KR102077695B1

KR102077695B1 - 전자 코 또는 전자 혀 센서

Info

Publication number: KR102077695B1
Application number: KR1020147024850A
Authority: KR
Inventors: 티에리 리바체; 아르나우드 부호트; 다비드 본나페; 얀시아 호우-브로우틴
Original assignee: 꼼미사리아 아 레네르지 아토미끄 에뜨 옥스 에너지스 앨터네이티브즈; 상뜨르 나쇼날 드 라 러쉐르쉬 샹띠피끄; 유니베르시떼 파리스-쉬드
Priority date: 2012-02-21
Filing date: 2013-02-21
Publication date: 2020-02-14
Also published as: IL234029A0; EA028768B1; IL234029B; NZ628371A; EA201491561A1; FR2987129A1; EP2817622B1; EP2817622B8; BR112014020586A2; US20150037909A1; US11085921B2; FR2987129B1; MX2014010070A; KR20140132358A; JP2015508175A; CN104169720A; AU2013223697A1; CA2863894A1; AU2013223697B2; EP2817622A1

Abstract

본 발명은 샘플을 분석하거나, 대상물을 검출하는 전자 혀 또는 전자 코용 센서에 관한 것이다. 상기 센서는 하나의 표면 상에서 지지부를 포함하고, 이때 상기 표면에는 복수의 고감도 영역이 위치하고, 각각의 고감도 영역은 적어도 하나의 수용체를 포함하고, 적어도 하나의 수용체와 상기 샘플의 적어도 하나의 구성요소와의 상호 작용 또는 적어도 하나의 수용체와 하나의 대상물과의 상호 작용에 의해 발생된 측정 가능한 신호를 전달할 수 있다. 상기 센서는 수용체 조성물이 각기 서로 다른 적어도 3 개의 고감도 존을 포함하며, 상기 고감도 영역 중 적어도 하나는 적어도 2 개의 서로 다른 수용체의 혼합물을 포함하면서, 다른 2 개의 고감도 영역 각각은 2 개의 수용체 중 적어도 하나를 포함한다.

Description

전자 코 또는 전자 혀 센서{ELECTRONIC NOSE OR TONGUE SENSORS}

본 발명은 전자 코(electronic noses) 또는 전자 혀(electronic tongues)의 제품을 사용되는 센서에 관한 것으로, 유체 샘플, 특히 액체 또는 기체 샘플을 분석하기 위한 센서 사용에 관한 것이다.

바이오센서는 2 개의 별개의 과(families)로 분리될 수 있다.

제 1 과는 하나 이상의 특정 상호 작용(들)에 의한 분석을 수반한다. 예를 들면, 글루코스(glucose) 바이오센서 같은 경우를 보면, 상기 바이오 센서는 DNA 칩 또는 단백질 칩 유형의 효소 또는 다중 파라미터 시스템(여러 개의 고감도 존)을 사용하며, 이때 상기 효소 또는 다중 파라미터 시스템은 특정 선택 결합(DNA/DNA 또는 항원/단백질 등)을 통한 리간드를 인식한다. 이러한 바이오칩은 널리 사용되고, 단일 수용체(single receptor)로 구성된 고감도 존(sensitive zone)을 통하여 관련 정보를 발생시킨다.

바이오센서의 제 2 과는 "비-특정" 시스템을 포함한다. 이와 같은 경우에서, 단일 수용체를 함유한(bearing) 단일 고감도 존에 의해 발생된 정보는, 분석되는 매체의 화합물과 수용체 간의 상호 작용이 알려져 있지 않기 때문에 해석될 수 없다. 나아가, 이러한 유형의 센서의 특수성의 낮음으로 인해, 다양한 수용체 간의 교차 반응(cross reactions)이 관측될 수 있다. 그러므로 정보의 일부를 각각 발생시키는 수용체 세트가 사용된다: 이로써, 이러한 정보 모두는 디지털 지문과 유사한 패턴을 발생시킨다. 분석의 필요성에 있어, 이러한 패턴은 이전의 학식으로부터 도출된 것과 비교될 수 있다. 현실적으로 사용되는 방법에 대한 이러한 유사성은, 기체 매체의 연구에 관하여 "전자 코" 또는 액체 매체의 연구에 있어 "전자 혀"라 불리는 이러한 센서를 불러일으켜 왔다.

그러므로, 이러한 전자 코 또는 혀는 독립적인 고감도 존의 세트로 구성되고, 상기 고감도 존 각각은 연구된 매체와 상호 작용할 수 있는 수용체로 구성된 코팅물을 함유한다. 그로므로, 각각의 고감도 존은 일반적으로, 상호 작용에 의해 발생된 신호 세기를 측정함으로써 상호 작용을 수량화하기 위한 시스템과 연관되어야 한다. 현재 존재하는 모든 경우에서, 각각의 고감도 존은 서로 이웃하는 정보와 독립적인 정보의 일부를 발생시킨다. 이로써, n 고감도 존의 매트릭스는, 히스토그램(histogram)에 의해 종종 나타나는 상호 작용 패턴을 구성할 수 있는 정보의 n 개의 독립적인 부분을 발생시킬 것이고, 이때 고감도 존의 수는 상기 존에 측정된 신호 세기 값과 연관된다.

일반적으로, 고감도 존은 분석된 매체에 대하여 가변 친화도를 가질 수 있는 방식으로 또는 보다 일반적인 가변 물리 화학적 속성을 가질 수 있는 방식으로 제조된다(Turner & Magan(2004) Nature Reviews Microbiology 2:161-166). 최근에는, 결합 접근법이 나타나 왔고, 펩티드 수용체는 고감도 존 상에 이식되어 왔다. 이러한 방법은 대량의 서로 다른 수용체를 손쉽게 발생시키는 것을 가능케 한다(Edwards et al.(2007) J. Am. Chem. Soc. 129:13575-13583). 각각의 고감도 존은 하나 및 단지 하나 유형의 펩티드와, 독립적인 상태에서 발생된 정보의 부분을 함유한다. 게다가, 이와 같은 표현은 점 구름의 형태로 도시된다.

그러므로, 이러한 유형의 분석에서, 정보 각각의 부분은 동일한 값을 가지고 가중치는 쉽게 실행되지 않는다. 그러므로, 이러한 센서는 연속적인 반응을 제공하지 않는다. 공교롭게도, 발견된 바와 같이, 이러한 전자 형 또는 코 분야에서, 물체 제품은 복잡한 상태를 이루며, 그리고 고감도 존 중 하나의 결함은 매우 빈번하게 일어난다. 그러므로, 이러한 센서에 의한 반응은 왜곡될 것이고, 가중치 현상이 가능하지 않은 경우(고감도 존은 서로 독립적임), 발생되는 패턴은 해석되기에 어려움이 있을 것이다.

게다가, 광학 판독으로 인한 연속적인 신호를 발생시키는 전자 코 유형의 센서는 Di Natale et al.(2009) Sensors & Actuators B 142:412-7에 의해 기술된다. 이러한 센서는 투수성 중합체로 덮여진 고감도 염료 층을 포함한다. 그 후, 중합체에서 분석되는 기체 화합물의 확산 후에, 염료의 반응은 카메라를 사용하여 기록된다. 반응의 연속성은 이러한 경우에서 확산 층의 속성에 의해 제공되고, 수용체 그 자체에 의해서는 제공되지 않는다. 이러한 방법은 기체 화합물에 반응하여 염료의 반응 능력에 의해 제한된 상태를 유지한다. 그러므로, 상기 방법은 중합체를 통하여 확산되지 않은 복잡한 분자(complex molecules)의 분석에 적용될 수 없다. 나아가, 고감도 염료 층이 확산 층, 즉 중합체 아래에서 트랩되어 있기(trapped) 때문에, 센서의 수용체와 샘플 사이의 직접적인 상호 작용은 전혀 일어나지 못한다(이는 중합체 장벽(polymer barrier)이 센서 동작을 필요로 하기 때문)

그러므로, 보다 일반적인 적용을 위해, 특히, 연속적인 반응을 발생시킬 수 있는 전자 코 또는 전자 혀 유형의 센서가 여전히 제공되어야 한다.

본 발명은 전자 혀 또는 코 센서에 관한 것으로, 본 발명자에 의해 예기치 못한 증명으로부터 특히 확보되고, 상기 전자 혀 또는 코 센서는 여러 개의 부분 또는 고감도 존 상의 지지부를 포함하고, 상기 고감도 존에는 2 개의 서로 다른 수용체의 혼합물이 서로 다른 비율로 부착되고, 상기 고감도 존은 신호 방출 프로파일을 나타내고, 상기 신호는 다양한 고감도 존에 의해 센서의 수용체와 접촉하는 샘플의 구성요소의 상호 작용에 의해 발생되고, 이때 상기 샘플은 비선형적이며 주어진 화합물의 특정에 대해 충분히 복잡하다.

신호의 비선형성은 획득된 정보의 양이 순수 수용체로 구성된 고감도 존으로부터 얻어지는 것보다 크다는 것을 나타낸다.

다른 것 중에서, 고감도 존 수의 증가는 기본적으로 연속적인 신호 방출 프로파일에 목표를 두는 것을 가능케 하고, 결함이 있는 고감도 존을 검출 및 제거를 가능케 한다.

