KR101684620B1 - 미각 수용체 기능화된 탄소 나노튜브 전계효과 트랜지스터 기반 미각센서 및 이를 포함한 고선택성 바이오 전자혀 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 미각 수용체 기능화된 단일벽 탄소 나노튜브-전계효과 트랜지스터(swCNT-FET)에 기초하고 인간의 미각 시스템을 모사한 고선택성의 바이오 전자혀에 관한 것이다. 본 발명자들은 최초로 미각 수용체 단백질을 인공혀에 적용하였으며 고선택성, 고민감성의 전자혀를 성공적으로 증명하였다. 이는 인간의 미각 수용체 단백질을 전자혀의 1차 신호 변환기로 사용함으로써 인간의 미각 시스템을 모방하는 전자혀를 구현하였다. 또한 기존의 전자혀에 비해 선택성과 민감성 측면에서 매우 우수하다. 본 발명에 의한 바이오 전자혀는 식품 산업에서 품질검사의 목적이나 맛 물질의 선별을 위한 도구로 사용될 수 있다.

Description

미각 수용체 기능화된 탄소 나노튜브 전계효과 트랜지스터 기반 미각센서 및 이를 포함한 고선택성 바이오 전자혀 {Taste Receptor-Functionalized Carbon Nanotube Field Effect Transistors Based Taste Sensor and High Selective Bio-Electronic Tongue Containing the Same}

본 발명은 미각 수용체 기능화된 탄소 나노튜브 전계효과 트랜지스터 기반 미각센서 및 이를 포함한 고선택성 바이오 전자혀에 관한 것이다.

본 발명은 교육과학기술부의 신기술융합형 성장동력 사업의 일환으로 수행한 연구로부터 도출된 것이다. [과제명: 미각 수용체 기반 인공 미각 센서 개발]

세계적으로 식품 산업에서 품질 검사의 목적으로 매우 유용하게 이용 될 수 있는 미각 센서를 개발하려는 시도가 활발히 진행 중이다. 현재까지 개발된 미각 센서는 대부분 지질막 (lipid membrane), 금속, 고분자 재료 등 단순한 화학재료를 이용하여 전기적 또는 광학적 방법으로 맛 물질을 감지하는 원리를 이용하여 맛 물질을 검지하는 것으로 맛 물질 분석에 있어서 선택도(selectivity)와 민감도(sensitivity)가 떨어지고, 인간의 미각 시스템을 재현할 수 없다는 한계를 가지고 있다.

미각 세포는 화학물질을 수용하는 세포로서 화학 감각기의 하나이다. 이는 수용성의 화학 물질을 수용한다. 맛은 짠맛, 신맛, 쓴맛, 단맛 등의 기본적 4가지 맛과 맛있는 맛으로 분류할 수 있다. 혀 표면의 돌기 속에는 미각 세포가 수십 개의 꽃봉오리 모양으로 모여 있는 기관이다. 미각 세포의 첨단에는 섬모가 있어 이 부분에서 화학물질이 수용된다. 화학 물질이 수용되면 수용막에 탈분극 현상이 발생하여 이 전위 변화가 시냅스로 전달된다. 즉 수용막에서 시냅스 영역으로 전류가 흐르게 된다. 여기서 다시 시냅스에 탈분극 현상이 일어나게 되면 이 부분에 존재하고 있는 칼슘 채널이 열려 칼슘이 세포간 액으로부터 세포 내로 흘러 든다. 이 결과 각 세포로부터 노르아드레날린이 방출되어 이것이 미각 세포 말단에 작용하여 자극을 발생시킨다.

본 발명은 상기한 종래기술의 문제점을 해결하여, 미각 수용체 단백질(taste receptor protein)이 기능화된 탄소 나노튜브 전계효과 트랜지스터를 이용한 미각 센서 및 바이오 전자혀(bioelectronic tongue) 를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 미각 수용체 단백질 기능화된 단일벽 탄소 나노튜브-전계효과 트랜지스터(이하, 'swCNT-TFT'로 약칭하기도 함)에 기초한 인간의 미각 시스템을 모방하는 고선택성 바이오 전자혀를 제공한다.

일 예에 따른 미각 센서는 기판 및 상기 기판 표면에 형성된 미각 수용체 단백질을 포함하고, 상기 미각 수용체 단백질은 특정 미각물질과 선택적으로 결합하는 물질로서 재접힘(refolding)됨으로써 기능화되어 있다.

