KR100968334B1 - 바이오센서에 사용되는 여러 분석물질의 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 여러 분석물질을 포함하는 시료를 다수의 분획으로 분리한 후 여러 분석물질에 대한 수용체를 섞어 고정시킨 센서 칩을 이용하여 차례로 검출할 수 있도록 하는 분석물질의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 여러 분석물질의 검출 방법은 다수의 분석물질을 함유하는 시료를 다수의 분획으로 분리하는 단계; 및 상기 다수의 분리된 분획을 각각 서로 다른 다수의 분석물질에 대한 다수의 수용체가 혼합되어 고정된 바이오센서 칩에 순차적으로 주입하여 각각의 분석물질을 순차적으로 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명을 이용할 경우 한 개의 센서 칩으로 여러 물질을 검출할 수 있는 효과가 있다.

분석물질(analyte), 분획(fractionation), 바이오센서(biosensor)

Description

바이오센서에 사용되는 여러 분석물질의 검출 방법{Method for detecting multiple analytes for use in a biosensor}

본 발명은 바이오센서를 이용한 분석물질의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 여러 분석물질을 포함하는 시료를 다수의 분획으로 분리한 후 차례로 검출할 수 있도록 하는 분석물질의 검출방법에 관한 것이다.

바이오센서는 신호발생장치(signal transducer)에 인식 물질(sensing material)로 작용하는 수용체(receptor)를 고정시킨 것으로 수용체와 분석물질(analyte) 사이의 특이적이고 강한 상호작용을 통해 분석물질을 매우 민감하게 검출할 수 있는 장점을 가지고 있다. 수용체란 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로서 대표적인 예로는 항체, DNA, 탄수화물 등을 들 수 있다.

표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance, SPR), 수정결정 미소저울(Quartz crystal microbalance, QCM), 전계 효과 트랜지스터 (Field-effect transistor, FET), 거대자기저항 (Giant magnetoresistance, GMR)과 같은 방식의 바이오센서는 수용체를 고정시킨 센서 칩을 이용하여 분석물질에 표지를 붙이지 않은 상태로 직접 검출할 수 있지만 이 경우에는 한 센서 칩으로 한 종류의 단백질만 검출할 수 있는 단점이 있다(도 1 참고).

혈청이나 한 세포에 있는 여러 종류 단백질의 농도를 동시에 측정하는 단백질체 분석(proteom analysis)을 위해서는 여러 단백질에 대한 항체를 별도의 점으로 고정시킨 항체 어레이 또는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 그러나 이 경우 분석물질이 결합한 점을 확인하기 위해서는 형광물질과 같은 표지를 붙인 또 하나의 항체를 사용해야 하는 단점이 있다(도 2 참고).

따라서 본 발명은, 상기와 같은 종래 기술의 한계를 극복하기 위하여 안출된 것으로, 그 목적은 여러 분석물질을 포함하는 시료를 다수의 분획으로 분리한 후 차례로 검출할 수 있는 분석물질의 검출방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 바이오센서 시스템에서 한 개의 센서 칩으로 여러 종류의 분석물질을 검출하여 바이오센서 칩의 제작을 단순화시킬 수 있는 분석물질의 검출방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 제1특징에 따르면, 본 발명은 다수의 분석물질을 함유하는 시료를 다수의 분획으로 분리하는 단계; 및 상기 다수의 분리된 분획을 각각 서로 다른 다수의 분석물질에 대한 다수의 수용체가 혼합되어 고정된 바이오센서 칩에 순차적으로 주입하여 각각의 분석물질을 순차적으로 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석물질의 검출방법을 제공한다.

단, 여기에서 한 분획에 한 종류의 이상의 분석물질이 포함되어 있을 경우에는 서로 다른 바이오센서 칩에 이들 분석물질에 대한 수용체를 고정시켜 검출함으로써 그 분석물질들을 구별할 수 있다.

상기 다수의 분석물질을 포함하는 시료를 다수의 분획으로 분리하는 단계는 크로마토그래피, 전기영동 및 등전초점법(isoelectric focusing) 중에서 선택된 적어도 하나의 방법을 사용할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에서는 여러 분석물질을 포함하는 시료를 다수의 분획으로 분리한 후 차례로 검출할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 바이오센서 시스템에서 한 개의 센서 칩으로 여러 종류의 분석물질을 검출할 수 있도록 함으로써 바이오센서 칩의 제작을 단순화시킬 수 있다.

