모늄 브로마이드 및 세틸트리메틸암모늄 브로마이드) 및 특정 소단백질, 예컨대 단일 가닥 결합 단백질.

이하에는 DNA 특이성을 확인하는 방법에 대하여 설명될 것이다.

일 예에 따르면, DNA 회로 가교 주형 및 변형체는 서열 특이성에 대하여 확인된다. 선택된 DNA 단편의 소프트웨어 분석은 생물인자 특이성 선별을 통해 확인할 수 있는 표적 생물 인자의 한 종에 있는 한 영역에 대한 단편의 특이성을 증명할 수 있다. 이러한 방법의 일 예에는 생물인자 표적 게놈( 및 의심되는 임의의 다른 관련 종)의 각종 제한효소 분해된 단편을 전기영동으로 분리하고 고체 기재(즉, 나일론 또는 니트로셀룰로스)로 전이시키는 서던 선별법이 있다. 고정된 게놈 DNA 단편은 그 다음 라벨링된(즉, 형광성 또는 방사성) DNA 가교 주형 DNA와 항온처리될 수 있다. 적당한 조건(즉, 온도, pH 및 염 농도) 하에서 주형 DNA는 단일 단편에 하이브리드할 것이다(게놈 DNA 제한효소 분해가 이 단편을 절단하지 않았다고 가정할 때). DNA 주형이 게놈 DNA의 다수 부위에 하이브리드화하면 생물검출 장치의 조건 변화 또는 새로운 주형 DNA의 선발이 필요로 될 수 있다.

이제 DNA 가교 주형 및 라벨링에 대해 설명할 것이다.

일 예에 따르면, 합성, PCR 증폭 또는 클로닝된 DNA 단편(MEMS 회로 납을 가교결합하기 위해 선발한 것)은 유기 또는 무기 표면에 DNA를 부착하는 방법에 관한 다양한 임의의 방법으로 MEMS 표면에 부착된다. 일 예에 따르면, 배향 특이적 고정화는 DNA 가교 주형 말단과 MEMS 납 표면에 존재하는 고유의 화학적 잔기가 가교결합될 때 형성된다. 시중에서 입수용이한 화학적 잔기 특이성 가교제는 일반적으로 친핵 치환 반응을 기초로 한다. 이 화학 반응은 일반적으로 공격성 친핵체에 의한 이탈기의 직접 치환을 수반한다. 일 예에 따르면, MEMS 회로 납은 금 및 스트렙트아비딘이 각각 피막된 납을 포함한다. 일 양태에 따르면, ssDNA 가교 주형은 비오틴-스트렙트아비딘 및 티올-금 결합을 통해 AFM 및 MEMS 표면에 공유 부착된다. DNA 단편은 시중에서 입수용이한 키트 또는 DNA 5' 및 3' 말단을 라벨링 또는 작용기 부착하는 임의의 다른 수단에 의해 5'/3' 비오틴/티올 말단 라벨링된다. 부착 약품에는 아미노 기(예컨대, N-하이드록시-숙신이미딜 에스테르), 폴리에틸렌 글리콜, 카르보디이미드, 티올 기(예컨대, 말레이미드 또는 할로아세틸), 유기실란 기 또는 비오틴-스트렙트아비딘을 포함할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 일 예에 따르면, DNA 단편은 5' 및 3' 비오틴 또는 스트렙트아비딘 변형 뉴클레오타이드로 합성되거나, 또는 게놈 또는 플라스미드 기반 DNA 표적 유래의 비오틴/스트렙트아비딘 라벨링된 프라이머를 이용하여 PCR 증폭한다.

이하에는 MEMS 제작 예를 설명할 것이다.

일 예에 따르면, 미세전자기계 시스템(MEMS)은 백만분의 1 미터(마이크론) 크기로 구축된 소형 이동성 구조물을 이용한 기술을 의미한다. 이 구조물은 집적 회로 제작에 사용된 것과 유사한 다수의 기구 및 방법론을 이용하여 제조한다. 일 예에 따르면, MEMS 장치는 기계 부품과 전자 부품의 조합을 포함하고, 제작 시 핀형 패키징에 배치되어, 인쇄회로판(PCB)에 소켓을 통해 부착될 수 있다.

다음은 MEMS 층상 구조물에 관한 설명이다.

일반적으로, MEMS 장치의 제작은 기재 상에 물질의 박막을 침착시키는 단계, 사진석판술을 이용하여 상기 물질 상에 패턴형 마스크를 적용하는 단계, 및 최종 현상된 마스크를 사용하여 필름을 선택 에칭하는 단계를 수반한다. 기재(보통, 실리콘 웨이퍼) 상에 물질의 침착은 화학 반응 기반 접근법(화학 증착, 적층, 전기침착 또는 열 산화)으로 수행하거나 물리적 반응 기반 접근법(증발, 스퍼터링 또는 캐스팅)으로 수행할 수 있다. 각 방법은 속도, 정확성 및 공정 비용이 다양하고, 적용된 물질은 수 나노미터에서 약 100 마이크론 범위일 수 있다. 패턴의 적용은 표면에 감광성 물질을 놓고, 이 표면 위에 패턴형 마스크를 배치한 다음(일반적으로 표면과 마스크에 정렬 표식을 하여 수행한다), 마스크를 통해 감광 물질을 노출시키는 것을 포함한다. 사용되는 공정에 따라, 포지티브 또는 네거티브의 노출 물질이 제거되어, 기재 물질 위에 패턴을 남길 수 있다. 다른 절차로서, 표면을 제조하는 단계, 감광 필름을 현상시키는 단계 및 그 산물을 세척하는 단계를 포함한다.

MEMS 부재 제조는 미세 제작 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 일 예에 따르면, 사진석판술은 반도체 제조 절차, 예컨대 유리, 석영 또는 실리콘 기재에 대한 석판 에칭, 플라즈마 에칭 또는 습식 약품 에칭을 이용하는 제작에서 이용된다.

물질의 제거는 일반적으로 약품 용액에 침지시켜 물질을 용해 제거하는 습식 에칭, 또는 물리적 반응에 근거한 침착에 실질적으로 정반대의 방법으로 물질을 제거하는 건식 에칭을 통해 수행한다. 침착 접근법이 다양함에 따라 속도, 정확성 및 비용은 접근법마다 달라진다. 일 예에 따르면, 기재의 "심부" 포켓의 에칭은 측벽 종횡비 50 대 1로 수행한다.

MEMS 장치에는 하나 이상의 이동성 부재가 제작될 수 있고, 이 부재를 따라 ssDNA의 주형 분자가 부착될 것이다. 이동성 부재, 예컨대 캔틸레버 빔(beam)은 이 빔과 이 빔의 자유 말단 아래의 기재가 모두 1 이상의 전도성 층을 함유하도록 구축할 수 있다. 즉, 패턴형 사진석판술 마스크 이용 시, 상기 장치의 회로소자는 절연 및 전도성 물질 층의 적절한 적용을 통해 구축할 수 있다. 일 예에 따르면, 기하 형태가 하나의 DNA 가교결합 MEMS에서 다음으로 시료를 유동시키고 재순환시켜 접촉 확률을 높이고 시약을 보존시킬 수 있다. 일 양태로는, 유리, 석영, 실리콘 및 다양한 중합체 기재, 예컨대 플라스틱 등(이에 국한되지 않음)의 물질로 구성된 지지체에 구축된 전자 회로가 있다.

일 예에 따르면, 다양한 절연 층이 기재에 제공될 수 있다. 일 예로서, 지탱할 수 있고 전술한 분자적 성질(즉, 전도율 및 이동성)에 반응할 수 있는 고체 물질이 상기 장치의 구축에 사용된다. 본 명세서의 도면에는 회로가 수평 배치가 도시되어 있지만, 다른 양태는 다른 배향(즉, 수직 등)도 포함한다.

일 예는 채널과 저장기를 에워싸고 봉인하기 위해 중첩되어 도관을 형성하는 추가 평면 부재를 포함한다. 이러한 추가 평면적 표면은 특정 하전성 또는 친수성 기재의 존재 하에 접착제, 열 결합 또는 자연 접착을 통해 부착된다.

일 예에서, 시료 수집과 제조는 장치의 외부에서 완료한다. 시료는 면봉이나 패드를 이용하여 표면에서 수집하거나, 또는 필터, 액체 트랩 또는 크로마토그래피 수지를 통한 흡인에 의해 공기 또는 액체로부터 수집한다. 이 시료들은 생물 인자를 파괴하여, 표적 분자를 방출시키고, 상기 장치에 의해 감지되는 분자를 제조하기 위한 시약의 첨가로 제조한다. 제조된 시료는 그 다음 주사기, 피펫, 점안기 또는 이와 같은 다른 수동 또는 자동 수단을 이용하여 유동 채널, 저장기 또는 수관을 통해 장치로 주입한다.

일 예에는 내장 팬 흡인 시스템의 존재를 통해 장치 스스로 자동으로 공기 시료를 획득하고 제조하는 것이 있다. 또 다른 일 예에는 장치에 자동 액체 시료 수집 및 제조를 수행하는 것이 있다. 시료의 파괴는 초음파술과 같은 기계적 기법으로 제공할 수 있다.

일 예에 따르면, 시료는 장치에 내장된 유동 통로를 통해 바이오칩 표면으로 전달된다. 이러한 장치는 시료 제조뿐만 아니라 시스템 세정, 장치 조정 및 폐기물 수집을 위한 시약 저장기를 구비한다. 일 예에 따르면, 장치는 상기 저장기로 물질을 강제 주입 또는 배출시키는 수단을 구비하기도 한다. 일 예에 따르면, 장치는 양성 감지 반응이 발생하지 않고, 시약이 적당한 순도를 유지한다면 시스템에서 시약을 재활용하기도 한다.

