CN1846130B - 用于检测靶物质的桥接元件 - Google Patents
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Abstract
通过监测模板分子的变化来检测由于模板分子和靶分子间结合引起的物理变化。变化实例包括模板分子的物理尺寸或者刚度方面的变化、模板分子电导率的变化以及解离靶分子和模板分子所需能量的变化。变化幅度表示靶分子的特定身份。
Description
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.Section119(e)，本申请要求享有在2003年8月6日由Fred G.Albert等人提交的名为“METHOD AND BIO-ELECTRONIC DEVICE FOR RAPIDDETECTION OF ANALYTES SUCH AS BIOLOGICAL AGENTS”的美国临时专利申请60/493,142的优先权权益，该申请通过引用并入本文。
技术领域
本文件一般地属于传感器设备，更具体地属于但并不限于靶物质的检测和分析。
技术背景
以前用于检测分析物比如生物因子、病原体、细菌、病毒、真菌、分子和毒素的方法，都相当麻烦、耗时，还要求显著的专业技术经验来操作。例如，一种技术方法通常要求样品在皮氏培养皿中持续培养几天。另一种技术涉及选择已染色抗体用于识别特定病原细菌存在的的用途。
此外，有些系统要求靶生物分子经过扩增过程，这很容易出错并要求高水平的技术能力。而且，扩增有时并不能确定靶生物因子的浓度，也不适于现场应用。
有些系统不能检测生物因子的天然或者工程化变化，已知它们会产生假阳性错误，而且对测试条件也很敏感。有些用于检测生物分子(比如DNA序列或者蛋白质)的设备需要大量靶分子的有效作用，因此，必须扩增靶分子，并在有些情况下靶分子被标记，这阻止模板分子的进一步利用。
附图说明
在附图中，所示附图不必按比例画出，所有这几个视图中相似数字表示基本类似的组件；具有不同字母后缀的相似数字表示基本相似元件的不同情况。以实例的方式而非限制性方式，附图一般性举例说明本文件中讨论的各种实施方案。
图1表示检测靶分子方法的流程图。
图2表示悬臂检测器。
图3表示悬臂结构的一部分。
图4表示位移随时间变化的函数图。
图5A和5B表示悬臂检测器系统的示意图。
图6表示电流随电压变化的函数图。
图7A和7B表示测量的参数随时间变化的函数图。
图8表示谐振中的偏移。
图9表示准备模板分子方法的流程图。
图10和11表示检测靶分子方法的流程图。
图12表示系统中悬臂阵列的示意图。
图13表示便携检测器的实例。
详细说明
下面的详细说明包括参考结合附图的内容，附图部分构成详细说明的一部分。附图以举例说明的方式表示可实施发明的具体实施方案。通过对这些典型实施方案(本文中也称为实施例)足够详细的说明，可使本领域的普通技术人员能够实施本发明。实施方案之间可以相互结合，也可以利用其他的实施方案，或者可以进行结构、逻辑和与电有关的变化而不超出本发明的范围。因此，下面的详细说明并不对本发明起限制作用，本发明的范围由附属权利要求及其等价物来确定。
象通常专利文件中一样，本文件中术语“一”包括一个或者多于一个。本申请文件中，术语“或者”表示非唯一的，除非有其他明确说明。此外，本文件参考的所有出版物、专利和专利文件，在此都合并作为一个整体全部引用，就像单独参考引用一样。如果出现本文件和那些合并引用文件不一致的地方，合并引用文件中的用法应考虑是对本文件的补充说明；对于不能协调一致的内容，以本文件中用法为准。
附图是申请文件的一部分，以举例说明的方式、而非限制性方式表示可实施本发明主题的具体实施方案。对示例性的实施方案进行足够详细说明，以使本领域的普通技术人员能够实施公开的内容。也可以利用其他实施例并从中衍生，使得可以做出结构和逻辑方面的替代和变化而不偏离本公开的范围。因此所述详细说明不具有限制意义，各种实施方案的范围仅受所附权利要求、以及全部范围的由这些权利要求享有权利的等价物的限制。
此处涉及的本发明主题的实施方案在本文中可以全部或者单独地用术语“发明”来表示，这仅仅是为了方便，如果实际上超过一种被公开，这并不意味着将本申请的范围限于任意单一发明或发明构思。因此，尽管具体实施方案已经在此处用于举例说明并被描述，应该理解任何能够达到相同目的的方案都可替代所列出的具体实施方案。本文件意思覆盖各种实施方案的任意和所有改变、变化或组合。
通过上述说明，对本领域的普通技术人员来说，上述实施方案和其他没有具体说明的实施方案的组合将是显而易见的。
概述
分子受周围环境变化的影响。比如，单链脱氧核糖核酸(ssDNA)会对引入它的互补ssDNA产生反应；一条DNA链与其互补链的杂交导致总长度的减小，以及DNA导电特性的变化。这些变化与两条DNA链之间的匹配忠实度成正比，即使单个核苷酸的错配都有可检测的效应。对这些变化的分析使鉴定各种病原体成为可能并允许区分特定株系。
在一个实施例中，用微机电(MEMS)结构测量与杂交相关的分子变化。例如，MEMS芯片中的移动元件由选择的单链DNA片段桥接。根据该元件偏移的测量和由杂交引起的电导率的测量来检测和鉴定互补片段。在一个实施例中，信号处理用于解释检测和鉴定时的杂交事件。长度和电导率变化与DNA链同源性之间的相关性用于区分已知和变体病原体以及区分良性和毒性株。
此外，杂交后施加的电压导致病原体DNA链或者靶分子从模板分子上释放。释放靶分子的电流也可以提供鉴定靶分子的信息。另外，通过释放靶分子，传感器可为另外的检测事件作准备。而且，在检测事件之前，通过给模板分子施加低水平电流来测试传感器的完整性。在一个实施例中，DNA桥接的MEMS传感器阵列允许同时多路检测很多病毒或者细菌病原体，或者使之能够测量单种病原体的浓度。
此外，模板分子谐振的变化被用于鉴定与模板分子结合的样品。在一个实施例中，悬臂的可移动端通过模板分子和一个结构桥接，悬臂系统(和模板分子桥)的谐振频率将随样品和模板分子的杂交而变化。可根据振幅或者频率偏移的幅度和方向来确定同源性程度。
方法实例
图1表示用于检测和鉴定靶物质的示例性方法100。在一个实施例中，靶物质包含单链DNA片段。
此处所用的靶分子和模板分子是新创的术语，所述分子以它们结合在一起的方式而相互关联。因此，特定的传感器利用第一种ssDNA链作为模板分子而第二种ssDNA链是靶分子，另外一个传感器则可利用第一种ssDNA链作为靶分子而第二种ssDNA链作为模板分子。
也包括其它的结合伴侣组合。例如，模板分子或者靶分子可以包含核酸分子(比如寡核苷酸，包括ss-DNA或者称为ss-RNA的RNA)、蛋白质和碳水化合物。包含单链DNA的模板分子可与互补DNA链杂交，形成双链DNA(ds-DNA)。另外，包含蛋白质的模板分子可与靶分子结合，所述靶分子也包含蛋白质(通过蛋白质-蛋白质识别)、核酸(通过蛋白质-核酸识别)或者碳水化合物(通过蛋白质-碳水化合物识别)。另外，包含核酸的模板分子可与靶分子结合，所述靶分子包含使用DNA的核酸(通过核酸-核酸识别)或者碳水化合物(通过核酸-碳水化合物识别)。而且，包含碳水化合物的模板分子可与包含碳水化合物的靶分子结合(通过糖类-糖类识别)。通常，模板分子-靶分子间的组合可描述为象锁和钥匙的关系，允许某些分子仅与其他分子结合。
在105，收集待分析的样品。潜在包含靶分子的样品可以是气态、液态或者固态。在110，准备样品用于分析，在一个实施例中，包括样品的过滤。在115，样品递送给传感器进行分析。在一个实施例中，样品递送包括使用微流泵、阀、通道、储器或者其他构造发送样品。在120，样品被导入一个或者多个传感器进行可能的检测和鉴定。在各种实施例中，检测和鉴定包括：监测长度或者位置的变化、力的变化、电导率或者电阻率的变化，确定将样品从模板分子解离的信号水平和确定谐振偏移。在125，处理收集的数据来检测和鉴定样品。在各种实施例中，数据处理包括将输出信号与存储的数据进行比较，其中存储的数据包括靶分子与模板分子相关性的查表。
也包括其他方法。比如，可以在将传感器暴露于样品之前通过监测各种参数进行传感器完整性检测。
悬臂传感器实例
图2是根据一个实施例的传感器200。衬底215提供一个结构或者参考平台，悬臂构造于其上。基座210附着在悬臂205A的一端，并将悬臂205A抬升到衬底215之上。在一个实施例中，悬臂205A的尺寸大约是200μm长、20μm宽和1μm厚。模板分子220的一部分附着在悬臂205A的自由端。
该附图表示，模板分子220作为线性元件，其中一端与悬臂205A的自由端结合，另一端与衬底215的一部分结合。悬臂205A和衬底215之间的空间通过模板分子220桥接。
如图所示，模板分子220是在没有互补结合伴侣结合的状态下，悬臂205A是在松弛或者无负载的状态下，悬臂205A还可位于图中虚线所示处。比如，图中所示的悬臂205B是当结合伴侣与模板220结合时的状态。悬臂205B产生悬臂205A所示位置下距离D1的一段位移，模板分子220与低亲和性的结合伴侣结合。所示的悬臂205C是当不同的结合伴侣与模板220结合时的状态，悬臂205C产生悬臂205A所示位置下距离D2的一段位移。悬臂205C表示模板分子220与比悬臂205B表示的结合伴侣具有更强亲和性的结合伴侣结合时的状态。
在光学检测系统的一个实施例中，检测悬臂205A的位移。如图所示，光源230将光束250投射到悬臂205A的表面并被反射，如光线245A所示，并被光学传感器235的池240A检测。悬臂205B反射光，如光线245B所示，该光线被池240B检测；悬臂205C反射光，如光线245C所示，该光线被池240C检测。图示的传感器235有三个池，但是也包括更多或更少的池。在一个实施例中，光源230包括激光或者其他准直光源。
也包括检测悬臂205A的位移和谐振的其它手段。在一个实施例中，压电元件提供作为悬臂205A偏移函数的电信号。该压电元件包括与悬臂205A、基座210或者其他结构的表面结合或集成一体的压电材料。
在一个实施例中，通过测量电容来确定位移或者谐振。例如，悬臂结构的导电层作为电容极板，悬臂导电层和另一个导体之间的电容随导体间的距离变化。因此，对电容的测量可以提供位移和谐振数据。在各种实施例中，悬臂的导电层与悬臂的其他导电层是电隔离的。
在一个实施例中，通过磁场或者电场来确定悬臂结构的位移或者谐振。磁体和导体间的相对运动提供用于确定位移或者谐振的信号。此外，附着于悬臂的应变仪提供位移和谐振信息。
悬臂结构实例
图3表示利用定向模板电路(Directed Template Circuitry：DiTC)构造制造的传感器结构的实例。定向模板电路利用微机电系统、自组装单层(SAM)和DNA杂交。利用光刻技术，各种材料包括金属如银(Ag)、铬(Cr)、金(Au)和碳的薄膜都以微米级大小制成图样。自组装单层允许将模板分子选择性固定在MEMS表面。此外，蛋白质和其他生物分子可以用SAM固定在诸如金的表面上。而且，可利用电流测量方法和电极上SAM来检测靶分析物。
在定向模板电路的一个实施例中，SAM技术用于将单层蛋白质链亲和素施加在铬上的金层上。基于金表面上蛋白质和生物素disulde单层之间的结合，将链亲和素固定在金电极表面上。
然后同样基于生物素的化学被用于专门设计和合成的约20-100个碱基寡核苷酸引物之间的结合，该引物用以与单链DNA模板桥杂交，如图8所示。该定向模板电路引物指导ssDNA模板桥即左手引物的定向和定位。
在一个实施例中，利用寡核苷酸引物以一定的方式结合单链DNA(ssDNA)模板，其结合方式使得其桥接电子MEMS基的电路。与来源于待鉴定微生物的靶分子的杂交导致悬臂梁间距离的减小。
利用定向模板电路制造MEMS微芯片装置简单地需要凝胶光聚合技术来产生由疏水玻璃表面隔离开的聚丙烯酰胺凝胶垫微基质(micromatrices)。在一个实施例中，DNA寡核苷酸施加到凝胶垫上并利用荧光显微镜和核酸外切酶消化来测试是否正确定位和定向。
可用其他方法来将模板分子附着在接触点上，其附着方式使得模板分子适于检测和识别靶分子。例如，也包括利用金-链亲和素和硫基/生物素建立的结合。
在一个实施例中，该引物被设计和合成以杂交包含单链DNA分子的模板分子。而且引物的排列和定向使得模板分子将具有期望的定向和位置。更具体而言，引物确保模板分子的选定部分(位于或者朝向第一端)与悬臂的一个表面结合，并且确保模板分子的选定部分(位于或者朝向第二端)和悬臂的另外一个表面结合。在各种实施例中，模板分子的末端与悬臂结构的特定部分配合(单向匹配)或者不配合(双向匹配)。
性能-位移
在一个实施例中，DNA链的强度和长度取决于碱基组成、序列和环境。当单链DNA与其互补链相互作用时发生可测量的生物物理学现象。具体地，与其互补链杂交时DNA长度平均自由减少大约为40％。DNA核苷序列及组成可与结构和其他生物物理参数建立相关性。
图4表示力幅度和悬臂205A表面位移之间关系。对于一个特定的悬臂来说，测量性能可用于鉴定互补结合伴侣。如果悬臂暴露于不是完全互补的样品分子，那么结果将会不同。