마지막으로, 소량의 서로 다른 수용체의 혼합물 사용은 대량의 서로 다른 고감도 존을 발생시키는 것이 가능하고, 서로 다른 수용체의 전개에 연관된 비용이 제한되는 한, 경제적으로도 바람직하다.

이로써, 본 발명은 샘플을 분석하거나, 적어도 하나의 대상물을 검출하는 전자 혀 또는 코 센서에 관한 것으로, 상기 센서는 샘플을 분석하거나 적어도 하나의 대상물을 검출하고, 하나의 표면 상에서 지지부를 포함하고, 이때 상기 표면은 복수의 고감도 존이 위치하고, 상기 고감도 존 각각은 적어도 하나의 수용체를 포함하고, 적어도 하나의 수용체와 상기 샘플의 적어도 하나의 구성요소와의 상호 작용 또는 적어도 하나의 수용체와 적어도 하나의 대상물과의 상호 작용에 의해 발생된 측정 가능한 신호를 방출할 수 있고, 상기 센서는 수용체 조성물이 각기 서로 다른 적어도 3 개의 고감도 존을 포함하며, 상기 고감도 존 중 적어도 하나는 적어도 2 개의 서로 다른 또는 서로 동일하지 않은 수용체의 혼합물을 포함하고, 다른 2 개의 고감도 존 각각은 상기 2 개의 서로 다른 수용체 중 적어도 하나를 포함한다.

기술 분야의 통상의 기술자에게 있어 명확히 명백한 바와 같이, 본 발명에 따른 센서는 특히, 액체 매체의 샘플의 분석의 정황에서의 전자 혀, 또는 특히, 기체 매체의 샘플의 분석의 정황에서의 전자 코를 특별하게 시행하여 사용하기 위한 것이다.

이로써, 본 발명은 추가로 상기에서 정의된 바와 같이, 샘플을 분석하기 위한 센서의 사용에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 샘플을 분석하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 다음과 같다:

- 상기에서 정의된 바와 같은 센서는 상기 샘플과 접촉한다;

- 상기 센서의 고감도 존에 의해 방출된 신호는 측정된다;

- 이전 단계에서 측정된 신호는, 적어도 하나의 다른 샘플과 접촉한 후에 동일 센서 또는 제 2 유사 센서의 고감도 존에 의해 독립적으로 발생된 신호와 비교된다;

- 상기 샘플은 분석되어 기술된다.

본 발명은 추가로 적어도 하나의 대상물과 상호 작용하거나 상호 작용하기 위한, 3 차원 구조체를 코팅하는 수용체의 혼합물의 수용체 조성물 정의하는, 상기에서 정의된 바와 같은 센서의 사용에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 적어도 하나의 대상물과 상호 작용하거나 상호 작용하지 않기 위한, 수용체의 혼합물로 코팅된 3 차원 구조체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

- 상기에서 정의된 바와 같은 센서와 상기 대상물을 접촉시키는 단계;

- 신호를 방출하는 상기 센서의 고감도 존을 식별하는 단계로서, 상기 신호의 세기는 상기 대상물에 대해 수용체의 혼합물로 코팅되는 3 차원 구조체의 원하는 친화도와 유사한, 강하거나 약할 수 있는 상기 대상물용 친화도(affinity)를 나타내는, 식별 단계;

- 선택적으로 필요하다면, 다른 대상물을 위해 이러한 2 개의 단계를 반복하는 단계;

- 상기 식별된 고감도 존의 수용체 조성물과 유사한 수용체 조성물을 가진 수용체 혼합물로 3 차원 구조체를 코팅하는 단계;를 포함한다.

본 발명은 비-제한적인 다음의 도면 및 예시에 의해 추가로 설명될 것이다.
도 1
도 1은 본 발명에 따른 센서의 획득 및 사용을 도시한다. 간략하게 보면, 서로 다른 비율로(BB 1의 0, 10, 20, 30, 50, 70, 80, 90 및 100%), 락토스(lactose)(BB 1) 및 황산화 락토스(BB 2)의 9 개의 혼합 침전물(deposits)이 고감도 존을 형성하기 위해, 금으로 덮여진 프리즘으로 구성된 지지부의 일부 상에서 구현된다. 이로써, 형성된 센서는, 센서에 접촉되어 일어날 수 있는 다양한 용액을 순환시키는 것이 가능한 세포에 위치된다. 센서의 반사율은 발광 다이오드 및 CCD 카메라를 사용하여, 표면 플라즈몬 공명 이미징(surface plasmon resonance imaging, SPRi)에 의해 획득된 센소그램(sensograms)의 형태로 측정된다.
도 2
도 2는 센서에 위치한 ECL(Erythrina cristagalli lectin) 농도(x-축, nM 단위)의 함수로서, 표면 플라즈몬 공명 이미징에 의해 측정된 본 발명의 센서의 반사율(y-축, % 단위)의 전개 결과(evolution)를 나타낸다.
도 3
도 3은 본 발명의 센서를 이용하여, ECL(200 nM), CXCL12-α(100 nM), CXCL12-γ(100 nM) 및 IFN-γ(25 nM) 각각에 대해 얻어진 다양한 연속적인 전개 결과 프로파일(continuous evolution profiles)을 나타낸다. 이러한 프로파일은 도 1에 도시된 지지부에 함유된 BB 1의 비율의 함수로서 반사율(x-축, % 단위)을 나타낸다.
도 4
도 4는 ECL + CXCL12-α의 혼합물과, 그리고 ECL 및 CXCL12-α 각각 단독에 대응하는 연속적인 전개 결과 프로파일을 나타낸다.
도 5
도 5는 센서와의 접촉 시간의 함수로서, ECL 단독(상부 좌측)과, CXCL12-α 단독(상부 우측)과, 그리고 ECL + CXCL12-α 혼합물에 대해 각각 얻어진, 연속적인 전개 결과 프로파일의 3D 모델을 나타낸다.
도 6
도 6은 음식 혼합물: 즉, 두유(도 6a), 우유(도 6b) 및 쌀 우유(rice milk)(도 6c)에 대해 얻어진 연속적인 전개 결과 프로파일을 나타낸다.
도 7
도 7은 본 발명에 따른 센서의 고감도 존에 대해 표면 플라즈몬 공명 이미징에 의해 측정된 반사율(y-축, % 단위)을 나타내고, 각각의 예시적인 락토스(BB 1) 및 황산화 락토스(BB 2)의 혼합물은 서로 다른 비율로(BB 1의 0, 10, 20, 30, 50, 70, 80, 90 및 100%)(x-축) 인터페론 감마(interferon gamma) D136(IFNgD136)의 존재를 나타낸다.
도 8
도 8은 10% BB 1/90% BB2(좌측)의 혼합물로 덮여진 나노입자 및 90% BB 1/10% BB2의 혼합물(우측)로 덮여진 나노입자를 나타낸다
도 9
도 9는, 2 개 유형의 코팅: 10% BB 1 또는 90% BB 1로 기능하는 금 나노입자에 위치한 IFNgD136의 상호 작용의 10% BB 1 표시 상의 SPRi 측정 결과를 나타낸다. 이러한 효과는 나노입자 농도에 따라 달라진다.
도 10
도 10은 항-인터페론 항체(anti-interferon antibody)의 ELISA 분석에 의한 IFNgD136의 분석시험(assaying)을 나타낸다. IFNgD136은 2 개 유형의 코팅: 10% BB 1 또는 90% BB 1로 기능하는 금 나노입자로 배양된다(preincubated). 그 후, 상등액(supernatant)의 IFNgD136 농도는 ELISA 분석시험에 의해 평가된다.

수용체( Receptor )

본원에서 이해하는 바와 같이, "수용체"는, 그 자체로 상호 작용할 수 있거나, 또는 수용체 조립체를 형성하기 위해, 혼합물 내에 하나 이상의 다른 수용체와 조립될 시에 샘플의 하나 이상의 구성요소 또는 대상물과 상호 작용할 수 있는 화학적 유형을 가질 수 있는 화합물이다. 본원에서 이해할 수 있는 바와 같이, 수용체는 또한 "샘플의 하나 이상의 구성요소를 가지거나, 대상물을 가진 인식용 또는 결합용 요소, 또는 결정 요인"으로 지칭될 수 있다.

바람직하게, 본 발명에 따른 수용체는 적어도 하나의 물리화학적 특징에 따라, 예를 들면, 한편으로는 친수성 또는 소수성, 다른 한편으로는 전자 밀도, 극성 또는 전하에 따라 서로 다르다. 게다가, 다른 형태 또는 구성 특징은 이들을 구별할 수 있다: 이로써, 수용체는 2 차 구조체의 존재, 예를 들면, 나선 구성(helices) 또는 시트 구성(sheets)에 따라 서로 다를 수 있거나, 서로에 대한 입체 이성체의 관계(stereoisomeric relationships)에 놓일 수 있다.