일 예에 따르면, DNA 가교 주형의 위치제어 및 배향을 돕기 위하여 올리고뉴클레오타이드 서열이 납 위에 중층되기도 한다. 일반적으로, 회로를 가로지르는 올리고뉴클레오타이드 지향성 DNA 하이브리드화는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 가교 주형을 배향 및 배치하는데 사용된다. 일 예에서, ssDNA 가교 주형은 임의의 부착 방법, 예컨대 티올 또는 비오틴 매개 결합을 통해 MEMS 납에 결합된다.

다중 DNA 가교결합된 MEMS 회로는 동일 시료 유래의 복수의 병원균을 동시에 검출 및 식별하기 위하여, 매트릭스 또는 어레이 기하 형태의 단일 칩에 배치될 수 있다. 일 예에 따르면, 매트릭스는 동일한 DNA 가교결합된 MEMS의 다중 반복체를 포함하여, 시료 부피당 "자극된" 회로 수의 함수로서 표적 DNA분자의 농도를 측정할 수도 있다.

다음은 MEMS 이동성 부재의 생물학적 가교결합에 대한 설명이다.

이동성 부재 및 회로소자를 함유하는 물리적 MEMS 장치가 제작된 다음, 당해의 단일 가닥 ssDNA(주형 분자)를 상기 장치에 부착시킨다. 캔틸레버 빔을 가진 일 예에서, ssDNA는 캔틸레버의 자유 말단에서부터 캔틸레버 아래의 기재 베이스까지 부착된다. 일 예에서, 표면은 주형 ssDNA의 작용기 부착된 말단이 표면에 부착할 수 있도록 제조된다. ssDNA는 한쪽 말단은 티올 기(금 표면에 대한 친화성이 높다)로, 다른쪽 말단은 비오틴(스트렙트아비딘 피막 표면에 대한 친화성이 높다)으로 작용기화한다. 즉, 캔틸레버의 바닥면의 전도체 위에 금이 사용되었다면, 여기에는 ssDNA의 티올 작용기화된 말단이 부착할 것이다. 또한, 캔틸레버의 자유 말단 아래의 기재에는 금 표면이 노출될 수 있다. 결합시킬 ssDNA 주형을 첨가하기에 앞서서, 기재의 금 표면에 비오틴을 정전기적으로 침착시킨다. 이러한 웨이퍼 상에 스트렙트아비딘을 첨가하면 기재 위의 비오틴화된 표면에 결합할 것이다. 따라서, MEMS 장치의 표면은 ssDNA 주형과 결합할 준비가 되게 된다.

다음은 가교결합된 분자 주형의 정전기적 트래핑에 대한 설명이다. 일 예에 따르면, 캔틸레버의 자유 말단과 그 아래에 제조된 기재 베이스 사이의 갭을 따라 단일 가닥 ssDNA 분자를 부착시키는 것을 포함한다. 일 예에서는, 전기 전위가 대형 저항기와 직렬 연결된 상태 하에 갭을 통해 적용된다. 그 결과 형성된 전기장으로 ssDNA 분자가 유인된다. 근접 위치할 때, 비오틴-스트렙트아비딘 결합이 기재 베이스 위에 형성되고, 캔틸레버의 자유 말단에는 금-티올 결합이 형성된다. 이러한 방시긍로 한 분자가 부착하자마자, 갭을 통한 전위는 회로에 직렬 연결된 저항으로 인해 급격하게 감소된다. 즉, 각 부위마다 하나의 ssDNA 분자만이 부착되게 된다. 단일 분자 부착을 돕는 MEMS 납 아암-장치에 대한 ssDNA의 전기장 보조 유인. 나노전극 사이의 단일 전도성 나노입자의 정전기적 트래핑. Appl. Phys. Lett. 71(9).

다음은 과잉 주형 분자의 제거에 대한 설명이다.

한 가닥만을 갭을 따라 부착시켰음에도 불구하고, 몇몇 경우에는 다수의 ssDNA가 금 또는 비오틴화된 표면에 테터링될 수 있다. 이러한 "불량체(stray)"는 표적 병원균 ssDNA 서열과 불필요하게 결합할 가능성이 있다. 일 예로서, 이 장치는 양 말단이 테터링되지 않은 모든 ssDNA를 제거하는 엑소뉴클레아제로 처리하면 센서 부위 외에서의 결합 반응의 가능성을 제거할 수 있다.

일 예에 따르면, 시스템은 추가 이동성 부재로서, 온도, 압력, 이동성, 불량체 전압, 유도 전기장 및/또는 시료 약품 불순물과 같은 기계적, 전기적 또는 화학적 배경 영향을 없애기 위한 참조 또는 기준 대조구로서 작용하는 합성 또는 생물 분자에 의해 가교결합된 부재를 포함한다. 일 예에서, 장치는 하나의 MEMS 칩에 수천 개의 센서 및 참조 부위를 포함한다. 센서 부위는 모두 하나의 생물인자의 존재를 검출하는 생물 부재를 포함하거나 또는 하나의 바이오칩에서 다수의 생물인자를 동시에 검출할 수 있기 위해 다양한 생물 부재를 포함할 수 있다.

다음으로는 시그널 증폭, 프로세싱 및 디스플레이 시스템에 MEMS 회로의 통합에 대하여 설명한다. 나노앰프 범위의 전류 측정은 집적 회로 증폭기를 필요로 한다. 일 예에 따르면, 다중화 집정 회로(IC) 증폭기 및 다른 전자 장치와 프로세싱은 감지 반응의 결과를 디스플레이하는 데 사용된다. 집적 회로는 MEMS 칩으로부터 아날로그 시그널을 증폭시키고 이 시그널을 디지털 시그널로 전환시키는 데 사용된다. 일 예에서, IC 제작은 이 IC를 인쇄회로판(PCB)에 핀 부착시키는 패키징에 IC를 끼운다. MEMS 및 IC 칩의 부착 외에도, PCB는 계산을 수행하고 PCB 상의 전기적 작동을 제어하는 주 프로세서를 포함한다. PCB는 메뉴 버튼에 대한 입출력 장치 뿐만 아니라 디스플레이 및 배터리용의 전기 인터페이스를 포함한다. 일 예에서, 프로세서는 IC로부터 출력되는 디지털 시그널을 이용하여 디스플레이를 제공하도록 프로그램된다. 사용자 인터페이스는 디스플레이의 직접 제어 장치, 및 디스플레이 특성, 한계 검출 값, 배터리 레벨, 온/오프 및 생물인자 분자 세척 콘트롤을 결정하는 변수들을 설정하는 제어 장치를 포함한다. 일 예에서, PCB, 디스플레이, 사용자 인터페이스, 배터리 및 입력/출력 장치는 플라스틱이나 금속 하우징에 통합되어 있다.

다음은 예시적 시스템의 검사 및 분석에 대한 설명이다. 일 예는 시료 수집, 프로세싱 및 전자 회로소자로의 전달을 수반한다.

a. 시료 수집: 공기, 액체 또는 고체 시료 수집의 절차는 표적 분자 급원 및 기구 작업 환경에 기초하여 결정한다. 예를 들어, 적당한 크기, 질량 또는 전하의 입자는 여과 및/또는 질량 분광분석법으로 분리 및 수집할 수 있다. 필터에 걸린 화학 인자 또는 생물 인자는 시료 제조 시약으로 용출시켜 기구로 전달할 수 있다. 일 예에 따르면, 기구 흡인술은 공기 시료를 시료 제조 시약을 통해 유인하거나 강제 유입시킨 뒤 검출 칩으로 전달하는 데 이용된다.

b. 시료 제조: 일 예에 따르면, 공기, 액체 또는 고체 시료는 검출 장치의 외부에서 제조하거나, 자동 시료 제조 기술을 통해 내부에서 제조한다. 시료 제조의 구체적인 단계 및 시약은 급원 및 검출 및 식별되어야 하는 표적 분자에 따라 달라진다. 화학적, 열적 및/또는 기계적 수단은 생물학적 세포 내용물을 파괴시켜 표적 분자를 방출시키는 데 이용된다. 이와 유사한 수단이 사전 준비된 표적 분자의 유기 또는 무기 급원을 제조하는 데 사용된다. 일반적으로, 생물학적 세포의 파괴는 지질 막을 용해시키는 세정제, 세포막 또는 표적 분자와 결합되어 있는 단백질의 효소 분해 및 검출 및 식별을 위해 표적 분자를 변형하거나 또는 다르게 제조하는 다양한 변성제를 필요로 한다. 기계적 수단에는 초음파처리 또는 교반 자체 또는 붕괴용 비드의 존재하에서의 상기 처리를 포함한다. 일 예에서, 여과 또는 크로마토그래피 방법은 표적 분자를 크기, 친수성, 전하 또는 리간드 친화성에 근거하여 정제하는 데 사용된다. 일 예에 따르면, 시스템은 표적 급원과 관련 있는 성분 및 다른 환경 불순물(즉, 염, 먼지, 용매 또는 적당한 검출 또는 식별을 억제하기 위해 특별하게 첨가된 시약)에 저항적이다. 일 예에 따르면, 시스템은 시료와 결합된 미량의 표적 분자에 민감하다. 일 예에서, 시스템은 DNA 급원(즉, 미생물, 동물 세포, 바이러스)의 표면에서, 또는 표면 위에서 발견되거나 또는 이와 다르게 관련되어 있는 특정 DNA 단편을 검출 및 식별한다. 일 예에서, 이중 가닥 DNA는 단편화되고 변성된다.

c. 마이크로칩으로 시료 전달.

d. 검출, 식별 및 구별 수행.

e. 장치에 의한 결과 디스플레이.

본 시스템의 예시적 응용예에는 토양, 물, 또는 공기에서 발견되는 동물, 박테리아, 바이러스, 진균, 식물, 시원균을 이에 국한됨이 없이 포함하는 급원 유래인 성분들의 실시간 검출, 식별, 구별 및 농도 측정을 포함한다. 예시적 성분에는 사람, 식물 또는 동물 병원균과 관련 있는 유기(즉, 핵산, 아미노산 또는 탄수화물 등으로 구성된 것), 또는 무기(즉, 금속, 무기 인산염 등) 성분, 식품 안전성에 중요한 성분 및 급원, 의학적 질환에 중요한 성분 및 습원, 식물 및 동물의 질환의 소인, 질환의 징후전 진단에 관여하는 유전자 서열, 이러한 성분 또는 급원의 실험적 진단 기구, 특정 RNA의 유전자 발현을 모니터하고 다형 ID를 통한 특정 동물 또는 사람을 식별하기 위한 실험 기구가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.

