BR112020023494A2

BR112020023494A2 - Dispositivo, sistema e método para medição elétrica direta de atividade enzimática, bem como método para sequenciamento

Info

Publication number: BR112020023494A2
Application number: BR112020023494-0A
Authority: BR
Inventors: Stuart Lindsay; Peiming Zhang
Original assignee: Stuart Lindsay
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2021-03-30
Also published as: WO2019222527A1; JP7433300B2; IL278769A; CA3100693A1; EP3793721A1; EP3793721A4; AU2019269615A1; AU2019269615B2; US20210208127A1; SG11202011394WA; KR20210045361A; JP2021524281A; CN112384296B; CN112384296A; MX2020012329A; US11808755B2

Abstract

a presente revelação refere-se a um dispositivo, sistema e método para captar movimentos funcionais de uma única molécula de proteína por meio de fixação direta de um ou mais eletrodos à molécula. a presente revelação também se refere a um arranjo, um sistema que compreende um arranjo e método para sequenciar um biopolímero com o uso de um arranjo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “DISPOSITIVO E MÉTODO PARA MEDIÇÃO DIRETA DE ATIVIDADE DE PROTEÍNA, SISTEMA PARA MEDIÇÃO

ELÉTRICA DIRETA DE ATIVIDADE DE PROTEÍNA E MÉTODOS PARA SEQUENCIAMENTO DE UM BIOPOLÍMERO E DE UM POLINUCLEOTÍDEO” PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO COM PATROCÍNIO FEDERAL

[001] Esta invenção foi produzida com apoio do governo sob HG910080, concedido pelos Institutos Nacionais de Saúde. O governo tem certos direitos na invenção.

ANTECEDENTES

[002] A leitura elétrica de movimentos subjacentes às funções de uma proteína nativa pode permitir muitos novos tipos de medição analítica sem rotulagem. Por exemplo, monitorar flutuações funcionais de uma enzima forneceria uma maneira rápida e simples de selecionar moléculas de fármaco candidatas. Monitorar as flutuações de proteínas que processam biopolímeros revelaria informações sobre sua composição e conformação.

[003] A leitura elétrica da função enzimática foi demonstrada por Choi et al. (Choi, Moody et al. 2012) que mostraram que o ruído telegráfico, induzido em um transistor de efeito de campo de nanotubo de carbono, refletiu o movimento funcional da enzima lisozima ao atuar sobre seu substrato, o peptidoglicano. Percebeu-se que monitorar as flutuações das enzimas precessivas, tais como a polimerase de DNA, poderia, desse modo, fornecer um método para sequenciar o DNA. Foi fornecido um exemplo foi em um artigo controverso, no qual o grupo Huang (Chen, Lee et al. 2013) afirmou medir flutuações elétricas em uma polimerase, à medida que nucleotídeos foram incorporados em uma cadeia estendida, sendo que os sinais relatam a sequência do modelo que é estendido com alta precisão. O artigo foi posteriormente recolhido (Nature Nanotechnology 8 , páginas 452 a 458 (2013); publicado on-line em 5 de maio de 2013; corrigido após impressão em 11 de julho de 2013 e 28 de agosto de 2013; recolhido após impressão em 3 de junho de 2015), mas ilustra o que poderia ser possível se as flutuações estruturais de uma proteína pudessem ser monitoradas por uma leitura elétrica. Mais significativamente, uma realização de trabalho desta proposta foi demonstrada, na mesma época, pelo grupo Collins, que usou um transistor de efeito de campo de nanotubo de carbono ao qual uma polimerase foi amarrada (Olsen, Choi et al. 2013). Os sinais consistiram em ruído telegráfico, que se mostrou associado à abertura e ao fechamento da polimerase, à medida que foram incorporados nucleotídeos. É importante ressaltar que as características do ruído refletiram o nucleotídeo específico que estava sendo incorporado, abrindo o caminho para leitura elétrica de molécula única de sequências de DNA.

[004] Em Olsen, Choi et al. 2013, flutuações da proteína foram detectadas indiretamente através das flutuações do campo elétrico que geram, sendo que as flutuações de campo são detectadas por um canal transistor de efeito de campo em estreita proximidade com a polimerase ou lisozima. A Figura 1 ilustra a proposta de Chen et al. Uma polimerase 1 ligada a um modelo de DNA iniciado 2 na presença de trifosfatos de nucleotídeos na solução 3 é ligada por meio de anticorpos 4 a microesferas de ouro 5 que abrangem o vão entre a fonte 6 e o dreno 7 de um transistor de efeito de campo, cujo canal 8 é formado sobre um eletrodo de porta 9. Tendo em vista a recolha do relatório original, não está claro que esta invenção realmente funcionou, mas o mesmo contém muitos dos elementos da invenção bem- sucedida do grupo Collins. Isso é ilustrado na Figura 2A em que a fonte 21 e o dreno 22 de um transistor de efeito de campo são unidos por um nanotubo de carbono 23 que forma o canal do transistor. Uma enzima (lisozima nesse caso) 24 é fixada ao nanotubo de carbono. Uma porta traseira de semicondutor 25 é usada para ajustar o transistor ao seu ponto de operação mais sensível, a meio caminho entre ligar e desligar, e a atividade enzimática é detectada através de flutuações na corrente FET. Em um artigo posterior, o mesmo grupo mostrou (Figura 2B ) como uma polimerase 26 fixada ao canal de nanotubo de carbono 23 e ligada por um modelo de DNA preparado 27 gerou picos de ruído, sendo que cada um foi associado à incorporação de um nucleotídeo, pela polimerase. Dois exemplos da sucessão de sinais obtidos são dados na Figura 2C para um poli(dA) 28 e um poli(dC) 29. Diferenças claras nos sinais mostram que o sequenciamento é possível, embora o ruído em segundo plano 30 do FET CNT seja significativo, em comparação com o nível de sinal 31 . Um método bastante similar foi proposto por Merriman e Mola (Merriman e Mola, 2016). Isso é ilustrado na Figura 2C. Uma polimerase 436 é quimicamente ligada através de um ligante 437 a um fio molecular 433 que é conectado à fonte 438 e ao dreno 439 de um transistor de efeito de campo. Um eletrodo de porta 440 é colocado abaixo do fio molecular. Os dados apresentados em seu pedido de patente parecem indicar níveis de sinal ainda menores do que os obtidos no dispositivo de Olsen et al.

[005] Claramente, seria desejável fazer uma conexão elétrica mais direta com a enzima em teste. Foi desenvolvida uma tecnologia chamada tunelamento de reconhecimento e foram usadas moléculas de reconhecimento para ligar uma proteína a pelo menos um de um par de eletrodos estreitamente espaçados (Zhang, Song et al. 2017). Essa abordagem está ilustrada na Figura 3. O dispositivo consiste em um primeiro eletrodo 41 e um segundo eletrodo 42, separados por uma fina camada dielétrica 43. As moléculas de reconhecimento 44 são fortemente ligadas a cada um dos eletrodos, por exemplo, por meio de ligações de tiol e metal. As moléculas são escolhidas para serem especificamente reconhecidas e ligadas por uma proteína-alvo

45. Esses eventos de reconhecimento, em geral, são reversíveis e, portanto, inadequados para manter uma proteína de interesse no vão para estudos de sua função. Desse modo, a tecnologia anterior de tunelamento de reconhecimento não é aplicável ao problema atual e é irrelevante para o mesmo, visto que, no presente documento, é necessário manter uma proteína conhecida conectada ao dispositivo de medição, em vez de usar o dispositivo de medição para detectar a chegada de uma proteína desconhecida. Ainda mais limitante é a exigência de que esses dispositivos sejam operados com uma polarização alta o suficiente (Vt, 46), de modo que a própria polarização conduza a proteína em um modo no qual as flutuações de ruído telegráfico, na corrente (47), são geradas. No caso deste trabalho publicado, no qual a proteína era integrina e a molécula de reconhecimento era um peptídeo RGD, a ligação à proteína é detectada operando-se o dispositivo em uma polarização relativamente alta (> 100 mV) e observando-se as flutuações induzidas pela polarização aplicada. O uso de flutuações induzidas por tensão como um detector de ligação à proteína impede inteiramente o uso deste dispositivo para medir flutuações na estrutura e na conformação de uma proteína que possibilitam a função biomolecular crítica da proteína, devido ao fato de que essas flutuações induzidas por tensão ocorrem em todas as proteínas expostas a uma diferença de potencial suficientemente alta, independentemente dos movimentos funcionais. Por essa razão, na técnica discutida anteriormente, os sinais desses movimentos funcionais críticos não podem ser distinguidos das flutuações induzidas por tensão. Consequentemente, deseja-se encontrar um sistema e um método para detectar a ligação de uma molécula de proteína através de um par de eletrodos, em condições que eliminam flutuações de condutância induzidas por tensão e mantêm a proteína no lugar, enquanto estiver exposta a estímulos químicos que geram a chave e as flutuações funcionais mensuráveis, e medir a resposta dessas flutuações a outros produtos químicos, como fármacos candidatos ou biopolímeros.

[006] A citação de qualquer referência nesta seção não deve ser interpretada como uma admissão de que tal referência é a técnica anterior da presente revelação.

SUMÁRIO

[007] A presente revelação se refere a dispositivos, sistemas e métodos para medição elétrica direta da atividade proteica. Em algumas modalidades, é fornecido um dispositivo, sendo que o dispositivo compreende: um primeiro e um segundo eletrodos, em que o primeiro e segundo eletrodos são separados por um vão; uma proteína fixada a um ou ambos os eletrodos; em que o primeiro eletrodo e o segundo eletrodo são configurados para entrar em contato com uma amostra a ser analisada.

[008] Em algumas modalidades, a proteína é fixada a um eletrodo. Em outras modalidades, a proteína é fixada a dois eletrodos.

[009] Em algumas modalidades, o dispositivo compreende adicionalmente uma camada dielétrica isolante disposta dentro do vão.

[010] Em algumas modalidades, a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em uma polimerase, uma nuclease, um proteassoma, uma glicopeptidase, uma glicosidase, uma quinase e uma endonuclease.

[011] Em algumas modalidades, a proteína é fixada a um eletrodo. Em outras modalidades, a proteína é fixada a ambos os eletrodos.

[012] Em algumas modalidades, a proteína é fixada ao eletrodo através de um ligante.

[013] Em algumas modalidades, o dispositivo compreende: um primeiro e um segundo eletrodo, sendo que o primeiro e segundo eletrodo são separados por um vão; uma proteína fixada a um ou ambos os eletrodos; em que uma flutuação de corrente é produzida quando a proteína interage com uma entidade química.

[014] Em algumas modalidades, é fornecido um dispositivo, sendo que o dispositivo compreende: (a) um substrato dielétrico; (b) um primeiro eletrodo disposto sobre o substrato dielétrico; (c) uma camada dielétrica isolante disposta no primeiro eletrodo; (d) um segundo eletrodo disposto na camada dielétrica isolante; (e) uma camada de passivação disposta no segundo eletrodo; (f) uma proteína fixada a um ou a ambos os eletrodos; em que o primeiro eletrodo, a camada dielétrica isolante, o segundo eletrodo e a camada de passivação têm uma abertura formada através dos mesmos.