이로써, 구조적인 관점에서 보면, 본 발명에 따른 수용체는 다음과 같을 수 있다:

- 간단한 분자, 특히 1000 Da 또는 그 미만의 간단한 분자, 예를 들면, 이온, 금속 착물, 유기 화합물, 특히 유기금속 화합물, 아미노산, 펩티드, 단당류(monosaccharides), 올리고당(oligosaccharides), 뉴클레오티드(nucleotides) 또는 올리고뉴클레오티드; 또는

- 복잡한 분자, 특히 1000 Da 보다 큰 복잡한 분자, 예를 들면, 선택적으로 글리코실화된 폴리펩티드 또는 단백질, 폴리삭카라이드(polysaccharides), 지방질(lipids), DNA, RNA 또는 유기 중합체.

본 발명에 따른 수용체는 또한 분자 "브릭(bricks)"을 구성할 수 있고, 혼합물 내에서, 특히 결합 유형의 혼합물 내의 상기 분자의 조립체는 샘플의 하나 이상의 구성요소 또는 대상물과 상호 작용하는 분자 구조체를 초래한다. 이러한 유형의 수용체의 조립체는 특히 Ojeda et al. (2007) Carbohydrate Research 342:448-459; Di Gianvincenzo et al. (2010) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20:2718-2721; Bresee et al. (2010) Chem. Commun. 46:7516-7518; Bresee et al. (2011) Small 7:2027-2031; 또는 Wolfenden & Cloninger, (2006) Bioconjugate Chem. 17:958-966에 기술된다.

바람직하게, 본 발명에 따른 수용체는 1,000,000 Da 미만의 크기를 가진다.

본원에서 이해하는 바와 같이, 본 발명에 따른 수용체는 서로 독립적이거나, 분자 결합, 특히 공유 결합에 의해 서로 연결될 수 있다. 수용체가 서로 연결될 시에, 이들의 연관성은 샘플의 구성요소와의 상호 작용의 다양한 부위(site)를 나타내는 고분자(macromolecule)를 형성할 수 있고, 이러한 부위는 본 발명에 따른 수용체에 대응한다.

고감도 존( Sensitive zone )

본 발명에 따른 "고감도 존"은, 샘플의 하나 이상의 구성요소와 상기 구성요소를 포함하는 수용체 간의 상호 작용에 의해 발생된 신호를 방출할 수 있는 지지부의 일부이다.

상기와 같은 고감도 존은 가변 토폴로지(topology) 및 가변 형상을 이룰 수 있는 지지부 상의 영역 또는 체적을 차지한다. 이로써, 이는 평면일 수 있거나, 부각물일 수 있고, 즉 수용체는 지지부에 직접 부착될 수 있거나, 또는 3 차원으로 분배됨으로써 표면 상에 위치된 체적을 차지할 수 있다. 게다가, 본 발명에 따른 고감도 존은 임의의 형상을 구성할 수 있고, 특히 원형 또는 다각형, 특히 평행 6면체일 수 있다. 본 발명에 따른 고감도 존은 또한 적어도 하나의 다른 고감도 존로부터 분리되거나, 상기 적어도 하나의 다른 고감도 존과 연결될 수 있다. 바람직하게, 센서의 고감도 존 모두는 동일한 영역, 동일한 토폴로지 및 동일한 형상을 가진다. 특히, 바람직하게, 본 발명에 따른 고감도 존은 평면 토폴로지 및 원형 형상을 가진다. 또한, 바람직하게, 본 발명에 따른 고감도 존의 영역은 약 0.25 ㎛² 내지 10 ㎜²이다. 이와 더불어, 고감도 존의 두께는 바람직하게 0.5 nm 내지 100 ㎛일 수 있다.

본 발명에 따른 센서와 샘플을 접촉시키는 것은 여러 개의 측정 가능한 신호, 각각의 고감도 존에 대한 적어도 하나의 신호의 방출을 야기하여, 샘플의 특성인 신호 프로파일을 형성한다. 기술 분야의 기술자가 명확하게 이해할 수 있는 바와 같이, 고감도 존의 수의 증가는 측정 가능한 신호 프로파일의 해상도를 증가시킬 수 있다.

이로써, 바람직하게, 본 발명에 따른 센서는 본 발명에 따른, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 500, 1000, 10,000, 100,000 또는 1,000,000 개의 고감도 존을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게, 본 발명에 따른 센서는 본 발명에 따른, 10,000,000, 1,000,000, 100,000, 10,000, 5000, 1000, 500, 100, 50 또는 25 개의 고감도 존 미만을 포함할 수 있다.

수용체의 표면 밀도는 측정 가능한 신호의 세기를 조절할 수 있다(modulate).

고감도 존 내의 수용체의 표면 밀도는, 이러한 동일 고감도 존이 지지부 상에 차지하는 영역에 관련된 고감도 존에 포함된 수용체 수에 의해 주어진다. 여러 개의 서로 다른(non-identical) 수용체가 고감도 존에 존재할 시에, 서로 다른 수용체 각각의 표면 밀도 각각, 나아가 수용체 세트의 표면 밀도를 정의하는 것이 가능하다. 수용체의 표면 밀도는 고감도 존 전체에서 균일할 수 있거나 변화될 수 있다. 변화될 시에, 수용체는 표면 밀도 구배에 따라 분배될 수 있고, 예를 들면, 지지부의 표면에 의해 정의된 평면에서의 방향 기능으로서 분배될 수 있다. 바람직하게, 고감도 존 내의 수용체 세트의 표면 밀도는 10⁸ 내지 10¹⁵ receptors/mm²이다. 바람직하게, 센서의 모든 고감도 존은, 균일하고 기본적으로 유사한 수용체의 세트의 표면 밀도를 가진다.

게다가, 서로 다른 고감도 존의 수의 증가는 샘플의 구성요소와 고감도 존 간의 가능한 상호 작용을 증가시킴으로써(multiplying), 센서의 민감도(sensitivity)를 증가시킬 수 있다; 이는 신호 프로파일의 다이버시티(diversity)을 증가시키고, 이에 따라 분석될 샘플 내의 대량의 서로 다른 구성요소를 특징지을 수 있다. 이와 더불어, 서로 다른 고감도 존 수의 증가는 센서의 고감도 존에 의해 방출된 신호의 프로파일의 연속성을 증가시킬 수 있고, 정보와 상관없는 부분을 발생시키는 결함성 고감도 존의 위치를 정확하게 나타내어 제거할 수 있다.

바람직하게, 본 발명에 따른 센서는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50 또는 100 개의 서로 동일하지 않거나, 서로 다른 수용체를 포함하고, 이때 상기 서로 다른 수용체는 서로 다른 유형의 수용체 또는 서로 특성이 다른 수용체로 기술될 수도 있다. 또한, 바람직하게, 본 발명에 따른 센서는 최대 1000, 100, 50, 25 또는 10 개의 서로 동일하지 않거나, 서로 다른 수용체를 포함한다. 본 발명에 따른 동일 고감도 존은 단일 수용체를 포함하거나, 2 내지 20 개의 서로 동일하지 않거나 서로 다른 수용체를 포함할 수 있다.

기술 분야의 통상의 기술자가 명확하게 이해할 수 있는 바와 같이, 각각의 수용체 또는 수용체 유형은 본 발명에 따른 고감도 존에서 여러 개의 복제물로 나타나는 것이 바람직하다. 이로써, 예를 들면, 고감도 존이 2 개의 서로 다른 수용체를 포함할 시에, 상기 고감도 존은 서로 다른 수용체, 특히 이전에 정의된 표면 밀도를 가진 서로 다른 수용체 각각의 여러 개의 복제물을 포함하는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 고감도 존이 단지 하나의 유형의 수용체만을 포함한다는 것을 나타낼 시에, 이는 고감도 존이 단일 수용체 또는 수용체 유형의 여러 개의 복제물을 포함할 수 있다는 것을 의미한다.

바람직하게, 본 발명에 따른 센서에서, 고감도 존의 적어도 하나는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 서로 동일하지 않거나 서로 다른 수용체를 포함한다.

게다가, 본 발명에 따른 바람직한 일 실시예에서, 센서의 복수의 고감도 존, 특히 적어도 3, 5, 10 또는 100 개의 고감도 존 각각은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 서로 동일하지 않거나 서로 다른 수용체의 혼합물을 포함하며(상기 서로 동일하지 않거나 서로 다른 수용체는 각 혼합물에서 동일함), 그리고 포함하는 있는, 서로 동일하지 않거나 서로 다른 수용체의 각각의 비율에 대해서는 서로 다르다. 다른 말로 하면, 상기 센서는 복수의 고감도 존, 특히 적어도 3, 5, 10 또는 100 개의 고감도 존을 포함하고, 상기 복수의 고감도 존 각각은, 복수의 고감도 존 각각에 나타난 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 서로 다른 수용체의 서로 다른 비율을 가진다.

이로써, 본 발명의 일 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 센서는 n 개의 서로 다른 수용체(n은 1보다 큰 정수)를 포함하고, 상기 고감도 존은 비율이 변화할 수 있는 이러한 n 개의 서로 다른 수용체의 혼합물을 포함한다.