상기 기판 상에는 반도체 채널이 형성되는 바, 반도체 채널의 형성을 위한 패터닝을 한다. 패터닝은 자기조립단분자막(Self Assembled Monolayer, SAM)으로 이루어질 수 있고, 이러한 SAM 상에 소스/드레인 전극이 형성될 수 있다. 상기 자기조립단분자막은 옥타데실트리클로로사일렌(octadecyltrichlorosilane) 등을 들 수 있다. 또한, 상기 미각 수용체 단백질은 hTAS2R 류의 쓴맛 수용체 단백질일 수 있다.

상기 미각 수용체 단백질은 지질막에 흡착된 형태로 swCNT-TFT 에 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 기판 상에 SAM 패턴층, 반도체 채널, 소스/드레인 전극이 형성되어 swCNT-FET를 구성하고, swCNT-FET 표면에서 소스/드레인 전극을 제외한 부분으로서, 적어도 반도체 채널 상에 지질막이 형성될 수 있다. 상기 지질막에는 미각 수용체 단백질이 흡착된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 단일벽 탄소나노튜브 전계효과 트랜지스터를 포함하는 바이오 전자혀를 제공한다. 이러한 전자혀에는 다양한 맛 물질 선택성, 특이성을 갖는 다양한 수용체 단백질이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 바이오 전자혀는 인간 미각 수용체 기능화된 swCNT-FET에 기초한 것으로서, 종래 알려진 전자혀에 비하여 월등히 향상된 높은 선택성 및 민감성을 발휘할 수 있다. 인간의 혀에 존재하는 미각 수용체 단백질을 1차 신호변환기로 이용하기 때문에 인간의 미각 시스템을 재현할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명에 의한 바이오 전자혀는 식품 산업에서 품질검사의 목적이나 맛 물질을 선별을 위한 도구로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 예에 따른 미각 수용체 단백질이 기능화된 swCNT-FET 미각센서의 모식도이다;
도 2는 도 1에 따른 미각센서의 제조 과정을 나타내는 모식도이다;
도 3(A)는 대장균에서 hTAS2R38의 미각(PAV)형질과 미맹(AVI)형질 발현을 각각 SDS-PAGE로 나타내는 도면이며, 도 3(B)는 웨스턴 블롯으로 확인한 도면이며, 도 3(C)는 인간 미각 수용체(hTAS2R38)-기능화된 swCNT-FET 센서의 형광 사진이다;
도 4(A)는 인간 쓴맛 미각 수용체 hTAS2R38의 미각(PAV)에 선택적으로 결합하는 것으로 알려진 쓴맛 물질, PROP와 PTC의 분자 구조를 나타내는 개요도 이고; 도 4(B)와 도 4(C)는 각각 PROP와 PTC의 자극에 의해 미각(PAV) 타입의 hTAS2R38로 기능화된 swCNT-FETs로부터 나온 실시간 컨덕턴스 측정 결과를 나타내고 있으며; 도 4(D)와 도 (E)는 각각 PROP와 PTC의 자극에 의해 미맹(AVI) 타입의 hTAS2R38로 기능화된 swCNT-FETs로부터 나온 실시간 컨덕턴스 측정 결과를 나타내고 있고; 도 4(F)와 도 4(G)는 각각 PROP와 PTC의 자극에 의해 아무 것도 기능화하지 않은 swCNT-FETs로부터 나온 실시간 컨덕턴스 측정 결과를 나타내고 있다;
도 5(A)은 hTAS2R38에 결합하지 않는 것으로 알려진 쓴맛 물질, methylthiouracil (MTU), 감칠맛 (Umami) 물질, L-Glutamic acid 그리고 단맛 물질, sucrose의 분자 구조를 나타내는 개요도 이고; 도 5(B), 도 5(C), 도 5(D)는 각각 MTU, L-Glutamic acid 그리고 sucrose의 도입 이후 미각(PAV) 형질의 hTAS2R38이 기능화된 swCNT-FET센서로부터 얻어진 실시간 컨덕턴스 측정의 결과이다;

상술한 목적, 특징 및 장점은 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 후술되어 있는 상세한 설명을 통하여 명확해 질 것이며, 그에 따라 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시 할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서 본 발명과 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에 그 상세한 설명을 생략하기로 한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 실시예를 설명하기로 한다.

단일벽 탄소 나노튜브-전계효과 트랜지스터

본 발명은 인간 미각 수용체 단백질 기능화된 단일벽 탄소 나노튜브-전계효과 트랜지스터(swCNT-FET)에 기초한 미각센서 및 인간 미각 시스템을 제공한다. 상기 미각은 단맛, 짠맛, 신맛, 쓴맛, 감칠맛을 포함한다. 이러한 인간 미각 수용체 단백질이 표면에 형성되어 고선택성 및 민감성 바이오 전자혀를 형성한다.

