CN104169720A - 电子鼻或电子舌传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于分析样本或者检测目标的电子舌或电子鼻的传感器。该传感器包括支撑体，在所述支撑体的一个表面上为多个敏感区域，每个敏感区域包括至少一个受体并且能够发射由样本的至少一个成分或者至少一个目标与至少一个受体交互作用所产生的可测量信号。所述传感器的特征在于，所述电子舌或电子鼻传感器包括至少三个敏感区域，所述至少三个敏感区域在它们各自的受体组成上彼此不同，至少一个所述敏感区域包括由至少两个不同受体构成的混合物，其他两个敏感区域中的每个敏感区域包括这两个受体中的至少一个受体。

Description

电子鼻或电子舌传感器
技术领域
本发明涉及用于生产电子鼻或电子舌的传感器，并且涉及其在分析流体样本，尤其在分析液体或气体样本中的使用。
背景技术
生物传感器可被分为两种不同的种类。
第一类涉及凭借一个或更多特定交互作用的分析。例如，可以提及的有使用DNA芯片或蛋白质芯片类型的酶或多参数系统(若干敏感区域)的葡萄糖生物传感器，它经由特定的和选择性的结合(DNA/DNA或抗原/蛋白质等)来识别配体。这些生物芯片被广泛使用并且经由由单个受体组成的敏感区域产生相关信息。
第二类生物传感器包括“非特定的”系统。在这种情况下，因为待分析介质的化合物与受体之间的交互作用是未知的，所以由带有单个受体的单个敏感区域产生的信息是不可译的。另外，由于这类传感器的低特异性，还可以观察到多种受体之间的交叉反应。因此使用每个受体产生一条信息的一组受体：于是，所有这样的信息产生相当于数字指纹的模式。出于分析的需求，将这些模式与从之前的研究中得到的模式相比较。出于使用过程本质上的相似性，使得这些传感器被称为关于气体介质研究的“电子鼻”或者用于液体介质研究的“电子舌”。
因此，这些电子鼻或电子舌由一组独立的敏感区域组成，每个敏感区域带有由能够与被研究的介质交互的受体组成的涂层。因此，通常通过测量由交互作用产生的信号的强度，每个敏感区域必须与用于量化交互作用的系统相关联。在现存的所有情况中，每个敏感区域产生一条独立于其邻居的信息的信息。因此，n个敏感区域的矩阵会产生构造交互模式的n条独立信息，通常用柱状图表示，敏感区域的数字与在该区域上测量的信号强度值相关联。
一般而言，敏感区域被制造为使得它们相对被分析的介质具有可变的亲和性，或者更一般而言，具有可变的物化(physicochemical)特性(Turner&Magan(2004)Nature Reviews Microbiology2:161-166)。近来，已经出现组合方法并且肽受体已经被移植到敏感区域上。这种方法使得能够容易产生大量不同受体(Edwards et al.(2007)J.Am.Chem.Soc.129:13575-13583)。每个敏感区域包含有一种且仅仅一种类型的肽，并且所产生的多条信息保持独立。另外，这种表征以点云(point cloud)的形式示出。
在这类分析中，每条信息因此具有相同的值并且不容易进行权衡(weighting)。因此这些传感器不提供连续响应。当这种情况发生时，可以发现在这些电子舌或电子鼻领域中，对象的产生仍然是复杂的，并且在一个敏感区域上的缺陷仍然是非常频繁的。因此，这种传感器的响应将失真，并且如果不能权衡(敏感区域彼此是独立的)，则产生的模式将很难译出。
另外，Di Natale et al.(2009)Sensors&Actuators B142:412-7中已经描述了凭借光学读数产生连续信号的电子鼻类型的传感器。这些传感器包括覆盖有渗透性聚合物的一层敏感染料。然后，使用摄像机记录下在聚合物中待分析的气体化合物扩散之后染料的反应。在这种情况中，通过扩散层的特性而不是受体本身，提供了连续的响应。这个过程仍然受到对染料响应于气体化合物的反应能力的限制。因此，这个过程不适于对不通过聚合物扩散的复杂分子的分析。另外，因为敏感染料层被限制在扩散层也就是聚合物的下方，由于传感器的工作需要聚合物屏障，所以在传感器的受体与样本之间不能发生直接的交互作用。
因此仍然需要提供一种用于更一般的应用，特别是能够产生连续响应的电子鼻或电子舌类型的传感器。
发明内容
特别地，本发明由发明者由意想不到的示例得到，一种电子鼻或电子舌传感器，包括在若干部分上的支撑体，或敏感区域，其上附有不同比例的两种不同受体的混合物，其显示信号发射曲线，所述信号由多种敏感区域与传感器的受体接触的样本的成分交互作用所产生，所述信号为非线性的并且足够复杂以表征给定化合物。
信号的非线性表明得到的信息量多于从由纯受体组成的敏感区域得到的信息量。
其中，敏感区域在数量上的增加使得可以得到基本上连续的信号发射曲线，这有利地使检测和消除任何有缺陷的敏感区域成为可能。
最后，少量不同受体混合物的使用使得可以产生大量不同的敏感区域，这限制了与开发不同受体相关的花费，在经济上是有利的。
因此，本发明涉及一种用于分析样本或者检测至少一个目标的电子舌或电子鼻传感器，包括支撑体，在所述支撑体的一个表面上为多个敏感区域，每个所述敏感区域包括至少一个受体，每个所述敏感区域能够发射由样本的至少一个成分或者至少一个目标与所述至少一个受体交互作用所产生的可测量信号，其特征在于，所述电子舌或电子鼻传感器包括至少三个敏感区域，所述至少三个敏感区域在它们各自的受体构成上彼此不同，至少一个所述敏感区域包括由至少两个不同的或者不等效的受体组成的混合物，其他两个敏感区域中的每个敏感区域包括这两个受体中的至少一个受体。