图4图解表示生物分子强度的一个实例。对于提供的数据，分子被束缚在悬臂尖端和衬底之间。通过向模板ssDNA的末端添加官能团从而将一端附着在悬臂上并且另一端附着在衬底上来实现这种束缚。组合实例包括金-硫醇结合和生物素-链亲和素结合。
图中显示确定分子抗张强度的数据分析。在一个实施例中，构造传感器结构使得模板分子处于轻微张力，但是也包括中性或接近零的张力。模板分子处于这种方式下，导入结合伴侣。对于ssDNA模板分子来说，合适的结合伴侣是互补ssDNA链。模板分子与靶分子的随后结合(或杂交)提供了物理参数或者特性的可测量变化。悬臂可检测(和测量)由于杂交引起的位移和分子长度的变化。
图中显示悬臂位移与模板ssDNA和靶ssDNA的杂交相关。参照附注，将模板ssDNA暴露于遗传匹配(或互补)的靶ssDNA后，悬臂大约有10.2nm的变形。用超过100种不同生物分子对这种实验方法进行了重复。
如图所示，标准靶表示与模板分子(链)有100％同源性的互补ssDNA链。所示的其他靶是来自100％同源性互补ssDNA链的2％、19％和38％的变体。此处用的术语“变体”表示相对于100％同源性互补ssDNA链包含随机碱基对替换的靶ssDNA。图中的等级表示利用本发明的系统也可检测和鉴定变体ssDNA分子。
双悬臂检测器实例
图5A和5B是基于悬臂的传感器500的示意图。图5A表示模板分子545桥接、或连接双悬臂505A自由端。悬臂505A通过导体550和位于悬臂505A固定端的连接板535与传感器电路530电连接。连接板535结合到位于层515和层520之上的层510上。在一个实施例中，层510、515和520分别由Si3N4、Si、Si3N4组成，并分别为约50nm、150nm和250nm厚。悬臂505A悬在形成于层515中的样品通道540之上。在一个实施例中，悬臂505A由厚度分别为约40nm和5nm的层555(金)和层560(铬)形成。
图5A中，悬臂505A通过模板分子ssDNA545在很小或者没有张力的情况下桥接。在一个实施例中，检测器电路530提供电流以检测电导率水平。我们知道电导率是电阻的倒数并且在一个实施例中测定电阻。在一个实施例中，测定阻抗值。在图5B中，桥565表示由模板分子(ssDNA)和靶分子(ssDNA)组合形成的杂交dsDNA。如图5B所示，悬臂505A收敛偏移，检测器电路530生成电导率的测量值，并在dsDNA链杂交时，反映电导率测量值的增加。
在多种实例中，检测器电路530中有测试电路和复位电路，测试电路设置成向模板分子545提供电流，以确立模板分子和悬臂梁之间的正确附着。例如，如果传感器和模板分子正确设置，电流源、传感器和电阻的串联组合将指示预期电流。与预期电流水平的偏差可能表示模板分子或者传感器没有为样品测试正确配置。
检测器电路的复位电路包括驱动电路，所述驱动电路用于将靶分子从模板分子解离，从而为另一次检测和鉴定事件作准备。在一个实施例中，这需要向模板分子提供斜线电压并监控峰值电流。在一个实施例中，这需要向模板分子提供斜线电流并监测峰值电压。该峰值电压或电流将与模板分子和靶分子的变性或解离事件同时发生。
图6表示诱导束缚DNA与互补链变性所需电流的实例。复位电路、或提供变性电流的其它手段可将互补链从传感器位置移除，从而为新的感测事件作准备。在一个实施例中，置于流动流中的传感器可用于连续的和单独的感测事件，从而允许对该传感器的连续操作。
如图所示，纵坐标表示变性电流，横坐标表示所加电压，如图所示，电流强度的差异提供区分互补模板分子和变化的手段。
应该注意的是，无论变化发生在遗传序列的一个区域还是沿靶序列散布在多个不同位置，促使变性所需的电流量和模板与靶ssDNA链间的错配程度之间是高度成比例的。
图7A和7B表示人工操作步骤，增加电压以促使变性，随后将电压降低至感测水平，以允许另一次杂交发生。如图7A所示，记录了多个感测事件，与那些感测事件相应的复位信号如图7B所示。变性电流提供复位传感器的手段，在ssDNA期间以及杂交(dsDNA)状态之后，变性电流都显示是一致的。
如图所示，开始数据采集大约15秒后引入互补链，随后立即是感测事件。几秒钟后，人工将电压增加到约4伏，导致双链DNA变性。人工将电压降至3伏，系统由此复位从而为另一次感测事件作准备。
谐振实例
图8包括图解数据800，该数据800表示如何能够使用谐振来利用桥接模板分子鉴定和检测靶分子。
如图所示，横坐标表示频率，纵坐标表示振幅。悬臂结构或者其他悬结构被激励信号驱动而振荡。在各种实施例中，该激励信号由位于可移动结构附近的磁性、压电或者声学元件提供。如图所示，曲线805表示一个实例，其中模板分子以初始频率F2和初始振幅A2谐振。模板分子暴露于靶分子后，该结构以频率F1和振幅A1谐振。频率差ΔF和振幅差ΔA表示同源性程度，从而允许检测和鉴定靶分子。例如，认为靶分子与模板分子匹配率越高所表现的振幅和/或频率变化越大。
图中示出振幅和频率的下降。然而，在其它实例中，振幅和频率之一或者二者都可能表现为增加或者下降。
在一个实施例中，MEMS装置移动部件的谐振允许检测和鉴定。在一个实施例中，悬臂的一端包括磁性物质，并且通过位于悬臂下面的线圈的交变电流引起悬臂以交变电流的频率振动。在一个实施例中，选择悬臂的尺寸和交变电流来使输出最大。例如，如果交变电流接近悬臂的固有频率，这个结构系统的反应将最大。当有ssDNA或者其他模板分子被束缚在悬臂一端和基座之间时，结构系统的刚度会变化。振荡系统的振幅位移和/或振荡频率将不同于具有自由悬臂端的系统。当引入靶分子(比如分析物或者与模板ssDNA互补的ssDNA)时，振荡系统的振幅位移和频率将变化。由于dsDNA链的刚度比两个独立的ssDNA的刚度之和大，变化的量与模板分子和靶分子间的同源性程度成比例。因此，除了检测分析物的存在外，当和互补配对比较时，振幅和频率的变化可用于测量ssDNA分子的同源性程度。
准备实例
图9表示根据一个实施例的方法900的流程图。如图所示，在905将悬臂构造于基座上。也包括悬臂以外的结构，例如，包括具有一个支持点和自由端的圆形或者螺旋状结构。此外，也可以是盘状或者矩形结构，具有可移动中心区域和以鼓膜方式附着于基座结构的周边。在一个实施例中，利用半导体制造技术在基座上形成悬臂。
在910，向悬臂和向基座结构或衬底施加结合物或者引物(primer)。选择引物确保模板分子以正确的对准和定向固定。在各种实施例中，引物包括金和链亲和素。
在915，模板分子桥接在衬底和悬臂之间。
在一个实施例中，由制备特定用途的传感器的制造商来实施方法900。
检测和鉴定实例
图10和11分别表示测试方法1000和测试方法1100。如图所示的方法以及其他方法可通过和传感器偶联的计算机或者其他控制电路实现。在一个实施例中，该方法通过人工控制传感器来完成。
图10中，在1005进行样品准备。在各种实施例中，样品准备需要过滤、纯化、扩增和其他程序以准备样品进行分析。
在1010，分析模板分子以建立一个或者多个参数作为基线。在一个实施例中，这需要通过验证通过模板分子的电流水平来校验模板分子正确对准和定位。此外，测量单独的模板分子电导率或者电阻率、谐振振幅和频率。在一个实施例中，测量模板分子的物理位置。
在1015，样品暴露于模板。在一个实施例中，这需要将样品(其中可能包括靶分子)注入测试仪器的通道或者储器中。通道或者储器与模板分子连通。
在1020，分析模板分子以生成对应于暴露模板分子的物理参数。在各种实施例中，暴露参数包括测量位置变化或位移、测量对准程度变化、测量电导率或电阻率的变化、测量变性电流和测量谐振的变化。也可测量其他的物理参数，包括基于模板与靶分子结合的颜色或者光学性质的参数。
在1025，出现询问以确定是否发现传感器暴露于靶分子后基线和参数之间的差别。如果发现物理参数的变化或差别，则继续执行1030，鉴定样品。差别的存在指示模板分子的检测。
如本文中其他地方说明，同源性程度指示模板分子和靶分子间的匹配程度。也包括其他结合对，并且与完全匹配的接近程度可以与物理参数的差别建立关联。
在一个实施例中，与本主题的处理器偶联的存储器包括查表形式的存储数据。存储数据提供了物理参数的差别和变化与同源性程度之间的关联性。
如果1025的询问得到否定结果，则继续执行1035，产生输出信号。在各种实施方案中，该输出信号包括所述差别和变化的量度、同源性程度或者靶分子鉴定。
在1040，模板分子被清除出剩余的靶分子或者样品物质，或复位，这是通过向模板分子施加电激励并诱导变性或者解离。
在一个实施例中，1040之后，方法返回1005以检测和鉴定另外的样品。
图11表示包括串行测试样品的方法1100。容易理解，也可以用其他测试顺序以及并行测试。例如，谐振频率变化、谐振振幅和电导的测试可以同时进行。在方法1100中，初始状态或者基线在1105建立。
在1110，确定由于模板分子与靶分子的杂交引起的传感器位移。在1115，确定谐振偏移。该偏移可以对应谐振频率或者谐振振幅的变化。在1120，确定模板分子与靶分子的电导率。在1125，通过监测峰值信号确定解离电流或者热水平。
图12表示在具有公共基座1210的衬底1205上制造的悬臂传感器阵列。其中有些悬臂被标记为1240A、1240B、1240C和1240D，悬臂的一端与基座1210相连并且通过模板分子分别被束缚到衬底1205表面上的接触点1245A、1245B、1245C和1245D。在一个实施例中，模板分子都是同样的组分，并为测试提供一个冗余水平。在一个实施例中，至少两种模板分子是不同的，并被定制为检测和鉴定不同的靶分子。
利用多路复用器1220通过导电体1235A和1235B将每个悬臂比如1240A与控制器1215偶联。控制器1215选择性地施加测试电流、电压、驱动信号或者其他信号，以使每个悬臂检测和鉴定靶分子。控制器1215的电源1225提供恒定或者斜变的激励电压或者电流。在一个实施例中，电源1225提供变性电流或者电压。在一个实施例中，电源1225为每个悬臂提供驱动信号以激励谐振。
接口1230与控制器1215偶联，并提供数据输入和数据输出。在各种实施例中，接口1230包括显示器、触摸屏、键盘、小键盘、鼠标或者其他指针控制，音频转换器、存储设备、打印机、网络连接(例如，广域网如因特网，或者局域网如内联网)、电连接器或者无线收发机。
图13是根据一个实施方案的便携设备1300实例。如图所示，显示器1305提供视频提示和对应于靶分子分析及设备状况的数据。用户易接近的控制装置和数据输入点包括电源键1310、试剂切口1315、样品输入1320和控制装置1325。也可以包括其他控制装置和输入设备。在一个实施例中，设备1300上的可渗透表面允许用户利用注射器或者其他注射设备递送样品。在一个实施例中，1300表面的端口包括接收样品的储器。
图示的设备1300是便携的、用电池工作的设备，但是，也可以包括其他实施方案，例如包括具有接收样品和提供输出能力的桌面装置。
实施例
除了长度或者力的可测量变化外，DNA结构传递电流的能力与含量、序列、长度和桥接电路化学环境有关。在一个实施例中，电导率与鸟嘌呤/胞嘧啶水平有关。
在一个实施例中，121个碱基对(bp)的杆菌(Bacillus)基因组DNA序列分离自基因组、质粒和λ病毒DNA。利用关于DNA特性(长度、序列组成)和分析条件(氧化还原、pH、盐、变性剂和杂交促进剂控制)和从杆菌分离的其他DNA(单链和双链)、分子和遗传变体以及E.coli DNA的大量变量，数据显示了一致的结果。
通过限制性核酸内切酶消化从杆菌基因组DNA分离研究片段并连接到pUC13质粒克隆载体，用该载体转化入作为亲代菌株的大肠杆菌宿主。沿着质粒插入片段的长度创建随机遗传点突变文库，并对含有与亲代相比变化2％、19％和35％的插入片段的分离物进行测序并用于进一步分析。从宿主质粒切出亲代和变体插入物并用硫醇和生物素基团化学修饰5’和3’端。利用亲和色谱(基于生物素修饰)分离单链DNA，并附着在包被链亲和素和金的导电原子力显微镜(AFM)尖端与工作台之间，AFM尖端最初是不偏斜的。在一个实施例中，由于单链DNA和其互补链杂交，它的有效长度减小40％。
在将DNA互补链(在杂交溶液中)或者遗传变体引入到束缚DNA模板的几秒钟内，即可观察到AFM尖端的位移。实验结果显示，一致的尖端位移(＜0.5％COV)是模板与互补链错配程度的函数。可以认为，碱基对错配对整体螺旋结构的形成没有贡献，因此减小了分子长度的减少。
利用AFM导电尖端来确定电导率。相同的121bp片段束缚在AFM尖端和工作台之间，并引入DNA互补链。作为固定电压下的时间函数测量电流(纳安)。
在引入互补DNA之前，施加电压导致流过束缚ssDNA的稳定或者基线电流(约0.3nA)。用DNA核酸酶处理束缚ssDNA导致损失该基线电流，热处理的核酸酶不导致电流损失。
由于如果ssDNA保持束缚于MEMS移动元件则电流将流动，所以通过传感器的可测量电流提供传感器功能验证(传感器自检)。束缚ssDNA和它的互补链之间杂交后，如图所示出现电流增加。此外，图中示出测量电流和链间匹配程度之间的关系。杂交后，只要电压施加在传感器位置上，电流即维持在相对稳定的状态。