상기 미각 수용체 단백질은 특정한 맛 물질에 대해 선택적으로 결합하는 물질이다.

예를 들어, 인간 쓴맛 수용체 단백질 hTAS2R38은 쓴맛 물질인 페닐티오카바마이드(phenylthiocarbamide, PTC)와 프로필티오우라실 (propylthiouracil, PROP)와 선택적으로 결합한다. hTAS2R38은 유전자 서열 상에 3곳의 단일 핵산 다형성(single-nucleotide polymorphim) 위치를 가지고 있다. 3곳의 단일 핵산 다형성 위치 중 1번째 위치는 프롤린(proline) 또는 알라닌(alanine), 2번째 위치는 알라닌(alanine) 또는 발린(valine) 그리고 3번째 위치는 발린(valine) 또는 아이소루신(isoleucine)을 코딩한다.

프롤린, 알라닌, 발린(PAV)순의 hTAS2R38을 가진 사람은 PTC를 쓴맛으로 느끼는 미각타입이고, 알라닌, 발린, 아이소루신(AVI)순의 hTAS2R38을 가진 사람은 PTC를 쓴맛으로 느끼지 못하는 미맹타입이다.

이에, 미각 타입 hTAS2R38과 미맹 타입의 hTAS2R38이 각각 부착된 swCNT-FET에 상기 단백질에 선택적으로 결합하는 쓴맛 물질 PTC를 반응시킴으로써 쓴맛 물질을 감지할 수 있다.

본 발명에 따른 바이오 전자혀가 인간의 미각 시스템과 동일하게 동작하는지 알아보기 위해 미각 타입 hTAS2R38과 미맹 타입의 hTAS2R38을 각각 대장균에서 생산한 후 각각의 타입으로 기능화 된 swCNT-FET로부터 인간의 미각 시스템과 유사한 반응을 보임을 확인하였다. 즉, 미각 타입의 hTAS2R38로 기능화된 바이오 전자혀는 PTC와 PROP에 대하여 선택적이고 민감한 반응을 보인 반면, 미맹 타입의 hTAS2R38로 기능화된 바이오 전자혀는 PTC와 PROP에 대하여 거의 반응이 없었다.

또한 미각 타입의 바이오 전자혀는 선택적 결합을 보이는 맛 물질에 대하여 피코 몰(pico-molar range) 수준의 민감성을 보였다. 그리고 미각타입의 바이오 전자혀는 선택적으로 결합하는 쓴맛 물질 이외에 다른 맛 물질과는 반응을 보이지 않는 것으로 보여 높은 선택성을 보임을 확인하였다.

본 발명에 따른 swCNT-FET 센서를 이용한 특정 맛 물질 검출의 가능한 메커니즘을 살펴보면 미각 수용체 단백질은 일반적으로 이온화 될 수 있는 시스테인 잔기를 포함하고 있으며, 비활성 및 활성 생물 물리학적 상태 사이의 형태 평형(conformational equilibrium)으로 존재한다. 이러한 비활성 및 활성 상태는 각각 시스테인의 중성 산 형태(neutral acid form) 및 음-하전된 염기 형태(negatively-charged base form)에 관련되어 있다. 특정 맛 물질이 수용체 단백질에 결합되면, 수용체 단백질의 평형은 음전하를 갖는 활성 수용체 상태로 이동하게 되어, swCNT 접합 상에 정전기적 섭동(electrostatic perturbation)을 야기한다.

종래 음으로 하전된 핵산 분자는 금 전극의 일함수 및 저하된 접합의 컨덕턴스(conductance)에 영향을 미친다는 것이 알려져 있다. 금속 전극과 swCNTs 사이의 접촉 저항의 변조(modulation)에 의하여 컨덕턴스의 저하가 일어날 수 있으며, 이는 미각 수용체와 맛 물질간의 선택적 결합에 의해 음으로 대전된 염기 형태로의 변화에 의하여 야기되는 것으로 예측된다.

도 1은 본 발명의 일 예에 따른 swCNT-FET기반 미각 센서가 모식적으로 나타나 있다.