对本领域的技术人员显而易见的是，特别在分析液体介质样本的情况下，根据本发明的传感器特别用于实现电子舌，或者特别在分析气体介质样本的情况下，根据本发明的传感器特别用于实现电子鼻。
因此，本发明还涉及一种如上限定的传感器的用途，即用于分析样本。
本发明还涉及一种用于分析样本的过程，其中：
-使如上限定的传感器接触样本；
-测量由传感器的敏感区域发射的信号；
-在接触至少一个其他样本之后，将在先前步骤中测量的信号与由相同传感器或者第二相似传感器的敏感区域独立产生的信号进行比较；
-描述被分析的样本。
本发明还涉及一种如上限定的传感器的用途，用于限定受体混合物的受体构成，所述受体混合物用于涂覆待与至少一个目标交互作用或不交互作用的三维结构。
本发明还涉及一种用于制备涂覆有受体混合物的三维结构的过程，所述三维结构待与至少一个目标交互作用或不交互作用，所述过程包括：
-使目标与如上限定的传感器接触；
-识别所述传感器的一敏感区域，该敏感区域发射的信号的强度表示对所述目标的亲和力在强弱上与涂覆有受体混合物的所述三维结构对所述目标的期望亲和力相似；
-可选地，如必要为其他目标重复这两个步骤；
-用具有与所识别的敏感区域的受体构成相似的受体构成的受体混合物涂覆所述三维结构。
受体
如在本文中所理解的，“受体”是化合物，它可以是任何化学类型，通过自身或者当它与混合物内一个或更多其他受体组装以便形成受体组装时，能够与样本的一个或更多成分或与目标交互。如在本文中所理解的，受体还可以表示为“用于识别或者与样本的一个或更多成分或与目标结合的元素或决定簇(determinant)”。
优选地，根据至少一个物化特征(诸如，一方面的亲水性或疏水性，另一方面的电子浓度、极性或电荷)，根据本发明的受体彼此不同。另外，其他构造或配置特征可以区分这些受体：因此，根据诸如螺旋线、板料(sheet)或彼此的立体异构关系等次级结构的存在，受体可以彼此不同。
因此，从结构的观点来看，根据本发明的受体可以是：
-简单分子，特别是1000Da或者更小，诸如离子、金属复合物、有机化合物，特别是有机金属化合物、氨基酸、缩氨酸、单糖、低聚糖、核苷酸或寡核苷酸；或者
-复杂分子，特别是大于1000Da，诸如多肽或蛋白质，可选地是糖基化的、多糖、脂类、DAN、RNA或有机聚合物。
-根据本发明的受体还能构成分子“砖”、在混合物内的受体组装，特别是组合类型，导致与样本的一个或多个成分或者与目标交互作用的分子构造。Ojeda et al.(2007)Carbohydrate Research342:448-459；Di Gianvincenzoet al.(2010)Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters20:2718-2721；Bresee etal.(2010)Chem.Commun.46:7516-7518；Bresee et al.(2011)Small7:2027-2031；或Wolfenden&Cloninger,(2006)Bioconjugate Chem.17:958-966中特别描述了这类受体组装。
优选地，根据本发明的受体具有小于1000 000Da的尺寸。
如在本文中所理解的，根据本发明的受体可以彼此独立或通过分子键，特别是共价键彼此连接。当受体彼此连接时，它们的关联能形成表现出与样本的成分的多种交互作用位点(site)的高分子，这些作用位点与根据本发明的受体一一对应。
敏感区域
根据本发明的“敏感区域”是支撑体的一部分，其能够发射由样本的一个或更多成分与敏感区域所包含的受体交互作用所产生的信号。
这样的敏感区域占据可能是可变拓扑或可变形状的支撑体上的面积或体积。因此，它可以是平面的或浮雕的，也就是说，受体直接连接到支撑体或通过占据位于表面上方的体积由此分布在三维结构中。另外，根据本发明的敏感区域可以采取任意形状，特别是圆形或多边形，特别是平行六面体。根据本发明的敏感区域还可以与至少一个其他敏感区域分离或连接到至少一个其他敏感区域。优选地，传感器的所有敏感区域具有相同的面积、相同的拓扑和相同的形状。特别优选地，根据本发明的敏感区域具有平面拓扑和圆形形状。同样优选地，根据本发明的敏感区域的面积大约是0.25μm2到10mm2。另外，敏感区域的厚度将优选地在0.5nm和100μm之间。
使样本与根据本发明的传感器接触导致发射若干可测量信号，每个敏感区域至少一个信号，因此形成表明样本特征的信号曲线。本领域技术人员将清楚地理解，增加敏感区域的数量可以因此增加可测量信号曲线的分辨率。
因此，优选地，根据本发明，根据本发明的传感器包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、500、1000、10 000、100 000或1000 000个敏感区域。同样优选地，根据本发明，根据本发明的传感器可以包括少于10 000 000、1 000 000、100 000、10 000、5000、1000、500、100、50 25个敏感区域。
受体的表面密度使得可以调节可测量信号的强度。
由包括在与同一敏感区域在支撑体上占据的面积相关的敏感区域中受体的数量来给定敏感区域内受体的表面密度。当在敏感区域中存在若干不等效的受体时，可以限定每个不等效受体的各自表面密度，以及受体集合的表面密度。在整个敏感区域中受体的表面密度可以是统一的或者可以是可变的。当它是可变的时，可以根据表面密度梯度，例如作为由支撑体的表面限定的平面中方向的函数，来分布受体。优选地，敏感区域内受体集合的表面密度在108受体/mm2到1015受体/mm2之间。优选地，传感器的所有敏感区域具有的它们所包含受体集合的表面密度是统一的和基本相似的。