[015] Em algumas modalidades, o dispositivo compreende: um primeiro e um segundo eletrodo, sendo que o primeiro e segundo eletrodo são separados por um vão; uma proteína fixada a um ou ambos os eletrodos; em que o primeiro eletrodo e o segundo eletrodo têm uma abertura formada através dos mesmos.

[016] Em algumas modalidades, o dispositivo compreende: um primeiro e um segundo eletrodo, sendo que o primeiro e o segundo eletrodo são coplanares e separados por um vão; uma proteína fixada a um ou ambos os eletrodos; em que o primeiro eletrodo e os segundos eletrodos são configurados para entrar em contato com uma amostra a ser analisada.

[017] Em algumas modalidades, o dispositivo compreende adicionalmente uma camada dielétrica isolante disposta dentro do vão.

[018] Em algumas modalidades, a proteína é fixada a um eletrodo. Em alguns aspectos desta modalidade, a proteína é uma polimerase. Em alguns aspectos desta modalidade, a polimerase é fixada ao eletrodo, através de um ligante. Em alguns aspectos, a polimerase é uma polimerase biotinilada. Em alguns aspectos, a polimerase é uma polimerase biotinilada e é fixada ao eletrodo por meio da estreptavidina.

[019] Em algumas modalidades do dispositivo, o primeiro e/ou segundo eletrodos compreendem um metal selecionado a partir do grupo que consiste em ouro, platina, paládio, e rutênio. Em algumas modalidades, o metal é paládio.

[020] Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 1,0 nm a cerca de 20,0 nm. Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 1,0 nm a cerca de 10,0 nm. Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 2,0 nm a cerca de 10,0 nm. Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 1,0 nm a cerca de 7,5 nm. Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 1,0 nm a cerca de 5,0 nm. Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 4,0 nm a cerca de 5,0 nm. Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 5,0 nm a cerca de 6,0 nm.

[021] Em algumas modalidades, o dispositivo pode ser usado para detectar uma única molécula.

[022] Em algumas modalidades, é fornecido um sistema, sendo que o sistema compreende um dispositivo, conforme descrito no presente documento; um meio para a introdução de uma entidade química com capacidade de interagir com a proteína; um meio para aplicar uma polarização entre o primeiro e o segundo eletrodo de valor; e um meio de monitoramento de flutuações que ocorrem como uma entidade química interage com a proteína.

[023] Em algumas modalidades, a polarização é entre 1 mV e 50 mV.

[024] Em algumas modalidades, a polarização é entre 1 mV e 100 mV.

[025] Em algumas modalidades, é fornecido um método, sendo que o método compreende (a) fornecer um sistema conforme descrito no presente documento; (b) colocar a proteína em contato com uma entidade química; (c) aplicar uma polarização entre o primeiro e o segundo eletrodo de valor, de modo que não ocorram flutuações espontâneas da corrente entre os eletrodos; (d) detectar flutuações que ocorrem à medida que a entidade química interage com a proteína.

[026] Os métodos da revelação podem ser usados para detectar a atividade de uma única molécula de proteína. Os métodos também podem ser usados para sequenciar um biopolímero. Os métodos também podem ser usados em ensaios de seleção de fármacos. Vantajosamente, os métodos não exigem rótulos ou produtos químicos especiais.

[027] Os métodos de sequenciamento de um biopolímero fornecem leituras longas (> 10 kB), e a polimerase funciona na velocidade da polimerase nativa (100 nt/s).

[028] Os dispositivos da revelação têm geometrias de dispositivos simples, o que permite um escalonamento fácil.

[029] A presente revelação se refere a um arranjo, um sistema e um método para sequenciar um biopolímero por medições elétricas diretas, em proteína processiva única.

[030] Em uma modalidade, a presente revelação fornece um arranjo para sequenciar um biopolímero que compreende: uma disposição de uma pluralidade de dispositivos, conforme descrito no presente documento. Em um aspecto desta modalidade, o arranjo é para sequenciar o DNA.

[031] A presente revelação fornece um sistema de medição direta da atividade proteica. O sistema compreende: (a) um arranjo, conforme descrito no presente documento; b) opcionalmente um meio de introdução e remoção de uma solução no arranjo; c) um meio de aplicação de uma polarização entre o primeiro e o segundo eletrodos; e (d) um meio de monitoramento da corrente gerada entre o primeiro e o segundo eletrodos. Em um aspecto desta modalidade, o sistema é para a medição direta da atividade de polimerase.

[032] A presente revelação também fornece um método para sequenciar um biopolímero. Em uma modalidade, o método deve sequenciar o DNA, sendo que o método compreende: (a) introduzir uma solução que compreende um DNA e modelo em um sistema, conforme descrito no presente documento; (b) medir uma primeira corrente gerada, quando uma polarização é aplicada a um sistema, conforme descrito no presente documento; (b) introduzir uma solução que compreende um dNTP no sistema, sob condições que permitam a incorporação do dNTP complementar ao modelo de DNA; (c) medir uma segunda corrente gerada na etapa (b); (d) remover a solução que compreende dNTP não incorporado; (e) repetir as etapas (b) a (d) com cada um dos três tipos restantes de dNTP não usados na etapa (b); (f) repetir as etapas (b) a (e); em que o DNA é sequenciado a partir dos sinais de corrente gerados.

[033] Em outra modalidade, o método compreende: (a) introduzir uma solução que compreende um modelo de DNA em um sistema descrito no presente documento; (b) medir uma primeira corrente gerada, quando uma polarização é aplicada a um sistema, conforme descrito no presente documento; (b) introduzir uma solução que compreende pelo menos dois tipos de dNTPs no sistema, sob condições que permitam a incorporação do dNTP complementar ao modelo de DNA, em que os tipos de dNTP estão presentes na solução, em diferentes concentrações; (c) medir uma segunda corrente gerada na etapa (b); (d) remover a solução que compreende os dNTPs não incorporados; (e) repetir as etapas (b) a (d), com os tipos de dNTP restantes não utilizados na etapa (b); (f) repetir as etapas (b) a (e); em que o DNA é sequenciado a partir dos sinais de corrente gerados.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[034] A Figura 1 mostra um sistema de detecção conhecido para flutuações da polimerase, de acordo com Chen et al.

[035] A Figura 2A mostra um sistema de detecção conhecido para as flutuações da lisozima, de acordo com Choi et al. A Figura 2B mostra um sistema de detecção conhecido para flutuações da polimerase, de acordo com Olsen et al. A Figura 2C mostra dados dependentes de sequência de nucleotídeos, de acordo com Olson et al. A Figura 2D mostra um sistema de detecção conhecido para flutuações da polimerase, de acordo com Merriman e Mola.

[036] A Figura 3 mostra um dispositivo conhecido para detecção de proteínas.

[037] A Figura 4 mostra um diagrama esquemático de uma modalidade da revelação.

[038] A Figura 5A mostra a característica de tensão de corrente linear obtida quando uma proteína é ligada em dois pontos, conforme mostrado na Figura 4. A Figura 5B mostra a distribuição das inclinações da região linear para um grande número de medições de molécula única.

[039] A Figura 6 mostra sinais representativos de flutuações de proteína.

[040] A Figura 7 mostra um diagrama esquemático de uma modalidade da revelação, em que a proteína é uma polimerase.

[041] A Figura 8A mostra o princípio do ensaio de atividade de fluorescência usado para medir a atividade da polimerase. A fluorescência FAM (F) é arrefecida, a menos que a atividade da polimerase esteja presente. A Figura 8B mostra a intensidade fluorescente de FAM no substrato, após 60 minutos de incubação com o tipo selvagem, sem exonuclease (D12A, E14A) ou enzima sem exonuclease fixada à estreptavidina.

[042] A Figura 9 mostra a distribuição de condutâncias medidas para a estreptavidina tiolada (esquerda) e (direita), após a fixação da polimerase biotinilada phi29. As medições de estreptavidina foram feitas em um vão de 2,5 nm, e as medições de estreptavidina mais phi29 foram feitas em um vão de 3,5 nm.

[043] A Figura 10 mostra alterações de condutância com conformação. O painel esquerdo é para tio-estreptavidina, e o painel direito são dados obtidos do mesmo filme de moléculas, depois que a biotina foi adicionada. A condutância é alterada, o que mostra que é sensível às alterações conformacionais induzidas pela ligação à biotina.

[044] A Figura 11 mostra alto contraste, registros de alta resolução de tempo de flutuações de proteínas à (esquerda) e vão de STM e à (direita) um chip de estado sólido. A amostra é anti-DNP IgE com DNP nos eletrodos. Os dispositivos são operados a 200 mV, com um vão de 4,6 nm.

[045] A Figura 12 mostra a corrente coletada no vão constante (como marcado à esquerda inferior, em cada painel) e a polarização de 50mV no complexo estreptavidina phi29, que mostra apenas flutuações de contato na ausência de modelo de DNA e dNTPs (A, B, C) e o ruído telegráfico adicional que aparece quando o modelo de DNA e dNTPs são adicionados (D, E, F). As inserções à direita mostram corridas completas com mais de 20 a 40 s de duração. O círculo vermelho denota o ponto de corrente alta expandido nos traços à esquerda.

[046] A Figura 13 mostra as distribuições de condutâncias medidas (escala de log) para três anticorpos e integrina, ligados a ligantes peptídicos (conforme indicado na Tabela 1), em eletrodos Pd, para um vão de cerca de 4,5 nm, com exceção dos dados relativos à estreptavidina acoplados por ligações de tiol aos eletrodos, em que os dados foram obtidos em um vão de cerca de 2,5 nm. As distribuições são arbitrariamente deslocadas verticalmente, a título de clareza. As inserções ilustram como os anticorpos, com dois sítios de ligação para o peptídeo fixado aos eletrodos, podem preencher o vão, o que resulta no segundo pico mais alto na condutância (rotulado “2"). Conexões únicas também podem ocorrer (“1"). Esses dados mostram como a alta condutância (cerca de 2 nS) pode ser obtida em longas distâncias (os 13 nm entre os locais de ligação dos anticorpos) se duas conexões químicas forem feitas entre a proteína e os eletrodos, uma para cada eletrodo.

[047] A Figura 14 mostra a dependência de distância do vão das distribuições de condutância para a estreptavidina (esquerda) e direita, um complexo de streptavidina e polimerase obtido em diferentes tamanhos de vão, conforme marcado. As distribuições de condutância são pouco alteradas com o tamanho do vão, o que mostra que a condução, nessas proteínas, se dá por meio de um mecanismo de transporte sem localização. A inserção mostra as estimativas das alturas de proteína - a estreptavidina tem cerca de 4 nm de altura, e complexo de phi29 ligado à estreptavidina tem cerca de 9 nm de altura. Os sinais foram obtidos a partir de vãos tão grandes quanto 5,5 nm, o que mostra que o caminho de condução precisa ser, em parte, através do phi29, embora a sonda esteja quase certamente em contato com o interior da polimerase nesses conjuntos de dados.

