ES2760501T3 - Sistemas y procedimientos para realización de inmunoensayos - Google Patents

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Yujing Song
Walker M Mchugh
Pengyu Chen
Katsuo Kurabayashi
Timothy T Cornell
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Abstract

Un dispositivo de resonancia de plasmón superficial localizado (LSPR), que comprende: a) un sustrato; b) una matriz de partículas metálicas en el sustrato, en el que la matriz de partículas metálicas comprende nanotubos localizados, nanovarillas metálicas, nanoesferas, nanoestrellas, nanopirámides de nano-rombos, nanobipirámides o nanoanillos y estructuras de caparazón de núcleo metálico dispuestas en bandas u otros patrones regulares en la superficie de dicho sustrato, y en el que la matriz de partículas metálicas se funcionaliza con anticuerpos específicos para al menos un polipéptido; y c) una pluralidad de canales de microfluidos en comunicación de fluido con la matriz, en el que cada canal de microfluidos tiene un puerto de entrada y un puerto de salida y es ortogonal a la matriz de partículas metálicas; y en el que dicho sustrato comprende además una pluralidad de microelectrodos configurados para electroósmosis de CA, en el que dichos microelectrodos están en comunicación operable con dicha matriz de partículas metálicas, y configurado para obtención de imágenes de campo oscuro que escanea la intensidad de la luz de dispersión a través de dicho dispositivo LSPR.

Description

DESCRIPCIÓN
Sistemas y procedimientos para realización de inmunoensayos
La presente solicitud reivindica prioridad para la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos con número de serie 62/116.741 presentada el 16 de febrero de 2015, y la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos con número de serie 62/245.066 presentada el 22 de octubre de 2015.
Declaración con respecto a la investigación o el desarrollo con apoyo federal
La presente invención fue apoyada por la subvención No. 1263889 otorgada por la National Science Foundation. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.
Campo de la divulgación
En el presente documento se proporcionan sistemas y procedimientos para realizar ensayos. En particular, en este documento se proporcionan sistemas y procedimientos para realizar inmunoensayos de alto rendimiento.
Antecedentes
Las citocinas son proteínas bioactivas responsables de la señalización celular y la regulación de la maduración, el crecimiento y la capacidad de respuesta de las células inmunes (Opal, SM y DePalo, VA Chest 117, 1162-1172 (2000); Rothenberg, EV Nat. Immunol. 8, 441-444 (2007)). La cuantificación de citocinas en suero humano proporciona información clínica muy valiosa para controlar el estado inmune de los huéspedes y ajustar las terapias en diferentes condiciones de enfermedades inflamatorias, tales como la sepsis (Damas, P., et al., Crit. Care Med. 25, 405-412 (1997). )), cáncer (Lippitz, BE Lancet Oncol. 14, E218-E228 (2013)), lupus (Maczynska, I., et al., Immunol. Lett. 102, 79-82 (2006)), y enfermedad injerto contra huésped (GVh D) (Visentainer, JEL, et al., Exp. Hematol. 31, 1044-1050 (2003)). Dada la complejidad y la naturaleza dinámica del sistema inmune humano, la detección y la tendencia de las firmas de biomarcadores y los cambios sutiles que ocurren durante un estado de enfermedad requieren un análisis rápido de un panel complejo de múltiples citocinas con alta precisión, sensibilidad y rendimiento. Sin embargo, los procedimientos convencionales basados en inmunoensayos de fluorescencia tipo sándwich no cumplen con esta demanda ya que enfrentan limitaciones estrictas en su implementación práctica en un enfoque de monitoreo inmunológico ideal. Estas limitaciones surgen principalmente debido a la necesidad de múltiples procesos de etiquetado y lavado que consumen mucho tiempo mientras se consume un gran volumen de muestra. En la actualidad, no existe un ensayo que satisfaga todos los requisitos de monitoreo del estado inmune casi en tiempo real que implica el análisis de muestras biológicas complejas.
Se necesitan sistemas y procedimientos para inmunoensayos de alto rendimiento.
Sumario
La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones de la descripción que no entran dentro del alcance de dichas reivindicaciones se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no forman parte de la presente invención. En el presente documento se proporcionan sistemas y procedimientos para realizar ensayos. En particular, en este documento se proporcionan sistemas y procedimientos para realizar inmunoensayos de alto rendimiento.
Las realizaciones de la presente divulgación proporcionan inmunoensayos de LSPR con capacidad múltiple que satisfacen la necesidad de inmunoensayos rápidos (por ejemplo, casi en tiempo real) y precisos (por ejemplo, para su uso junto con los diagnósticos). Los ensayos de LSPR son tan precisos como los ensayos ELISA existentes, pero proporcionan la ventaja de una mayor velocidad y capacidad múltiple. Además, los inmunoensayos de LSPR pueden analizar pequeños volúmenes de muestras complejas de pacientes (por ejemplo, suero).
Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un dispositivo de resonancia de plasmón superficial localizado (LSPR), que comprende: a) una serie de puntos metálicos (por ejemplo, oro u otro metal noble tal como nanovarillas, esferas, pirámides, bipirámides, estrellas u otra formas) localizada en, por ejemplo, sustrato de vidrio o termoplástico, en el que los puntos metálicos comprenden anticuerpos específicos para al menos un polipéptido; y b) una pluralidad de canales de microfluidos en comunicación de fluido con la matriz. En algunas realizaciones, los anticuerpos comprenden una pluralidad (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) de anticuerpos, en las que cada anticuerpo es específico para un polipéptido diferente. En algunas realizaciones, los polipéptidos son citocinas, polipéptidos, anticuerpos o ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, las citocinas se seleccionan de, por ejemplo, interleucina 2 (IL-2); interleucina 4 (IL-4); interleucina 6 (IL-6); interleucina 10 (IL-10); interferón gamma (IFN-y); proteína estimuladora de la acilación del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), adipocina, albinterferón, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24 , CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, factor estimulante de colonias, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCLX, CXCLX, CXCLX, CXCLX CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL9, eritropoyetina, Gc-MAF, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, factor de crecimiento de hepatocitos, IL-17, IL1A, IL1B, inflamasoma, interferoma, interferón, interferón beta 1a, interferón beta 1b, interferón gamma, interferón tipo I, interferón tipo II, interferón tipo III, gen estimulado por interferón, familia de interleucina 1, antagonista del receptor de interleucina 1, interleucina 12, subunidad beta de interleucina 12, interleucina 13, interleucina 16, interleucina 2, interleucina 23, subunidad alfa de interleucina 23, interleucina 34, interleucina 35, interleucina 7 , interleucina 8, interleucina 36, factor inhibidor de la leucemia, factor promotor de leucocitos, linfocina, linfotoxina, linfotoxina alfa, linfotoxina beta, factor estimulante de colonias de macrófagos, proteína inflamatoria de macrófagos, factor activador de macrófagos, monocina, miocina, mionectina, nicotinamida fosforribosiltransferasa, oncostatina M, oprelvecina, factor plaquetario 4, citocina proinflamatoria, promegapoyetina, RANKL, factor 1 derivado de células estromales, talimogén laherparepvec, XCL1, XCL2, XCR1 interleucina 1, antagonista del receptor de interleucina 1, interleucina 2, antagonista del receptor de interleucina 2, interleucina 4, interleucina 6, interleucina 8, interleucina 10, interleucina 12, interleucina 17, interleucina 23, factor de necrosis tumoral alfa, Interferón gamma, Granzima B, HSP1AB, MMP-8, MIP-1a , anticuerpos (por ejemplo, monoclonales o policlonales), ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARNm, miARN, ARNlnc), sondas de ácido nucleico, ligando 3 de quimiocina (motivo c-c) (proteína 1 alfa inflamatoria de macrófagos), matriz de metaloproteinasa 8, o proteína de choque térmico 70 A1B. En algunas realizaciones, los canales de microfluidos son ortogonales al conjunto de partículas metálicas. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende al menos 5 (por ejemplo, 10 o más) canales paralelos de microfluidos. En algunas realizaciones, los canales de microfluidos tienen un volumen de aproximadamente 10 nl a 10 |jl (por ejemplo, 50 a 500 nl). De acuerdo con la invención, cada uno de los canales de microfluidos tiene un puerto de entrada y un puerto de salida. En algunas realizaciones, los canales de microfluidos están construidos de PDMS o termoplástico. En algunas realizaciones, el sustrato comprende al menos 100 (por ejemplo, al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500, al menos 750 o al menos 1000) anticuerpos. En algunas realizaciones, el sustrato se trata con plasma de oxígeno, UV/ozono o silanización. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a dicho sustrato a través de un enlazador (por ejemplo, un enlazadortiol bifuncional C1-C10).
De acuerdo con la invención, el sustrato comprende además una pluralidad de microelectrodos configurados para la electroósmosis de CA, en el que los microelectrodos están en comunicación operable con la matriz de partículas metálicas. En algunas realizaciones, cada una de las matrices de nanopartículas metálicas está en comunicación operable con un par de microelectrodos. En algunas realizaciones, los microelectrodos están configurados para suministrar corriente alterna.
El dispositivo de la invención está configurado para imágenes de campo oscuro que escanea la intensidad de luz de dispersión a través de dicho dispositivo de LSPR. Otras realizaciones proporcionan un sistema, que comprende a) el dispositivo mencionado anteriormente; y b) un aparato de detección de LSPR. En algunas realizaciones, el sistema comprende además uno o más de un componente de manejo de muestras, un componente de análisis de datos o una interfaz de usuario. En algunas realizaciones, el dispositivo se proporciona como un cartucho.
Realizaciones adicionales proporcionan un procedimiento para medir niveles de uno o más polipéptidos, que comprende a) poner en contacto el sistema descrito en el presente documento con una muestra (por ejemplo, una muestra de un sujeto); y b) medir el nivel de uno o más polipéptidos en la muestra usando LSPR. En algunas realizaciones, la detección es detección múltiple de dos o más polipéptidos distintos. En algunas realizaciones, los polipéptidos son citocinas. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra biológica (por ejemplo, que incluye pero no se limita a suero, sangre, orina, esputo, CSF o saliva). En algunas realizaciones, el nivel de las citocinas es indicativo de la presencia de una respuesta inflamatoria (por ejemplo, en sepsis, cáncer, lupus o enfermedad de injerto contra huésped (GVHD)), una respuesta inmune, daño orgánico o infección en el sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto se somete a quimioterapia, terapia basada en células o genes, inmunomodulación o cirugía. En algunas realizaciones, los resultados de la medición se usan para determinar un curso de acción de tratamiento en el sujeto (por ejemplo, administración de un inmunosupresor, un fármaco que bloquea la actividad de una citocina (por ejemplo, etanercept y/o tocilizumab), un fármaco contra el rechazo (por ejemplo, tacrolimus), o un fármaco que comprende proteínas recombinantes (por ejemplo, sargramostim y/o filgrastim). En algunas realizaciones, la medición se completa en 2 horas (por ejemplo, 1 hora, 50 minutos, 45 minutos, 40 minutos, 35 minutos, 30 minutos, 25 minutos, 20 minutos, 15 minutos, 10 minutos, 5 minutos) o menos.
Aún otros ejemplos proporcionan un procedimiento para medir niveles de una o más citocinas en una muestra biológica de un sujeto, que comprende: a) poner en contacto el sistema descrito en el presente documento con una muestra biológica de un sujeto; y b) medir el nivel de uno o más polipéptidos en la muestra usando LSPR.
Se describen realizaciones adicionales en este documento.
Descripción de las Figuras
La Figura 1 muestra un esquema y un principio de ejemplos de inmunoensayos. (A) Esquema del chip de LSPRmi. (B) Histogramas de la distancia entre partículas de las AuNR en el chip de LSPRmi caracterizado usando imágenes de SEM. (C) El principio del procedimiento de LSPRmi.
La Figura 2 muestra las señales de un microarreglo de AuNR en tiempo real durante la detección de múltiples citocinas.
La Figura 3 muestra el mapeo de intensidad de LSPRmi y las curvas de calibración. (A) Diseño del chip de LSPRmi que consta de 60 bandas de AuNR con función de anticuerpos segmentadas por 8 canales de detección de microfluidos. (B) Mapeo de los cambios de intensidad de la señal de LSPR sobre los 480 puntos del sensor de código de barras de AuNR en el chip de LSPRmi obtenido por el proceso de calibración de múltiples analitos para las seis citocinas en (A). (C) Curvas de calibración de TNF-a, IFN-y, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 obtenidas del mapeo de intensidad de código de barras de LSPR en (B).
La Figura 4 muestra la detección de múltiples citocinas en matriz de suero de donantes sanos y muestras de suero de pacientes. (A) Imágenes de campo oscuro de microarreglos de AuNR dentro de un único canal de detección de microfluidos cargado con diferentes mezclas de muestras de citocinas recombinantes añadidas en la matriz del suero. (B) Concentraciones de citocina cuantificadas para las muestras en (A). (C) Correlación entre los datos obtenidos del ensayo de LSPRmi y ELISA con estándar de oro para las muestras de suero enriquecidas con concentraciones de citocinas que varían de 32-5000 pg/ml. D) Variaciones de la concentración de citocinas de cinco días medidas por el ensayo de LSPRmi para muestras de suero extraídas de dos pacientes pediátricos después de cirugía CPB.
La Figura 5 muestra (A) Micrografía electrónica de barrido de fundición de gotas de AuNR sobre un sustrato de vidrio conductor. (B) Estadísticas de la longitud y el ancho de las AuNR medidas a partir de microscopía electrónica de gran aumento en (A). (C) Espectros de extinción de AuNR en solución que muestran la dispersión de longitud de onda de Rayleigh a aproximadamente 626 nm.
La Figura 6 muestra un esquema del proceso de modelar el chip de LSPRmi que implica tratamiento previo del vidrio, la deposición de AuNR y la función de los anticuerpos.