도 1에 따르면, swCNT-FET 기반 미각 센서(100)에서 단일벽 탄소 나노튜브-전계효과 트랜지스터(swCNT-FET)는 기판(110), 상기 기판(110) 상에 형성된 단일벽 탄소나노튜브로 이루어진 반도체 채널(210), 및 상기 반도체 채널(210)의 양 단에 형성된 소스-드레인 전극(221, 222)을 포함한다. 상기 반도체 채널 표면(210)의 적어도 일부에는 미각 수용체 단백질(300)이 흡착되어 있다. 상기 미각 수용체 단백질(300)은 재접힘(refolding)에 의해 기능화됨으로써, in vivo 또는 인체 내에서와 유사하게 특정 맛 물질(400)과 선택적으로 결합한다.

이러한 미각 센서(100)는 예를 들어, 표적 맛 물질(400)을 포함하는 샘플을 상기 미각 수용체 단백질(300)에 제공하고, 반도체 채널(210)에 흐르는 전류 값을 측정하여 미반응시의 전류값과 비교함으로써 표적 맛 물질(400)을 검출할 수 있다. 즉, 맛 물질(400)이 수용체 단백질(300)에 결합되면, 수용체 단백질(300)의 평형은 음전하를 갖는 활성 수용체 상태로 이동되는 바, 이 때 컨덕턴스의 변화를 측정한다.

상기 기판(110)은 실리콘 웨이퍼, III-V족 반도체 기판, II-VI 족 반도체 기판, 에피텍셜 성장된 SiGe 기판, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 반도체 채널(210)을 제외한 기판 상에 형성된 자기조립단분자막(120)을 형성하고, 상기 자기조립단분자막(120) 상에 소스-드레인 전극(221, 222)을 형성할 수 있다. 즉, 소스/드레인 전극(221, 222)은 기판(110) 상에 직접 형성될 수도 있고, 자기조립단분자막(120) 상에 형성될 수도 있다

상기 소스 전극 및 드레인(221, 222)은 각각 독립적으로 백금(Pt), 금(Au), 크롬(Cr), 구리(Cu), 알루미늄(Al), 니켈(Ni), 팔라듐(Pd), 티타늄(Ti), 몰리브덴(Mo), 납(Pb), 이리듐(Ir), 로듐(Rh), 코발트(Co), 텅스텐(W), 탄탈륨(Ta), 어븀(Er), 이터븀(Yb), 사마륨(Sm), 이트륨(Y), 가돌륨(Gd), 터븀(Tb), 세륨(Ce) 및 이들의 혼합물 또는 합금으로 이루어진 군에서 선택된 금속으로 이루어질 수 있다.

상기 수용체 단백질(300)은 기판(110) 및 전극(221, 222)의 표면에 물리, 화학적으로 흡착 또는 부착되며 이를 용이하게 하기 위해 기판(110) 및 전극(221, 222)의 표면을 개질할 수 있다. 예를 들어, 상기 전극의 표면은 아미노기, 카르복실기, 옥소기 및 싸이올기 등의 반응성 작용기 또는 링커 분자를 포함하도록 개질될 수 있다.

하나의 예에서, 생체 내에서와 유사하게 단백질의 재접힘이 효과적으로 일어날 수 있도록 상기 미각 수용체 단백질(300)은 소스-드레인 전극(221, 222)을 제외한 단일벽 탄소나노튜브 전계효과 트랜지스터 표면에 결합된 지질막(310) 내에 흡착된 형태일 수 있다.

이러한 미각 센서의 제조과정을 도 2를 참조하여 예시적으로 살펴보면, 먼저 실리콘(SiO₂) 기판 상에 포토리소그래피를 이용하여 자기조립단분자층(self-assembled monolayer, SAM)를 패터닝한다(S1). 여기서, '자기조립단분자층'은 기판 표면에 생성된 규칙적으로 잘 정렬된 유기 분자막을 뜻하는 것으로, 카르복실기(-COOH) 및/또는 하이드록실기(-OH) 중 어느 하나를 갖는 것이 바람직하다. SAM 형성용 물질은 비극성 말단기를 갖는 옥타데실트리클로로사일렌(octadecyltrichlorosilane, OTS), 머캅토 알킬 카르복실산 등을 들 수 있다. 패터닝된 기판을 단일벽 탄소나노튜브(CNT) 함유 용액(일반적으로 o-다이클로로벤젠 중의 0.1 mg/ml)에 담지하고, 패터닝되지 않은 부위인 노출된 기판 상에 단일벽 탄소나노튜브 단일층이 선택적으로 흡착되었다(S2). 그럼 다음, 소스/드레인 전극(10 nm 팔라듐(Pd) 상의 30 nm 금(Au))을 포토리소그래피를 이용하여 형성함으로써 swCNT-FET를 제조한다(S3). 마지막으로 소스/드레인 전극을 제외한 부분에 지질막(Lipid Membrane)을 형성하고, 미각 수용체 단백질(Taste Receptor)을 지질에 흡착시켜 고정한다(S4).