杂交后，增加施加电压，电流将相应增加到峰值。对这种特定的121bp片段来说，束缚ssDNA和互补链变性发生在约4.1伏电势。与变性相关的电流量随束缚ssDNA和互补链之间的匹配程度变化。与电流下降同时发生，AFM尖端返回未偏转位置。可以认为，较高水平的电流向杂交链提供充分的能量，使得它们能不再保持杂交，尽管其他机理或者因素也可解释这种现象。变体中存在的碱基对错配表现为在链上引入隔离位置，由此成比例地降低导电性。
在一个实施例中，选择用于桥接电路或者悬臂结构的模板分子比如特定DNA影响DNA特异性、长度、序列、组成和电导率。在一个实施例中，从病原体的多个遗传区域选择用于束缚的ssDNA可增强检测和鉴定的特异性。在一个实施例中，较长的DNA片段提供增强的特异性(对特定生物因子靶独特的DNA序列)。在一个实施例中，较短的DNA片段允许选择高鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)含量的区域。GC总体组成和序列提供腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的隔离特性。DNA中高AT含量导致非柔性，以及依赖于富含AT区域的相对定位而造成整体分子弯曲(即处于含螺旋旋转的状态)。在各种实施方案中，选择的DNA片段具有超过40％的GC，或者超过60％的GC。DNA片段长度因此小于500个碱基对(bp)，或者小于150-200个碱基对(bp)。利用商业和公开软件比如PubMed BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/)确定DNA的GC组成、序列和特异性。可获得其他软件用于建立一级分子参数与高级特性(即柔性、曲率)之间的关联性。在一个实施例中，利用软件算法来选择模板分子。
其他实施例
在一个实施例中，传感器包括包括悬臂的悬部件。模板分子附着在接触点上，至少一个接触点位于悬部件上。在各种实施例中，悬臂是弯曲、圆形或者网状。在一个实施例中，悬部件是能绕轴转动的旋转部件。作为旋转部件，当模板分子和靶分子结合时，接触点沿着弧线移动。在一个实施例中，旋转部件的一端旋转，同时另一端静止，或者朝相反的方向旋转或在较小范围旋转，旋转部件两个端点间的相位差提供用于区分靶分子的差别信号。
在一个实施例中，模板分子具有超过一个对靶分子特异的结合位点。在一个实施例中，靶分子有多个结合位点，每个位点对不同靶分子具有特异性。在一个实施例中，靶分子有多个结合位点，每个位点对单个靶分子具有特异性。
在一个实施例中，传感器上提供多个接触点，模板分子与多个接触点中的两个或者多个结合。例如，双末端的模板分子可以和具有两个、三个或者更多个接触点的传感器结合。作为另一个实施例，有三个末端的模板分子可以和具有两个、三个、四个或者更多个接触点的传感器结合。
在一个实施例中，产生的输出信号是物理参数测量变化的函数。物理参数包括结构以及电参数。结构参数的实例包括位置变化比如物理位移、谐振频率、谐振振幅、接触点和参考点的物理对准程度或定向、施加在轴上的力、生成的热和包括颜色在内的光学变化。也包括其他物理参数。
在一个实施例中，产生的输出信号是电参数测量值变化的函数。电参数的实例包括阻抗、电导率、电阻率、电感、电容。此外，在输入信号存在下电参数也可描述为输出信号。比如，在模板分子上传导的电流的变化可导致电压的变化。此外，施加在模板分子上的电压可导致电流的变化。也可施加其他驱动信号，测量的响应可用于产生输出信号。也包括其他电参数。
在一个实施例中，物理参数包括电导率的测量。电导率是对电子在物质中流动的度量。电导率是电阻率或者电阻的倒数，在一个实施例中，监测的物理参数包括电阻。
在一个实施例中，经由寡核苷酸引物结合的ssDNA模板分子桥接基于电子MEMS的电路。与靶分子(比如DNA)杂交源自待鉴定的微生物，并引起悬臂元件间距离的缩小。
在各种实施例中，比较器或者惠斯通电桥用于检测、鉴定和比较电压水平、电流水平、电导率或者其他参数。
在一个实施例中，通过加热模板和靶分子使模板分子变性。加热水平通过测量电流、电压或者功率来定量。在一个实施例中，加热水平差异与靶分子身份相关。
在一个实施例中，单个传感器位点包括微机电系统(MEMS)芯片上与移动元件桥接的束缚、单链DNA(ssDNA)。在一个实施例中，几百几千个这样的位点分布在单个芯片上。选择束缚ssDNA与从感兴趣生物因子提取的互补链杂交，产生的杂交改变束缚分子的物理长度，还改变束缚分子的电导率。这些变化在MEMS系统中以高信噪比被测量。变化的程度与束缚和生物因子DNA链之间的匹配程度有关。因此，可以测量生物因子的变化程度(特异性)。在检测、鉴定和区分被确认后，增加通过分子中电流将生物因子DNA链排出束缚链，由此复位传感器用于随后的测试事件。由于束缚ssDNA(没有其互补链)能传导可测量的电流，因此通过自检来验证传感器的可用性。
物理参数的变化与模板分子和靶分子(或者DNA链)间的匹配忠实度成比例。单个核苷酸错配产生可测量的变化，由此能够鉴定多种病原体并区分特定菌株间的细微变化。
在一个实施例中，模板分子包括ssDNA。在一个实施例中，炭疽杆菌的特定DNA区域被扩增并功能化。传感器可通过来自任何生物因子(细菌、病毒或者真菌)的DNA桥接。
在一个实施例中，选择炭疽杆菌(Bacillus anthracis(Ames))的4个150-200碱基对(bp)片段用作DNA桥接模板。在一个实施例中，为了测试系统区分菌株的能力，设计模板中一种的替代序列。通过随机核苷酸替换产生与亲代差异2％、10％和20％的变体。模板分子的选择基于计算特异性、电导率参数和柔性。从16S rRNA指纹和毒力基因中选择物种和菌株特异性片段。
在一个实施例中，通过商业DNA合成设备合成4种选择的150-200bp模板和变体。所述150-200bp DNA模板和变体合成为～50bp ssDNA片段。用杂交和连接步骤产生全长150-200bp的模板。模板被连接到适当的质粒克隆载体中并在准备大规模质粒生产中生成DNA桥接模板文库。任选地，通过限制性核酸内切酶消化切出150-200bp候选模板或从炭疽杆菌(Ames)DNA中PCR扩增并亚克隆。
在一个实施例中，DNA桥接模板经由生物素-链亲和素和硫醇-金键合共价地附着在AFM和MEMS表面。携带模板的质粒被限制性核酸内切酶切割并用商品试剂盒进行5’-/3’-生物素/硫醇末端标记。在一个实施例中，用生物素和硫醇标记的引物经PCR扩增模板。
在一个实施例中，通过商业转包的DNA测序服务来验证DNA模板和变体的序列完整性。每个分子的特异性通过对炭疽杆菌菌株(即Ames、Sterne、A2012、1055、Vollum、Kruger)和炭疽模拟物(simulant)(即B.globigii、B.cereus、B.subtilis、B.thuringiensis)的基因组DNA的标准Southern筛选来验证，这些菌株从American TypeCulture Collection购得或通过材料转让协议或其它合作者获得。
在一个实施例中，原子力显微镜(AFM)用于测量炭疽杆菌和变体ssDNA片段的特定物理性质(即位移和电导率)。AFM尖端和工作台包被金和链亲和素，硫醇/生物素末端标记的DNA桥接模板附着到上面。在与互补链和变体ssDNA分子杂交之前、之中和之后测量AFM尖端的位移和材料电特性，并作为MEMS设备设计的输入。在一个实施例中，选择用于控制杂交(pH缓冲剂、盐)、变性、水解和核苷酸氧化的试剂。
在一个实施例中，MEMS制造技术用于构建传感器芯片。在一个实施例中，制造需要将材料薄膜沉积在衬底上、用光刻方法将带有图案的掩模敷在材料上以及利用所产生的显影掩模选择性蚀刻膜。利用基于化学反应的方法(化学气相沉积、外延生长、电沉积或加热氧化)或者基于物理反应的方法(蒸发、溅射或铸造)来实现将材料沉积在衬底(硅晶片)上。通过蚀刻技术来完成材料的去除。因此，使用施加带有图案的光刻掩模，适当使用施加绝缘和导电材料层来构建设备的电路。制造设备将芯片集成到封装中，在一个实施例中，所述封装包括芯片的陶瓷或者塑料外壳，所述芯片包括连接到印刷电路板(PCB)上的引脚接口。
在一个实施例中，当制造MEMS芯片时，DNA桥接模板被产生并检验。在一个实施例中，MEMS移动单元(悬臂端)包括硫醇/金和生物素/链亲和素的共价键。单个分子的附着通过静电吸引来实现。在一个实施例中，该设备在移动MEMS单元间隙施加5伏电压，其中期望束缚ssDNA与10MΩ的电阻串联。ssDNA分子被吸引到形成的电场中。当足够接近时，在衬底基座上形成生物素-链亲和素键，并且金-硫醇键在悬臂自由端形成。当一个分子以这种方式附着时，间隙电压将由于电路中串联电阻而减小。因此，单个ssDNA分子附着在每个位点上。其余不桥接MEMS电路的过量DNA由DNA核酸外切酶消化去除。该电路保存在DNA稳定缓冲液(即300mMNaCl，10mM柠檬酸钠和5mM EDTA)中。
在一个实施例中，利用集成电路放大器来测量纳安培级电流。利用多路复用集成电路(IC)放大器和其他电子器件及处理方法来显示感测事件的结果。从MEMS芯片提取的模拟信号被放大并转换为数字信号。
在一个实施例中，印刷电路板包括用于附着MEMS芯片和IC芯片的安排。该电路板还包括专门的主处理芯片，用于执行计算和控制PCB板上的电操作。该PCB板包括用于显示和电池以及菜单钮的电接口。在一个实施例中，由主处理器执行的程序利用来自IC的数字信号提供显示。用户接口包括显示和设置参数的控制，所述参数确定显示特性、检测阈值、电池水平、开/关和病原体分子清除控制。
在一个实施例中，塑料外壳包含印刷电路板(和附着的生物和IC芯片)、样品流路、LCD显示和控制钮。在一个实施例中，外壳内壁包含突出部和沟槽，用于容纳电子元件和防止壳内的偏移。在一个实施例中，外壳包括一个或多个用于引导和清除试剂和样品的流路。
在一个实施例中，利用AFM技术，通过传感器位点的电流大于0.2nA。在一个实施例中，集成电路提供模拟信号放大＞10mV峰峰值。
在一个实施例中，配置传感器用于检测和鉴定制备的炭疽杆菌菌株和炭疽模拟物(simulant)(即B.globigii，B.cereus，B.subtilis，B.thuringiensis)的基因组DNA、化学和/或机械(超声)破碎灭活的前述炭疽菌株和模拟物的全细胞和孢子、普通污染物和干扰物如邮寄灰尘、土壤成分、其他化学混合物和微生物混合体(mixedconsortia)存在下的DNA和全细胞/孢子。
在一个实施例中，系统包括信号放大、处理和显示部分，足以检测和鉴定靶分子。在一个实施例中，电子控制包括开/关、模式、显示控制、电池寿命、自检和复位功能。在一个实施例中，该系统包括一个或者多个流路，用于向传感器表面传送制备好的样品，所述传感器配置成鉴定破碎溶液中的单个预先确定的病原体、模拟物或DNA靶变体。
在一个实施例中，利用表面擦拭或者批空气收集器在系统外收集样品。
本系统包括用于确定包含生物或化学分析物的靶物质的存在、身份或数量的方法和装置。在一个实施例中，包括生物-电子悬臂的至少一个可偏移臂的电子线路经表面处理以辅助结合到模板聚合物分子上，对环境变化如存在与待检测靶物质结合的靶分子作出应答时，所述模板聚合物分子经历物理参数的可测量变化。例如，模板分子在物理结构或者尺寸上的变化被转变为悬臂梁的偏移。在一个实施例中，通过单链DNA桥接模板与其互补链的杂交来检测通过模板分子的电特性的变化。测量这种物理性质或者参数方面的变化以提供与感兴趣的物质存在和身份相关的信息。在一个实施例中，提供多个由相似模板分子桥接的这种电路，并可获得与靶物质浓度或量相关的信息。
在一个实施例中，提供具有定制用于生物因子检测设备中的几何结构的微电路，用于检测靶和相关生物因子或物质的存在。
用于本文的靶分子可以是任意分子，只要该分子能结合生物因子或生物因子的成分，或可以对生物因子或生物因子成分的存在或结合作出反应。因此，模板分子可包含天然存在或合成的生物分子，该生物分子将、或能够、选择性应答、或结合到、与待检测靶物质结合的靶分子。在一个实施例中，靶分子包括抗体、蛋白质、核酸、碳水化合物、糖蛋白或聚合物。在一个实施例中，选用于检测特定靶分子(或者靶分子的种或属)存在的特定模板分子这样选择，使得模板分子仅与正确的靶分子或者相关的靶分子作出反应或结合。在一个实施例中，差异电流或者物理位移源于模板和靶之间的生物分子-生物分子识别。因此，模板分子和靶分子间的关系可以是核酸(包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)和衍生分子)互补链的关系。模板分子和靶分子间关系的另外实例包括核酸-核酸识别、蛋白质-蛋白质识别、蛋白质-核酸识别、蛋白质-碳水化合物识别、核酸-碳水化合物识别和碳水化合物-碳水化合物识别。
在一个实施例中，提供含有所述电路的生物检测设备，所述电路包括跨越两个表面之间间隙的模板分子。在一个实施例中，这两个表面相互之间可相对移动。当模板分子暴露于靶分子或与靶分子结合时，该模板分子发生尺寸上的变化，改变两个表面之间的距离。因此，当检测到两个表面之间距离的变化时，依据本发明该实施方案的生物检测设备能够发出靶或者相关生物因子或物质存在的信号。
