CN107849738B - 用于进行免疫测定的系统和方法 - Google Patents

用于进行免疫测定的系统和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107849738B
CN107849738B CN201680021618.3A CN201680021618A CN107849738B CN 107849738 B CN107849738 B CN 107849738B CN 201680021618 A CN201680021618 A CN 201680021618A CN 107849738 B CN107849738 B CN 107849738B
Authority
CN
China
Prior art keywords
lspr
sample
interleukin
aunr
cytokine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680021618.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107849738A (zh
Inventor
M·T·钟
Y·宋
W·M·麦克休
P·陈
K·仓林
T·T·康奈尔
T·P·尚利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Michigan
Original Assignee
University of Michigan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Michigan filed Critical University of Michigan
Publication of CN107849738A publication Critical patent/CN107849738A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107849738B publication Critical patent/CN107849738B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0636—Integrated biosensor, microarrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0645—Electrodes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0877—Flow chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/12—Specific details about materials
    • B01L2300/123—Flexible; Elastomeric
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/16—Surface properties and coatings
    • B01L2300/161—Control and use of surface tension forces, e.g. hydrophobic, hydrophilic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0406—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces capillary forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/043—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces magnetic forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0442—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces thermal energy, e.g. vaporisation, bubble jet
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0457—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces passive flow or gravitation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本文提供了用于测定的系统和方法。具体而言，本文提供了用于进行高通量免疫测定的系统和方法。本公开内容的实施方案提供满足快速(例如接近实时)、准确免疫测定(例如用于除诊断学之外)的需要的多重功能LSPR免疫测定。LSPR测定与现有ELISA测定一样准确，但提供了增加速度和多重功能的优点。此外，LSPR免疫测定能够分析小体积的复杂患者样品(例如血清)。