La Figura 7 muestra imágenes de microscopio electrónico de barrido de partículas de AuNR dentro de un patrón de microarreglos en un sustrato de vidrio.
La Figura 8 muestra (A) Un esquema de la configuración del microscopio de campo oscuro para el inmunoensayo de LSPRmi. (B) Ilustración del protocolo de ensayo de LSPRmi utilizando el chip de LSPRmi preparado y la imagen de campo oscuro. (C) Imágenes de microarreglos analizadas por el programa Matlab personalizado.
La Figura 9 muestra A) Un esquema de simulación de FDTD sobre la respuesta de dispersión de luz de una sola AuNR. B) Perfil de intensidad de LSPR de campo cercano de una sola AuNR descubierta excitada por luz incidente. D) Variación prevista del espectro de dispersión (o espectro de LSPR) con el espesor del recubrimiento de proteínas en la AuNR
La Figura 10 muestra la longitud de onda máxima calculada del espectro de dispersión (alternativamente, sección transversal de dispersión normalizada por el valor de una superficie de AuNR descubierta) como una función del espesor de la capa de proteína que cubre la superficie de AuNR, r.
La Figura 11 muestra (A) Perfil de intensidad de línea de los microarreglos de AuNR fabricados uniformemente, que se midió usando microscopía de imagen de campo oscuro. (B) Gráficos de calibración que muestran la variación de la señal de LSPRmi con concentración de TNF-a recombinante, en los que cada estrella representa un punto de datos de medición individual.
La Figura 12 muestra los niveles de citocinas en suero de pacientes con leucemia.
La Figura 13 muestra un esquema del flujo de ACEO y su efecto sobre la reacción superficial.
La Figura 14 muestra (a) Deposición de microelectrodos (b) Funcionalización de la superficie de microarreglos de AuNR (c) Carga de muestras de analitos usando el canal de flujo PDMS (d) Detección en tiempo real de analitos objetivo bajo flujo de vórtice de ACEO (e) Imagen de un ejemplo de dispositivo ACEO (f) Imagen de campo oscuro del código de barras de AuNR acoplada con electrodos.
La Figura 15 muestra (a) Esquema de la configuración del microscopio de campo oscuro (b) Reacción de superficie dentro de un ejemplo de nanobiosensor acoplado a ACEO (c) Imagen de campo oscuro en tiempo real recopilada por EMCCD.
La Figura 16 muestra (a) Curva de unión en tiempo real de biotina-estreptavidina bajo diferentes concentraciones (b) Curva de calibración (c) Esquema de la función de superficie (d) Prueba de unión no específica.
La Figura 17 muestra la detección de citocinas usando dispositivos de realizaciones de la presente divulgación. La Figura 18 muestra un flujo de trabajo para un ejemplo de un sistema de análisis de realizaciones de la presente divulgación.
Definiciones
El término "reactivos de ensayo" como se usa en el presente documento se usa en el sentido más amplio y se refiere a cualquier reactivo útil, necesario o suficiente para realizar los inmunoensayos de la presente divulgación. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, controles, tampones, patrones de calibración y similares.
El término "muestra" en la presente memoria descriptiva y reivindicaciones se usa en su sentido más amplio. Está destinado a incluir muestras biológicas y ambientales. Una muestra puede incluir una muestra de origen sintético.
Las muestras biológicas pueden ser animales, incluidos humanos, fluidos, sólidos (por ejemplo, heces) o tejidos, así como productos alimenticios y piensos líquidos y sólidos e ingredientes tales como productos lácteos, verduras, carne y subproductos cárnicos, y residuos. Se pueden obtener muestras biológicas de todas las diversas familias de animales domésticos, así como de animales salvajes o silvestres, incluidos, entre otros, animales como ungulados, osos, peces, lagomorfos, roedores, etc.
Las muestras ambientales incluyen material ambiental tal como materia superficial, suelo, agua y muestras industriales, así como muestras obtenidas de instrumentos de procesamiento de alimentos y lácteos, aparatos, equipos, utensilios, artículos desechables y no desechables. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes de los tipos de muestra aplicables a la presente divulgación.
Como se usa en el presente documento, el término "in vitro" se refiere a un entorno artificial y a procesos o reacciones que se producen dentro de un entorno artificial. Los entornos in vitro pueden consistir, pero no se limitan a, tubos de ensayo y cultivo celular. El término "in vivo" se refiere al entorno natural (por ejemplo, un animal o una célula) y a procesos o reacciones que ocurren dentro de un entorno natural.
La "molécula de unión a antígeno" se refiere a una molécula que se une a un antígeno específico. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, proteínas, ácidos nucleicos, aptámeros, moléculas sintéticas, etc.
La "proteína de unión a antígeno" se refiere a proteínas que se unen a un antígeno específico. Las "proteínas de unión a antígeno" incluyen, pero no se limitan a, inmunoglobulinas, que incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena sencilla y humanizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 y bibliotecas de expresión de Fab.
"Unión específica" o "que se une específicamente" cuando se usa en referencia a la interacción de un anticuerpo y un antígeno significa que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, el determinante antigénico o epítopo) en el antígeno; en otras palabras, el anticuerpo reconoce y se une a una estructura específica en lugar de a los antígenos en general. Por ejemplo, si un anticuerpo es específico para el epítopo "A", la presencia de una proteína que contiene el epítopo A (o A en forma libre, sin etiquetar) en una reacción que contiene "A" etiquetado y el anticuerpo reducirá la cantidad de A etiquetado unido al anticuerpo.
Como se usa en este documento, "microfluido" se refiere, por ejemplo, a un dispositivo para el transporte o almacenamiento de pequeños volúmenes (por ejemplo, de líquidos tales como reactivos de ensayo). En algunas realizaciones, los canales individuales o la cámara de dispositivos de microfluidos comprenden un volumen de 10 nl a 1 |jl (por ejemplo, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500 o 750 nl), aunque se contemplan otros tamaños.
Los términos "compuesto de prueba" y "compuesto candidato" se refieren a cualquier entidad química, compuesto farmacéutico, fármaco y similares que es un candidato para su uso para tratar o prevenir una afección, dolencia, enfermedad o trastorno de la función corporal. Los compuestos de prueba comprenden compuestos terapéuticos tanto conocidos como potenciales. Se puede determinar que un compuesto de prueba es terapéutico mediante detección usando los procedimientos de detección de la presente divulgación.
Descripción detallada
La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones de la descripción que no entran dentro del alcance de dichas reivindicaciones se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no forman parte de la presente invención. En el presente documento se proporcionan sistemas y procedimientos para realizar ensayos. En particular, en este documento se proporcionan sistemas y procedimientos para realizar inmunoensayos de alto rendimiento.
La LSPR es un fenómeno plasmónico que surge alrededor de estructuras a nanoescala o nanopartículas de metal noble (por ejemplo, rutenio, cesio, paladio, plata, oro, iridio, platino y combinaciones de los mismos) cuando se ilumina con luz sobre una superficie de detección a escala nanométrica. Cuando la frecuencia de la luz incidente coincide con la frecuencia natural de oscilación electrónica de las nanopartículas metálicas conductoras, las interacciones entre la luz incidente y la superficie de la nanoestructura maximizan la extinción óptica de las partículas con electrones altamente mejorados cerca de las superficies de las partículas y activan la LSPR. La longitud de onda de resonancia y la intensidad pueden modificarse fácilmente mediante la absorción temporal o irreversible de analitos tan pequeños como proteínas, ácidos nucleicos y citocinas. Como tal, se ha demostrado que es un procedimiento de detección eficaz sin etiquetas para la unión antígeno-anticuerpo que permite un análisis de alta sensibilidad y en tiempo real. Además, la eliminación del etiquetado de anticuerpos secundarios puede suprimir significativamente la reactividad cruzada. Dado que los elementos sensores utilizados en la técnica de LSPR pueden ser tan pequeños como unas pocas decenas de nanómetros de diámetro, proporciona una ventaja significativa en la construcción de una gran cantidad de matrices de sensores integradas en un solo chip, lo que permite una plataforma de detección de alto rendimiento y alta multiplicidad con volumen de muestra y tiempo total de ensayo drásticamente reducidos.
Co base en la medición de las señales de etiquetado, los inmunoensayos tipo sándwich convencionales empleados a menudo en ELISA proporcionan la lectura del analito de punto final solo después de la finalización de todos los procesos con múltiples reactivos. Sin conocer con precisión el momento final, los usuarios de estas técnicas de ensayo deben seguir un protocolo que requiere dos horas para la incubación del analito. Las etapas adicionales de etiquetado y lavado junto con el proceso de incubación que lleva mucho tiempo dan como resultado un tiempo de ensayo total de típicamente ocho horas o más. Por el contrario, tanto la naturaleza libre de etiquetas como la capacidad de monitoreo de unión de analitos en tiempo real demostrada en la presente divulgación proporcionan las ventajas significativas. Estas características permitieron la eliminación de un proceso de ensayo de múltiples etapas y redujeron el tiempo de incubación del analito a, por ejemplo, menos de 30 minutos. Desde el punto de saturación de la señal del sensor en tiempo real, fue posible determinar el punto final del ensayo de unión al analito cuando el proceso de lavado podría iniciarse para eliminar las moléculas de analito adsorbidas de forma no específica. Esto permitió que todo el inmunoensayo de LSPRmi involucrara la carga de muestras paralelas, la unión de múltiples analitos (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a e IFN-y), incubación y lavado a través de 480 puntos de biosensores sobre el chip que se completarán en un período de tiempo tan corto (por ejemplo, 40 min). Este tiempo de ensayo es más de diez veces más corto que aquel del ELISA convencional.
A pesar de la impresionante rapidez, eficiencia de la muestra y rendimiento, los esquemas de biochips de LSPR de multiarreglos en la detección de citocinas en suero se han enfrentado a un problema importante en el pasado: el límite de detección deficiente (LOD). Por ejemplo, se han realizado grandes esfuerzos para identificar los perfiles de citocinas en suero útiles para la detección temprana de sepsis o para evaluar la gravedad de la enfermedad (Wong, HR, et al., Critical Care 16, artículo R174 (2011); Bozza, FA, et al., Critical Care 11, artículo R49 (2007)). Las concentraciones de citocina en suero para pacientes con sepsis pueden variar ampliamente, lo que requiere un amplio intervalo dinámico y un bajo LOD para proporcionar información significativa con utilidad clínica. Bozza et al., informan la capacidad de predecir la mortalidad a los 28 días en pacientes con sepsis midiendo la IL-8 en suero dentro de las primeras 72 horas de ingreso (Bozza et al., citado más arriba). Un corte de IL-8 en suero capaz de discriminar significativamente entre sobrevivientes y no sobrevivientes con una precisión razonable sería un ensayo capaz de medir concentraciones de citocinas en suero <100 pg/ml. Este valor de corte ya es comparable o muy inferior a los LOD obtenidos por estudios previos (Endo, T., et al., Anal. Chem. 78, 6465-6475 (2006); Acimovic, SS, et al., Nano Lett. 14, 2636-2641 (2014)). Para lograr dicha alta sensibilidad, las realizaciones del procedimiento de detección descrito en este documento emplean imágenes de campo oscuro que escanean la dispersión de la intensidad de la luz a través de los puntos biosensores de LSPR (Figura 8).
Las reacciones cruzadas de anticuerpos inespecíficos plantean desafíos significativos para retener una alta precisión para los inmunoensayos múltiples de tipo sándwich. Este problema se vuelve serio cuando el ensayo involucra una gran cantidad de pares de anticuerpos en un medio biológico complejo, tal como suero humano. Evita la ampliación de la múltiplexación porque las uniones no específicas entre anticuerpos, analitos objetivo y otros componentes biológicos en la solución (por ejemplo, proteínas, lípidos, electrolitos, libres en plasma etc.) aumentan exponencialmente. El ensayo de LSPR descrito en este documento supera estos problemas. Proporciona la ventaja adicional de la naturaleza sin etiquetado del esquema de biosensores de LSpR que elimina el etiquetado de anticuerpos secundarios. La medición directa de la respuesta del sensor tras la unión del analito eliminó sustancialmente la adsorción no específica entre todas las especies biológicas. Como resultado, el ensayo mostró una reactividad cruzada insignificante a concentraciones de citocinas de 500 pg/ml en suero humano. El ensayo de LSPRmi mostró una correlación significativamente mejor con ELISA para un solo componente que los ensayos comerciales de arreglos de perlas múltiples (MBAA) para análisis de suero humano (Bozza, F. A., et al., Critical Care I I , artículo R49 (2007)).
Al obtener las muestras de suero de pacientes pediátricos con cirugía de CPB, fue posible definir exactamente la fuente de la respuesta inflamatoria de los huéspedes: la cirugía y predecir los resultados de ensayo anticipados. El ensayo de LSPRmi midió con éxito los niveles elevados de citocinas, más notables para IL-6 e IL-10, en ambos recién nacidos a las 24 h después de la cirugía para la enfermedad cardíaca congénita mediante derivación cardiopulmonar. Se observó un patrón muy similar a los reportados anteriormente en el que las elevaciones en los niveles séricos de citocinas del paciente regresan más comúnmente a los niveles prequirúrgicos dentro de las 48 horas posteriores a la cirugía. Dicha información es valiosa porque la expresión muy alta y/o prolongada de citocinas proinflamatorias (por ejemplo, IL-6) y antiinflamatorias (por ejemplo, IL-10) están asociadas con la disfunción inmune aguda después de la derivación cardiopulmonar y predicen peores resultados (Ashraf, et al., Eur. J. Pediatr. Surg.