더욱이, 본 발명에서는 분석물질을 검출할 때 두 종류의 항체를 이용하거나 여러 개의 센서 칩을 사용하지 않고 한 개의 센서 칩으로 여러 종류의 분석물질을 검출할 수 있도록 함으로써 경제성을 향상시킬 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 분석물질의 검출방법은 센서 칩에서 검출하기 이전에 분석물질을 다수의 분획으로 분리시킴에 의해 한 개의 센서 칩으로 여러 종류의 분석물질 을 검출할 수 있을 뿐만 아니라 한 종류의 수용체만으로 각 분석물질을 검출할 수 있도록 한 것에 특징이 있다.

여기에서 분석물질(analyte)이란 검출 대상이 되는 물질로서 대표적인 예로는 박테리아, 바이러스, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 금속 이온, 유기화합물 등을 들 수 있다.

또한, 여기에서 수용체(receptor)란 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로서 대표적인 예로는 항체 또는 효소를 비롯한 단백질, 펩타이드, 핵산, 탄수화물 등을 들 수 있다.

분획(fraction)은 혼합물을 물질의 크기, 전하, 용해도, 끓는점 등의 성질을 이용하여 그 성질이 차츰 변하는 순서대로 더 작은 부피로 나눠 놓은 것을 가리킨다. 예를 들어 이온교환 크로마토그래피에서 칼럼에 흡착된 단백질들은 표면의 전하에 따라 서로 다른 세기로 흡착되는데 더 강하게 흡착된 단백질일수록 그 단백질을 용출시키기 위해서 이온농도가 더 높은 완충용액을 흘려주어야 한다. 따라서 칼럼에 이온세기를 점점 높인 완충용액을 흘려주면서 일정한 부피의 분획을 모으면 첫 분획은 칼럼에 가장 약하게 흡착된 단백질을 포함하게 되고 나중으로 갈수록 점점 강하게 흡착된 단백질을 포함하게 된다.

한편 본 명세서 전체에 걸쳐서, 분획을 수행하는 것은 분획 기능이 내장된 바이오센서를 이용하는 경우뿐만 아니라, 분획 기능을 수행하는 별도의 분획 기구(unit)를 통해 분획을 수행한 후 그 분획된 분석물질이 바이오센서로 제공되어 분석물질의 검출이 수행되는 경우도 포함하는 넓은 의미로 이해되어야 함에 유의할 필요가 있다.

도 3a에는 본 발명의 제1실시예에 따른 다수의 분석물질(A,B,C)을 포함하는 시료의 검출방법이 도시되어 있다.

도 3a와 같이 본 발명의 제1실시예에 따른 검출방법에서는 여러 분석물질(A,B,C)을 포함하는 시료를 각각 한 종류의 분석물질을 포함하는 여러 개의 분획으로 분리한 후, 각 분획을 여러 분석물질(A,B,C)에 대한 수용체를 섞어 고정시킨 센서 칩(6)에 주입하여 차례로 검출할 수 있다.

일반적으로 한 개의 센서 칩에 서로 다른 분석물질에 대한 수용체를 함께 고정시켰을 경우 이들 분석물질이 함께 센서 칩으로 주입되면 센서 칩에서 발생하는 신호가 어느 분석물질에 의한 것인지 알 수 없다.

그러나, 서로 다른 분석물질은 전하, 크기, 등전점(isoelectric point) 등에서 서로 다른 특성을 가지고 있기 때문에 크로마토그래피, 전기영동, 등전초점법(isoelectric focusing) 등 다양한 방법을 이용하여 서로 다른 분획으로 분리할 수 있다. 따라서, 각 분획이 서로 다른 시점에 센서 칩으로 주입된다면 특정 시점에 나온 신호는 그 분획에 포함된 분석물질에 의한 것임을 알 수 있다. 이는 특정 분리 방법에서 각 분석물질이 어느 분획에 포함되어 있는지 미리 알고 있을 경우 특히 유용하다.