Description

用于进行免疫测定的系统和方法
本申请要求2015年2月16日提交的美国临时专利申请序列号62/116,741和2015年10月22日提交的美国临时专利申请序列号62/245,066的优先权，其每篇通过引用整体并入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明得到美国国家科学基金授予的资助号1263889的支持。政府对发明有一定的权利。
技术领域
本文提供了用于进行测定的系统和方法。特别地，本文提供了用于进行高通量免疫测定的系统和方法。
背景
细胞因子是负责细胞信号传导和调节免疫细胞的成熟、生长和反应性的生物活性蛋白(Opal,S.M.&DePalo,V.A.Chest 117,1162-1172(2000)；Rothenberg,E.V.Nat.Immunol.8,441-444(2007))。人血清中的细胞因子定量提供了非常有价值的临床信息，用于监测宿主的免疫状态并调节不同炎性疾病病症如败血症的治疗(Damas,P.,etal.Crit.Care Med.25,405-412(1997))、癌症(Lippitz,B.E.Lancet Oncol.14,E218-E228(2013))、狼疮(Maczynska,I.,et al.Immunol.Lett.102,79-82(2006))和移植物抗宿主病(GVHD)(Visentainer,J.E.L.,et al.Exp.Hematol.31,1044-1050(2003))。鉴于人类免疫系统的复杂性和动态性质，生物标志物的检测和趋势以及在疾病状态下发生的微妙变化需要以高准确性、高灵敏度和高通量快速分析复杂组成的多种细胞因子。然而，基于荧光夹心免疫测定法的常规方法没有满足这种需求，因为它们的理想的免疫监测方法在实际实施中面临严格限制。这些限制主要是由于在消耗大量样品量的同时需要多次耗时的加标签和洗涤过程。目前，尚不存在满足参与复杂生物样品分析的接近实时免疫状态监测的所有要求的测定。
需要用于高通量免疫测定的系统和方法。
概要
本文提供了用于进行测定的系统和方法。特别地，本文提供了用于进行高通量免疫测定的系统和方法。
本公开的实施方案提供满足快速(例如接近实时)、准确免疫测定(例如用于除诊断学之外(beside diagnostics))的需要的多重功能LSPR免疫测定。LSPR测定与现有ELISA测定一样准确，但提供了增加速度和多重功能的优点。此外，LSPR免疫测定能够分析小体积的复杂患者样品(例如血清)。
例如在一些实施方案中，本公开提供了局域表面等离子体共振装置(LSPR)，其包括：a)位于例如玻璃或热塑性基板上金属点(例如金或其他贵金属作为纳米棒、球、锥体、双锥体、星或其它形状)阵列，其中所述金属点包含特异性针对至少一种多肽的抗体；和b)与所述阵列流体连通的多个微流体通道。在一些实施方案中，抗体包含多种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)抗体，其中每种抗体特异性针对不同的多肽。在一些实施方案中，所述多肽是细胞因子、蛋白质、抗体或核酸。在一些实施方案中，细胞因子选自例如白介素-2(IL-2)；白介素-4(IL-4)；白介素-6(IL-6)；白介素-10(IL-10)；干扰素-γ(IFN-γ)；肿瘤坏死因子(TNF-α)；酰化刺激蛋白，脂肪因子，白蛋白干扰素，CCL1,CCL11,CCL12,CCL13,CCL14,CCL15,CCL16,CCL17,CCL18,CCL19,CCL2,CCL20,CCL21,CCL22,CCL23,CCL24,CCL25,CCL26,CCL27,CCL28,CCL3,CCL5,CCL6,CCL7,CCL8,CCL9,集落刺激因子,CX3CL1,CX3CR1,CXCL1,CXCL10,CXCL11,CXCL13,CXCL14,CXCL15,CXCL16,CXCL17,CXCL2,CXCL3,CXCL5,CXCL6,CXCL7,CXCL9,红细胞生成素，Gc-MAF，粒细胞集落刺激因子，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，肝细胞生长因子，IL-17，IL1A，IL1B，炎性体，干扰素体(interferome)，干扰素，干扰素β1a，干扰素β1b，干扰素γ，I型干扰素，II型干扰素，III型干扰素，干扰素刺激基因，白介素1家族，白介素1受体拮抗剂，白介素12，白介素12亚单位β，白介素13，白介素16，白介素2，白介素23，白介素23亚单位α，白介素34，白介素35，白介素7，白介素8，白介素-36，白血病抑制因子，白细胞促进因子，淋巴因子，淋巴毒素，淋巴毒素α，淋巴毒素β，巨噬细胞集落刺激因子，巨噬细胞炎症蛋白，巨噬细胞活化因子，单核因子，肌肉激素(myokine)，肌联素(myonectin)，烟酰胺磷酸核糖基转移酶，抑瘤素M，奥普瑞白介素(oprelvekin)，血小板因子4，促炎细胞因子，促巨核细胞生成素(promegapoietin)，RANKL，基质细胞衍生因子1，talimogene laherparepvec，XCL1，XCL2，XCR1，白介素-1，白介素-1受体拮抗剂，白介素-2，白介素-2受体拮抗剂，白介素-4，白介素-6，白介素-8，白介素-10，白介素-12，白介素-17，白介素-23，肿瘤坏死因子α，干扰素γ，颗粒酶B，HSP1AB，MMP-8，MIP-1a，抗体(例如单克隆或多克隆)，核酸(例如DNA，mRNA，miRNA，lncRNA)，核酸探针，趋化因子(c-c基序)配体3(巨噬细胞炎症蛋白1-α)，基质金属蛋白酶-8或热休克蛋白70A1B。在一些实施方案中，微流体通道与金属颗粒阵列正交。在一些实施方案中，该装置包含至少5个(例如10个或更多个)平行的微流体通道。在一些实施方案中，微流体通道具有约10nl至10μl(例如50至500nL)的体积。在一些实施方案中，微流体通道中的每一个具有入口端口和出口端口。在一些实施方案中，微流体通道由PDMS或热塑性材料构成。在一些实施方案中，基板包含至少100个(例如至少200个，至少300个，至少400个，至少500个，至少750个，或至少1000个)抗体。在一些实施方案中，用氧等离子体、UV/臭氧或硅烷化处理基板。在一些实施方案中，抗体经接头(例如C1-C10双功能巯基接头)附接到所述基板。
在一些实施方案中，基板还包括配置为用于AC电渗的多个微电极，其中所述微电极与所述金属颗粒阵列可操作地连通。在一些实施方案中，所述金属纳米颗粒阵列中的每一个与一对所述微电极可操作地连通。在一些实施方案中，所述微电极被配置为提供交流电流。
另外的实施方案提供一种系统，包括：a)上述任何装置；和b)LSPR检测设备。在一些实施方案中，系统还包括样本处理组件、数据分析组件或用户界面中的一个或多个。在一些实施方案中，该装置被提供为盒。
另外的实施方案提供了测量一种或多种多肽的水平的方法，其包括a)使本文所述的系统与样品(例如来自受试者的样品)接触；和b)使用LSPR测量样品中一种或多种多肽的水平。在一些实施方案中，检测是两种或更多种不同多肽的多重检测。在一些实施方案中，多肽是细胞因子。在一些实施方案中，样品是生物样品(例如包括但不限于血清、血液、尿液、痰液、CSF或唾液)。在一些实施方案中，细胞因子的水平指示在受试者中存在炎性反应(例如在败血症、癌症、狼疮或移植物抗宿主病(GVHD))、免疫应答、器官损伤或感染。在一些实施方案中，受试者正在进行化疗、基于细胞或基因的治疗、免疫调节或手术。在一些实施方案中，测量结果用于确定受试者的作用疗程(例如施用免疫抑制剂、阻断细胞因子活性的药物(如依那西普和/或托珠单抗)、抗排斥药物(例如他克莫司)或包含重组蛋白的药物(例如沙格司亭和/或非格司亭)。在一些实施方案中，测量在2小时(例如1小时，50分钟，45分钟，40分钟，35分钟，30分钟，25分钟，20分钟，15分钟，10分钟，5分钟)或更少的时间内完成。
其它实施方案提供了测量来自受试者的生物样品中一种或多种细胞因子的水平的方法，包括：a)使本文所述的系统与来自受试者的生物样品接触；和b)使用LSPR测量样品中一种或多种多肽的水平。
本文描述了另外的实施方案。
附图说明
图1显示了示例性免疫测定的示意图和原理。(A)LSPRmi芯片的示意图。(B)使用SEM图像表征LSPRmi芯片上AuNR的颗粒至颗粒的距离的直方图。(C)LSPRmi方法的原理。
图2显示了多重细胞因子检测期间的实时AuNR微阵列信号。
图3显示了LSPRmi强度作图和校准曲线。(A)由8个微流体检测通道分割的60个抗体功能化AuNR条带组成的LSPRmi芯片布局。(B)在a)中对六种细胞因子通过多分析物校准过程获得的LSPRmi芯片上的480个AuNR条形码传感器点上的LSPR信号强度移位作图。(C)从(B)中的LSPR条形码强度作图获得的TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10的校准曲线。
图4显示了健康供体血清基质和患者血清样品中的多重细胞因子检测。(A)AuNR微阵列在单个微流体检测通道中的暗场图像，其加载了掺入血清基质中的重组细胞因子的不同样品混合物。(B)(A)中样品定量的细胞因子浓度。(C)对于具有32-5000pg/mL的细胞因子浓度的加标血清样品，从LSPRMi测定与金标准ELISA获得的数据之间的相关性。d)通过LSPRmi测定法测量两个CPB手术后儿科患者提取的血清样品的5天细胞因子浓度变化。
图5显示(A)AuNR滴铸在导电玻璃基板上的扫描电子显微镜照片。(B)(A)中从高倍数电子显微镜测量的AuNR的长度和宽度的统计。(C)在溶液中AuNR的消光光谱显示在626nm附近的共振瑞利散射波长。
图6显示了需要玻璃预处理、AuNR沉积和抗体功能的LSPRmi芯片图案化工艺的示意图。
图7显示了在玻璃基板上的微阵列图案内的AuNR颗粒的扫描电子显微镜图像。
图8显示了(A)LSPRmi免疫测定的暗场显微镜设置示意图。(B)使用制备的LSPRmi芯片和暗场成像的LSPRmi测定操作方案的图示。(C)通过定制的Matlab程序分析微阵列图像。
图9显示了一个单个AuNR的光散射响应的FDTD模拟方案。B)由入射光激发的裸露的单个AuNR的近场LSPR强度分布。D)预测的散射光谱(或LSPR光谱)随着涂覆在AuNR上的蛋白质厚度的变化而变化。
图10显示了计算的散射光谱峰的波长(或者，经裸露AuNR表面的值标准化的散射横截面)作为覆盖AuNR表面的蛋白质层的厚度r的函数。
图11显示(A)均匀制造的AuNR微阵列的线强度分布，其是使用暗场成像显微镜测量的。(B)显示LSPRmi信号随着重组TNF-α浓度变异的校准图，其中每个星号代表单独的测量数据点。
图12显示白血病患者血清中的细胞因子水平。
图13显示了ACEO流动及其对表面反应的影响的示意图。
图14显示(a)微电极的沉积(b)AuNR微阵列的表面功能化(c)使用PDMS流动通道的分析物样品加载(d)在ACEO涡流下实时检测靶分析物(e)示例性ACEO装置的图片(f)与电极耦合的AuNR条形码的暗场图像。
图15显示了(a)暗场显微镜设置的示意图(b)示例性ACEO偶联纳米生物传感器内的表面反应(c)由EMCCD收集的实时暗场图像。
图16显示(a)不同浓度下生物素-链霉抗生物素蛋白的实时结合曲线(b)校准曲线(c)表面功能示意图(d)非特异性结合测试。
图17显示了使用本公开实施方案的装置的细胞因子的检测。
图18显示了本公开实施方案的示例性分析系统的工作流程。
定义
本文所用的术语“测定试剂”以最广泛的含义使用，并且是指用于进行本公开的免疫测定的任何有用的、必需的或足够的试剂。实例包括但不限于抗体、对照、缓冲剂、校准标准品等。
本说明书和权利要求书中的术语“样品”以其最广泛的意义使用。它意图包括生物和环境样品。样品可以包括合成来源的标本。
生物样品可以是动物，包括人，流体，固体(例如粪便)或组织，以及液体和固体食物以及饲料产品和成分如乳制品，蔬菜，肉类和肉类副产物以及废物。生物样品可以从各种科的家畜以及野化或野生动物获得，包括但不限于诸如有蹄类动物，熊，鱼类，兔类动物，啮齿类动物等的动物。
环境样品包括环境材料例如表面物质，土壤，水和工业样品以及从食品和乳品加工仪器，设备，装备，器具，一次性和非一次性物品获得的样品。这些实例不应被解释为限制适用于本公开的样品类型。
如本文所用，术语“体外”是指人造环境以及在人造环境内发生的过程或反应。体外环境可以由试管和细胞培养物组成但不限于试管和细胞培养物。术语“体内”是指天然环境(例如动物或细胞)以及在天然环境中发生的过程或反应。
“抗原结合分子”是指结合特异性抗原的分子。实例包括但不限于蛋白质，核酸，适体，合成分子等
“抗原结合蛋白”是指结合特异性抗原的蛋白质。“抗原结合蛋白”包括但不限于免疫球蛋白，包括多克隆、单克隆、嵌合、单链和人源化抗体，Fab片段，F(ab')2片段和Fab表达文库。
当用于指抗体和抗原的相互作用时，“特异性结合(specific binding或specifically binding)”意味着所述相互作用取决于所述抗原上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；换句话说，抗体识别并结合特异性结构而不是一般意义上的抗原。例如如果抗体对于表位“A”是特异性的，则在含有表位“A”和该抗体的反应中含有表位A(或游离的、未标记的A)的蛋白质的存在将减少与该抗体结合的标记的A的量。
如本文所用，“微流体”是指例如用于运输或储存小体积(例如小体积的液体例如测定试剂)的装置。在一些实施方案中，微流体装置的个体通道或室包括10nL至1μL(例如10、20、50、100、200、300、400、500或750nL)的体积，但也可考虑其它大小的体积。
术语“测试化合物”和“候选化合物”是指作为用于治疗或预防疾病、病患、病症或身体功能障碍的候选药物的任何化学实体、药品、药物等。测试化合物包括已知和潜在的治疗化合物。可以使用本公开的筛选方法通过筛选将测试化合物确定为治疗性的。
详述
本文提供了用于进行测定的系统和方法。特别地，本文提供了用于进行高通量免疫测定的系统和方法。
LSPR是当光照射到纳米尺度的特征感测表面上时，围绕贵金属(例如钌，铯，钯，银，金，铱，铂，金及其组合)的纳米尺度结构或纳米颗粒周围出现的等离子体现象。当入射光频率与导电金属纳米颗粒的电子振荡的固有频率相匹配时，入射光和纳米结构化表面之间的相互作用使具有在颗粒表面附近高度增强的电子的颗粒的光学消光最大化，并触发LSPR。共振波长和强度可以通过像蛋白质、核酸和细胞因子一样小的分析物的时间或不可逆吸收而容易地修饰。因此，已经证明它是抗体-抗原结合的有效的无标记检测方法，其允许高灵敏度和实时分析。另外，取消二抗标记可以显著抑制交叉反应性。由于LSPR技术中使用的传感器元件的直径可以小到几十纳米，因此在构建集成在单个芯片上的大量传感器阵列方面提供了显著的优势，这使得能够实现其样品体积显著减少和总测定时间的高通量、多样性感测平台。
