DE102008039624B4

DE102008039624B4 - MIP-Nanopartikel-Chipsensor, dessen Verwendung und analytisches Nachweisverfahren

Info

Publication number: DE102008039624B4
Application number: DE200810039624
Authority: DE
Inventors: Ute Dr. Steinfeld; Hyeck-Hee Dr. Lee; Jung Tae Dr. Ing. Kim
Original assignee: Korea Institute of Science and Technology Europe Forschungs GmbH
Current assignee: Korea Institute of Science and Technology Europe Forschungs GmbH
Priority date: 2008-08-25
Filing date: 2008-08-25
Publication date: 2010-05-20
Anticipated expiration: 2028-08-26
Also published as: WO2010025853A1; DE102008039624A1

Abstract

Chipsensor zum Nachweis mindestens eines Analyten in einer Probe enthaltend mindestens ein Mikrofluidiksystem mit mindestens einem Durchströmungskanal sowie mindestens einem im Durchströmungskanal angeordneten Cantilever, wobei auf der Oberfläche des Cantilevers zumindest bereichsweise Nanopartikel enthaltend mindestens ein molekular geprägtes Polymer, das für den mindestens einen Analyten spezifische Bindungskavitäten aufweist, angeordnet sind, wobei der Cantilever zumindest bereichsweise elektromagnetische Bereiche aufweist, die durch elektromagnetische Wechselwirkung eine Anbindung von Nanopartikeln, die ein magnetisches oder magnetisierbares Material enthalten, an der Oberfläche des Cantilevers ermöglicht.

Description

Die Erfindung betrifft einen Chipsensor zum Nachweis mindestens eines Analyten in einer Probe, wobei der Sensor auf einem Cantilever mit molekular geprägtem Polymer (MIP)-Nanopartikeln beruht. Die Erfindung betriff weiterhin ein Verfahre zum Nachweis mindestens eines Analyten in einer Probe, bei dem dieser Chipsensor eingesetzt wird. Verwendung finden die erfindungsgemäßen Sensoren für vielfältige analytische Anwendungen in den Bereichen Medizin, Lebensmittelchemie und Umwelt.
Für Anwendungen im Bereich der Biosensorik ist aus dem Stand der Technik der Einsatz von mittels Mikrofabrikationstechniken hergestellten Cantilever als Sensor bekannt. Ein Cantilever ist dabei als einseitig eingespannter Federbalken ausgeprägt und chemisch mit einem möglichst spezifischen Fängermolekül be schichtet. Dieser Sensor wird üblicherweise mit der zu analysierenden Flüssigkeit in Kontakt gebracht. Befinden sich Moleküle der gesuchten Substanz in der Flüssigkeit, binden diese an das Fängermolekül. Dabei kommt es einerseits zu einer veränderten Oberflächenspannung auf dem Cantilever, sog. Stress, andererseits zu einer Zunahme der Masse des Cantilevers. Während der Oberflächenstress zu einer minimalen mechanischen Verbiegung des Cantilevers führt, bewirkt die Massenzunahme typischerweise eine Abnahme der Eigenfrequenz des Cantilevers. Sowohl die minimale Auslenkung als auch die Änderung des Schwingungsverhaltens können als Indikatoren für die Analyse ermittelt werden.
Somit dient eine mechanische Änderung des Zustands oder Verhaltens des Cantilevers zur Detektion. Die hohe Sensitivität von einseitig eingespannten mikromechanischen Cantilevern ist ein besonderer Vorteil, der nur schwer oder überhaupt nicht mit üblichen Methoden erreichbar ist.
In der Analytik finden in der letzten Zeit vermehrt molekular geprägte Polymere (molecular imprinted polymers, MIP) Verwendung. Bei dem molekularen Prägen handelt es sich um ein Verfahren zur Herstellung von Polymeren mit molekularen Abdrücken, sog. Templat-Moleküle. Dazu werden an bestimmten Stellen des als Schablone verwendeten Templats Bindungen mit funktionellen Monomeren ausgebildet. Dieser Komplex wird dann in Gegenwart eines Lösungsmittels durch Copolymerisation mit geeigneten Quervernetzungen stabilisiert. Anschließend wird die Schablone aus der vernetzten Polymermatrix mit einem geeigneten Lösungsmittel herausgewaschen bzw. extrahiert. Die zurückbleibenden Hohlräume (Prägungen) weisen eine zum Templat komplementäre Form und entsprechende Bindungsstellen auf. Beide Effekte begründen die Affinität der Prägung zum Templat-Molekül bei erneutem Kontakt mit diesem.