12, 862-868 (1997); Seghaye, MC, et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 111, 545-553 (1996)). El ensayo de LSPR de realizaciones de la presente divulgación fue capaz de detectar grados variables de respuestas en los dos sujetos después de CPB. Existen múltiples mecanismos que contribuyen a esta expresión variable de citocinas (por ejemplo, edad del paciente, lesión cardíaca, duración de la cirugía y CPB, uso de esteroides intraoperatorios, etc.), sin embargo, no existe una metodología para medir de manera segura, rutinaria y repetitiva las citocinas en suero casi en tiempo real para permitir a los médicos monitorear la respuesta inflamatoria del huésped y, por lo tanto, alterar las estrategias terapéuticas según sea necesario. Los experimentos descritos en este documento demuestran la capacidad de monitorear rutinariamente múltiples citocinas en suero en pacientes que usan el ensayo de LSPR. El tiempo de respuesta rápido (por ejemplo, ~40 min), alta sensibilidad (por ejemplo, hasta ~ 6,46 pg/ml - 20,56 pg/ml), capacidad extrema de conservación de la muestra (por ejemplo, ~ 1 ul de muestra para seis citocinas con 10 medidas técnicas replicadas) y una reactividad cruzada insignificante permiten el monitoreo de rutina de las citocinas en suero con una precisión estadísticamente alta. Dichas características permiten el uso en el monitoreo de un número sustancial de diferentes estados de enfermedad, particularmente en lactantes y neonatos, en el que el volumen de muestra ha sido un factor atenuante. Dichas características clave no existen con los procedimientos actuales, ya que el tiempo de respuesta del ensayo y el volumen sangre requerido hacen que su uso no sea práctico, especialmente en bebés pequeños.
Por consiguiente, en este documento se proporciona un dispositivo de microarreglos de LSPR múltiples arreglos (LSPRmi) para la detección en paralelo (por ejemplo, masivamente en paralelo) de alto rendimiento de múltiples biomarcadores de citocina en suero. Los ejemplos de dispositivos, sistemas y procedimientos se describen en este documento.
I. Dispositivos y sistemas
Las realizaciones de la presente divulgación proporcionan dispositivos y sistemas para su uso en inmunoensayos de LSPR. En algunas realizaciones, los dispositivos comprenden un componente de LSPR y un componente de microfluidos. Los ejemplos de dispositivos se muestran en la Figura 1. La presente divulgación proporciona además sistemas para realizar la LSPR usando los dispositivos descritos.
A. Superficies de LSPR
En algunas realizaciones, los dispositivos comprenden un componente de LSPR que comprende una superficie sólida funcionalizada con un metal. En algunas realizaciones, la superficie sólida es vidrio. Los sustratos de vidrio ofrecen buenas propiedades ópticas para la formación de imágenes y la capacidad de modificación de la superficie para la función de la superficie. Las superficies alternativas incluyen, pero no se limitan a, plásticos transparentes, como el poli(metacrilato de metilo) (PMMa ), conocido como vidrio acrílico, un termoplástico transparente que puede modificarse con fracciones de superficie para la función del anticuerpo; policarbonato; copolímero de olefina cíclica (COC); polímero de ciclo olefina (COP); poliestireno; polipropileno; y tereftalato de polietileno modificado con glicol (PEGT).
En algunas realizaciones, los sustratos están recubiertos con metales que permiten la oscilación resonante de electrones de conducción en la interfaz entre un material de permitividad positivo y negativo estimulado por la luz incidente. Esto puede ocurrir como depósito de material a granel que permite la detección de resonancia de plasmón superficial (SPR), o como se describe en este documento como nanopartículas plasmónicas discretas que permiten la detección de resonancia de plasmón localizada (LSPR). Los metales que soportan plasmones de superficie incluyen, pero no se limitan a, plata, oro, cobre, titanio o cromo. En algunas realizaciones, los metales se proporcionan como nanotubos localizados u otras configuraciones geométricas. En algunos ejemplos de realizaciones (véase, por ejemplo, la Figura 1), las nanovarillas metálicas u otras configuraciones metálicas se disponen en franjas u otros patrones regulares en la superficie (véase, por ejemplo, Williams SE, Davies PR, Bowen JL y Allender CJ. Controlling the nanoscale patterning of AuNPs on silicon surfaces. Nanomaterials 2013; 3: 192­ 203). Además de las nanovarillas, otras configuraciones de partículas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, nanoesferas, nanoestrellas, nanopirámides de nano-rombos, nanobipirámides o nanoanillos y estructuras de caparazón de núcleo metálico (por ejemplo, estructuras de caparazón de núcleo de oro/plata). La plata exhibe buenas propiedades ópticas pero puede ser tóxica en un entorno biológico debido a la liberación de iones de plata. La nanocapa de oro químicamente inerte proporciona biocompatibilidad mientras mantiene las extraordinarias propiedades ópticas del núcleo de plata. En algunas realizaciones, se utilizan otros metales nobles (por ejemplo, rutenio, rodio, paladio, osmio, iridio, platino).
En algunas realizaciones, las superficies o áreas metálicas se funcionalizan con anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales o policlonales) que se unen a un péptido o polipéptido específico (por ejemplo, antígeno). La presente divulgación no se limita a anticuerpos particulares. En algunas realizaciones, los anticuerpos son específicos para una citocina o quimiocina (por ejemplo, una o más de interleucina 2 (IL-2); interleucina 4 (IL-4); interleucina 6 (IL-6); interleucina 10 ( IL-10); interleucina 8 (IL-8); interleucina 12 (IL-12); interferón gamma (IFN-y); o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a)). Las citocinas adicionales incluyen, pero no se limitan a, proteína estimuladora de la acilación, adipocina, albinterferón, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, factor estimulante de colonias, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL9, eritropoyetina, Gc-MAF, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, factor de crecimiento de hepatocitos, IL-17, IL1A, IL1B, inflamasoma, interferoma, interferón, interferón beta 1a, interferón beta 1b, interferón gamma, interferón tipo I, interferón tipo II, interferón tipo III, gen estimulado por interferón, familia de interleucina 1, antagonista del receptor de interleucina 1, interleucina 12, subunidad beta de interleucina 12, interleucina 13, interleucina 16, interleucina 2, interleucina 23, subunidad alfa de interleucina 23, interleucina 34, interleucina 35, interleucina 7, interleucina 8, interleucina 36, factor inhibidor de leucemia, factor promotor de leucocitos, linfocina, linfotoxina, linfotoxina alfa, linfotoxina beta, factor estimulante de colonias de macrófagos, proteína inflamatoria de macrófagos, factor activador de macrófagos, monocina, miocina, mionectina, nicotinamida fosforribosiltransferasa, oncostatina M, oprelvecina, factor de plaquetas 4, citocina proinflamatoria, promegapoyetina, RANK, factor 1 derivado de células estromales, talimogén laherparepvec, XCL1, XCL2 y XCR1.
Los analitos adecuados adicionales incluyen, pero no se limitan a, interleucina 1, antagonista del receptor de interleucina 1, interleucina 2, antagonista del receptor de interleucina 2, interleucina 4, interleucina 6, interleucina 8, interleucina 10, Interleucina 12, Interleucina 17, interleucina 23, factor alfa de necrosis tumoral, interferón gamma, Granzima B, HSP1AB, MMP-8, MIP-1a, anticuerpos (por ejemplo, monoclonales o policlonales), ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARNm , miARN, ARNlnc), sondas de ácido nucleico, ligando 3 de quimiocina (motivo c-c) (proteína 1 -alfa inflamatoria de macrófagos), metaloproteinasa 8 de matriz y proteína de choque térmico 70 A1B. En algunas realizaciones, los enlazadores se utilizan para unir anticuerpos a superficies (por ejemplo, usando carbodiimida (por ejemplo, EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida))/química NHS). En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador tiol bifuncional. La presente divulgación no se limita a la longitud del enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador comprende una cadena de átomos de carbono de 1 a 10 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 carbonos).
En algunas realizaciones, la detección múltiple se hace posible proporcionando distintos anticuerpos en ubicaciones direccionables en la superficie de la matriz (por ejemplo, mediante códigos de barras direccionados físicamente). Por ejemplo, en algunas realizaciones, las filas o canales individuales contienen cada uno un anticuerpo específico (por ejemplo, como se muestra en la Figura 1A). Esto proporciona una matriz de códigos de barras que permite la múltiplexación mediante la asignación de anticuerpos distintos a ubicaciones específicas (por ejemplo, manchas o puntos) en la matriz.
Las superficies (por ejemplo, superficies de vidrio o termoplásticas) se generan usando cualquier procedimiento adecuado. En algunas realizaciones, se utiliza el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el sustrato se trata con plasma de oxígeno, UV/ozono, y nanovarillas metálicas u otros componentes metálicos se diseñan usando una técnica de modelado de microfluidos a través de interacciones electrostáticas entre el metal y la superficie del vidrio. En algunas realizaciones, los diseños metálicos construidos se funcionalizan (por ejemplo, con alcano tiolado 10-carboxi-1-decanetiol (HS-(CH2)10-COOH)) a través del intercambio de ligandos y posteriormente se activan para la unión de anticuerpos usando química de acoplamiento EDC/NHS estándar.
Otros protocolos adecuados para funcionalizar superficies incluyen, pero no se limitan a, vidrio con función APTES o termoplástico que interactúan covalentemente con nanovarillas de oro (Kathryn Mayer et. Al., ACS Nano, 2, 687-692, 2008); Las superficies con función de silano interactúan covalentemente con nanopartículas de oro estabilizadas con citrato (Maniraj Bhagawati et. al., Anal. Chem., 85, 9564-9571, 2013); y nanovarillas de oro CTAB depositadas al azar con aptámeros para detección (Christina Rosman et. al., Nano Lett. 13, 3243-3247, 2013).
En algunas realizaciones, las superficies se silanizan (véase, por ejemplo, Haddada MB, et al., Gold Bull 2013; 46: 335-341; Cant NE, et al., Thin Solid Films 2003; 426: 31-39). En algunas realizaciones, los silanos se modifican con amina, tiol o disulfuro. En algunas realizaciones, la silanización se realiza mediante deposición química de vapor (por ejemplo, CVD potenciada con plasma o CVD de baja presión o mediante disolvente prótico).
En algunas realizaciones, las superficies comprenden componentes de electroósmosis de CA (ACEO). ACEO es un fenómeno electrocinético no lineal de flujo electroosmótico de carga inducida alrededor de los electrodos cuando se aplica un voltaje alterno. La polarización de la superficie del electrodo induce una capa difusa de iones llamada capa eléctrica doble (EDL) (Véase, por ejemplo, la Figura 13). A una frecuencia dada, el potencial eléctrico en el borde exterior de la EDL provoca un campo eléctrico tangencial, que ejerce una fuerza externa no promediada en el tiempo (como se muestra con las flechas verdes en la superficie del electrodo) sobre la carga inducida (EDL). Este movimiento de EDL conduce a un movimiento de fluido circunferencial dentro del canal de microfluidos y puede funcionar como una microbomba para facilitar el transporte de analitos hacia la superficie de detección. Por lo tanto, la zona de agotamiento formada bajo un régimen de límite de difusión puede reducirse significativamente mediante ACEO. Por lo tanto, la velocidad de reacción en la superficie se mejora considerablemente debido a este movimiento continuo de fluido, especialmente para la detección de biomarcadores de concentración ultrabaja. En consecuencia, en algunas realizaciones, los dispositivos comprenden además una pluralidad de microelectrodos configurados para ACEO en comunicación con las matrices de partículas metálicas. En algunas realizaciones, cada matriz (por ejemplo, nanotubos) está unida a una pluralidad de electrodos.
B. Componente de microfluidos
En algunas realizaciones, los dispositivos de realizaciones de la presente divulgación comprenden un componente de microfluidos. El componente de microfluidos está en comunicación de fluido con el componente de LSPR y sirve para transportar componentes del ensayo (por ejemplo, muestras de pacientes y reactivos de ensayo) al componente de LSPR. En algunas realizaciones, el componente microfluidos comprende una pluralidad (por ejemplo, 2, 4, 6, 8, 10, 12 o más, dependiendo del tamaño del dispositivo) de canales de microfluidos. En algunas realizaciones, los canales tienen componentes de salida y entrada y/o componentes de depósito para suministrar fluidos a las regiones del dispositivo. En algunas realizaciones, los canales de microfluidos se colocan perpendiculares a los componentes con el diseño de LSPR.
El componente de microfluidos está construido de cualquier material adecuado. En algunas realizaciones, las capas se hacen suministrando un "patrón" negativo y moldeando un material moldeable sobre el patrón. Los materiales moldeables incluyen, pero no se limitan a, polímeros, incluidas resinas epoxídicas, elastómeros de poliuretano curables, soluciones de polímeros (por ejemplo, soluciones de polímeros de acrilato en cloruro de metileno u otros disolventes), poliorganosiloxanos curables y poliorganosiloxanos que contienen predominantemente grupos metilo (por ejemplo, polidimetilsiloxanos ("PDMS")). Los polímeros de PDMS curables son bien conocidos y están disponibles a partir de muchas fuentes. Se encuentran disponibles sistemas curables por adición y curables por condensación, al igual que los sistemas curados con peróxido. Todos estos polímeros PDMS tienen una pequeña proporción de grupos reactivos que reaccionan para formar enlaces cruzados y/o causar la extensión de la cadena durante el curado. Están disponibles sistemas de una parte (RTV-1) y dos partes (RTV-2).
En algunas realizaciones, son deseables dispositivos transparentes. Dichos dispositivos pueden estar hechos de vidrio o polímeros transparentes. Los polímeros PDMS son muy adecuados para dispositivos transparentes. Una ventaja de emplear un polímero que es ligeramente elastomérico es el caso de la extracción del molde y la posibilidad de proporcionar canales socavados, que generalmente no es posible con materiales duros y rígidos. Los procedimientos de fabricación de dispositivos de microfluidos mediante moldeo de polímeros de silicona son bien conocidos. Véase, por ejemplo, D.C. Duffy et al., "Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly (dimethylsiloxane)", Analytical Chemistry 70, 4974-4984 (1998). Véase también, J.R. Anderson et al., Analytical Chemistry 72, 3158-64 (2000); y M.A. Unger et al., Science 288, 113-16 (2000).