在一个实施例中，表面间距离变化的量是暴露于模板分子或与模板分子结合的分子的指标。比如，与模板分子准确匹配的靶分子(即“正确靶分子”)可导致连接两个表面的模板分子的点间距离的缩短，这个缩短的量比当模板分子与相关分子而不是与其准确匹配的分子结合时发生的缩短量大。因此，通过测量两个表面间距离的变化量，可获得与模板分子结合的分子的身份相关的信息。
在一个实施例中，提供含有能够测量跨模板分子电导率的电路的生物检测设备。具体地，模板分子与第一和第二电极相互连接，由此模板分子跨越两个电极间的间隙。当模板分子与靶分子结合时，电极间的电导率发生改变。因此，通过测量两个电极间电导率的变化，可检测到靶分子或者相关分子的存在。此外，电极间电导率的变化量是与模板分子结合的分子的指标。例如，与模板分子与相关的而不是完全等同于正确靶分子的靶分子产生的电导率变化相比，正确的靶分子会导致电极间观察到的导电率的更大变化。
根据本发明的一个实施方案，提供一种可再利用的、无需替换部件的检测装置。具体地，通过加热模板分子，靶或者相关分子能够从模板分子解离。根据本发明的一个实施方案，通过向模板分子(和结合分子)通电流来实现对模板分子的加热。此外，将靶分子与模板分子解离的过程可用于获得与靶分子身份相关的信息。具体地，施加于模板分子(和靶分子)的电流可稳定增加或逐步增加，直到观察到电导率的突然变化，这指示靶分子已经与模板分子解离。因为解离靶分子所需的电流和因此产生的热与靶分子和模板分子的匹配紧密程度相关，所以解离靶分子所需电流的量指示结合分子和靶分子间匹配的紧密程度。例如，正确靶分子需要更多能量以将其与模板分子解离，而将模板分子和与所述靶分子不同的分子解离就不需要那么多的能量。
在一个实施例中，提供包含组合多种检测机理或技术的电路的生物因子检测设备。例如，通过检测模板分子经历的尺寸变化、通过检测通过模板分子的电导率的变化、或者通过确定将靶分子与模板分子解离需要的电流量，检测设备可确定靶生物因子的存在。此外，利用这些机理或技术可提供鉴定靶分子的信息。
根据本发明的实施方案，提供一种通过检测与模板分子相关的物理尺寸的变化来检测靶物质或者分析物的方法。根据这种方法，当和靶分子结合时发生物理尺寸变化的模板分子可暴露于怀疑的生物因子或者靶物质(即怀疑包含靶分子的物质)。待检生物因子可来源于气态、液态或者固态介质。如果正确靶分子或者相关分子与模板分子结合，可检测到模板分子所产生的尺寸变化，并报告这种变化。根据另一个实施方案，该方法包括测量模板分子物理尺寸变化的量。
在一个实施例中，提供一种通过感测在分析物存在下与模板分子相关的电导率变化来检测靶物质的方法。能够选择性与正确靶分子或者相关靶分子结合的模板分子暴露于生物因子。根据该方法，监测通过模板分子的电导率。当变得与靶分子结合时，检测通过模板分子的电导率的变化结果，并报告该结果。在一个实施例中，测量电导率的变化。
在一个实施例中，提供一种通过确定将靶分子与模板分子解离需要的能量来检测待检生物因子存在的方法。电流通过模板分子-靶分子对。此外，可以增加电流强度，直到观察到通过模板分子的电导率突然变化，这指示靶分子已经与模板分子解离。而且，靶分子与模板分子解离的电流用于表征或者鉴定与模板分子结合的靶分子。
本系统涉及检测和鉴定生物分析物。根据本发明，通过感测模板生物分子的变化来检测靶分子。模板生物分子的变化可包括模板分子物理尺寸的变化、观察到的通过模板分子的电导率的变化、和/或将靶分子与模板分子解离所需的能量。可测量物理尺寸的变化幅度、电导率的变化或者将靶分子与模板分子解离所需的能量，以确定靶分子与模板分子间的同源性程度。另一方面，本发明提供一种检测方法和装置，用于多次读取而无需替换部件。
在一个实施例中，通过包括生物组分或者生物组分的代表物的模板分子将电路桥接。在一个实施例中，该电路包括通过核酸分子如DNA分子或者物理和化学表现为单链DNA分子的分子来桥接的基于MEMS的结构。在一个实施例中，当桥接DNA分子与其互补物杂交或者接近互补的DNA链杂交时，该MEMS电路感测并响应桥接DNA分子的运动和电导率。
下面描述生物-电子线路的生物组分的选择和设计。
当用于本文中时，生物检测和鉴定设备的特异性是指系统特异性和精确性鉴定靶生物因子的具体属、种和菌株的能力。在基于DNA的生物检测器/鉴定器的情况下，术语特异性有时指系统的DNA组分与从生物因子分离的DNA特异性互补和杂交的能力。为了增强检测和鉴定特异性，在此，选择多个(在一个实施例中超过3个)生物因子DNA片段。所述DNA片段选择基于桥接MEMS电路的分子的计算长度、特异性、电导率参数和柔性。越长的DNA片段趋于保持越大的特异性(对特定生物因子靶独特的DNA序列)，而较短的DNA片段允许选择高鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)含量的区域。GC整体组成和序列与腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的绝缘特性相关。另外，根据富含AT区域(即处于螺旋旋转状态)的相对位置，DNA中的高AT含量导致非柔性和整体分子弯曲。因此，选择的DNA片段可含有多于40％的GC，或者多于60％的GC。在一个实施例中，DNA片段的长度小于500个碱基对(bp)，或者小于150-200个碱基对(bp)。通过多种私人、商业和可公开获取的软件比如PubMedBLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/)来测定DNA的GC组成、序列、柔性、曲率和特异性。在一个实施例中，4个DNA模板片段与炭疽杆菌(Ames)是100％同源性的，与其他的杆菌属菌种和菌株表现出较小同源性。菌种和菌株特异性片段从16S rRNA指纹和毒力基因中选择。在这个实施例中，杆菌属以外的微生物低于准确检测和鉴定的阈值。在一个实施例中，基质包括具有与其他生物因子特异性的DNA组分的DNA桥接MEMS，在一个实施例中，能够同时连续监测这些因子的存在。
下面描述生物-电子线路的生物组分的制造。
在一个实施例中，为了附着于MEMS电路，选择、生成、大量生产和化学修饰靶生物因子的特异性DNA区域。此外，为了测试建议电路的区分能力，也生成并生产DNA区域的变体。在一个实施例中，变体是与选定DNA模板在核苷酸组成和序列方面有2％-30％差异的DNA分子。在一个实施例中，4个选择的150-200bp片段或者被合成、PCR扩增，或者从实际的靶生物因子中亚克隆。高忠实度DNA合成通常限制于～50bp ssDNA片段，为了产生期望的全长150-200bp DNA模板，需要杂交和连接步骤。如果5’-和3’-～50bp合成片段用附着配体特异性标记，则完成的DNA模板随后直接附着在MEMS引线表面上。作为替代方案，完成的150-200bp模板被连接到质粒克隆载体中并且制备DNA桥接模板文库，用于准备大量生产。在一个实施例中，选用于桥接MEMS电路引线的选定DNA区域可以经限制性核酸内切酶消化切出或者从目标生物因子中PCR扩增和亚克隆。
下面描述生物组分完整性的验证。
在一个实施例中，验证DNA电路桥接模板和变体的序列完整性。序列完整性是指与期望序列比较的实际核苷酸序列。DNA测序方法将揭露将要被标记和附着在MEMS引线表面的分子的正确核苷酸序列。本主题对单碱基对错配敏感，因此，应该解释任何序列变化。
下面描述生物组分的生化和物理性质的测试和分析。
在一个实施例中，选择、大量制造特定ssDNA分子，并用于桥接MEMS电路移动元件。特定ssDNA分子的选择基于多种生物物理性质，如长度、核苷酸组成和序列、柔性和机械运动、和电导率参数。计算的运动和电导率参数由能够测量ssDNA桥接模板和变体ssDNA片段特定物理性质(即由尖端位移和电导率测定的分子运动)的原子力显微镜(AFM)来验证。根据公开方法包被金和链亲和素的AFM尖端和工作台由硫醇/生物素末端标记的DNA桥接模板来桥接。作为MEMS设备设计的输入，在和互补链或者变体ssDNA分子杂交之前、之中和之后测量AFM尖端位移和物质电特性。
对于特定ssDNA桥接模板可以考虑操作、化学和温度环境。例如，用于控制用户定义操作环境、操作温度和DNA特异性杂交(pH缓冲剂、盐)、变性、水解和核苷酸氧化的影响的试剂会有作用。在一个实施例中，操作试剂包括：
a.盐、pH值、温度
b.水解控制：通过水环境的电导率可以诱导可能对通过介质的电导率产生影响的水解，通过添加合适的试剂控制这种影响。
c.氧化控制：通过DNA的电导率可以引起氧化性破坏，尤其是对鸟嘌呤残基。通过添加抗氧化剂(即抗坏血酸、柠檬酸)来控制这种氧化性破坏。
d.DNA热稳定因子(即0.5-3摩尔的甜菜碱(N，N，N，-三甲基甘氨酸；(Rees等人，Biochem.，(1993)32：137-144)。
e.变性试剂(即2-4摩尔乙酸四乙基酯、尿素、离液盐(即三氯乙酸盐、高氯酸盐、硫氰酸盐和氟乙酸盐)，或者甘油、甲酰胺、甲醛和二甲亚砜(DMSO)。
f.杂交促进剂，通过分子排斥现象增强DNA对DNA的杂交；促进剂实例包括醋酸盐与醇、某些胺(精胺、亚精胺、多赖氨酸)、0.1-0.5摩尔去污剂(十二烷基三甲铵溴化物和十六烷基三甲铵溴化物)和特定的小蛋白质如单链结合蛋白。
下面描述DNA特异性的验证。
在一个实施例中，验证DNA电路桥接模板和变体的序列特异性。用软件分析选择的DNA片段可证明所述片段对靶生物因子的一个菌株的一个区域的特异性，这可以通过生物因子特异性筛选来确认。这些方法的一个实例包括Southern筛选，其中生物因子靶基因组(和任何其他待检的相关种)的各种限制性消化片段被电泳分离并转移到固相基质(即尼龙或硝化纤维素)上。然后固定的基因组DNA片段可以与标记(即荧光或放射性)的DNA桥接模板DNA一起孵育。在合适条件下(即温度、pH值和盐浓度)模板DNA将与单个片段(假设基因组DNA限制性消化物不切割片段)杂交。DNA模板与基因组DNA在多个位点杂交可能需要改变生物检测设备的条件或者选择新模板DNA。
下面描述DNA桥接模板末端标记。
在一个实施例中，合成、PCR扩增或者克隆的DNA片段(选择用于桥接MEMS电路引线)通过DNA附着有机或无机表面的各种方法中任意方法附着在MEMS表面。在一个实施例中，当DNA桥接模板末端和MEMS引线表面的独特化学结构交联时，实现方向特异性固定。商品化学结构特异性交联剂通常基于亲核取代化学。这种化学通常涉及通过攻击亲核试剂直接替换离去基团。在一个实施例中，MEMS电路引线包括分别包被金和链亲和素的引线。在一个实施方案中，ssDNA桥接模板经由生物素-链亲和素和硫醇-金结合共价地附着在AFM和MEMS表面上。用商品试剂盒或用标记或功能化DNA的5’和3’末端的任意其他手段对DNA片段进行5’/3’生物素/硫醇末端标记。附着化学可包括但并不限于氨基(如N-羟基-琥珀酰亚胺酯)、聚乙二醇、碳二亚胺、硫醇基团(如马来酰亚胺或者α-卤代乙酰基)、有机-硅烷基团、或生物素-链亲和素。在一个实施例中，DNA片段用5’和3’生物素或者链亲和素修饰的核苷酸合成，或者用生物素/链亲和素标记的引物从基因组或质粒携带的DNA靶进行PCR扩增。
下面描述制造MEMS的实例。
在一个实施例中，微机电系统(MEMS)指利用在百万分之一米(微米)尺寸上构造的小移动结构的技术。这些结构利用多种工具和方法来制造，它们与集成电路(IC)制造的工具和方法类似。在一个实施例中，MEMS设备包括机械元件和电元件的组合，当制造时，这些元件都放置在引脚封装中，该封装允许通过印刷电路板(PCB)上的插口来连接。
下面描述MEMS的层结构。
通常，MEMS设备的制造涉及将薄膜材料沉积在衬底上、利用光刻法将具有图案的掩膜覆盖在材料上、和利用所产生的显影掩膜选择性蚀刻膜。利用基于化学反应的方法(化学气相沉积、外延生长、电沉积或加热氧化)或者基于物理反应的方法(蒸发、溅射或铸造)实现将材料沉积在衬底(通常是硅晶片)上。每种方法的速度、精度和处理成本不一样；涂覆材料可以是几纳米至约100微米。涂覆图案涉及将感光材料置于表面上，将成图的掩膜定位在表面上(通常在表面和掩膜上对准标记的帮助下进行)，以及将感光材料通过掩膜曝光。根据所用方法，可以去除曝光或未曝光的材料，在衬底物质上留下图案。其他程序包括准备表面、显影感光薄膜和清洁所得物。
MEMS元件制造可利用微制造技术来完成。在一个实施例中，使用半导体制造工艺，比如在玻璃、石英或者硅衬底上光学蚀刻、等离子体蚀刻或者湿化学蚀刻，将蚀刻技术应用于制造中。
材料的去除典型地通过湿蚀刻来完成，其中当浸入化学溶液中时材料被溶解；或者通过干蚀刻来完成，其中通过与基于物理反应沉积基本相反的方法去除材料。当用各种方法沉积时，方法的速度、精度和成本都有变化。在一个实施例中，以50比1的侧壁深宽比来实施在衬底上蚀刻“深”口。
MEMS设备可制造成具有一个或者多个移动元件，通过这些元件与ssDNA模板分子附着。能够构造移动单元比如悬臂梁，使得梁和位于梁自由端下的衬底包含至少一个导电层。这样，利用成图光刻掩膜，可以用适当涂覆绝缘和导电材料层来构造设备的电路。在一个实施例中，几何结构允许样品从一个DNA桥接MEMS流向下一个，并如此循环以提高接触的概率和节约试剂。一个实施方案包括在支持物上构造的电子电路，所述支持物由诸如玻璃、石英、硅和多种聚合物衬底如塑料的材料组成，但并不限于这些材料。