이 방법은 혈청단백질 전기영동(serum protein electrophoresis)과 같은 진단방법을 개선하는데 사용될 수 있다. 혈청단백질 전기영동에서는 혈청에 포함된 6-8종의 주요 단백질을 전기영동으로 분리한 후 각 띠의 강도를 분석하여 여러 가 지 질병을 진단한다. 만약 이 단백질들을 바이오센서로 검출한다면 전문적인 기술이 없는 사람도 훨씬 간편하게 그리고 짧은 시간에 진단에 필요한 정보를 얻을 수 있다.

그러나, 바이오센서를 이용한 분석을 위해서는 6-8개의 센서 칩이 필요하기 때문에 많은 비용이 드는 단점이 있다. 반면에, 본 발명의 방법에 따라 이 단백질들을 먼저 서로 다른 분획으로 분리하여 차례로 센서 칩에 주입되도록 한다면 이 단백질들에 대한 항체를 섞어 고정시킨 한 개의 센서 칩으로도 분석이 가능하다.

더 나아가서 혈청에 포함된 단백질들의 농도 패턴을 분석하는 혈청 단백체 분석(serum proteom analysis) 기법은 더 많은 질병의 진단에 유용한 정보를 제공할 수 있는 가능성이 있다. 이 경우 진단에 필요한 주요 단백질의 종류가 수십 종류에 이르게 되며 크로마토그래피나 전기영동으로 분리한 후에도 각 분획에 몇 종류의 단백질이 포함될 수 있다.

이 경우, 도 3b에 나타낸 것처럼 분석물질로서 다수의 단백질의 혼합물을 몇 개의 분획으로 분리하고, 한 분획에 포함된 몇 개의 단백질들을 서로 다른 센서 칩으로 검출하는 방법을 사용할 수 있다.

도 3b는 본 발명의 제2실시예에 따라 혈청에 포함된 단백질들의 농도 패턴을 분석하는 혈청 단백질체 분석(serum proteom analysis) 기법에 적용하도록 멀티 센서 칩을 사용한 검출방법을 나타낸 설명도이다.

도 3b에 도시된 바와 같이, 시료가 9 종류의 단백질(a-i)을 포함하는 혼합물인 경우, 예를 들어, 이온교환 크로마토그래피(50)를 이용하여 3개의 분획으로 분 리한다.

이 경우 분획 Ⅰ에 예를 들면, a, b, c의 세 단백질이 포함되어 있기 때문에 한 개의 센서 칩으로는 구별하여 검출할 수 없으며 서로 다른 센서 칩을 사용해야 한다. 따라서, 도 3b와 같이 각 분획에 최대 3종류의 단백질이 포함되어 있다면 세 개의 센서 칩(6a-6c)을 필요로 한다. 이는 마치 이차원 전기영동(two-dimensional electrophoresis)과 같이 전체 단백질을 이차원으로 펼쳐 분석하는 효과가 있다.

이상에서 언급한 바이오센서 칩은 다양한 검출방식을 구현하는 바이오센서에 해당되는 것으로서 여러 가지 종류가 있을 수 있음에 유의할 필요가 있다. 예를 들면, 바이오센서 칩은 QCM(quartz crystal microbalance) 바이오센서 칩, SPR(surface plasmon resonance) 바이오센서 칩, GMR(giant magnetoresistance) 바이오센서 칩, FET(field-effect transistor) 바이오센서 칩 중의 어느 하나 일 수 있다.

이하 본 발명을 바람직한 실시예를 들어 보다 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니라, 본 발명을 구현하는 예시적인 것에 불과하다.

<실시예 1> 혼합 단백질의 분리-검출

[실험 1] 한 개의 센서 칩에서 두 종류의 단백질 검출 실험

여러 분석물질에 대한 수용체를 섞어 고정시킨 한 개의 센서 칩에 각 분석물질을 서로 다른 시점에 주입함으로써 여러 분석물질을 검출하는 원리의 증명을 위해 한 개의 수정미소저울(QCM) 센서 칩에 두 종류의 항체, 인간 면역 글로불린 G(hIgG) 단백질에 대한 항체와 인간 헵토글로빈 (hHp) 단백질에 대한 항체를 고정시켰다. 그리고, hIgG 단백질과 hHp 단백질 2.5 ㎍ 씩을 차례로 주입하였을 때 도 4와 같이 17 Hz와 8 Hz의 주파수 변화가 관찰되었다.