특히, n = 2이고, 예를 들면, 균일하고 서로 동일한 수용체의 세트의 표면 밀도를 가진 서로 다른 고감도 존이 6 개인 경우, 2 개의 수용체 A 및 B의 비율을 다음과 같이 고려하면; A 0% B 100%; A 20% B 80%; A 40% B 60%; A 60% B 40%; A 80% B 20%; A 100% B 0%이고, 백분율은 고감도 존의 수용체 전체 양에 대한 고감도 존에서 고려된 수용체의 양으로 여기에 표기된다. 수용체 A의 비율의 20% 연속 증가는 증가량(increments)이라 한다. 이러한 경우에, 증가량이 일정하지만, 비-일정한 증가량도 생각해볼 수 있는데, 예를 들면 A는 0, 10, 20, 30, 50, 70, 80, 90, 100%, B는 100%까지 증가량도 생각해볼 수 있다.

보다 일반적으로, 생각해볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따르면, k 개의 고감도 존 내에서, 2 개의 수용체의 혼합물에서 제 1 수용체의 백분율 비율은 100/(k-1)의 증가량으로 변화되고, 수용체 세트의 표면 밀도는 각각의 고감도 존과 동일한 것이 바람직하다.

이로써, 본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 센서는 n 개의 서로 다른 수용체(n은 1보다 큰 정수)를 포함하고, 고감도 존은 가변 비율로 이러한 n 개의 서로 다른 수용체의 혼합물을 포함하고, 증가량 i(백분율로 표시)의 함수로 제공되는 고감도 존의 바람직한 수(k)는, 100/i가 정수이고 n<(100/i)+1일 시에 k =((100/i)+n-1)!/(n-1)!(100/i)!)이며, 그리고 n>(100/i)+1일 시에 k=n^(100/i)/(100/i)!이다.

증가량 값의 감소는 연속성 및 신호 프로파일의 해상도를 증가시킨다. 이와 더불어, 이는 서로 매우 근접한 신호를 획득할 수 있거나, 또는 가능한 결함이 있는 고감도 존을 보정하는 결과로 또는 상기 고감도 존에 가중치를 제공하는 결과로서 심지어 부분적으로 잉여(redundant) 신호를 획득할 수 있다. 바람직하게, 증가량은 50%, 33%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.1%일 수 있다.

결함이 있는 고감도 존의 검출은 특히 기능성을 평가하기에 필요한 감도 존에 의해 방출된 신호와, 유사한 조성물을 가진 고감도 존에 의해 방출된 신호를 비교함으로써 가능하다. 이로써, 본 발명에 따른 방법의 일 특정 실시예에서, 이러한 방법은 또한, 고감도 존에 의해 방출된 신호와, 적어도 2 개의 다른 고감도 존, 특히 기능성을 입증하기에 필요한 것과 유사한 조성물을 가진 고감도 존에 의해 방출된 신호를 비교함으로써, 센서의 고감도 존의 기능성, 즉, 고감도 존의 무-결함성을 입증하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 목적을 위해, 기능성을 평가하기에 필요한 고감도 존에 대하여, 유사한 조성물을 가진 고감도 존은 다음과 같을 것이다. 고감도 존의 수용체의 총 양에 관련된 고감도 존당 존재하는 다양한 수용체의 양 각각의 백분율은, 기능성을 평가하기에 필요한 고감도 존의 수용체와는 50%, 33%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 또는 0.1% 미만만큼 다르다. 바람직하게, 고감도 존 1은, 이러한 고감도 존에 의해 방출된 신호 R1이 유사한 조성물을 가진 2 개의 고감도 존에 의해 방출된 신호 R2 및 R3와는 실질적으로 다른 경우에, 결함이 있는 것으로 간주될 것이다. 예를 들면, 상기 존은 (|R1-R2|, |R1-R3|)의 최소 절대 값 차가 2 개의 신호 R2와 R3 간의 차 |R2-R3|보다 적어도 50, 20, 10, 5, 4, 3 또는 2 배 큰 경우에 결함이 있는 것으로 간주될 것이다. 또 다른 예시에서, 상대 차를 사용할 수 있다; 이러한 경우에서, 고감도 존 1은, (2|R1-R2|/(R1+R2), 2|R1-R3|/(R1+R3))의 최소가 상대 차 2|R2-R3|/(R2+R3)보다 적어도 50, 20, 10, 5, 4, 3 또는 2 배 큰 경우에 결함이 있는 것으로 간주될 것이다. 결함이 있는 고감도 존의 다른 정의는 기술 분야의 통상의 기술자에게 손쉽게 얻어질 수 있다.

서로 다른 수용체의 혼합물을 포함하는 고감도 존으로부터 얻어진 신호는, 단지 동일한 수용체를 포함하는 고감도 존 각각으로부터 얻어진 신호보다 샘플의 구성요소에 관한 정보의 비-잉여 부분을 많이 획득할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 센서를 이용하여 얻어진 신호의 이러한 비선형성은 비용 절감원인, 서로 다른 수용체의 제한된 수를 사용하여 달성될 수 있다.

바람직한 또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 센서는 센서에 있는 서로 다른 수용체만큼, 단일 유형의 수용체를 포함하는 고감도 존을 적어도 다수 개 포함하고, 센서의 서로 다른 수용체 각각은 단일 유형의 수용체를 포함한 고감도 존 각각에 포함된다.

수용체는 적합한 기법으로 본 발명에 따른 지지부에 부착된다. 간단한 흡착, 정전기 상호 작용 또는 공유 접붙임(covalent grafting)은 예를 들면 생각해볼 수 있다. 예를 들면, 고체 지지부가 유리일 시에, 유리의 표면 상에 접붙임을 실행하는 것을 가능케 하는 실란 유형(silane type)의 수용체 또는 수용체 전구체를 사용하는 것이 바람직할 것이다; 고체 지지부가 금으로 구성되거나, 금으로 구성된 부분을 포함할 시에, 금속을 손쉽게 결합시킬 수 있는 티올(thiol) 기능을 포함한 수용체 전구체 또는 수용체를 사용하는 것이 바람직할 것이다. 지지부의 표면 상에 위치한 중합체 매트릭스(polymer matrices)에 수용체를 고정시키는 것 역시 가능하다.

바람직하게, 지지부로의 수용체 부착은 수용체 전구체를 사용하여 실행되고, 이때 상기 수용체의 특성이 부착을 허용하는 경우에, 상기 수용체 전구체의 구조는 수용체(상호 작용을 가능케 하는 기능은 제조 요건에 대해 특히 보호될 수 있음), 또는 수용체 그 자체와는 실질적으로 다르지 않는다.

신호(Signal)

본 발명의 목적을 위해, 용어 "신호"는 물리적인 현상을 의미할 수 있다. 의미하는 바와 같이, 신호는, 신호의 존재 또는 부재를 판별하고, 그리고/또는 상기 신호를 수량화하는 것이 가능할 시에 측정 가능하다.

본 발명에 따른 신호는 센서의 적어도 하나의 고감도 존과 접촉하는 샘플의 제공에서 발생된다; 상기 신호의 기원은 이러한 고감도 존 내에 존재하는 적어도 하나의 수용체와, 샘플의 적어도 하나의 구성요소 사이의 상호 작용이다. 상호 작용은 일반적으로, 적어도 하나의 수용체와 샘플의 적어도 하나의 구성요소 간의 결합의 형성에 대응하고, 상기 결합은 강하거나 약할 수 있고, 가역성을 가질 수도 있다. 본 발명에 따라서, 방출된 신호는 전체적으로 각각의 고감도 존에 대해 측정된다. 그러나, 필요하다면, 본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 고감도 존 모두에 의해 방출된 신호가 측정된다.

신호는 종료점에서 또는 실시간으로 측정 가능하다.

바람직하게, 본 발명에 따른 신호는 실시간으로 측정 가능하다. 표현 "실시간"은, 수용체와 샘플의 구성요소 사이의 상호 작용이 일어날 순간에, 신호가 생성되고 기본적으로 측정된다는 것을 의미한다. 바람직하게, 제공된 신호의 실시간 측정은 추가적인 파라미터이고, 일시적이고 비선형적인 치수를 신호에 부가함으로써, 본 발명에 따른 센서에 의해 제공된 정보를 더 증가시킨다.

또한, 바람직하게, 측정 가능한 신호는 질량적, 기계적, 음향적, 전기적, 광학적 유형이다. 본 발명에 따른 신호의 특성에 따라서, 신호는 특히 광학 현미경법(optical microscopy)에 의해, 형광 현미경법(fluorescence microscopy)에 의해, 공초점 현미경법(confocal microscopy)에 의해, 공명 미러(resonating mirror)를 통한 표면 플라즈몬 공명법에 의해, 수정 미세저울(quartz microbalance)을 통한, 캔틸리버(cantilever)를 통한 임피던스 측정법에 의하여, 또는 광 흡수 측정법에 의하여 측정될 수 있다.