另外，通过成倍增加样本的成分与敏感区域之间的交互作用，增加不等效的敏感区域的数量可以增加传感器的灵敏度；同样也可以增加信号曲线的多样性，并且因此可以表征待分析的样本内更多的不同成分。另外，增加非相同的敏感区域的数量，可以增加由传感器的敏感区域发射的信号的曲线的连续性，这使得可以找到和消除产生不相关的信息的有缺陷的敏感区域。
优选地，根据本发明的传感器包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50或100个不同或者不等效的受体，也可以被描述为不同类型的受体或不同性质的受体。同样优选地，根据发明的传感器包括最多1000、100、50、25或10个不同或不等效的受体。根据本发明的相同的敏感区域可以包括单个受体或者2到20之间的不同或不等效的受体。
本领域技术人员将清楚地理解，优选地，每个受体或者每类受体在根据本发明的敏感区域中存在若干副本。因此，举例而言，当提及敏感区域包括两种不同受体时，它优选地包括每个不同受体的若干副本，特别是具有之前限定的表面密度。同样地，当表明敏感区域包括仅仅一种类型的受体时，意味着它可包含单个受体或某类受体的若干副本。
优选地，在根据本发明的传感器中，至少一个敏感区域包括至少3、4、5、6、7、8、9或10个不同或不等效的受体。
另外，在根据本发明的一个优选实施例中，传感器的多个敏感区域，特别是至少3、5、10或100个敏感区域，每个敏感区域包括至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同或不等效受体的混合物，在每个混合物中不同或不等效受体是相同的一些受体，并且在它们包含的不同或不等效受体的各自比例上彼此不同。换句话说，传感器包括多个敏感区域，特别是至少3、5、10或100个，每个敏感区域具有不同比例的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个不等效受体，存在于多个敏感区域的每个敏感区域中。
因此，在本发明的一个优选实施例中，根据本发明的传感器包括n个不等效受体(n是大于1的整数)并且敏感区域包括可变比例的这些n个不等效受体的混合物。
在n＝2的特定情况中，可以例如6个不同的敏感区域，它们包含的受体集合的表面密度是一致的并且彼此相等，考虑具有下面比例的两种受体A和B：A0％B100％；A20％B80％；A40％B60％；A60％B40％；A80％B20％；A100％B0％，这里的百分数表示敏感区域中所考虑的受体的数量相对于敏感区域中受体的总数量的比例。受体A的比例的20％的系列增长称为增量。在这种情况下，增量是常数，但还可以预想不是常数的增量，例如A的0％、10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、100％，与B相加为100％。
更一般地，根据本发明可以预想，在k个敏感区域内，在两个受体的混合物中第一个受体的百分比比例以增量100/(k-1)变化，每个敏感区域受体集合的表面密度优选为相同的。
因此，在本发明的优选实施例中，依据根据本发明的传感器包括n个不等效的受体(n是大于1的整数)，并且敏感区域包括以可变比例的这些n个不等效受体的混合物，提供优选的数量(k)个敏感区域作为增量i(以百分比表示)的函数：当100/i是整数且n<(100/i)+1时，k＝((100/i)+n-1)！/(n-1)！(100/i)！)，并且当n>(100/i)+1时，k＝n^(100/i)/(100/i)！。
增量值的下降增加了信号曲线的连续性和分辨率。另外，这可以得到彼此非常接近或甚至部分冗余的信号，并且结果是校正或甚至权衡可能的有缺陷的敏感区域。优选地，增量将是50％、33％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％。
特别地，通过比较由期望评估功能性的敏感区域发射的信号与由具有相似构成的敏感区域发射的信号，可以检测有缺陷的敏感区域。因此，在根据本发明的过程的一个特别实施例中，这些过程还包括以下步骤：通过比较由敏感区域发射的信号与由至少两个其他敏感区域(特别是具有与期望验证功能性的敏感区域相似的构成的敏感区域)发射的信号，验证传感器的敏感区域的功能性，即它们的非缺陷性。举例而言，为了发明的目的，与被期望来评估功能性的敏感区域具有相似构成的敏感区域，将是那些其中在每个敏感区域中存在的各种受体的量各自相对于敏感区域的受体总数量的百分比优选地相差少于50％、33％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的敏感区域。优选地，如果由此敏感区域发射的信号R1与由具有相似构成的两个敏感区域发射的信号R2和R3大致上不同，那么敏感区域1将被认为是有缺陷的。例如，如果(|R1-R2|,|R1-R3|)的最小绝对值之差是大于信号R2与R3之间的差|R2-R3|的至少50、20、10、5、4、3或者2倍，那么该区域将被认为是有缺陷的。在另一个示例中，可以使用相对差；在这种情况下，如果(2|R1-R2|/(R1+R2),2|R1-R3|/(R1+R3))的最小值大于相对差2|R2-R3|/(R2+R3)的至少50、20、10、5、4、3或者2倍，那么敏感区域1将被认为是有缺陷的。本领域的技术人员容易想出有缺陷的敏感区域的其他定义。
从包含不等效受体混合物的敏感区域得到的信号，可以比从每个仅包含相同受体的敏感区域得到的信号，得到关于样本成分的更多的非冗余信息。有利地是，有限量的不同受体能够实现使用根据本发明的传感器得到的信号的非线性，这是一种节省金钱的来源。