Aus der WO 2005/119233 A1 ist ein Sensor bekannt, der auf einen Cantilever basiert, dessen Oberfläche mit einer MIP-Beschichtung versehen ist. Die ganzflächige und permanente Beschichtung des Cantilevers bringt jedoch Nachteile hinsichtlich der Beladungskapazität auf der einen Seite und der Wiederverwendbarkeit auf der anderen Seite mit sich.
Ausgehend hiervon war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung einen Sensor bereitzustellen, der die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile beseitigt und eine möglichst flexible Handhabung sowie die Möglichkeit der Detektion verschiedenster Analyten ermöglicht.
Diese Aufgabe wird durch den Chipsensor mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 19 gelöst. In Anspruch 22 werden erfindungsgemäße Verwendungen aufgeführt. Die weiteren abhängigen Ansprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildungen auf.
Erfindungsgemäß wird ein Chipsensor zum Nachweis mindestens eines Analyten in einer Probe bereitgestellt, der mindestens ein Mikrofluidiksystem mit mindestens einem Durchströmungskanal sowie mindestens einen im Durchströmungskanal angeordneten Cantilever enthält. Auf der Oberfläche des Cantilevers sind dabei zumindest bereichsweise Nanopartikel angeordnet, die mindestens ein molekular geprägtes Polymer enthält, das für den mindestens einen Analyten spezifische Bin dungskavitäten aufweist.
Der Sensor besteht somit aus einem mikrofluidischen Chip-System, in dessen mikrofluidischen Kanälen ein oder mehrere Cantilever angeordnet sind. An der Oberfläche des Cantilevers sind dabei Nanopartikel, die ein molekular geprägtes Polymer enthalten, vorübergehend oder permanent angelagert.
Gegenüber dem Stand der Technik zeichnet sich der erfindungsgemäße Chipsensor dadurch aus, dass anstelle von vollflächigen Beschichtungen des Cantilevers Nanopartikel an die Cantilever-Oberfläche gebunden werden. Dies bringt wesentliche Vorteile hinsichtlich der Beladungskapazität des Sensors für verschiedenste Analyten mit sich. Der Einsatz von Nanopartikeln führt zu einer erheblich vergrößerten Oberfläche, wodurch sich die Zahl der Bindungskavitäten auf der Oberfläche des Cantilevers drastisch erhöht. Somit ist es mit dem erfindungsgemäßen System erstmals möglich, auch Proben mit deutlich höherer Konzentration des Analyten zu vermessen. Aufwendige Verdünnungsschritte entfallen damit.
Vorzugsweise besteht der Cantilever im Wesentlichen aus Siliciumdioxid, wobei auf der Oberfläche bevorzugt mindestens eine piezoelektrische Schicht zumindest bereichsweise angeordnet ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nanopartikel zumindest bereichsweise mit dem molekular geprägten Polymer beschichtet.
Die Nanopartikel werden dabei bevorzugt chemisch, insbesondere durch kovalente oder ionische Bindung an die Cantilever-Oberfläche gebunden. Ebenso ist es aber auch möglich, dass eine Anbindung durch Physisorption oder Chemosorption erfolgt. Weiterhin können Spacer eingesetzt werden, um die Nanopartikel an die Cantilever-Oberfläche zu binden. Besonders bevorzugt ist eine chemische Anbindung über die OH-Gruppen der Cantilever-Oberfläche, da der Cantilever aus Siliciumdioxid besteht und an der Oberfläche eine Vielzahl von SiOH-Gruppen existieren.
Die Partikelgröße der Nanopartikel liegt allgemein im Bereich von 10 bis 1.000 nm.