상기 미각 수용체 단백질은 특정 맛 물질에 대해 선택적 결합능을 갖는 것으로서, 예를 들어 하기 표 1에서와 같은 TAS2R 류의 쓴맛 수용체 단백질을 들 수 있다. 또한, 표 2에서와 같은 단맛 수용체 단백질 및 표 3에서와 같은 감칠맛 수용체 단백질 등을 들 수 있다. 표 1 내지 3에 나타난 바와 같이, 미각 수용체 단백질에 특이적으로 결합하는 쓴맛 물질은 1 이상일 수 있다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

미각 수용체 단백질은 상기 단백질을 인코딩하는 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 대장균(Escherichia coli) 등의 숙주로부터 발현될 수 있다. 상기 벡터는 박테리아, 플라스미드, 파지, 코스미드, 에피솜, 바이러스 및 삽입 가능한 DNA 단편 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터에는 단백질을 인코딩 하는 유전자 이외에 발현조절 서열(예: 프로모터 또는 기타 전사 조절 서열)을 포함한다. 프로모터는 폴리머라제 결합 부위와 같은 전사의 출발 부위 근처의 핵산 서열을 포함한다. 또한, 프로모터는 말단 인핸서(enhancer) 또는 리프레서(repressor) 요소를 포함할 수 있다. 경우에 따라, 미각 수용체 단백질의 발현여부를 확인하기 위해 N-말단 부분에 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)-태그가 함께 발현된 융합 단백질(fusion protein)일 수 있다.

미각 수용체 단백질은 배양액으로부터 회수한 형질전환 대장균을 초음파 분쇄기(sonicator) 또는 프랜치 프레스(French press) 등을 이용하여 파쇄한 후 저속의 원심분리를 통해 수확될 수 있다. 필요에 따라 5% 이내의 트라이톤 X-100, 5M 우레아, 또는 2% 디옥시콜레이트 등으로 세척함으로써 미각 수용체 단백질을 포함하는 불용성 부분을 얻는다. 얻어진 불용성 부분의 재접힘을 유도하기 위하여 인공지질을 첨가한 후 초음파를 가하고 200 ng의 단백질을 swCNT-FET소자 위에 올리고 진공 건조한다.

단백질 접힘은 1차 구조와 아미노산 서열에 의해 결정되어 최저 에너지를 갖는 3차 구조로 이루어지는 것이 일반적이며, 단백질의 변성(denaturation)에 사용된 우레아 또는 구아닌딘-HCl의 농도를 줄여줌으로써 재접힘 과정을 수행할 수 있다. 일반적으로 완충액에 직접 희석시키는 방법과 투석 방법이 있다. 디설파이드 결합이 요구되는 단백질의 경우 산화를 위해 글루타티온(glutathione)을 사용한다.

이 재접힘 과정에 따라 회수되는 단백질의 수율이 크게 영향을 받기 때문에 이 과정에서 최적 조건을 찾는 것이 매우 중요하다. 일반적으로 단백질 수율을 높이기 위해 재접힘 과정을 매우 천천히 수행한다. 또한 단백질 농도도 중요하며 높은 농도의 단백질 용액에서 재접힘을 수행할 경우 IB 형성을 초래할 수 있다. 일반적으로 20 mg/L 이하의 낮은 농도에서 재접힘을 수행하는 것이 바람직하다.

시료 내 미각 물질 검출 방법

본 발명의 또 다른 측면에 따르면 상기 swCNT-FET기반 미각센서를 이용하여 시료 내 미각 물질을 검출하는 방법을 제공한다.

즉, 미각 수용체 단백질을 포함하는 swCNT-FET기반 미각센서를 제작하고, 시료를 반응시켜 시료 내 맛 물질과 미각센서 내 수용체 단백질의 반응여부를 검출함으로써 미각물질의 존부를 확인할 수 있다.

하나의 예에서, 미각 타입 미각 수용체 단백질을 포함하는 제1 swCNT-FET를 제작하는 과정; 미맹 타입 미각 수용체 단백질을 포함하는 제 2 swCNT-FET를 제작하는 과정; 상기 미각 수용체 단백질과 특이적으로 반응하는 맛 물질을 포함하는 시료를 제1 swCNT-FET및 제 2 swCNT-FET에 모두 반응시켜 시그널을 얻는 과정; 및 제1 swCNT-FET및 제 2 swCNT-FET로부터 얻은 시그널을 비교하는 과정;을 포함할 수 있다.