DNA-DNA 상호작용 외에, 다음과 같은 다른 대체 반응이 사용될 수 있다:

단백질-단백질

1) 다른 프리온들에 의한 단백질 단백질 상호작용. 소 해면뇌병증(BSE, 광우병으로 알려져 있다)은 소의 신경변성 질환이며, 감염 고기의 섭취는 사람의 크로이츠펠트 야콥병(Creutzfeldt-Jakob Disease, CJD 및 vCJD)을 유발한다. BSE의 변형은 동물 종에서 식별되었으며, 모두 전염성 해면 뇌병증(TSE)로 분류되었다. 소의 BSE 또는 사람의 CJD는 프리온으로 불리는 신경 단백질이 정상 형태에서 폴딩오류에 의한 감염성 형태로 변화될 때 유발된다. 이러한 폴딩오류에 의한 감염성 프리온은 그 다음 다른 프리온 단백질의 폴딩오류를 유도한다. 본 시스템은 감염성 형태에 대하여 정상 프리온의 물리적 형태를 검출할 수 있다. 일 예에서, 정상 프리온 단백질은 표면에 노출된 시스테인 또는 히스티딘 잔기를 통해 금, 니켈 또는 백금 코팅된 MEMS 표면에 부착된다.

2) 항체-항원 상호작용. 일 예에 따르면, MEMS 회로의 이동성 부재는 특정 생물학적 또는 무기 인자 유래의 항원에 특이적인 항체의 항원 결합 부위의 자연 발생적 또는 합성적 표상과 가교결합된다. 일 예에 따르면, 항원 결합 부위를 나타내는 아미노산 분자는 프리온에 대하여 전술한 바와 유사한 화학을 통해 이동성 MEMS 표면에 부착된다. 가교결합된 항원 결합 부위와 생물인자 항원의 상호작용은 가교결합된 부재에 구조적 변화를 유도하여 측정가능한 시그널을 만들어낸다.

단백질-탄수화물(당단백질 형성)

1) 세포외 탄수화물 에피토프 및 수용체 단백질 사이의 상호작용은 검출 및 분석될 수 있다. 이러한 생물학적 과정의 예에는 바이러스 및 박테리아 감염이 포함된다. 예시적인 한 모델은 만노스 당과 잭 빈(Canavalia ensiformis) 단백질 콘카나발린 A(con A)와 만노스 당이다(Acta Crystallogr., Sect. D 50pp. 847(1994)). 일 예는 히스티딘 또는 시스테인 잔기를 통해 ConA와 MEMS 회로의 이동성 부재를 가교결합시키는 것을 포함한다. 글루코스 함유 시료는 결합하여 Con A 단백질의 치수 형태를 변화시켜 시스템에 시그널을 제공한다. 이러한 회로를 포함하는 본 시스템은 당뇨 제어 장치인 경우 글루코스 잔기의 존재 및 농도를 검출할 수 있다.

2) 신장 세포 표면에서 발현되는 당지질 글로보트리아오실 세라미드는 단백질 5량체의 'B' 결합 서브유닛 사이의 결합 상호작용을 통해, 2성분 박테리아 독소의 일원인 시가(Shiga) 유사 독소 1(SLT1)에 대한 수용체로서 작용한다.

탄수화물-탄수화물

세포-세포 상호작용 및 세포 부착력은 때로 다른 탄수화물 또는 당단백질에 대한 탄수화물 상호작용과 관련이 있다(J Cell Biol. 2004 May 24; 165(4): 529-37. 2004 May 17). 글리코스핑고리피드(GSL) 공동상호작용은 마우스 흑색종 세포 부착에 역할을 하는 것으로 보인다. 한가지 예시적 시스템에는 암세포 성장을 모니터하기 위한 GSL 결합 부위를 가진 당단백질 구조를 제조하는 단계를 포함한다.

일 예에 따르면, 화학적 및 생물학적 검출/식별 시스템은 시료 수집, 시료 가공 및 전달, 시료 분석 기술 및 시그널 프로세싱 및 출력을 수반한다.

DNA 가닥의 강도 및 길이는 염기 조성, 서열 및 환경에 따라 좌우된다. 평균적으로, dsDNA의 직경은 20 옹스트롬(Å)이고, 인접 뉴클레오타이드 간의 거리 3.4Å 또는 하나의 전체 나선 회전 거리 약 34Å이다. 이러한 dsDNA 나선은 2개의 홈을 나타낸다: 작은 홈(약 12Å) 및 큰 홈(약 22Å). 이에 반해, ssDNA의 인접 뉴클레오타이드 간의 거리는 약 5.84Å이다.

분자 수축

제1의 물리적 현상은 이중 가닥 DNA(dsDNA)에 의한 것으로 추정되는 나선 형태와 관련이 있다. 단일 가닥 DNA(ssDNA)는 일반적으로 뉴클레오타이드 염기 당 약 5.84Å과 같은 길이의 선형 물리적 구조이다. DNA 가닥을 구성하는 각 빌딩 블록(염기)은 구아닌(G), 아데닌(A), 티민(T) 및 사이토신(C)이다. DNA 한 가닥과 이의 상보성 가닥과의 정렬 및 결합(하이브리드화라고 불리는 과정)은 뉴클레오타이드 염기 사이의 거리가 3.4Å으로 감소된 나선형 dsDNA 구조를 생성한다. ssDNA의 50 염기는 약 292Å인 반면, 동일한 뉴클레오타이드 수의 dsDNA는 단지 175Å(17.5nm), 즉 약 40%의 DNA길이의 예상 평균 감소(염기 조성, 서열 및 환경에 따라 달라진다)를 나타낸다. 이러한 길이 감소는 일관된, 물리적으로 측정가능한 반응이다.

또한, 분자 길이의 총 변화량은 제1(주형) ssDNA과 제2(보체 또는 표적) 부착성 가닥 사이의 정합 정도와 관련이 있다. 적당한 조건에서는 완전치 않은 정합성 DNA 가닥도 하이브리드할 것이다. 하지만, 길이 감소에는 비례적으로 감소되는 영향을 미친다. 즉, 길이 변화가 측정되고, 완전한 정합성 때문인 길이의 최대 변화가 알려져 있다면, 표적 ssDNA와 도입된 ssDNA 사이의 유전자 서열의 변화 정도가 측정될 수 있다. 정확한 정합을 요구하는 환경 조건에는 저염 조건 및 고온(20℃ A&T, 40℃ G&C). 이에 반해 부정확한 정합성 DNA 가닥(또는 유전자 변형체) 사이의 하이브리드화는 염 농도를 높이고 온도를 낮추면 가능하다. 하나의 ssDNA 분자와 다른 분자의 상호작용과 그 결과 수득되는 물리적 형태의 변화는 본 발명의 기능에 중요하다. 가닥 대 가닥 및 서브유닛 연결 결합의 총 강도는 각 유닛 사이의 복합된 유인력의 결과이다. 이러한 유인력에는 수소 결합, 염기 적층 상호작용 및 염기는 내부로, 인산염은 외부로 이동시키는 소수성 상호작용이 포함된다. 또한, 결합 에너지의 정확한 측정이 인접 뉴클레오타이드와 고유 환경(pH, 온도, 이온 강도 등)에 따라 좌우된다는 것도 잊지 말아야 한다. 수소 결합은 4 내지 7kcal/mol, 염기 적층은 3.8 내지 14.6kcal/mol, 포스포디에스테르 결합의 공유 결합 에너지는 80 내지 100kcal/mol을 증가시킨다(참조문헌). 실험 및 이론적 연구에 따르면, 평균 염기 조성 및 서열의 dsDNA 인장 강도는 약 5 x 10^-12 뉴톤(kg/sec²)이다(참조문헌). 이러한 힘은 박테리아 하나의 중량에 거의 상응한다; 그럼에도 불구하고, 전술한 기술은 그러한 힘을 정확하게 적용하기에 충분하게 정밀하다.

전도율

두 정합성 ssDNA의 재조합과 관련된 제2의 물리적 현상은 하이브리드화 후 ssDNA의 전도율의 현저한 증가가 일어난다는 점이다. 다수의 연구 논문들은 ssDNA가 전기를 전도시킬 수 있음을 입증한 바 있다. ssDNA의 전도율은 유전자 서열의 구성에 따라 매우 좌우되는데, 구아닌과 사이토신(G 및 C)은 전도체로 작용하는 반면 아데닌과 티민(A 및 T)은 절연체로서 더 작용하는 경향이 있다(참조문헌).

하이브리드화 후 전도율의 증가는 적당한 G-C 고밀도 서열의 ssDNA 보다 100X 정도일 수 있다. 이러한 놀라운 증가에 기여하는 기작과 관련하여 많은 논란이 문헌에 제시되고 있지만, 염기쌍 영역을 통한 전자 터널링이거나 또는 당 인산염 주쇄에서의 전자 호핑(hopping)일 수 있다; 이러한 기작에도 불구하고, 상기 증가는 측정가능하며, 임의의 신호대잡음 비 문제 보다 확실하다.

분자 길이의 변화와 관련하여, 전도율의 증가는 표적 ssDNA와 잠재적 정합성 ssDNA와의 사이에 정합성 정도에 비례한다. ssDNA 분자 사이의 부정합이 클수록, 하이브리드화 후 전도율의 증가는 적다.