[048] AFigura 15 mostra a fixação de uma polimerase através de dois sítios biotinilados na polimerase, separados por 5 nm, a duas moléculas de estreptavidina nos eletrodos. As moléculas de estreptavidina são acopladas aos eletrodos através de porções químicas de tiol.

[049] A Figura 16 mostra um arranjo de moléculas de polimerase ligadas aos modelos de DNA, sendo que cada polimerase é conectada em um par de eletrodos individualmente endereçados.

[050] A Figura 17 mostra uma sequência de exposição a trifosfatos nucleotídicos e enxaguamentos para determinar a sequência de cada modelo de molécula, em cada sítio.

[051] AFigura 18 mostra duas explosões de ruído telegráfico características da incorporação sequencial de dois nucleotídeos idênticos em sítios que contêm bases idênticas.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[052] A revelação inclui, pelo menos, o seguinte: (1.) um dispositivo substancialmente como mostrado e descrito. (2.) um sistema para medição elétrica direta da atividade de proteína como mostrado e descrito. (3.) um método para detectar a atividade proteica como mostrado e descrito. (4.) um método de sequenciamento de um biopolímero como mostrado e descrito. (5.) Um dispositivo para medição direta da atividade da proteína, sendo que o dispositivo compreende um primeiro e um segundo eletrodos, sendo que o primeiro e o segundo eletrodos são separados por um vão; e uma proteína fixada a um ou ambos os eletrodos; em que o primeiro eletrodo e o segundo eletrodos têm uma abertura formada através dos mesmos. (6.) O dispositivo descrito acima (5.), em que o vão tem uma largura de cerca de 1,0 nm a cerca de 20,0 nm. (7.) um dispositivo para medição direta da atividade proteica, sendo que o dispositivo compreende: (a) um substrato dielétrico; (b) um primeiro eletrodo disposto sobre o substrato dielétrico; (c) uma camada dielétrica isolante disposta no primeiro eletrodo; (d) um segundo eletrodo disposto na camada dielétrica isolante; (e) uma camada de passivação disposta no segundo eletrodo; (f) uma proteína fixada a um ou a ambos os eletrodos; em que o primeiro eletrodo, a camada dielétrica isolante, o segundo eletrodo e a camada de passivação têm uma abertura formada através dos mesmos. (8.) um dispositivo para medição direta da atividade proteica, sendo que o dispositivo compreende: (a) um primeiro e um segundo eletrodos, sendo que o primeiro e o segundo eletrodos são coplanares e separados por um vão; (b) uma proteína ligada a pelo menos um eletrodo; em que o primeiro eletrodo e os segundos eletrodos são configurados para entrar em contato com uma amostra a ser analisada. (9.) O dispositivo de qualquer um dentre os citados acima (5.) a (8.), em que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em uma polimerase, uma nuclease, um proteassoma, uma glicopeptidase, uma glicosidase, uma quinase e uma endonuclease. (10.) O dispositivo descrito acima (9.), em que a proteína é uma polimerase. (11.) O dispositivo descrito acima (10.), em que a polimerase é fixada a um eletrodo. (12.) O dispositivo descrito acima (10.) ou (11.), em que a polimerase é fixada ao eletrodo através de um ligante. (13.) O dispositivo dentre qualquer um dos citados acima (10.) a (12.), em que a proteína é uma polimerase biotinilada. (14.) O dispositivo citado acima (13.), em que a polimerase biotinilada é fixada ao eletrodo através de um ligante de tio-estreptavidina. (15.) O dispositivo de qualquer dentre os citados acima (5.) a (14.), em que o primeiro e/ou segundo eletrodo compreendem um metal selecionado a partir do grupo que consiste em ouro, platina, paládio e rutênio. (16.) O dispositivo citado acima (15.), em que o primeiro e/ou segundo eletrodo compreendem paládio. (17.) Um dispositivo para medição direta da atividade proteica, sendo que o dispositivo compreende: (a) um substrato dielétrico; (b) um primeiro eletrodo disposto sobre o substrato dielétrico; (c) um segundo eletrodo disposto sobre o substrato dielétrico, em que o primeiro e o segundo eletrodos são separados por um vão entre 1 e 10 nm; (d) uma camada de passivação disposta no topo dos eletrodos; e (e) uma proteína fixada a um ou a ambos os eletrodos; em que a camada de passivação tem uma abertura formada através da mesma posicionada para permitir que uma amostra para passar para o vão entre o primeiro e segundo eletrodos. (18.) Um sistema de medição elétrica direta da atividade proteica que compreende (a) um dispositivo de qualquer um dentre os citados acima (5.) a (17.); (b) um meio de introdução de uma entidade química com capacidade de interagir com a proteína; (c) um meio de aplicação de uma plarização entre o primeiro e o segundo eletrodos; e (d) um meio de monitoramento das flutuações que ocorrem, à medida que a entidade química interage com a proteína. (19.) O sistema citado acima (18.), em que a proteína é uma polimerase. (20.) O sistema citado acima (18.), em que a proteína é uma exonuclease, proteassoma, ou glicana. (21.) O sistema citado acima (18.), em que a proteína é uma quinase. (22.) Um método de detecção da atividade de uma única molécula de proteína, sendo que o método compreende (a) introduzir uma entidade química com capacidade de interagir com a molécula de proteína no sistema acima referido (18.); (b) aplicar uma polarização entre os dois eletrodos escolhidos, de modo que uma corrente CC estável seja observada; e (c) observar flutuações de corrente entre os dois eletrodos que surgem quando a entidade química interage com a proteína. (23.) O método citado acima (22.), em que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em uma polimerase, uma nuclease, um proteassoma, uma glicopeptidase, uma glicosidase, uma quinase e uma endonuclease. (24.) O método citado acima (22.) ou (23.), em que a entidade química é selecionada a partir do grupo que consiste em um trifosfato de nucleotídeo, um ácido nucleico, um peptídeo, um glicano e uma quinase. (25.) Um método de sequenciamento de DNA, sendo que o referido método compreende (a) introduzir um modelo de DNA preparado para o sistema acima referido (18.); (b) introduzir uma solução que compreende os quatro dNTP; (c) aplicar uma polarização entre os dois eletrodos escolhidos, de modo que uma corrente CC estável seja observada; (d) detectar flutuações de corrente entre os dois eletrodos, que surgem quando cada novo nucleotídeo é incorporado ao iniciador; e (e) determinar a identidade de cada um dos nucleotídeos incorporados.

(26.) O método citado acima (25.), em que a solução compreende os quatro dNTPs a cerca da mesma concentração de uns em relação aos outros. (27.) O método citado acima (25.) ou (26.), em que as concentrações dos dNTPs são aproximadamente iguais ou superiores à concentração de saturação da polimerase ligada ao modelo. (28.) O método de qualquer um dentre os citados acima (25.) até (27.), em que a etapa (d) compreende a detecção da presença de um ou mais picos de corrente. (29.) O método de qualquer um dentre os citados acima (25.) a (27.), em que a etapa (e) compreende usar as características de cada pico. (30.) Um método de sequenciamento de um biopolímero, sendo que o dito método compreende (a) introduzir um biopolímero no sistema citado acima (18.); (b) aplicar uma polarização entre os dois eletrodos escolhidos, de modo que uma corrente CC estável seja observada; c) detectar flutuações de corrente entre os dois eletrodos que surgem quando um monômero é removido da extremidade do biopolímero; e (d) determinar a identidade de cada monómero removido do biopolímero. (31.) O método citado acima (30.), em que o biopolímero é DNA, um peptídeo ou um glicano. (32.) Um método de detecção da atividade da quinase, sendo o método compreende (a) introduzir uma molécula de inibidor de quinase candidata no sistema acima (20.); (b) aplicar uma polarização entre os dois eletrodos escolhidos, de modo que uma corrente CC estável seja observada; (c) detectar flutuações na corrente entre os dois eletrodos que surgem, quando a quinase interage com a molécula de inibidor de quinase candidata; e (d) determinar se a quinase tem atividade na presença da molécula de inibidor de quinase candidata.

(33.) Um arranjo para sequenciar um biopolímero, conforme descrito no presente documento. (34.) Um arranjo para sequenciar o DNA, conforme descrito no presente documento. (35.) Um arranjo para sequenciar o DNA, que compreende: uma disposição de uma pluralidade de dispositivos, em que cada dispositivo compreende: (a) um substrato dielétrico; (b) um primeiro eletrodo disposto sobre o substrato dielétrico; (c) uma camada dielétrica isolante disposta no primeiro eletrodo; (d) um segundo eletrodo disposto na camada dielétrica isolante; (e) uma camada de passivação disposta no segundo eletrodo; e (f) uma molécula de polimerase fixada ao primeiro e ao segundo eletrodos, em que o primeiro eletrodo, a camada dielétrica isolante, o segundo eletrodo e a camada de passivação têm uma abertura formada através dos mesmos. (36.) Um arranjo para sequenciar o DNA, que compreende: uma disposição de uma pluralidade de dispositivos, em que o dispositivo compreende: (a) um substrato dielétrico; (b) um primeiro eletrodo disposto sobre o substrato dielétrico; (c) um segundo eletrodo disposto sobre o substrato dielétrico; (d) uma camada de passivação disposta no topo dos eletrodos; e (e) uma molécula de polimerase ligada a um ou a ambos os eletrodos; em que a camada de passivação tem uma abertura formada através dos mesmos. (37.) Um arranjo para sequenciar o DNA, que compreende: uma disposição de uma pluralidade de dispositivos, em que o dispositivo compreende: (a) um primeiro e um segundo eletrodos, sendo que o primeiro e o segundo eletrodos são separados por um vão e se encontram em um plano em conjunto com o segundo eletrodo; (b) uma polimerase fixada a pelo menos um eletrodo; em que o primeiro eletrodo e os segundos eletrodos são configurados para entrar em contato com uma amostra a ser analisada. (38.) O arranjo de qualquer um dos mencionados acima (33.) a (37.), em que a disposição é uma grade. (39.) Um sistema de medição direta da atividade da polimerase que compreende: (a) um arranjo, conforme descrito no presente documento; b) opcionalmente, um meio de introdução e remoção de uma solução para o arranjo; (c) um meio de aplicação de uma plarização entre o primeiro e o segundo eletrodos; e (d) um meio de monitoramento da corrente gerada entre o primeiro e o segundo eletrodos. (40.) Um método para sequenciar o DNA, sendo que o método compreende: (a) introduzir uma solução que compreende um modelo de DNA em um sistema, conforme descrito no presente documento; (b) medir uma primeira corrente gerada, quando uma polarização é aplicada a um sistema, conforme descrito no presente documento; (c) introduzir uma solução que compreende um dNTP no sistema em condições que permitam a incorporação do dNTP complementar ao modelo de DNA; (d) medir uma segunda corrente gerada na etapa (c); (e) remover a solução que compreende dNTP não incorporado; (f) repetir as etapas (c) a (e) com cada um dos três tipos restantes de dNTP não usados na etapa (c); e (g) repetir as etapas (c) a (f);

em que o DNA é sequenciado a partir dos sinais de corrente gerados. (41.) Um método para sequenciar o DNA, sendo que o método compreende: (a) introduzir uma solução que compreende um modelo de DNA em um sistema, conforme descrito no presente documento; (b) medir uma primeira corrente gerada, quando uma polarização é aplicada a um sistema, conforme descrito no presente documento; c) introduzir no sistema uma solução que compreende, pelo menos, dois tipos de dNTP, em condições que permitam a incorporação do dNTP complementar ao modelo de DNA, em que os tipos de dNTPs estão presentes na solução em diferentes concentrações; (d) medir uma segunda corrente gerada na etapa (b); (e) remover a solução que compreende os dNTPs não incorporados; (f) repetir as etapas (c) a (e) com os tipos restantes de dNTPs não usados na etapa (c); e (g) repetir as etapas (c) a (f); em que o DNA é sequenciado a partir dos sinais de corrente gerados. (42.) O método citado acima (41.), em que a solução na etapa (c) compreende quatro tipos de dNTPs. (43.) O método citado acima (41.), em que a solução na etapa (c) compreende pelo menos dois tipos de dNTPs.