Im Falle von Nanopartikeln, die auf die zuvor beschriebene Weise an die Cantilever-Oberfläche gebunden werden, weisen die Nanopartikel vorzugsweise eine Partikelgröße im Bereich von 10 bis 200 nm, bevorzugt von 10 bis 100 nm und besonders bevorzugt von 10 bis 30 nm auf. Im Anschluss kann dann eine Beschichtung mit dem molekular geprägten Polymer der auf der Cantilever-Oberfläche gebundenen Nanopartikel erfolgen. Es ist jedoch auch möglich, dass die Nanopartikel vorab mit dem molekular geprägten Polymer beschichtet und anschließend an die Cantilever-Oberfläche gebunden werden. In diesem Falle weisen die Nanopartikel vorzugsweise eine Partikelgröße im Bereich von 200 bis 1.000 nm, bevorzugt von 500 bis 800 nm auf.
Eine besonders bevorzugte Variante des erfindungsgemäßen Chipsensors sieht vor, dass der Cantilever zumindest bereichsweise elektromagnetische Bereiche aufweist. Hierzu zählt beispielsweise eine elektromagnetische Schicht, die vorzugsweise auf der piezoelektrischen Schicht angeordnet ist. Durch elektromagnetische Wechselwirkung kann dann eine Anbindung von Nanopartikeln, die ein magnetisches oder magnetisierbares Material erhalten, an der Oberfläche des Cantilevers erfolgen. Die elektromagnetische Schicht ermöglicht somit eine temporäre Fixierung der Nanopartikel auf dem Cantilever. Dies führt zu einem sehr flexiblen und vielfältig einsetzbaren System in Bezug auf die mikrofluidische Analytik. Es wird so ermöglicht, dass die MIP-Nanopartikel einfach ausgetauscht werden können, wodurch ein Sensorsystem mit beliebiger Spezifität bereitgestellt werden kann. Durch die einfache Austauschbarkeit der Nanopartikel ist erstmalig das Recycling und die Wiederverwendbarkeit derartiger Systeme gewährleistet.
Die magnetischen oder magnetisierbaren Materialien sind vorzugsweise eisenhaltige Materialien, insbesondere Magnetit, Maghemit und/oder Hematit.
Die magnetischen oder magnetisierbaren Nanopartikel, die vor Inkontaktbringen mit dem Cantilever mit dem molekular geprägten Polymer beschichtet wurden, weisen inkl. MIP-Beschichtung eine Partikelgröße im Bereich von 200 bis 1.000 nm, bevorzugt von 500 bis 800 nm auf.
Die erfindungsgemäß eingesetzten molekular geprägten Polymere folgen der Technik des molekularen Prägens, die auf der komplexen Bindung eines Templats, funktionellen Monomeren und Quervernetzern basiert. Bei der Polymerisation bildet sich eine Detektionskavität mit spezifisch und gut ausgerichteten funktionellen Gruppen, die komplementär zum Templat-Molekül ist. Diese künstlich geschaffenen, für das Templat maßgeschneiderten molekularen Kavitäten zeigen hochselektive molekulare Erkennungsfähigkeit. Vorteile solcher Strukturen für Sensoren sind neben der hohen Spezifität die damit verbundenen geringen Kosten, die Robustheit, die hohe Stabilität und einfache Handhabung und Aufbewahrung über einen längeren Zeitraum.
Die erfindungsgemäß eingesetzten molekular geprägten Polymere sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe Poly(meth)acrylsäuren, Poly(meth)acrylaten, Polyacrylamiden, Polyolefine, Polydiolefine, Polyvinylverbindungen, Polylactiden, Polyglykosiden, Polyphosphazenen, Polyorthoestern, Polyanhydriden, Polyurethanen, Polysiloxanen sowie Copolymeren, Blends und Mischungen hiervon und/oder ausgewählt aus der Gruppe der natürlichen Polymere bestehend aus Stärke, Cellulose, Chitosan und Copolymeren, Blends und Mischungen hiervon.