依靠标记信号的测量，在ELISA中经常使用的常规夹心免疫测定仅在所有多个试剂过程完成后提供端点分析物读数。如果没有精确了解终点定时，这些测定技术的用户需要遵循需要两个小时的分析物孵育的操作方案。额外的标记和洗涤步骤以及耗时的孵育过程导致总测定时间通常为8小时或更长。相比之下，在本公开中证明的无标记性质和实时分析物结合监测能力都提供了显著的优点。这些特征允许取消多步测定过程，并将分析物孵育时间减少至例如少于30分钟。从实时传感器信号饱和点，可以确定分析物结合测定的终点，其中可以启动洗涤过程以除去非特异性吸附的分析物分子。这允许在单片(on-chip)480个生物感测点上涉及平行样品加载、多分析物(IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α和IFN-γ)结合、孵育和洗涤的整个LSPRmi免疫测定在短时间内完成(如40分钟)。该测定时间比常规ELISA短的十分之一还要短。
尽管具有令人印象深刻的快速性、样本效率和通量，多阵列的LSPR生物芯片方案在血清细胞因子筛选中过去面临着一个主要问题-检测极限(LOD)差。例如已经作出许多努力来鉴定可用于早期检测败血症或评估疾病严重程度的血清细胞因子分布(Wong,H.R.,etal.Critical Care 16,文章R174(2011)；Bozza,F.A.,et al.Critical Care 11,articleR49(2007))。败血症患者的血清细胞因子浓度可以发生宽范围变化，需要宽动态范围和低LOD以提供具有临床效用的有意义信息。Bozza等报告通过在入院的头72小时内测量血清IL-8来预测败血症患者28天死亡率的能力(Bozza et al.，同上)。能够以合理的准确性有意义地区分幸存者和非幸存者的血清IL-8截止值将是能够测量血清细胞因子浓度<100pg/mL的测定。这个截止值已经与之前的研究获得的LOD相当或远低于之前的研究(Endo,T.,etal.Anal.Chem.78,6465-6475(2006)；Acimovic,S.S.,et al.Nano Lett.14,2636-2641(2014))。为了实现这样的高灵敏度，本文所述的检测方法的实施方案采用暗场成像来扫描LSPR生物感测点上的散射光强度(图8)。
非特异性抗体交叉反应在保持多重夹心免疫测定的高准确性中构成重大挑战。当测定涉及复杂生物介质如人血清中的大量抗体对时，该问题变得严重。由于溶液中的抗体、靶分析物和其他生物组分(例如游离血浆蛋白、脂质、电解质等)之间的非特异性结合成指数地增加，其阻止多重测定的成比例扩大。本文描述的LSPR测定克服了这些问题。它额外提供了取消二抗标记的LSPR生物感测方案的无标记特性的优点。对分析物结合的传感器应答的直接测量基本上淬灭了所有生物物质之间的非特异性吸附。结果，该测定在细胞因子浓度为500pg/mL的人血清中显示可忽略的交叉反应性。用于人血清分析时，与商业化多重珠阵列测定(MBAA)相比，LSPRmi测定显示与单一(singleplex)ELISA具有显著更好的相关性(Bozza,F.A.,et al.Critical Care 11,article R49(2007))。
从CPB手术儿科患者获得血清样品，能够确切定义宿主炎症反应的来源-手术并预测测定结果。LSPRmi测定成功测量升高的细胞因子水平，对于先天性心脏病使用心肺转流术(cardiopulmonary bypass)的手术后24小时的两个新生儿中IL-6和IL-10最为显著。观察到与以前报道的非常相似的模式，其中在手术的48小时内患者血清细胞因子水平升高最常见地恢复到术前水平。这种信息是有价值的，因为促炎(例如IL-6)和抗炎(例如IL-10)细胞因子的非常高和/或延长的表达与心肺转流术后的急性免疫功能障碍相关并且预测更差的结果(Ashraf,et al.,Eur.J.Pediatr.Surg.12,862-868(1997)；Seghaye,M.C.,etal.J.Thorac.Cardiovasc.Surg.111,545-553(1996))。本公开实施方案的LSPR测定能够在CPB之后检测两个受试者的可变程度的反应。有多种机制有助于这种可变的细胞因子表达(例如患者年龄，心脏病变，手术和CPB长度，使用术中类固醇等)，然而，不存在使得临床医生监测宿主炎症反应从而根据需要改变治疗策略的接近实时的安全、常规和重复测量血清细胞因子的方法学。本文描述的实验证明了使用LSPR测定法在患者中常规监测多种血清细胞因子的能力。快速周转时间(例如
Figure BDA0001432581740000101
40分钟)、高灵敏度(例如低至
Figure BDA0001432581740000102
6.46pg/mL-20.56pg/mL)、极致样品节约能力(例如
Figure BDA0001432581740000103
1uL样品用于6种细胞因子的10个技术重复测量)和可忽略的交叉反应性使得能够以高统计学准确度常规监测血清细胞因子。这些特征可用于监测大量不同的疾病状态，特别是在婴儿和新生儿，其中样品体积已经是缓解因素。现有方法并不存在这些关键特征，因为测定周转时间和所需血液体积使得使用它们是不切实际的，特别是在小婴儿中。
因此，本文提供了用于并行(例如大规模并行)高通量检测血清中多种细胞因子生物标志物的多阵列LSPR微阵列(LSPR microarray，LSPRmi)装置。本文描述了示例性的设备、系统和方法。
I.装置和系统
本公开的实施方案提供了用于LSPR免疫测定的装置和系统。在一些实施方案中，装置包括LSPR组件和微流体组件。在图1中显示了示例性装置。本公开还提供了使用所述装置来进行LSPR的系统。
A.LSPR表面
在一些实施方案中，装置包括包含用金属功能化的固体表面的LSPR组件。在一些实施方案中，固体表面是玻璃。玻璃基材提供良好的用于成像的光学性能和用于表面功能的表面改性能力。可选的表面包括但不限于透明塑料，例如称为丙烯酸玻璃的聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)，可用表面部分修饰以用于抗体功能的透明热塑性材料；聚碳酸酯；环烯烃共聚物(COC)；环烯烃聚合物(COP)；聚苯乙烯；聚丙烯；和二醇改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PEGT)。
在一些实施方案中，基板涂覆有允许在入射光刺激的负介电常数材料和正介电常数材料之间的界面处的传导电子的共振振荡的金属。这可以发生为允许检测表面等离子体共振(SPR)的本体材料的沉积，或者如本文所述的允许检测局域等离子体共振(LSPR)的离散等离子体纳米颗粒的沉积。支持表面等离子体的金属包括但不限于银，金，铜，钛或铬。在一些实施方案中，金属被提供为局域纳米管或其它几何构型。在一些示例性实施方案中(参见例如图1)，金属纳米棒或其它金属构型以表面上的条带或其他规则图案排列(参见例如Williams SE,Davies PR,Bowen JL,和Allender CJ.Controlling the nanoscalepatterning of AuNPs on silicon surfaces.Nanomaterials 2013；3:192-203；通过引用整体并入本文)。除了纳米棒之外，其它合适的颗粒构型包括但不限于纳米球，纳米星，纳米菱形，纳米锥体，纳米双锥体或纳米环和金属核-壳结构(例如金/银核-壳结构)。银显显示良好的光学性质，但由于银离子的释放，其在生物环境中可能是有毒的。化学惰性金纳米壳提供生物相容性，同时保持银核的非凡光学性能。在一些实施方案中，使用其它贵金属(例如钌，铑，钯，锇，铱，铂)。
在一些实施方案中，金属表面或区域用与特定肽或多肽(例如抗原)结合的抗体(例如单克隆抗体或多克隆抗体)进行功能化。本公开不限于特定的抗体。在一些实施方案中，抗体对于细胞因子或趋化因子(例如白介素-2(IL-2)；白介素-4(IL-4)；白介素-6(IL-6)；白介素-10(IL-10)；白介素-8(IL-8)；白介素-12(IL-12)；干扰素-γ(IFN-γ)；或肿瘤坏死因子α(TNF-α)中的一种或多种)是特异性的。另外的细胞因子包括但不限于酰化刺激蛋白，脂肪因子，白蛋白干扰素，CCL1,CCL11,CCL12,CCL13,CCL14,CCL15,CCL16,CCL17,CCL18,CCL19,CCL2,CCL20,CCL21,CCL22,CCL23,CCL24,CCL25,CCL26,CCL27,CCL28,CCL3,CCL5,CCL6,CCL7,CCL8,CCL9,集落刺激因子,CX3CL1,CX3CR1,CXCL1,CXCL10,CXCL11,CXCL13,CXCL14,CXCL15,CXCL16,CXCL17,CXCL2,CXCL3,CXCL5,CXCL6,CXCL7,CXCL9,红细胞生成素，Gc-MAF，粒细胞集落刺激因子，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，肝细胞生长因子，IL-17，IL1A，IL1B，炎性体，干扰素体，干扰素，干扰素β1a，干扰素β1b，干扰素γ，I型干扰素，II型干扰素，III型干扰素，干扰素刺激基因，白介素1家族，白介素1受体拮抗剂，白介素12，白介素12亚单位β，白介素13，白介素16，白介素2，白介素23，白介素23亚单位α，白介素34，白介素35，白介素7，白介素8，白介素-36，白血病抑制因子，白细胞促进因子，淋巴因子，淋巴毒素，淋巴毒素α，淋巴毒素β，巨噬细胞集落刺激因子，巨噬细胞炎症蛋白，巨噬细胞活化因子，单核因子，肌肉激素，肌联素，烟酰胺磷酸核糖基转移酶，抑瘤素M，奥普瑞白介素，血小板因子4，促炎细胞因子，促巨核细胞生成素，RANKL，基质细胞衍生因子1，talimogenelaherparepvec，XCL1，XCL2和XCR1。
其他合适的分析物包括但不限于白介素-1，白介素-1受体拮抗剂，白介素-2，白介素-2受体拮抗剂，白介素-4，白介素-6，白介素-8，白介素-10，白介素-12，白介素-17，白介素-23，肿瘤坏死因子α，干扰素γ，颗粒酶B，HSP1AB，MMP-8，MIP-1a，抗体(例如单克隆或多克隆)，核酸(例如DNA，mRNA，miRNA，lncRNA)，核酸探针，趋化因子(c-c基序)配体3(巨噬细胞炎症蛋白1-α)，基质金属蛋白酶-8和热休克蛋白70A1B。
在一些实施方案中，使用接头将抗体附接于表面(例如使用碳二亚胺(例如EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺))/NHS化学)。在一些实施方案中，接头是双功能巯基接头。本公开不限于接头的长度。在一些实施方案中，接头包含1至10个碳原子的链(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳)。
在一些实施方案中，通过在阵列表面上的可寻址位置(例如通过物理寻址的条形码)提供不同的抗体来实现多重检测。例如在一些实施方案中，各个行或通道各自含有一种特异性抗体(例如如图1A所示)。这提供了条形码阵列，其允许通过为阵列上的特定位置(例如点(spot或dot))分配不同的抗体来进行多重检测。
使用任何合适的方法生成表面(例如玻璃或热塑性表面)。在一些实施方案中，使用实施例1中所述的方法。例如在一些实施方案中，用氧等离子体、UV/臭氧处理基板，使用微流体图案化技术通过金属和玻璃表面之间的静电相互作用对金属纳米棒或其他金属组件进行图案化。在一些实施方案中，构建的金属图案通过配体交换被功能化(例如通过硫醇化烷烃10-羧基-1-癸硫醇(HS-(CH2)10-COOH))，并随后使用标准EDC/NHS偶联化学法活化用于抗体附接。
用于功能化表面的其它合适的操作方案包括但不限于与金纳米棒共价相互作用的APTES功能化玻璃或热塑性材料(Kathryn Mayer et.al.,ACS Nano,2,687-692,2008；通过引用整体并入本文))；与柠檬酸盐稳定的金纳米颗粒共价相互作用的硅烷功能化表面(Maniraj Bhagawati et.al.Anal.Chem.,85,9564-9571,2013；通过引用整体并入本文)；和采用用于检测的适体的随机沉积的CTAB金纳米棒(Christina Rosman et.al.NanoLett.13,3243-3247,2013；通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，表面是硅烷化的(参见例如Haddada MB,et al.Gold Bull2013；46:335-341；Cant NE,et al.Thin Solid Films 2003；426:31-39)。在一些实施方案中，硅烷被胺化、硫醇化或二硫化物改性。在一些实施方案中，硅烷化通过化学气相沉积(例如等离子体增强CVD或低压CVD或者通过质子溶剂)进行。
在一些实施方案中，表面包括AC电渗(ACEO)组件。ACEO是施加交流电压时电极周围感应电渗电流的非线性动电现象。电极表面的极化引起称为双电层(EDL)的扩散离子层(参见例如图13)。在给定频率下，EDL外边缘处的电位导致切向电场，其在感应电荷上施加非零时间平均向外方向(如电极表面上的绿色箭头所示)的力(EDL)。EDL的这种运动导致微流体通道内的周向流体运动，并且可以用作微型泵，以便于将分析物输送到感测表面。因此，ACEO可以显著降低在扩散极限状况下形成的耗尽区。因此，由于这种连续的流体运动，特别是对于超低浓度生物标志物检测，表面反应速率被大大增强。因此，在一些实施方案中，装置还包括配置用于与金属颗粒阵列连通的配置用于ACEO的多个微电极。在一些实施方案中，每个阵列(例如纳米管)附接到多个电极。
B.微流体组件
在一些实施方案中，本公开的实施方案的装置包括微流体组件。微流体组件与LSPR组件流体连通，用于将测定组分(例如患者样品和测定试剂)输送到LSPR组件。在一些实施方案中，微流体组件包括多个(取决于装置的尺寸例如2、4、6、8、10、12或更多个)微流体通道。在一些实施方案中，通道具有出口和入口组件和/或用于将流体供应到设备的区域的储存器组件。在一些实施方案中，将微流体通道垂直于LSPR图案化组件放置。
微流体组件由任何合适的材料构成。在一些实施方案中，通过提供负的“母版”并在母版上浇注可浇注材料来制造层。可浇注材料包括但不限于聚合物，包括环氧树脂，可固化聚氨酯弹性体，聚合物溶液(例如丙烯酸酯聚合物在二氯甲烷或其它溶剂中的溶液)，可固化聚有机硅氧烷和主要承载甲基的聚有机硅氧烷(例如聚二甲基硅氧烷(“PDMS”))。可固化的PDMS聚合物是众所周知的，可从许多来源获得。可以使用可加成固化和缩合固化体系，也可以使用过氧化物固化体系。所有这些PDMS聚合物具有小比例的反应性基团，其在固化期间反应形成交联和/或引起链延伸。可以使用一部分(RTV-1)和两部分(RTV-2)系统。
在一些实施方案中，透明装置是期望的。这种装置可以由玻璃或透明聚合物制成。PDMS聚合物非常适用于透明装置。使用轻微弹性体的聚合物的益处是从模具中取出的情况和提供底切通道的可能性，这通常不能用硬的刚性材料。通过浇注硅酮聚合物制造微流体装置的方法是众所周知的。参见，例如D.C.Duffy et al.,“Rapid Prototyping ofMicrofluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane),”Analytical Chemistry 70,4974-4984(1998)。另见J.R.Anderson et al.,Analytical Chemistry 72,3158-64(2000)；和M.A.Unger et al.,Science 288,113-16(2000)，其各自的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，通过任何合适的方法将流体供应到装置。可以例如从注射器、从附接到或粘合到入口通道的微管等供应流体。