DEFINIÇÕES

[053] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que os comumente compreendidos por uma pessoa de habilidade comum na técnica a que esta invenção pertence. Embora os métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos no presente documento possam ser usados na prática ou em teste da presente revelação, os métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes. Todas as publicações, patentes e outros documentos mencionados no presente documento são incorporados a título de referência, em sua totalidade.

[054] Ao longo deste relatório descritivo, a palavra “compreender” ou variações como “compreende” ou “que compreende” será entendida como implicando a inclusão de um número inteiro ou de grupos de números inteiros declarados, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros.

[055] O termo “o/a” ou “um/uma” pode significar mais de um item.

[056] Os termos “e” e “ou” podem se referir à conjuntiva ou disjuntiva e significar “e/ou”.

[057] O termo “cerca de” significa dentro de mais ou menos 10% de um valor declarado. Por exemplo, “cerca de 100” referir-se-ia a qualquer número entre 90 e

110.

[058] O termo “nucleotídeo” se refere a uma combinação fosfato de base açúcar e inclui trifosfatos de ribonucleosídeos ATP, UTP, CTG, GTP e trifosfatos de desoxirribonucleosídeos, tais como dATP, dCTP, DITP, dUTP, dGTP, dTTp ou seus derivados.

DISPOSITIVO E SISTEMA PARA MEDIÇÃO DIRETA DA ATIVIDADE PROTEICA

[059] A presente revelação fornece um dispositivo para medição direta da atividade proteica. Em uma modalidade, o dispositivo compreende um primeiro e um segundo eletrodos, sendo que o primeiro e segundo eletrodos são separados por um vão; e uma proteína fixada a um ou ambos os eletrodos; em que o primeiro eletrodo e o segundo eletrodo têm uma abertura formada através dos mesmos.

[060] Em uma outra modalidade, o dispositivo compreende um primeiro e um segundo eletrodos, sendo que o primeiro e segundo eletrodos são separados por um vão; e uma proteína fixada a um ou ambos os eletrodos.

[061] Em algumas modalidades, o dispositivo compreende: (a) um substrato dielétrico; (b) um primeiro eletrodo disposto sobre o substrato dielétrico;

(c) uma camada dielétrica isolante disposta no primeiro eletrodo; (d) um segundo eletrodo disposto na camada dielétrica isolante; (e) uma camada de passivação disposta no segundo eletrodo; (f) uma proteína fixada a um ou a ambos os eletrodos; em que o primeiro eletrodo, a camada dielétrica isolante, o segundo eletrodo e a camada de passivação têm uma abertura formada através dos mesmos.

[062] Em algumas modalidades, o dispositivo compreende: (a) um substrato dielétrico; (b) um primeiro eletrodo disposto sobre o substrato dielétrico; (c) um segundo eletrodo disposto na camada dielétrica isolante; (d) uma camada de passivação disposta no topo dos eletrodos; e (e) uma proteína fixada a um ou a ambos os eletrodos; em que a camada de passivação tem uma abertura formada através dos mesmos.

[063] Em algumas modalidades, o dispositivo compreende: (a) um primeiro e um segundo eletrodos, sendo que o primeiro e o segundo eletrodos são coplanares e separados por um vão e se encontram em um plano em conjunto com o segundo eletrodo; (b) uma proteína ligada a pelo menos um eletrodo; em que o primeiro eletrodo e os segundos eletrodos são configurados para entrar em contato com uma amostra a ser analisada.

[064] Em modalidades nas quais os eletrodos são planares, o dispositivo vantajosamente não exige uma camada dielétrica. Dispositivos que exigem camadas dielétricas podem sofrer de desvantagens. As camadas dielétricas exigem camadas de adesão para aderir aos eletrodos. Essas camadas de adesão podem oxidar mediante exposição ao ar, o que, de fato, aumenta o tamanho do vão entre os eletrodos. Para compensar este efeito, a camada dielétrica pode se tornar mais fina. No entanto, uma camada dielétrica fina é suscetível a furos, que podem ser difíceis de eliminar.

[065] Em cada uma das modalidades do dispositivo, descritas no presente documento, a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em uma polimerase, uma nuclease, um proteassoma, uma glicopeptidase, uma glicosidase, uma quinase e uma endonuclease.

[066] A proteína pode ser fixada a um eletrodo direta ou indiretamente. Em algumas modalidades, a proteína é fixada ao eletrodo através de um ligante. Em algumas modalidades, a proteína é fixada ao eletrodo indiretamente, através de interações com um ligante ligado ao eletrodo. Em algumas modalidades, a proteína é modificada para incorporar um sítio de ligação ao ligante.

[067] Em uma modalidade, o dispositivo compreende: um primeiro e um segundo eletrodos, sendo que o primeiro e segundo eletrodos são separados por um vão; uma polimerase fixada a um ou ambos os eletrodos; em que o primeiro eletrodo e o segundo eletrodos têm uma abertura formada através dos mesmos.

[068] Em algumas modalidades, a polimerase é fixada a um eletrodo. Em alguns aspectos desta modalidade, a polimerase é fixada ao eletrodo, através de um ligante. Em alguns aspectos, a polimerase é uma polimerase biotinilada. Em alguns aspectos, a polimerase é uma polimerase biotinilada e é fixada ao eletrodo por meio da estreptavidina.

[069] Em cada uma das modalidades do dispositivo descritas no presente documento, o primeiro e/ou segundo eletrodos compreendem um metal selecionado a partir do grupo que consiste em ouro, platina, paládio, e rutênio. Em algumas modalidades, o metal é paládio.

[070] Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 1,0 nm a cerca de 20,0 nm. Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 1,0 nm a cerca de 10,0 nm. Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 1,0 nm a cerca de 7,5 nm. Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 1,0 nm a cerca de 5,0 nm. Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 4,0 nm a cerca de 5,0 nm.

[071] Em algumas modalidades, o dispositivo pode ser usado para detectar uma única molécula.

[072] A presente revelação também fornece um sistema de medição direta da atividade proteica. O sistema compreende um dispositivo, conforme descrito no presente documento; um meio de introdução de uma entidade química com capacidade de interagir com a proteína; um meio de aplicação de uma polarização entre o primeiro e o segundo eletrodos; e um meio de monitoramento da corrente gerada entre o primeiro e o segundo eletrodos, à medida que a entidade química interage com a proteína.

[073] Em cada uma das modalidades do sistema descritas no presente documento, a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em uma polimerase, uma nuclease, um proteassoma, uma glicopeptidase, uma glicosidase, uma quinase e uma endonuclease. Em uma modalidade, a proteína é uma polimerase.

[074] Quando a proteína é uma polimerase, a polimerase é fixada a um eletrodo, ou, de preferência, a ambos os eletrodos. Em alguns aspectos desta modalidade, a polimerase é fixada aos eletrodos através de um ou mais ligantes. Em alguns aspectos, a polimerase é uma polimerase biotinilada. Em alguns aspectos, a polimerase é uma polimerase biotinilada e é fixada ao eletrodo por meio da estreptavidina.

[075] Em cada uma das modalidades do sistema descritas no presente documento, o primeiro e/ou segundo eletrodos compreendem um metal selecionado a partir do grupo que consiste em ouro, platina, paládio, e rutênio. Em algumas modalidades, o metal é paládio.

[076] Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 1,0 nm a cerca de 20,0 nm. Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 1,0 nm a cerca de 10,0 nm. Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 1,0 nm a cerca de 7,5 nm. Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 1,0 nm a cerca de 5,0 nm. Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 4,0 nm a cerca de 5,0 nm.

[077] A Figura 4 mostra um diagrama esquemático de um sistema, de acordo com uma modalidade da revelação. Uma molécula de proteína 51 é modificada covalentemente em determinados sítios 53 e 54. Tais sítios podem ser resíduos de cisteína superficial modificados por reação com uma maleimida, resíduos de lisina modificados por meio de um éster NHS ou a inserção de um marcador de histidina no terminal N ou C da proteína, para ligar o ácido nitrilotriacético, ou por biotinilação da proteína e fixação por meio de moléculas de estreptavidina tiolada fixadas aos eletrodos. Outros meios de fixação, como marcadores Myc ou marcadores GST, podem ser usados, conforme é bem conhecido na técnica. Os aspectos críticos e únicos do projeto desta modalidade são que a proteína, em si, é usada como o detector, para cuja extremidade, amarras químicas fortes e permanentes sejam usadas para fixar a proteína aos eletrodos. Os sítios modificados são acoplados a ligantes flexíveis, que podem ser oligômeros de alcano curtos (1 a 10 repetições) ou oligômeros de polietilenoglicol ou cadeias curtas de peptídeos incorporadas à proteína recombinantemente. Estes são, por sua vez, terminados por grupos reativos 56 que amarram as moléculas de ligantes aos eletrodos metálicos 57 e 58. Embora uma variedade de ligações sejam possíveis, as ligações de tiol são preferenciais, e as aminas também podem ser usadas, bem como as ligações de biotina-estreptavidina. Uma polarização 59 é aplicada entre os dois eletrodos, e a corrente que passa entre os eletrodos é monitorada 60. O sistema é imerso em uma solução de tampão que contém íons necessários para a função enzimática, e são registrados os efeitos da introdução da entidade química 61 (como um substrato para a enzima, e/ou um fármaco).

[078] A base da presente revelação se situa em uma observação notavelmente inesperada e muito recente sobre o comportamento de uma proteína em um vão grande (aproximadamente 4,5 nm), quando a proteína é fortemente amarrada a dois eletrodos, conforme descrito acima. Foi constatado que, abaixo da tensão de polarização crítica anteriormente relatada para o início dos sinais de ruído telegráfico, é encontrada uma resposta linear simples (Ohmic). Isso é completamente inesperado devido ao fato de que se acredita que as proteínas sejam sólidos moleculares, nos quais o modo de transporte de elétrons deve ser apenas um tunelamento. No entanto, o tunelamento não pode levar em conta as grandes correntes com tensões de corrente lineares observadas quando as proteínas são amarradas da maneira descrita na Figura 4. Um exemplo de uma curva típica de tensão de corrente medida em uma única molécula de proteína é mostrado na Figura 5. Grandes flutuações de ruído são observadas acima de cerca de ±100 mV, conforme relatado anteriormente, mas abaixo de ± 100 mV (área em caixa rotulada 71 na Figura 5A) há uma região linear que implica uma condutância de CC notavelmente alta para a proteína, mesmo sobre essa grande distância (4,5 nm). Quando essa região linear é ajustada, e uma distribuição de condutâncias ajustadas é obtida, a distribuição de condutância pode ser ajustada por uma distribuição exponencial, conforme mostrado na Figura 5B (linha sólida é o ajuste). Deve-se observar que, nesse caso, a condutância média, K, tem um valor de 1,5 nS.