Typische verwendete funktionelle Monomere (polymerisierbare Einheit, die mit dem Printmolekül wechselwirkt) können sein:
Carbonsäuren, wie Acrylsäure, Methacrylsäure, Trifluormethacrylsäure, Vinylbenzoesäure, Itaconsäure, sowie deren Amide;
Sulfonsäuren, wie Acrylamidomethylpropansulfonsäure;
heteroaromatische bzw. schwache Basen, wie substituierte oder unsubstituierte Vinylpyridine, Vinylpyrimidine, Vinylpyrazole, Vinylimidazole, Vinyltriazine, Vinylpurine, -indole, -chinoline, -acridine, -phenanthridine, Bis(acrylamido)pyridin;
aliphatische oder aromatische Vinylderivate, wie substituierte oder unsubstituierte Styrole, Vinylnaphthaline, Vinylnaphthalincarbonsäuren, Vinylnaphthole, Vinylanthracene, Vinylanthracencarbonsäuren, Vinylphenanthrene, Vinylphenanthrencarbonsäuren, und ähnliche kondensierte Aromaten, Vinylbenzamidin;
Acryloylamino-benzamidin, (Amidinoalkyl)-styrol, wobei das Alkyl Methyl, Ethyl oder Propyl sein kann, N-Acryloyl-(amidinoalkyl)-anilin, Vinylderivate mit chelatbildenden Gruppen, wie Iminodiessigsäure, Ethylendiamintetraessigsäure u. ä., zum Komplexieren von Metallionen, Silane sowie auch Mischungen derartiger Monomere. Auch andere funktionelle Monomere können zum Einsatz kommen.
Als Quervernetzer (Einheit mit zwei oder mehr Verknüpfungsmöglichkeiten mit den funktionellen Monomeren) können dienen:
Isomere des Divinylbenzols;
Bis(acryloyl)-alkane, wobei als Alkane Ethan, Propan und Butan infrage kommen;
Systeme basierend auf Acrylsäure oder Methacrylsäure, wie z. B. Ethylenglykoldimethacrylat (EDMA) und Trimethylolpropantrimethacrylat (TRIM);
tri- und tetrafunktionale Acrylat-Quervernetzer, wie z. B. Pentaerythritoltriacrylat (PETRA) und Pentaerythritoltetraacrylat (PETER) sowie
Quervernetzer, die funktionelle Gruppen enthalten, wie z. B. Acrylamideinheiten, die an den Amidstickstoffen über aliphatische (Methylen- u. ä.), aromatische (Phenylen- u. ä.) oder heteroaromatische (Pyridinyl- u. ä.) Spacer miteinander verknüpft sind. Auch andere Quervernetzer können zum Einsatz kommen, zum Beispiel auch gegen UV-Licht oder Ozon stabile Quervernetzer.
Als Porogene (Lösemittel, die als Solventien für die Polymerisierungsreaktion dienen und Porosität in das geprägte Polymer induzieren) können Lösemittel verschiedener Dielektrizitätskonstante verwendet werden, die Parameter, wie unterschiedliche Quelleigenschaften des Polymers, unterschiedliche Morphologie des Polymers mit verschiedenen Strukturen und Porendurchmessern/Porosität oder unterschiedliche Bindungsstärken der nonkovalenten Wechselwirkungen beeinflussen, insbesondere aliphatische oder alicyclische Kohlenwasserstoffe wie Hexan, Heptan oder Cyclohexan;
aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Toluol;
halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Dichlormethan oder 1,2-Dichlorethan;
kurzkettige Alkohole, wie Methanol, Ethanol, Propanol;
Ether, Acetonitril, Tetrahydrofuran, Ethylacetat, Aceton, Dimethylformamid, Dioxan, Dimethylsulfoxid;
auch in Mischungen untereinander und mit Wasser.
Der Zusatz eines Porogens bei der Herstellung der molekular geprägten Polymere bewirkt dabei, dass die entstehenden Nanopartikel Makroporen mit einer Porengröße im Bereich von 10 bis 50 nm aufweisen.
Die Polymerisation kann auf verschiedene Weise initiiert werden. Hierzu zählt neben der thermischen Initiierung auch für radikalische Polymerisation der Zusatz von Initiatoren (Radikalstartern).
Als Initiatoren können 2,2'-Azobis-isobutyronitril (AIBN), 2,2'-Azobis-(2,4-dimethyl-valeronitril) (ADVN) und andere verwendet werden, auch die Verwendung von UV-Licht ist möglich.