전압 유도 변성

제3의 물리적 현상은 dsDNA의 두 상보성 ssDNA로의 분리와 관련이 있다. 서던 하이브리드화는 DNA 분자의 하이브리드화 및 변성을 조절하는 확인된 실험 접근법이다(참고문헌). 염도 및 온도와 같은 환경 변수를 조절함으로써, DNA 분자의 하이브리드화 또는 변성을 유도할 수 있다. 변성은 또한 dsDNA를 통해 충분한 전류를 통과시켜 수행할 수 있다. 또한, 최후의 기작이 완전하게 이해되지는 않았지만, 이러한 현상은 여러 차례 관찰되었다(참고문헌). 분자 길이 및 전도율의 변화와 관련하여 dsDNA를 2성분 ssDNA로 변성시키는 데 필요한 전류는 성분 ssDNA 사이의 정합도에 비례한다. 정합성이 클수록 변성시키는데 필요한 전류 양도 많아진다.

DNA 주형 생산

바실러스 서브틸리스 게놈 DNA 제조: 바실러스 서브틸리스(Ehrenberg) Cohn 균주 168(미국 모식균 배양수집소(ATCC) #27370)은, 1L 당 심장 주입액(BD #238400) 12.5g, 영양 배지(BD #234000) 5.4g 및 효모 추출물(BD #212730) 2.5g을 함유하는 멸균 ATCC 배지 #265 100ml에서 배양했다. 이 배양물을 140rpm으로 진탕시키면서 30℃에서 15시간 동안 증식시켰다. 이 배양물로부터 표준 절차(Marmur, J. 1961. A precedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J.Mol.Biol. 3:208-218)에 따라 게놈 DNA를 정제했다. 간략히 설명하면, 바실러스 배양물 100ml을 4000xg로 10분 동안 원심분리했다. 펠릿을 TE(10mM Tris(10mM 트리스 하이드록실-아미노메탄 EM #9210), 1mM EDTA(에틸렌 디아마이드 테트라아세트산 EM #4010)) 9.5ml; 10% SDS(소듐 도데실 설페이트 EM#DX2490-2) 0.5ml; 및 20mg/ml 프로테이나제 K(EM #24568-3) 50㎕에 재현탁시키고 37℃에서 1시간 동안 항온 처리했다. 항온 처리 후, 5M NaCl(염화나트륨 VWR #6430-1) 1.8ml를 첨가하고, 이 용액을 철저하게 혼합한 다음, CTAB/NaCl 용액(0.7M NaCl 중의 10% CTAB(헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드 VWR 80501-950)) 1.5ml을 첨가한 다음 65℃에서 20분 동안 항온 처리했다. 이 용액을 동량의 클로로포름(EM #CX1054-6)/이소아밀 알코올(Calbiochem #80055-544)로 추출한 다음, 22℃, 6000xg에서 10분 동안 회전 침강시켰다. 수성 상을 페놀(EM #PX0511-1)/클로로포름/이소아밀로 추출하고, 22℃, 6000xg에서 10분 동안 회전 침강시켰다. 수성상 중의 DNA를 0.6 부피량의 이소프로필 알코올(VWR 3424-7) 첨가로 침전시키고 4℃, 6000xg로 10분 동안 회전 침강시켰다. 침전물을 70%(v/v) 에탄올로 세척하고 4ml TE에 재현탁시켰다. 농도는 260nm에서의 분광 광도계로 흡광도를 측정하여 100㎍/ml로 조정했다. 에티디움 브로마이드(EM #4310) 200㎕ 및 CsCl(세슘 클로라이드 EM #3030) 4.3g을 DNA 4ml 당 첨가했다. 이 용액을 15℃에서 300,000xg로 4시간 동안 회전 침강시켰따. 게놈 DNA 밴드는 자외선으로 가시화하여 주사기로 분리했다. 에티디움 브로마이드를 CsCl 포화 이소프로판올로 추출하고, 4℃의 2L TE에서 하룻밤 동안 투석하여 CsCl을 제거했다. DNA를 0.6 부피의 이소프로필 알코올로 침전시키고 -70℃에 보관했다.

바실러스 서브틸리스 16S rRNA의 PCR 증폭: B. 서브틸리스의 16S rRNA 유전자를 공지의 방법에 따라 앞서 제조한 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시켰다(H.-J. Bach, l, D. Errampalli, K. T., Leung, H., Lee, A, . Hartmann, J., T. Trevors, and J.C. Munch. 1999. Specific Detection of the Gene for the Extracellular Neutral Protease of Bacillus cereus by PCR and Blot Hybridization. Applied and Environmental Microbiology, p. 3226-3228, Vol. 65, No.7). DNA 증폭은 GeneAmp PCR System 9600(Perkin-Elmer, Norwalk, Conn.)으로 수행했다. 시료 50㎕는 주형 B.서브틸리스 게놈 DNA 50ng, 각 프라이머(순방향: 5'-gggtttgatcctggctcag-3'; 역방향: 5'-acggttaccttgttacgactt-3') 25 피코몰, 0.2 mM 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(Boehringer, Mannheim, Germany), Taq/AmpliTaq® DNA 폴리머라제(Promega) 2유닛, 10x 반응 완충액(EM) 5㎕ 및 3mM MgCl₂(EM)을 함유했다. PCR 프로그램은 다음과 같다: 94℃ 5분 및 80℃ 4분의 고온 개시 사이클; 94℃ 2분, 64℃ 1분 및 72℃ 2분, 1 사이클; 94℃ 30초, 64℃ 30초 및 72℃ 45초, 30 사이클; 72℃ 10분 동안의 최종 신장 단계. 증폭된 PCR 산물은 TAE 완충액(40mM Tris-아세테이트(pH 7.6), 1mM Na₂EDTA)에서 0.8% 아가로스(Promega LMP #V2831)로 겔 전기영동하여 분리했다. 약 1500bp PCR 산물을 분리하여 AgarACE®(Promega) 분해 방법으로 아가로스로부터 추출했다(주: 전술한 프라이머는 다양한 박테리아의 16S rRNA 뉴클레오타이드 서열을 PCR 증폭시키기 위한 수단으로서 알버트 박사가 특별히 설계한 것이다).

바실러스 서브틸리스 16S rRNA의 클로닝: 상기 단계에서 생산된 16S rRNA PCR 산물은 제조자의 제안 절차에 따라 플라스미드 클로닝 벡터 pGem®-T Easy(Promega)에 결찰시켰다. 간략히 설명하면, 75ng PCR 산물은 2x 급속 결찰 완충액(Promega) 5㎕, 벡터 DNA(50ng) 1㎕, 및 T4 DNA 리가제(3 바이스 유닛) 1㎕에 첨가했다. 이 반응 용액을 22℃에서 1시간 동안 항온처리했다. 이러한 결찰 반응 산물을 이용하여 다음과 같은 절차에 따라 JM109 컴피턴트 세포(Promega)를 형질전환시켰다: 멸균 1.5ml 튜브 안의 빙냉한 컴피턴트 세포 50㎕에 빙냉한 결찰 반응액 2㎕를 천천히 첨가했다. 이 튜브를 얼음 상에서 20분 동안 항온처리한 다음, 42℃에서 50초 처리하고, 다시 얼음에 넣어 2분간 방치했다. 22℃ 멸균 SOC 배지 950㎕를 첨가하고 튜브를 150rpm으로 진탕 하에 37℃에서 1.5시간 동안 항온배양했다. 형질전환된 세포를 LB/앰피실린/IPTG/X-Gal 평판에 도말했다. 이 평판을 37℃에서 20시간 동안 항온배양했다. 그 다음, 백색 콜로니를 아래에 정리된 플라스미드 미니프렙 절차에 따라 삽입체 여부에 대하여 선별했다.

플라스미드 미니프렙 절차: B.서브틸리스 16S rRNA 뉴클레오타이드 서열의 삽입체를 함유하는 플라스미드를, 블린과 돌리(Blin & Doly in Nucleic Acids Research 7:1513-1523(1979)) 기술의 변법에 따라 JM109 대장균 숙주로부터 신속하게 정제했다. 후보 삽입체/벡터 형질전환된 클론을 나타내는 20개의 백색 콜로니를 각각 멸균 피펫 팁으로 취하여, 멸균 마개가 씌워진 시험관의 2ml LB/앰피실린 배지에 넣고 200rpm 진탕 하에 37℃에서 16시간 동안 항온 배양했다. 이 배양물을 각각 멸균 1.5ml 마이크로원심분리 관에 첨가하고, 4℃, 4000xg에서 5분 동안 원심분리했다. 펠릿을 180㎕ 용액 I + 20㎕ 5mg/ml 리소자임에 재현탁시키고, 22℃에서 5분 동안 항온배양했다. 용액 II 400㎕를 뒤집어가며 5회 투입하고, 이 용액을 얼음 상에서 5분 동안 방치했다. 빙냉 용액 III 300㎕를 첨가하고, 튜브 내용물을 볼텍싱한 뒤 얼음상에서 10분 동안 방치했다. 시료를 22℃, 10,000xg에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액을 DNA 침전을 위해 이소프로판올 500㎕(0.6 부피량)를 함유하는 새 멸균 1.5ml 마이크로원심분리 관으로 이동시켰다. 시료를 볼텍싱한 뒤, 22℃, 10,000xg에서 5분 동안 원심분리하고, 펠릿을 TE 200㎕에 재현탁시켰다.

16S rRNA 유전자 삽입체의 형질전환체 선별: 플라스미드 제조물 5㎕를 Not I(Promega)로 제조자의 지침에 따라 제한 분해하고, 플라스미드와 절단된 삽입 단편을 1% 아가로스 전기영동으로 분리하여, 원하는 pGem-B.서브틸리스 rRNA 플라스미드 작제물을 함유한 콜로니 분리물을 식별했다. 전기영동 분석을 통해 적당한 플라스미드 작제물을 함유한 것으로 확인된 클론 후보를 500ml LB/앰피실린 배지에서 배양하고, 일정량을 70% 글리세롤에서 -70℃ 하에 보관하고, 배양물 스톡과 DNA를 만들기 위해 대량 플라스미드 제조 실험을 수행했다.

동일한 121bp 가교 주형을 생산하기 위한 대체 접근법: 동일한 121bp 뉴클레오타이드 서열을 생산하는 2가지 대체 방법은 다음과 같다.

1) B.서브틸리스 DNA의 서브클로닝.