En algunas realizaciones, los fluidos se suministran al dispositivo mediante cualquier procedimiento adecuado. Los fluidos pueden, por ejemplo, ser suministrados desde jeringas, desde microtubos unidos o enlazados a los canales de entrada, etc.
El flujo de fluido puede establecerse por cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, hay disponibles microbombas externas adecuadas para bombear pequeñas cantidades de líquidos. Las microbombas también se pueden proporcionar en el propio dispositivo, accionadas por gradientes térmicos, campos magnéticos y/o eléctricos, presión aplicada, etc. La integración de sistemas de bombeo pasivos y canales de microfluidos es descrita por B.H. Weigl et al., Proceedings of MicroTAS 2000, Enshede, Países Bajos, páginas 299-302 (2000).
En algunas realizaciones, el flujo de fluido se establece por una bomba de flujo por gravedad, por acción capilar o por combinaciones de estos procedimientos. Una bomba de flujo por gravedad simple consiste en un depósito de fluido externo o interno al dispositivo, que contiene fluido a un nivel más alto (con respecto a la gravedad) que la salida del dispositivo respectivo. Dichas bombas de gravedad tienen la deficiencia de que la cabeza hidrostática y, por lo tanto, el caudal, varía a medida que cae la altura del líquido en el depósito. Para muchos dispositivos, se desea un flujo relativamente constante y sin impulsos.
Para obtener un flujo constante, se puede usar una bomba accionada por gravedad como se describe en la solicitud PCT publicada No. WO 03/008102 A1 (18 de enero de 2002). En tales dispositivos, se usa un depósito horizontal en el que el fluido se mueve horizontalmente, evitando que se colapse verticalmente en el depósito por la tensión superficial y las fuerzas capilares entre el líquido y las paredes del depósito. Como la altura del líquido permanece constante, no hay variación en la cabeza hidrostática.
El flujo también puede ser inducido por la acción capilar. En tal caso, el fluido en el canal o depósito respectivo exhibirá mayores fuerzas capilares con respecto a su canal o paredes del depósito en comparación con las fuerzas capilares en el dispositivo asociado. Esta diferencia en la fuerza capilar puede ser provocada por varios procedimientos. Por ejemplo, las paredes de los canales o depósitos de salida y entrada pueden tener diferente hidrofobicidad o hidrofilicidad. Alternativamente, el área de la sección transversal del canal o depósito de salida se hace más pequeña, exhibiendo así una mayor fuerza capilar.
En algunas realizaciones, la construcción de dispositivos de fluidos se realiza mediante técnicas de litografía suave como las descritas, por ejemplo, por Duffy et al., (Analytical Chem 70, 4974-4984 1998; véase también Anderson et al., Analytical Chem 72, 158-64, 2000 y Unger et al., Science 288, 113-16, 2000). Los elastómeros de silicona RTV-2 curables por adición, tales como SYLGARD.RTM 184 Dow Corning Co, pueden usarse para este propósito. Las dimensiones de los canales se determinan fácilmente por las propiedades de volumen y caudal, etc.
El sustrato puede ser de una capa o pluralidad de capas. Las capas individuales pueden prepararse mediante numerosas técnicas que incluyen ablación con láser, grabado con plasma, procedimientos químicos húmedos, moldeo por inyección, moldeo por presión, etc. Lo más preferido es el moldeo con silicona curable, particularmente cuando las propiedades ópticas son importantes. La generación del molde negativo puede realizarse mediante numerosos procedimientos, todos los cuales son bien conocidos por los expertos en la materia. La silicona se vierte sobre el molde desgasificado si es necesario o deseado y se deja curar. La adherencia de múltiples capas entre sí se puede lograr mediante técnicas convencionales.
Un procedimiento de fabricación de algunos dispositivos emplea la preparación de un patrón mediante el uso de fotorresistencia negativa SU-850 de Micro Chem Corp Newton Mass.
En algunas realizaciones, los dispositivos están moldeados por inyección. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los dispositivos comprenden capas de fluidos termoplásticas moldeadas por inyección unidas al sustrato de detección.
C. Sistemas
En algunas realizaciones, las señales de LSPR son detectadas por cualquier detector adecuado. Un ejemplo de detector se muestra en la Figura 8. En algunas realizaciones, los dispositivos se colocan en una plataforma o platina móvil para escanear múltiples ubicaciones en el dispositivo. En algunas realizaciones, los detectores comprenden una fuente de luz, uno o más objetivos, filtros, condensadores de campo oscuro y componentes de formación de imágenes (por ejemplo, detectores CCD).
En algunas realizaciones, los dispositivos están configurados para la detección múltiple de múltiples polipéptidos. Por ejemplo, como se describió anteriormente, se proporciona un componente de código de barras al proporcionar anticuerpos específicos distintos en ubicaciones direccionables en la superficie de LSPR.
En algunas realizaciones, después de la formación de imágenes, se utiliza un componente de software para analizar la señal de la matriz. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el software está configurado para procesar una imagen, determinar qué ubicaciones tienen el antígeno objetivo unido y proporcionar un informe. En algunas realizaciones, los datos de unión son cuantitativos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se obtiene una curva de calibración antes de realizar el ensayo (Véase, por ejemplo, la Figura 3) y/o en paralelo en cada chip (por ejemplo, como controles internos positivos y negativos).
En algunas realizaciones, los sistemas están automatizados. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los sistemas (véase, por ejemplo, la Figura 18) comprenden uno o más de un cartucho empacado, listo para usar (chip de LSPR), componente integrado de procesamiento de muestras (por ejemplo, sistema robótico de manejo de muestras), plataforma de detección óptica automatizada (por ejemplo, los descritos en este documento), y el análisis de muestras con base en ordenador y el componente de visualización (por ejemplo, pantalla, tableta, teléfono inteligente, etc.).
En algunas realizaciones, se usa un programa de análisis con base en ordenador para traducir los datos sin procesar generados por el ensayo de detección (por ejemplo, la presencia, ausencia o nivel de un antígeno) en datos de valor predictivo para un médico (por ejemplo, elección de terapia). El médico puede acceder a los datos predictivos utilizando cualquier medio adecuado. Por lo tanto, en algunas realizaciones preferentes, la presente divulgación proporciona el beneficio adicional de que el médico, que probablemente no esté capacitado en inmunología o biología molecular, no necesita comprender los datos sin procesar. Los datos se presentan directamente al médico en su forma más útil. El médico puede utilizar de inmediato la información para optimizar la atención del sujeto.
La presente divulgación contempla cualquier procedimiento capaz de recibir, procesar y transmitir la información hacia y desde los laboratorios que realizan los ensayos, la información que proporciona, el personal médico y los sujetos. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la presente divulgación, se obtiene una muestra (por ejemplo, una muestra de sangre, orina o suero) de un sujeto y se envía a un servicio de elaboración de perfiles (por ejemplo, laboratorio clínico en un centro médico, negocio de elaboración de perfiles, etc.), ubicado en cualquier parte del mundo (por ejemplo, en un país diferente al país donde reside el sujeto o donde la información se utiliza en última instancia) para generar datos sin procesar. Cuando la muestra comprende un tejido u otra muestra biológica, el sujeto puede visitar un centro médico para obtener la muestra y enviarla al centro de obtención de perfiles, o los sujetos pueden recolectar la muestra ellos mismos (por ejemplo, una muestra de orina) y enviarla directamente a un centro de obtención de perfiles. Cuando la muestra comprende información biológica previamente determinada, la información puede ser enviada directamente al servicio de creación de perfiles por el sujeto (por ejemplo, una tarjeta de información que contiene la información puede ser escaneada por un ordenador y los datos transmitidos a un ordenador del centro de creación de perfiles utilizando sistemas de comunicación electrónica). Una vez recibida por el servicio de creación de perfiles, la muestra se procesa y se produce un perfil (por ejemplo, niveles de antígenos), específico para la información de diagnóstico o pronóstico deseada para el sujeto.
Los datos del perfil se preparan luego en un formato adecuado para la interpretación por un médico tratante. Por ejemplo, en lugar de proporcionar datos sin procesar, el formato preparado puede representar un diagnóstico o una evaluación de riesgos (por ejemplo, probabilidad de rechazo de órganos o respuesta inmune) para el sujeto, junto con recomendaciones para opciones de tratamiento particulares. Los datos pueden mostrarse al médico por cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el servicio de creación de perfiles genera un informe que puede ser impreso por el médico (por ejemplo, en el punto de atención) o mostrarse al médico en un monitor de ordenador.
En algunas realizaciones, la información se analiza primero en el punto de atención o en una instalación regional. Los datos sin procesar se envían luego a una instalación de procesamiento central para su posterior análisis y/o para convertir los datos sin procesar en información útil para un médico o paciente. La instalación de procesamiento central ofrece la ventaja de la privacidad (todos los datos se almacenan en una instalación central con protocolos de seguridad uniformes), la velocidad y la uniformidad del análisis de datos. La instalación de procesamiento central puede controlar el destino de los datos después del tratamiento del sujeto. Por ejemplo, utilizando un sistema de comunicación electrónica, la instalación central puede proporcionar datos al médico, el sujeto o los investigadores. En algunas realizaciones, el sujeto puede acceder directamente a los datos usando el sistema de comunicación electrónica. El sujeto puede elegir más intervención o asesoramiento en función de los resultados. En algunas realizaciones, los datos se usan para uso en investigación. Por ejemplo, los datos pueden usarse para optimizar aún más la inclusión o eliminación de marcadores como indicadores útiles de una condición o etapa particular de la enfermedad.
En algunas realizaciones, se proporcionan sistemas que comprenden dispositivos, detectores, software y componentes de ordenador (por ejemplo, procesador de ordenador y pantalla de visualización, teléfono inteligente, etc.). En algunas realizaciones, los componentes de detección y análisis se proporcionan como una plataforma y los dispositivos se proporcionan como cartuchos o placas (por ejemplo, dispositivos desechables o reutilizables). Por ejemplo, en algunas realizaciones, la parte del sistema que contacta la muestra del paciente se proporciona como un cartucho o tira desechable y la plataforma de detección y análisis es un componente reutilizable independiente que puede aceptar y analizar cartuchos específicos para uno o más antígenos objetivo.
En algunas realizaciones, todo el sistema se proporciona como un dispositivo portátil (por ejemplo, adecuado para uso junto a la cama). En algunas realizaciones, los dispositivos portátiles comprenden una tira o cartucho desechable para la muestra del paciente. En algunas realizaciones, los dispositivos portátiles son específicos del objetivo (por ejemplo, dedicados a un antígeno específico) o independientes del objetivo (por ejemplo, adecuados para aceptar diferentes cartuchos o bandas específicos para diferentes antígenos).
II. Procedimientos
Las realizaciones de la presente divulgación proporcionan el uso de los dispositivos y sistemas descritos en este documento para la detección de antígenos (por ejemplo, en muestras de pacientes). En algunas realizaciones, el ensayo total se completa en una hora (por ejemplo, 50 minutos, 40, minutos, 30 minutos, 20 minutos, 10 minutos, 5 minutos, 4 minutos, 3 minutos, 2 minutos, 1 minuto, etc.) o menos. Esto proporciona una clara ventaja sobre los ensayos de ELISA tradicionales, que a menudo requieren varias horas para completarse. Dichos ensayos rápidos son especialmente útiles en entornos de atención al paciente en los que las decisiones sobre el tratamiento y las intervenciones deben tomarse rápidamente.
La presente divulgación no se limita a muestras particulares de pacientes. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, suero, sangre completa, orina, esputo, semen, líquido cefalorraquídeo (CSF) o saliva. En algunas realizaciones, las muestras se procesan o purifican antes de su uso. En algunas realizaciones, las muestras se utilizan sin procesamiento (por ejemplo, de un pinchazo en el dedo o una muestra de orina). En algunas realizaciones, los volúmenes de muestra son de 1 pl o menos (por ejemplo, 900 nl, 800 nl, 700 nl, 600 nl, 500 nl, 400 nl, 300 nl, 200 nl o 100 nl o menos).
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona procedimientos para detectar una o más citocinas (por ejemplo, las divulgadas en el presente documento), quimiocinas u otros responsables de inflamación, respuesta inmune, daño orgánico o infección. En algunas realizaciones, la presencia y/o los niveles de las citocinas en la muestra se usan para determinar la presencia de una respuesta inflamatoria, una respuesta inmune, daño orgánico o infección en el sujeto. La presente divulgación no se limita a respuestas inflamatorias o inmunes particulares. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, trauma quirúrgico, sepsis, cáncer, lupus, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), hepatitis autoinmune, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, miastenia grave, diabetes tipo I, artritis reumatoide, psoriasis, tiroiditis de Hashimoto, Enfermedad de Grave, espondilitis anquilosante, enfermedad de Sjogren, síndrome CREST, esclerodermia, enfermedad de Crohn, síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), pacientes que han recibido trasplantes de órganos sólidos y están recibiendo terapia de inmunosupresión, colitis ulcerosa, poliarteritis nodosa, enfermedad de Whipple, colangitis esclerosante primaria, etc. En algunas realizaciones, el sujeto se somete a quimioterapia o se ha sometido a cirugía. En algunas realizaciones, los niveles de las citocinas se usan para determinar el curso de acción del tratamiento. Por ejemplo, en un paciente que sufre GVHD, sepsis o una respuesta inflamatoria, se administra un fármaco inmunosupresor (por ejemplo, esteroide) o un fármaco inmunomodulador (por ejemplo, filgrastim).