바람직하게, 센서는 신호를 직접 검출할 수 있다. 이로써, 예를 들면, 신호가 표면 플라즈몬 공명법에 의해 측정될 시에, 적합한 검출 수단은 표면 플라즈몬 공명을 광학적으로 판독하는 시스템에 대응한다. 이러한 시스템은 다음과 같이 알려져 있다; 상기 시스템은 일반적으로 플라즈몬 여기(plasmon excitation)를 발생시키기 위해, 광원, 예를 들면 LED 유형의 광원과, 플라즈몬 공명에 의해 생성된 신호를 기록하는 CCD 카메라를 갖춘다. 이에 대해, 본 발명에 따른 신호가 이미징 모드에서 모니터링되는 것이 특히나 매우 바람직하다. 기술 분야의 통상의 기술자가 명확하게 인식하는 바와 같이, 이미징 모드는 사용되는 CCD 카메라의 이미지를 구성하는 모든 픽셀의 신호의 변화를 모니터링하는 것으로 이루어지는 반면, 다지점 모드(multipoint mode) 그 자체는 이미지, 즉 픽셀 세트의 영역을 정의하는 것 또는 미리 정의하는 것으로 이루어지고, 이때 상기 픽셀 세트의 얻어진 신호의 평균치는 선택된 이미지 영역의 평균 신호를 반영한다.

지지부 (Support)

본 발명에 따른 지지부는 신호를 측정하기에 적합한 재료로 구성된다.

바람직하게, 본 발명에 따른 센서에서, 수용체는 고감도 존과의 매체의 구성요소의 상호 작용에 의해 발생된 신호를 변환하는 지지부(즉, 상기 지지부는 대표적인 또 다른 특성의 신호를 통하여 상기 발생된 신호를 중계함)에 부착된다.

센서가 표면 플라즈몬 공명에 의해 샘플의 분석을 위해 이용될 시에, 고체 지지부는 플라즈몬 여기에 적합하고, 상기 지지부의 표면에서 소실파(evanescent wave)의 전파에 적합하다. 바람직하게, 지지부는 투명 재료, 예를 들면, 금속 층, 특히 10 내지 100 nm 두께, 보다 특별하게 50 nm 두께의 금으로 덮인 유리일 수 있다.

본 발명에 따른 지지부는 특히 유리; 실리콘; 유기 중합체 재료; 특히 아크릴레이트(acrylate), PDMS, COC, PEEK 또는 니트로-셀룰로스 유형(nitro-cellulose type); 금속 재료, 특히 은, 금 또는 백금; 탄소계 전도성 재료, 특히 유리질 탄소, 흑연(graphite), 그래핀(graphene), 탄소계 나노구조체, 또는 다이아몬드 유형; 또는 이러한 재료 중 적어도 2 개의 조합으로 구성될 수 있다.

샘플(Sample)

본 발명에 따른 샘플은 임의의 유형을 갖출 수 있다. 바람직하게 유체, 보다 바람직하게는 액체 매체 또는 기체 매체의 샘플이 바람직하다.

특히 다음과 같을 수 있다:

- 생물학적 샘플, 예를 들면, 혈액, 혈장, 혈청, 수액(cerebrospinal fluid), 소변, 대변, 관절 낭액(synovial fluid), 정액, 질 분비물(vaginal secretions), 경구 분비물, 특히 폐, 코 또는 목으로부터 비롯된 호흡 시료(respiratory specimens), 고름, 복수 유체(ascites fluid), 또는 피부 또는 결막 장액(conjunctival serous fluids)의 시료의 샘플;

- 특히 식재료 속성, 양념, 준비된 곡물 또는 음료로부터 미가공, 요리 또는 준비될 수 있는 음식으로부터 비롯된 부유액에 선택적으로 놓인 음식 샘플;

- 예를 들면, 물 처리 또는 분배 플랜트로부터의 물 샘플;

- 토양 샘플;

- 기체 또는 공기 샘플, 예를 들면, 공기 조절 시스템으로부터의 주변 공기 또는 공기 또는 내쉰 공기의 샘플.

샘플은 사전 처리를 받을 수 있다. 상기 처리는 물리적, 화학적 또는 생물학적일 수 있다; 상기 샘플은 특히 추출물, 여과물, 희석물 또는 농축물일 수 있다; 상기 샘플은, 특히 초기에 고체 샘플인 경우, 가용화물(solubilization), 분쇄물(milling), 기화물 또는 부유물일 수도 있다. 상기 처리는 또한 시료에m 적어도 하나의 신호 마커(marker), 즉, 추가 신호를 방출하는 화합물, 또는 고감도 존에 의한 신호의 생성을 가능케 하고, 촉진시키고, 또는 증대시킬 수 있는 화합물을 추가하는 것에 대응할 수 있다. 신호 마커는 샘플의 구성요소에 부착될 수 있다; 상기 샘플은 예를 들면, 형광성, 발광성 또는 방사성 분자일 수 있다.

상기 처리는 또한 내부 제어의 샘플에 내부 제어물(internal control), 즉 농도 및/또는 구성이 알려진 화합물을 추가하는 것에 대응할 수 있다.

상술된 바와 같이 사용 및 방법에 따라서, 고감도 존(들)에 의해 방출되고 샘플과의 접촉을 하는 신호는 특히 본 발명에 다른 센서와 샘플 사이의 접촉 시간의 함수로서, 측정되거나 기록되는 것이 바람직하다.

대상물(Target)

본 발명에 따른 대상물은 임의의 유형을 가질 수 있다. 상기 대상물은 박테리아, 진핵 세포, 바이러스, 단백질, 지방질, 당, 핵산, 휘발성 또는 비휘발성 유기 화합물, 또는 무기 화합물, 예를 들면 금속인 것이 바람직하다. 기능적인 면을 볼 시에, 상기 대상물은 특히 약제(medicament), 호르몬, 시토킨(cytokine), 또는 세포 수용체일 수 있다.

본원에서 대상물을 위한 고감도 존의 친화성과 유사한 것으로 간주될 수 있는 친화도는 고감도 존에 의해 방출된 신호에 기반하여 평가된다. 예를 들면, 신호의 세기가 대상물을 위한 고감도 존의 친화도에 따라 달라질 시에, 강한 신호는 강한 친화도를 나타낼 수 있는 반면, 약한 신호는 약한 친화도를 나타낸다(원하는 2 개의 주요 친화도를 이룸)

실제, 적어도 하나의 제 1 대상물을 위한 강한 친화도를 가지는 동시에, 적어도 하나의 제 2 대상물에 부착되지 않는 3 차원 구조체를 검색하는 것이 가능하다.

분석(Analysis)

본 발명에 따른 분석은 샘플의 하나 이상의 구성요소를 검출 및/또는 수량화하는 것에 목적을 둘 수 있다. 게다가, 본 발명에 따른 분석은 또한, 2 개 또는 그 이상의 미리 정의된 부류에 따른 샘플을 기술하고, 분류하고, 또는 구분하고, 예를 들면, 생물학적 근원의 샘플을 건강하거나 악성인 것으로 구분하거나, 또는 병리 조건의 유형, 예를 들면, 병리 조건을 나타내는 암에 따라 구분하거나, 또는 음식 근원의 샘플을 양호하거나(compliant) 비-양호한 것으로 구분하는 것에 목적을 둘 수 있다. 이러한 정황에서, 예를 들면, 순수 상태에서의 구성요소를 포함하거나, 정의되는 부류를 나타낼 수 있는 제어 샘플을 사용하여 비교에 의해 진행하는 것이 가능할 것이다.

이로써, 본 발명에 따른 방법의 바람직한 일 실시예에서:

- 상기에서 정의된 바와 같은 센서는 샘플과 접촉하고;

- 센서의 고감도 존에 의해 방출된 신호는 측정되고;

- 이전 단계에서 측정된 신호는, 적어도 하나의 제어 샘플과 접촉한 후에 동일 센서 또는 제 2 유사 센서의 고감도 존에 의해 독립적으로 발생된 신호와 비교되고;

- 상기 샘플은 분석되고 적어도 하나의 제어 샘플에 대해 기술된다.

이와 더불어, 본 발명에 따른 분석은 또한 2 개 또는 그 이상의 비-미리 정의된 부류에 따라 샘플을 기술, 분류 또는 구분하는 것에 목적을 둘 수 있다. 이로써, 본 발명에 따른 방법의 또 다른 바람직한 실시예에서:

- 상기에서 정의된 바와 같은 센서, 또는 상기에서 정의된 바와 같은 복수의 유사 센서는 복수의 샘플과 접촉하고;

- 각 샘플에 대한 센서(들)의 고감도 존에 의해 방출된 신호는 측정되고;

- 각 샘플에 대해 측정된 신호는 서로 비교되고;

- 각 샘플은 분석된 모든 샘플에 대해 분류된다.

비교 단계, 그 후 상기에서 정의된 기술 단계는 감독 하의(supervised) 학습 또는 감독 없는 학습(learning) 단계를 필요로 할 수 있다. 이러한 학습 단계는, 특히 Jain et al.(2000) IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence 22. 4-37에 기술된 바와 같이, 특히 기본 종래 기법으로서 사용될 수 있는 전자 혀 및 코의 분야에서 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 손쉽게 실행될 수 있다. 예를 들면, PCA(principal component analysis), 인공 신경 회로망(artificial neural networks)(Turner & Magan, op. cit.) 또는 특히, Cortes & Vapnik (1995) Machine Learning 20:273-297)에 의해 기술되고, Brown et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:262-267에 의해 기술된 바와 같이, DNA 칩들에 대해 최근에 연속적으로 사용되어 왔던 SVMs(support vector machines)에 의한 분리가 언급될 수 있다.