在另一个优选实施例中，根据本发明的传感器包括：包括有单个类型受体的敏感区域，其数量与所述传感器中不同受体的数量至少一样多，所述传感器的所述不同受体中的每个受体被各自包括在所述包括有单个类型受体的敏感区域当中的每个敏感区域中。
受体通过任意合适的技术附接在根据本发明的支撑体上。例如，可以预想简单的吸附、静电交互作用或共价嫁接。举例而言，当固体支撑体是玻璃时，将优选使用硅烷类型的受体或受体前体，使得可以实施嫁接到玻璃的表面上；当固体支撑体由金制成或者包含由金制成的部分时，将优选使用包含容易键合到金属的巯基功能(thiol function)的受体前体或受体。还可以将受体固定放置在支撑体的表面上的聚合物基体中。
优选地，使用受体前体(其结构与受体没有本质不同，其功能是为制造的需求允许特别保护交互作用)或受体本身(如果它们的性质允许的话)实施将受体附接到支撑体上。
信号
为了发明的目的，术语“信号”被用来指代物理现象。当可以确定信号存在或不存在和/或量化该信号时，可以说该信号是可测量的。
使样本接触传感器的至少一个敏感区域之后，随之产生根据本发明的信号；它的起源是敏感区域内存在的至少一个受体与样本的至少一个成分之间的交互作用。交互作用通常对应于至少一个受体与样本的至少一个成分之间结合的形成，此结合可以是强的或弱的，并且可以是可逆的。根据本发明，将每个敏感区域作为整体来测量所发射的信号。但是，若需要，在本发明的一个优选实施例中，测量由所有敏感区域发射的信号。
信号在结束点处是可测量的或者是实时可测量的。
优选地，根据本发明的信号是实时可测量的。表述“实时”是指基本上在受体与样本的成分之间发生交互作用的时刻产生和测量信号。有利地，提供的信号的实时测量是附加参数，它还通过将时间和非线性的维度添加到信号中来增加由根据本发明的传感器提供的信息。
同样优选地，可测量的信号是大规模的、机械的、声学的、电的或光学类型。取决于根据本发明的信号的性质，尤其可以通过光学显微镜、通过荧光显微法、通过共聚焦显微镜、通过表面等离子体共振，经由谐振镜，通过阻抗测量、经由石英微量天平、经由悬臂、或者通过光吸收来测量。
优选地，传感器可以直接检测信号。因此，例如，当由表面等离子体共振测量信号时，合适的检测手段对应用于表面等离子体共振的光学读取的系统。这些系统是已知的；它们通常与例如LED类型的光源组合，以便引起等离子激发，并且与CCD摄像机组合来记录由等离子体共振产生的信号。在这个方面，特别优选的是，以成像模式监测根据本发明的信号。正如本领域技术人员清楚地意识到的，成像模式包括监测构成所使用的CCD摄像机的图像的所有像素的信号的变化，其中多点模式本身包括限定、或预限定图像的区域(即像素点的集合)，该区域中所得到的信号的平均值反映所选择的图像区域的平均信号。
支撑体
根据本发明的支撑体包括适合用于测量信号的材料。
优选地，在根据本发明的传感器中，受体被附接在支撑体上，该支撑体转换由介质的成分与敏感区域交互作用所产生的信号，即，其经由代表所产生的信号的另一性质的信号中继所产生的信号。
当传感器用于通过表面等离子体共振分析样本时，固体支撑体适合于等离子激发并在它的表面处适合衰减波的传播。有利地，支撑体将是透明的材料，例如玻璃，覆盖有金属层特别是金，特别是10nm到100nm厚，并且更特别地50nm厚。
特别地，根据本发明的支撑体可以包括玻璃、硅、有机聚合物材料，特别是丙烯酸酯、PDMS、COC、PEEK或硝化纤维素类型；或金属材料，特别是银、金或铂；碳基导电材料，特别是玻璃态碳、石墨、石墨烯、碳基纳米结构或金刚石类型；或至少两种这些材料的组合。
样本
根据本发明的样本可以是任意类型。优选地是流体并且更优选地是液体介质或气体介质的样本。
它可以特别是：
-生物样本，例如血液、血浆、血清、脑脊液、尿、粪便、滑液、精液、阴道分泌物、口腔分泌物、呼吸道标本，尤其源自肺、鼻子或喉咙的脓液、腹水、皮肤或者结膜浆液的样本；
-食物样本，可选为悬浮放置地，特别地源自生的、熟的或半熟的食物，源自食品添加剂、调味料、即食餐或源自饮料；
-水样本，例如，来自水处理厂或配水厂；
-土壤样本；
-气体或空气样本，例如环境空气或来自空调系统的空气或呼出的空气的样本。
样本可以经过预处理。处理可以是物理的、化学的或生物的；特别地可以是提取、过滤、稀释或浓缩；它还可以是溶解、研磨、蒸发或悬浮，特别是在最初固体样本的情况下。处理还可以对应于增加至少一个信号标记到标本中，也就是发射附加信号的化合物或通过敏感区域能够启动、促进或增强信号的生成的化合物。信号标记可以结合到样本的成分中；信号标记例如可以是荧光的、发光的或辐射的分子。
处理可以对应于添加内部控制的样本，即浓度和/或构造是已知的化合物。
根据如上限定的用途和过程，优选地测量或记录由敏感区域发射且与样本接触的信号，特别是测量或记录为根据本发明的样本与传感器之间接触时间的函数。
目标
根据本发明的目标可以是任意类型。优选地可以是细菌、真核细胞、病毒、蛋白质、脂质、糖类、核酸、挥发或非挥发的有机化合物或无机化合物，诸如金属。从功能的角度来看，目标可以特别地是药剂、激素、细胞素或其他细胞受体。
基于由敏感区域发射的信号评估敏感区域对于目标的亲和性(affinity)(这里认为和亲合性(avidity)同义)。例如，当信号的强度取决于敏感区域对于目标的亲和性时，强的信号将表示强的亲和性，而弱的信号将表示弱的亲和性，它们构成了所研究的两种主要的亲和性。