이는 수정미소저울 센서 칩에 고정된 항체에 각 단백질이 결합하여 표면의 질량이 증가하였기 때문이다. 즉, 이 결과는 한 개의 센서 칩에 두 종류의 서로 다른 항체를 고정시키고 각 항원을 서로 다른 시점에 주입하면 각 항원을 검출할 수 있음을 보여준다.

[실험 2] 두 종류 단백질의 분리 조건 조사

hIgG 단백질과 hHp 단백질을 분리할 수 있는 조건을 조사하기 위해 3×5 mm 크기의 Q-Sepharose 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼을 만들고 완충용액 A(10 mM Tris-Cl, pH8.0) 조건에서 두 단백질을 주입하였다. 그 결과, 두 단백질이 모두 칼럼에 흡착되고 전혀 흘러나오지 않는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 완충용액 A에 NaCl을 첨가하며 용출시킨 결과 hIgG는 0.1 M NaCl에서 hHp는 0.3 M NaCl에서 용출되는 것을 확인할 수 있었다.

[실험 3] QCM 바이오센서에서 두 단백질 혼합물의 분리-검출

다음으로 QCM 바이오센서 장치에서 센서 칩을 수용하는 셀 앞에 실험 2의 칼럼을 설치하여 도 5와 같이 바이오센서 시스템을 만들었다.

도 5는 본 발명에 따라 음이온 교환 칼럼이 부착된 바이오센서 시스템을 나타낸 개략 구성도이다.

도 5에 도시된 본 발명에 따른 바이오센서 시스템은 완충용액을 흘려주는 펌 프(61), hIgG 단백질과 hHp 단백질을 주입하기 위한 주입밸브(62), 음이온 교환 칼럼(51), 단백질의 항체가 고정된 QCM 센서 칩을 수용하는 셀(63), 및 폐기물 수거병(67)이 도관(68)을 통하여 순차적으로 연결되어 있고, 상기 QCM 센서 칩에는 오실레이터(Oscillator)(64), 주파수 카운터(Frequency counter)(65) 및 검출신호 분석용 컴퓨터(66)가 순차적으로 연결되어 있다.

여기에서 기본 운반 완충용액은 전과 종일하게 완충용액 A를 사용하였고 유속은 25 ㎕/min으로 하였다. 그리고, 센서 칩에는 실험 1과 동일하게 hIgG 단백질에 대한 항체와 hHp 단백질에 대한 항체를 섞어 고정시켰다.

QCM의 주파수는 이온 세기에 영향을 받을 수 있기 때문에 먼저 0.1 M과 0.3 M NaCl을 포함하는 완충용액 A를 흘리며 주파수를 측정한 결과 도 6에 나타난 것처럼 각각 2.7 Hz와 2.1 Hz의 주파수 감소가 관찰되었다. 다시 NaCl이 없는 완충용액 A로 바꿔주고 hIgG 단백질 2.5 ㎍과 hHp 단백질 2.5 ㎍을 섞어 주입하였다. 그러나, 도 6에서 볼 수 있는 것처럼 NaCl이 없는 완충용액으로 30분 정도 흘려보냈음에도 불구하고 주파수가 변하지 않았다. 이는 두 단백질이 모두 칼럼에 흡착되었기 때문에 센서 칩에서 검출되지 않았음을 의미한다.

다음으로 0.1 M NaCl을 포함하는 완충용액 A를 흘려보냈을 때 21 Hz의 주파수 감소가 확인되었다(도 6). 0.1 M NaCl에서는 hIgG만 용출된다는 것이 이미 확인되었기 때문에 이 주파수 감소는 용출된 hIgG가 센서 칩에 결합한 것 때문에 발생한 것으로 생각할 수 있다. 또한, 21 Hz의 변화 값에서 0.1 M NaCl에 의한 주파수 변화 값 2.7 Hz를 빼면 18.3 Hz가 되는데 이는 실험 1에서 동일한 양의 hIgG를 주 입하였을 때와 거의 비슷하다. 또한, 0.3 M NaCl을 포함하는 완충용액 A를 흘려보냈을 때는 12.6 Hz의 주파수 변화가 관찰되었는데 0.3 M에서는 hHp이 용출되기 때문에 이 주파수 변화 값은 용출된 hHp가 센서 칩에 결합함으로써 발생한 것으로 생각된다(도 6).