Die erfindungsgemäß eingesetzten molekular geprägten Polymere weisen bevorzugt Bindungskavitäten für Biomoleküle, insbesondere Bakterien, Viren, Proteine, Peptide, Antigene, Antikörper, Vitamine, Prionen, Tumormarker, ds DNA-Sequenzen, ss DNA-Sequenzen, RNA-Sequenzen, Zellen und spezifische Zelloberflächen auf. Ebenso können die Polymere Bindungskavitäten für Schadstoffe, pharmazeutische Stoffe und Körperpflegemittel (engl. pharmaceuticals and personal care products, PPCP) endokrin wirksame Substanzen (engl. endocrine disrupting chemical, EDC), Herbizide, Pestizide, Nitrate, Phosphate, chlorierte Kohlenwasserstoffe (Lindan, PCB) und organische Phosphorverbindungen aufweisen. Ebenso ist es möglich, dass die Polymere für mehrere der zuvor genannten Gruppen Bindungskavitäten aufweisen.
Die spezifischen Bindungskavitäten werden dabei vorzugsweise durch den Einbau spezifischer Epitope, Rezeptoren oder Teilen hiervon erzeugt. Anschließend werden diese wieder aus der Polymermatrix entfernt, z. B. durch den Einsatz von hydrolytischen Enzymen oder durch thermische bzw. chemische Zersetzung. Auch ist es möglich, dass die spezifischen Bindungskavitäten durch den Einbau spezifischer Proteine, Polysaccharide, Fette und/oder Nucleinsäuren erzeugt und mit anschließender Hydrolyse durch lysosomale Enzyme entfernt werden.
Erfindungsgemäß wird ebenso ein Verfahren zum Nachweis mindestens eines Analyten in einer Probe unter Verwendung des zuvor beschriebenen Chipsensors bereitgestellt. Das Verfahren weist dabei die folgenden Schritt auf:

– eine die den mindestens einen Analyten enthaltende und in flüssiger oder gasförmiger Form vorliegende Probe wird in den Durchströmungskanal eingebracht,
– die Probe wird mit dem Cantilever in Kontakt gebracht, wobei durch Wechselwirkung zwischen dem mindestens einen Analyten und den Bindungskavitäten eine Anbindung an der Cantilever-Oberfläche erfolgt,
– die durch die Anbindung des mindestens einen Analyten bedingte Massenzunahme des Cantilevers wird mittels einer Messung des Schwingungsverhaltens bestimmt,
– es erfolgt eine Freisetzung des an der Cantilever-Oberfläche gebundenen Analyten und
– die Probe wird mit dem mindestens einen desorbierten Analyten aus dem Durchströmungskanal abgeführt.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, dass eine Probe in flüssiger oder gasförmiger Form über den Chipsensor geleitet wird. Sind die gesuchten Analyten in der Probe vorhanden, binden diese in den entsprechenden spezifischen Kavitäten und die Masse an der Cantilever-Oberfläche nimmt zu. Diese Massenzunahme verändert das Schwingungsverhalten des Cantilevers. Die Messung kann hier bevorzugt anhand der Amplitude, der Frequenz und/oder der Phase der Schwingung, d. h. ihrer Intensität und ihrem zeitlichen Verhalten gemessen werden. Auf diese Weise erfolgt die Detektion von Analyten in Echtzeit und ohne diese in irgendeiner Form zu verändern oder zu markieren. Dadurch wird eine unerwünschte Beeinflussung durch die Markermoleküle und damit eine Verfälschung der untersuchten Wechselwirkung vermieden. Dies steht im Gegensatz zu klassischen Sensoren, bei denen etwa fluoreszierende Marker zur Kennzeichnung der zu untersuchenden Stoffe verwendet werden.
Die Freisetzung des in den Bindungskavitäten gebundenen Analyten erfolgt vorzugsweise durch chemische oder thermische Desorption, pH-abhängig, durch lysosomale Hydrolyse und/oder magnetische Wechselwirkung.
Im letzten Fall werden die magnetischen bzw. magnetisierbaren Nanopartikel wieder vollständig von der Cantilever-Oberfläche entfernt. Dies bringt den großen Vorteil mit sich, dass auf sehr einfache Weise die Cantilever-Oberfläche mit neuen Nanopartikeln, die für andere Analyten spezifisch sind, belegt werden kann.