可以通过任何合适的方法建立流体流动。例如可以使用适合泵送少量液体的外部微型泵。微型泵还可以由热梯度、磁场和/或电场、施加压力等驱动而在设备本身中提供。由B.H.Weigl et al.,Proceedings of MicroTAS 2000,Enshede,Netherlands,pp.299-302(2000)描述了被动驱动的泵送系统和微流体通道的整合。
在一些实施方案中，通过重力流动泵、通过毛细管作用或通过这些方法的组合建立流体流动。简单的重力流动泵由装置的外部或内部的流体储存器组成，其包含比相应的装置出口更高水平(相对于重力)的流体。这种重力泵具有液柱静压头和因此流速随储存器中液体高度下降而变化的缺点。对于许多装置，相对恒定和非脉冲的流动是期望的。
为了获得恒定的流动，可以使用公开的PCT申请号WO 03/008102A1(2002年1月18日)中公开的重力驱动泵，其通过引用并入本文。在这种装置中，使用水平储存器，其中流体水平移动，防止由液体和储存器壁之间的表面张力和毛细作用力引起的在储存器中垂直暴跌(collapsing)。由于液体的高度保持恒定，所以液柱静压头没有变化。
毛细管作用也可引起流动。在这种情况下，与相关装置中的毛细管力相比，相应通道或储存器中的流体相对于其通道或储存器壁将表现出更大的毛细管力。毛细管力的这种差异可由几种方法引起。例如出口和入口通道或储存器的壁可具有不同的疏水性或亲水性。或者，使出口通道或储存器的横截面面积更小，从而显示更大的毛细管力。
在一些实施方案中，流体装置是通过例如Duffy等(Analytical Chem 70 4974-4984 1998；还参见Anderson et al,Analytical Chem 72 158-64 2000和Unger et al.,Science 288 113-16 2000)所述软光刻技术构造出的。可加入固化的RTV-2硅酮弹性体如SYLGARD.RTM 184 Dow Corning Co可用于此目的。通道的尺寸很容易由体积和流速特性等决定。
基板可以是具有一层或具有多层。单独的层可以通过包括激光烧蚀、等离子体蚀刻、湿化学法、注射成型、压制成型等众多技术来制备。最优选的是可固化硅酮的浇注，特别是当光学性质重要时。阴模的生成可以通过许多方法进行，所有这些方法都是本领域技术人员众所周知的。然后，将硅酮倒入脱气(如果需要或期望)的模具并使其固化。可以通过常规技术来实现多个层彼此粘附。
一些装置的制造方法通过使用来自Micro Chem Corp Newton Mass的负光致抗蚀剂SU-8 50光致抗蚀剂来制备母版。
在一些实施方案中，装置是注射成型的。例如在一些实施方案中，装置包括粘合到检测基板的注射成型热塑性流体层。
C.系统
在一些实施方案中，LSPR信号由任何合适的检测器检测。在图8中显示了示例性的检测器。在一些实施方案中，将装置放置在用于扫描装置上的多个位置的可移动平台或台上。在一些实施方案中，检测器包括光源、一个或多个物镜、滤光器、暗场聚光器和成像组件(例如CCD检测器)。
在一些实施方案中，装置被配置用于多重检测多个多肽。例如如上所述，通过在LSPR表面上的可寻址位置提供特定的不同抗体来提供条形码组件。
在一些实施方案中，成像后，使用软件组件来分析来自阵列的信号。例如在一些实施方案中，软件被配置为处理图像，确定哪些位置具有靶抗原结合，并提供报告。在一些实施方案中，结合数据是定量的。例如在一些实施方案中，在进行测定之前获得校准曲线(参见例如图3)和/或在每个芯片上并行获得(例如作为内部阳性和阴性对照)。
在一些实施方案中，系统是自动化的。例如在一些实施方案中，系统(参见例如图18)包括一个或多个封装的即用型盒(LSPR芯片)，集成样品处理组件(例如机器人样品处理系统)，自动光学检测平台(例如本文所述的那些)和基于计算机的样本分析和显示组件(例如显示屏、平板电脑、智能电话等)。
在一些实施方案中，使用基于计算机的分析程序将由检测测定生成的原始数据(例如抗原的存在、不存在或水平)转化为临床医生的预测值数据(例如治疗选择)。临床医生可以使用任何合适的手段访问预测数据。因此，在一些优选实施方案中，本公开提供了不太可能接受免疫学或分子生物学方面培训的临床医生不需要理解原始数据的进一步益处。数据以最有用的形式直接呈现给临床医生。然后，临床医生能够立即使用该信息以优化对受试者的护理。
本公开涉及能够接收、处理并传送至和来自进行测定的实验室、信息提供者、医学个人和受试者的信息的任何方法。例如在本公开的一些实施方案中，从受试者获得样品(例如血液、尿液或血清样品)，并提交到分析(profiling)服务(例如医疗机构的临床实验室、分析业务等)，其位于世界的任何地方(例如在与受试者所在国家或最终使用该信息的国家不同的国家)来生成原始数据。当样品包含组织或其他生物样品时，受试者可以访问医疗中心以使其获得样品并使其发送到分析中心，或者受试者可以自己收集样品(例如尿样)并直接发送到分析中心。在样本包含先前确定的生物信息的情况下，该信息可以被受试者直接发送到分析服务(例如包含该信息的信息卡可被计算机扫描，并且使用电子通信系统将数据传递到分析中心的计算机)。一旦被分析服务接收，则样品被进行处理，并且产生对于该受试者所需的诊断或预后信息是特异性的分布(例如抗原水平)。
然后，以适合于治疗临床医生解释的格式准备分布数据。例如经准备的格式不是提供原始数据可表示受试者的诊断或风险评估(例如器官排斥或免疫应答的可能性)以及特定治疗选择的建议。数据可以通过任何合适的方法显示给临床医生。例如在一些实施方案中，分析服务生成可以为临床医生(例如在照护位置(point of care))打印或在计算机监视器上向临床医生显示的报告。
在一些实施方案中，首先在床旁或区域设施处分析信息。然后将原始数据发送到中央处理设施以进行进一步分析和/或将原始数据转换为对临床医师或患者有用的信息。中央处理设施提供数据分析的隐私(所有数据都存储在具有统一安全协议的中央设施中)、速度和统一性的优势。然后，中央处理设施可以控制受试者治疗后数据的命运。例如使用电子通信系统，中央设施可以向临床医师、受试者或研究人员提供数据。
在一些实施方案中，受试者能够使用电子通信系统直接访问数据。受试者可以根据结果选择进一步的干预或咨询。在一些实施方案中，数据用于研究用途。例如可以使用数据来进一步优化标记物的包含或取消作为特定病况或疾病阶段的有用指标。
在一些实施方案中，提供了包括装置、检测器、软件和计算机组件(例如计算机处理器和显示屏幕、智能电话等)的系统。在一些实施方案中，检测和分析组件被提供为平台，并且装置被提供为盒或板(例如一次性或可重复使用的装置)。例如在一些实施方案中，与患者样品接触的系统的部分被提供为一次性的盒或条带，并且检测和分析平台是可以接受和分析特异性针对一种或多种靶抗原的盒的独立的可重复使用的组件。
在一些实施方案中，整个系统被提供为手持装置(例如适合于床旁使用)。在一些实施方案中，手持装置包括用于患者样品的一次性条带或盒。在一些实施方案中，手持装置是靶特异性的(例如专用于特定抗原)或靶非依赖性的(例如适合于接受特异性针对不同抗原的不同盒或条带)。
II.方法
本公开的实施方案提供本文所述的装置和系统用于检测抗原(例如在患者样品中)的用途。在一些实施方案中，整个测定在一小时(例如50分钟，40分钟，30分钟，20分钟，10分钟，5分钟，4分钟，3分钟，2分钟，1分钟等)或更少的时间中完成。这提供了优于其通常需要多个小时来完成的传统ELISA测定的独特优点。这种快速测定在患者护理环境中特别有用，其中需要快速制定关于治疗和干预的决定。
本公开不限于特定的患者样品。实例包括但不限于血清，全血，尿液，痰液，精液，脑脊髓液(CSF)或唾液。在一些实施方案中，样品在使用前被处理或纯化。在一些实施方案中，使用样品而不进行处理(例如从手指刺或尿液样品)。在一些实施方案中，样品体积为1μL或更少(例如900nL，800nL，700nL，600nL，500nL，400nL，300nL，200nL或100nL或更少)。
在一些实施方案中，本公开提供了用于检测一种或多种细胞因子(例如本文公开的那些)、趋化因子或炎症、免疫应答、器官损伤或感染的其它因子的方法。在一些实施方案中，样品中细胞因子的存在和/或水平用于确定受试者中是否存在炎症反应、免疫应答、器官损伤或感染。本公开不限于特定的炎症或免疫应答。实例包括但不限于手术创伤，败血症，癌症，狼疮，移植物抗宿主病(GVHD)，自身免疫性肝炎，多发性硬化，系统性红斑狼疮，重症肌无力，I型糖尿病，类风湿性关节炎，牛皮癣，桥本甲状腺炎，格雷夫斯病，强直性脊柱炎，舍格伦病，CREST综合征，硬皮病，克罗恩病，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，患有实体器官移植并接受免疫抑制治疗的患者，溃疡性结肠炎，结节性多动脉炎，惠普尔病，原发性硬化性胆管炎等。
在一些实施方案中，受试者正在进行化疗或已经历手术。在一些实施方案中，细胞因子的水平用于确定作用疗程。例如在正在经历GVHD、败血症或炎症反应的患者中，施用免疫抑制剂药物(例如类固醇)或免疫调节药物(例如非格司亭)。
在一些实施方案中，监测正在进行导致细胞因子释放的化疗的患者(例如嵌合抗原受体T细胞治疗(CAR T细胞))以测量细胞因子水平。监测细胞因子的水平以确定患者何时具有临床过高的细胞因子水平(例如导致休克和/或血流动力学不稳定性)。给予这样的患者抗细胞因子疗法(如依那西普和/或托珠单抗)。在一些实施方案中，监测细胞因子水平以确定何时水平已经充分降低足以减少或停止治疗。在一些实施方案中，不给予不具有升高的细胞因子水平的患者抗细胞因子疗法。
在一些实施方案中，在疗程、从手术恢复期间或用免疫抑制药物治疗后，患者被监测(例如使用床旁装置)多次，以确定是否需要改变治疗。例如在一些实施方案中，监测发现需要免疫抑制治疗的患者，以确定炎症或GVHD何时消退，以便确定剂量的减少或治疗的停止是可取的。
实验
实施例1
方法
LSPRmi芯片制造：本研究中使用的带正电荷的AuNR(CTAB涂层)购自Nanoseedz。使用微流体图案化技术通过AuNR和玻璃表面之间的静电相互作用在氧等离子体处理的玻璃基板上对AuNR进行图案化。通过配体交换，构建的AuNR条形码图案用巯基化的烷烃10-羧基-1-癸硫醇(HS-(CH2)10-COOH)进行功能化，随后使用标准EDC/NHS偶联化学法进行活化。然后将探针细胞因子抗体加载到单独的图形化通道中，形成条形码阵列，其由六条平行的条带组成，每个条带均用不同的抗体进行功能化，从而一次可以多重检测6种不同的细胞因子。
LSPRmi测定操作方案：将准备好的LSPRmi测定芯片安装在允许进行3D定位和自动图像扫描的机动化台(ProScanIII，Prior Scientific，Rockland，MA)上。芯片的玻璃基板背面经透镜油与暗场聚光器(NA＝1.45，Nikon)相连。从入口注入250nL样品，流过样品通道，并从出口收集。从条形码散射的光通过测定芯片下方的10X物镜收集，通过带通滤波器(610-680nm)过滤，用电子倍增CCD(EMCCD，Photometrics，Tucson，AZ)相机成像并使用NIS-Element BR分析软件进行记录。然后通过定制的Matlab程序对所获得的图像进行分析。在每次测量之前，经过约10分钟以建立温度稳定化的EMCCD以使背景信号漂移最小化。
LSPRmi测定人血清基质多重性能表征。为了表征多重测定能力和测定的性能，使用三种单独的细胞因子混合物。一种混合物包含单一细胞因子物质(TNF-α)，一种含有三种分析物(IL-4，IFN-γ和TNF-α)，最后一种含有所有六种细胞因子(IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，IFN-γ和TNF-α)。将重组细胞因子(LifeTechnologies，Frederick，MD)掺入市售的热灭活的经炭吸附的人血清基质中以除去痕量水平的细胞因子(EMD Millipore，St.Charles，MO)。
LSPRmi测定与“金标准”ELISA的性能比较。所有六种细胞因子(IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，IFN-γ，TNF-α)被掺入在书面知情同意后通过静脉穿刺获得的健康供体人血清。该研究由University of Michigan Institutional Review Board批准。通过静脉穿刺获得的血清进入含有凝块活化剂(BD Diagnostics，Franklin Lake，NJ)的真空管中。根据制造商的说明书处理管。掺有所有六种细胞因子的血清样品用健康供体血清进一步稀释，以获得在LSPRmi测定的整个动态范围(32pg/mL-5,000pg/mL)上的样品。使用LSPRmi测定定量血清细胞因子浓度，并与市售ELISA试剂盒(IL-6，IL-10，IFN-γ，TNF-α，BioSource EuropeS.A.，Nivelles，Belgium；IL-2，IL-4，Thermo-Fisher Scientific，Rockford，IL)进行比较。
用心肺转流术进行心脏直视手术后儿科患者血清细胞因子定量的LSPRmi测定。这里描述的所有研究均由University of Michigan Institutional Review Board批准，并经过家长知情同意后进行。简言之，选择了两名加入正在进行的血清细胞因子定量临床试验的患者。根据制造商的说明，使用SST microtainer(BD Diagnostics)在手术前并且然后在术后第1天、第2天、第3天和第4天(分别为Pre，D1，D2，D3和D4)收集血清样品。使用如上所述的LSPRmi免疫测定定量血清细胞因子(IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，IFN-γ，TNF-α)。
FDTD模拟：使用商业多物理场模拟软件COMSOL执行在单个AuNR上计算散射效率的光学模拟。在模拟中，根据材料表征的结果(直径40nm，纵横比为2)设定AuNR的尺寸。从Lorenze-Drude模型导出金的频率依赖的复介电常数。远场域被定义为围绕AuNR的球壳，其半径与入射光波长的一半相同。边界条件设置为完美匹配层。入射光的波矢量和电场极化被设置为垂直并与An的取向平行。AuNR表面上的网孔尺寸设定为1nm，其他地方的孔径不大于研究波长的1/10。在有和没有AuNR的情况下，在变化的频率下测量远场平面上的电磁场的空间分布，以确定来自AuNR的散射波的强度。通过对模拟抗体/分析物结合的具有电介质层的AuNR建模进行FDTD模拟。裸露的AuNR和被覆的AuNR的计算散射光谱可以在图9中找到。