미생물 DNA의 클로닝된 단편은 종종 개인이나 상업적 급원에서 수득할 수 있다. 원하는 121bp 단편을 비롯한 B.서브틸리스 DNA의 대형 삽입체를 함유하는 플라스미드는 제한 효소 AatII 및 SphI로 분해할 수 있다. 이 분해물은 171 bp 단편을 제공하며, 이는 pGem-T(프로메가) AatII/SphI부위와 같은 임의의 적당한 클로닝 벡터에 클로닝할 수 있다. 이 플라스미드로부터 전술한 PCR 절차에 따라 원하는 121bp 단편을 서브클로닝할 수 있다.

2) 원하는 가교 주형의 합성.

원하는 올리고뉴클레오타이드 가교 주형은 ABI 392 DNA 합성기와 같은 임의의 상용화된 시스템을 이용하여 합성할 수 있다. 표준 포스포아미다이트 약품을 사용하여 5' 말단에 디메톡시 트리틸 보호기를 제공할 수 있다. 이 분자는 C18 역상 HPLC(25mM NH₄OAc, pH 7.5-25% CH₃CN, 30분간)로 정제한 다음, 80% 아세트산에서 15분 동안 보호기제거 반응시킬 수 있다. 탈보호 후, 올리고뉴클레오타이드를 다시 동일한 C18 컬럼에서 역상 HPLC(25mM NH₄OAc, pH 7.5-25% CH₃CN, 30분간)로 정제할 수 있다. 합성된 DNA 양은 단일 가닥 DNA의 흡광 계수, (260nm, M^-1cm^-1) 아데닌(A)=15,000; 구아닌(G)=12,300; 사이토신(C)=7400; 티민(T)=6700을 사용하여 UV-가시광선 흡수 분광분석술로 측정할 수 있다. 대부분의 합성 절차는 80 내지 90 염기를 넘으면 충실도가 떨어지기 때문에, 여기서 논하는 121bp 가교 주형은 적어도 2개의 단편으로 합성해야 한다. 구체적으로, 연구 계획의 단계 1에 제시된 바와 같이, 4개의 약 60 염기 단일 가닥 뉴클레오타이드를 합성하여, 적당한 방식으로 서로 하이브리드하고 결찰시켰다. 그 산물은 클로닝 벡터에 결찰시킬 수 있다.

PCR 증폭에 의한 121bp 회로 가교 주형의 제조:

B.서브틸리스 16S rRNA 유전자의 121bp 분절은 pGem-B.서브틸리스 rRNA 플라스미드 작제물로부터 PCR 증폭시켰다. 시료 50㎕는 Sal I 분해된 주형 플라스미드 DNA 50ng, 각 프라이머(순방향: 5'-CGAGCGGCCGCCTGGGCTACACACGTGC-3'; 역방향: 5'-CGACCGCGGCCAGCTTCACGCAGTCG-3') 25 피코몰, 0.2 mM 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(Boehringer, Mannheim, Germany), Taq/AmpliTaq® DNA 폴리머라제(Promega) 2유닛, 10x 반응 완충액(EM) 5㎕ 및 3mM MgCl₂(EM)을 함유했다. PCR 프로그램은 다음과 같다: 94℃ 5분 및 80℃ 4분의 고온 개시 사이클; 94℃ 2분, 64℃ 1분 및 72℃ 2분, 1 사이클; 94℃ 30초, 64℃ 30초 및 72℃ 45초, 30 사이클; 72℃ 10분 동안의 최종 신장 단계. 증폭된 PCR 산물은 TAE 완충액(40mM Tris-아세테이트(pH 7.6), 1mM Na₂EDTA)에서 1.5% 아가로스(Promega LMP #V2831)로 겔 전기영동하여 분리했다. 약 121bp PCR 산물을 분리하여 AgarACE®(Promega) 분해 방법으로 아가로스로부터 추출했다. 정제된 산물은 pGem 벡터의 NotI/SacII 부위에 결찰시키고 JM109를 형질전환시킨 뒤, 121bp 삽입체 함유 플라스미드를 전술한 바와 같이 생산했다.

DNA 가교 주형 특이성 확인: 전술한 절차에 의해 클로닝된 121bp B.서브틸리스 단편은 통상적인 하도급 DNA 서열분석 기관을 통해 서열 보존성에 대하여 확인했다. 121bp 삽입 뉴클레오타이드의 서열은 다음과 같이 확인되었다: 5'- ctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaat Cccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctgg-3'. 이 서열은 16S rRNA 바실러스 서브틸리스 아종인 서브틸리스 균주 168(Entrez PubMed 수탁번호 #NC000964)와 정확하게 정합되었다.

121bp 삽입체의 특이성은 미국 모식균 배양수집소에서 시판하는 바실러스 서브틸리스 및 다른 바실러스 종(즉, B. 글로비기, B. 세레우스, B. 서브틸리스, B. 투린지엔시스)의 게놈 DNA에 대한 표준 서던 선별법으로 확인했다. 서던 하이브리드화 선별의 절차는 다음과 같다. 전술한 바와 같이 제조된 바실러스 종 게놈 DNA를, 121bp 삽입체를 분해하지 않는 제한 효소, HindIII, EcoRI 및 PstI으로 제한분해했다. 분해로 생산된 단편을 TAE 중의 0.8% 아가로스로 분리하고 에티디움 브로마이드로 염색했다. 겔을 투조기 상에서 260nm UV로 5분간 처리하고, 0.2M HCl에 7분 동안 침지시켰다. 이 겔을 그 다음 염기성 용액(1.5M NaCl, 0.5M NaOH)에 45분 동안 침지시킨 다음, 중화 용액(5M Tris-HCl, 3M NaCl, pH 7.4)에 90분 동안 침지시켰다. 표준 서던 구성(Southern, E. M. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98, 503-517). 간략히 설명하면, 처리된 겔을 흡수성 와트만 3MM 여지 및 DNA 결합 니트로셀룰로스(SS) 사이에 중층시키고, 20x SSPE(3M NaCl, 0.2M NaH2PO4, 20mM EDTA, pH 7.0)를 여지 및 겔을 통해 흡수시켜 겔 DNA를 결합 막 위로 이동시켰다. 게놈 DNA를 실온에서 16시간 동안 이동시켰다. 막을 분리하여 5x SSPE에 30분 동안 침지시킨 다음, 여지가 마를 때까지 수시간 동안 80℃ 진공 오븐에서 구웠다. 그 다음, AlkPhos®-DIRECT(Pharmacia) 제조자 지침에 따라 라벨링된 상기 121bp 클로닝된 주형 단편에 하이브리드할 단편에 대하여 탐침했다. 탐침된 막의 발색 결과, 프로브가 B.서브틸리스, 특히 B.서브틸리스 게놈 내의 한 부위에만 특이적임이 분명하게 확인되었다.

점 돌연변이 변형체의 제조:

121bp 뉴클레오타이드 서열의 유전자 변형체는 공지의 방법에 따라 제조했다(Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends. Eds. A. M. Griffin and H.G. Griffin. ISBN 1-898486-01-8. 1995 Horizon Scientific Press, PO Box 1, Wymondham, Norfolk, U.K). 구체적으로, 0.5pmol의 pGem-B.서브틸리스 플라스미드 주형 DNA를, 1x 돌연변이유발 완충액(20mM Tris HCl, pH 7.5; 8mM MgCl₂; 40㎍/ml BSA) 25㎕에 T7 및 SP6 프라이머(Promega) 각각 20pmol, 각 dNTP 250μM, Taq DNA 폴리머라제 2.5U, Taq 신장제(Stratagene) 2.5U를 함유하는 PCR 칵테일에 첨가했다. PCR 사이클 변수는 다음과 같다: 94℃ 4분, 50℃ 2분 및 72℃ 2분, 1사이클; 94℃ 1분, 54℃ 2분 및 72℃ 1분, 5 내지 10사이클. 모 주형 DNA 및 선형, 돌연변이유발 프라이머를 함유한 새로 합성한 DNA를 DpnI(10U) 및 Pfu DNA 폴리머라제(2.5U)로 처리했다. 그 결과, 생체내 메틸화된 모 주형 및 하이브리드 DNA의 DpnI 분해물이 수득되었다. 이 선형 PCR 산물에 있는 Taq DNA 폴리머라제-신장된 염기를 Pfu DNA 폴리머라제로 제거했다. 이 반응은 37℃에서 30분간 항온배양 한 뒤, 72℃에서 추가 30분간 항온배양하여 수행했다. 0.5mM ATP를 함유하는 돌연변이유발 완충액 115㎕를 첨가하고 이 용액을 혼합했다. 이 용액 10㎕를 새로운 미량원심분리 튜브에 담고, 여기에 T4 DNA 리가제 4 유닛을 첨가한 뒤 37℃에서 90분 동안 항온배양했다. 이 용액으로 전술한 컴피턴트 JM109 대장균을 형질전환시키고, LB/앰피실린 배지 위에 도말한 뒤 37℃에서 16시간 동안 배양했다. 각 분리물로부터 플라스미드 DNA를 제조하고, 뉴클레오타이드 서열을 전술한 바와 같이 분석했다. 2%, 19% 및 35% 염기 변이를 나타내는 분리물을 추가 연구를 위해 보관했다.

121bp 주형의 말단 라벨링화:

DNA 가교 주형은 비오틴-스트렙트아비딘 및 티올-금 결합을 통해 AFM 및 MEMS 표면에 공유 부착할 것이다. 121bp 16S rRNA B.서브틸리스 단편을 함유하는 플라스미드는 NotI 및 SacII로 제한효소 분해하여 삽입체를 방출시키고, 이를 전술한 바와 같이 TAE 완충액에서의 0.8% LMP 아가로스로 겔 정제했다. 분자의 5' 말단 및 3' 말단은 통상적인(Pierce #89818) 말단 라벨링화 키트를 공지의 절차(B. A. Connolly and P. Rider, Nucleic Acids Res. 13, 4485 (1985) 및 A. Kumar, S. Dvani, H. Dawar, G. P. Talwar, 상기 동일 문헌, 19, 4561 (1991))에 따라 사용하여 티올 및 비오틴 기로 각각 라벨링시켰다.