在一个实施例中，在衬底上提供多种绝缘层。在一个实施例中，用于支持和响应所述分子特性(即电导率和运动)的固体材料被用于构造该设备。虽然本公开文本中的附图可描述该电路的平面定位，但其他实施方案包括其他定向(即垂直方向等)。
一个实施例包括覆盖通道和储器的附加平面元件，以包围和密封从而形成管道。在某些带电或亲水衬底存在下，通过粘合剂、热连接或者自然粘合连接这种附加平面。
在一个实施例中，样品收集和准备在设备外完成。用拭子或垫子收集表面上的样品，或者利用抽吸通过过滤器、液体阱或者色谱树脂在空气中或者液体中收集样品。通过加入试剂以破坏生物试因子、释放靶分子并制备用于经设备感测的那些分子，从而准备那些样品。然后利用注射器、移液器、滴眼器或者其他类似手动或者自动手段，将准备好的样品通过流通道、储器或导管引入设备。
一个实施例包括通过板上风扇抽吸系统的自动化操作由设备自己获取和准备空气样品。一个实施例包括自动收集和准备液体样品进入设备。样品破坏可由机械手段如超声技术来提供。
在一个实施例中，样品通过与设备一体的流路传输到生物芯片的表面。该设备包括试剂储器，用于样品准备以及系统冲洗、设备校准和废弃物收集。在一个实施例中，该设备包括将物质泵送到储器中或从储器中泵出的手段。在一个实施例中，如果没有阳性感测事件发生并且反应物保持合适纯度，设备循环使用通过该系统的试剂。
在一个实施例中，在引线上形成寡核苷酸序列层，以协助DNA桥接模板定位和定向。通常，寡核苷酸指导的经电路DNA杂交被用于单链DNA(ssDNA)桥接模板的定向和定位。在一个实施例中，ssDNA桥接模板经由包括硫醇或者生物素结合的任意附着方法与MEMS引线结合。
多个DNA桥接MEMS电路可以矩阵或阵列几何结构定位于单个芯片上，以便能够从相同样品中同时检测和鉴定多种病原体。在一个实施例中，矩阵包括相同DNA桥接MEMS的多个重复，使得可以作为单位体积样品中“激励”电路数量的函数来测量靶DNA分子浓度。
下面描述MEMS移动元件的生物桥接。
包含移动元件和电路的物理MEMS设备制造以后，感兴趣的单个ssDNA分子(模板分子)连接到设备中。在一个具有悬臂梁的实施例中，ssDNA连接于悬臂自由端和悬臂下的衬底基座间。在一个实施例中，准备表面以使模板ssDNA的功能化末端连接于表面。ssDNA一端用硫醇基团功能化(对金表面具有高亲和力)、另一端用生物素功能化(对包被链亲和素的表面具有高亲和力)。这样，如果金用于悬臂底部表面的导体上，ssDNA硫醇功能化的一端将与之连接。位于悬臂自由端下的衬底金表面也被暴露。在引入待结合的ssDNA模板之前，将生物素静电沉积在衬底的金表面。链亲和素被引入晶片上，它与衬底上的生物素化表面结合。因此，MEMS设备的表面准备好结合ssDNA模板。
下面描述桥接分子模板的静电捕获，在一个实施例中，包括将单个ssDNA分子连接于悬臂自由端和其下的制备的衬底基座的间隙之间。在一个实施例中，电压被施加于间隙，其中与大电阻串联。在一个实施例中，ssDNA分子被所产生的电场吸引。当足够接近时，在衬底基座上形成生物素-链亲和素的结合，以及在悬臂自由端形成金-硫醇结合。一旦有一个分子以这种方式附着，由于电路中串联电阻而使间隙电压大大降低。因此，每个位点仅连接一个ssDNA分子。场辅助吸引ssDNA到MEMS引线臂-设备有助于单分子连接。静电捕获单个导电纳米颗粒在纳米电极之间(Electrostatic trapping of single conducting nanoparticles between nanoelectrodes.)。Appl.Phys.Lett.71(9)。
下面描述过量模板分子的去除。
某些情况下，即使只有一条链跨间隙连接，可以有多个ssDNA与或者金或者生物素化表面连接。这些“游离”物具有不期望的结合靶病原体ssDNA序列的能力。在一个实施例中，利用核酸外切酶处理设备，以去除所有没有在两端都连接的ssDNA，从而消除与非传感器位点发生结合事件的可能。
在一个实施例中，系统包括另外的移动元件，该元件桥接合成或生物分子，作为参考或基线对照用于消除机械、电或化学背景影响(如温度、压力、运动、杂散电压、感应电场、和/或样品化学污染物)。在一个实施例中，所述设备包括位于一个MEMS芯片上的数千个传感器和参考位点。这些传感器位点可以都包括检测单个生物因子存在的生物元件，或者可以包括多种生物元件，以能够在单个生物芯片上同时检测多种生物因子。
下面描述将MEMS电路集成到信号放大、处理和显示系统。测量纳安培级的电流需要集成电路放大器。在一个实施例中，多路复用和集成电路(IC)放大器和其它电子组件和处理用于显示感测事件的结果。集成电路用于放大来自MEMS芯片的模拟信号，并将它们转变为数字信号。在一个实施例中，IC制造将IC进行封装，以允许将IC的引脚连接到印刷电路板(PCB)上。除了提供MEMS和IC芯片的连接外，PCB包括主处理器，执行计算和控制PCB上的电操作。PCB包括显示和电池的电接口，以及菜单钮的输入/输出。在一个实施例中，对处理器进行编程，以利用来自IC的数字信号输出进行显示。用户接口包括显示的直接控制以及参数设置的控制，以确定显示的特性、检测阈值、电池水平，开/关和生物因子分子清除的控制。在一个实施例中，PCB、显示器、用户接口、电池和输入/输出都集成在塑料或者金属外壳内。
下面描述示例性系统的测试和分析。其中一个实施例需要样品收集、处理和向电子线路传送。
a.样品收集：气体、液体或者固体样品的收集方法基于靶分子源和仪器的工作环境。例如，合适大小、质量或者电荷的粒子可以通过过滤和/或质谱方法分离并收集。过滤器捕获的化学或者生物因子能够被样品准备试剂洗脱并传递给仪器。在一个实施例中，采用仪器抽吸技术吸引或者迫使气态样品通过样品准备试剂并随后传递给检测芯片。
b.样品准备：在一个实施例中，气体、液体或者固体样品在检测设备外部准备，或者利用自动样品准备技术在内部准备。样品准备的具体步骤和试剂依赖于待检测和鉴定的靶分子和来源。化学、热、和/或机械手段用于破裂生物细胞内容物和释放靶分子。相似手段被用于准备先前准备的有机或者无机来源的靶分子。通常，破坏生物细胞需要溶解脂质膜的去污剂、酶促消化与细胞膜或靶分子结合的蛋白质、和修饰或者其它准备靶分子用于检测和鉴定的各种变性剂。机械手段包括单独或破碎珠存在下的超声或搅拌。在一个实施例中，基于大小、亲水性、电荷或者配体亲和，用过滤或者色谱方法纯化靶分子。在一个实施例中，系统抵抗与靶来源结合的成分和其它环境污染物(即盐、灰尘、溶剂或特别加入抑制正确检测或鉴定的试剂)。在一个实施例中，系统对与样品结合的痕量靶分子敏感。在一个实施例中，系统检测和鉴定在DNA源(即微生物、动物细胞、病毒)中发现、DNA源表面、或与DNA源结合的特定DNA片段。在一个实施例中，双链DNA被片段化并变性。
c.向微芯片传递样品。
d.发生检测、鉴定和区分。
e.在设备上显示结果。
本系统的应用实例包括实时检测、鉴定、区分和浓度测量来自源(包括但不限于在土壤、水或空气中发现的动物、细菌、病毒、真菌、植物和古菌)的成分。成分实例包括但不限于与人类、植物或者动物病原体相关的有机物(即由核酸、氨基酸或者碳水化合物等组成)或者无机物(即金属、无机磷酸盐等)、涉及食品安全的成分和源，涉及医学疾病的成分和源、与疾病易感性相关的遗传序列、植物和动物疾病出现症状之前的诊断、列出的成分或源的实验室诊断工具、监测特定RNA的基因表达和通过多态性ID鉴定特定动物或人的实验室工具。
除了DNA-DNA间的相互作用，还包括其它替代方案，包括：
蛋白质-蛋白质
1)朊病毒蛋白质和其他朊病毒的相互作用。牛海绵样脑病(BSE，也称作疯牛病)，是牛的一种神经退行性疾病，摄取受感染的肉制品导致人类克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease)(CJD和vCJD)。已经在动物中鉴定出BSE的变型，所有变型都被归类为传染性海绵样脑病(TSE)。牛BSE或者人类CJD是称为朊病毒的神经蛋白质从正常形状变形为错折叠的有传染性的形状时所产生的结果。这种错折叠传染性的朊病毒然后诱导其他朊病毒蛋白质也错折叠。本系统能够检测正常朊病毒以及传染性形式的物理构象。在一个实施例中，正常的朊病毒蛋白质经由表面暴露的半胱氨酸或组氨酸连接于包被金、镍或铂的MEMS表面。
2)抗体-抗原相互作用。在一个实施例中，MEMS电路的移动元件与天然产生的或者合成的抗体的抗原结合位点代表物(representation)桥接，所述抗体对来自特定生物或无机因子的抗原是特异性的。在一个实施例中，代表抗原结合位点的氨基酸分子经由上述与朊病毒类似的化学反应附着在移动MEMS表面上。生物因子抗原与桥接的抗原结合位点的相互作用诱导桥接元件的结构变化，由此产生可测量信号。
蛋白质-碳水化合物(糖蛋白的形成)
1)细胞外糖表位和受体蛋白间的相互作用能够被检测和分析。这种生物过程的实例包括病毒和细菌传染。一个实例模型是带有甘露糖的刀豆(Canavalia ensiformis)蛋白质伴刀豆球蛋白A(conA)(Acta Crystallogr.，Sect.D 50pp.847(1994))。一个实例包括经由组氨酸或半胱氨酸残基桥接MEMS电路的移动单元和Con A。含葡萄糖的样品结合并改变ConA蛋白质的尺寸构造，从而产生系统信号。包括这种电路的本系统在糖尿病控制中能够检测葡萄糖残余物的存在和浓度。
2)糖脂类globotriaosyl神经酰胺，在肾细胞表面表达，通过蛋白质的五聚体“B”结合亚基之间的结合相互作用而作为志贺样毒素(SLT1)的受体起作用，这种毒素是两组分细菌毒素的成员。
碳水化合物-碳水化合物
细胞-细胞相互作用和细胞粘附力有时与碳水化合物与其他碳水化合物或糖蛋白间的相互作用有关(J Cell Biol.2004May 24；165(4)：529-37.2004May 17)。糖鞘脂(GSL)的共相互作用似乎在小鼠黑素瘤细胞粘附方面起关键作用。一个实例系统包括为监测癌细胞生长而创建具有GSL结合位点的糖蛋白结构。
在一个实施例中，化学和生物检测/鉴定系统需要样品收集、样品处理和传送、样品分析技术、和信号处理和输出。
DNA链的强度和长度取决于碱基组成、序列和环境。平均而言，dsDNA的直径为20埃()，邻近核苷酸间的距离为3.4或者整个一圈螺旋约为34。dsDNA螺旋表现出两个沟：小沟(～12埃)和大沟(～22埃)。而ssDNA中相邻核苷酸的距离约为5.84埃。
分子收缩
第一个物理现象与双链DNA(dsDNA)所采用的螺旋形状有关。单链DNA(ssDNA)通常是线状物理结构，每个核苷酸碱基的长度约为5.84埃。(组成DNA链的单个构造模块(碱基)是鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C))。一条DNA链与其互补链的匹配和结合(此过程称为杂交)产生螺旋状dsDNA结构，其中核苷酸碱基间距离减小为3.4埃。因此，尽管ssDNA的50个碱基约为292埃，但相同数量的dsDNA核苷酸只有175埃(17.5nm)，或者DNA长度期望平均减小约40％(由碱基组成、序列和环境决定)。这种长度的减小是一种稳定和物理可测量的事件。
此外，分子长度总体变化的量还和第一(模板)ssDNA与第二(互补或靶)附着链间的匹配程度相关。在适当条件下，不完全匹配的DNA链也可杂交。然而，对长度缩短具有相应更小的影响。因此，如果测量长度变化，并且由于完全匹配引起的最大长度变化是已知的，那么可以确定靶ssDNA和引入的ssDNA之间遗传序列的变异程度。要求正确匹配的环境条件包括低盐条件和高温(20C A&T，40C G&C)条件。相反地，通过提高盐条件和降低温度可导致不完全匹配的DNA链(或者遗传变体)间的杂交。
一个ssDNA分子与另一个的相互作用以及引发的物理构象变化对本发明的功能至关重要。链-链间和亚基连接键合的总体强度是个体单元间吸引力组合的结果。这些吸引力包括氢键、碱基堆积作用、和促使碱基进入内部和磷酸基处于外部的疏水作用。认识到结合能的确切测量值与相邻核苷酸和环境条件(pH值、温度、离子强度等)有关也是重要的。氢键增加4-7千卡/摩尔，碱基堆积增加3.8-14.6千卡/摩尔，磷酸二酯键的共价键能量(80-100千卡/摩尔)(referecences)。实验和理论研究证实，平均碱基组成和序列dsDNA的抗张强度约为5×10-12牛顿(kg/s2)(referecences)。这个力与单个细菌的重量大体一致；不过，前面提到的技术足够精密，能够精确施加这种力。
电导率
与两个匹配ssDNA再结合相关的第二个生理学现象是，杂交后ssDNA电导率显著增加。大量研究工作已经证实ssDNA能够传导电流。ssDNA的电导率高度依赖于遗传序列的组成，鸟嘌呤和胞嘧啶(G和C)趋于作为导体，而腺嘌呤和胸腺嘧啶(A和T)更趋于作为绝缘体(referecences)。