Verwendung finden die erfindungsgemäßen Chipsensoren für beliebige analytische Fragestellungen. Beispielsweise können die Sensoren in folgenden Bereichen eingesetzt werden:

• Medizin, sowohl zu diagnostischen wie therapeutischen Zwecken,
• Lebensmittelchemie, insbesondere zur Qualitätskontrolle von Lebensmitteln und der Überwachung von Prozessen in der Lebensmittelindustrie,
• Umwelt, insbesondere zur Behandlung, Reinigung und/oder Qualitätsverbesserung von Flüssigkeiten, insbesondere von Abwässern wie Industrieabwässern, Prozessabwässern der chemischen oder pharmazeutischen Industrie oder der Papier- und Zellstoffin dustrie, kommunalen Abwässern, Krankenhausabwässer, Ausscheidungen von Tieren, auch in Verbindung mit mikrobiellen Behandlungsverfahren, sowie Lebensmittelchemie,
• Laboranalytik im Forschungs- und Screeningbereich,
• Nachweisverfahren für Biowaffen,
• DNA- bzw. RNA-Nachweis, Sequenzselektivität, Nachweis bestimmter ds DNA-Sequenzen, ss DNA-Sequenzen oder RNA-Sequenzen.

Der erfindungsgemäße Chipsensor findet dabei Anwendung für den Nachweis von Biomolekülen, insbesondere Bakterien, Viren, Proteine, Peptide, Antigene, Antikörper, Vitamine, Prionen, Zellen und spezifische Zelloberflächen sowie Schadstoffe, pharmazeutische Stoffe und Körperpflegemittel, endokrin wirksame Substanzen, Tumormarker, ds DNA-Sequenzen, ss DNA-Sequenzen, RNA-Sequenzen, Herbizide, Pestizide, Nitrate, Phosphate, chlorierte Kohlenwasserstoffe (Lindan, PCB) und organische Phosphorverbindungen in flüssigen Proben, insbesondere Wasser oder Blut, oder gasförmigen Proben, insbesondere in der Luft.
Anhand der nachfolgenden Figuren soll der erfindungsgemäße Gegenstand näher erläutert werden, ohne diesen auf die hier gezeigten speziellen Ausführungsformen einzuschränken.
1 zeigt den Aufbau eines erfindungsgemäßen Cantilevers.
2 zeigt eine erste Variante eines erfindungsgemäßen Chipsensors.
3 zeigt eine zweite Variante eines erfindungsgemäßen Chipsensors.
In 1 ist ein erfindungsgemäßer Cantilever 1 dargestellt, der auf einer seiner Oberflächen mit einer piezoelektrischen Schicht 2 versehen ist. Auf der piezoelektrischen Schicht ist eine elektromagnetische Schicht angeordnet, durch die eine elektromagnetische Wechselwirkung mit den magnetischen oder magnetisierbaren Nanopartikeln 4 ermöglicht wird. Auf die elektromagnetische Schicht 3 kann hier verzichtet werden, wenn eine andere Bindung der Nanopartikel an dem Cantilever erfolgt, z. B. eine chemische Bindung oder eine Anbindung durch Physisorption oder Chemisorption.
In 2 ist eine erste Variante eines erfindungsgemäßen Chipsensorsystems dargestellt. Dieses besteht aus einem mikrofluidischen System mit einem Durchströmungskanal 5, an dessen Einlassöffnung die den nachzuweisenden Analyten enthaltende Probe eingebracht wird. In dem Durchströmungskanal sind mehrere erfindungsgemäße Cantilever 6, 6' und 6'' angeordnet, die mit der Probe in Kontakt treten, wodurch es zu einer Wechselwirkung zwischen dem Analyten und den Bindungskavitäten des molekulargeprägten Polymers an der Cantilever-Oberfläche damit zur spezifischen Anbindung kommt. Hierbei ist dann eine Massenzunahme des Cantilevers festzustellen, die anhand der Messung des Schwingungsverhaltens, zum Beispiel der Amplitude, der Frequenz und/oder Phase der Schwingung detektiert werden kann.
In 3 ist eine zweite Variante eines erfindungsgemäßen Chipsensors dargestellt. Hierbei weist der Durchströmungskanal 5 Gabelungen auf, so dass die Probe über eine erste Einlassöffnung eingebracht wird, und über eine zweite Einlassöffnung weitere Reagenzien zugesetzt werden können, so dass im Durchströmungskanal eine chemische Umsetzung stattfindet. Auch hier sind wieder analog zu 2 mehrere Cantilever 6, 6' und 6'' angeordnet.