3 차원 구조체(Three-dimensional structure)

본원에서 이해하는 바와 같이, 본 발명에 따른 "3 차원 구조체"는 특히 입자, 보다 구체적으로 나노입자, 즉 특히 1 nm 내지 999 nm의 적어도 하나의 나노메트릭 치수(nanometric dimension)를 가진 입자, 또는 마이크로입자, 즉 적어도 하나의 마이크로메트릭 치수, 특히 1 ㎛ 내지 999 ㎛의 적어도 하나의 마이크로메트릭 치수를 가진 입자이다. 본 발명에 따른 3 차원 구조체는 탄소 나노튜브, 그래핀, 덴드리머(dendrimer), 수포, 미셀(micelle), 리포솜(liposome), 중합체, 나노크리스탈(nanocrystal), 나노실(nanothread), 자기 입자 또는 다공성 입자일 수 있다. 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 상기와 같은 3 차원 구조체는 특히 약제, 예를 들면, 병적 대상물에 부착되는 약제로 사용될 수 있다.

3 차원 구조체는 적어도 하나의 대상물과 상호 작용할 수 있도록, 본 발명에 따른 수용체로 코팅된다. 바람직하게, 본 발명에 따른 3 차원 구조체는 수용체의 혼합물로 코팅되고, 상기 수용체의 조립체, 특히 결합 유형의 수용체의 조립체는 예를 들면, 다음과 같이 기재된 바와 같이, 대상물과 상호 작용하는 분자 구조를 초래한다: Ojeda et al. (2007) Carbohydrate Research 342:448-459; Di Gianvincenzo et al. (2010) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20:2718-2721; Bresee et al. (2010) Chem. Commun. 46:7516-7518; Bresee et al. (2011) Small 7:2027-2031; 또는 Wolfenden & Cloninger, (2006) Bioconjugate Chem . 17:958-966.

예시

예시 1: 고감도 존이 2 개의 수용체 혼합물로 이루어진 센서

1. 센서 제조

2 개의 간단한 분자는, 수용체의 가변 비율을 조합하는 여러 개의 고감도 존을 수용하는 지지부를 포함한 센서를 구성하기 위해 BB(building bricks)로 사용된다: 락토스(BB 1) 및 황산화 락토스(BB 2). 0, 10, 20, 30, 50, 70, 80, 90 및 100%의 [BB1]/([BB1]+[BB2]) 비율을 가진 9 개의 혼합물이 준비되고, 총 농도는 20 μM으로 일정하다. 그 후, 상기 혼합물은 표면 플라즈몬 공명 이미징(SPRi)을 위해 사용될 수 있는 프리즘의 금 표면에 의해 형성된 지지부 상에 놓이게 되고, 프리즘의 표면과 하루 동안(overnight) 접촉하게 된다. 이로써, 형성된 칩은 그 후에 에탄올로 세척되고, N₂의 스팀으로 건조된다.

결과적으로, 자가 조립된 후에, BB 1 및 BB 2의 서로 다른 비율을 각각 가진 9 개의 고감도 존을 포함한 센서는 도 1에 도시된 바와 같이 얻어질 수 있다. 그 후에, 이러한 센서는 SPRi에 의해 단일 단백질을 포함하는 매체를 분석하기 위해 사용된다.

2. 단일 단백질을 함유한 제어 매체의 분석

단백질 매체의 분석은, 디개서(degasser)와 연동 펌프(peristaltic pump)에 연결된 10 μl 테플론 세포(Teflon cell)에서 실행된다. 500 μl의 단백질 매체가 주입된다. 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% Tween 20, 2 mM MgCl₂, pH 7.4에 포함되어 사용된 작동 완충액(working buffer solution)이 사용 전에 여과되고 기체가 제거된다. 모든 실험은 100 μl/min의 유동으로 주변 온도에서 실행된다. 각 단백질 주입 전에, 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)은 비-특정 상호 작용을 피하기 위해, 드러낸(bare) 금 표면을 차단하기 위해 사용된다.

당에 결합된 4 개의 단백질이 테스트된다: ECL(Erythrina cristagalli lectin), CXCL12 케코카인(chemokine)의 α 및 γ 아이소폼(isoforms) 및 향-염증성 시토킨 인터페론-γ(pro-inflammatory cytokine interferon-γ)(IFN-γ). 이러한 단백질은 당 사슬(saccharide chains)에 결합되는 능력에 따라 2 개의 군으로 분류될 수 있다: ECL은 갈락토스(galactose)에 결합되는 렉틴(lectin)인 반면, 2 개의 종류인 CXCL12 및 IFN-γ은 헤파란 황산(heparan sulfate)에 결합된다.

실제, ECL은 우선 여러 개의 농도(200 nM, 400 nM, 800 nM 및 1.6 μM)에서 센서를 테스트하기 위해 사용된다. 검량 곡선(calibration curve)(도 2 참조)이 만들어진다. 이러한 곡선은 시스템이 K_D(K_D = 300+/-150 nM)를 가진 센서로서 정확하게 동작한다고 보여주는 랭뮤어 유형(Langmuir type)의 흡착 프로파일을 가진다.

예비 테스트 중에, 2 개의 서로 다른 농도는, 방출된 신호가 비교될 수 있는 농도를 선택하기 위해, 다른 단백질(CXCL12 아이소폼을 위한 100 및 200 nM, 및 IFN-γ을 위한 25 및 50 nM)을 위해 사용된다. 최종적으로, 선택된 농도는 다음과 같다: 200 nM ECL, 100 nM CXCL12-α, 100 nM CXCL12-γ 및 25 nM IFN-γ. 특히 주목해야 하는 바와 같이, 각 단백질을 분석한 후, 센서는 적당한 용액을 사용하여 재생된다. 이를 위하여, 다양한 용액이 각각의 단백질에 적합한 용액을 식별하기 위해 테스트된다. 이로써, ECL용 0.02 M NaOH 용액, CXCL12-α용 1 M NaCl 용액, 그리고 CXCL12-γ 및 IFN-γ용 1% SDS 용액은 손상을 일으킴 없이, 센서의 완전한 재생을 가능케 하기 때문에, 유지된다.

선택된 농도에서 순수 단백질은 연속적으로 센서 상에 주입되고, 그 후 센서의 지지부 상에 혼합물을 놓으면, 상기 혼합물은 다양한 레벨의 회색으로 빛을 낸다. 이러한 이미지는 기록되고, 그 후에 일련의 센소그램으로 변환된다.

놀랍게도, 본 발명자가 관측한 바와 같이, 주어진 단백질에 있어, 반사율은 도 3에 도시된 바와 같이 고감도 존의 BB 조성물에 따라 달라진다. 특히 관측된 바와 같이, 다양한 BB 혼합물의 반응은 순수 수용체의 반응의 간단한 선형 추가가 아니다. 그러므로, 이러한 비선형 행동은 수용체 각각의 비율을 변화시킨 다양한 고감도 존을 사용함으로써 귀납적으로 타당함으로 보여줘야 하는데, 이는 각 고감도 존의 반응이 정보의 추가 부분을 가지고 있기 때문이다. 나아가, 관측되는 바와 같이, 주어진 고감도 존에 있어, 반응 세기는 주입된 단백질에 따라 달라지고, 이는 센서가 각 단백질에 대해 서로 다르게 반응한다는 것을 보여준다.

각각의 단백질의 개별적인 행동을 보여주기 위해서, 단백질 주입 종료 전에 일분 동안 측정된 반사율 값은 혼합물의 BB 1의 비율 함수로 나타낸다(도 3). 흥미롭게도, 연속적인 전개 결과 프로파일의 형태에서 특이한 프로파일이 각 단백질에 대해 덧붙여질 수 있다(interpolated). 본 발명자가 입증할 수 있는 바와 같이, 주어진 단백질에 있어, 상기 프로파일은 단백질의 농도, 단백질 일부를 위한 신호 세기, 물론 가변성까지 상관없이, 농도 함수로서 기본적으로 유지된다.

결과적으로, 상기와 같은 센서는 단백질을 구별 및 식별할 수 있을 뿐만 아니라, 수량화할 수 있는 목적을 위해서도 사용될 수 있다. 나아가, 단백질에 대한 이러한 센서의 반응의 연속적인 행동은 종래의 전자 코 및 혀 센서로 얻어진 데이터의 세트와 비교되는, 상당하고 중요한 이점을 제공한다. 이는 연속적인 전개 결과 프로파일 각각에 있어, 일 수용체의 신호가 다른 수용체의 신호와 상관 관계가 있고, 비정상적인 신호가 배제됨으로써, 보다 정확하고 보다 정밀한 분석 식별을 실행할 수 있기 때문이다.