金纳米棒的表征。在本研究中使用的在水性溴化十六烷基三甲铵(CTAB，0.1M)缓冲液的金纳米棒(AuNR)(图5A)购自NanoSeedz。这些纳米棒最初使用标准种子介导的生长方法合成。产生平均长度为80±5nm和平均宽度为40±3nm的单结晶微颗粒。(图5B)AuNR上的CTAB涂层导致ζ电位为42±5mV的带正电荷表面(Zetasizer Nano ZS90，Malvern)。使用定制的分光光度计获得溶液中AuNR的消光光谱。(Oh,B.et al.ACS Nano 8,2667–2676(2014))。AuNR的共振峰的波长约为626nm，与以下所示模拟结果一致。
金纳米棒微阵列制造。在AuNR微阵列制造之前，使用软光刻技术构建由PDMS制成的微流体流动图案化掩模层。掩模层包含多组用于图案化AuNR微阵列的平行微流体通道。具体地，使用深反应离子蚀刻(DRIE)(Deep Silicon Etcher，Surface TechnologySystems，Allenton，PA)，在硅基板内图案化用于PDMS流动图案化掩模层的模具。模具表面用 1H,1H,2H,2H-全氟辛基-1-三氯硅烷蒸气(United Chemical Technologies)在真空中硅烷化1小时以促进随后的PDMS释放。将通过将固化剂与基础单体(wt:wt＝1:10)充分混合制备的PDMS预聚物(Sylgard-184，Dow Corning)倒入硅模具中，并在110℃的烘箱中固化4小时。然后将固化的PDMS掩模层从模具中剥离以形成微流体流动图案化层。将该层切割成多片，每个孔冲孔以产生通道的入口和出口用于进一步的用途。
随后，将AuNR储备溶液(0.2nM)以5700rpm、10分钟离心三次，将沉淀物重新悬浮于去离子水(D.I.)中以除去溶液中过量的CTAB。在微阵列制造前将AuNR溶液进一步稀释8倍。首先用Piranha溶液(H2SO4:H2O2＝3:1)处理玻片(类型)10分钟，用D.I.彻底漂洗，并保持在乙醇超声波浴中30分钟。玻璃基板的表面在O2等离子体下18W处理2分钟(COVANCE 1-MP，Femto)。由于存在于玻璃上的解离的羟基，这产生带负电的玻璃表面，这使得玻璃基板能够将CTAB稳定的带正电荷的AuNR吸引到其表面上。在表面处理之后，立即将上述制备微流体流动图案化PDMS掩模层之一粘合到每个玻璃基板上。将2μL的AuNR溶液以1μL/min的流速加载入每个通道，并孵育过夜，然后用盖玻璃片密封入口和出口以免蒸发并且避免AuNR溶液干燥。
孵育后，所有通道用100％乙醇洗涤以除去未结合的AuNR。这导致在通道覆盖的玻璃表面的区域上形成AuNR微阵列图案。SEM图像显示，每个微阵列上产生的AuNR的表面密度为每2.56μm2约1个颗粒。
金纳米棒微阵列功能化。在玻璃基板上构建AuNR微阵列图案之后，它们通过简单的配体交换形成自组装单层(SAM)而在上述构建的微流体流动图案化通道内被功能化(Eck,W.et al.ACS Nano 2,2263–2272(2008)。将硫醇化烷烃10-羧基-1-癸硫醇(HS-(CH2)10-COOH)的储备溶液在100％乙醇中稀释至1mM，并流过玻璃基板上的图案化通道。硫醇锚定基团与金表面的强结合使硫醇化烷烃替代CTAB涂层，并用作至探针抗体的接头。通过抗体通过标准1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)偶联化学法(Grabarek,Z.&Gergely,J.Anal.Biochem.185,131–135(1990))与-COOH官能团结合进行抗体连接。简而言之，将在0.1M MES(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐，Thermo Scientific)溶液中以1:1的体积的0.4M EDC(Thermo Scientific)和0.1M NHS(Thermo Scientific)注射通过微流控流动图案化通道，并活化玻璃基板上的AuNR微阵列表面。表面活化后，将细胞因子一抗(Ebioscience)在1x PBS中从100μg/mL稀释至10μg/mL中，加载到各个通道中，并在室温下孵育60分钟。这导致在玻璃基板上以50μm的间距构建宽度为25μm和长度为2cm的六个曲折的平行AuNR条带图案，各自用不同的抗体分子功能化。这些图案形成了LSPR生物传感器微阵列，提供了6种不同细胞因子的多重检测。为了抑制检测表面上的非特异性结合，将10μL 1％BSA(白蛋白，来自牛血清，SIGMA)的1x PBS和1x酪蛋白(5x酪蛋白封闭溶液，Surmodics BioFX)封闭缓冲液加入到微流体流动图案化通道中并孵育20分钟。在所有方法步骤中，使用注射泵(LEGATO210，Kd Scientific)以1μL/min加载试剂溶液。在每个步骤之间，用20μl 1x PBS以3μL/min彻底洗涤AuNR微阵列表面以除去任何过量的溶液或分子。
光学设置和LSPR微阵列成像(LSPRmi)测量。在AuNR微阵列抗体功能化过程之后，将PDMS掩模层从玻璃基板上除去，并立即用另外的具有样品流动微流体通道阵列的PDMS层代替。按照与如上所述的PDMS微流体流动图案化掩模层的构造所述相同的程序制备新的PDMS层。在组装测定芯片的过程中，将新的PDMS层粘合到玻璃基板上，使样品流动通道阵列(200μm(W)×2.5cm(L)×50μm(H))垂直于LSPR微阵列条带。将构建的微阵列测定芯片安装在机动化X-Y平台(ProScanIII，Prior Scientific，Rockland，MA)上，使用移液管手动加载约5μL的样品至每个芯片流动通道，并以180个感测点/分钟的速率进行自动图像扫描。图8显示了基于暗场LSPR成像技术检测和成像AuNR微阵列阵列的系统设置。
简而言之，LSPR微阵列成像过程开始于将白光照射到安装在倒置荧光显微镜(Nikon Eclipse Ti-S，Nikon)上的暗场聚光器油镜(n.a.1.20至1.45，Mager Scientific)中。分析物分子与每个微阵列的纳米结构金属表面的结合增加了一定光谱带内光的散射率，以及LSPR峰的红移(AuNR为630nm，如图5所示)。使用带通滤波器(610-680nm)来捕获在分析物表面结合期间针对微阵列观察到的最大强度增加。使用EMCCD相机获得微阵列图像，并使用NIS-Element BR分析软件进行记录。使用定制的Matlab程序来分析和定量每个微阵列图案的散射强度变换。通过边缘检测/背景减法算法自动选择感兴趣区域，然后读出每个像素的原始数据并进行处理。
局部折射率改变后单个金纳米棒上的电磁场光学模拟。为了理论上估计LSPRmi测量的检测限，进行时域有限差分法(FDTD)模拟，并使用商业多物理场模拟软件COMSOL预测单个AuNR上的散射效率。模拟使用由上述材料表征的结果确定的AuNR的尺寸信息(直径40nm，纵横比：2)。在制造的微阵列图案中的等离子体去耦AuNR布置(图1)允许将注意力集中在单个AuNR的LSPR行为上，这显著地简化了模拟。金的频率相关复介电常数来自Lorenze-Drude模型(Kabashin,A.V.et al.Nature Mater.8,867–871(2009))。
远场域被定义为围绕AuNR的球壳，其半径与入射光波长的一半相同。作为模拟的边界条件，与入射光波长的一半相同厚度的完全匹配层设置在远场域球壳表面的顶部，其中来自AuNR的散射光强度呈指数衰减。入射光的波矢量和电场极化分别设定为垂直并与AuNR的取向平行。这激发了AuNR在模拟中的纵向谐振模式。AuNR表面上的网孔尺寸设定为1nm，其他地方的孔径不大于研究波长的1/10(图9A)。
在有和没有AuNR存在的情况下，在变化的频率下计算远场平面上的电磁场的空间分布，以确定来自AuNR的散射波的强度(IAuNR)和背景信号强度(I背景)。通过对在远场平面Ω上的散射波的强度进行积分确定AuNR的散射截面Cscs为
Figure BDA0001432581740000261
并且还用于计算检测限。
接下来，进行模拟以预测蛋白质结合如何通过裸露AuNR表面附近的标准化局部电场强度(|Ey|2/|E0|2)的空间分布作图增强LSPR(图9B和9C)，其中|Ey|2是局部场的y-分量的强度，|E0|2是入射光的场强。模拟了由于蛋白质结合而从AuNR散射的光的光谱偏移。模拟对作为抗体功能化AuNR表面上均匀电介质层的形成的蛋白质结合的建模，其假定引起近表面折射率值从1.33(水)变为1.5(水合蛋白)(Voros,J.Biophys.J.87,553-561(2004))。附接于AuNR表面的蛋白质可以是研究中使用的分析物或探针抗体。以蛋白质层的厚度范围为0
Figure BDA0001432581740000262
10nm，增量为2nm进行模拟。比较图9B和图9C，显示用10nm厚的蛋白质层涂覆AuNR被预测得到|Ey|2/|E0|2的显著增强。图9D显示了涂覆有不同厚度的蛋白质层的AuNR的一组散射光谱。
LSPRmi测量检测限的理论预测。上述模拟预测了在更大的蛋白质涂层厚度下来自AuNR的散射光的明显的光谱红移以及强度增强。(图9D)这里，散射光强度是在测量中直接观察到的LSPR信号。使用上面的模拟方法，计算了由单个AuNR上的分析物结合引起的LSPR信号的光谱偏移和强度变化的定量值。假定在测定中AuNR的抗体缀合形成厚度为7nm的均匀的紧密堆积的抗体分子层(Erickson et al.,Biol.Proced.Online.15,32-51(2009))并且折射率为1.5。此外，假设在抗体层顶部称为“感测体积”的理论体积(图10的插图)。感测体积的厚度等于分析物分子的有效直径(细胞因子通常为3.4nm；Erickson et al.,Biol.Proced.Online.15,32-51(2009))。在该模型中，当体积被分析物分子完全占据时，感测体积层的折射率也被设定为1.5。然后，由单个分析物分子的表面结合引起的LSPR信号变化ΔI由下式给出：
Figure BDA0001432581740000271
其中ΔRI是如上所述的感测体积Vs的体积的折射率变化，Va是单个分析物分子的体积，ΔS是在将分析物分子加载到AuNR表面之前和之后的实验观察到的信号差异。更具体地说，ΔS是分析物吸附诱导的LSPR峰的波长偏移，由用于光谱偏移测量的
Figure BDA0001432581740000272
给出，其中Δλp是共振峰的偏移，RIU是折射率单位(＝1)。ΔS是用于基于强度的成像测量的
Figure BDA0001432581740000273
给出的分析物吸附诱导的LSPR强度(例如散射强度)偏移，其中
Figure BDA0001432581740000274
是分析物加载之后散射截面ΔCscs的变化对λ＝610-680nm(这是本研究中使用的光学滤波器带(图9D中的灰色区域))的积分。这里，ΔCscs从以上公式(1)推导得出的。对于流动通道中[A]的给定分析物浓度，可以如(De Boer,J.H.The dynamical characterof adsorption,second ed.(Oxford University Press,London,1968))使用Hill-Langmuir等温线估计在单个AuNR表面上的分析物结合事件的概率θ：
Figure BDA0001432581740000275
其中Kd是在抗体与其接合抗原之间的平衡解离状态下测定的结合常数，KA是产生半占据的配体浓度，n是Hill系数。或者，θ表示占据的结合位点的数量与可用于分析物结合的总位点数的比。
假设检测通道内每单位面积的AuNR沉积密度为D，一个单个AuNR上的总结合位点为Ns，则从微阵列感测区域收集的总信号强度变化ΔIA可以通过以下公式计算：
Figure BDA0001432581740000281
然后，可以在信号变化等于系统信号不确定度
Figure BDA0001432581740000282
时确定LSPRmi的分析物的LOD，其中Usys是由于检测系统而导致的不确定度，Ufit是收集散射光谱时的峰拟合的不确定度。因此，得到：
Figure BDA0001432581740000283
组合方程(2)和(5)允许将LSPRmi的LOD分析估计为：
Figure BDA0001432581740000284
为了估计LSPRmi相对于常规基于光谱的LSPR测量中的灵敏度提高，使用等式(6)中的一阶Langmuir方程来定量分析物结合事件时的信噪比。一个单个AuNR(40nm(W)×80nm(L))上的总可用结合位点可以计算为约361个。在AuNR表面完全占据的极端情况下，光谱偏移(Δλ＝5.1nm)和散射截面变化对从610nm到680nm的积分(ΔCscs＝7.2％)如图10所示。
根据最近使用基于光谱的纳米棒LSPR生物传感器的研究(Nusz et al.,ACS Nano3,795-806(2009))，研究人员的实验设置(白炽灯白光源，CCD散射检测)产生了U光谱＝0.3nm的信号变异。通过测量空白样品，系统中传感器和信号处理单元的不确定度为U强度＝0.11％。将这些数字代入方程(6)可以计算出基于强度的LSPRmi平台的LOD(LOD强度)与常规光谱偏移测量技术LOD(LOD光谱)的比为
Figure BDA0001432581740000285
因此，与传统的LSPR检测方案相比，估计该技术将LOD降低了约十分之一。
AuNR微阵列强度和LSPRmi信号变异。表征了沉积在普通玻璃基板上的AuNR微阵列来自其校准测量中扫描的暗场图像的结构变异(图11A)。图11A中的上图显示了在同一芯片上的24个连续AuNR微阵列的线强度分布。图像数据表示所有微阵列的平均强度为约21,000，变异系数(CV)约为8％。它揭示了制造技术在生产具有良好阵列到阵列结构均匀性的微阵列条带中的一致性。在给定的分析物(TNF-α)浓度下，这样的均匀性提供了在相同芯片上的10个微阵列条带上获取的校准数据点的约7％或更低的CV(图11B)。该结果验证了使用这些微阵列的LSPRmi测量的高重现性和准确性。
LSPRmi的系统不确定度和检测限。为了表征LSPRmi系统的不确定度和检测限，进行了对照实验，测量没有细胞因子加载的抗体缀合的AuNR微阵列的背景信号变异。平均系统不确定度被计算为约0.11％，其由等于设置为背景噪声(σ)的标准偏差的3倍的置信因子的最小可区分信号确定。因此，从3σ/k斜率获得靶细胞因子的检测限，其中k斜率是使用S形曲线拟合的校准曲线的回归斜率。
结果
LSPR微阵列芯片制备。LSPRmi生物芯片包括体积为250nL的八个平行微流体通道和六个曲折的抗体功能化AuNR条带(AuNR的特征在图5中显示)在玻璃基板上整体上十个转弯，其与通道正交地运行(图1a)。每个微流体通道具有用于试剂加载和洗涤的入口和出口端口。这种芯片设计在整个芯片上产生了各自宽25μm和长200μm的480个条带LSPR生物感测点的阵列。使用一步微流体图案化技术，将AuNR条带与针对六种不同细胞因子的抗体缀合：白介素-2(IL-2)；白介素-4(IL-4)；白介素-6(IL-6)；白介素-10(IL-10)；干扰素-γ(IFN-γ)；和肿瘤坏死因子α(TNF-α)(图6)。微流体图案化技术允许在每个通道中构建六个并置平行多重免疫测定点的十个区段，而不需要麻烦的在大量位置上手动试剂分配(图1a)。