对于适当富含G-C的序列，杂交后电导率的增加能达到ssDNA的100X倍。对于允许这种显著增加的机理在文献中仍存在争议，可能是通过碱基区的电子隧道效应或是电子在糖磷酸骨架中的跳跃；无论机理如何，这种增加是可测量的并且良好地在任何信噪比问题之上。
随着分子长度的变化，电导率的增加与靶ssDNA和潜在匹配ssDNA间的匹配程度成正比。ssDNA分子间错配程度越大，杂交后电导率的增加越小。
电压诱导的变性
第三个生理学现象与dsDNA分离为两个互补ssDNA相关。Southern杂交是一种经很好验证的实验室方法，用于控制DNA分子的杂交和变性(referecences)。通过控制环境变量如盐度和温度，可以促使DNA分子的杂交或者变性。还可使足够的电流通过dsDNA来实现变性。此外，虽然最终机理没被完全理解，但是已经反复观察到该现象(referecences)。
随着分子长度和电导率的变化，促使dsDNA变性为两个组分ssDNA所需的电流与组分ssDNA链间的匹配程度成正比。匹配程度越高，导致变性需要的电流越大。
DNA模板生产
枯草杆菌基因组DNA制备：枯草芽孢杆菌(Ehrenberg)Cohn株168，(AmericanType Culture Collection(ATCC)#27370)，培养在100ml无菌ATCC培养基#265中，每升该培养基由12.5g心脏浸出肉汤(BD#238400)、5.4g营养肉汤(BD#234000)和2.5g酵母提取物(BD#212730)组成。培养基在30℃、140rpm振荡下生长15小时。根据对标准方法的改进(Marmur，J.1961.A procedure for the isolation ofdeoxyribonucleic acid from microorganisms.J.Mol.Biol.3：208-218)，从培养基中分离基因组DNA。简单地说，100ml杆菌培养基在4000xg下离心10分钟。沉淀重悬于9.5mlTE(10mM Tris(三羟基-氨基甲烷EM#9210)、1mM EDTA(乙二胺四乙酸EM#4010))、0.5ml 10％SDS(十二烷基硫酸钠EM#DX2490-2)和50微升20mg/ml蛋白酶K(EM#24568-3)中并在37℃培养1小时。培养后，加入1.8ml 5M NaCl(氯化钠VWR#6430-1)，完全混合溶液，然后加入1.5ml CTAB/NaCl溶液(0.7M NaCl中的10％CTAB(十六烷基三甲基铵溴化物VWR 80501-950)，并在65℃下保温20分钟。用等体积氯仿(EM#CX1054-6)/异戊醇(Calbiochem#80055-544)萃取溶液，并在22℃ 6000xg下离心10分钟。水相用酚(EM #PX0511-1)/氯仿/异戊醇萃取并在22℃以6000xg离心10分钟。水相中的DNA通过加入0.6体积的异丙醇(VWR3424-7)而沉淀并在4℃ 6000xg下离心10分钟。沉淀物用70％(v/v)乙醇洗涤，然后重悬于4ml TE中。用分光光度计在260nm吸光度处测定浓度，并调至100μg/ml。每4ml DNA中加入200μl溴乙锭(EM #4310)和4.3g CsCl(氯化铯 EM#3030)。溶液在15℃ 300,000xg下离心4小时。基因组DNA带通过UV光观察，并用注射器针头取出。用CsCl饱和的异丙醇萃取溴乙锭，在4℃下2升TE中透析过夜去除CsCl。用0.6体积的异丙醇沉淀DNA，并在-70℃下保存。
枯草杆菌16S rRNA的PCR扩增：由根据上述公开方法(H.-J.Bach，1，D.Errmpalli，K.T.，Leung，H.，Lee，A，.Hartmann，J.，T.Trevors，and J.C.Munch.1999.Specific Defection of the Gene for the Extracellular Neutral Protease of Bacillus cereus byPCR and Blot Hybridization.Applied and Environmental Microbiology，p.3226-3228，Vol.65，No.7)制备的基因组DNA来PCR扩增枯草杆菌的16S rRNA基因。DNA扩增由GeneAmp PCR系统9600(Perkin-Elmer，Norwalk，Conn.)来进行。包含50ng模板枯草杆菌基因组DNA的50μl样品、25pmol每种引物(正向：5’-gggtttgatcctggctcag-3’；反向：5’-acggttaccttgttacgactt-3’)、0.2mM脱氧核苷三磷酸(Boehringer，Mannheim，Genrmany)、2单位DNA聚合酶(Promega)、5μl 10×反应缓冲液(EM)和3mM MgCl2(EM)。PCR程序如下：94℃持续5分钟和80℃持续4分钟的热启动循环；94℃持续2分钟、64℃持续1分钟和72℃持续2分钟的一个循环；94℃持续30秒、64℃持续30秒和72℃持续45秒的30个循环；最后在72℃延伸10分钟。扩增PCR产物用TAE缓冲液中(40mM Tris-乙酸盐〔pH7.6〕，1mM Na2EDTA)的0.8％琼脂糖(Promega LMP#2831)凝胶电泳分离。切出约1500bp的PCR产物，并利用
(Promega)消化方法从琼脂糖中提取PCR产物。(注：上面提到的引物已由Dr.Albert专门设计，作为从多种细菌中PCR扩增16S rRNA核苷酸序列的工具)。
枯草杆菌16S rRNA的克隆：根据制造商推荐的方法，在上述步骤中产生的16SrRNA PCR产物被连接至质粒克隆载体
-T Easy(Promega)上。简单地说，75ngPCR产物加入5μl 2×快速连接缓冲液(Promega)、1μl(50ng)载体DNA和1μl(3Weiss单位)T4DNA连接酶中。反应液在22℃保温1小时。根据下述方法，连接反应产物转化入JM109感受态细胞(Promega)中：将2μl冰冷连接反应体系小心加入无菌1.5ml试管中的50μl冰冷感受态细胞中。管子在冰上保温20分钟，然后在42℃保持50秒，再转到冰上保持2分钟。加入22℃ 950μl无菌SOC培养基，管子在37℃下150rpm振荡1.5小时。转化细胞铺在LB/氨苄青霉素/IPTG/X-Gal培养皿上。培养皿在37℃下培养20小时。利用下面的质粒小量制备方法随后筛选白色菌落以获得插入片段。
质粒小量制备方法：利用Blin&Doly在Nucleic Acids Research 7：1513-1523(1979)技术的改进方法从JM109E.coli宿主中快速纯化含枯草杆菌16S rRNA核苷酸序列插入片段的质粒。用无菌移液器吸头将代表候选插入片段/载体转化克隆的20个白色菌落分别挑入无菌带盖试管中的2ml LB/氨苄青霉素肉汤中，并在37℃下200rpm振荡培养16小时。将培养物分别加入无菌1.5ml微离心管，并在4℃下以4000xg离心5分钟。沉淀重悬于180μl溶液I和20μl 5mg/ml溶菌酶中，并在22℃保温5分钟。加入400μl溶液II，颠倒5次，并将溶液冰浴保温5分钟。加入300μl冰冷溶液III，旋转振荡试管内容物，并在冰上保温10分钟。样品在22℃ 10,000xg下离心2分钟，将上清液转移到新的无菌1.5ml微离心管中，该管含有500μl(0.6体积)的异丙醇以沉淀DNA。旋转振荡样品，并在22℃下以10,000xg离心5分钟，沉淀重悬于200μl TE中。
筛选含16S rRDA基因插入片段的转化体：根据制造商指导，5μl质粒制备物用NotI(Promega)限制性消化，并用1％琼脂糖电泳分离质粒和切出的插入片段，从而鉴定含期望pGem-B.subtils rRNA质粒构造物的菌落分离物。由电泳分析鉴定为含有合适质粒构造物的候选克隆在500ml LB/氨苄青霉素培养基中培养，等分保存在-70℃下的70％甘油中，并进行大量质粒制备以建立培养物和DNA的保存物。
用于生成相同121bp桥接模板的替代方案：下面提供两种用于产生相同121bp核苷酸序列的替代方案。
1)由枯草杆菌DNA亚克隆。通常，微生物DNA的克隆片段能够从个人或者商业渠道获取。含有包括期望121bp片段的枯草杆菌DNA大插入片段的质粒可以用限制酶AatII和SphI消化。消化将释放一个171bp片段，能被克隆入任意合适的克隆载体如pGem-T(Promega)的Aat II/Sph I位点。根据上述PCR方法，期望的121bp片段能够从质粒中亚克隆。
2)合成期望桥接模板。期望寡核苷酸桥接模板可通过任何商业系统如ABI 392DNA合成仪来合成。可以利用标准的氨基磷酸酯(phosphoramidite)化学在5’末端产生二甲氧三苯甲基保护基团。所述分子由C18反相HPLC(25mM NH4OAc，pH7，5-25％CH3CN 30分钟)纯化，随后在80％乙酸溶液中去保护15分钟。去保护后，用反相HPLC(25mM NH4OAc，pH7，2-20％CH3CN，30分钟)在相同C18柱上将寡核苷酸二次纯化。合成的DNA量通过紫外-可见吸收光谱法用下面的单链DNA的消光系数来确定：(260nm，M-1 cm-1)腺嘌呤(A)＝15,000；鸟嘌呤(G)＝12,300；胞嘧啶(C)＝7400；胸腺嘧啶(T)＝6700。由于超过70-90个碱基时大部分合成方法丧失忠实度，此处讨论的121bp桥接模板将合成为至少两个片段。特别地，如研究计划的步骤1所示，四个约60碱基的单链核苷酸将被合成，并且以合适的方式互相杂交和连接。然后将产物连接入克隆载体。
利用PCR扩增制备121bp电路桥接模板：从pGem-B.subtilis rRNA质粒构造物中PCR扩增枯草杆菌16S rRNA基因的121bp片段。含50ng Sal I消化的模板质粒DNA的50μl样品、25pmol每种引物(正向：
5’-CGAGCGGCCGCCTGGGCTACACACGTGC-3’；反向：
5’-CGACCGCGGCCAGCTTCACGCAGTCG-3’)、0.2mM脱氧核苷三磷酸
(Boehringer，Mannheim，Germany)、2单位
DNA聚合酶(Promega)、5μl 10×反应缓冲液(EM)和3mM MgCl2(EM)。PCR程序如下：94℃持续5分钟和80℃持续4分钟的热启动循环；94℃持续2分钟、64℃持续1分钟和72℃持续2分钟的一个循环；94℃持续30秒、64℃持续30秒和72℃持续45秒的30个循环；最后在72℃延伸10分钟。扩增PCR产物用TAE缓冲液中(40mM Tris-乙酸盐〔pH7.6〕，1mM Na2EDTA)的1.5％琼脂糖(Promega LMP#2831)凝胶电泳分离。切出约121bp的PCR产物，并利用
(Promega)消化方法从琼脂糖中提取PCR产物。纯化的产物连接至pGem载体的Not I/Sac II位点，转化入JM109，并利用上述方法制备含121bp插入片段的质粒。
验证DNA桥接模板的特异性：利用上述方法克隆的121bp枯草杆菌片段经商业转包合同DNA测序服务来验证序列完整性。经确定121bp插入核苷酸序列是：
5’-ctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaat
Cccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctgg-3’
，并且与16S rRNA枯草杆菌亚种枯草菌株168(Entrez PubMed accession#NC000964)完全匹配。
通过对从American Type Culture Collection购买的枯草杆菌和其他杆菌种(即B.globigii，B.cereus，B.subtilis，B.thuringiensis)的基因组DNA进行标准Southern筛选来验证121bp插入片段的特异性。Southern杂交筛选涉及以下操作。如上述制备的杆菌种基因组DNA用不消化121bp插入片段的限制酶Hind III、EcoR I和Pst I限制性消化。消化产生的片段在TAE中0.8％琼脂糖分离，并用溴乙锭染色。在透射仪上，凝胶用260nm UV处理5分钟，随后浸泡在0.2M HCl中7分钟。然后凝胶在碱液(1.5MNaCl，0.5M NaOH)中浸泡45分钟，随后用中和液(5M Tris-HCl，3M NaCl，pH7.4)处理90分钟。见标准Southern参数(Southern，E.M.(1975)Dection of specific sequencesamong DNA fragments separated by gel electrophoresis.J.Mol.Biol.98，503-517)中。简要地，处理的凝胶夹在吸水Whatman 3MM滤纸和结合DNA的硝化纤维素(SS)之间，使得20×SSPE(3M NaCl，0.2MNaH2PO4，20mM EDTA，pH7.0)经毛细作用通过滤纸、并通过凝胶，同时将凝胶DNA转移至结合膜。在室温条件下，基因组DNA被允许转移16个小时。取出膜，并在5×SSPE中浸泡30分钟，在80℃真空箱中烤几小时，直至滤膜干燥。然后探测膜上的片段，所述片段将与根据制造商指导