이상의 실험들을 통해, 여러 종류의 단백질이 혼합된 시료를 분획으로 나누고, 각 단백질에 대한 항체들을 혼합하여 고정시킨 센서 칩에 차례로 주입하면 한 개의 센서 칩으로 여러 단백질을 검출할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 방법은 여러 종류의 분석물질을 포함하는 시료를 간단하고 경제적으로 검출할 수 있는 것으로서 다양한 바이오센서 시스템에 활용될 수 있다.

도 1은 종래 방법에 따라 서로 다른 수용체를 고정시킨 다수의 센서 칩을 이용하여 여러 종류의 분석물질을 검출하는 방법을 설명하기 위한 설명도이다.

도 2는 종래방법에 따라 단백질 칩에서 첫 번째 항체가 고정된 항체 어레이 센서 칩에 분석물질을 결합시키고 표지가 부착된 두 번째 항체를 다시 결합시켜 분석물질을 검출하는 방법을 설명하기 위한 설명도이다.

도 3a는 본 발명의 제1실시예에 따라 여러 분석물질에 대한 수용체를 섞어 고정시킨 센서 칩에서 여러 분석물질을 포함하는 시료를 분획으로 분리하여 차례로 검출하는 방법을 나타낸 설명도이다.

도 3b는 본 발명의 제2실시예에 따라 혈청에 포함된 단백질들의 농도 패턴을 분석하는 혈청 단백질체 분석(serum proteom analysis) 기법에 적용하도록 멀티 센서 칩을 사용한 방법을 나타낸 설명도이다.

도 4는 한 개의 수정미소저울 (QCM) 센서 칩에 두 종류의 항체, 인간 면역 글로불린 G (hIgG) 단백질에 대한 항체와 인간 헵토글로빈(hHp) 단백질에 대한 항체를 섞어 고정시키고 hIgG와 hHp를 차례로 주입하여 검출한 실험 결과이다.

도 5는 본 발명의 제1실시예에 따라 이온 교환 칼럼이 부착된 바이오센서 시스템을 나타낸 개략 구성도이다.

도 6은 도 5의 시스템에서 이온 교환 칼럼으로 hIgG와 hHp 단백질 혼합물을 서로 다른 분획으로 분리한 후 두 단백질의 항체가 혼합되어 고정된 QCM 센서 칩으로 검출한 실험 결과이다.

Claims (4)

1. 바이오센서에 사용되는 여러 분석물질의 검출 방법에 있어서,

   다수의 분석물질을 함유하는 시료를 다수의 분획으로 분리하는 단계; 및

   상기 다수의 분리된 분획을 각각 서로 다른 다수의 분석물질에 대한 다수의 수용체가 혼합되어 고정된 바이오센서 칩에 순차적으로 주입하여 각각의 분석물질을 순차적으로 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 여러 분석물질의 검출방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 다수의 분석물질을 포함하는 시료를 다수의 분획으로 분리하는 단계는 크로마토그래피, 전기영동 및 등전초점법(isoelectric focusing) 중에서 선택된 적어도 하나의 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 여러 분석물질의 검출방법.
3. 제1항에 있어서, 한 분획에 한 종류의 이상의 분석물질이 포함되어 있을 경우 이들 각 분석물질에 대한 수용체를 서로 다른 바이오센서 칩에 고정시켜 검출하는 것을 특징으로 하는 여러 분석물질의 검출방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오센서 칩은 QCM(quartz crystal microbalance) 바이오센서 칩, SPR(surface plasmon resonance) 바이오센서 칩, GMR(giant magnetoresistance) 바이오센서 칩, FET(field-effect transistor) 바이오센서 칩 중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 여러 분석물질의 검출방법.

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