当然，搜索对于至少一个第一目标具有强亲和性同时又不与至少一个第二个目标结合的三维结构将是可能的。
分析
根据本发明的分析尤其可以旨在检测和/或量化样本的一个或更多成分。另外，根据本发明的分析还可以旨在根据两个或更多预定义的类别(例如将生物源的样本归类为健康的或恶性的)，或者根据病理状态的类型(诸如它所表示的癌症)，或者食品源的样本是相容型还是非相容型的来描述、分类或归类样本。在这个背景下，通过使用控制样本(其包括例如在纯状态中的成分或者表示待定义的类别)比较可以进行。
因此，在根据本发明的过程的一个优选实施例中：
-使如上限定的传感器与样本接触；
-测量由传感器的敏感区域发射的信号；
-在接触至少一个样本之后，将在先前步骤中测量的信号与由相同传感器或者第二相似传感器的敏感区域独立产生的信号进行比较。
-相对于至少一个控制样本，描述被分析的样本。
另外，根据本发明的分析还可以旨在根据两个或更多预定义的类别来描述、分类或归类样本。因此，在根据本发明的过程的另一个优选实施例中：
-使如上限定的传感器或如上限定的多个相似传感器与样本接触；
-为每个样本测量由传感器的敏感区域发射的信号；
-将为每个样本测量的信号进行相互比较；
-相对于所有被分析的样本，将每个样本归类。
比较的步骤和如上限定的描述可能需要监控学习或无监控的学习的步骤。此学习可以由电子舌或电子鼻领域内的技术人员容易地实施，他们能像Jain et al.(2000)IEEE Transactions on Pattern Analysis and MachineIntelligence22.4-37中特别描述地，特别地作为基本常规技术使用。举例而言，可以提及的有主成分分析(PCA)、人工神经网络(Turner&Magan,op.cit.)或由支持向量机(SVM)的分离，特别地由Cortes&Vapnik(1995)Machine Learning20:273-297)描述的，并且如Brown et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:262-267描述的，其最近被成功地应用于DNA芯片。
三维结构
如本文在所理解地，根据本发明的“三维结构”特别地是颗粒，更特别的是纳米颗粒，即具有至少一个纳米量级尺寸，特别地从1nm到999nm的颗粒，或者微粒，即具有微观量级尺寸，特别地从1μm到999μm的颗粒。根据本发明的三维结构可以特别地是碳纳米管、石墨烯、树形分子、水疱、胶束、脂质体、聚合物、纳米晶体、纳米丝、磁性颗粒或其他多孔颗粒。这样的三维结构对本领域技术人员是公知的，它尤其作为药剂使用，例如，用于与病理目标结合。
根据本发明的三维结构涂覆有受体，以便能与至少一个目标交互作用。优选地，根据本发明的三维结构涂覆有受体的混合物、受体的组装，特别是组合类型，导致与目标交互作用的分子构造，诸如Ojeda et al.(2007)Carbohydrate Research342:448-459；Di Gianvincenzo et al.(2010)Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters20:2718-2721；Bresee et al.(2010)Chem.Commun.46:7516-7518；Bresee et al.(2011)Small7:2027-2031；或Wolfenden&Cloninger,(2006)Bioconjugate Chem.17:958-966中描述的那些。
通过下面非限制性的附图和示例进一步说明本发明。
附图说明
图1
图1描述根据本发明的传感器的获得和使用。简单而言，在由覆盖有金子的棱柱构成的支撑部分上制作不同比例(0％、10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％和100％的BB1)的乳糖(BB1)和硫酸化乳糖(BB2)的9个混合物的沉积物，从而形成敏感区域。如此形成的传感器被放置在细胞中，使得可以循环待以与传感器接触的多种溶液。使用发光二极管和CCD摄像机测量由表面等离子体共振成像(SPRi)得到的传感图(sensograms)形式的传感器的反射率。
图2
图2表示，由表面等离子体共振成像测量的本发明的传感器的反射率的演变(y轴，单位％)作为存在传感器时的刺桐鸡冠凝集素(ECL)浓度(x轴，单位nM)的函数。
图3
图3表示使用本发明的传感器分别对ECL(200nM)、CXCL12-α(100nM)、CXCL12-γ(100nM)和IFN-γ(25nM)得到的多种连续演变曲线。这些曲线表示反射率(x轴，单位％)作为在图1描述的支撑部分中所包含的BB1的比例的函数。
图4
图4表示ECL+CXCL12-α混合物的连续演变曲线和分别单独对应于ECL和CXCL12-α的曲线。
图5
图5表示连续演变曲线的3D模型，作为与传感器的接触时间的函数，分别由仅仅ECL(左上)、仅仅CXCL12-α(右上)和ECL+CXCL12-α混合物得到。
图6
图6表示为食物混合物：即豆奶(图6A)、牛奶(图6B)和米奶(图6C)得到的连续演变曲线。
图7
图7表示根据本发明为传感器的敏感区域由表面等离子体共振成像测量的反射率(y轴，单位％)，每一个表示在存在干扰素γD136(IFNgD136)时不同比例(0％、10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％和100％的BB1)(x-轴)的乳糖(BB1)和硫酸化乳糖(BB2)的混合物。
图8