-DIRECT(Pharmacia)标记的上述121bp克隆模板片段杂交。探测膜显色清楚表明，探针对枯草杆菌是特异性的并且仅对枯草杆菌基因组内的单个位点是特异性的。
制备点突变变体：用公开方法(Molecular Biology：Current Innovations and FutureTrends.Eds.A.M.Griffin and H.G.Griffin.ISBN 1-898486-01-8.1995 Horizon ScientificPress，PO Box 1，Wymondham，Norfolk，U.K.)制备121bp核苷酸序列的遗传变体。具体地，向PCR混合物中加入0.5pmol pGem-B.subtilis质粒模板DNA，在25μl 1×突变缓冲液：(20mM Tris HCl，pH7.5；8mM MgCl2；40ug/ml BSA)中所述PCR混合物含有T7和SP6引物(Promega)各20pmol、250uM每种dNTP、2.5U Taq DNA聚合酶、2.5U Taq Extender(Stratagene)。PCR循环参数是1个循环的：94℃保持4分钟、50℃保持2分钟和72℃保持2分钟；随后进行5-10个循环的94℃保持1分钟、54℃保持2分钟和72℃保持1分钟。用DpnI(10U)和Pfu DNA聚合酶(2.5U)处理亲代模板DNA和掺入线性致突变引物的新合成DNA。这导致体内甲基化的亲代模板和杂合DNA的DpnI消化。Pfu DNA聚合酶除去线性PCR产物上Taq DNA聚合酶延伸的碱基。反应体系在37℃下保温30分钟，然后转至72℃下再保温30分钟。加入含0.5mM ATP的115ul致突变缓冲液并将溶液混合。将4单位T4DNA连接酶加入到新微离心管中的10ul这种溶液中，并在37℃下保温90分钟。用上述方法将该溶液转化入感受态JM109 E.coli，并铺板于LB/氨苄青霉素上在37℃下保温16小时。制备来自单个分离物的质粒DNA并如上述测定其核苷酸序列。保留证明2％、19％和35％碱基突变的分离物以备进一步研究。
末端标记121bp模板：DNA桥接模板将经由生物素-链亲和素和硫醇-金结合共价连接到AFM和MEMS表面。用Not I和Sac II限制性消化含121bp 16S rRNA枯草杆菌片段的质粒以释放插入片段，如上述该插入片段在TAE缓冲液中用0.8％LMP琼脂糖凝胶纯化。用商品末端标记试剂盒(Pierce#89818)并根据公开方法(B.A.Connoly and P.Rider，Nucleic Acids Res.13，4485(1985).和A.Kumar，S.Dvani，H.Dawar，G.P.Talwar，ibid.19，4561(1991))将分子的5’-末端和3’-末端分别用硫醇和生物素化学标记。
测量DNA物理特性：原子力显微镜(AFM)典型地用于评估分子水平的表面状况。AFM系统包括具有突出尖端的悬臂梁，所述尖端垂直于臂长轴。降低臂直到尖端接触表面，然后沿表面拖动尖端以测量表面尺寸的变化。测量悬臂尖端的移动；对样品表面充分重复这个过程以表征表面状况。最常见的，利用反射激光方法来测量尖端偏移。
在这个操作中，为了测量断裂沿单链或双链DNA分子轴的键所需的力，用AFM测量由于结合DNA分子的运动引起的AFM尖端位移。
实验测量施加到连接AFM尖端和工作台的分子上的力的阻力：松散连接于尖端和工作台间的分子开始以标准AFM方式被压缩直至记录到正力。当尖端随后从表面抬升时，分子变得绷紧从而产生负力，记录结果直到尖端和工作台之间的距离超出最大分子长度，在该点上分子断裂。
原子力显微镜(AFM)用于精确测量枯草杆菌121bp插入片段和变体DNA片段的特定物理特性(即位移和电导率)。根据预定化学反应和方法来操作AFM。根据公开方法在AFM尖端和工作台包被金和链亲和素，并连接用上述方法制备的硫醇/生物素末端标记的DNA桥接模板(RM Zimmermann and EC Cox.1994.DNA stretchingon functionalized gold surface.Nucleic Acids Research，Vol 22，Issue 3492-497)。在连接之前，用0.04M DTT、pH8.0的0.17M磷酸盐缓冲溶液过夜去保护末端标记的DNA硫醇基团。在10mM HEPES、pH6.6的5mM EDTA缓冲液中连接之前，用乙酸乙酯反复萃取除去过量DTT。在室温下，将用金处理过的AFM尖端浸泡在DNA溶液中2小时，然后在氮气流中干燥。结合DNA的AFM尖端装在AFM上，反应室里充满SPE(0.1M磷酸钠，pH6.6，1mM EDTA，和1M氯化钠)，以便形成生物素-链亲和素共价键。
在与互补链和变体ssDNA分子杂交之前、之中和之后测量AFM尖端位移和材料电特性。检查控制杂交(pH缓冲液、盐)、变性、水解和核苷酸氧化的试剂。
关于尖端从固定状态的位移的试验：在与其互补联杂交后，单链束缚DNA的长度减小。在这些实验条件下，束缚ssDNA长度的减小导致可测量的AFM尖端向工作台方向的位移。
结果
此处描述的该项工作实际上包括对长度在83bp至2854bp间的大约80种分子进行的分子和AFM研究。DNA源自质粒载体、λ病毒、E.coli基因组和B.subtilis基因组DNA。虽然对上述的121bp片段上进行了最集中的研究，但是，所有分子的结果都是相似的。初始研究是根据前述方法测量两端都与AFM尖端和工作台结合的121bp单链片段长度的减小。在吸移4-5μl稀释(每μl 1-2个分子)单链121bp片段或包含该121bp插入片段的变性质粒的数秒内观察到AFM尖端位移。图4表示121bp片段长度如何缩短约10nm。
DNA链的准确长度取决于碱基组成、序列和环境。平均起来，dsDNA的直径是20埃()，两个相邻核苷酸间的距离是
或者一个完整螺旋的长度大约是
。dsDNA螺旋表现出两个沟；小沟(
)和大沟(
)。而ssDNA中相邻核苷酸间的距离大约是5.84埃。因此，尽管ssDNA的121个碱基大约为701埃，但相同数量的dsDNA核苷酸约为411埃，或者DNA长度预期平均减小约40％。因此，如果允许连接于AFM的121bp链自由扭曲，尖端将被移动29nm。
分别引入核苷酸序列与亲本具有2％、19％和35％不同的DNA分子(变体)显示出可测量的尖端位移差异。如果这些研究中AFM尖端位移是由于双链DNA螺旋形成的长度小于单链DNA的长度，那么接下来可知，由越少互补的链组成的杂合分子表现出越小的尖端位移。
图4表示在约15秒钟之前的时间，如文中所述的连接AFM尖端和工作台并保持轻微张力的121bp DNA桥接模板。当引入模板的互补DNA链时，保持在约71nm稳定状态位置的尖端移动大约10nm。分别引入与亲本具有2％、19％和35％差异的分子导致可测量的尖端位移差异。图中的线表示每个经5次测量的小于0.3％的偏差。
包被金的AFM悬臂表面允许电流传导通过所研究分子。通过向悬臂和工作台间施加电压，测量到通过桥接的121bp ssDNA模板的对应电流。如果施加大约1伏的电压，那么测量出的通过ssDNA模板的电流大约为0.3nA。当引入完全匹配的靶ssDNA时，相同电压下测量的电流将增至2.1nA。
这些结果证实这种行为与前面讨论的ssDNA/dsDNA电导率有关。DNA分子的电导率还被证实依赖于DNA分子的组成和序列。具体地，腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)核苷酸起绝缘体的作用，而鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)核苷酸是较好的导体。
当引入工程化变体的靶ssDNA链时出现类似的结果，所述变体具有已知的与模板不同的变异程度。引入变形研究中用的相同变体靶ssDNA分子，从而测量电导率反应。值得注意的是，杂交时分子电导率的增加与模板和靶ssDNA链间错配程度之间的高度比例关系，这提供前述特异性现象的实验证据。不论变异出现在遗传序列的一个区域还是分布在沿靶序列的多个不同位置，结果都是一致的。
当测量通过dsNDA传导电流的量时，人工增加AFM悬臂和衬底间施加的电压，从而导致通过dsDNA的电导率增加。实验结果图在图6中表示。在变性点处，传导电流下降到ssDNA相关的水平。
如图6所示，促使变性所需的电流量和模板与靶ssDNA链的错配程度之间高度成比例。当与现有研究比较时，不论变异出现在遗传序列的一个区域还是分布在沿靶序列的多个不同位置，结果都是一致的。
另一个AFM操作实验涉及增大电压以促使变性，然后减小电压回到感测水平允许发生另一次杂交。从图7可以看出，AFM成功地执行了多次感测事件，并已验证，通过增加电流作为复位生物传感器的手段，电流感测杂交/强迫变性的用途。图7中要注意的是，ssDNA期间和杂交(dsDNA)之后，在多次感测事件之间测量电流的一致性。图7的实验描述了4次分立的感测事件，实际上通过数百次感测事件进行了大量试验，没有发现明显的信号减弱，也没有发现感测前后测量电流的明显变化。
AFM允许研究和验证前述的现象。感测事件涉及专用生物检测设备的选定属性。例如，利用与设备制造相同的方法和技术来构造AFM悬臂尖端，涉及AFM的传感器设备利用一个ssDNA作为探测位点。
合成121bp DNA桥接模板的研究计划：
步骤1：合成带连接头(小写)的分子片段(A+，A-，B+和B-)
(A+)＝5′-CTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCC
(B+)＝5′-CACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGgcatg
(A-)＝3′-tgcaGACCCGATGTGTGCACGATGTTACCTGTCTTGTTTCCCGTCGCTTTGGCGCT
(B-)＝3′-CCAATTCGGTTAGGGTGTTTAGAGAAGAGTCAAGCCTAGCGTCAGACGTTGAGCTGACGCACTTCGACC
步骤2：分子片段的杂交(A+到A-，B+到B-)
(A+/A-)-加热到95摄氏度，缓慢冷却到室温
CTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCC
tgcaGACCCGATGTGTGCACGATGTTACCTGTCTGTTTCCCGTCGCTTTGGCGCT
(B+/B-)-加热到95摄氏度，缓慢冷却到室温
CACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGgcatg
CCAATTCGGTTAGGGTGTTTAGACAAGAGTCAAGCCTAGCGTCAGACGTTGAGCTGACGCACTTCGACC
步骤3：连接片段A+/A-到B+/B-
(A+/A-)-室温下，在1×连接缓冲液中加入T4DNA连接酶
CTGGGCTACA----ACCGCGAGGTTAAGCCAATCCACAAATCTGTT---GTGAAGCTGGgcatg
tgcaGACCCGATGT----TGGCGCTCCAATTCGGTTAGGGTGTTTAGACAA---CACTTCGACC
产生的121bp分子然后可以连接到pGem-T的Aat II/Sph I克隆位点中。
溶液：
溶液I：50mM葡萄糖(0.9％w/v)；25mM Tris pH8，10mM EDTA pH7.5
溶液II：0.2NNaOH，1％SDS
溶液III：2.7M醋酸钾，用冰醋酸调节至pH4.8
SOC培养基＝(每100ml：2g -胰蛋白胨(BD)，0.5g酵母提取物(BD)，1ml 1M NaCl，0.25ml 1M KCl，1ml 2M Mg+2储备液，1ml 2M葡萄糖)
Mg+2储备液＝1M MgCl2，1M MgSO4
LB/氨苄青霉素/IPTG/X-Gal平板＝每升加入15g琼脂(BD)，10g 
-胰蛋白胨(BD)、5g酵母提取物(BD)和5gNaCl；用NaOH调pH值，高压灭菌，冷却至50℃；每ml加入100微克氨苄青霉素，0.5mM IPTG和80μg/ml X-Gal。每85mm平板中倒入30-35ml培养基，使琼脂在22℃硬化，在4℃保存。
缩写：
ml：毫升，μl：微升，g：克，mg：毫克，ng：纳克，M：摩尔/升(mol/l)，mM：毫摩尔/升，
(BD＝Becton，Dickinson and Company，Franklin Lakes，NJ)
(EM＝EMD Chemical Inc.，Gibbstown，NJ)
(VWR＝VWR International，West Chester，PA)
(Calbiochem/Novabiochem Corp，San Diego，CA)
(Promega＝Promega Corporation Madison，WI)
(Pierce＝Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL)