<실험방법>

swCNT-FETs의 제조

먼저 OTS SAM을 포토리소그래피 기술을 이용하여 300 nm 두께의 열적 산화막 층(thermal oxide layer)으로 덮인 축퇴 도핑된 실리콘 웨이퍼를 포함하는 기판 상에 패터닝 하였다. 한편, 정제된 swCNTs (Carbon Nanotubes)를 20분 동안 초음파 진동으로 1,2-다이클로로벤젠에 분산시켜, swCNT 서스펜젼을 제조하였다. SwCNT 서스펜젼의 일반적 농도는 0.1 mg/ml 이하였다. 상기 패터닝된 기판 표면을 일반적으로 10초 동안 상기 서스펜젼 내에 둔 후, 1,2-다이클로로벤젠으로 완전히 헹구었다. 통상의 포토리소그래피 후 Au/Pd(30 nm/10 nm) 증착 및 리프트-오프(lift-off) 방법에 의하여 접촉 전극을 제조하였다. 소스 전극과 드레인 전극 사이의 갭 간격은 4 μm이었다.

인간 쓴맛 미각 수용체 hTAS2R38 및 이를 함유하는 인공 지질막 제조

PTC를 쓴맛으로 느끼는 미각 사람과 맛을 느끼지 못하는 미각 사람을 구분하여 각 사람의 상피세포에서 인간 유전체를 추출하였다. 미각과 미맹의 각 사람의 유전체중 hTAS2R38 유전자를 시퀀싱하여 각 사람이 미각 타입과 미맹타입의 hTAS2R38 유전자를 각각 가지고 있는지 확인하였다. PCR로 미각 타입과 미맹 타입의 hTAS2R38 유전자를 증폭하여 이를 pDEST15(Invitrogen) 발현 벡터에 삽입하였다. 각각의 hTAS2R38 유전자가 삽입된 pDEST15 벡터로 형질 전환된 대장균 BL21(DE3)으로 목표 단백질의 발현을 유도하고 원심 분리로 수확하고 초음파 처리한 후 다시 원심분리 하는 방법으로 목표 단백질을 포함하는 불용성 부분을 얻었다. 이를 5 vol%의 트라이톤 X-100으로 1시간 동안 4℃에서 처리하고 이를 다시 원심분리 하여 미각 수용체 단백질을 포함하는 불용성 부분을 획득 했다. 생산된 불용성부분의 재접힘을 유도하기 위하여 인공지질을 첨가한 후 초음파를 가하고 200 ng의 단백질을 swCNT-FET소자 위에 올리고 진공건조 시켰다. 이에 따라, 미각 수용체 단백질을 함유하는 인공 지질막이 단일벽 탄소 나노튜브-전계 효과 트랜지스터 표면에 형성된다.

SDS-PAGE와 면역점적 분석(Immunoblot assay)

대장균의 불용성 부분을 원심분리 방법으로 분획하여 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 상의 전기영동에 의해 분리하였다. 이를 쿠마시블루(Coomassie blue)로 15분간 염색하였다. 같은 SDS-폴리아크릴아마이드 젤을 니트로셀룰로우스 막(nitrocellulose membrane; Watman)으로 전달하였다. 이 막을 0.1 vol%를 함유하는 PBS(PBST, pH 7.4) 중의 5 wt%의 탈지우유로 1시간 동안 차단하였다. 상기 막을 항-GST 항체(Santa Cruz) 및 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)와 결합된 항체(GE helthcare)로 처리하였다. 블롯은 향상된 화학발광 검출 키트(ECL kit; GE helthcare)를 이용하여 나타내었다.

이하, 본 발명의 예시에 따른 실시예 및 실험예를 참조하여 더욱 상세하게 살펴본다.

[실시예 1] hTAS2R38 인간 쓴맛 수용체 단백질의 발현 및 swCNT-FET위의 고정화

대장균을 숙주세포로 이용하여 인간 쓴맛 미각 수용체 단백질 hTAS2R38의 성공적인 과발현을 확인하였으며 이를 swCNT-FET 소자 위에 고정하였다.

도 2(A)와 도 2(B)는 각각 미각(PAV) 타입과 미맹(AVI) 타입의 인간 쓴맛 미각 수용체 단백질(hTAS2R38)이 대장균에서 발현되었음을 확인하는 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.

이는 인간 쓴맛 미각 수용체 단백질이 대장균에서 과발현 되었음을 나타낸다.