图8表示覆盖有10％BB1/90％BB2的混合物的纳米颗粒(左边)和覆盖有90％BB1/10％BB2的混合物的纳米颗粒(右边)。
图9
图9表示当存在用两类涂层：10％BB1或90％BB1功能化的金纳米颗粒时，与IFNgD136的交互作用的10％BB1图形的SPRi测量结果。此效果取决于纳米颗粒浓度。
图10
图10表示通过ELISA干扰素抗体上的分析对IFNgD136的试验。用两种类型的涂层：10％BB1或90％BB1功能化的金纳米颗粒预培养IFNgD136。然后通过ELISA试验评估浮在上层的IFNgD136浓度。
具体实施方式
示例1：敏感区域包含2种受体的混合物的传感器
1、传感器的制造
使用两种简单的分子作为砌砖(BB)来构造包含支撑体的传感器，该支撑体容纳有组合了可变比例的受体：乳糖(BB1)和硫酸化乳糖(BB2)的若干敏感区域。具有[BB1]/([BB1]+[BB2])比例为0％、10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％和100％的九个混合物，总浓度为常数20μM。然后混合物沉积在由可用于表面等离子体共振(SPRi)的棱柱的金表面形成的支撑体上，并且整夜与棱柱的表面保持接触。然后用乙醇清洗如此形成的芯片并且然后在N2气流下干燥。
因此，在自组装之后，能够得到包含9个敏感区域的传感器，每个敏感区域具有不同的BB1和BB2的比例，如图1所示。然后通过SPRi使用此传感器分析包含单个蛋白质的介质。
2、对包含单个蛋白质的控制介质的分析
在连接到脱气装置和蠕动泵(peristaltic pump)的10μl聚四氟乙烯细胞中实施对蛋白质介质的分析。注入500μl的蛋白质介质。使用的工作缓冲溶液包括10mM HEPES、150mM NaCl、0.005％Tween20、2mM MgCl2、pH7.4，并且在使用之前过滤和脱气。所有实验在具有100μl/min的流速的室温下实施。在注入每个蛋白质之前，为了避免非特异性的交互作用，使用牛血清白蛋白来阻挡裸露的金表面。
测试结合到糖类的四种蛋白质：刺桐鸡冠凝集素(ECL)、CXCL12趋化因子的α和γ同分异构体(isoform)、促炎细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)。根据把它们结合到糖类的能力将这些蛋白质分为两组：ECL是结合到半乳糖的凝集素，然而两种形式的CXCL12还有IFN-γ结合到硫酸乙酰肝素。
在实践中，首先使用ECL测试若干浓度(200nM、400nM、800nM和1.6μM)的传感器。建立校准曲线(如图2)。这个曲线具有朗缪尔类型吸附曲线，其证实该系统被正确地操作为具有KD＝300+/-150nM的传感器。
在初步测试期间，为了选择所发射信号可比较的浓度，对其他蛋白质(100和200nM的CXCL12同分异构体，和25和50nM的IFN-γ)使用两种不同的浓度。最终，所选择的浓度如下：200nM ECL、100nM CXCL12-α、100nM CXCL12-γ和25nM IFN-γ。还应该注意到，在每个蛋白质分析之后，使用合适的溶液使传感器再生。为此，为了识别适合于每个蛋白质的溶液，测试各种溶液。因此，保留0.02M NaOH用于ECL、1M NaCl用于CXCL12-α，以及1％SDS用于CXCL12-γ和IFN-γ的溶液，因为它们允许传感器完全再生而不引起损害。
所选择的浓度下的纯蛋白质被相继注入到传感器上，然后以各种灰度的光线照亮传感器的支撑体上混合物的沉积物。这些图像被记录下来并且然后被转化为一系列的传感图。
出人意料地，发明者观察到对于给定的蛋白质，反射率取决于敏感区域的BB构成，如图3可见。特别地观察到各种BB混合物的响应不是纯受体响应的简单线性相加。因为每个敏感区域的响应带有额外条信息，因此，这种非线性特性后验性地证明具有可变比例的每个受体的各种敏感区域的使用是合理的。另外，可以观察到，对于给定的敏感区域，响应的强度取决于被注入的蛋白质，它表示传感器对每个蛋白质响应不同。
为了说明每个蛋白质的单独特性，结束注射蛋白质一分钟之前测量到的反射率值被表示为混合物中BB1比例的函数(图3)。有意思地是，对每个蛋白质，可以以连续演变曲线形式插补不同的曲线。发明者能够证明，对于给定的蛋白质，曲线基本被保持为与蛋白质的浓度无关，信号的强度部分作为浓度的函数当然是可变的。
因此，这样的传感器不仅能用来区分和识别蛋白质，还可用作量化的目的。另外，相比较于用传统的电子鼻或电子舌传感器得到的数据的集合，这些传感器对蛋白质的响应的连续特性提供了显著的和重要的优点。这是因为，由于对于每个连续演变曲线，一个受体的信号与其他信号相关联，非正常的信号能被排除，因此能够实施更精确和更准确的分析物识别。
详细而言，具有70％的BB1处最大信号的ECL曲线与具有10％的BB1处最大信号在的ECL曲线完全不同，正如预期地，表明ECL对富有乳糖的支撑体的敏感区域具有更大的亲和性。相反地，结合到硫酸乙酰肝素的蛋白质对富有硫酸化乳糖BB2的敏感区域具有更大的亲和性。因此，能容易地将ECL和其他区别开来。更有利地是，CXCL12的α同分异构体给出与从CXCL12-γ或IFN-γ得到的相对不同的连续演变曲线。当然，对于CXCL12-α，当BB1的比例是50％或更大时，反射率几乎为零，然而，对于CXCL12-γ或IFN-γ，反射率高很多。图3所示的连续演变曲线的更完全的分析揭示了在相同的浓度处，CXCL12-γ比CXCL12-α对敏感区域具有更高的亲和性。因此，然而用100nM的CXCL12-α，没有传感器的敏感区域显示大于1.35％的反射率，用CXCL12-γ实现2.30％的信号。