[079] Uma maior coleta de medições revela uma distribuição mais complexa das condutâncias, conforme mostrado na Figura 13. Esta figura representa graficamente histogramas da frequência de uma determinada condutância versus condutância para uma série de proteínas acopladas aos eletrodos por vários meios. A escala de condutância é logarítmica (base 10) e os picos que são ajustados, conforme mostrado pelas linhas, são gaussianos, de modo que essas condutâncias são distribuídas de acordo com uma distribuição log-normal. (As distribuições foram arbitrariamente deslocadas verticalmente a título de clareza.) As proteínas são amarradas aos eletrodos ligando-se a um ligante específico para uma proteína particular ou, no caso da estreptavidina, através de ligações de tiol. Os ligantes foram quimicamente fixados aos eletrodos por meio de ligações de tiol (cisteína). As várias proteínas, seus ligantes, a constante de dissociação para o complexo de proteína e ligante, os controles usados para verificar a ligação específica, e os valores de picos de condutância obtidos por ajuste das distribuições estão listados na Tabela 1.

Proteína Ligante KD Controle Condutância máxima (nS) IgE Anti-DNP Dinitrofenol 65 nM Isotipo IgE 0,266; 1,95 Tiolatado IgG Anti-HIV CHNTPVYKLDIS 240 nM Isotipo IgG 0,334; 2,21

EATQV IgG Anti-Ébola CALDRWEKIRLR 1.400 nM Isotipo IgG 0,260; 2,09 aVb3Integrina RGD-C cíclico ~10 nM a4b1Integrina 0,341 Tio- NA NA Adicionar 0,336 Estreptavidina Biotina TABELA 1: PROTEÍNAS USADAS NO ESTUDO DE CONDUTÂNCIA

[080] Não foi observada condutância, quando os eletrodos foram expostos às moléculas de controle listadas, o que mostra que a amarração química específica da proteína aos eletrodos é necessária para que a condutância eletrônica seja observada.

[081] No caso dos três anticorpos, estão disponíveis dois sítios de ligação, um em cada um dos dois domínios de ligação, separados por 13 nm. Como consequência, um segundo pico de condutância maior é observado nas distribuições para essas três moléculas. Isso produz o segundo pico de condutância listado para essas moléculas na Tabela 1. Consequentemente, a alta condutância pode ser obtida em longas distâncias (13 nm), se as proteínas estiverem quimicamente amarradas a ambos os eletrodos.

[082] Esse limiar para o início de flutuações direcionadas por tensão de cerca de 100 mV foi encontrado para um número de proteínas estudadas até o momento. Desse modo, operando-se a junção abaixo desse limiar para o início das flutuações espontâneas (ou seja, V < VC na Figura 4 , em que VC é cerca de 100 mV), uma corrente CC serve para indicar que uma proteína está presa em seu estado quiescente. Esse sinal é bastante grande: em média, 75 pA, em polarização de 50 mV, apenas para o exemplo fornecido, e substancialmente mais, se a proteína for quimicamente amarrada, de modo a fazer uma ponte com o vão do eletrodo.

[083] As flutuações de proteínas abrem canais adicionais para o transporte de elétrons. Desse modo, quando uma proteína é tendenciosa abaixo de VC, mas estimulada pela introdução de uma molécula de substrato, grandes flutuações de corrente podem ocorrer. Um exemplo dos sinais atuais induzidos por flutuações de proteína é mostrado na Figura 6. Deve-se observar o sinal grandemente melhorado 82 para ruído 81, em comparação com o mostrado na Figura 2C. Um outro exemplo de flutuações proteicas induzidas é fornecido na Figura 12. Isso mostra os dados coletados por uma sonda STM, mantida a uma altura constante de 3,5 ou 4,5 nm acima de uma monocamada de polimerase phi29, acoplada a um eletrodo de paládio, através de moléculas de estreptavidina tioladas ligadas ao N-terminal biotiniladas ligadas à superfície do eletrodo. Os painéis A, B e C mostram as flutuações na corrente que ocorrem como resultado de flutuações no ponto de contato com a polimerase. Ao longo do tempo (inserções à direita), isso pode levar a grandes alterações na corrente, mas o ruído telegráfico em escala de tempo, em ms, não é observado se a polarização estiver abaixo de VC. Os traços de tempo atual expandido à esquerda são obtidos das regiões atuais de pico (circuladas em vermelho nas inserções de plotagens de escala de longo período à direita). Quando iniciados, são adisionados o modelo de DNA de cadeia única e dNTPs, é induzido o ruído telegráfico em escala de tempo, em ms, conforme mostrado nos painéis D, E e F.

[084] Os sinais mostrados na Figura 12 foram obtidos com um único ponto de fixação química para a polimerase. Em consequência, a conexão ao segundo eletrodo é altamente variável, conforme mostrado pelas flutuações de corrente nas Figuras 12 A, B e C. Outra desvantagem importante de um único contato químico é o mau desempenho do contato físico entre a proteína e o segundo eletrodo. Isso é ilustrado na Figura 14. Isso mostra as distribuições de condutância medidas sobre uma monocamada de streptavidina (lado esquerdo) e sobre a mesma monocamada, após a ligação da polimerase phi29 biotinilada (lado direito), à medida que o vão do eletrodo aumenta em 1 nm para valores de vão, conforme marcado (as curvas de distribuição são deslocadas verticalmente, a título de maior clareza). Para o caso da estreptavidina, muito poucas curvas são registradas a uma distância de vão de 3,5 nm. Para o caso em que phi29 está ligado à estreptavidina, as curvas são registradas a 4,5 nm (com alguns registros em 5,5 nm - não mostrados). No entanto, isso é substancialmente menor do que a altura total do complexo de polimerase e estreptavidina de cerca de 9 nm (mostrado na inserção). Isso está em nítido contraste com os dados de anticorpos mostrados na Figura 13, em que as altas condutâncias foram obtidas ao longo do trajeto de 13 nm que separa os dois domínios de ligação. Isso demonstra o desejo de formar dois contatos quimicamente bem definidos, um para cada eletrodo no par.

MÉTODOS DE CRIAÇÃO DE UM DISPOSITIVO DA REVELAÇÃO

[085] Um dispositivo da revelação pode ser facilmente fabricado depositando-se uma camada de um metal nobre, como Au, Pt ou Pd, em uma pastilha de silício, vidro ou safira (ou outro substrato dielétrico), em seguinda, depositando-se uma camada fina (tipicamente 1 nm) de um metal reativo para adesão (como cromo ou titânio) e, em seguida, uma camada de 1 a 10, ou 1 a 20 ou 1 a 50 nm do metal nobre. Esse eletrodo inferior é coberto com uma camada dielétrica isolante, de preferência, alumina, embora outros óxidos, como SiO2 ou óxido de háfnio possam ser usados. A camada deve estar entre 2 e 10 nm de espessura. Uma camada de 2 nm pode ser depositada revestindo-se o eletrodo de metal nobre inferior com 1 a 1,5 nm de alumínio, e permitindo-se que o mesmo se oxide no ar, produzindo, desse modo, uma camada grossa de 2 a 3 nm de Al2O3. Se for necessária uma maior espessura do dielétrico, mais Al2O3pode ser adicionado por deposição de camada atômica, com ciclos de água/ trimetilalumínio, conforme é bem conhecido na técnica.

[086] Um segundo eletrodo de metal nobre, então, é depositado, novamente com uso de uma camada fina de adesão (cromo ou titânio), mas de um máximo de 1 nm, de modo a não alterar significativamente o vão apresentado na borda do dispositivo em que essa camada de adesão se oxidará.

[087] Por fim, uma camada de passivação é colocada em cima do eletrodo superior. Isso pode ser alumina, SiO2, óxido de háfnio ou um material resistente, como PMMA ou SU8.

[088] Para tornar uma cavidade pequena o suficiente para garantir que a área exposta do eletrodo seja tal que apenas uma polimerase esteja conectada, uma pequena abertura é feita com uso de Corrosão por Íon Reativo (RIE), conforme é bem conhecido na técnica. Essa abertura pode ser entre 10 e 500 nm de diâmetro, de preferência, cerca de 50 nm. A profundidade da abertura deve ser grande o suficiente para que a mesma corte a camada de passivação, o eletrodo superior, a camada dielétrica que separa os eletrodos e no eletrodo inferior.

[089] Uma segunda maneira de limitar a quantidade de área exposta do eletrodo é tornar um dos eletrodos (superior ou inferior, de preferência, o topo) um fio fino de 50 a 100 nm de largura. A abertura RIE pode, então, ser muito maior (por exemplo, com tamanho mícron que permita litografia convencional) devido ao fato de que o eletrodo exposto será limitado pela pequena largura do eletrodo.

[090] Uma terceira maneira é controlar a química da funcionalização controlando- se a quantidade de tempo que a junção é exposta às moléculas de polimerase e/ou à concentração de polimerase. O carregamento de cada junção pode ser testado monitorando-se o ruído telegráfico que é induzido por flutuações de contato, quando a polarização aplicada está acima de 100 mV. A presença de 2 níveis de sinal indica que apenas uma única molécula está presa. A presença de três níveis indica que duas moléculas estão presas, e assim por diante. Dessa forma, a concentração e o tempo de exposição podem ser ajustados por um carregamento ideal de Poisson, em que cerca de 30% dos sítios unicamente ocupados.

[091] Após a limpeza com um plasma de oxigênio, a área exposta dos eletrodos, na abertura, pode ser funcionalizada com proteína. Isso pode ser diretamente, com uso dos tióis nativos na superfície da proteína, ou através de modificações químicas que fixam os grupos sulfidrila à proteína, ou indiretamente, fixando-se uma estreptavidina tiolada e, em seguida, capturando-se uma proteína biotinilada.

[092] Uma segunda abordagem para produzir o dispositivo é formar os dois eletrodos no mesmo plano, com um pequeno vão entre os mesmos. Isso pode ser feito abrindo-se uma trincheira através de um único fio, com uso de litografia de feixe eletrônico e suspensão ou Corrosão por Íon Reativo (RIE), como é bem conhecido na técnica. Outras abordagens devem usar moagem de íons de hélio, ou deposição angulada de metal sobre uma borda da etapa, para que um vão seja formado naturalmente. O par de eletrodos são, então, cobertos com uma camada de passivação e uma abertura formada por RIE, de modo que o vão do eletrodo seja exposto. Os eletrodos podem, então, ser funcionalizados, conforme descrito acima.