상세한 방식으로, BB 1의 70%에서 최대 신호를 가진 ECL 프로파일은 BB 1의 10%에서의 최대 신호를 가진 다른 것보다 완전하게 상이한데, 여기에서 예측되어 보여주는 바와 같이, ECL은, 락토스에 농후한 지지부의 고감도 존에 대해 큰 친화도를 가진다. 이와 반대로, 헤파란 황산에 결합된 단백질은 황산화 락토스 BB 2에 농후한 고감도 존에 대해 큰 친화도를 가진다. 결과적으로, ECL은 다른 것과는 손쉽게 구분될 수 있다. 보다 바람직하게, CXCL12의 α 아이소폼은 CXCL12-γ 또는 IFN-γ을 위해 얻어진 것과는 상대적으로 다른 연속적인 전개 결과 프로파일을 제공한다. 실제로, CXCL12-α에 있어, 반사율은 BB 1의 비율이 50% 또는 그 이상일 시에 사실상 0인 반면, CXCL12-γ 또는 IFN-γ에 있어, 반사율은 이보다 더 높게 나타난다. 도 3에 도시된 연속적인 전개 결과 프로파일의 완전한 분석에서 도시된 바와 같이, 동일 농도에서, CXCL12-γ는 CXCL12-α보다 고감도 존에 대한 친화도가 높다. 이로써, 100 nM에서 CXCL12-α를 이용하면, 센서의 고감도 존이 1.35%보다 큰 반사율을 나타내지 않는 반면, 2.30%의 신호는 CXCL12-γ로 달성된다.

ECL이 센서를 이용하여 다른 단백질로부터 구분될 수 있다는 것을 손쉽게 이해할 수 있는 반면, 주목해야 하는 바와 같이, 이들의 영역 1-68에 동일한 CXCL12의 2 개의 아이소폼은 IFN-γ에 대해 CXCL12-γ보다 크게 구분된다.

그러나, 서로 다른 비율의 2 수용체를 가진 9 개의 고감도 존을 포함한 이러한 제 1 세대의 센서를 이용하면, 서로 다른 신호 세기임에도 불구하고 CXCL12-γ 및 IFN-γ을 구별하는 것이 불가능하다. 이에 대하여, 본 발명자는 예측한 바와 같이, 고감도 존의 레벨에서 큰 다이버시티를 발생시키기 위해 추가 수용체로부터 준비된 센서는, 유사하지만 서로 다른 담당 토폴로지(charge topologies)를 가진 헤파란 황산-결합 단백질을 구별하는 것이 가능해야 한다.

3. 복합 매체의 분석에 대한 적용

전자 코 및 혀 기법의 주요 적용은 복합 매체의 테스트 및 분석에 있다. 매체 분석에서 상기의 센서의 유효성을 테스트하기 위해서, 본 발명자는 2 개의 단백질의 혼합물을 이용하여 테스트한다: ECL(200 nM) 및 CXCL12-α(100 nM)(혼합물 1) 및 음식 혼합물, 예를 들면, 두유, 우유 또는 쌀 우유.

얻어진 연속적인 전개 결과 프로파일은 도 4에 도시된 바와 같이, 비교를 위해 2 개의 순수 단백질에 대해 얻어진 프로파일에 의해 수반된다. 이러한 초기 결과에서 입증된 바와 같이, 센서는 혼합물에 민감하고, 순수 단백질로부터 혼합물을 구별할 수 있다. 사실, 관측된 바와 같이, 2 개 단백질의 혼합물의 프로파일은 순수 단백질의 프로파일의 간단한 추가와 가깝다. 이로부터 제안되는 바와 같이, 센서의 고감도 존 상에 흡착되는 단백질 간의 연동 상호 작용은 사실상 없다. 이러한 속성의 주요 이점은, 간단한 선형 분해물(decomposition)에 의한 혼합물의 개별적인 구성요소의 각 프로파일에 기반하여 혼합물을 검출 및 수량화하는 것이 가능하다는 점이다.

게다가, SPRi에 의해 얻어진 실시간 흡착 및 탈착 운동을 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 추가 정보는 연속적인 전개 결과 프로파일과 더불어, 다양한 단백질을 구분하기 위해 또 다른 방식을 추가할 수 있다. 예를 들면, 도 5는 3 차원으로 ECL + CXCL12-α 혼합물의 인식의 프로파일의 일시적인 전개 결과의 프로파일을 도시한다.

이와 더불어, 3 개 유형의 음식 샘플, 두유, 우유 및 쌀 우유에 대한 전자 혀의 반응의 양호한 비교를 위하여, 프로파일은 각 샘플에 대해 만들어진다. 이러한 프로파일은 고감도 존의 락토스/황산화 락토스(L/SL) 비율의 함수로서 6분(min) 동안 세척된 후의 반사율을 도시한다(도 6). 매우 손쉽게 확인할 수 있는 바와 같이, 두유(도 6a)에 있어서, 순수 황산화 락토스, 90% SL, 80% SL, 70% SL, 60% SL 및 50% SL를 포함하여, 황산화 락토스에 농후한 여러 개의 고감도 존에서 강한 친화도가 나타났다. 한편, UHT 우유(도 6b)에 있어, 2 고감도 존인 순수 황산화 락토스 및 90% SL에서만 강한 친화도가 나타났다. 이는 전자 혀가 이러한 2 개의 제품을 구별할 수 있다는 것을 보여준다. 쌀 우유(도 6c)에 있어, 프로파일은 완전하게 서로 다른데, 이는 최고 친화도가 순수 락토스로 구성된 고감도 존에서 얻어지기 때문이다. 이러한 결과에서 보여준 바와 같이, 전자 혀는 복잡한 샘플을 분석 및 구분하기에 효과적이다. 나아가, 각 샘플에 대해 얻어진 프로파일은 이들의 식별을 위한 특징(signature)으로 간주될 수 있다.

예시 2: 적합한 결합 표면을 선택하는 방법

치료제(therapeutic agent)로서 형성된(decorated) 나노입자(NPs)의 사용은 널리 탐구된 주제이다. 이로써, 여러 명의 저자는 특정 유효성을 가진 시스템을 기술한다. 사용되는 코팅 중에는 언급하면 다음과 같은 것이 있다:(i) 예를 들면, 대상물과, 분자 간 직접 상호 작용하는 항체 등의 특정 리간드 또는 (ii) 최근에 개발된 작은 분자로 구성되거나(Bowman et al.(2008) J. Am. Chem. Soc. 130:6896-6897; Baram-Pinto et al.(2009) Bioconjugate Chem. 20:1497-1502; Baram-Pinto et al.(2010) Small 6:1044-1050; Rele et al.(2005) J. Am. Chem. Soc. 127:10132-10133), 또는 정의된 생물학적 속성을 그 자체로 개별적으로 가지지 않은 작은 분자의 조립체로 구성되는 코팅(Ojeda et al. (2007) Carbohydrate Research 342:448-459; Di Gianvincenzo et al. (2010) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20:2718-2721; Bresee et al. (2010) Chem. Commun. 46:7516-7518; Bresee et al. (2011) Small 7:2027-2031; 또는 Wolfenden & Cloninger, (2006) Bioconjugate Chem. 17:958-966)(그러나, 상기 코팅은 나노입자의 표면에 놓일 시에, 특정 속성을 발생시킴).

이러한 후자 조립체는 통상적으로 결합적으로 만들어지고: 기본 브릭(base bricks)의 정의된 세트는 혼합되고, 그 후에 나노입자와 함께 조립된다. 이러한 혼합물의 선택은 반드시 합리적인 것이 아닌데, 이는 적합한 구조체가 각 유형의 NP의 활동성을 확인함으로써(screening), 최종적으로 식별되기 때문이다.

그러므로, 상기에서 의미하는 바와 같이, 생물학적 활동성을 반드시 갖지 않은 화합물의 라이브러리(libraries)에 기반한 활성 코팅을 발견하기 위해서, 결합 혼합물로부터 얻어진 코팅을 가진 대량의 NP를 제조하는 것이 필요할 것이다. 이러한 NP의 생물학적 활동성의 확인은 선택적으로, 활성 혼합물을 검출하는 것을 가능케 할 것이다. 이러한 결과로, 준비된 서로 다른 NP 수와 활성 NP 수 간에는 비율이 매우 낮다.

이러한 혼합물을 대상물로 성공적으로 삼기 위해서, 그리고 제조된 비활성 NP의 수를 줄이기 위해서, 신속하고 높은 처리량의 분석에 대해 보다 호의적인 형태로 수용체를 형성하는 기본 브릭의 혼합물 활동성을 신속하게 평가할 수 있는 것이 바람직하다.

이러한 정황에서, 본 발명자가 놀랍게도 보여주는 바와 같이, 2 차원(2D) 지지부 상의 수용체 혼합물로 구성된 표면의 활동성은 동일한 혼합물로 코팅된 나노입자의 활동성과 매우 유사한 상태를 유지한다.

이로써, 본 발명자는 나노입자의 활동성, 또는 보다 일반적으로, 특정 수의 고감도 존을 갖춘 2D 센서 상에 테스트에 의해 수용체를 형성하는 화합물의 혼합물을 표면에서 가진 3 차원 구조체, 예를 들면, 초기 화합물의 2 개의 특정 비율의 혼합물을 각각 나타내는 점의 형태를 한 3 차원 구조체의 활동성을 평가하는 것을 제안한다. 그 후, 단백질 또는 미생물일 수 있는 대상물은, 예를 들면, 이들 센서와 접촉하고, 상호 작용은 예를 들면, SPRi에 의해 측정된다. 대상물과 다양한 고감도 존 사이에서 측정된 상호 작용의 세기는 NP 등의 3 차원 구조체의 코팅의 생성을 위해 제공되는 혼합 조성물을 나타낸다. 마찬가지로, 상호 작용을 피하는 것이 선호되는 경우, 정의된 대상물과의 약간의 상호 작용 또는 비-상호 작용을 나타내는 고감도 존의 것과 유사한 혼합물 조성물은 바람직하게 선택될 것이다.