所有化学和生物检测/鉴定系统都必须包括(A)样品收集、(B)样品处理和传递、(C)样品分析技术、和(D)信号处理和输出(图1)。在一个实施例中，微芯片、或者一系列微芯片是由数千个对DNA敏感的称作微机电系统(MEMS)的悬臂以一定方式排列组成，允许检测、鉴定多种病原体和确定其浓度流量(多路复用)。
微芯片上每个孔可包含一个或者数百个基于悬臂的电路，每个电路由某种形式的优选由生物分子桥接的移动单元组成，使得当该分子与其他分子相互作用时，相关的运动促使悬臂发生移动。可以有多种几何结构，比如象AFM图所描述的悬在台面之上的单悬臂，单个旋转盘或者其他形状，或者如图10所述的相互相对运动的两个悬臂梁。能够构造这些桥接悬臂的矩阵或者这些悬臂的孔，使得在一个轴上冗余的相同电路上，根据对生物因子响应的电路的数量来测量单个生物因子的浓度。这些悬臂或者这些悬臂孔的每行可以专门用于不同的生物因子。每个芯片还将包括显著量的参考悬臂，以对化学、机械或者其他环境“噪声”的背景水平做出反应。生物检测/鉴定设备可包括专用于生物因子特定阵列的芯片。例如，一个设备可含有具有由分子桥接的悬臂的芯片，所述分子只对与国家安全相关的因子做出反应。其他的设备可以包含只对食品安全、或者对医疗或农业重要的因子做出反应的桥接悬臂。
当生物分子对其所在环境中的变化产生反应时，移动单元会偏移，随后测量这种偏移。测量MEMS设备内的移动已有很好记录。一种测量变形的方法是在可变形元件表面上反射激光束。当分子反应时，元件移动，激光束随后偏移到不同的接收器位置。反射光束的变化通过不同的接收器位置来测量，并且与分子表现出的物理反应的量相关。
本发明对位移的灵敏度约为10埃，对力的灵敏度约为5皮牛顿，但预期随着设备体积的缩小可改进灵敏性。报道的最小晶体管-探针的尺寸为3×2μm×140nm。Stanford’s Thomas Kenny报道了原子力显微镜中的精细悬臂用于测量阿托牛顿(attonewton)(10-18牛顿)水平的力。
还存在测量移动MEMS元件变形的几种替代方法。一种方法是，在变形元件自身上有压电材料层。另一种方法涉及在移动MEMS元件末端添加一定量的磁性物质，在移动元件由于生物元件的反应而移动时，测量磁场变化。而另一种方法涉及当由于生物元件而发生移动时，测量由生物元件桥接的间隙之间电容的变化。
MEMS设备的移动单元还包含包括模板分子的电路。由此，可以向移动单元施加电压，产生的电流通过ssDNA。杂交后通过电路的电导率将增加，通过感测电流增加、放大该信号并将结果转换为数字输出以备处理，从而实现测量。
在正常操作中，当传感器位点处于其准备状态(检测事件还没有发生)时，跨移动单元的电压将被设在“感测”水平。这个水平足够高，允许产生可测量的电流，但接近变性极限相比太低。这个电流似乎还具有将靶ssDNA拉向感测位点的附加好处，最有可能是通过电泳。
使电流通过ssDNA还具有其他好处。由于ssDNA自己能够传递较小量的电流(在杂交之前)，设备具有固有的自检能力。如果ssDNA模板被破坏、断裂或者与移动MEMS元件变得松弛，则电路不再完整。因此，能够验证每个传感器位点处于感测事件准备状态的能力。如果发现特定位点不能操作，在将来计算病原体存在和浓度计算中，可以将来自那个位点的信号从软件中去除。
具有由模板ssDNA完成的电路还将使得能够测量前述的第三现象：利用电流进行变性。施加的电压可以增加到产生足以使dsDNA变性的电流的水平。这提供传感器自我复位的能力，从而在感测事件发生后，可以排除与设备的模板部分连接的病原体。被排除的ssDNA靶在流经传感器的物质中被冲掉，降低电压回到感测水平，然后传感器位点为另一次感测事件做好准备。
这些元件的尺寸非常小，使得成千个传感器位点能够位于硬币大小的MEMS芯片上。因此，多种毒力基因区能够被包括在特定病原体的给定芯片上，此外，多种病原体也可以被包括在给定的芯片上。
在多个实施例中，本主题的传感器与检测器偶联。在一个实施例中，检测器包括电路，称作检测器电路。在一个实施例中，检测器利用非电学手段来区分物理位移或者谐振状况。当缺少调节器时，术语检测器包括电学和非电学检测器。
应该理解，上面的描述旨在举例说明，而不是限制性的。比如，上述实施方案、或其方面可以相互组合使用。在查阅以上说明时，很多其他实施方案对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。因此，本发明的范围应参考附属权利要求来确定，还包括授权权利要求的全范围的等价物。在附属权利要求中，术语“包括”和“其中”是通俗英语的用法，其分别与术语“包含”和“在其中”的意思一致。此外，在以下权利要求中，术语“包括”和“包含”是开放式的，也就是说，除了在权利要求中这种术语之后列举的以外，还包括其他元素的系统、设备、物品或方法都落在所述权利要求的范围内。而且，在以下权利要求中，术语“第一”、“第二”和“第三”等仅用作标记，而没有对其对象有任何数字要求的含义。
Claims (49)
1.一种装置，包含：
连接在至少两个接触点之间的模板分子(220，545)，该至少两个接触点包括位于第一表面(205A，505A，1245A，1245B，1245C，1245D)的第一接触点和位于第二表面的第二接触点，其中第一表面独立于第二表面，而且其中模板分子(220，545)包括靶分子的至少一个结合位点；和
与所述第一接触点和第二接触点偶联的检测器(530，1215)，所述第一接触点和第二接触点具有第一物理参数，该参数指示通过所述模板分子(220，545)的电传导，所述检测器(530，1215)配置为产生基于第一物理参数变化的输出信号，其中第一物理参数的变化与靶分子和模板分子(220，545)间的结合对应。
2.权利要求1的装置，其中模板分子(220，545)是核酸。
3.权利要求2的装置，其中模板分子(220，545)是ssDNA或者ssRNA。
4.权利要求2的装置，其中靶分子是含有和模板分子(220，545)中的序列充分互补的序列的核酸，以使靶分子能和所述模板分子(220，545)杂交。
5.权利要求2的装置，其中模板分子(220，545)是核酸，该核酸在其3’-末端与第一接触点和在其5’-末端与第二接触点结合。
6.权利要求1的装置，其中模板分子(220，545)包含多肽。
7.权利要求6的装置，其中多肽在其羧基端与第一接触点结合，并在其氨基端与第二接触点结合。
8.权利要求6的装置，其中多肽包含靶分子结合区，其中该靶分子是抗体。
9.权利要求6的装置，其中多肽包含源自结合靶分子的抗体的结合位点，该靶分子包含所述抗体的抗原性位点。
10.权利要求6的装置，其中多肽包含靶分子的受体位点。
11.权利要求10的装置，其中靶分子是包含受体位点的多肽的拮抗剂或者激动剂。
12.权利要求1的装置，其中靶分子是多肽，该多肽包含模板分子(220，545)至少一部分的受体位点。
13.权利要求1的装置，其中靶分子是或者包含金属离子。
14.权利要求1的装置，其中模板分子(220，545)是多糖。
15.权利要求1的装置，其中模板分子(220，545)是核酸序列的合成类似物。
16.权利要求1的装置，其中模板分子(220，545)是多肽的合成类似物。
17.权利要求1的装置，其中模板分子(220，545)是多糖的合成类似物。
18.权利要求1的装置，其中第一接触点还包括可测量结构参数，该参数包括以下至少一个：
第一接触点相对于参考点的谐振频率；
第一接触点相对于参考点的谐振振幅；
第一接触点和参考点之间的距离；和
第一接触点和参考点间的对准程度。
19.权利要求18的装置，其中参考点包括第二接触点。
20.权利要求1的装置，其中第一表面包括悬结构(205A，505A，1245A，1245B，1245C，1245D)。
21.权利要求20的装置，其中所述悬结构包括悬臂(205A，505A，1245A，1245B，1245C，1245D)。
22.权利要求1的装置，其中第一表面(205A，505A，1245A，1245B，1245C，1245D)包括可移动表面。
23.权利要求1的装置，其中检测器(530，1215)是电阻传感器。
24.权利要求1的装置，其中检测器(530，1215)包括比较器和桥接电路中的至少一种。
25.权利要求1的装置，其中检测器(530，1215)包括与第一表面连通的谐振驱动器。
26.权利要求1的装置，其中第一接触点具有第二物理参数，并且其中检测器(530，1215)配置成产生基于第二物理参数变化的输出信号，其中第二物理参数的变化与靶分子和模板分子(220，545)的结合相对应。
27.权利要求1的装置，其中指示通过所述模板分子(220，545)的电传导的所述第一物理参数包括指示所述模板分子的电阻抗、电导率或电阻率的电参数。
28.权利要求1的装置，其中检测器(530，1215)包括与第一接触点和第二接触点偶联的电压源，并且其中指示通过所述模板分子(220，545)的电传导的所述第一电参数包括电流的测量值。
29.权利要求28的装置，其中电压源配置成能够提供递增电压。
30.权利要求1的装置，其中检测器包括与第一接触点和第二接触点偶联的电流源，并且其中指示通过所述模板分子(220，545)的电传导的所述第一电参数包括电压的测量值。
31.权利要求30的装置，其中电流源配置成能够提供递增电流。
32.权利要求1的装置，其中检测器(530，1215)包括配置成传递电信号的驱动电路，并且其中第一物理参数的变化与靶分子和模板分子(220，545)的解离相对应。
33.权利要求1的装置，其中第一表面和第二表面中至少一个包括玻璃、石英、硅和聚合物中的至少一种。
34.权利要求1的装置，其中模板分子(220，545)包括硫醇、金、生物素和链亲和素中的至少一种。
35.一种方法，包括：
将靶分子暴露于模板分子(220，545)，该模板分子(220，545)连接在至少两个接触点之间，该至少两个接触点包括位于第一表面(205A，505A，1245A，1245B，1245C，1245D)的第一接触点和位于第二表面的第二接触点，其中模板分子(220，545)包括靶分子的至少一个结合位点；和
产生作为第一物理参数变化的函数的输出信号，该参数指示通过所述模板分子(220，545)的电传导，其中第一物理参数的变化与靶分子和模板分子(220，545)的结合相对应。
36.权利要求35的方法，还包括：
监测第一接触点相对于参考点的谐振频率；
监测第一接触点相对于参考点的谐振振幅；
监测第一接触点和参考点之间的距离；和
监测第一接触点和参考点之间的对准程度。
37.权利要求36的方法，其中参考点包括第二接触点。
38.权利要求35的方法，还包括驱动第一表面共振。
39.权利要求35的方法，还包括在暴露之前利用模板分子(220，545)传导电流。
40.权利要求35的方法，还包括，
利用模板分子(220，545)传导递增的电流；
监测对应于靶分子和模板分子(220，545)解离的电压峰值；和
产生作为电压峰值处电流函数的输出。
41.权利要求35的方法，还包括，
向模板分子(220，545)施加递增电压；
监测对应于靶分子和模板分子(220，545)解离的电流峰值；和
产生作为电流峰值处电压函数的输出。
42.权利要求35的方法，还包括向模板分子(220，545)施加电信号以解离靶分子。
43.一个系统，包含：
用于接受样品的靶分子入口；
具有和靶分子入口连通的模板分子(220，545)的传感器，所述模板分子(220，545)位于第一表面(205A，505A，1245A，1245B，1245C，1245D)的第一接触点和第二表面的第二接触点之间，所述第一表面(205A，505A，1245A，1245B，1245C，1245D)独立于所述第二表面，并且其中模板分子(220，545)具有靶分子特异性的至少一个结合位点；
检测器(530，1215)，所述检测器(530，1215)与所述第一接触点和第二接触点偶联并配置成产生基于所测量参数之变化的输出信号，所述测量参数指示通过所述模板分子(220，545)的电传导，所述输出信号与模板分子(220，545)和靶分子间的结合对应；和
提供基于输出信号的结果的输出电路。
44.权利要求43的系统，还包括多个传感器，每个传感器通过多路复用器和检测器(530，1215)偶联。
45.权利要求43的系统，还包括处理器，其中处理器与检测器(530，1215)偶联并可访问存储器，其中存储器提供数据存储，用于基于测量参数的变化而鉴定靶分子。
46.权利要求43的系统，其中输出电路包括接口、显示器和无线收发机中的至少一个。
47.权利要求43的系统，还包括和模板分子(220，545)偶联的测试电路，用于确定模板分子(220，545)的电导率。
48.权利要求43的系统，还包括和模板分子(220，545)偶联的复位电路，用于解离靶分子和模板分子(220，545)。
49.权利要求43的系统，还包括外壳，用于放置靶分子入口、传感器、检测器(530，1215)和输出电路中的至少一个。
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