[093] A largura dos eletrodos expostos é importante, devido ao fato de que os dispositivos descritos no presente documento, em geral, dependem da conexão a apenas uma molécula. No caso de extrair informações de sequência, essa exigência de um único sinal de molécula é particularmente importante. Se os eletrodos não são muito mais largos do que uma única molécula (5 a 15 nm), então, a fixação de múltiplas moléculas, através do vão, não é possível. No entanto, a funcionalização e a fabricação confiáveis de tais eletrodos pequenos são muito difíceis. Na prática, foi constatado que que os eletrodos de até 100 nm de largura não são suscetíveis à captura de mais de uma molécula de proteína. Em particular, quando a probabilidade de ligação na configuração desejada (ponte) é pequena, pode até ser desejável ter eletrodos ainda mais largos, de 200, 300, 400, 500 ou mesmo 1.000 nm de largura. As moléculas de proteína que estão ligadas a apenas um eletrodo, em vez de fazer uma ponte sobre o par de eletrodos, contribuirão relativamente para pequenas quantidades de corrente.

MÉTODOS DE FIXAÇÃO DE UMA POLIMERASE AOS ELETRODOS

[094] Quando a proteína é uma polimerase, deve ser uma polimerase com alta processividade, como a polimerase phi29, e sua função exonuclease deve ser desativada, conforme descrito abaixo.

[095] A polimerase de tipo selvagem (WT) exige modificação para (a) remover a sua atividade exonuclease e (b) adicionar um ponto de fixação química, se assim for desejado. Essa modificação é obtida pelo DNA recombinante com uso de um sistema de expressão de E. coli para produzir a polimerase modificada.

[096] A atividade da exonuclease do phi29 exige os seguintes aminoácidos ácidos: D12, E14, D66 e D169. A mutação de qualquer um dos mesmos eliminará a atividade da exonuclease, e D12 e E14 sofreram mutação para alanina.

[097] O clone usado tem tanto o his-tag quanto o avitag (para biotinilação) no N- terminal, ou seja, His-Avitag-Phi29. Como resultado, a seguinte sequência foi adicionada ao N-terminal da enzima: MGSSHHHHHHSSGLVPRGSGLNDIFEAQKIEWHEGASS.

[098] Os seis resíduos de histidina são o seu marcador (usado para purificação do produto enzimático desejado) e o GLNDIFEAQKIEWHE é o Avitag. A biotina é fixada ao K no avitag pela biotina ligase BirA (Avidity, Lansing, MI). Os ensaios de atividade mostram que a enzima biotinilada ligada à estreptavidina ainda está ativa (Figura 8B).

[099] Outro recurso útil e inesperado da presente revelação é que tanto a estreptavidina quanto a polimerase são proteínas condutoras, portanto, conforme mostrado abaixo, a polimerase pode ser fixada ao eletrodo indiretamente. Primeiro, uma estreptavidina modificada com tióis é fixada ao eletrodo e, em seguida, a polimerase biotinilada introduzida. Isso se liga à estreptavidina, o que fornece um trajeto condutor para o eletrodo.

[0100] A polimerase também pode ser modificada no C-terminal pelos mesmos métodos recombinantes. Além da avitag, outros marcadores de ligação baseados em peptídeos podem ser usados, como marcadores GST, marcadores Myc e marcadores His. Todos esses marcadores podem ser incorporados ao N- ou C-terminal da polimerase. A incorporação no C-terminal coloca o sítio de marcador perto do sítio em que um modelo iniciado é capturado, de modo que as sequências espaçadoras de oligoalanina ou glicina-glicina-serina possam ser incorporadas entre o C-terminal e o marcador para reduzir a interferência no modelo de atividade de captura da polimerase.

[0101] A mesma tecnologia também pode ser usada para fixar outras proteínas, cuja atividade deve ser monitorada com uso dos métodos da presente revelação (como quinases, proteases ou moléculas que processam glicanos).

[0102] Além da modificação nos N-ou C-terminais, existem sete cisteínas em phi29. Nenhuma é dissulfureto ligado, então todas têm o potencial de formar ligações de dissulfeto, o que oferecendo sítios adicionais para fixação aos eletrodos. Com base na estrutura de phi29, com modelo e iniciador C448, C106 e C22, são mais expostos à superfície e parecem bons candidatos para biotinilação através de maleimida ou ligação direta a metais pesados que ligam grupos sulfidrila. O problema é como controlar a especificidade. Houve uma tentativa de provocar mutação em tudo, de uma vez, menos em uma cisteína, mas o resultado é proteína insolúvel. No entanto, até quatro podem ser removidos, sem afetar a solubilidade, o que deixa C448, C106 e C22 como alvos para pontos de fixação.

[0103] Embora a presente revelação funcione com apenas um sítio de fixação química a um eletrodo, sendo que o segundo contato é feito pelo contato físico entre a proteína e o metal, é desejável fazer dois contatos quimicamente bem definidos, de forma que abranja o vão entre os dois eletrodos. O C-terminal é separado do N- terminal por uma distância de ~ 5 nm, e se a biotinilação através de um avitag for usada, é improvável a fixação à mesma molécula de estreptavidina pelo N- e C- terminais da mesma polimerase. Desse modo, com ambos os eletrodos funcionalizados com tio-estreptavidina, há uma oportunidade para formar pontes de estruturas nas quais o N-terminal é conectado a um eletrodo e o C-terminal ao segundo eletrodo.

[0104] Outra abordagem é usar dois pontos de fixação que são amplamente espaçados, mas em uma região inativa da proteína. No caso da polimerase phi29, em que o domínio exonuclease foi desativado por mutações de D12 e E14, dois pontos no domínio exonuclease espaçados por > 5 nm são encontrados entre G111 e K112, e entre E279 e D280. Consequentemente, com a sequência de Avitag

GLNDIFEAQKIEWHE inserida nesses dois pontos, e a lisina Avitag biotinilada pelo BirA, a polimerase pode ser ligada através de um par de eletrodos, conforme mostrado na Figura 15. Isso mostra uma polimerase phi29 1501 que é biotinilada com uso do lugar de Avitags entre G111 e K112, e entre E279 e D280 (1502 e 1503 ). Essas biotinas ligam as moléculas de estreptavidina tioladas 1504 e 1505, que são fixadas através das ligações de enxofre 1506 e 1507 aos eletrodos 1508 e 1509. Uma vez que o vão entre esses pontos de fixação (seta de cabeça dupla na Figura 15) tem um pouco mais de 5 nm, essa geometria de fixação exige um vão de 1510de um pouco abaixo de 5 nm.

REALIZAÇÃO DE CONTATOS DETERMINÍSTICOS ENTRE POLIMERASES E ELETRODOS ADICIONANDO-SE “BIGODES CONDUTORES” À POLIMERASE.

[0105] No N-terminal, adicione recombinantemente:

CGSSHHHHHHSSFTLIELLIVVAIIGILAAIAIPQFSAYRVKAYNSAASSDRL NLKTALESAFADDQTYPPESGLVPRGSGASS-f29

[0106] O C-terminal é a cisteína para fixação ao primeiro eletrodo.

[0107] O marcador his é para extração e purificação de proteínas.

[0108] A sequência de aminoácidos 61, após SS, é a sequência da proteína pilus de geobacter sulferreductans, que atua como um fio metálico.

[0109] No C-término, adicione recombinantemente: f29-

AAFTLIELLIVVAIIGILAAIAIPQFSAYRVKAYNSAASSDRLNLKTALESAFADDQTYPP ESC

[0110] A sequência de aminoácidos 61, após AA, é a sequência da proteína pilus de geobacter sulferreductans.

[0111] O C-terminal é a cisteína para fixação ao primeiro eletrodo.

CONDUTIVIDADE DO COMPLEXO

[0112] A chave para a presente revelação é que uma boa condutância eletrônica pode ser obtida através da polimerase. A Figura 9 mostra (painel esquerdo) uma distribuição das condutâncias através da estreptavidina conectada ao substrato através de ligações tiol. Esses dados foram obtidos com um vão de eletrodo de 2,5 nm. Se o vão aumentar para 3,5 nm, muito poucas leituras ocorrerão. Se o vão aumentar adicionalmente para 4,5 nm, nenhuma leitura será obtida. Isso está de acordo com o fato de que uma molécula de estreptavidina, que se situa de forma plana na superfície, tem cerca de 4 nm de altura. O lado direito da Figura 9 mostra dados de um complexo de polimerase phi29 biotinilada com estreptavidina em um eletrodo Pd. Esses dados foram obtidos com um tamanho de vão de 3,5 nm. Os dados semelhantes foram registrados em um tamanho de vão de 4,5 nm para o complexo (um vão no qual nenhuma condutância foi registrada para a estreptavidina). Uma vez que essas distâncias são maiores do que os vãos em que a estreptavidina sozinha forneceu sinais robustos, é mostrado que a condução está ocorrendo através da polimerase conectada em série com a estreptavidina. Deve-se observar como a distribuição de condutâncias é alterada no complexo, em comparação com a estreptavidina sozinha.

ALTERAÇÕES DE CONDUTIVIDADE COM CONFORMAÇÃO

[0113] A Figura 10 mostra uma distribuição medida das condutâncias para estreptavidina isolada (painel esquerdo) e estreptavidina após exposição à biotina. A distribuição das condutâncias medidas se altera após a estreptavidina ligar-se à biotina, o que mostra que a condutância da proteína é sensível às alterações na conformação protéica.

MONITORAMENTO DINÂMICO DE CONFORMAÇÃO PROTEICA

[0114] A Figura 11 mostra um registro de flutuações conformacionais induzidas por tensão registradas (painel esquerdo) com um microscópio de varredura de tunelamento e (painel direito) com um chip de estado sólido com uso de um vão de 4,5 nm. A polarização foi de 200 mV, 100 mV acima de VC. A proteína é um dinitrofenol de ligação à molécula anti-dinitrofenol (DNP) ligada aos eletrodos. As mudanças muito grandes na condutância na escala de tempo de milissegundo são prontamente registradas com excelente razão de sinal para ruído. As Figuras 12D, Ee Fmostram as flutuações na corrente que ocorrem quando a polarização é reduzida abaixo de VC (a 50 mV, nesse caso) e a proteína, ativada pela adição de substrato. O ruído telegráfico é gerado em escalas de tempo em ms, com razão de sinal para ruído muito alta.

MÉTODOS DE USO DOS DISPOSITIVOS E SISTEMAS

[0115] A presente revelação fornece métodos para sequenciar um biopolímero. Isso foi ilustrado para o caso específico de uma cadeia de ácido nucleico que´e estendida por uma polimerase na Figura 7. No presente documento, uma polimerase 96 é modificada em dois pontos 53, 52. Um exemplo específico seria as duas cisteínas expostas à superfície disponíveis na polimerase phi29. Outro exemplo é a funcionalização da biotina mostrada na Figura 15. Os alcanos modificados por maleimida, ou ligantes PEG 54, 55, são usados para fixar a polimerase aos eletrodos 57, 58 através de ligações fortes de tiol (por exemplo) 56. A ligação da polimerase no vão do eletrodo é verificada por meio de uma corrente CC estável 60, quando V < VC

59. Quando a polimerase 96 é complexada com um modelo iniciado 91 e exposta a uma solução que compreende cada um dos quatro trifosfatos nucleotídicos 92 93 94 95, as flutuações características de corrente sinalizarão a incorporação de um determinado nucleotídeo. Em uma modalidade alternativa, as cisteínas de superfície podem ser usadas para produzir uma das fixações diretamente.