그러므로, 본 발명자는 3 차원 구조체, 특히, 예를 들면, NP, 덴드리머 또는 리포솜 등의 나노 객체(nanoobject) 또는 마이크로 객체 유형의 코팅의 결합적인 생성, 표면 속성의 신속한 평가에 매우 적합한, 본 발명을 따른 센서를 사용하여 2D 확인 단계와 조합하는 것을 제안한다. 이로써, 2D-대-3D 속성 보존은 활성 표면을 미리 선택하는 것을 가능케 함으로써, 앞날의 약제가 빠르고 저렴하게 개발될 수 있다.

원칙 기술(Description of the principle):

1 - 센서는, 기본 브릭을 형성하는 수용체의 특정 비율을 가진 혼합물, 즉 0, 10, 20, 30, 50, 70, 80, 90 및 100%의 [BB1]/([BB1]+[BB2]) 비율로 이루어진 9 개의 혼합물로 각각 구성된 고감도 존을 준비함으로써, 예시 1에 나타난 바와 같이, 우선적으로 구성되고, 총 농도는 20μM으로 일정하고, BB 1은 락토스를, BB 2는 황산화 락토스를 나타낸다.

2 - 그 후에, 대상물을 위한 고감도 존의 친화도, 이 경우에 인터페론 감마 D136(IFNg D136)가 측정되되, 본 경우에서 예시 1의 모드에 따른 SPRi에 의해 측정된다.

3 - 최적의 친화도를 제공하는 고감도 존(들)이 선택된다. 본 경우에서, IFNg D136 단백질에 대해 관련 있는 고감도 존은 10% BB 1/90% BB 2의 혼합물로 구성된다(도 7). 90% BB1/10% BB 2의 혼합물에 대응하는 고감도 존은 부정적인 제어(negative control)로서 선택된다.

4 - 식별된 혼합물과 유사한 혼합물로 코팅된 금 입자인 NP가 준비된다(도 8). 나노입자의 크기는 20 nm이다.

5 - 대상물을 위해 준비된 NP의 친화도는, 이 경우에 SPRi(도 9)에 의한, 또는 ELISA(도 10)에 의한 종래의 생화학 테스트에 의해 입증된다.

SPRi를 이용하면, 선명하게 관측할 수 있는 바와 같이, 코팅과 관련 있는 NP(10% BB1)는 NP 농도에 따라 달라지는 신호에서 감소되고; 한편, 부정적인 제어 NP(90% BB1)는 신호에서 전혀 변화되지 않는다.

ELISA의 결과물에서 보여주는 바와 같이, 2 차원 지지부 상의 수용체의 혼합물로 구성된 고감도 존의 대상물을 위한 친화도는 동일한 혼합물로 코팅된 나노입자의 것과 매우 유사한 상태로 유지한다.

게다가, 단계 1 내지 5의 동일 유형의 방법은 여러 개의 대상물에 대해 실행될 수 있다; 예를 들면, 제 2 대상물 B의 결합 없이, 제 1 대상물 A가 결합된 입자가 필요한 경우.

Claims

샘플을 분석하거나 적어도 하나의 대상물을 검출하고, 하나의 표면 상에서 지지부를 포함하는 전자 혀 또는 코 센서에 있어서,
상기 표면에는 복수의 고감도 존이 위치하고, 상기 고감도 존 각각은 적어도 하나의 수용체를 포함하고, 적어도 하나의 수용체와 상기 샘플의 적어도 하나의 구성요소와의 상호 작용, 또는 적어도 하나의 수용체와 적어도 하나의 대상물과의 상호 작용에 의해 발생된 측정 가능한 신호를 방출할 수 있고,
상기 전자 혀 또는 코 센서는, 수용체 조성물이 각기 서로 다른 적어도 3 개의 고감도 존을 포함하며,
상기 고감도 존 중 적어도 하나는 적어도 2 개의 서로 다른 수용체의 혼합물을 포함하고,
다른 2 개의 고감도 존 각각은 상기 2 개의 서로 다른 수용체 중 적어도 하나를 포함하는 전자 혀 또는 코 센서.
청구항 1에 있어서,
상기 전자 혀 또는 코 센서는 복수의 고감도 존을 포함하고,
상기 복수의 고감도 존 각각은 적어도 2 개의 서로 다른 수용체의 혼합물을 포함하고,
각각의 혼합물에 있는 서로 다른 수용체는 동일하나, 상기 서로 다른 수용체 각각의 비율은 서로 다른 전자 혀 또는 코 센서.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 고감도 존 중 적어도 하나는 적어도 3 개의 서로 다른 수용체의 혼합물을 포함하는 전자 혀 또는 코 센서.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 전자 혀 또는 코 센서는 복수의 고감도 존을 포함하고,
상기 복수의 고감도 존 각각은 적어도 3 개의 서로 다른 수용체의 혼합물을 포함하고,
각각의 혼합물에 있는 서로 다른 수용체는 동일하나, 상기 서로 다른 수용체 각각의 비율은 서로 다른 전자 혀 또는 코 센서.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 전자 혀 또는 코 센서에 서로 다른 수용체가 있기 때문에, 상기 센서는 단일 유형의 수용체를 포함한 고감도 존을 적어도 다수 개 포함하고,
상기 단일 유형의 수용체를 포함한 고감도 존 각각은 상기 센서의 서로 다른 수용체 각각을 포함하는 전자 혀 또는 코 센서.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 전자 혀 또는 코 센서는, 적어도 하나의 결함성(defective) 고감도 존의 존재의 식별을 가능케 하기 위해, 상기 고감도 존 모두에 의해 방출된 신호의 프로파일을 위한 충분한 개수의 고감도 존을 포함하는 전자 혀 또는 코 센서.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 전자 혀 또는 코 센서는 샘플을 분석하는 전자 혀 또는 코 센서.
샘플을 분석하는 방법에 있어서,
- 청구항 1에 따른 전자 혀 또는 코 센서는 상기 샘플과 접촉하고;
- 상기 센서의 고감도 존에 의해 방출된 신호는 측정되고;
- 이전 단계에서 측정된 신호는, 적어도 하나의 다른 샘플과 접촉한 후에 동일 센서 또는 제 2 유사 센서의 고감도 존에 의해 독립적으로 발생된 신호와 비교되고;
- 상기 샘플은 분석되어 기술되는(described) 샘플 분석 방법.
청구항 8에 있어서,
- 상기 센서는 상기 샘플과 접촉하고;
- 상기 센서의 고감도 존에 의해 방출된 신호는 측정되고;
- 이전 단계에서 측정된 신호는, 적어도 하나의 제어 샘플과 접촉한 후에 동일 센서 또는 제 2 유사 센서의 고감도 존에 의해 독립적으로 발생된 신호와 비교되고;
- 상기 샘플은 적어도 하나의 제어 샘플에 대해 분석되어 기술되는 샘플 분석 방법.
청구항 8에 있어서,
- 상기 센서 또는 복수의 유사 센서는 복수의 샘플과 접촉하고;
- 상기 센서(들)의 고감도 존에 의해 방출된 신호는 각 샘플에 대해 측정되고;
- 각 샘플에 대해 측정된 신호는 서로 비교되고;
- 각 샘플은 분석된 모든 샘플에 대해 분류되는 샘플 분석 방법.
청구항 8 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플 분석 방법은, 일 측 고감도 존에 의해 방출된 신호와 적어도 2 개의 타 측 고감도 존에 의해 방출된 신호를 비교함으로써, 상기 센서의 고감도 존의 기능성을 입증하는 단계를 더 포함하는 샘플 분석 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 전자 혀 또는 코 센서는 적어도 하나의 대상물과 상호 작용하거나 상호 작용하지 않기 위한, 3 차원 구조체를 코팅하는 수용체의 혼합물의 수용체 조성물을 정의하기 위해 사용되는 전자 혀 또는 코 센서.
적어도 하나의 대상물과 상호 작용하거나 상호 작용하지 않기 위한 수용체의 혼합물로 코팅된 3 차원 구조체를 제조하는 방법에 있어서,
- 청구항 1에 따른 전자 혀 또는 코 센서와 상기 대상물을 접촉시키는 단계;
- 신호를 방출하는 상기 센서의 고감도 존을 식별하는 단계 - 상기 신호의 세기는 상기 대상물에 대해 수용체의 혼합물로 코팅되는 3 차원 구조체의 원하는 친화도와 유사한 대상물용 친화도를 나타냄;
- 상기 식별된 고감도 존의 수용체 조성물과 유사한 수용체 조성물을 가진 수용체 혼합물로 3 차원 구조체를 코팅하는 단계;를 포함하는 3 차원 구조체 제조 방법.
청구항 13에 있어서,
상기 3 차원 구조체 제조 방법은, 각각의 고감도 존에 의해 방출된 신호와 적어도 2 개의 다른 고감도 존에 의해 방출된 신호를 비교함으로써, 상기 고감도 존의 기능성을 입증하는 단계를 더 포함하는 3 차원 구조체 제조 방법.