尽管容易理解使用传感器能够将ECL和其他蛋白质区别开来，但应该注意CXCL12的在它们的区域1-68中是相同的两个同分异构体，比CXCL12-γ更好地区别于IFN-γ。
但是，具有包含有不同比例的2种受体的9个敏感区域的此第一代传感器，尽管在信号强度上有差别，也无法区分CXCL12-γ和IFN-γ。因此，发明者预测，为了在敏感区域水平产生更大多样性而由额外的受体制备的传感器应该能够区分结合有相似但不相同电荷拓扑的蛋白质的硫酸乙酰肝素。
3、复杂介质的分析的应用
电子鼻和电子舌技术主要应用于复杂介质的测试和分析。为了测试上述传感器在介质分析中的有效性，发明者使用两种蛋白质(ECL(200nM)和CXCL12-α(100nM)(混合物1))的混合物还有诸如豆奶、牛奶或米奶等食物混合物来对其进行测试。
图4示出得到的连续演变曲线，伴随用于比较的两种纯蛋白质得到的曲线。这个最初结果显示传感器对混合物敏感并且能够区分混合物和纯蛋白质。事实上，还观察到两种蛋白质的混合物的曲线接近于纯蛋白质的曲线的简单相加。这表明在传感器的敏感区域上吸收的蛋白质之间大致上没有协同的交互作用。这个特性的主要优点是通过简单的线性分解，基于混合物的单独组分的各自曲线，能够检测和量化混合物。
另外，这对于利用由SPRi得到的实时吸附和解吸附动力学将是有利的。此附加信息能够增加除了连续演变曲线以外的另一种方式来区分各种蛋白质。举例而言，图5用三维方式示出识别ECL+CXCL12-α混合物的曲线的暂态演变。
另外，为了更好地比较电子舌相对于三类食物样本(豆奶、牛奶和米奶)的响应，为每个样本制作曲线。此曲线将清洗6分钟之后的反射率表示为敏感区域的乳糖/硫酸化乳糖(L/SL)比例的函数(图6)。能够非常容易地确证，对于豆奶(图6A)而言，其对富有硫酸化乳糖(包括纯硫酸化乳糖、90％SL、80％SL、70％SL、60％SL和50％SL)的几个敏感区域具有强的亲和性。另一方面，对于UHT牛奶(图6B)而言，仅对具有纯硫酸化乳糖和90％SL的2个敏感区域具有强的亲和性。这表明电子舌能够区别这两个产品。对于米奶(图6C)而言，因为由纯乳糖组成的敏感区域得到最强的亲和性，所以曲线完全不同。这些结果表明电子舌对于分析和区别复杂样本是有效的。另外，为每个样本得到的曲线能被认为是它们身份的签名。
示例2：用于选择合适的组合表面的方法
使用装饰的纳米颗粒(NP)作为治疗药剂是被广泛研究的课题。几个作者已经因而描述了具有一定有效性的系统。在所使用的涂层当中，可以提及的有：(i)特定的配体，诸如例如会与它们的目标以分子对分子直接交互作用的抗体，或者(ii)最近开发的，由小分子组成的涂层(Bowman et al.(2008)J.Am.Chem.Soc.130:6896-6897；Baram-Pinto et al.(2009)Bioconjugate Chem.20:1497-1502；Baram-Pinto et al.(2010)Small6:1044-1050；Rele et al.(2005)J.Am.Chem.Soc.127:10132-10133)或由自身不具有限定的生物学特性的小分子的组装组成的涂层(Ojeda et al.(2007)Carbohydrate Research342:448-459；Di Gianvincenzo et al.(2010)Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters20:2718-2721；Bresee et al.(2010)Chem.Commun.46:7516-7518；Bresee et al.(2011)Small7:2027-2031；或者Wolfenden&Cloninger,(2006)BioconjugateChem.17:958-966)，但当其沉积在纳米颗粒的表面上时产生特定的特性。
后者的这些组装通常被组合地生产：混合基本砌砖的限定集合被并且然后组装有纳米颗粒。因为通过筛选每类NP的活性才最终识别出合适的结构，所以这些混合物的选择不一定是合理的。
因此这意味着为了基于不一定具有生物活性的化合物的库找到活性涂层，有必要制造大量NP，其具有由组合混合物导致的涂层。可选地，筛选这些NP的生物活性将使得能够检测哪个是活性混合物。其结果是，在所制备的不同NP的数量和活性NP的数量之间具有很低的比例。
为了更成功地定位(target)这些混合物，因而减少所制造的非活性NP的数量，能够快速评估形成受体的基本砌砖的混合物的活性，以利于快速高生产量分析将是有利的。
本文中，发明者已经出人意料地示出由2维(2D)支撑体上的受体的混合物组成的表面的活性和涂覆有相同混合物的纳米颗粒的活性相似。
因此，发明者提出借助于带有一定数量的敏感区域(例如以点的形式，每个表示两种特定比例的最初化合物的混合物)的2D传感器上的测试，来评估纳米颗粒，或者更一般地评估三维结构的活性，在其表面上带有形成受体的化合物的混合物。然后，可以例如为蛋白质或微生物的目标，与这些传感器接触并且通过例如SPRi测量交互作用。在目标与各个敏感区域之间测量到的交互作用的强度表示混合物的构成有利于诸如NP等三维结构的涂层的生产。同样地，如果优选避免交互作用，则优选地选择与表现出与限定目标很少或无交互作用的敏感区域的构成类似的混合物构成。
因此发明者提出，与三维结构(特别地诸如NP、树状聚合物或脂质体等纳米物体或微物体类型)涂层的组合生产组合，使用根据本发明的传感器的2D筛选步骤非常适合表面特性的快速评估。因此，2D-到-3D的性质保留可以预选活性表面，由此使得未来医药的发展更快且更经济。