DNA 물리적 성질의 측정:

원자간 힘 현미경(AFM)은 일반적으로 분자 수준에서 표면 지형을 평가하는 데 사용된다. AFM 시스템은 예리한 팁이 아암의 종축과 직교 방향으로 돌출해 있는 캔틸레버 아암을 포함한다. 아암은 팁이 표면에 접촉하게 될 때까지 하강한 다음, 표면을 따라 당겨져서 표면 치수 변화를 측정한다. 캔틸레버 팁의 이동이 측정되며; 지형의 특성이 밝혀질 때까지 충분한 시료 표면 상에서 그 공정이 반복된다. 가장 일반적으로, 팁 편향은 반사 레이저 접근법으로 측정한다.

본 연구에서, AFM은 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 분자의 축을 따라 형성된 결합을 파괴하는 데 필요한 힘을 측정하거나 또는 결합된 DNA 분자의 이동 결과로서 AFM 팁의 이동을 측정하는 데 사용되었다.

AFM 팁과 제물대 사이에 테터링된 분자에 가해진 힘에 대한 저항의 실험적 측정: 팁과 제물대 사이에 느슨하게 테터링된 분자는 먼저 양성 힘이 기록될 때까지 표준 AFM 방식으로 압축된다. 그 다음, 팁을 표면에서부터 들어올리면, 분자는 팽팽해지고, 팁과 제물대 사이의 거리가, 분자의 파괴 지점인 최대 분자 길이를 초과할 때까지 음성 힘을 기록한다.

원자간 힘 현미경(AFM)은 B.서브틸리스 121bp 삽입체 및 변형 DNA 단편의 특이적인 물리적 성질(즉, 이동 및 전도율)을 정확하게 측정하는 데 사용되었다. AFM은 규정된 약품과 방법에 따라 사용했다. AFM 팁 및 제물대는 공지의 절차에 따라 금 및 스트렙트아비딘으로 피막하고, 상기에서 수득한 티올/비오틴 말단 라벨링된 DNA 가교 주형을 부착했다(RM Zimmermann and EC Cox. 1994. DNA stretching on functionalized gold surfaces. Nucleic Acids Research, Vol 22, Issue 3 492-497). 부착에 앞서, 말단 라벨링된 DNA티올 기는 0.04M DTT, 0.17M 인산염 완충액(pH 8.0)으로 하룻밤동안 처리하여 보호기제거되었다. 과량의 DTT를 제거하기 위해 에틸 아세테이트로 반복 추출한 후, 10mM HEPES, 5mM EDTA 완충액, pH 6.6에서 부착시켰다. 이러한 DNA 용액에 금 처리된 AFM 팁을 침지시켜 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후 질소류 하에서 건조했다. DNA 결합된 AFM 팁을 AFM에 장착하고, 반응 챔버에 SPE(0.1M 인산나트륨 pH 6.6, 1mM EDTA 및 1M 염화나트륨)를 쏟아부어 공유 비오틴-스트렙트아비딘 결합을 형성시켰다.

AFM 팁 이동 및 물질 전기적 성질은 보체 및 변형체 ssDNA 분자와 하이브리드하기 전, 하이브리드 동안 및 하이브리드 후 측정했다. 하이브리드화(pH 완충액, 염), 변성, 가수분해 및 뉴클레오타이드 산화를 조절하는 시약도 조사했다.

고정 상태로부터 팁 이동에 대한 실험: 테터링된 단일 가닥 DNA의 길이는 보체 가닥과의 하이브리드화 결과로서 감소된다. 이러한 실험 조건 하에 테터링된 ssDNA의 길이 감소는 AFM 팁을 제물대쪽으로 이동시켜 측정가능한 이동성 결과를 산출한다.

결과

여기에 기술한 실험은 사실상 길이가 83bp 내지 2854bp 범위인 약 80개 분자에 대한 분자 및 AFM 연구에 관한 것이다. DNA는 플라스미드 벡터, 람다 바이러스 대장균 게놈 및 B. 서브틸리스 게놈 DNA에서 유래하는 것이다. 전술한 121bp 단편에 대하여 가장 집중된 연구를 수행했지만, 그 결과는 모든 분자들마다 유사했다. 최초 실험으로, AFM 팁과 제물대에 양 말단이 부착된 단일 가닥 121bp 단편의 길이 감소를 전술한 방법에 따라 측정했다. AFM 팁 이동은 4 내지 5㎕의 희석된(1㎕당 1 내지 2분자) 단일 가닥 121bp 단편 또는 121bp 삽입체를 함유하는 변성된 플라스미드를 피펫주입한 후 수초 이내에 관찰했다. 도 4는 121bp 단편의 길이가 약 10nm 감소되는 방식을 보여준다.

DNA 가닥의 정확한 길이는 염기 조성,서열 및 환경에 따라 달라진다. 평균적으로, dsDNA의 직경은 20Å이고, 인접 뉴클레오타이드 사이의 길이는 3.4Å 또는 하나의 전체 나선 회전당 약 34Å이다. dsDNA 나선은 2개의 홈, 즉 작은 홈(약 12Å)과 큰 홈(약 22Å)을 보여준다. 하지만, ssDNA의 인접 뉴클레오타이드 간의 거리는 약 5.84Å이다. 따라서, 121개 염기의 ssDNA는 약 701Å인 반면, 이와 동일한 뉴클레오타이드 수의 dsDNA는 약 411Å이거나 또는 약 40%의 예상 DNA 길이 평균 감소율을 나타낼 것이다. 따라서, AFM에 테터링된 121bp 가닥을 자유롭게 꼬이게 했다면, 팁은 29nm 만큼 이동했을 것이다.

이와 별도로, 모 뉴클레오타이드 서열과 2%, 19% 및 35% 상이한 DNA 분자(변형체)를 주입하여 팁 이동의 측정가능한 차이를 확인했다. 본 연구에서 AFM 팁 이동이 단일 가닥 DNA보다 길이가 짧은 이중 가닥 DNA 나선구조의 형성 때문이라면, 상보성이 적은 가닥으로 구성된 하이브리드 분자는 적은 팁 이동을 나타낼 것이다.

도 4는 121bp DNA 가교 주형이 테터링되고, 본 명세서에 논의된 바와 같이 AFM 팁과 제물대 사이에 약간의 장력 하에 약 15초 전 일정 시간 동안 유지되고 있음을 보여준다. 약 71nm의 안정 상태 위치로 유지되던 팁은 주형의 상보성 DNA 가닥이 도입되자마자 약 10nm 이동했다. 이와 별도로, 모 서열과 2%, 19% 및 35% 상이한 분자의 도입은 팁 이동의 측정가능한 차이를 나타냈다. 그래프 선은 각각 5회의 측정치에 대한 편차가 0.3% 미만임을 보여준다.

AFM 캔틸레버 표면은 시험 분자를 통해 전기 전류의 전도가 이루어지도록 금으로 피막시켰다. 캔틸레버와 제물대 사이에 전위를 적용하여, 가교결합된 121bp ssDNA 주형을 통해 흐르는 해당 전류를 측정했다. 적용된 전압이 약 1볼트인 경우, ssDNA 주형을 통해 측정된 전류는 약 0.3nA이었다. 완전한 상보성의 표적 ssDNA가 도입된 경우, 동일 전압에서 측정된 전류는 약 2.1nA로 증가되었다.

이러한 결과는 앞서 논의한 ssDNA/dsDNA 전도율과 관련된 양태를 확인시켜 준다. 또한, DNA 분자의 조성 및 서열에 따라 DNA 분자의 전도율이 변화되는 지를 확인했다. 구체적으로, 아데닌(A) 및 티민(T) 뉴클레오타이드는 절연체로서 작용하는 반면, 구아닌(G)과 사이토신(C) 뉴클레오타이드는 전도체로서 양호하게 작용한다.

이와 유사한 결과는 표적 ssDNA 가닥이 주형과 공지의 변형도를 보유한 조작된 변형체로서 도입된 경우에도 일어난다. 변형 연구에 사용된 것과 동일한 변형 표적 ssDNA 분자를 첨가했고, 이에 따라 전도율 반응을 측정했다. 중요한 점은 하이브리드화 시 분자의 전도율 증가 및 주형과 표적 ssDNA 가닥의 부정합 정도 사이의 높은 비례성이 존재하고, 이는 앞에서 개략한 특이성 현상의 실험적 증거로서 t용될 수 있다는 점이다. 이러한 결과는, 그 변화가 유전자 서열의 한 영역에서 일어난 것인지, 또는 표적 서열을 따라 다수의 여러 위치에서 일어난 것인에 관계없이 일정했다.

일단 dsDNA를 통해 전도된 전류의 양을 측정하고, AFM 캔틸레버와 기재를 따라 작용되는 전압을 수동으로 증가시켜, dsDNA를 통과하는 전도성을 증가시켰다. dsDNA의 변성이 일어날 때까지 전압을 증가시켰다. 이러한 실험에 대한 결과의 플롯은 도 6에 도시했다. 변성 지점에서 전도된 전류는 ssDNA에 의한 수준으로 강하되었다.

도 6에서 볼 수 있듯이, 변성을 일으키는 데 필요한 전류의 양과 주형 및 표적 ssDNA 가닥의 부정합 정도 사이에는 높은 비례성이 있었다. 앞선 연구에서와 마찬가지로, 이 결과는 유전자 서열의 한 영역에서 변화가 일어나는지 또는 표적 서열을 따라 다수의 여러 위치에서 변화가 일어나는지에 상관없이 일관된 결과였다.