도 2(C)는 형광 물질이 달려있는 지질막과 인간 쓴맛 미각 수용체 단백질을 함께 swCNT-FET상에 올린 후에 얻은 형광 사진이다. 밝은 부분이 형광을 띄는 부분으로 이는 양쪽 금 전극 사이에 있는 swCNT 위에 지질막과 함께 존재하는 인간 쓴맛 미각 수용체 단백질이 선택적으로 고정화 되어있음을 나타낸다.

[실시예 2]미맹과 미각 타입의 hTAS2R38로 기능화 된 swCNT-FET소자의 PTC와 PROP의 자극에 의한 신호 측정

본 실시 예에서 미맹 타입과 미각 타입의 hTAS2R38로 기능화된 swCNT-FET에 hTAS2R38에 선택적으로 결합하는 것으로 알려진 쓴맛 물질 PTC와 PROP로 자극하여 신호를 얻고 미맹과 미각타입의 신호를 비교하였다.

미각(PAV)와 미맹(AVI) 타입의 hTAS2R38으로 기능화된 swCNT-FET에 대한 맛 물질의 효과를 측정하기 위한 실험을 수행하였다. 모든 실험은 인산염 완충 식염수(PBS) 방울을 hTAS2R38으로 기능화된 swCNT-FET 상에 놓고 이에 맛 물질 용액을 도입한 후에 소스-드레인 전류(source-drain current)를 모니터링하였다. hTAS2R38으로 기능화된 swCNT-FET 사람의 미각 반응과 유사한지 알아보기 위하여 미각과 미맹 타입의 hTAS2R38로 기능화된 swCNT-FETs로부터 PROP와 PTC의 자극에 의한 신호 차이가 어떤지 실험하였다.

도 4(A)는 인간 쓴맛 미각 수용체 hTAS2R38에 선택적으로 결합하는 것으로 알려진 쓴맛 물질 페닐티오카바마이드(PTC)와 프로필티오우라실(propylthiouracil, PROP)의 분자구조를 나타내는 개요도이다. PTC와 PROP는 일반적으로 미각 테스트에 사용되는 쓴맛 물질로서 미각 타입의 hTAS2R38 유전자를 가진 사람은 쓴맛으로 느끼고, 미맹 타입의 유전자를 가진 사람은 그 맛을 느끼지 못한다.

도 4(B)와 도 4(C)는 각각 PROP와 PTC의 자극에 의해 미각(PAV) 타입의 hTAS2R38로 기능화된 swCNT-FETs로부터 나온 신호를 나타내고 있다.

도 4(D)와 도 (E)는 각각 PROP와 PTC의 자극에 의해 미맹(AVI) 타입의 hTAS2R38로 기능화된 swCNT-FETs로부터 나온 신호를 나타내고 있다.

도 4(F)와 도 4(G)는 각각 PROP와 PTC의 자극에 의해 아무 것도 기능화하지 않은 swCNT-FETs로부터 나온 신호를 나타내고 있다.

모든 신호는 swCNT-FETs 센서의 소스-드레인 전류의 시간 의존성으로부터 얻어졌다. 실험 결과에 따르면 PROP와 PTC의 자극에 대하여 미각(PAV) 타입의 hTAS2R38로 기능화된 swCNT-FETs는 모두 피코몰 농도(pico-molar concentration)수준의 민감도를 보인 반면, 미맹(AVI) 타입의 hTAS2R38로 기능화된 swCNT-FETs에서는 PROP와 PTC의 자극에 대하여 마이크로몰 농도(micro-molar concentration) 수준의 민감도를 보였다. 기능화 처리를 하지 않은 swCNT-FETs 센서에서도 PROP와 PTC에 대하여 마이크로몰 농도 수준의 민감도를 보이는 것으로 보아 미맹(AVI) 타입의 hTAS2R38로 기능화된 swCNT-FETs에서 얻어진 PROP와 PTC에 대한 결합 신호는 swCNT-FET 소자에 PROP와 PTC가 비특이적(non-specific)으로 결합하여 생긴 신호라고 판단된다.

따라서 본 발명에 의한 바이오 전자혀가 사람의 미각 시스템과 유사하게 미각을 재현하고 있고 기존의 전자혀에 비하여 최소한 10000배 우수한 검지능을 보임을 증명하였다.