原理描述：
1-首先，通过制备每个包含具有特定比例的形成基本砌砖的受体的混合物的敏感区域来构造如示例1所示的传感器，这些混合物为具有[BB1]/([BB1]+[BB2])比例为0％、10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％和100％的9个混合物，整个浓度为20μM的常数，BB1表示乳糖并且BB2表示硫酸化乳糖。
2-然后，测量敏感区域对目标的亲和性，在本例中为干扰素γD136(IFNgD136)，在本例中根据示例1的模式通过SPRi来测量。
3-选择提供最好的亲和性的敏感区域或多个敏感区域。在本例中，对IFNg D136蛋白质的相关敏感区域包括10％BB1/90％BB2的混合物(图7)。选择对应于90％BB1/10％BB2的混合物的敏感区域作为负控制。
4-制备作为涂覆有类似于被识别的混合物的金颗粒的NP(图8)。纳米颗粒的尺寸是20nm。
5-通过常规的生化测试，在本例中通过SPRi(图9)或者通过ELISA(图10)，验证为目标制备的NP的亲和性。
通过SPRi可以清楚地观察到，具有相关涂层(10％BB1)的NP引起信号的下降，该信号的下降取决于NP浓度；另一方面，负控制NP(90％BB1)不会引起信号的任何变化。
ELISA的结果证实对于包含2维支撑体上受体的混合物的敏感区域的目标的亲和性与涂覆有相同混合物的纳米颗粒的亲和性非常相似。
另外，例如如果需要将颗粒结合到第一个目标A而不结合到第二个目标B，能够在几个目标上实施与从步骤1到步骤5同样类型的处理。

Claims (14)

1.一种电子舌或电子鼻传感器，用于分析样本或者检测至少一个目标，所述电子舌或电子鼻传感器包括支撑体，在所述支撑体的一个表面上为多个敏感区域，每个所述敏感区域包括至少一个受体，每个所述敏感区域能够发射由样本的至少一个成分或者至少一个目标与所述至少一个受体交互作用所产生的可测量信号，其特征在于，所述电子舌或电子鼻传感器包括至少三个敏感区域，所述至少三个敏感区域在它们各自的受体构成上彼此不同，至少一个所述敏感区域包括由至少两个不同受体组成的混合物，其他两个敏感区域中的每个敏感区域包括这两个受体中的至少一个受体。
2.如权利要求1所述的电子舌或电子鼻传感器，包括多个敏感区域，每个敏感区域包括由至少两个不同受体组成的混合物，在每个混合物中，所述不同受体是同样的一些不同受体，但在这些混合物所包括的不同受体的各自比例上彼此不同。
3.如权利要求1或2所述的电子舌或电子鼻传感器，其中所述敏感区域中的至少一个敏感区域包括由至少三个不同受体组成的混合物。
4.如权利要求1至3中任一项所述的电子舌或电子鼻传感器，包括多个敏感区域，每个所述敏感区域包括由至少三个不同受体组成的混合物，在每个混合物中所述不同受体是同样的一些不同受体，但在这些混合物所包括的不同受体的各自比例上彼此不同。
5.如权利要求1至4中任一项所述的电子舌或电子鼻传感器，包括：包括有单个类型受体的敏感区域，其数量与所述传感器中不同受体的数量至少一样多，所述传感器的所述不同受体中的每个受体被各自包括在每个所述包括有单个类型受体的敏感区域中。
6.如权利要求1至5中任一项所述的电子舌或电子鼻传感器，包括足够数量的敏感区域，使得由所有区域发射的信号的曲线能够识别出至少一个有缺陷的敏感区域的存在。
7.如权利要求1至6中任一项限定的传感器的用途，用于分析样本。
8.一种用于分析样本的过程，其中：
-使如权利要求1至6中任一项限定的传感器接触所述样本；
-测量由所述传感器的所述敏感区域发射的信号；
-在接触至少一个其他样本之后，将在先前步骤中测量的信号与由相同传感器或者第二相似传感器的敏感区域独立产生的信号进行比较；
-描述被分析的所述样本。
9.如权利要求8所述的过程，其中：
-使如上限定的传感器接触所述样本；
-测量由所述传感器的所述敏感区域发射的信号；
-在接触至少一个控制样本之后，将在先前步骤中测量的信号与由相同传感器或者第二相似传感器的敏感区域独立产生的信号进行比较；
-相对于至少一个控制样本描述被分析的所述样本。
10.如权利要求8中所述的过程，其中：
-使如上限定的传感器，或者使与如上限定的传感器相似的多个传感器接触多个样本；
-对于每个样本，测量由所述传感器的敏感区域发射的所述信号；
-相互比较为每个样本测量的信号；
-相对于所有被分析的样本对每个样本分类。
11.如权利要求8至10中任一项所述的过程，还包括以下步骤：通过比较由敏感区域发射的信号与由至少两个其他敏感区域发射的信号，验证所述传感器的敏感区域的功能性。
12.如权利要求1至6中任一项限定的传感器的用途，用于限定受体混合物的受体构成，所述受体混合物用于涂覆待与至少一个目标交互作用或不交互作用的三维结构。
13.一种用于制备涂覆有受体混合物的三维结构的过程，所述三维结构待与至少一个目标交互作用或不交互作用，所述过程包括：
-使所述目标与如权利要求1至6中任一项限定的传感器接触；
-识别所述传感器的一敏感区域，该敏感区域发射的信号的强度表示对所述目标的亲和力与涂覆有受体混合物的所述三维结构对所述目标的期望亲和力相似；
-用具有与所识别的敏感区域的受体构成相似的受体构成的受体混合物涂覆所述三维结构。
14.如权利要求13所述的过程，还包括以下步骤：通过比较由每个敏感区域发射的信号与由至少两个其他敏感区域发射的信号，验证敏感区域的功能性。
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