AFM으로 수행한 또 다른 실험은 변성 유발을 위해 전압을 증가시키고, 그 다음 또 다른 하이브리드화가 일어나게 하는 감지 수준으로 전압을 감소시켰다. 도 7에서 볼 수 있듯이, AFM은 다수의 감지 반응을 성공적으로 수행했고, 하이브리드화의 전류 감지/바이오센서를 복귀시키는 수단으로서 전류 증가에 의한 변성 유도를 사용할 수 있음을 확인했다. 도 7에서 중요한 것은, 복수의 감지 반응 전반에 걸쳐서, ssDNA 동안 및 하이브리드화(dsDNA) 후에 측정된 전류의 일관성이다. 도 7에 도시된 실험은 4가지 별도의 감지 반응을 보이고 있지만, 실제로는 수백 가지의 감지 반응을 통해 수많은 실험이 수행되었으며, 이 때 감지 반응 전과 후에 시그널의 현저한 감소 및 측정된 전류의 큰 변화는 전혀 보이지 않았다.

AFM은 앞선 섹션에서 개략한 현상의 조사 및 확인을 수행할 수 있다. 이러한 감지 반응에는 전용 생물검출 장치의 선택 특성이 포함된다. 예컨대, AFM 캔틸레버 팁은 장치 제조에 사용된 것과 같은 접근법 및 기술을 사용하여 구축되며, 이러한 센서 장치는 감지 부위로서 하나의 ssDNA를 이용한 AFM을 수반한다.

121bp DNA 가교 주형을 합성하기 위한 연구 계획:

단계 1. 링커(소문자)를 보유한 분자 단편(A+, A-, B+ 및 B-)의 합성

단계 2. 분자 단편(A+ 대 A-, 및 B+ 대 B-)의 하이브리드화

(A+/A-) - 95℃로 가열하고 실온까지 서서히 냉각한다.

(B+/B-) - 95℃로 가열하고, 실온까지 서서히 냉각한다.

단계 3. 단편 A+/A- 대 B+/B-를 결찰한다.

(A+/A-) - 실온의 1x 결찰 완충액 + T4 DNA 리가제에서.

수득되는 121 bp 분자를 그 다음 pGem-T의 AatII/SphI 클로닝 부위에 결찰시킬 수 있다.

용액:

용액 I: 50mM 글루코스; 25mM Tris pH 8, 10mM EDTA pH 7.5

용액 II: 0.2N NaOH, 1% SDS

용액 III: 2.7M 아세트산칼륨(빙초산으로 pH 4.8로 조정)

SOC 배지 = (100ml 당: Bacto®-트립톤(BD) 2g, 효모 추출물(BD) 0.5g, 1M NaCl 1ml, 1M KCl 0.25ml, 2M Mg²⁺ 스톡 1ml, 2M 글루코스 1ml)

Mg ²⁺ 스톡 = 1M MgCl₂, 1M MgSO₄

LB/앰피실린/IPTG/X-Gal 평판 = 1L 당 아가(BD) 15g, Bacto®-트립톤(BD) 10g, 효모 추출물(BD) 5g 및 NaCl 5g을 첨가한다; NaOH로 pH를 조정한다; 오토클레이브하고 50℃로 냉각한다; 1ml 당 100㎍의 앰피실린, 0.5mmol의 IPTG 및 X-Gal 80㎍/ml을 첨가한다; 85mm 평판에 30 내지 35ml의 배지를 주입하고, 아가를 22℃에서 고화시키고 4℃에 보관한다.

약어:

ml: 밀리리터, ㎕: 마이크로리터, g: 그램, mg: 밀리그램, ng: 나노그램, M: 몰(mol/L), mM: 밀리몰

(BD= 벡톤, 디킨슨 앤드 컴패니, 뉴저지 프랭클린 레익스 소재)

(EM= EMD 케미컬 인크., 뉴저지 깁스타운 소재)

(VWR= VWR 인터내쇼널, 펜실베니아 웨스트 체스터 소재)

(칼바이오켐/노바바이오켐 코포레이션, 캘리포니아 산디에고 소재)

(프로메가= 프로메가 코포레이션, 위스콘신 매디슨 소재)

(피어스= 피어스 바이오테크놀로지 인크., 일리노이 록포드 소재)

모든 화학 및 생물학적 검출/식별 시스템은 (A) 시료 수집, (B) 시료 처리 및 전달, (C) 시료 분석 기술, 및 (D) 시그널 프로세싱 및 출력을 포함해야 한다(도 1). 일 예에서, 마이크로칩 또는 연속 마이크로칩은 다수의 병원균(멀티플렉스)의 검출, 식별 및 농도 계측이 실시가능하도록 배열된 미세전자기계 시스템(MEMS)으로 불리는 수천 개의 DNA 민감성 캔틸레버로 구성되어 있다.

마이크로칩 상의 각 웰은 단독 또는 수백 개의 캔틸레버계 회로를 함유할 수 있다. 각 회로는 바람직하게는 생물학적 분자가 가교결합되어, 이 분자가 다른 분자와 상호작용할 때, 이 관련 움직임이 캔틸레버를 움직이게 하는, 몇가지 형태의 이동성 부재로 구성된다. 다양한 기하형태가 가능하며, 그 예로서 AFM 도면에 도시된 바와 같이 제물대 상에 현수되어 있는 단독 캔틸레버, 단독 회전성 디스크 또는 다른 형태, 또는 도 10에 도시된 바와 같이 서로 상대적으로 움직이는 2개의 캔틸레버 아암이 있다. 이러한 가교결합된 캔틸레버의 매트릭스 또는 캔틸레버의 웰은 한 축 위의 다수의 동일한 회로가 생물 인자의 존재에 반응한 회로의 수에 따라 단일 생물 인자의 농도를 측정하도록 구축될 수 있다. 이러한 캔틸레버의 각 열 또는 캔틸레버의 웰은 다른 생물 인자에 전용인 것일 수 있다. 또한, 각 칩은 화학적, 기계적 또는 다른 환경적 '잡음'의 배경 수준에 반응하는 참조 캔틸레버의 유의적 수를 함유할 수도 있다. 생물검출/식별 장치는 특정 배열의 생물 인자에 대해서 전용인 칩을 포함할 수 있다. 예를 들어, 장치는 자국 안전과 관련된 인자와 유일하게 반응할 분자가 가교결합된 캔틸레버를 보유한 칩을 함유할 수 있다. 또 다른 장치는 식품 안전에 유일하게 반응하는, 또는 의업 또는 농업에 중요한 인자와 유일하게 반응하는 가교결합된 캔틸레버를 함유할 수 있다.

생물 분자는 이의 환경 변화에 반응하므로, 이동성 부재는 편향하고, 이러한 편향이 측정된다. MEMS 장치의 이동성 측정은 문헌에 공지되어 있다. 변형을 측정하는 1가지 방법은 변형성 부재 위의 표면에 레이저 빔을 반사시키는 것이다. 분자가 반응할 때, 상기 부재는 이동하고, 이어서 레이저 빔은 다른 수용체 위치로 편향된다. 반사된 빔의 변화는 다른 수용체 위치들에 의해 측정되고, 이 분자에 의해 나타나는 물리적 반응의 양과 상호 관련되어진다.

본 장치의 민감도는 이동에 대해서는 약 10Å이고 힘에 대해서는 5 피코뉴턴이다. 그러나, 이 장치의 크기가 축소되면 보다 향상될 것으로 예상된다. 보고된 가장 작은 트랜지스터-탐침 구조의 크기는 3x2 마이크론 x 140nm이다. 스탠포드의 토마스 케니는 아토뉴턴(10^-18 뉴턴) 수준의 힘을 측정하는 원자간 힘 현미경에 세장형 캔틸레버를 사용한 예를 보고하고 있다.

이동성 MEMS 부재의 변형을 측정하는 또 다른 몇 가지 대안법도 또한 있다. 한 방법은 변형성 부재 자체에 압전성 물질의 층을 포함하는 것이다. 또 다른 방법은 이동성 MEMS 부재의 말단에 다량의 자기 물질을 첨가하고, 이동성 부재가 생물 인자의 반응에 의해 이동될 때 자기장의 변화를 측정하는 것을 수반한다. 또 다른 방법은 생물 인자에 의해 이동될 때 생물 인자가 가교결합된 갭을 따라 흐르는 정전용량의 변화를 측정하는 것을 수반하기도 한다.

MEMS 장치의 이동성 부재는 또한 주형 분자를 비롯한 회로를 포함할 수 있다. 즉, 이동성 부재를 따라 전압이 적용될 수 있고, 결과적으로 생성되는 전류가 ssDNA를 통해 통과하게 된다. 하이브리드화에 따른 회로를 통한 전도율의 증가는 전류 흐름의 증가를 감지하여, 그 시그널을 증폭시킨 뒤, 그 결과를 프로세싱을 위해 디지털 출력 신호로 전환시킴으로써 측정할 수 있다.

정상적인 작동 동안, 센서 부위가 준비 상태에 있을 때(검출 반응이 아직 일어나지 않은 상태), 이동성 부재를 따라 적용되는 전압은 "감지" 수준으로 설정되어 있을 것이다. 이러한 수준은 측정가능한 전류를 제공하기에 충분히 높지만, 변성 한계 부근이 되기에는 매우 낮다. 이러한 전류는 표적 ssDNA를 감지 부위로 유도하는 추가적인 장점이 있는 것으로 추정되며, 가장 유력한 방법은 전기영동을 통한 방법이다.

ssDNA를 통한 전류 통과는 또 다른 장점을 갖고 있다. ssDNA는 스스로 소량의 전류를 통과시킬 수 있으므로(하이브리드화 전), 장치는 자신의 고유 검사가 가능하다. ssDNA 주형은 손상 또는 파괴되거나 이동성 MEMS 부재로부터 느슨해지면 회로는 더 이상 완전하지 않게 된다. 즉, 감지 반응을 위해 각 센서 부위가 준비 상태가 되도록 하는 능력은 확인될 수 있다. 특정 부위가 작동할 수 없는 것으로 관찰되면, 이 부위에서 제공되는 시그널은 이후의 병원균 존재에 대한 계산 및 농도 계산에서 포함되지 않도록 소프트웨어에서 제외될 수 있다.