[실시예 3] 미각 타입의 hTAS2R38로 기능화 된 swCNT-FET소자의 맛 물질에 대한 선택성 확인

본 실시 예에서는 hTAS2R38에 선택적으로 결합하는 쓴맛 물질 PTC와 PROP외에 다른 맛 물질의 자극에 의한 미각 타입의 hTAS2R38로 기능화된 swCNT-FET의 신호를 분석하여 본 발명에 의한 바이오 전자혀의 우수한 선택성을 확인하였다.

도 5(A)는 선택도 실험에 사용한 메틸티오우라실(methylthiouracil, MTU: 쓴맛), L-글루탐산 (glutamic acid, 감칠맛) 및 수크로오스 (sucrose, 단맛)의 분자 구조를 각각 나타낸 모식도이다.

도 5(B), 도 5(C), 도 5(D) 각각 MTU, L-글루탐산, 수크로오스의 자극에 의해 미각(PAV) 타입의 hTAS2R38로 기능화된 swCNT-FETs로부터 나온 신호를 나타내고 있다.

MTU의 경우(5(B) 참조) hTAS2R38에 특이적으로 결합하는 PROP와 분자구조가 매우 유사하며 단지 탄소수가 2개 적은 분자구조를 가지고 있음에도 불구하고, PROP가 피코몰의 검지한계를 보인 것에 비교할 때 마이크로몰 수준으로 낮은 검지한계를 보였다.

L-글루탐산과 수크로오스에는 거의 반응하지 않은 것으로 볼 때, 본 발명에 따른 바이오 전자혀가 매우 높은 선택도를 갖고 있음을 증명 하였다.

전술한 바와 같이 본 발명자들은 생물학적은 미각 수용체 단백질을 이용하여 인간의 미각 시스템을 모방하고 동시에 높은 선택성과 민감성을 보이는 최초의 바이오 전자혀를 성공적으로 증명하였다.

현재까지 미각 수용체 단백질을 이용하여 전자혀를 개발한 예는 세계적으로 최초이며 인간의 미각 시스템을 재현할 수 있다는 점에서 우수한 특성을 나타낸다. 또한, 선택성이 매우 뛰어나며 민감성의 관점에서도 종래의 전자혀에 비해 적어도 10000배 우수하다. 이러한 바이오 전자혀에 의하면 신속하고 높은 처리량으로 다양한 맛 물질이 선택적이고 민감한 복합 검출용 대규모의 다양한 센서 어레이 실현이 가능해 질 수 있으며 인간이 맛을 느끼는 것과 매우 유사한 반응을 내므로 여러 가지 맛 물질의 선별과 식품 산업에서 품질검사의 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

Claims (7)

1. 기판, 상기 기판 상에 형성된 단일벽 탄소 나노튜브로 이루어진 반도체 채널, 및 상기 반도체 채널의 양 단에 형성된 소스-드레인 전극을 포함하는 단일벽 탄소나노튜브-전계효과 트랜지스터(swCNT-FET); 및
   상기 반도체 채널 표면의 적어도 일부에 형성된 hTAS2R 류의 쓴맛 수용체 단백질;을 포함하고,
   상기 수용체 단백질은 재접힘(refolding)에 의해 기능화되고 특정 맛 물질과 선택적으로 결합하는 물질인, swCNT-FET기반 미각센서.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 반도체 채널을 제외한 기판 상에 형성된 자기조립단분자막; 상기 자기조립단분자막 상에 형성된 소스-드레인 전극을 포함하는, swCNT-FET기반 미각센서.
3. 제 2 항에 있어서,
   소스-드레인 전극을 제외한 단일벽 탄소나노튜브-전계효과 트랜지스터 표면에 결합된 지질막 및 상기 지질막 내에 흡착된 미각 수용체 단백질을 포함하는, swCNT-FET기반 미각센서.
4. 삭제
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 수용체 단백질은 특정 맛 물질과 선택적으로 반응하는 미각 타입 및 특정 맛 물질과 반응하지 않는 미맹 타입을 포함하는, 미각센서.
6. 삭제
7. 미각 타입 hTAS2R 류의 쓴맛 수용체 단백질을 포함하는 제1 swCNT-FET를 제작하는 과정;
   미맹 타입 hTAS2R 류의 쓴맛 수용체 단백질을 포함하는 제 2 swCNT-FET를 제작하는 과정;
   상기 수용체 단백질과 특이적으로 반응하는 맛 물질을 포함하는 시료를 제1 swCNT-FET및 제 2 swCNT-FET에 모두 반응시켜 시그널을 얻는 과정;
   제1 swCNT-FET및 제 2 swCNT-FET로부터 얻은 시그널을 비교하는 과정;을 포함하는, 시료 내 미각 물질을 검출하는 방법.

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