扫描电子显微镜图像显示，LSPR感测点用无序单层涂覆，表面密度数为每个2.56μm2约1个颗粒(图1a和图7)，其对应于平均颗粒与颗粒的距离>200nm(图1b)。理论计算预测了围绕每个纳米颗粒的高度局域化的光激发EM场的更短得多(65nm)衰减长度(图1b的插图)。纳米颗粒的分散分布消除了整体中相邻纳米颗粒之间复杂的电磁耦合。这关键地使得多阵列LSPR传感器的性能不受无序纳米颗粒排列的影响。每个传感器点上约2000个等离子体解偶联的AuNR的整体产生具有不同共振的散射光谱(图1c)。因此，LSPRmi平台的原理依赖于由靶分析物结合到AuNR上引起的特定等离子体共振范围内的散射光强度变化
实时LSPR多重免疫测定。表征LSPR生物传感器的动态性能允许评估总测定时间。为此，在多重方案中测量与分析物表面结合相关的实时传感器信号变化。该测量使用悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中的六种靶细胞因子的混合物。这里，对于每个分析物设定不同的浓度水平，使得IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α和IFNγ分别为10,000pg/mL，5,000pg/mL，3,000pg/mL，1000pg/mL，500pg/mL和250pg/mL。将细胞因子混合物加载到装置的一个微流体通道中，观察到来自传感器点的时程信号变化(图2)。从该测量结果可以看出，分析物结合事件在引入细胞因子混合物后30分钟内达到平衡。与常规荧光夹心免疫测定相比，这种快速的分析物结合动力学允许以非常短的孵育时间进行测定。达到平衡后，洗涤加载的样品以从传感器表面去除非特异性结合的血清成分。这导致传感器信号强度降低约8％。
高通量LSPR微阵列生物感测和校准。LSPRmi芯片测定的一个重要特征是其能够以高通量分析多种分析物。通过在短时间内使用该装置进行大规模并行的数据密集型传感器校准来证明该能力。获得的每个分析物的校准数据随后允许确定测定的动态范围和检测限。首先制备8个PBS样品，每个样品含有六种纯化的细胞因子(即IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，IFN-γ和TNF-α)的混合物，将它们手动吸取到装置的八个通道的入口(图3a)。引入其中一个通道的每个样品含有相同浓度的细胞因子，这是50至10,000pg/mL之间的8个水平之一。在样品加载前和洗涤后、分析物表面结合达到平衡时约30分钟，对单个芯片上480个单独的AuNR微阵列感测点的传感器反应以扫描速率为180个点/分钟进行记录。因此，包括样品加载和洗涤(5分钟)、孵育和平衡(30分钟)和图像扫描(5分钟)的总测定时间为约40分钟。图3b显示了在加载和洗涤细胞因子分子超过480个传感器点之后作图局部强度变化(ΔI/I0)的结果，其中I0是测定前的传感器原始信号强度，ΔI是测定后的强度偏移。然后通过对10个传感器点绘制作为分析物浓度的函数的空间平均的标准化强度偏移ΔI/I0，获得6个细胞因子的传感器校准曲线(图3c)。另外证实，如上所述，这些测量在十个传感器点重复中是一致的，平均的变异系数约为7％。校准曲线表明，该测定对于细胞因子生物标志物实现10至10,000pg/mL的大动态范围。曲线中的虚线表示拟合到数据点的S形曲线(Hill型)。如通过3σ/k斜率定义的每个分析物确定检测限(LOD)，其中σ和k斜率分别为空白对照获得的背景信号的标准偏差和每个校准曲线的回归斜率。如表1中所概括的，确定的LOD为11.43pg/mL(TNF-α)，6.46pg/mL(IFN-γ)，(IL-2)，20.56pg/mL(IL-4)，11.29pg/mL(IL-6)和10.97pg/mL(IL-10)。
血清细胞因子的多重LSPR微阵列免疫测定。为了测试装置的多重免疫测定能力，使用热灭活和炭吸附的人血清制备血清样品组，并掺入不同的细胞因子混合物。使用这些样品，获得了一组集成在相同微流体通道内的六个条带感测点的分析后信号图像，其中加载了特定细胞因子混合物模式的样品。观察到每个传感器阵列的信号强度取决于靶细胞因子，并且与血清溶液中靶外(off-target)细胞因子的存在无关(图4a)。从上述获得的校准曲线将强度偏移转化为每个传感器检测到的分析物浓度(图4b)。在测定的细胞因子浓度和预期值为500pg/mL之间没有发现统计学上的显著差异。此外，针对来自血清基质中不存在的细胞因子的传感器在预期的情况下产生低于其LOD的信号。计算回收百分比，其被定义为被检测的分析物的量样品为已知分析物的量的分数。所有细胞因子的回收百分比都在85-115％的可接受范围内(Guidance for Industry:Bioanalytical MethodValidation.Rockville,MD:Food and Drug Administration,U.S.Department of Healthand Human Services,2001)。因此，多重测定显示六种细胞因子生物传感器之间的最小交叉反应性。
用金标准法进行测定验证。广泛接受新的多重免疫测定方法利用现有的“金标准”测定-ELISA的全面验证。制备掺入六种细胞因子混合物的健康供体血清样品，浓度范围在测定的整个动态范围内，并用于使用LSPRmi芯片进行多重免疫测定。与该测定一起，进行与上述相同样品的分析物的基于ELISA的测量。基于ELISA的测量是基于单一方案。换句话说，在每个测量中，测定仅靶向六种细胞因子中的一种，以避免不同探针分子之间的任何潜在的串扰。对上述制备的血清样品中的所有六种细胞因子重复单一ELISA测定。最后，将LSPRmi免疫测定与ELISA测量值进行比较，并观察到极好的相关性(R2＝0.9726)，导致两种测定方法之间几乎一对一的线性回归(图4c)。
儿科患者心肺转流术手术的免疫状态监测。利用LSPRmi免疫测定的优势，证明了该技术用于监测新生儿在心肺转流术(CPB)所需心胸外科手术之后的炎症反应的效用。先天性心脏缺陷的修复需要使用CPB在手术中取代心肺功能的心脏直视手术，并且是美国最常见的出生缺陷(Agus,M.S.D.,et al.N.Engl.J.Med.367,1208-19(2012))。已知与CPB电路的人造表面的血液接触在即刻的术后期引起实质性炎症反应，通常在48小时内恢复到术前水平(Mahle,W.T.,et al.Ann.Thorac.Surg.97,950-6(2014))。手术前(Pre)，术后第1天(D1)，第2天(D2)，第3天(D3)和第4天(D4)收集血清样本和LSPRmi免疫测定用于定量在两名接受具有CPB的先天性心脏手术的新生儿中这几天的循环血清细胞因子水平(图4d)。两个患者CPB术后第1天均观察到IL-6和IL-10水平二者升高，然后，术后D2、D3、D4所有细胞因子水平回复至术前水平。LSPRmi测定显示检测可变程度的细胞因子表达的能力。
表1.靶细胞因子的LOD是从由3σ/k斜率定义的最小可区分的分析信号确定的，其中σ是来自空白样本的LSPRmi信号的标准偏差，k斜率是使用S形曲线拟合从校准曲线获得的回归斜率。
Figure BDA0001432581740000331
实施例2
使用实施例1中所述的LSPR细胞因子测定来测定接受治疗的白血病患者的细胞因子水平。结果如图12所示。两名患者均为复发性急性淋巴细胞白血病(ALL)患者，其已经接受嵌合抗原受体T细胞治疗(CAR T细胞)。这种治疗导致炎性介质(细胞因子)的释放，其导致全身性炎症反应综合征导致血流动力学不稳定性和休克。两种治疗方法可用于阻断这些细胞因子中的两种的作用；依那西普阻断组织坏死因子-α(TNF-α)，而托珠单抗阻断白介素6(IL-6)。如果细胞因子水平升高，这些疗法就起作用，并且过度使用这些疗法有可能免疫抑制患者将其置于脓毒症(压倒性感染)发展的风险中。目前，测量细胞因子的标准周转时间是几天，因此通常在不知道细胞因子水平的情况下治疗患者。
这两名患者都向PICU提供进展为休克的全身炎症反应综合征。将测量值提供给患者1的治疗临床医师，以帮助指导托珠单抗治疗。由于患者的临床状况，没有对患者2的数据作出临床决定。
实施例3
该实施例描述了将AC电渗(ACEO)结合到示例性装置中。
制造与功能化
装置制造：
如图 14a所示，使用标准光刻剥离、整体微切削加工(bulk micromachining)和溅射工艺将平行共面Cr/Pt(50nm)板微电极沉积在玻璃基板上。简言之，用Piranha溶液((HOSO4:H2O2＝3:1v/v))处理玻璃晶片，用去离子水彻底冲洗并在使用前空气干燥。电极图案首先转移到预涂正性抗蚀剂层(AZ726)，使用暗场光掩模和接触光刻。在用显影剂除去曝光的光致抗蚀剂后，使用电子束蒸发法(EnerJet Evaporator)沉积10nm的铬作为粘附层，然后在其顶部沉积50nm的铂。将电极涂覆的玻璃基板浸泡在纯丙酮溶液中以除去光致抗蚀剂残留物和油脂，然后用硝酸溶液(HNO3:H2O＝1:2v/v)处理，用去离子水彻底冲洗，保存在去离子水超声波浴中，并且空气干燥以进一步表面功能化。
装置功能化：
用O2等离子体处理玻璃基板和PDMS微流体掩模层的表面。在等离子体处理之后，立刻在显微镜下对准PDMS掩模和玻璃基板上的电极以确保PDMS图案化通道落入相邻电极之间(图2b)。由于存在于玻璃上的解离的羟基，O2等离子体处理可以产生带负电的玻璃表面，这使得玻璃基板能够将带正电荷的CTAB稳定的AuNR吸引到其表面上。将含有AuNR的胶体溶液通过微流体图案化通道以1.5μl/min的流速在两个方向上加载2分钟。然后将芯片储存在培养皿中2小时，其中入口和出口通过盖玻片密封以防止蒸发，并避免AuNR溶液在通道中干燥。
然后用去离子水(约5-6μl)洗涤微流体通道以除去溶液中的未结合的AuNR，并加载1mM生物素PEG(聚乙二醇，10kDa)硫醇水溶液(NANOCS)。巯基锚定基团与金表面的较强亲合力使硫醇化PEG生物素能够替代CTAB涂层，并用作至探针链霉抗生物素蛋白的接头。将PEG-生物素功能化的AuNR与培养皿中的湿纸巾孵育过夜以构成水分环境并避免干燥。
生物感测平台
一般感测设置
如图15a所示，在上述ACEO耦合的LSPR纳米生物传感器的信号检测中使用具有电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)的暗场显微镜。基于LSPR的检测测量由于分析物分子的结合而导致的纳米结构金属表面的吸收光谱偏移(局部折射率变化)。这里，通过使用与EMCCD检测器耦合的适当的带通滤波器(680/13)将该光谱偏移信号转换成光强度变化。对微阵列中大量纳米颗粒生物传感器分析光强度信号，其包含统计学和生物学上有意义的信息。理论模型预测，这种方法导致LOD值是常规无标签LSPR生物感测中常用的光谱偏移检测方案的十分之一还要少。
测定细节
如图14c所示，剥离具有加载通道的PDMS掩模，并立即用垂直于电极条形码的平行直通道(400μm(W)×2.5cm(L)×50μm(H))替换。为了产生适当的离子浓度环境，使用1000倍稀释×1PBS溶液作为漂洗缓冲液以洗去未结合的生物素PEG硫醇分子。然后将芯片安装在机动化X-Y暗场显微镜平台(ProScanIII，Prior Scientific，Rockland，MA)上，电极连接到两个AC功能发生器(180相位差)并准备进行测量。将链霉亲和素溶解于1000倍稀释×1PBS中，浓度为50fg/ml(0.67fM)至100pg/ml(1.33pM)，注射泵以2μl/min的流速注射。基于上述的暗场LSPR成像技术检测AuNR微阵列并进行成像。使用带通滤波器(680/13nm)捕获由于金表面上的生物素-链霉抗生物素蛋白的结合引起的微阵列的最大强度增加。使用NIS-Element BR分析软件，通过EMCCD相机实时记录微阵列图像，并通过我们实验室开发的定制MATLAB代码对散射强度变化进行了分析和定量。
结果
结果表明，ACEO偶联的LSPR纳米生物传感器检测到链霉抗生物素蛋白降至50fg/ml(≈0.67fM)，如图16a所示。ACEO偶联生物传感器的检测限(LOD)计算为36.3fg/ml(基于对照信号的3σ，其中σ是测量空白样品时信号的标准偏差)，其大约是没有ACEO的LOD(29.4pg/ml)的一千分之一，如图16b所示。此外，，测定时间缩短到15分钟，其为之前相同的样品体积(5μl)的测定的两倍。如图16d所示，感测表面上的剪切流也可以帮助消除非特异性结合。
实施例4
针对细胞因子(炎症反应的关键生物学成分)在败血症的早期尝试导致超过100个II/III期临床试验的混合结果。这些研究的不同结果是这种复杂患者群体的异质性、遗传学的根本差异以及导致不同种类的免疫调节异常的疾病病因(细菌/病毒感染，创伤)的直接结果。预期在临床试验设计中将前瞻性生物标志物风险分层和精确靶向抗细胞因子治疗的整合将大大增加这些试验显示显著益处的可能性。
本实施例使用目前FDA批准的抗细胞因子生物制剂在临床试验设计中测试经验证的生物标志物风险分层算法和精确靶向的抗细胞因子治疗。
设计/方法：简而言之，使用本文所述的能够从小血液体积(<1滴血液)快速(<30分钟)、多重细胞因子(>6种分析物)定量的微流体免疫测定平台。
结果：测量了PICU入院的头24小时内测量的五个血清生物标志物，其一起具有28天死亡率为97％的阴性预测值。该小组允许儿科败血症患者的风险分层为低风险死亡率(<3％概率)和高风险死亡率(>25％的概率)组，近2/3的患者被归类为“低风险”。结果(图17)显示，与那些鉴定为低风险的患者相比，鉴定为高风险患者的两种血清细胞因子，肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)显著增加(图17)。
结论：高风险组中血清细胞因子值的变异性大，支持快速细胞因子测定的需要，以指导只在那些细胞因子升高的患者中精确靶向抗细胞因子治疗。
实施例5
本实施例描述了制造表面的其它方法。
在基板表面上化学气相沉积胺化硅烷以促进AuNR沉积。
将胺化硅烷(例如(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，(3-氨基丙基)二甲基甲氧基硅烷或(3-氨基丙基)二甲基乙氧基硅烷)通过化学气相沉积(CVD)(真空，15-20英寸Hg，18-24小时)沉积在基板表面(玻璃或热塑性聚合物(例如COP，COC，PMMA))上。使用微流控图案化技术通过AuNR和胺功能化基板之间的配位键合，在胺功能化基板上对CVD AuNR进行构图。构建的AuNR条形码图案通过配体交换与硫醇化烷烃10-羧基-1-癸硫醇(HS-(CH2)10-COOH)进行功能化，随后使用标准EDC/NHS偶联化学法活化。然后将探针细胞因子抗体加载到单个图案化通道形成由六条平行的条带组成的条形码阵列，每个条带都用不同的抗体进行功能化，一次可以多次检测6种不同的细胞因子。
本申请中提及的所有出版物和专利通过引用并入本文。在不脱离本公开的范围和精神的情况下，本公开的所述方法和组合物的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方案描述了本公开，但是应当理解，所要求保护的公开内容不应被不适当地限于这些具体实施方案。实际上，对于相关领域的技术人员显而易见的用于实施本公开的所描述的模式的各种修改旨在在所附权利要求书的范围内。