회로가 주형 ssDNA에 의해 완성되면, 주형 ssDNA는 전술한 제3 현상, 즉 전기 전류를 이용한 변성의 실시를 측정하는 능력을 갖게 된다. 적용된 전압은 dsDNA를 변성시키기에 충분한 전류를 제공하는 수준까지 증가될 수 있다. 이로 인해, 센서는 스스로 복귀하는 능력을 갖추게 되고, 이러한 점에서 감지 반응이 일어난 다음, 장치의 주형 부분에 부착된 병원균은 이탈될 수 있다. 이탈된 ssDNA 표적은 센서를 통해 흐르는 물질로 세정되고, 전압이 감지 수준으로 저하되면 센서 부위는 다른 감지 반응에 준비가 되게 된다.

이러한 부재의 크기는 매우 작아서, 아마도 수천 개의 센서 부위가 1 페니 크기의 MEMS 칩 위에 위치할 수 있을 정도이다. 따라서, 소정의 칩에는 특정 병원균에 대한 다수의 독성 유전자 영역이 포함될 수 있고, 뿐만 아니라 다수의 병원균도 소정 칩 위에 포함될 수 있다.

다양한 예에서, 본 발명의 센서는 검출기에 연결된다. 일 예에 따르면, 검출기는 전기 회로를 포함하여 검출기 회로라고 불리기도 한다. 일 예에 따르면, 검출기는 물리적 이동 또는 공진 상태를 구별하기 위해 비전기 수단을 이용하기도 한다. 변형제가 없는 경우, 검출기란 용어는 전기적 검출기와 비전기적 검출기를 모두 의미한다.

이상의 설명은 제한이 아닌 예시하는 것으로 간주되어야 함은 명백한 것이다. 예를 들어, 전술한 양태 또는 이의 관점들은 서로 함께 사용될 수도 있다. 이상의 설명을 검토해 보면 당업자는 이의 다른 다양한 양태를 시도할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 첨부되는 청구의 범위와 함께, 이러한 청구항의 자격이 되는 모든 등가물의 범위를 참고로 하여 결정되어야 한다. 첨부되는 청구의 범위에서, "포함하는" 및 "여기서"의 표현은 각각 "함유하는" 및 "이 때"와 같은 용어의 분명한 동의어로서 사용되는 것이다. 또한, 이하 청구의 범위에서, "포함하는" 및 "함유하는"은 개방적 표현으로서, 청구항에서 이러한 용어들 다음에 열거된 것 외의 부재를 포함하는 시스템, 장치, 물품 또는 방법이 본 청구항의 범위에 속하는 것으로 간주되어야 한다. 또한, 이하 청구의 범위에서, "제1", "제2" 및 "제3" 등의 표현은 단순히 표시로서 사용된 것으로, 그 대상들에 수치적 필요성을 부과하기 위한 것으로 간주되어서는 안 된다.

Claims (50)

1. 제1 표면에 배치된 제1 접촉 지점과 제2 표면에 배치된 제2 접촉 지점을 포함한 적어도 2개의 접촉 지점 사이에 결합된 주형 분자로서, 상기 제1 표면은 제2 표면과 무관하고, 상기 주형 분자는 표적 분자에 대한 적어도 하나의 결합 부위를 포함하는 주형 분자; 및

   상기 주형 분자를 통한 전기 전도를 나타내는 제1 물리적 변수가 있는 상기 제1 접촉 지점에 연결되어, 상기 제1 물리적 변수의 변화를 기반으로 하는 출력 시그널을 생성하도록 형성되어 있는 검출기

   를 포함하며,

   상기 제1 물리적 변수의 변화는 상기 표적 분자와 상기 주형 분자의 결합에 상응하며,

   상기 주형 분자는 핵산 분자 또는 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 주형 분자는 ssDNA 또는 ssRNA인 것을 특징으로 장치.
4. 제1항에 있어서, 상기 표적 분자는 상기 주형 분자에 하이브리드할 정도로 상기 주형 분자의 서열과 충분히 상보적인 서열을 함유하는 핵산인 것을 특징으로 하는 장치.
5. 제1항에 있어서, 상기 주형 분자는 3' 말단이 상기 제1 접촉 지점에 결합되고 5' 말단이 상기 제2 접촉 지점에 결합되는 핵산인 것을 특징으로 하는 장치.
6. 삭제
7. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 그 카르복시 말단이 상기 제1 접촉 지점에 결합되고 그 아미노 말단이 상기 제2 접촉 지점에 결합된 것을 특징으로 장치.
8. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 항체인 표적 분자에 대한 결합 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 장치.
9. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 항체 유래의 결합 부위를 함유하여, 그 항체에 대한 항원성 부위를 함유하는 표적 분자에 결합하는 것을 특징으로 하는 장치.
10. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 표적 분자에 대한 수용체 부위를 함유하는 것을 특징으로 하는 장치.
11. 제10항에 있어서, 상기 표적 분자는 수용체 부위를 함유하는 폴리펩타이드의 길항제 또는 작용제인 것을 특징으로 하는 장치.
12. 제1항에 있어서, 상기 표적 분자는 상기 주형 분자의 적어도 일부에 대한 수용체 부위를 함유하는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 장치.
13. 제1항에 있어서, 상기 표적 분자는 금속 이온이거나 금속 이온을 함유하는 것을 특징으로 하는 장치.
14. 제1항에 있어서, 상기 주형 분자는 폴리사카라이드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
15. 제1항에 있어서, 상기 주형 분자는 핵산 서열의 합성 유사체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
16. 제1항에 있어서, 상기 주형 분자는 폴리펩타이드의 합성 유사체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
17. 제1항에 있어서, 상기 주형 분자는 폴리사카라이드의 합성 유사체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
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35. 제1항에 있어서, 상기 주형 분자는 티올, 금, 비오틴 및 스트렙트아비딘 중 적어도 하나를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
36. 제1 표면에 배치된 제1 접촉 지점과 제2 표면에 배치된 제2 접촉 지점을 포함한 적어도 2개의 접촉 지점 사이에 결합되고 표적 분자에 대한 적어도 하나의 결합 부위를 포함하며, 핵산 분자 또는 폴리펩타이드를 포함하는 주형 분자에 표적 분자를 노출시키는 단계; 및

    기준 지점에 상대적으로, 상기 제1 접촉 지점을 사용하여 측정된 상기 주형 분자를 통한 전기 전도를 나타내는 제1 물리적 변수의 변화의 함수로서 출력 시그널을 발생시키는 단계를 포함하고, 상기 제1 물리적 변수의 변화는 상기 표적 분자와 상기 주형 분자의 결합에 대응하는 것을 특징으로 하는 방법.
37. 제36항에 있어서,

    상기 기준 지점에 상대적인 상기 제1 접촉 지점의 공진 진동수를 모니터하는 단계;

    상기 기준 지점에 상대적인 상기 제1 접촉 지점의 공진 진폭을 모니터하는 단계;

    상기 제1 접촉 지점과 상기 기준 지점 사이의 거리를 모니터하는 단계; 및

    상기 제1 접촉 지점과 상기 기준 지점 사이의 정렬을 모니터하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
38. 제37항에 있어서, 상기 기준 지점은 상기 제2 접촉 지점을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
39. 제36항에 있어서, 상기 제1 표면을 공진하도록 유도하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
40. 제36항에 있어서, 노출 전에 상기 주형 분자를 이용하여 전류를 전도하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
41. 제36항에 있어서,

    상기 주형 분자를 이용하여 증가적 전류를 전도하는 단계;

    상기 표적 분자와 상기 주형 분자의 절단에 상응하는 전압 피크를 모니터하는 단계; 및

    상기 전압 피크에서의 전류의 함수로서 출력 시그널을 발생시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
42. 제36항에 있어서,

    상기 주형 분자에 증가적 전압을 적용하는 단계;

    상기 표적 분자와 상기 주형 분자의 절단에 상응하는 전류 피크를 모니터하는 단계; 및

    상기 전류 피크에서의 전압의 함수로서 출력 시그널을 발생시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
43. 제36항에 있어서, 상기 표적 분자를 절단하도록 상기 주형 분자에 전기 시그널을 적용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
44. 시료를 공급받기 위한 표적 분자 도입 포트;

    상기 표적 분자 도입 포트와 연결되어 있고 제1 표면 위의 제1 지점과 상기 제1 표면과 무관한 제2 표면 위의 제2 지점 사이에 배치되며, 상기 표적 분자와 결합되는 적어도 하나의 특정 결합 부위를 가지며, 핵산 분자 또는 폴리펩타이드를 포함하는 주형 분자를 보유하는 센서;

    상기 제1 지점에 연결되고 상기 제1 지점의 측정된 변수의 변화를 기반으로 상기 표적 분자와 상기 주형 분자의 결합에 상응하는 출력 시그널을 생성하도록 구성된 검출기; 및

    상기 출력 시그널을 기반으로 결과를 제공하는 출력 회로를 포함하며,

    상기 측정된 변수는 상기 주형 분자를 통한 전기 전도인 것을 특징으로 하는 장치.
45. 제44항에 있어서, 추가로 복수의 센서를 포함하고, 상기 센서 각각이 다중장치를 통해 상기 검출기에 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 장치.
46. 제44항에 있어서, 상기 검출기에 연결되어 있고 메모리에 접근할 수 있는 프로세서를 포함하고, 상기 메모리는 측정된 변수의 변화를 기반으로 하여 표적 분자를 식별하기 위한 데이터 저장소를 제공하는 것을 특징으로 하는 장치.
47. 제44항에 있어서, 출력 회로는 인터페이스, 디스플레이 및 무선 송수신기 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
48. 제44항에 있어서, 상기 주형 분자의 전도율을 측정하기 위해 상기 주형 분자에 연결된 시험 회로를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
49. 제44항에 있어서, 상기 주형 분자로부터 상기 표적 분자를 절단하기 위해 상기 주형 분자에 연결된 복귀 회로를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
50. 제44항에 있어서, 상기 표적 분자 도입 포트, 상기 센서, 상기 검출기 및 상기 출력 회로 중 적어도 하나를 내장하기 위한 하우징을 추가로 포함하는 것을 특징으로 장치.

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