[0116] Em uso, uma vez que o dispositivo é preparado, o mesmo deve ser enxaguado e, em seguida, exposto ao DNA do modelo iniciado para ser sequenciado. Esse DNA é preparado a partir da amostra para ser sequenciado ligando-se iniciadores de grampo de cabelo, conforme é bem conhecido na técnica. Uma solução de tampão que compreende os quatro dNTPs e Mg 2+ deve ser introduzida no dispositivo. Os dNTPs estão presentes na solução de tampão em concentração aproximadamente igual. Em uma modalidade, as concentrações de dNTPs são aproximadamente iguais à concentração de saturação de polimerase ligada ao modelo, na saturação de concentração de polimerase ligada ao modelo, em uma segunda modalidade, e acima da concentração de saturação, na terceira modalidade.

Quando as concentrações de dNTPs estão na concentração de saturação ou acima da concentração de saturação, a polimerase funciona rapidamente (isto é, 100 incorporações de nucleotídeos por segundo).

[0117] Quando a solução de tampão que compreende os dNTPs é introduzida no dispositivo, uma reação de polimerização será iniciada, e o modelo capturado será copiado para o iniciador, produzindo-se uma série de picos de corrente. Cada pico (ou aglomerado de picos) ocorre à medida que cada novo nucleotídeo é incorporado ao iniciador, e as características de cada pico (duração, amplitude, forma) são usadas para decodificar a identidade do nucleotídeo que está sendo incorporado. Uma velocidade de sequenciamento típica na concentração de saturação (> 30 μM) de nucleotídeos é de cerca de 100 nucleotídeos por segundo. A concentração de saturação do modelo é de cerca de 10 nM, com um novo modelo incorporado quase imediatamente após a conclusão do modelo anterior. Cada molécula continuará a virar o modelo, desde que haja modelos disponíveis na solução. Por essa razão, uma molécula pode sequenciar continuamente, enquanto o dispositivo for operado.

[0118] A geometria do dispositivo é extremamente simples, sem necessidade de separar compartimentos fluídicos para cada junção, de modo que uma junção ocuparia apenas cerca de um mícron2. Permitindo interconexões, o isolamento e a eletrônica de processamento em chip, um único dispositivo de leitura poderia prontamente ser instalado em uma área de 100 mícrons por 100 mícrons, então uma área de chip ativa de 1 cm2 acomodaria 10.000 dispositivos. Um chip com 10.000 junções em um chip operado por 1 hora sequenciaria um genoma humano inteiro (10.000 x 3.600 x 100 = 3,6 x 109). Uma geometria de dispositivo mais densa ou um chip maior acomodaria até uma fração significativa de dispositivos inativos e ainda permitiria sequenciamento em escala de genoma em um dispositivo pequeno em períodos de uma hora ou menos.

[0119] O exemplo anterior ilustra o sequenciamento de polímeros de ácido nucleico, mas também pode ser aplicado de forma que outras enzimas que processam polímeros pudessem ser usadas. Por exemplo, as flutuações atuais em uma exonuclease refletirão a composição do ácido nucleico que estão se degradando. O mesmo seria verdadeiro dos proteasomas que digerem peptídeos. Um exemplo é o proteassoma 20S CP, e proteassomas como esse poderiam provavelmente ser usados para sequenciamento de peptídeos de molécula única incorporandose os mesmos no sistema da Figura 4 e monitorando-se os sinais elétricos gerados, quando os mesmos são alimentados por moléculas peptídicas e polarizados para serem de baixo VC.

[0120] Enzimas similares, chamadas glicosidases, existem para digerir glicanos. A incorporação de uma glicosidase ao dispositivo da Figura 4 permitiria o sequenciamento eletrônico de glicanos. A variação na ligação de glicanos pode impedir uma leitura linear direta fora da sequência, mas a organização dos eventos de corte no tempo pode permitir a identificação dos glicanos.

[0121] Em mais uma modalidade, a presente revelação fornece um método para detectar a atividade de quinase. Nesta modalidade, uma quinase é incorporada ao dispositivo da Figura 4, exposta ao seu substrato, e a atividade de quinase sinalizada pela geração de grandes flutuações de corrente, quando polarizada abaixo de VC. O sistema poderia, então, ser exposto a fármacos inibidores de quinase candidatos à medida que as flutuações são monitoradas, para constatar quais fármacos “matam” a atividade da quinase. Na presente técnica, o uso de métodos de rotulagem por fluorescência pode interferir em uma enzima proteica que interage com seu substrato, e a presente revelação remove a exigência de rotulagem de proteínas.

[0122] Em todos esses métodos, o uso de uma junção simples (em oposição a uma estrutura FET) tanto simplifica muito a fabricação quanto permite o escalonamento até grandes arranjos paralelos de dispositivos. O dispositivo da revelação pode ser preparado em fabricação maciçamente paralela com uso de métodos para fabricação escalável de dispositivos de junção, conforme descrito abaixo.

ARRANJOS E SISTEMAS PARA SEQUENCIAR DNA OU OUTROS POLÍMEROS

[0123] A presente revelação fornece um arranjo para sequenciar biopolímeros com uso de qualquer uma das enzimas que interagem processivamente com modelos moleculares, como uma nuclease, um proteassoma, uma glicopeptidase, uma glicosidase, uma quinase e uma endonuclease. As modalidades abaixo ilustram um arranjo para sequenciamento de DNA com uso de uma polimerase. Deve ser entendido que qualquer enzima processiva pode ser substituída pela polimerase nos arranjos.

[0124] O arranjo compreende uma disposição de uma pluralidade de dispositivos. O dispositivo usado nos arranjos da presente revelação inclui o seguinte.

[0125] Em uma modalidade, o dispositivo compreende um primeiro e um segundo eletrodo, sendo que o primeiro e o segundo eletrodo são separados por um vão; e uma polimerase fixada a um ou ambos os eletrodos; em que o primeiro eletrodo e o segundo eletrodo têm uma abertura formada através dos mesmos.

[0126] Em outra modalidade, o dispositivo compreende um primeiro e um segundo eletrodo, sendo que o primeiro e o segundo eletrodo são separados por um vão; e uma polimerase fixada tanto ao primeiro quanto ao segundo eletrodo.

[0127] Em algumas modalidades, o dispositivo compreende: (a) um substrato dielétrico; (b) um primeiro eletrodo disposto sobre o substrato dielétrico; (c) uma camada dielétrica isolante disposta no primeiro eletrodo; (d) um segundo eletrodo disposto na camada dielétrica isolante; (e) uma camada de passivação disposta no segundo eletrodo; (f) uma molécula de polimerase ligada ao primeiro e segundo eletrodos; em que o primeiro eletrodo, a camada dielétrica isolante, o segundo eletrodo e a camada de passivação têm uma abertura formada através dos mesmos.

[0128] Em algumas modalidades, o dispositivo compreende: (a) um substrato dielétrico; (b) um primeiro eletrodo disposto sobre o substrato dielétrico; (c) um segundo eletrodo disposto sobre o substrato dielétrico;

(d) uma camada de passivação disposta no topo dos eletrodos; e (e) uma molécula de polimerase ligada a um ou a ambos os eletrodos; em que a camada de passivação tem uma abertura formada através dos mesmos.

[0129] Em algumas modalidades, o dispositivo compreende: (a) um primeiro e um segundo eletrodos, sendo que o primeiro e o segundo eletrodos são coplanares e separados por um vão; (b) uma proteína ligada a pelo menos um eletrodo; em que o primeiro eletrodo e os segundos eletrodos são configurados para entrar em contato com uma amostra a ser analisada.

[0130] Em cada uma das modalidades do dispositivo descritas no presente documento, o primeiro e/ou segundo eletrodos compreendem um metal selecionado a partir do grupo que consiste em ouro, platina, paládio, e rutênio. Em algumas modalidades, o metal é paládio.

[0131] Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 1,0 nm a cerca de 20,0 nm. Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 1,0 nm a cerca de 10,0 nm. Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 1,0 nm a cerca de 7,5 nm. Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 1,0 nm a cerca de 5,0 nm. Em algumas modalidades, o vão tem uma largura de cerca de 4,0 nm a cerca de 5,0 nm.

[0132] O arranjo de dispositivos pode ser disposto de qualquer maneira adequada, por exemplo, em uma grade.

[0133] Em algumas modalidades, o arranjo compreende moléculas de polimerase ligadas ao modelo de DNA. Tais modelos podem ser produzidos ligando-se fragmentos de DNA genômico (gerados por sonicação, por exemplo) com sequências de iniciador que contêm um entalhe para ligação por polimerase, como é bem conhecido na técnica. O resultado é uma biblioteca de modelos que abrange todo um genoma, se necessário. Cada modelo, então, ligará aleatoriamente uma polimerase ao arranjo.

[0134] Em referência, agora, à Figura 16, uma grade de contatos 101, 102é formada a partir de duas camadas de metais de contato separados por um dielétrico, conforme é bem conhecido na técnica, e, em seguida, coberto por uma camada de passivação. Cada interseção é, então, exposta removendo-se seletivamente a passivação, e as moléculas de polimerase 103 ligadas em cada junção. Essas junções biomoleculares podem ser preparadas por métodos discutidos na seção anterior. Ao tornar os eletrodos estreitos o suficiente (cerca de um mícron de largura) geralmente apenas uma polimerase (ou nenhuma) se liga. No caso em que dois ou alguns mais se ligam, os sinais ainda podem ser deconvolvidos devido ao fato de que consistem em dois níveis atuais para uma molécula, três para duas, e assim por diante.

[0135] A presente revelação também fornece um sistema de arranjos para medição direta da atividade da polimerase. O sistema compreende um arranjo, conforme descrito no presente documento; opcionalmente, um meio de introdução e remoção de uma solução no arranjo; um meio de aplicação de uma polarização entre o primeiro e o segundo eletrodos; e um meio de monitoramento da corrente gerada entre o primeiro e o segundo eletrodos.

[0136] Em referência à Figura 16, são fornecidos os meios 106 para aplicar uma pequena polarização (tipicamente 50 mV) e ler a corrente de cada junção, de modo que a mesma possa ser registrada por um sistema de armazenamento de computador.

MÉTODOS PARA SEQUENCIAMENTO DE DNA COM USO DE UM SISTEMA DE ARRANJOS

[0137] A presente revelação também fornece um método para sequenciamento de DNA com uso de um sistema de arranjos, conforme descrito no presente documento.