En algunas realizaciones, los pacientes sometidos a quimioterapia (por ejemplo, terapia con células T del receptor de antígeno quimérico (células T del CAR)), que da como resultado la liberación de citocinas, se controlan para medir los niveles de citocinas. Los niveles de citocinas se controlan para determinar cuándo los pacientes tienen niveles de citocinas que son clínicamente demasiado altos (por ejemplo, provocan conmoción y/o inestabilidad hemodinámica). Dichos pacientes reciben terapia anticitocinas (por ejemplo, etanercept y/o tocilizumab). En algunas realizaciones, los niveles de citocinas se controlan para determinar cuándo los niveles han disminuido lo suficiente como para reducir o detener la terapia. En algunas realizaciones, a los pacientes que no tienen niveles elevados de citocinas no se les administra terapia anticitocinas.
En algunas realizaciones, los pacientes son controlados (por ejemplo, usando dispositivos al lado de la cama) varias veces durante el curso del tratamiento, la recuperación de la cirugía o después del tratamiento con un fármaco inmunosupresor para determinar si se necesitan cambios en el tratamiento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se controla al paciente que necesita terapia inmunosupresora para determinar cuándo ha disminuido la inflamación o la GVHD para determinar que es aconsejable una disminución de la dosis o la interrupción del tratamiento.
Parte experimental
(Los ejemplos son solo para fines ilustrativos).
Ejemplo 1
Procedimientos
Fabricación de chips de LSPRmi: las AuNR cargadas positivamente (recubrimiento de CTAB) utilizados en este estudio se adquirieron a través de Nanoseedz. Las AuNR se diseñaron sobre un sustrato de vidrio tratado con plasma de oxígeno usando una técnica de modelado de microfluidos a través de interacciones electrostáticas entre las AuNR y la superficie del vidrio. Los diseños de código de barras de AuNR construidos funcionaron con alcano tiolado 10-carboxi-1-decanotiol (HS-(CH2)10-COOH) a través del intercambio de ligandos y posteriormente se activaron usando química de acoplamiento EDC/NHS estándar. Los anticuerpos de citocina de la sonda se cargaron luego en un canal de modelado individual formando una matriz de códigos de barras que constaba de seis franjas paralelas, cada una de las cuales funcionaba con anticuerpos distintos para permitir la detección múltiple de 6 citocinas diferentes a la vez.
Protocolo de ensayo de LSPRmi: el chip de ensayo de LSPRmi preparado se montó en la platina motorizada (ProScanIII, Prior Scientific, Rockland, MA) que permitió el posicionamiento tridimensional y el escaneo automático de la imagen. La parte posterior del sustrato de vidrio del chip se unió con un condensador de campo oscuro (NA = 1,45, Nikon) a través del aceite de la lente. Se inyectaron 250 nl de muestra desde la entrada, se hicieron pasar por el canal de muestra y se recogieron a la salida. La luz dispersada de los códigos de barras fue recolectada por la lente objetivo 10X debajo del chip de ensayo, filtrada por un filtro de paso de banda (610-680 nm), fotografiada por una cámara CCD multiplicadora de electrones (EMCCD, Photometrics, Tucson, AZ) y registrada utilizando el software de análisis NIS-Element BR. Las imágenes obtenidas fueron luego analizadas por un programa Matlab personalizado. Antes de cada medición, transcurrieron ~10 minutos para establecer la estabilización de la temperatura del EMCCD para minimizar la deriva de la señal de fondo.
Caracterización del desempeño de múltiples matrices en suero humano en el ensayo de LSPRmi. Para caracterizar tanto la capacidad múltiple como el desempeño del ensayo, se utilizaron tres mezclas separadas de citocinas. Una mezcla contenía una sola especie de citocina (TNF-a), una que contenía tres analitos (lL-4, IFN-y y TNF-a), y finalmente una que contenía las seis citocinas (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-y y TNF-a). Las citocinas recombinantes (Life Technologies, Frederick, MD) se añadieron a una matriz de suero humano, inactivada por calor y absorbida por carbón, disponible comercialmente, para eliminar niveles traza de citocinas (EMD Millipore, St. Charles, MO).
Comparación del desempeño del ensayo de LSPRmi con ELISA con ‘estándar de oro'. Las seis citocinas (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-y, TNF-a) se añadieron al suero humano de donantes sanos obtenido mediante punción venosa tras el consentimiento informado por escrito. El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Michigan. El suero se obtuvo por punción venosa en tubos Vacutainer que contienen activador de coagulación (BD Diagnostics, Franklin Lake, NJ). Los tubos se procesaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras de suero dopadas con las seis citocinas se diluyeron aún más con suero de donante sano para obtener muestras en todo el intervalo dinámico del ensayo de LSPRmi (32 pg/ml-5.000 pg/ml). Las concentraciones de citocina en suero se cuantificaron utilizando el ensayo de LSPRmi y se compararon con los kits de ELISA disponibles comercialmente (IL-6, IL-10, IFN-y, TNF-a, BioSource Europe SA, Nivelles, Bélgica; IL-2, IL-4, Thermo -Fisher Scientific, Rockford, IL).
Ensayo de LSPRmi para cuantificación de citocinas en suero de pacientes pediátricos después de una cirugía a corazón abierto con derivación cardiopulmonar. Todos los estudios descritos en este documento fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Michigan y se realizaron siguiendo el consentimiento informado de los padres. En resumen, se seleccionaron dos pacientes inscritos en un ensayo clínico en curso para la cuantificación de citocinas en suero. Se recogieron muestras de suero antes de la cirugía y luego en los días uno, dos, tres y cuatro después de la operación (Pre, D1, D2, D3 y D4, respectivamente), utilizando un Microtainer SST (BD Diagnostics) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las citocinas en suero (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-y, TNF-a) se cuantificaron utilizando el inmunoensayo de LSPRmi como se describió anteriormente.
Simulaciones de FDTD: las simulaciones ópticas para calcular la eficiencia de dispersión en una AuNR individual se realizaron utilizando el software comercial de simulación Multiphysics COMSOL. En la simulación, las dimensiones de la AuNR se establecieron de acuerdo con los resultados de la caracterización del material (40 nm de diámetro, relación de aspecto: 2). La permitividad compleja del oro dependiente de la frecuencia se derivó del modelo de Lorenze-Drude. El dominio de campo lejano se definió como un caparazón esférico que rodea la AuNR con un radio idéntico a la mitad de la longitud de onda de la luz incidente. La condición límite se estableció para ser una capa perfectamente coincidente. El vector de onda y la polarización del campo eléctrico de la onda de luz incidente fueron configuradas para ser perpendiculares y paralelas a la orientación del An. El tamaño de la malla se ajustó a 1 nm en la superficie de la AuNR y no más de 1/10 de la longitud de onda estudiada en otra parte. La distribución espacial del campo electromagnético en el plano del campo lejano se midió a frecuencias variables con y sin la presencia de la AuNR para determinar la intensidad de la onda de dispersión de la AuNR. Las simulaciones de FDTD se realizaron modelando la AuNR con capas dieléctricas que imitan la unión del anticuerpo/analito. El espectro de dispersión calculado para la AuNR descubierta y la AuNR recubierta se puede encontrar en la Figura 9.
Caracterización de nanovarillas de oro. Las nanovarillas de oro (AuNR) utilizadas en este estudio (Figura 5A) se adquirieron a través de Nanoseedz en tampón de bromuro de etrimonio acuoso (CTAB, 0,1 M). Estas nanovarillas se sintetizaron originalmente utilizando el procedimiento estándar de crecimiento mediado por semillas. Esto produjo nanopartículas cristalinas individuales con una longitud promedio de 80 ± 5 nm y un ancho promedio de 40 ± 3 nm (Figura 5B). El recubrimiento de CTAB en las AuNR dio como resultado una superficie cargada positivamente con un potencial zeta de 42 ± 5 mV (Zetasizer Nano ZS90, Malvern). El espectro de extinción de las AuNR en solución se obtuvo utilizando un espectrofotómetro personalizado (Oh, B. et al., ACS Nano 8, 2667-2676 (2014)). La longitud de onda máxima de resonancia de la AuNR es de alrededor de 626 nm, de acuerdo con los resultados de la simulación, como se muestra a continuación.
Fabricación de microarreglos de nanovarillas de oro. Antes de la fabricación de los microarreglos de AuNR, se construyó una capa de máscara para modelar el flujo de microfluidos hecha de PDMS usando litografía blanda. La capa de máscara contiene múltiples conjuntos de canales de microfluidos paralelos para diseñar los microarreglos de AuNR. Específicamente, se diseñó un molde para la capa de máscara para modelar el flujo de PDMS dentro de un sustrato de silicio usando grabado profundo con iones reactivos (DRIE) (Deep Silicon Etcher, Surface Technology Systems, Allenton, PA). La superficie del molde se silanizó con vapor de (tridecafluoro-1,1,2,2,-tetrahidrooctil)-1-triclorosilano (United Chemical Technologies) durante 1 hora al vacío para facilitar la posterior liberación de PDMS. El prepolímero PDMS (Sylgard-184, Dow Corning), preparado mezclando completamente un agente de curado con un monómero base (p:p = 1:10) se vertió en el molde de silicio y se curó en un horno a 110 °C durante 4 horas. La capa de máscara de PDMS curada se despegó del molde para formar una capa para modelar el flujo de microfluidos. La capa se cortó en múltiples piezas, cada una perforada para crear entradas y salidas para sus canales para su uso posterior.
Posteriormente, la solución madre de AuNR (0,2 nM) se centrifugó tres veces a 5.700 rpm durante 10 minutos, y el sedimento se resuspendió en agua desionizada (DI) para eliminar el exceso de CTAB en la solución. La solución de AuNR se diluyó adicionalmente 8 veces antes de la fabricación del microarreglo. Los portaobjetos de vidrio (tipo) se trataron primero con solución Piraña (H2SO4:H2O2 = 3:1) durante 10 minutos, se enjuagaron a fondo con agua DI y se mantuvo en un baño de ultrasonido con etanol durante 30 minutos. Las superficies de los sustratos de vidrio se trataron bajo plasma de O2 durante 2 minutos a 18 W (COVANCE 1-MP, Femto). Esto creó una superficie de vidrio cargada negativamente debido a los grupos hidroxilo disociados existentes en el vidrio, lo que permitió que el sustrato de vidrio atrajera las AuNR cargadas positivamente estabilizados con CTAB sobre su superficie. Inmediatamente después del tratamiento de la superficie, una de las piezas de la capa de máscara de PDMS para moldeo de flujo de microfluidos preparada anteriormente se unió a cada sustrato de vidrio. Se cargaron dos pl de solución de AuNR en cada canal a un caudal de 1 pl/min y se incubaron durante la noche, seguido de un sellado de las entradas y salidas con un vidrio protector para evitar la evaporación y evitar el secado de la solución de AuNR.
Después de la incubación, todos los canales se lavaron con etanol al 100% para eliminar las AuNR no unidas. Esto dio como resultado la formación de moldes de microarreglos de AuNR en las regiones de la superficie de vidrio cubiertas por los canales. La imagen SEM mostró que la densidad superficial resultante de las AuNR en cada microarreglo es de alrededor de 1 partícula por 2,56 pm2
Funcionalización de microarreglos de las nanovarillas de oro. Después de construir los moldes de microarreglos de AuNR en el sustrato de vidrio, se funcionalizaron dentro de los canales de moldes de flujo de microfluidos construidos anteriormente formando una monocapa autoensamblada (SAM) a través del intercambio simple de ligando (Eck, W. et al., ACS Nano 2, 2263-2272 (2008). Una solución madre de alcano tiolado 10-carboxi-1-decanetiol (HS-(CH2)10-COOH) se diluyó hasta 1 mM en etanol al 100% y se hizo fluir a través del canal de modelado sobre el sustrato de vidrio. La fuerte unión del grupo de anclaje de tiol con la superficie de oro permitió que el alcano tiolado reemplazara el recubrimiento de CTAB y sirviera como un conector para los anticuerpos sonda. La unión de anticuerpos se realizó mediante la unión de anticuerpos al grupo funcional -COOH a través de la química de acoplamiento estándar con 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida/N-hidroxisuccinimida (EDC/NHS) (Grabarek, Z. & Gergely, J. Anal. Biochem. 185, 131-135 (1990)). Brevemente, se inyectó una mezcla de EDC 0,4 M (Thermo Scientific) y NHS 0,1 M (Thermo Scientific) en una relación de volumen 1:1 en solución de MES 0,1 M clorhidrato de (1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida, Thermo Scientific) a través de los canales del molde de flujo de microfluidos y activó las superficies de microarreglos de AuNR en el sustrato de vidrio. Después de la activación de la superficie, los anticuerpos de citocina primarios (Ebioscience) se diluyeron de 100 a 10 pg/ml en PBS 1x, se cargaron en canales individuales y se incubaron a temperatura ambiente durante 60 minutos. Esto dio como resultado la construcción de seis patrones de bandas de AuNR paralelas serpenteantes de 25 |jm de ancho y 2 cm de longitud con un paso de 50 jm en el sustrato de vidrio, cada uno funcionalizado con moléculas de anticuerpos distintas. Estos moldes formaron los microarreglos de biosensores de LSPR que permiten la detección múltiple de 6 citocinas diferentes. Para suprimir la unión no específica en la superficie de detección, se agregaron 10 j l de BSA al 1% (albúmina, de suero bovino, SIGMA) en PBS 1x y tampón de bloqueo caseína 1x (solución de bloqueo de caseína 5x, Surmodics BioFX) en los canales de modelado para flujo de microfluidos e incubación durante 20 minutos. Durante todas las etapas del proceso, se cargaron las soluciones reactivas usando una bomba de jeringa (LEGATO210, Kd Scientific) a razón de 1 jl/minuto. Entre cada etapa, se lavó minuciosamente la superficie del microarreglo de AuNR para eliminar cualquiera de las soluciones o moléculas en exceso utilizando 20 j l de PBS 1x a razón de 3 jl/min.