Claims (30)

1.一种局域表面等离子体共振(LSPR)装置，包括：
(a)基板上的金属颗粒阵列，
其中所述金属颗粒阵列包含以条带或其他规则图案排列在所述基板的表面上的局域纳米管、金属纳米棒、纳米球，纳米星，纳米菱形，纳米锥体，纳米双锥体、纳米环或金属核-壳结构，且
其中所述金属颗粒阵列用特异性针对至少一种靶分析物的抗体进行功能化；和
(b)与所述阵列流体连通的多个微流体通道，其中所述微流体通道中的每一个包括入口端口和出口端口，且与所述金属颗粒阵列正交，
其中所述基板还包括配置为用于AC电渗的多个微电极，其中所述微电极与所述金属颗粒阵列可操作地连通，且
其中所述LSPR装置配置为暗场成像来扫描穿过所述LSPR装置的散射光强度。
2.权利要求1所述的装置，其中所述抗体包括多种抗体，其中每种抗体特异性针对不同的靶分析物。
3.权利要求2所述的装置，其中所述多种是三种或更多种。
4.权利要求2所述的装置，其中所述多种是五种或更多种。
5.权利要求2所述的装置，其中所述多种是十种或更多种。
6.权利要求1至5中任一项所述的装置，其中所述靶分析物是细胞因子、蛋白质、抗体或核酸。
7.权利要求6所述的装置，其中所述细胞因子选自白介素-2(IL-2)；白介素-4(IL-4)；白介素-6(IL-6)；白介素-8(IL-8)；白介素-10(IL-10)；白介素-12(IL-12)；干扰素-γ(IFN-γ)；和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。
8.权利要求1所述的装置，其中所述装置包括至少5个平行的微流体通道。
9.权利要求1所述的装置，其中所述装置包括至少10个平行的微流体通道。
10.权利要求8或9所述的装置，其中所述微流体通道的体积为10nl至10μL。
11.权利要求1所述的装置，其中所述微流体通道由PDMS或热塑性材料构成。
12.权利要求1所述的装置，其中所述基板包含至少100个抗体。
13.权利要求1所述的装置，其中所述基板包含至少500个抗体。
14.权利要求1所述的装置，其中所述基板包含至少1000个抗体。
15.权利要求1所述的装置，其中所述基板用氧等离子体、UV/臭氧或硅烷化处理。
16.权利要求1所述的装置，其中所述基板是玻璃或热塑性材料。
17.权利要求1所述的装置，其中所述金属颗粒阵列是金纳米棒。
18.权利要求1所述的装置，其中所述抗体经接头附接到所述表面。
19.权利要求18所述的装置，其中所述接头是C1-C10双功能巯基接头。
20.一种系统，包括：
(a)权利要求1至19中任一项所述的装置；和
(b)LSPR检测设备。
21.权利要求20所述的系统，其中所述系统还包括样本处理组件、数据分析组件和用户界面中的一个或多个。
22.权利要求20或21所述的系统，其中所述装置被提供为盒。
23.一种测量一种或多种靶分析物的水平的非诊断性方法，包括：
(a)使权利要求20至22中任一项所述的系统与样品接触；和
(b)使用LSPR测量所述样品中的一种或多种靶分析物的水平。
24.权利要求23所述的方法，其中所述靶分析物是细胞因子、蛋白质、抗体或核酸。
25.权利要求23或24所述的方法，其中所述一种或多种靶分析物以多重形式检测。
26.权利要求23所述的方法，其中所述样品是生物样品。
27.权利要求26所述的方法，其中所述生物样品选自血清、血液、尿液、痰液、脑脊髓液和唾液。
28.权利要求23所述的方法，其中所述样品来自受试者。
29.权利要求23所述的方法，其中所述方法在40分钟或更短的时间内完成。
30.一种测量来自受试者的生物样品中一种或多种细胞因子的水平的非诊断性方法，包括：
(a)将权利要求20至22中任一项所述的系统与来自受试者的生物样品接触；和
(b)使用LSPR测量所述样品中的一种或多种靶分析物的水平。
CN201680021618.3A 2015-02-16 2016-02-16 用于进行免疫测定的系统和方法 Active CN107849738B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562116741P 2015-02-16 2015-02-16
US62/116,741 2015-02-16
US201562245066P 2015-10-22 2015-10-22
US62/245,066 2015-10-22
PCT/US2016/018060 WO2016133899A1 (en) 2015-02-16 2016-02-16 Systems and methods for performing immunoassays