[0138] O sequenciamento continua introduzindo-se uma solução que compreende um monofosfato de nucleotídeo (por exemplo, um dentre dATp, dGTP, dCTP, dTTP) juntamente com magnésio para o arranjo. Cada polimerase ligada a um nucleotídeo complementar gerará um sinal, que é lido pelo único par de eletrodos aos quais cada polimerase está ligada. Por exemplo, se o nucleotídeo adicionado for dCTP, então,

cada modelo ligado a uma base G incorporará um C na cadeia que se estende, gerando um sinal, enquanto as outras sequências gerarão sinais distintamente diferentes. Por exemplo, uma polimerase apresentada com uma base não correspondente gerará uma breve intermitência de sinal, à medida que a base incorreta é capturada, mas a sequência de sinais terminará prematuramente à medida que a incompatibilidade é rejeitada e o processo de polimerização e translocação é abortado. Em contrapartida, a incorporação de uma base correspondente resulta em uma sequência muito mais longa de pulsos, à medida que o processo de incorporação e translocação é concluído. Conforme a segundo etapa, o arranjo é enxaguado para remover o excesso de nucleotídeo, e uma solução que compreende o próximo nucleotídeo é introduzida (por exemplo dATP, de modo que todo o sítio com um T, agora, gere um sinal). O ciclo continua até que todos os quatro dNTPs tenham sido ciclados através do dispositivo, após o que o ciclo é repetido. Esse ciclo pode ser repetido até que todo o DNA de modelo esteja esgotado, o que gera, desse modo, dados de sequência para toda a biblioteca de fragmentos.

[0139] A Figura 17 mostra um método para sequenciar o DNA. Na adição do dATP ao arranjo 201, a molécula mostrada gerará um sinal 204à medida que o A é incorporado à cadeia que se estende. O arranjo, então, é enxaguado para remover o dATP 202, e o próximo nucleotídeo (mostrado como dTTP no presente documento) adicionou 203. O ciclo continua, conforme mostrado. A adição de dATP, então, dCTP e, em seguida, dATP fornece, todos, sinais de incorporação de base 204, enquanto a presença dos outros nucleotídeos não 205. Por conseguinte, a sequência, nesse local específico, será registrada como TGT.

[0140] Será reconhecido que essa abordagem tem duas principais vantagens sobre as estratégias de sequenciamento atuais que usam ciclagem de dNTPs. Uma delas é que, ao usar uma única molécula de leitura em uma escala de tempo mais rápida do que a taxa de incorporação de base de uma polimerase, torna-se, agora, simples contar as repetições da mesma base. Desse modo, a sequência AAAAA forneceria 5 explosões distintas de sinal na presença de dTTP, e assim por diante. A segunda é que, em contraste com esquemas de leitura óptica conhecidos, o comprimento do modelo lido não é limitado pela distância do substrato de montagem, de modo que o comprimento de leitura potencial seja tão alto quanto a processividade da polimerase (10 kB para phi29).

[0141] A Figura 18 mostra a capacidade de ler incorporações sequenciais individuais e, portanto, ler ensaios homopoliméricos de sequência. Um registro atual versus tempo 300 mostra a incorporação de duas bases sequenciais (no presente documento, os dados elétricos são mostrados para dTTP, que são incorporado em dois sítios A sucessivos). Cada sinal consiste em uma explosão 301 de ruído telegráfico de duração de cerca de 20 ms, separada por vãos entre explosões, também, em média, cerca de 10 a 20 ms, em concentrações micromolares de trifosfato de nucleotídeo. Desse modo, em qualquer etapa fornecida da ciclagem química ilustrada na Figura 17, em que apenas um trifosfato de nucleotídeo está presente, o número de bases repetidas do seu complemento, no filamento de modelo, pode ser contado simplesmente registrando-se o número de tais explosões de ruído telegráfico.

[0142] Em outra modalidade, a solução compreende mais de um dNtP, com os dNTPs presentes em diferentes concentrações. Por exemplo, a solução compreende 1 mM de dATP, 100 µM de dGTP 10 µM de dCTP e 0,1 µM de dTTP. Nesta modalidade, as polimerases no arranjo gerariam sinais continuamente, visto que cada modelo é estendido. Nos pontos em que T está presente no modelo de DNA, o sinal de incorporação seguiria rapidamente a explosão anterior do ruído telegráfico (geralmente dentro de 10 ms). Os DNAs de modelo, em que a base seguinte era um C, mostrariam uma explosão mais atrasada do ruído telegráfico devido à chegada mais lenta do dGTP, devido à sua menor concentração. Da mesma forma, os modelos que contêm um G seriam precedidos por um atraso mais longo devido à concentração ainda menor de dCTP. Os atrasos mais longos precederiam as bases A devido ao fato de que a concentração de dTTP é a mais baixa.

[0143] Ainda, em outra modalidade, as duas abordagens podem ser combinadas,com uso de 2 ciclos de enxágue, com uso de um par de nucleotídeos em concentração desigual no primeiro ciclo, e, em seguida, os outros dois, também em concentração desigual no segundo ciclo.

[0144] Embora a seção anterior descreva métodos de sequenciamento de DNA com uso de um sistema de arranjos que compreendem uma polimerase, o sistema de arranjos pode ser facilmente modificado para sequenciar outros polímeros também.

[0145] Embora a invenção tenha sido descrita e ilustrada nas modalidades ilustrativas anteriores, entende-se que a presente revelação foi produzida apenas a título de exemplo, e que inúmeras alterações nos detalhes da implantação da invenção podem ser feitas, sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Os recursos das modalidades reveladas podem ser combinados e redispostos de várias maneiras. Todas as publicações, patentes e outros documentos mencionados no presente documento são incorporados a título de referência, em sua totalidade.

REFERÊNCIA

[0146] São incorporadas ao presente documento, a título de referência, em sua totalidade, as seguintes referências:

[0147] Chen, Y.-S., C.-H. Lee, M.-Y. Pendurado, H.-A. Pan, J.-C. Chiou e G. S. Huang (2013). "DNA sequencing using electrical conductance measurements of a DNA polymerase." Natureza Nano Tecnologia 8 : páginas 452 a 458.

[0148] Choi, Y., I. S. Moody, P. C. Sims, S. R. Hunt, B. L. Corso, I. Perez, G. A. Weiss e P. G. Collins (2012). "Single-molecule lysozyme dynamics monitored by an electronic circuit." Ciência 335 (6066): páginas 319 a 324.

[0149] Merriman, B. e P. Mola, Biomolecular Sensors and Methods. Número do pedido de patente dos EUA: WO 2016210386A1, 2016

[0150] Olsen, T. J., Y. Choi, P. C. Sims, O. T. Gul, B. L. Corso, C. Dong, W. A. Brown, P. G. Collins e G. A. Weiss (2013). "Electronic measurements of single- molecule processing by DNA polymerase I (Klenow fragment)." J Am Chem Soc 135 (21): páginas 7855 a 7860.

[0151] Zhang, B., W. Song, P. Pang, Y. Zhao, P. Zhang, I. Csabai, G. Vattay e S. Lindsay (2017). "Observation of Giant Conductance Fluctuations in a Protein." Nano

Futures 1 (3).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Dispositivo para medição direta de atividade de proteína, sendo que o dispositivo é caracterizado por compreender: um primeiro eletrodo e um segundo eletrodo, sendo que o primeiro e o segundo eletrodos são separados por um vão; e uma proteína fixada ao primeiro e/ou ao segundo eletrodo por meio de um ligante que compreende pelo menos uma ligação química, em que o ligante é fixado a uma região da proteína que é inativa.

2. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o vão ter uma largura de cerca de 1,0 nm a cerca de 20,0 nm.

3. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o primeiro e o segundo eletrodos serem separados por uma camada dielétrica, sendo que uma camada de passivação é disposta no primeiro e no segundo eletrodos.

4. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a proteína ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma polimerase, uma nuclease, um proteassoma, uma glicopeptidase, uma glicosidase, uma quinase e uma endonuclease.

5. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a proteína ser uma polimerase.

6. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a atividade de exonuclease da polimerase estar desativada.

7. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por o ligante compreender uma ligação química covalente.

8. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por a proteína ser biotinilada.

9. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por o ligante compreender tio-estreptavidina.

10. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por a proteína e o eletrodo serem biotinilados, e sendo que o ligante compreende uma molécula de estreptavidina que compreende pelo menos dois sítios de ligação de biotina.

11. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por o primeiro e/ou o segundo eletrodos compreendem um metal selecionado a partir do grupo que consiste em ouro, platina, paládio e rutênio ou quaisquer combinações dos mesmos.

12. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por a ligação química encontrar-se na região N-terminal da proteína.

13. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a ligação química encontrar-se na região de exonuclease da polimerase.

14. Sistema para medição elétrica direta de atividade de proteína caracterizado por compreender: (a) o dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13; (b) um meio para introduzir uma entidade química que tem capacidade para interagir com a proteína; (c) um meio para aplicar uma polarização de tensão entre o primeiro e o segundo eletrodos, que é de 100 mV ou menos; e (d) um meio para monitorar flutuações que ocorrem à medida que a entidade química interage com a proteína.

15. Método para medição direta de atividade de proteína, sendo que o método é caracterizado por compreender (a) introduzir uma entidade química que tem capacidade para interagir com a proteína em qualquer um dos dispositivos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13; (b) aplicar uma polarização de tensão entre o primeiro e o segundo eletrodos que é de 100 mV ou menos; e (c) observar as flutuações na corrente entre o primeiro e o segundo eletrodos que ocorrem quando a entidade química interage com a proteína.

16. Método para sequenciamento de um biopolímero, sendo que o dito método é caracterizado por compreender: (a) introduzir um biopolímero em qualquer um dos dispositivos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13; (b) aplicar uma polarização de tensão entre o primeiro e o segundo eletrodos que é de 100 mV ou menos; (c) detectar flutuações na corrente entre os dois eletrodos que ocorrem quando um monômero é removido de uma extremidade do biopolímero; e (d) determinar a identidade de cada monômero removido do biopolímero.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o biopolímero ser uma molécula de DNA, uma molécula de RNA, um peptídeo, um polipeptídeo ou um glicano.

18. Método para sequenciamento de um polinucleotídeo, sendo que o dito método é caracterizado por compreender: (a) introduzir um modelo de polinucleotídeo com iniciador em qualquer um dos dispositivos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, sendo que a proteína é uma polimerase, e sendo que a polimerase é ligada ao modelo; (b) introduzir uma solução que compreende dNTPs; (c) aplicar uma polarização de tensão entre o primeiro e o segundo eletrodos que é de 100 mV ou menos; (d) detectar flutuações na corrente entre o primeiro e o segundo eletrodos que ocorrem quando cada dNTP é incorporado como um nucleotídeo adicional complementar a um nucleotídeo correspondente no modelo de polinucleotídeo; e (e) determinar a identidade de cada nucleotídeo adicional que é incorporado.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por cada dNTP estar presente na solução aproximadamente na mesma concentração.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por cada dNTP estar presente a uma concentração que é aproximadamente igual ou superior à concentração de saturação da polimerase ligada ao modelo.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizado por a etapa (d) compreender a detecção da presença de um ou mais picos de corrente.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a etapa (e) compreender o uso das características de cada pico.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado por cada nucleotídeo adicional ser introduzido por vez.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 23, caracterizado por cada dNTP ser introduzido simultaneamente, e sendo que pelo menos um dNTP está presente em uma concentração menor que a dos outros dNTPs.