Configuración óptica y medición de imágenes de microarreglos de LSPR (LSPRmi). Después del proceso de funcionalización del anticuerpo de microarreglos de AuNR, la capa de máscara de PDMS se retiró del sustrato de vidrio y se reemplazó inmediatamente con otra capa de PDMS con matrices de canales de microfluidos de flujo de muestra. Esta nueva capa de PDMS se fabricó siguiendo el mismo procedimiento descrito para la construcción de la capa de máscara de modelado para el flujo de microfluidos de PDMS como se describió anteriormente. Durante el proceso de ensamblaje del chip de ensayo, la nueva capa de PDMS se unió al sustrato de vidrio de manera que las matrices de canales de flujo de muestra (200 jm (ancho) x 2,5 cm (largo) x 50 jm (alto)) se colocaron perpendiculares a las bandas de microarreglos de LSPR. El chip de ensayo de microarreglos construido se montó en una platina XY motorizada (ProScanlII, Prior Scientific, Rockland, MA), se cargó manualmente una muestra de ~ 5 j l en cada uno de los canales de flujo del chip usando una pipeta y se realizó un escaneo de imagen automatizado a una velocidad de 180 puntos de detección/minuto. La Figura 8 muestra la configuración del sistema mediante el cual se detectaron las matrices de microarreglos de AuNR y se tomaron imágenes con base en una técnica de obtención de imágenes de LSPR de campo oscuro.
Brevemente, el proceso de formación de imágenes de microarreglos de LSPR comenzó guiando la luz blanca en la lente de aceite del condensador de campo oscuro (n.a. 1,20 a 1,45, Mager Scientific) instalada en el microscopio fluorescente invertido (Nikon Eclipse Ti-S, Nikon). La unión de las moléculas de analito en la superficie metálica nanoestructurada de cada microarreglo indujo un aumento en la velocidad de dispersión de la luz dentro de una determinada banda espectral, así como un desplazamiento hacia el rojo en el pico de LSPR (630 nm para las AuNR como se muestra en la Figura 5). Se usó un filtro de paso de banda (610-680 nm) para capturar el aumento de intensidad máximo observado para los microarreglos durante la unión a la superficie del analito. Se obtuvieron imágenes de microarreglos con la cámara EMCCD y se grabaron utilizando el software de análisis NIS-Element BR. Se utilizó un programa Matlab personalizado para analizar y cuantificar el cambio de intensidad de dispersión para cada molde de microarreglos. La región de interés se seleccionó automáticamente a través de un algoritmo de detección de bordes/sustracción de fondo, y luego los datos sin procesar de cada píxel se leyeron y procesaron.
Simulación óptica del campo electromagnético en una sola nanovarilla de oro al cambiar el índice de refracción local. Para estimar teóricamente el límite de detección de la medición de LSPRmi, se realizó una simulación de dominio de tiempo de diferencia finita (FDTD) y se predijo la eficiencia de dispersión en una sola AuNR utilizando el software comercial de simulación Multiphysics COMSOL. La simulación utilizó las dimensiones de la AuNR que fueron determinadas por los resultados de la información anteriormente descrito de caracterización del material (40 nm de diámetro, relación de aspecto: 2). La disposición de AuNR desacoplada plasmónicamente en los moldes de microarreglos fabricados (Figura 1) permitió centrar la atención en el comportamiento de LSPR de la AuNR única, lo que simplificó significativamente la simulación. La permitividad compleja del oro dependiente de la frecuencia se deriva del modelo Lorenze-Drude (Kabashin, A. V. et al., Nature Mater. 8, 867-871 (2009)).
El dominio de campo lejano se definió como un caparazón esférico que rodea la AuNR con un radio idéntico a la mitad de la longitud de onda de la luz incidente. Como condición límite de la simulación, se colocó una capa de espesor perfectamente coincidente idéntica a la mitad de la longitud de onda de la luz incidente en la parte superior de la superficie de la caparazón esférica del dominio de campo lejano, en la que la intensidad de la dispersión de luz de la AuNR decae exponencialmente. El vector de onda y la polarización del campo eléctrico de la luz incidente se estableció como perpendicular y paralela a la orientación de la AuNR, respectivamente. Esto excitó el modo resonante longitudinal de la AuNR en la simulación. El tamaño de la malla se estableció en 1 nm en la superficie de la AuNR y no más grande que 1/10 de la longitud de onda estudiada en otra parte (Figura 9A).
La distribución espacial del campo electromagnético en el plano del campo lejano se calculó a frecuencias variables con y sin la presencia de la AuNR para determinar la intensidad de la onda de dispersión de la AuNR, Iaunr y la intensidad de la señal de fondo, Ifondo. La sección transversal de dispersión Cscs de la AuNR se determina integrando la intensidad de la onda de dispersión sobre la superficie del plano de campo lejano O como
Csc = í T 1 fondo l,n O
y también se usa para calcular el límite de detección.
A continuación, se realizó una simulación para predecir cómo la unión a proteínas mejoraría el LSPR mediante el mapeo de la distribución espacial de la intensidad del campo eléctrico local normalizado (|Ey|2/|E0|2) cerca de la superficie de una AuNR descubierta (Figura 9B y 9C), en la que |Ey|2 es la intensidad del componente y del campo local y |E0|2 es la intensidad de campo de la luz incidente. Se simuló el desplazamiento espectral de la luz dispersada desde la AuNR debido a la unión a proteínas. La simulación modeló la unión a proteínas como la formación de una capa dieléctrica uniforme en una superficie de AuNR funcionalizada con anticuerpos, que se suponía que causaba que el valor del índice de refracción cercano a la superficie cambiara de 1,33 (agua) a 1,5 (proteína hidratada) (Voros, J. Biophys. J. 87, 553-561 (2004)). La proteína unida a la superficie de AuNR puede ser el analito o el anticuerpo sonda utilizado en el estudio. La simulación se realizó con un espesor de la capa de proteína que varía de 0 a 10 nm con un incremento de 2 nm. Comparando la Figura 9B y la Figura 9C, se muestra que se predice que el recubrimiento de la AuNR con una capa de proteína de 10 nm de espesor producirá una mejora notable de |Ey|2/|E0|2. La Figura 9D muestra un conjunto de los espectros de dispersión de luz de la AuNR recubierto con la capa de proteína de espesor variable.
Predicción teórica del límite de detección de la medición de LSPRmi. La simulación descrita anteriormente predice un notable desplazamiento espectral hacia el color rojo, así como una mejora de la intensidad para dispersar la luz de la AuNR a un espesor mayor de recubrimiento de proteínas (Figura 9d). En el presente documento, la intensidad de dispersión de la luz es la señal de LSPR que se observa directamente en las mediciones. Usando el enfoque de simulación anterior, se calcularon los valores cuantitativos del cambio espectral y la variación de intensidad de la señal de LSPR inducida por la unión del analito en un único AuNR. Se supuso que la conjugación de anticuerpos de la AuNR en el ensayo forma una capa uniforme de moléculas de anticuerpos estrechamente empaquetadas con un espesor de 7 nm (Erickson et al., Biol. Proced. Online. 15, 32-51 (2009) y un índice de refracción de 1,5. Además, se supuso un volumen teórico llamado "volumen de detección" en la parte superior de la capa de anticuerpos (recuadro de la Figura 10). El espesor del volumen de detección es equivalente al diámetro efectivo de la molécula de analito (típicamente 3,4 nm para citocinas; Erickson et al., Biol. Proced. Online. 15, 32-51 (2009)). En el modelo, el índice de refracción de la capa de volumen de detección también se estableció en 1,5 cuando el volumen estaba completamente ocupado por las moléculas del analito. La variación de la señal de LSPR AI debido a la unión a la superficie de una molécula de analito única viene dada por:
Figure imgf000015_0001
(2 i
en la que ARI es el cambio del índice de refracción en el volumen del volumen de detección Vs, que se describió anteriormente, Va es el volumen de la molécula de analito individual, y AS es la diferencia de señal observada experimentalmente entre antes y después de cargar las moléculas de analito en la superficie de AuNR. Más específicamente, AS es el desplazamiento de longitud de onda máximo de LSPR inducido por la adsorción del analito, dado por:
Figure imgf000015_0002
para la medición del desplazamiento del espectro, en la que AAp es el desplazamiento del pico de resonancia, y RIU es la unidad de índice de refracción (= 1). AS es el desplazamiento de la intensidad de LSPR inducida por adsorción del analito (por ejemplo, Intensidad de dispersión), dada por
Figure imgf000015_0003
para la medición de imágenes con base en la intensidad, en la que
Figure imgf000015_0004
es la integración del cambio en la sección transversal de dispersión ACscs después de la carga del analito sobre A = 610-680 nm, que es la banda de filtro óptico utilizada en este estudio (área gris en la Figura 9D). En el presente documento, ACscs se deriva de la ecuación (1) anterior. Para una concentración dada de analito de [A] en el canal de flujo, la probabilidad del evento de unión del analito en la superficie única de AuNR Q puede estimarse utilizando la isoterma de Hill-Langmuir como (De Boer, JH El The dynamical character of adsorption, segunda edición. (Oxford University Press, Londres, 1968)):
en la que Kd es la constante de unión determinada en el estado de disociación de equilibrio entre el anticuerpo y su antígeno de acoplamiento, KA es la concentración de ligando que produce la mitad de la ocupación, y n es el coeficiente de Hill. Alternativamente, 9 representa la relación del número de sitios de unión ocupados sobre el número total de sitios disponibles para la unión del analito.
Suponiendo que la densidad de deposición de AuNR por unidad de área dentro del canal de detección sea D y que los sitios totales de unión en un único AuNR sean Ns, el cambio total de intensidad de la señal AIa recogido del área de detección de microarreglos puede calcularse mediante:
Figure imgf000016_0001
El LOD del analito para LSPRmi se puede determinar cuando el cambio de señal es igual a la incertidumbre de la señal del sistema
Figure imgf000016_0002
donde Usis es la incertidumbre debido al sistema de detección y Uajuste es la incertidumbre debido al ajuste del pico al reunir el espectro de dispersión. Por lo tanto, se obtiene:
Figure imgf000016_0003
Combinando las ecuaciones (2) y (5) permite estimar analíticamente el LOD de LSPRmi como:
Figure imgf000016_0004
Para estimar la mejora de la sensibilidad del LSPRmi sobre la medición convencional de LSPR con base en el espectro, la relación señal/ruido en un evento de unión de analito se cuantifica utilizando la ecuación de Langmuir de primer orden en la ecuación (6) El total de sitios de unión disponibles en una única AuNR (40 nm (ancho) * 80 nm (Largo)) puede calcularse como ~361. En un caso extremo en el que la superficie de AuNR está completamente ocupada, el cambio de espectro (AA = 5,1nm) y el cambio de sección transversal de dispersión integrados de 610 nm a 68o nm (ACscs = 7,2%) como se muestra en la Figura 10.
De acuerdo con el estudio más reciente que utiliza un biosensor de LSPR de nanovarilla con base en el espectro (Nusz et al., ACS Nano 3, 795-806 (2009)), la configuración experimental de los investigadores (fuente de luz blanca incandescente, detección de dispersión CCD) produjo una varianza de señal de Uespectro = 0,3nm. La incertidumbre debida al sensor y la unidad de procesamiento de señal en el sistema es Uintensidad = 0,11% al medir muestras de blancos. La sustitución de estos números en la ecuación (6) permite calcular la relación de LOD de la plataforma de LSPRmi con base en la intensidad, LODintensidad, con aquella de la técnica convencional de medición de desplazamiento del espectro, LODespectro, como
Figure imgf000016_0005
Por lo tanto, se estima que la técnica reduce el LOD en un factor de ~10 en comparación con el esquema de detección de LSPR convencional.
Intensidad de microarreglos AuNR y varianza de la señal de LSPRmi. Se caracterizó la varianza estructural a través de los microarreglos de AuNR depositados en un sustrato de vidrio común a partir de imágenes escaneadas de campo oscuro tomadas para sus mediciones de calibración (Figura 11A). El panel superior de la Figura 11A muestra el perfil de intensidad de línea de 24 microarreglos consecutivos de AuNR en el mismo chip. Los datos de la imagen indican una intensidad promedio de ~ 21.000 con un coeficiente de varianza (CV) de alrededor del 8% en todos los microarreglos. Revela la consistencia de la técnica de fabricación en la producción de bandas de microarreglos con buena uniformidad estructural de matriz a matriz. Dicha uniformidad proporcionó un CV de ~7% o menos en los puntos de datos de calibración tomados para 10 bandas de microarreglos en el mismo chip a una concentración dada de analito (TNF-a) (Figura 11B). El resultado verificó la alta reproducibilidad y precisión de las mediciones de LSPRmi utilizando estos microarreglos.
Incertidumbre del sistema y límite de detección de LSPRmi. Para caracterizar la incertidumbre y el límite de detección del sistema de LSPRmi, se realizó un experimento de control que midió la varianza de la señal de fondo con microarreglos de AuNR conjugados con anticuerpos sin citocinas cargadas. La incertidumbre promedio del sistema se calculó como —0,11%, que se determinó mediante la señal mínima distinguible equivalente a un factor de confianza establecido en 3 veces la desviación estándar del ruido de fondo (a). Los límites de detección de las citocinas objetivo se obtuvieron de 3a/kpendiente, en la que kpendiente es la pendiente de la regresión de las curvas de calibración utilizando el ajuste de curva sigmoidal.
Resultados
Preparación del chip de microarreglo de LSPR. El biochip de LSPRmi incluye ocho canales de microfluidos en paralelo de 250 nl de volumen y seis bandas serpenteantes de ensambles de AuNR funcionalizados con anticuerpos (las propiedades características de las AuNR se muestran en la Figura 5) con diez vueltas en un sustrato de vidrio, que corren ortogonales a los canales (Figura 1a). Cada canal de microfluidos tiene puertos de entrada y salida para la carga y lavado de reactivos. Este diseño de chip da lugar a una matriz de 480 puntos biosensores de LSPR en forma de banda de 25 pm de ancho y 200 pm de largo cada uno en todo el chip. Las bandas de AuNR se conjugaron con anticuerpos contra seis citocinas diferentes: interleucina 2 (IL-2); interleucina 4 (IL-4); interleucina 6 (IL-6); interleucina 10 (IL-10); interferón gamma (IFN-y); y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) utilizando una técnica de modelado de microfluidos de una sola etapa (Figura 6). La técnica de modelado de microfluidos permitió la construcción de diez segmentos de seis puntos de inmunoensayo múltiple paralelos colocados en cada canal sin una engorrosa dispensación manual de reactivos en la gran cantidad de ubicaciones (Figura 1a).
Las imágenes de microscopía electrónica de barrido muestran que los puntos de detección de LSPR están recubiertos con una monocapa desordenada con una densidad de número de superficie de —1 partícula por 2,56 um2 (Figura 1a y Figura 7), que corresponde a una distancia promedio de partículas a partícula > 200 nm (Figura 1b). El cálculo teórico predice una longitud de decaimiento mucho más corta (65 nm) del campo EM foto excitado altamente localizado que rodea cada nanopartícula (panel insertado de la Figura 1b). La distribución dispersa de las nanopartículas elimina los acoplamientos electromagnéticos complicados entre las nanopartículas vecinas en los ensambles. Esto vuelve crítico el desempeño del sensor de LSPR de múltiples arreglos no influenciado por la disposición desordenada de las nanopartículas. El ensamble de —2.000 AuNR desacoplados plasmónicamente en cada punto del sensor produce un espectro de dispersión con una resonancia distinta (Figura 1c). Por lo tanto, el principio de la plataforma de LSPRmi se basa en el cambio de intensidad de luz de dispersión en un intervalo de resonancia de plasma particular causado por la unión del analito objetivo sobre la AuNR.
Inmunoensayo múltiple de LSPR en tiempo real. Caracterizar el rendimiento dinámico de los biosensores de LSPR permite evaluar el tiempo total del ensayo. Con este fin, las variaciones de señal del sensor en tiempo real asociadas con la unión a la superficie del analito se midieron en el esquema múltiple. Esta medición utilizó una mezcla de las seis citocinas objetivo suspendidas en solución salina tamponada con fosfato (PBS). En el presente documento, se estableció un nivel de concentración diferente para cada analito, de manera que IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a e IFN-y era de 10.000 pg/ml, 5.000 pg/ml, 3.000 pg/ml, 1.000 pg/ml, 500 pg/ml y 250 pg/ml, respectivamente. La mezcla de citocinas se cargó en uno de los canales de microfluidos del dispositivo y se observó la variación de la señal con el transcurso del tiempo desde los puntos del sensor (Figura 2). A partir de esta medición, se descubrió que el evento de unión al analito alcanzó el equilibrio dentro de los 30 minutos posteriores a la introducción de la mezcla de citocinas. Esta rápida cinética de unión al analito permite que el ensayo se realice con un tiempo de incubación muy corto en comparación con los inmunoensayos convencionales de fluorescencia tipo sándwich. Después de alcanzar el equilibrio, las muestras cargadas se lavaron para eliminar los constituyentes del suero no específicamente unidos de las superficies del sensor. Esto dio como resultado una reducción de la intensidad de la señal del sensor en ~ 8%.
Biosensores y calibración de microarreglos de LSPR de alto rendimiento. Una característica importante del ensayo con chip de LSPRmi es su capacidad para analizar los múltiples analitos con alto rendimiento. Esta capacidad se demostró al realizar una calibración masiva del sensor con muchos datos en paralelo utilizando el dispositivo en un corto período de tiempo. Los datos de calibración obtenidos para cada analito permitieron posteriormente una determinación del intervalo dinámico y el límite de detección del ensayo. Al principio, se prepararon ocho muestras de PBS, cada una con una mezcla de las seis especies de citocinas purificadas (es decir, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-y y TNF-a) y fueron pipeteado manualmente en las entradas de los ocho canales del dispositivo (Figura 3a). Cada muestra introducida en uno de los canales contenía las citocinas, todas a la misma concentración, que era uno de los ocho niveles entre 50 y 10.000 pg/ml. La respuesta del sensor se registró en 480 puntos de detección de microarreglos de AuNR individuales en un solo chip a una velocidad de barrido de 180 puntos/minuto antes de cargar la muestra y después del lavado cuando la unión a la superficie del analito alcanzó el equilibrio a ~ 30 minutos. Por lo tanto, el tiempo total del ensayo, incluida la carga y el lavado de muestras (5 minutos), la incubación y el equilibrio (30 minutos) y el escaneo de imágenes (5 minutos) fue de alrededor de 40 minutos. La Figura 3b muestra el resultado del mapeo de la variación de intensidad local (AI/Iü) después de cargar y lavar las moléculas de citocina en 480 puntos del sensor, en el que lo es la intensidad original de la señal del sensor antes del ensayo y Al es el cambio de intensidad después del ensayo. Luego se obtuvieron las curvas de calibración del sensor para las seis citocinas graficando el cambio de intensidad normalizado Al/lo promediado espacialmente sobre 10 puntos del sensor en función de la concentración del analito (Figura 3c). Además, se verificó que estas mediciones eran consistentes en diez réplicas de puntos del sensor con un coeficiente de varianza promedio de alrededor del 7% como se describió anteriormente. Las curvas de calibración indican que el ensayo logra un amplio intervalo dinámico de 10 a 10.000 pg/ml para los biomarcadores de citocinas. Las líneas punteadas en los gráficos representan curvas sigmoidales ajustadas a los puntos de datos (tipo Hill). El límite de detección (LOD) se determinó para cada analito de acuerdo con lo definido por 3a/kpendiente, en el que a y kpendiente son la desviación estándar de la señal de fondo obtenida a partir del control con el blanco y la pendiente de la regresión de cada curva de calibración, respectivamente. Los LOD determinados fueron 11,43 pg/ml (TNF-a), 6,46 pg/ml (IFN-y), (IL-2), 20,56 pg/ml (IL-4), 11,29 pg/ml (IL-6), y 10,97 pg/ml (IL-10) como se resume en la Tabla 1.
Inmunoensayo de microarreglos de LSPR múltiple de citocinas en suero. Para probar la capacidad del inmunoensayo múltiple del dispositivo, se prepararon conjuntos de muestras de suero utilizando suero humano inactivado por calor y absorbido por carbón y enriquecido con diferentes mezclas de citocinas. Usando estas muestras, se obtuvieron imágenes de señal posteriores al ensayo para el panel de los seis puntos de detección de bandas integradas dentro del mismo canal de microfluidos, en el que se cargó una muestra patrón de mezcla de citocina particular. Se observó que la intensidad de la señal de cada conjunto de sensores dependía de la citocina objetivo e independiente de la presencia de citocinas fuera del objetivo en la solución de suero (Figura 4a). El cambio de intensidad se tradujo en la concentración de analito detectada en cada sensor a partir de las curvas de calibración obtenidas anteriormente (Figura 4b). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las concentraciones de citocinas medidas y el valor esperado de 500 pg/ml. Además, los sensores dirigidos a las citocinas ausentes en la matriz del suero produjeron señales por debajo de su LOD como se esperaba. Se calculó el porcentaje de recuperación, que se define como la cantidad de analito detectado como la fracción de la cantidad de analito conocido en una muestra. El porcentaje de recuperación de todas las citocinas se ubicó dentro de un intervalo aceptable de 85-115% (Guía para la industria: Validación de Procedimiento Bioanalítico. Rockville, MD: Administración de Alimentos y Medicamentos, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, 2001). Por lo tanto, el ensayo múltiple exhibe una reactividad cruzada mínima entre los seis biosensores de citocinas.
Validación del ensayo con el procedimiento estándar de oro. La amplia aceptación de un nuevo procedimiento de inmunoensayo múltiple utiliza su validación completa con el ensayo "estándar de oro" existente, ELISA. Se prepararon muestras de suero de donantes sanos enriquecidas con una mezcla de seis citocinas en concentraciones que abarcan todo el intervalo dinámico del ensayo y se usaron para realizar inmunoensayos múltiples utilizando el chip de LSPRmi. Junto con este ensayo, se realizaron mediciones basadas en ELISA de los analitos para las mismas muestras que anteriormente. Las mediciones basadas en ELISA se basaron en el esquema de una sola muestra. En otras palabras, el ensayo apuntó solo a una de las seis citocinas en cada medición para evitar cualquier posible interferencia entre diferentes moléculas de sonda. Se repitieron las mediciones de ELISA para una sola muestra para las seis citocinas en las muestras de suero preparadas anteriormente. Finalmente, las mediciones del inmunoensayo de LSPRmi se compararon con las mediciones de ELISA y se observó una excelente correlación (R2 = 0,9726), lo que resultó en una regresión lineal casi uno a uno entre los dos procedimientos de ensayo (Figura 4c).
Monitoreo del estado inmune de pacientes pediátricos con cirugía de derivación cardiopulmonar.
Aprovechando las fortalezas del inmunoensayo de LSPRmi, se demostró la utilidad de la tecnología para permitir el monitoreo de la respuesta inflamatoria de los recién nacidos después de la cirugía cardiotorácica que requiere derivación cardiopulmonar (CPB). La reparación de defectos cardíacos congénitos requiere cirugía a corazón abierto con CPB para suplantar la función corazón-pulmón durante la cirugía, y es el defecto congénito más común en los Estados Unidos (Agus, MSD, et al., N. Engl. J. Med. 367, 1208 -19 (2012)). Se sabe que el contacto de la sangre con las superficies artificiales del circuito de CPB provoca una respuesta inflamatoria sustancial en el período postoperatorio inmediato que normalmente se restaura a los niveles preoperatorios dentro de las 48 horas (Mahle, WT, et al., Ann. Thorac. Surg 97, 950-6 (2014)). Se recogieron muestras de suero antes de la cirugía (Pre) y en los días postoperatorios uno (D1), dos (D2), tres (D3) y cuatro (D4) y se utilizó el inmunoensayo de LSPRmi para cuantificar los niveles de citocinas circulantes en suero en estos días en dos neonatos sometidos a cirugía cardíaca congénita con CPB (Figura 4d). Se observaron niveles mayores tanto de IL-6 como de IL-10 en el primer día postoperatorio después de la CP en ambos pacientes, seguido de un retorno a los niveles preoperatorios de todas las citocinas en los días postoperatorios D2, D3 y D4. El ensayo de LSPRmi demuestra una capacidad para detectar grados variables de expresión de citocinas.
Tabla 1: Los LOD de citocinas objetivo se determinaron a partir de la señal analítica distinguible mínima definida por 3a/Kpend¡ente, en la que a es la derivación estándar de las señales de LSPRmi de muestras de blancos y Kpendiente es la pendiente de la regresión obtenida a partir de las curvas de calibración usando el ajuste de curva sigmoidal
SD del blanco (a) Usistema (3a) Kpendiente LOD = 3a/Kpendiente ___________ (%)________________(%)____________ (%)*(pg/ml) -1 __________ (pg/ml)
IFN-y 0,022 0,065 0,010 6,46
TNF-a 0,034 0,103 0,009 11,43
(continuación)
Citocina SD del blanco (a) Usistema (3a) Kpendiente LOD — 3a/Kpendiente (%) (%) (%)*(pg/ml) -1 (pg/ml)
IL-2 0,069 0,206 0,010 20,56
IL-4 0,031 0,092 0,020 4,60
IL-6 0,038 0,113 0,010 11,29
IL-10 0,030 0,088 0,008 10,97
Ejemplo 2
El ensayo de citocinas de LSPR descrito en el Ejemplo 1 se usó para determinar los niveles de citocinas en pacientes con leucemia sometidos a tratamiento. Los resultados se muestran en la Figura 12. Los dos pacientes eran pacientes con leucemia linfoblástica aguda (ALL) recidivante que se habían sometido a terapia con células T del receptor de antígeno quimérico (células T del CAR). Esta terapia da como resultado la liberación de mediadores inflamatorios (citocinas) que dan como resultado un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica que conduce a inestabilidad hemodinámica y conmoción. Hay dos terapias disponibles para bloquear la acción de dos de estas citocinas; etanercept bloquea el factor de necrosis tisular alfa (TNF-a) y el tocilizumab bloquea la interleucina 6 (IL-6). Estas terapias funcionan si los niveles de citocinas son elevados y el uso excesivo de las terapias tiene el potencial de inhibir inmunológicamente al paciente y ponerlo en riesgo de desarrollar sepsis (infección abrumadora). Actualmente, el tiempo de respuesta estándar para medir las citocinas es de días, por lo que los pacientes generalmente reciben tratamiento sin conocer los niveles de citocinas.
Ambos pacientes se presentaron a la PICU con el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica que progresó hasta conmoción. Las medidas se proporcionaron a los médicos tratantes del paciente 1 para ayudar a guiar la terapia con tocilizumab. No se tomaron decisiones clínicas sobre los datos del paciente 2 debido a la condición clínica del paciente.
Ejemplo 3
Este ejemplo describe la incorporación de electroósmosis de CA (ACEO) en ejemplos de dispositivos.
Fabricación y funcionalización
Fabricación del dispositivo:
El despegue fotolitográfico estándar, los procesos de micromaquinado a granel y de pulverización catódica se utilizan para depositar microelectrodos de placa paralelas coplanares Cr/Pt (50 nm) en sustratos de vidrio, como se muestra en la Figura 14a. Brevemente, las obleas de vidrio se trataron con solución Piraña (H2SO4:H2O2 = 3:1 v/v), se enjuagaron completamente con agua DI y se secaron al aire antes de su uso. El patrón del electrodo se transfirió primero a una capa de resistencia positiva previamente recubierta (AZ726) usando una fotomáscara de campo oscuro y litografía de contacto. Después de eliminar la fotorresistencia expuesta con el revelador, se usó un procedimiento de evaporación de haz E (Evaporador EnerJet) para depositar 10 nm de cromo como capa de adhesión y luego 50 nm de platino encima. Los sustratos de vidrio recubiertos con electrodos se remojaron en solución de acetona pura para eliminar el residuo fotorresistente y la grasa, y luego se trataron con solución de ácido nítrico (HNO3:H2O = 1:2 v/v), se enjuagaron completamente con agua desionizada, se mantuvieron en un baño ultrasónico con agua desionizada y se secaron al aire para una mayor función de la superficie.
Funcionalización del dispositivo:
Las superficies de los sustratos de vidrio y la capa de máscara de microfluidos PDMS se trataron con plasma de O2. Inmediatamente después del tratamiento con plasma, la máscara PDMS y los electrodos en el sustrato de vidrio se alinearon bajo un microscopio para garantizar que los canales de modelado de PDMS caigan entre los electrodos adyacentes (Figura 2b). El tratamiento con plasma de O2 puede generar una superficie de vidrio cargada negativamente debido a los grupos hidroxilo disociados existentes en el vidrio, lo que permite que el sustrato de vidrio atraiga las AuNR estabilizadas con CTAB cargadas positivamente sobre su superficie. Se cargó una solución coloidal que contenía AuNR a través del canal de modelado de microfluidos a un caudal de 1,5 pl/min durante 2 minutos en ambas direcciones. Luego, el chip se almacenó en una placa de Petri durante 2 horas con entradas y salidas selladas con un vidrio de cubierta para evitar la evaporación y evitar el secado de la solución de AuNR en los canales.
Los canales de microfluidos se lavaron luego con agua DI (alrededor de 5-6 (pl) para eliminar las AuNR no unidas en la solución y se cargaron con solución acuosa Biotina PEG (polietilenglicol, 10 kDa) 1 mM tiolada (NANOCS). La afinidad más fuerte del grupo de anclaje tiol con la superficie de oro permite que la solución de PEG Biotina tiolada reemplace el recubrimiento de CTAB y sirva como un conector para sondear estreptavidina. Las AuNR funcionalizadas con PEG-Biotina se incubaron durante la noche con tejidos húmedos en la placa de Petri para construir un ambiente de humedad y Evitar la desecación.
Plataforma de biosensores
Configuración para detección general
Se usó microscopía de campo oscuro con un dispositivo acoplado de carga multiplicadora de electrones (EMCCD) en la detección de señal para el nanobiosensor LSPR acoplado con ACEO descrito anteriormente, como se muestra en la Figura 15a. La detección basada en LSPR mide el cambio de espectro de absorbancia (cambio de índice de refracción local) de una superficie metálica nanoestructurada debido a la unión de moléculas de analito. En el presente documento, esta señal de cambio de espectro se convierte en un cambio de intensidad óptica mediante el uso de un filtro de paso de banda adecuado (680/13) junto con el detector EMCCD. La señal de intensidad óptica se analiza a través de una gran cantidad de biosensores de nanopartículas en el microarreglo, que contiene información estadística y biológicamente significativa. El modelo teórico predice que este enfoque da como resultado un valor LOD más de 10 veces menor que el de los esquemas de detección de cambio de espectro comúnmente utilizados en los biosensores de LSPR sin etiquetas convencionales conocidos en la técnica anterior, por ejemplo, documentos US 2013/0065777 A1 o Acimovic et al.: "LSPR Chip for Parallel, Rapid, and Sensitive Detection of Cancer Markers in Serum", NanoLett, vol. 14, No. 5, páginas 2636-2641 y Acimovic et al.: "Supporting Information LSPR Chip for Parallel, Rapid, and Sensitive Detection of Cancer Markers in Serum", NanoLett, vol. 14, páginas 1­ 14.
Detalles del ensayo
La máscara PDMS con canal de carga se despegó y se reemplazó inmediatamente por canales rectos paralelos (400 |jm (ancho) * 2,5 cm (Largo) * 50 jm (alto)) perpendiculares al código de barras del electrodo, que se muestra en la Figura 14c. Para generar un entorno de concentración de iones adecuado, se usó una vez una solución de PBS diluida 1.000 veces como tampón de enjuague para eliminar las moléculas de biotina-PEG tioladas no unidas. Luego, el chip se montó en una platina motorizada de microscopio de campo oscuro X-Y (ProScanlII, Prior Scientific, Rockland, mA) con electrodos conectados a dos generadores de función de CA (diferencia de fase 180) y listos para las mediciones. La estreptavidina se disolvió una vez en PBS diluido 1000 veces con un intervalo de concentración de 50 fg/ml (0,67 fM) a 100 pg/ml (1,33 pM) y se inyectó con una bomba de jeringa a un caudal de 2 jl/min. El microarreglo de AuNR se detectó y se obtuvieron imágenes con base en la técnica de formación de imágenes de LSPR de campo oscuro mencionada anteriormente. Se usó un filtro de paso de banda (680/13 nm) para capturar el aumento de intensidad máxima de los microarreglos debido a la unión de biotina y estreptavidina en la superficie de oro. La imagen de microarreglos fue grabada en tiempo real por la cámara EMCCD usando el software de análisis NIS-Element BR y se analizó y cuantificó el cambio de intensidad de dispersión mediante un código MATLAB personalizado desarrollado en nuestro laboratorio.
Resultados
Los resultados muestran que el nanobiosensor de LSPR acoplado con ACEO detectó estreptavidina desde 50 fg/ml (“ 0,67 fM), como se indica en la Figura 16a. El límite de detección (LOD) para el biosensor acoplado a ACEO se calcula en 36,3 fg/ml (con base en 3a de la señal de control, en la que a es la derivación estándar de la señal cuando se mide la muestra del blanco) que es aproximadamente 1.000 veces menor que el LOD de aquella sin ACEO (29,4 pg/ml), que se muestra en la Figura 16b. Además, el tiempo de ensayo se acortó a 15 minutos dos veces más rápido que el ensayo anterior con el mismo volumen de muestra (5 jl). El flujo de corte en la superficie de detección también puede ayudar a eliminar la unión no específica, como se muestra en la Figura 16d.
Ejemplo 4
Los primeros intentos para citocinas objetivo, un componente biológico clave de la respuesta inflamatoria, en la sepsis dieron como resultado resultados mixtos para más de 100 ensayos clínicos de fase II/III. Los diferentes resultados de estos estudios son un resultado directo de la naturaleza heterogénea de esta compleja población de pacientes, diferencias fundamentales en genética, así como diversas etiologías de enfermedades (infecciones bacterianas/virales, trauma) que dan como resultado clases dispares de desregulación inmune. Se contempló que la integración de la posible estratificación de riesgo con biomarcadores y las terapias anticitocinas dirigidas con precisión en el diseño de ensayos clínicos aumentará en gran medida la probabilidad de que estos ensayos muestren un beneficio significativo.
El presente ejemplo prueba un algoritmo de estratificación de riesgo con biomarcador validado y una terapia anticitocina dirigida con precisión utilizando compuestos biológicos anticitocina actualmente aprobados por la FDA en el diseño de ensayos clínicos.
Diseño/Procedimientos: Brevemente, se usó la plataforma de inmunoensayo de microfluidos descrita en el presente documento que permite la cuantificación rápida (<30 minutos), de múltiples citocinas (> 6 analitos) a partir de pequeños volúmenes de sangre (<1 gota de sangre).
Resultados: se midieron cinco biomarcadores en suero, que juntos tienen un valor predictivo negativo para la mortalidad a los 28 días del 97%, cuando se mide dentro de las primeras 24 horas de ingreso en la PICU. Este panel permite la estratificación del riesgo de pacientes con sepsis pediátrica en grupos de bajo riesgo de mortalidad (<3% de probabilidad) y alto riesgo de mortalidad (> 25% de probabilidad), con casi 2/3 de los pacientes clasificados como de "bajo riesgo". Los resultados (Figura 17) mostraron un aumento significativo de dos citocinas en suero, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) e interleucina 6 (IL-6) en pacientes identificados como de alto riesgo en comparación con aquellos identificados como de bajo riesgo (Figura 17 )
Conclusión: la gran variabilidad de los valores de citocinas en suero dentro del grupo de alto riesgo respalda la necesidad de una determinación rápida de citocinas para guiar la terapia anticitocina dirigida con precisión en solo aquellos pacientes con citocinas elevadas.
Ejemplo 5
Este ejemplo describe procedimientos adicionales de fabricación de superficies.
Deposición química de vapor de silanos aminados en la superficie del sustrato para facilitar la deposición de AuNR. Se depositaron silanos aminados (por ejemplo, (3-aminopropil)trietoxisilano, (3-aminopropil)dimetilmetoxisilano o (3-aminopropil)dimetiletoxisilano) en la superficie del sustrato (vidrio o polímero termoplástico (por ejemplo, COP, COC, PMMA) mediante deposición química de vapor (CVD) (vacío, 15-20 mm de Hg durante 18-24 horas). Después de CVD, las AuNR se modelaron en el sustrato funcionalizado con amina utilizando una técnica de modelado de microfluidos a través de la unión dativa entre la AuNR y el sustrato funcionalizado con amina. Los patrones construidos con códigos de barras de AuNR se funcionalizaron con alcano tiolado 10-carboxi-1-decanetiol (HS-(CH2)-io-COOH) a través del intercambio de ligandos y posteriormente se activaron utilizando la química de acoplamiento EDC/NHS estándar. Los anticuerpos de citocina de la sonda se cargaron luego en canales de moldes individuales que forman una matriz de código de barras que consta de seis bandas paralelas, cada una de las cuales funciona con distintos anticuerpos para permitir la detección múltiple de 6 citocinas diferentes a la vez.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un dispositivo de resonancia de plasmón superficial localizado (LSPR), que comprende:
a) un sustrato;
b) una matriz de partículas metálicas en el sustrato, en el que la matriz de partículas metálicas comprende nanotubos localizados, nanovarillas metálicas, nanoesferas, nanoestrellas, nanopirámides de nano-rombos, nanobipirámides o nanoanillos y estructuras de caparazón de núcleo metálico dispuestas en bandas u otros patrones regulares en la superficie de dicho sustrato, y en el que la matriz de partículas metálicas se funcionaliza con anticuerpos específicos para al menos un polipéptido; y
c) una pluralidad de canales de microfluidos en comunicación de fluido con la matriz, en el que cada canal de microfluidos tiene un puerto de entrada y un puerto de salida y es ortogonal a la matriz de partículas metálicas; y
en el que dicho sustrato comprende además una pluralidad de microelectrodos configurados para electroósmosis de CA, en el que dichos microelectrodos están en comunicación operable con dicha matriz de partículas metálicas, y configurado para obtención de imágenes de campo oscuro que escanea la intensidad de la luz de dispersión a través de dicho dispositivo LSPR.
2. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que dichos anticuerpos comprenden una pluralidad de anticuerpos, en el que cada anticuerpo es específico para un polipéptido diferente, en el que preferiblemente dicha pluralidad es tres o más, cinco o más, o diez o más.
3. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dichos polipéptidos son citocinas, proteínas, anticuerpos, preferiblemente seleccionados del grupo que consiste en interleucina 2 (IL-2); interleucina 4 (IL-4); interleucina 6 (IL-6); interleucina 8 (IL-8); interleucina 10 (IL-10); interleucina 12 (IL-12); interferón gamma (IFN-y); y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a).
4. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho dispositivo comprende al menos 5 canales de microfluidos paralelos, preferiblemente al menos 10 canales de microfluidos paralelos; y/o en el que dichos canales de microfluidos tienen un volumen de 10 nl a 10 pl; y/o en el que cada uno de dichos canales de microfluidos tiene un puerto de entrada y un puerto de salida; y/o en el que dichos canales de microfluidos están construidos de PDMS o termoplástico.
5. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho sustrato comprende al menos 100 anticuerpos, preferiblemente al menos 500 anticuerpos, más preferiblemente al menos 1.000 anticuerpos.
6. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho sustrato se trata con plasma de oxígeno, UV/ozono o silanización; y/o en el que dicho sustrato es vidrio o termoplástico; y/o en el que dicha matriz de partículas metálicas son nanovarillas de oro.
7. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dichos anticuerpos están unidos a dicha superficie mediante un enlazador, preferiblemente en el que dicho enlazador es un enlazador de tiol bifuncional C1-C10.
8. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que cada una de dicha matriz de nanopartículas metálicas está en comunicación operable con un par de dichos microelectrodos.
9. El dispositivo de la reivindicación 8, en el que dichos microelectrodos están configurados para suministrar corriente alterna.
10. Un sistema que comprende:
a) el dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; y
b) un aparato de detección de LSPR.
11. El sistema de la reivindicación 10, en el que dicho sistema comprende además uno o más de un componente de manejo de muestras, un componente de análisis de datos y una interfaz de usuario; y/o en el que dicho dispositivo se proporciona como un cartucho.
12. Un procedimiento para medir los niveles de uno o más polipéptidos, que comprende:
a) poner en contacto el sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 con una muestra; y b) medir el nivel de uno o más polipéptidos en dicha muestra usando LSPR y empleando imágenes de campo oscuro que escanea la intensidad de la luz de dispersión a través de dicho dispositivo de LSPR.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dichos polipéptidos son citocinas, proteínas, anticuerpos; y/o en el que dicho uno o más polipéptidos se detectan en formato múltiple; y/o en el que dicha muestra es una muestra biológica, preferiblemente en el que dicha muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en suero, sangre, orina, esputo, líquido cefalorraquídeo y saliva.
14. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el nivel de dichas citocinas es indicativo de la presencia de una respuesta inflamatoria, una respuesta inmune, daño orgánico o infección en un sujeto del que se ha obtenido dicha muestra, en el que preferiblemente dicha respuesta inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en sepsis, cáncer, lupus y enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), y/o en el que los niveles de dicho uno o más polipéptidos se usan para determinar el curso de acción del tratamiento.
15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que dicho ensayo se completa en 40 minutos o menos.
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