Claims

Chipsensor zum Nachweis mindestens eines Analyten in einer Probe enthaltend mindestens ein Mikrofluidiksystem mit mindestens einem Durchströmungskanal sowie mindestens einem im Durchströmungskanal angeordneten Cantilever, wobei auf der Oberfläche des Cantilevers zumindest bereichsweise Nanopartikel enthaltend mindestens ein molekular geprägtes Polymer, das für den mindestens einen Analyten spezifische Bindungskavitäten aufweist, angeordnet sind, wobei der Cantilever zumindest bereichsweise elektromagnetische Bereiche aufweist, die durch elektromagnetische Wechselwirkung eine Anbindung von Nanopartikeln, die ein magnetisches oder magnetisierbares Material enthalten, an der Oberfläche des Cantilevers ermöglicht.
Chipsensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Cantilever im wesentlichen aus Siliciumdioxid besteht.
Chipsensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche des Cantilevers mindestens eine piezoelektrische Schicht zumindest bereichsweise angeordnet ist.
Chipsensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche der Nanopartikel zumindest bereichsweise mit dem molekular geprägten Polymer beschichtet sind.
Chipsensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel chemisch, durch kovalente oder ionische Bindung, Physisorption oder Chemosorption und/oder über einen Spacer an die Oberfläche des Cantilevers gebunden sind.
Chipsensor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel über die SiOH-Gruppen der Cantilever-Oberfläche an diese gebunden sind.
Chipsensor nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel eine Partikelgröße von 10 bis 200 nm, bevorzugt von 10 bis 100 nm und besonders bevorzugt von 10 bis 30 nm aufweisen.
Chipsensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Cantilever zumindest bereichsweise elektromagnetische Bereiche, insbesondere eine auf der piezoelektrischen Schicht aufgebrachte elektromagnetische Schicht aufweist.
Chipsensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass an der Oberfläche des Cantilevers zumindest bereichsweise Nanopartikel, die ein magnetisches oder magnetisierbares Material enthalten, reversibel gebunden sind.
Chipsensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das magnetische oder magnetisierbare Material ein eisenhaltiges Material ist, insbesondere Magnetit, Maghemit und/oder Hematit.
Chipsensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel eine Partikelgröße von 200 bis 1000 nm, insbesondere 500 bis 800 nm aufweisen.
Chipsensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das molekular geprägte Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Poly(meth)acrylsäuren, Poly(meth)acrylaten, Polyacrylamiden, Polyolefine, Polydiolefine, Polyvinylverbindungen, Polylactiden, Polyglykosiden, Polyphosphazenen, Polyorthoestern, Polyanhydriden, Polyurethanen, Polysiloxanen sowie Copolymeren, Blends und Mischungen hiervon und/oder ausgewählt aus der Gruppe der natürlichen Polymere bestehend aus Stärke, Cellulose, Chitosan und Copolymeren, Blends und Mischungen hiervon.
Chipsensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das molekular geprägte Polymer aus mindestens einem Monomer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (Meth)acrylsäuren, p-Vinylbenzoesäure, Itaconsäure, 4-Ethylstyrol, Styrol, 4-Vinylpyridin, 2-Vinylpyridin, 1-Vinylimidazol, 2-Acrylamid-2-methyl-1-propansulfonsäure, (Meth)acrylamid, trans-3-(3-pyridyl)-acrylsäure 2,5-Distyrylpyrazin, Diethyl-p-phenylendiacrylat und deren Mischungen gebildet ist.
Chipsensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das molekular geprägte Polymer mittels eines Quervernetzers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Divinylbenzol-Vernetzer, (Meth)acrylsäure-Vernetzer, tri- und tetrafunktionale Vernetzer, Acrylamid-Vernetzer und Mischungen hiervon, insbesondere N,N'-1,4-phenylendiacrylamin, N,N'-methylendiacrylamid, Ethylenglykoldimethacrylat, 3,5-Bis(acrylolamido)benzoesäure, Divinylbenzol, N,O-Bisacryloylphenylalaniol, 1,3-Diisoprenylbenzol, Tetramethylendimethacrylat, 1,4-Diacryloylpiperazin, 2,6-Biacryloylamidopyridin, Dimethylformamid, Trimethylpropantrimethacrylat, Pentaerythrioltetraacrylat und Mischungen hiervon, gebildet ist.
Chipsensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das molekular geprägte Polymer Makroporen mit einer Größe im Bereich von 10 bis 50 nm aufweist, die auf den Zusatz von Porogenen, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylacetat, Wasser, Alkohole, insbesondere Methanol und Ethanol, Acetonitril, Dimethylsulfoxid und Mischungen hiervon, bei der Herstellung des Polymers zurückzuführen sind.
Chipsensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das molekular geprägte Polymer Bindungskavitäten für Biomoleküle, insbesondere Bakterien, Viren, Proteine, Peptide, Antigene, Antikörper, Vitamine, Prionen, Zellen und spezifische Zelloberflächen sowie Schadstoffe, pharmazeutische Stoffe und Körperpflegemittel, endokrin wirksame Substanzen, Tumormarker, Herbizide und Pestizide aufweist.
Chipsensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die spezifischen Bindungskavitäten durch den Einbau spezifischer Epitope, Rezeptoren oder Teile davon erzeugt wurden und anschließend wieder aus der Polymermatrix entfernt werden, z. B. durch den Einsatz von hydrolytischen Enzymen, thermische oder chemische Zersetzung.
Chipsensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die spezifischen Bindungskavitäten durch Einbau spezifischer Proteine, Polysaccharide, Fette und/oder Nucleinsäuren erzeugt und mit anschließender Hydrolyse durch lysosomale Enzyme entfernt wurden.
Verfahren zum Nachweis mindestens eines Analyten in einer Probe unter Verwendung eines Chipsensors nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem – eine die den mindestens einen Analyten enthaltende und in flüssiger oder gasförmiger Form vorliegende Probe in den Durchströmungskanal eingebracht wird, – die Probe mit dem Cantilever in Kontakt gebracht wird, wobei durch Wechselwirkung zwischen dem mindestens einen Analyten und den Bindungskavitäten eine Anbindung an der Cantilever-Oberfläche erfolgt, – die durch die Anbindung des mindestens einen Analyten bedingte Massenzunahme des Cantilevers mittels einer Messung des Schwingungsverhaltens bestimmt wird, – eine Freisetzung des an der Cantilever-Oberfläche gebundenen Analyten erfolgt und – die Probe mit dem mindestens einen desorbierten Analyten aus dem Durchströmungskanal abgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung des Schwingungsverhaltens anhand der Amplitude, der Frequenz und/oder der Phase der Schwingung er folgt.
Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Freisetzung durch chemische oder thermische Desorption, pH-abhängig, durch lysosomale Hydrolyse und/oder durch magnetische Wechselwirkung erfolgt.
Verwendung des Chipsensors nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Analytik in den Bereichen • Medizin, sowohl zu diagnostischen wie therapeutischen Zwecken, • Lebensmittelchemie, insbesondere zur Qualitätskontrolle von Lebensmitteln und der Überwachung von Prozessen in der Lebensmittelindustrie, • Umwelt, insbesondere zur Behandlung, Reinigung und/oder Qualitätsverbesserung von Flüssigkeiten, insbesondere von Abwässern wie Industrieabwässern, Prozessabwässern der chemischen oder pharmazeutischen Industrie oder der Papier- und Zellstoffindustrie, kommunalen Abwässern, Krankenhausabwässer, Ausscheidungen von Tieren, auch in Verbindung mit mikrobiellen Behandlungsverfahren, sowie Lebensmittelchemie, • Laboranalytik im Forschungs- und Screeningbereich, • Nachweisverfahren für Biowaffen, • DNA- bzw. RNA-Nachweis, Sequenzselektivität, Nachweis bestimmter ds DNA-Sequenzen, ss DNA-Sequenzen oder RNA-Sequenzen.
Verwendung nach Anspruch 22 zum Nachweis von Biomolekülen, insbesondere Bakterien, Viren, Proteine, Peptide, Antigene, Antikörper, Vitamine, Prionen, Tumormarker, ds DNA-Sequenzen, ss DNA-Sequenzen, RNA-Sequenzen, Zellen und spezifische Zelloberflächen sowie Schadstoffe, pharmazeutische Stoffe und Körperpflegemittel, endokrin wirksame Substanzen, Herbizide, Pestizide, Nitrate, Phosphate, chlorierte Kohlenwasserstoffe (Lindan, PCB) und organische Phosphorverbindungen in flüssigen Proben, insbesondere Wasser oder Blut, oder gasförmigen Proben, insbesondere in der Luft.