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107849738A CN107849738A (zh) 2018-03-27
CN107849738B true CN107849738B (zh) 2021-03-16

Family

ID=56692696

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680021618.3A Active CN107849738B (zh) 2015-02-16 2016-02-16 用于进行免疫测定的系统和方法

Country Status (8)

Country Link
US (2) US11137394B2 (zh)
EP (1) EP3259386B1 (zh)
CN (1) CN107849738B (zh)
CA (1) CA2976678A1 (zh)
DK (1) DK3259386T3 (zh)
ES (1) ES2760501T3 (zh)
PT (1) PT3259386T (zh)
WO (1) WO2016133899A1 (zh)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018165331A1 (en) * 2017-03-08 2018-09-13 The Trustees Of Dartmouth College Method and apparatus for ordered nanoplasmonic sensor formation through microfluidic assembly
US11293920B2 (en) * 2017-04-18 2022-04-05 Okinawa Institute Of Science And Technology School Corporation Nanoplasmonic instrumentation, materials, methods and system integration
WO2018200377A1 (en) 2017-04-25 2018-11-01 The Regents Of The University Of Michigan Plasmo photoelectronic immunosensor
US10566245B2 (en) * 2017-04-26 2020-02-18 Samsung Electronics Co., Ltd. Method of fabricating gate all around semiconductor device
CN108507678A (zh) * 2018-03-01 2018-09-07 东南大学 一种等离激元多谐振机制增强的可调超光谱探测芯片
WO2019222527A1 (en) 2018-05-17 2019-11-21 Stuart Lindsay Device, system and method for direct electrical measurement of enzyme activity
CN108896363A (zh) * 2018-05-28 2018-11-27 杭州智微信息科技有限公司 一种骨髓涂片数字化的流程方法
WO2021050713A1 (en) * 2019-09-10 2021-03-18 Lexmark International, Inc. Cryptoanchor reader
CN115023763A (zh) 2019-12-04 2022-09-06 威尔德康股份有限公司 数字疗法系统和方法
EP4110951A4 (en) 2020-02-28 2024-03-20 Univ Arizona State METHOD FOR SEQUENCING BIOPOLYMERS
CN114277143B (zh) * 2020-03-30 2022-09-23 中国医学科学院肿瘤医院 外泌体arpc5、cda等在肺癌诊断中的应用
CN112033931B (zh) * 2020-09-07 2024-04-12 科竟达生物科技有限公司 一种光波导、其制造方法、包含其的生物传感系统及其应用
CN112033932B (zh) * 2020-09-07 2021-09-07 科竟达生物科技有限公司 一种局域表面等离子体激元共振生物芯片、其制造方法、包含其的生物传感系统及其应用
CN111999784B (zh) * 2020-09-07 2024-03-22 科竟达生物科技有限公司 聚合物用作生物芯片的基底的用途
WO2022093745A1 (en) 2020-10-26 2022-05-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting sars coronavirus spike protein and uses thereof
EP4264246A1 (en) * 2020-12-18 2023-10-25 Arizona Board of Regents on behalf of Arizona State University Method for manufacturing protein bioelectronic devices
CN112881312B (zh) * 2021-01-15 2022-04-05 中山大学 一种同时监测溶液变化和传感器固/液界面变化的检测装置
US20220334109A1 (en) * 2021-03-24 2022-10-20 InnoTech Precision Medicine, Inc. Device and method for detecting inflammation
WO2022232612A1 (en) 2021-04-29 2022-11-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Lassa virus-specific nanobodies and methods of their use
WO2022261017A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cross species single domain antibodies targeting pd-l1 for treating solid tumors
KR20240058167A (ko) 2021-09-17 2024-05-03 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 Sars-cov-2 중화 항체 동정을 위한 합성 인간화 라마 나노바디 라이브러리 및 이의 용도
WO2023076881A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting the s2 subunit of sars-cov-2 spike protein
CN115290605B (zh) * 2022-04-29 2024-01-02 科竟达生物科技有限公司 炽热表面等离子体共振生物芯片、其制造方法、包含其的生物传感系统及其应用
WO2024050399A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting hpv e6/e7 oncogenic peptide/mhc complexes

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100167958A1 (en) * 2006-06-16 2010-07-01 Washington, University Of Trapping of micro and nano scale objects based on localized surface plasmon
US20120164717A1 (en) 2007-07-18 2012-06-28 Joseph Irudayaraj Identity profiling of cell surface markers
WO2011106057A2 (en) * 2009-12-04 2011-09-01 Trustees Of Boston University Nanostructure biosensors and systems and methods of use thereof
US9322823B2 (en) * 2013-03-15 2016-04-26 Nicoya Lifesciences Inc. Method and apparatus for chemical detection

Also Published As

Publication number Publication date
EP3259386A4 (en) 2018-07-11
ES2760501T3 (es) 2020-05-14
EP3259386B1 (en) 2019-09-04
US20220082559A1 (en) 2022-03-17
DK3259386T3 (da) 2019-12-02
PT3259386T (pt) 2019-12-18
CN107849738A (zh) 2018-03-27
WO2016133899A1 (en) 2016-08-25
CA2976678A1 (en) 2016-08-25
US11137394B2 (en) 2021-10-05
US20180031549A1 (en) 2018-02-01
EP3259386A1 (en) 2017-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107849738B (zh) 用于进行免疫测定的系统和方法
Tang et al. High-throughput electrochemical microfluidic immunoarray for multiplexed detection of cancer biomarker proteins
Chen et al. Multiplex serum cytokine immunoassay using nanoplasmonic biosensor microarrays
Gao et al. Machine-learning-assisted microfluidic nanoplasmonic digital immunoassay for cytokine storm profiling in COVID-19 patients
KR102077695B1 (ko) 전자 코 또는 전자 혀 센서
WO2011149525A1 (en) Holographic fluctuation microscopy apparatus and method for determining mobility of particle and/or cell dispersions
Zhou et al. Gold nanoparticle layer: a promising platform for ultra-sensitive cancer detection
Liu et al. Biosensors for detection of human placental pathologies: a review of emerging technologies and current trends
Svedberg et al. Towards encoded particles for highly multiplexed colorimetric point of care autoantibody detection
EP4058594A1 (en) Systems and methods for rapid, sensitive multiplex immunoassays
CN112816706A (zh) 一种数字elisa系统及其使用方法
Ng et al. Biomedical applications of protein chips
Dey et al. Nanophotonic immunoarray with electrochemically roughened surfaces for handheld detection of secreted PD-L1 to predict immuno-oncology efficacy
Ju et al. One-shot dual-code immunotargeting for ultra-sensitive tumor necrosis factor-α nanosensors by 3D enhanced dark-field super-resolution microscopy
Song Ultrafast Microfluidic Immunoassays towards Real-Time Intervention of Cytokine Storms
JP2016527495A (ja) マイクロ流体を使用する協調的酵素増強反応（ｃｅｅｒ）による免疫アッセイ
US20160131643A1 (en) Microfluidic collaborative enzyme enhanced reactive ceer immunoassay
Lin Rapid Label-Free Electronic Detection of Biomarker Using Miniturized Microfluidic System
US11879830B2 (en) Quantitative large area binding sensor for detecting biomarkers
Dias et al. One-step trapping of droplets and surface functionalization of sensors using gold-patterned structures for multiplexing in biochips
US20220291211A1 (en) Microfluidic microparticle-labeled impedance sensor array for enhancing bioassay sensitivity
Song et al. Machine Learning-Based Protein Microarray Digital Assay Analysis
최성학 Modelling and Analysis of Nanoparticles Transport in a Microfluidic Channel for Enhancing the Sensitivity of Immunoassay
Pandey et al. Immunochemistry: A Review of Techniques and Applications
Prakash A Microfluidic Biosensing Architecture for Multiplexed Analyte Detection Using Hydrogel Barcoded Particles

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant