KR20120083987A - 후각 수용체 단백질을 코딩하는 유전자로 형질 전환된 동물세포로부터 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노 베지클을 제조하는 방법, 이에 의하여 제조된 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노 베지클, 상기 나노 베지클이 표면에 고정화된 단일벽 탄소나노튜브 전계 효과 트랜지스터 및 이를 이용하는 생체전자코 - Google Patents
후각 수용체 단백질을 코딩하는 유전자로 형질 전환된 동물세포로부터 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노 베지클을 제조하는 방법, 이에 의하여 제조된 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노 베지클, 상기 나노 베지클이 표면에 고정화된 단일벽 탄소나노튜브 전계 효과 트랜지스터 및 이를 이용하는 생체전자코 Download PDFInfo
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- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
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Abstract
본 발명은 후각 수용체 단백질을 코딩하는 유전자로 형질 전환된 동물 세포로부터 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노 베지클을 제조하는 방법, 이에 의하여 제조된 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노 베지클, 상기 나노 베지클이 표면에 고정화된 단일벽 탄소나노튜브 전계 효과 트랜지스터 및 이를 이용하는 생체전자코에 관한 것이다.
Description
본 발명은 후각 수용체 단백질을 코딩하는 유전자로 형질 전환된 동물 세포로부터 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노 베지클을 제조하는 방법, 이에 의하여 제조된 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노 베지클, 상기 나노 베지클이 표면에 고정화된 단일벽 탄소나노튜브 전계 효과 트랜지스터 및 이를 이용하는 생체전자코에 관한 것이다.
최근에 인간의 오감(시각, 촉각, 청각, 후각, 미각)을 모사하는 인공감각기관에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 다른 감각기관에 비해 후각을 모사하려는 연구는 덜 진척되어 있으며, 최근에야 인간 후각의 기본적 메커니즘이 규명되기 시작하고 이를 이용한 생체전자코(bioelectronic nose) 연구가 진행되고 있다. 특히 2004년 미국 리처드 액설 및 린다 벅은 후각 인지 메커니즘을 규명하여 노벨상을 수상하였다.
후각 센서는 환경, 식품, 포장, 의약, 화장품 등 다양한 산업 분야에 응용될 수 있으며, 전자코(electronic nose)라는 형태로 인간의 후각 시스템을 모사한 전기화학적 가스 센서들이 개발되었다. 그러나, 이러한 전기화학적 센서는 여러 가지 냄새를 구별하는데 있어서 그 선택도가 떨어지며, 더욱이 서로 상이한 냄새를 가지나 비슷한 구조를 보이는 화합물에 대한 구별이 매우 저조한 것으로 알려져 있다. 이에, 종래의 전기화학적 가스 센서의 선택도를 향상시키고, 인간 후각 시스템을 모방하기 위하여 후각 수용체 단백질을 이용한 생체전자코 개발이 진행되고 있다. 생체전자코의 연구는 크게 대장균이나 효모, 포유류 세포에 유전자 재조합에 의해 발현시킨 후각 수용체 단백질을 분리하여 이용하는 방법(receptor-based assay)과 유전자 재조합에 의해 후각 수용체 단백질이 발현된 포유류 세포를 이용하는 전세포 측정 방법(whole-cell based assay)이 있다.
이러한 생체전자코를 구현하기 위해 다양한 2차 신호전달기를 이용한 방법들이 사용되었으며, 이러한 방법들이 구체적인 예로는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance), 수정미량저울(quartz crystal microbalance), 광지시형 전위차 센서(light-addressable potentiometric sensor), 및 전기화학 임피던스 분광법(electrochemical impedence spectrometry) 등이 있다. 그러나 이러한 기술들은 큰 시스템 크기와 제한적인 민감도를 갖는 단점이 있었다.
최근에 단일벽 탄소나노튜브(swCNT)-전계효과 트랜지스터(FETs)를 이용한 고민감성 바이오센서에 대한 광범위한 연구가 진행되고 있다. 이러한 예로서 종래 대장균에서 발현된 후각 수용체를 swCNT-FETs소자에 흡착시키는 방법으로 고정화시켜 이를 생체전자코로 이용한 사례가 보고되어 있었다.
그러나, 이러한 방법은 단순한 후각 수용체-향 물질 반응만을 검출할 수 있는 시스템이고, 이러한 방법으로 제조된 상기 생체전자코는 후각 수용체 단백질이 세포막에 삽입되어 있는 기능적 구조의 유지가 어려우며, 후각 수용체를 발현하는 세포에서 향 물질 자극에 의해 유도된 세포내 신호전달의 분석이 가능하지 않다는 문제점이 있었다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 후각 수용체 단백질의 기능적 구조를 유지할 수 있도록 후각 수용체 단백질을 코딩하는 유전자로 형질 전환된 동물 세포로부터 후각 수용체 단백질을 나노 베지클 형태로 제조하는 방법, 이에 의하여 제조된 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노 베지클, 상기 나노 베지클이 표면에 고정화된 단일벽 탄소나노튜브 전계 효과 트랜지스터 및 이를 이용하는 생체전자코를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 위하여,
i)시스테인 잔기를 포함하며, 특정 냄새 물질이 결합하면 중성의 산 형태에서 음으로 대전된 염기 형태로 변화하는 것인 후각 수용체 단백질을 코딩하는 유전자로 동물 세포를 형질 전환하는 단계; ii)상기 동물 세포를 화합물로 처리하여 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노베지클을 분비하도록 하는 단계; 및 iii)상기 분비된 나노베지클을 원심 분리에 의하여 동물 세포로부터 분리하는 단계로 구성되는 후각 수용체 단백질을 코딩하는 유전자로 형질 전환된 동물 세포로부터 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노 베지클을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 후각 수용체 단백질은 구체적으로는 인간 후각 수용체 hOR2AG1 단백질인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 화합물은 사이토칼라신 B 이며, 상기 동물 세포를 화합물로 처리하여 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노베지클을 분비하도록 하는 단계에서는 상기 사이토칼라신을 10 내지 40 ㎍/ml되도록 첨가한 후, 0 내지 300 rpm 의 교반 속도로 10분 내지 40분간 배양하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 이러한 제조방법에 의하여 제조된 평균 입경 150 내지 250 nm 의 크기를 갖는 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노 베지클을 제공한다.
본 발명은 또한, 기판; 상기 기판 상에 서로 이격되어 형성된 소스 전극 및 드레인 전극; 상기 소스 전극 및 드레인 전극과 전기적으로 접촉하며 그 사이에 형성된 나노구조체; 및 상기 소스 전극의 표면, 상기 드레인 전극의 표면 및 상기 나노구조체 표면에 제4항의 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노 베지클이 고정화된 트랜지스터를 제공한다.
본 발명의 트랜지스터에 있어서, 상기 나노구조체는 나노튜브, 나노와이어, 나노로드, 나노리본, 나노필름 및 나노볼로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상의 형태인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 트랜지스터에 있어서, 상기 나노구조체는 단일벽 탄소나노튜브인 트랜지스터인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 트랜지스터를 이용하여 상기 후각 수용체 단백질에 결합되는 냄새물질을 검출하는 생체전자코를 제공한다.
본 발명은 또한, 냄새물질을 노출시키는 단계; 및 상기 생체전자코에 냄새물질 함유 용액 또는 냄새 물질 함유 기체를 접촉시킴으로써 상기 바이오센서의 후각 수용체 단백질과 상기 냄새물질의 결합에 의하여 발생하는 컨덕턴스(conductance) 변화를 측정하는 단계를 포함하는 생체전자코를 이용하는 냄새물질의 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 생체전자코는 생물학적 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노베지클을 이용하여 인간의 후각 시스템을 모방하고 동시에 높은 선택성과 민감성을 보인다. 본 발명에 따른 생체전자코는 선택성이 매우 뛰어나며 민감성의 관점에서도 종래의 전자 코에 비해 적어도 100배 우수하다. 따라서, 이러한 생체전자코를 이용하면, 신속하고 높은 처리량으로 다양한 향 물질을 검출하는 선택적이고 민감한 복합 검출용 대규모의 센서 어레이 실현이 가능해 질 수 있다. 또한, 인간이 향을 느끼는 것과 매우 유사한 반응을 이용하여 여러 가지 향 물질의 선별과 향료산업에서 품질검사 등에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 hOR2AG1을 발현 여부를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏을 실행한 결과를 나타내는 도면이다(모세포의 불용성 분획(lane 1)과, hOR2AG1을 포함하는 나노베지클의 불용성 분획(lane 2))
도 2는 hOR2AG1을 포함하는 나노베지클의 지질막을 세포막 특이적 염색시약으로 염색한 후 공초점형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 3은 hOR2AG1을 포함하는 나노베지클을 주사전자현미경으로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 형질전환된 숙주세포로부터 다량의 나노베지클 제조를 위해 제조과정을 최적화하기 위하여 시약처리 후 배양시간(incubation time), 교반속도(agitation speed), 사이토칼라신 B 농도(concentration of cytochalasin B)의 농도를 조절한 결과를 나타내었다.
도 5는 hOR2AG1을 포함하는 나노베지클에 형광 칼슘 지시제를 도입한 후, 아밀부티레이트(amyl butyrate, AB)자극에 의한 형광 신호를 나타낸 그래프이다.
도 6은 단일벽 탄소나노튜브-FET 센서 제조의 기본 단계를 나타낸다.
도 7은 제조된 상기 단일벽 탄소나노튜브-FETs 표면을 공초점형광현미경을 이용하여 관찰한 형광 이미지를 나타낸다. 적색으로 염색된 나노베지클이 단일벽 탄소나노튜브-FETs 표면에 고르게 고정화되어 있음을 확인할 수 있다.
도 8은 실시예 3에서 제조된 hOR2AG1으로 기능화된 단일벽 탄소나노튜브-FETs에 hOR2AG1에 선택적으로 결합하는 것으로 알려진 향 물질인 아밀부티레이트(amyl butyrate, AB)로 자극한 후 실시간 신호를 분석한 결과를 나타내었다.
도 9는 선택도 실험에 사용한 분자 구조를 각각 나타낸 모식도이다.
도 10은 각각 프로필부티레이트(propyl butyrate), 부틸부티레이트(butyl butyrate), 펜틸발레레이트(pentyl valerate)의 자극에 의해 hOR2AG1으로 기능화된 단일벽 탄소나노튜브-FETs로부터 측정된 신호를 나타낸다.
도 2는 hOR2AG1을 포함하는 나노베지클의 지질막을 세포막 특이적 염색시약으로 염색한 후 공초점형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 3은 hOR2AG1을 포함하는 나노베지클을 주사전자현미경으로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 형질전환된 숙주세포로부터 다량의 나노베지클 제조를 위해 제조과정을 최적화하기 위하여 시약처리 후 배양시간(incubation time), 교반속도(agitation speed), 사이토칼라신 B 농도(concentration of cytochalasin B)의 농도를 조절한 결과를 나타내었다.
도 5는 hOR2AG1을 포함하는 나노베지클에 형광 칼슘 지시제를 도입한 후, 아밀부티레이트(amyl butyrate, AB)자극에 의한 형광 신호를 나타낸 그래프이다.
도 6은 단일벽 탄소나노튜브-FET 센서 제조의 기본 단계를 나타낸다.
도 7은 제조된 상기 단일벽 탄소나노튜브-FETs 표면을 공초점형광현미경을 이용하여 관찰한 형광 이미지를 나타낸다. 적색으로 염색된 나노베지클이 단일벽 탄소나노튜브-FETs 표면에 고르게 고정화되어 있음을 확인할 수 있다.
도 8은 실시예 3에서 제조된 hOR2AG1으로 기능화된 단일벽 탄소나노튜브-FETs에 hOR2AG1에 선택적으로 결합하는 것으로 알려진 향 물질인 아밀부티레이트(amyl butyrate, AB)로 자극한 후 실시간 신호를 분석한 결과를 나타내었다.
도 9는 선택도 실험에 사용한 분자 구조를 각각 나타낸 모식도이다.
도 10은 각각 프로필부티레이트(propyl butyrate), 부틸부티레이트(butyl butyrate), 펜틸발레레이트(pentyl valerate)의 자극에 의해 hOR2AG1으로 기능화된 단일벽 탄소나노튜브-FETs로부터 측정된 신호를 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 상술한 목적, 특징, 및 장점은 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 후술되어 보다 명확해 질 것이며, 그에 따라 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시할 수 있을 것이다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 나노 베지클의 제조
동물 세포로서 포유류 세포인 HEK-293 세포를 사용하였으며, 인간 유래의 후각 수용체 2AG1(hOR2AG1)로 형질 전환하였다.
인간 유래의 후각 수용체 hOR2AG1 유전자를 인간 유전체(human genomic DNA)를 주형으로 사용하여 PCR 증폭시켰다. 다음 hOR2AG1 후각 수용체 유전자를 클로닝 하기 위하여, hOR2AG1 유전자와, 발현된 단백질을 세포막표면으로 유도하는 임포트 시퀀스(import sequence)인 rho-tag를 융합하여 동물발현벡터인 pcDNA3 벡터(Invitrogen)에 클로닝 하여 발현 벡터를 제조하였다. 이와 같이 제조된 벡터를 리포텍타민(lipofectamine, Invitrogen)을 이용하여 포유류 세포인 HEK-293에 형질전환(transfection) 시켰다. 이하 상기 동물 세포에서 hOR2AG1 발현을 위한 실험에서는 DMEM[10% FBS, penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 g/ml)]을 사용하였으며 5 % CO2, 37℃ 조건으로 배양하였다.
세포막에서 hOR2AG1 단백질이 발현되고 있음을 웨스턴 블랏(western blot) 방법을 사용하여 확인하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
숙주세포와 나노베지클의 불용성 부분을 원심분리 방법으로 분획하여 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 상의 전기영동에 의하여 분리하였다. SDS-폴리아크릴아마이드 젤을 니트로셀룰로우스 막(nitrocellulose membrane; Watman)으로 전달하였다. 이 막을 트리톤 X-100을 0.1 vol%를 함유하는 인산염 완충 식염수(PBST, pH 7.4) 중의 5 wt%의 탈지우유로 1시간 동안 차단하였다. 상기 막을 항-FLAG 항체(Cell Signaling) 및 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)와 결합된 항체(GE healthcare)로 처리하였다. 웨스턴 블랏은 향상된 화학발광 검출 키트(ECL kit; GE helthcare)를 이용하여 나타내었다.
도 1의 lane 1는 본 발명에 이용된 hOR2AG1 단백질의 웨스턴 블랏 분석을 나타낸다. 도 1에서 hOR2AG1 단백질이 숙주세포의 세포막에서 과발현(overexpression)되었음을 알 수 있다. 또한, 도 1의 lane 2는 숙주세포로부터 제조된 나노베지클의 웨스턴 블랏 분석을 나타낸다. 도 1의 lane 2 로부터 모세포에서 발현된 hOR2AG1이 나노베지클에 포함되어 있음을 알 수 있다.
<실험예 1> 제조된 나노베지클의 특성 분석
상기 실시예 1에서 제조된 나노베지클의 특성을 형광 분석과 FE-SEM 분석을 수행하여 분석하였다.
숙주세포로부터 제조된 나노베지클이 지질막에 의해 구조를 유지하고 있음을 확인하기 위해 세포막 특이적 염색시약인 DiR (1.25 μg/ml, lipophilic tracker, Molecular Probes)을 사용하여 나노베지클의 지질 부분을 염색하였다. 염색된 나노베지클은 0.1 mg/ml 농도의 poly-D-lysine로 처리된 커버글래스 표면에 고정화된 후, 공초점형광현미경(confocal fluorescence microscope, Nikon)과 주사전자현미경(scanning electron microscope, JEOL)을 이용하여 관찰하였다.
도 2의 공초점형광현미경(confocal fluorescence microscope, Nikon) 사진에서 나노베지클이 구 형태를 이루며 지질막층이 적색으로 염색되어 있음을 확인할 수 있으며, 도 3의 주사전자현미경(scanning electron microscope, JEOL) 사진에서는 숙주 세포로부터 분리된 나노베지클이 200 nm 내외의 크기와 지질막으로 구성된 구 형태를 이루고 있음을 확인하였다.
<실시예 2> 나노 베지클 제조 과정의 최적화
형질전환된 숙주세포로부터 다량의 나노베지클 제조를 위해 제조과정을 최적화하기 위하여 시약처리 후 배양시간(incubation time), 교반속도(agitation speed), 사이토칼라신 B 농도(concentration of cytochalasin B)의 농도를 조절하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 보는 바와 같이 나노베지클 제조를 위한 최적 조건은 20 min 배양시간, 300 rpm의 교반속도, 20 ㎍/ml의 사이토칼라신 B 농도로 확인되었다.
<실험예 2> 제조된 나노베지클의 신호 전달 확인
상기 실시예 1에서 제조된 나노베지클 내에서 향 물질 자극에 의한 신호전달을 확인하기 위하여 향 물질로서, hOR2AG1을 활성화하는 것으로 알려진 아밀부티레이트(amyl butyrate, AB)를 사용하여, 이러한 향 물질 자극에 의해 유발되는 칼슘 의존적 형광 신호는 스펙트로플로로미터를 이용하여 측정하였다.
형광 칼슘 지시제 (fluorescence calcium indicator)로서 Fura 2-AM를 사용하였으며, Fura 2-AM 은 37℃에서 30 분간 인큐베이션 되어 나노베지클 내로 유입되었다. 30분 후 Fura 2-AM을 포함한 인산염 완충 식염수(PBS)는 2 mM의 칼슘을 포함하는 인산염 완충 식염수로 교체되었고, 세포 내로 유입된 Fura 2-AM의 가수분해를 위해 추가적으로 1시간 동안 인큐베이션 하였다.
향 물질 아밀부티레이트(amyl butyrate, AB)의 스톡 1 M 용액을 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 제조하였으며, 인산염 완충 식염수에서 후속적인 1:10 희석에 의하여 추가적인 희석액(10-1 M 내지 10-15 M)을 수득하였다.
도 5는 hOR2AG1을 포함하는 나노베지클에 아밀부티레이트(amyl butyrate, AB)자극에 의해 유발된 형광 신호를 나타낸다. 향 물질인 아밀부티레이트(amyl butyrate, AB)는 1 mM 농도일 때 나노베지클을 자극하였고, 아밀부티레이트(amyl butyrate, AB)와 hOR2AG1의 결합에 의해 유도된 신호전달에 의해 칼슘이 나노베지클 내로 유입되어 형광이 관찰됨을 확인할 수 있었다. 이 같은 결과는 hOR2AG1을 발현하는 숙주세포의 신호전달과정이 나노베지클에도 동일하게 적용됨을 나타낸다.
<실시예 3> 나노베지클의 기반의 swCNT - FETs
<실시예 3-1> 탄소나노튜브 전계 트랜지스터의 제조
단일벽 탄소나노튜브-FET 센서 제조의 기본 단계를 도 6에 도시하였다.
정제된 swCNTs를 20분 동안 초음파 진동으로 1,2-디클로로벤젠에 분산시켜, 단일벽 탄소나노튜브 서스펜젼을 제조하였다. 단일벽 탄소나노튜브 서스펜젼의 일반적 농도는 0.1 mg/ml 이하였다. 단일벽 탄소나노튜브 어셈블리를 위하여, 먼저 OTS SAM을 포토리소그래피 기술을 이용하여 100 nm 두께의 열적 산화막 층(thermal oxide layer)으로 덮힌 축퇴 도핑된 Si 웨이퍼를 포함하는 기판상에 패터닝 하였다. 이렇게 패터닝된 표면을 일반적으로 10 s 동안 상기 서스펜젼 내에 둔 후, 1,2-디클로로벤젠으로 완전히 헹구었다. 통상의 포토리소그래피 후 Pd/Au(10 nm/30 nm) 증착 및 리프트오프(lift-off) 방법에 의하여 접촉 전극을 제조하였다. 소스 전극과 드레인 전극 사이의 간격은 4 ㎛였다.
무극성 말단기를 갖는 옥타데실트리클로로실란(octadecyltrichlorosilane, OTS), 자가조립된 단층(self-assembled monolayer, SAM)를 포토리소그래피를 이용하여 SiO2 표면에 패터닝하였다. 이 기판이 단일벽 탄소나노튜브 용액 (디클로로벤젠 중의 0.1 mg/ml) 에 놓여질 때, 단일벽 탄소나노튜브의 단일층이 선택적으로 노출된 SiO2 상에 선택적으로 흡착되었다. 이후, 전극 (10 nm Pd 상의 30 nm Au)을 포토리소그래피를 이용하여 제조하였다.
<실시예 3-2> 탄소나노튜브 표면에 나노 베지클의 고정화 및 형광 분석
상기 실시예 3-1에서 제조된 단일벽 탄소나노튜브-FETs 표면을 0.1 mg/ml poly D-lysine으로 1시간 동안 코팅한 후 탈이온수로 3회 세척하였다.
상기 실시예 1에서 제조된 hOR2AG1를 포함하는 나노베지클을 1.25 μg/ml DiR로 염색한 후, 0.1 mg/ml poly-D-lysine이 처리된 상기 단일벽 탄소나노튜브-FETs 표면에 고정화하였다.
도 7은 제조된 상기 단일벽 탄소나노튜브-FETs 표면을 공초점형광현미경을 이용하여 관찰한 형광 이미지를 나타낸다. 적색으로 염색된 나노베지클이 swCNT-FETs 표면에 고르게 고정화되어 있음을 확인할 수 있다.
<실험예 3> 향 물질 자극에 의한 후각수용체2AG1 을 포함한 나노베지클로 기능화된 swCNT - FET 소자의 신호측정
상기 실시예 3에서 제조된 hOR2AG1으로 기능화된 swCNT-FETs에 hOR2AG1에 선택적으로 결합하는 것으로 알려진 향 물질인 아밀부티레이트(amyl butyrate, AB)로 자극한 후 실시간 신호를 분석하였으며, 결과를 도 8에 나타내었다.
모든 실험은 2 mM 칼슘을 포함하는 인산염 완충 식염수를 나노베지클로 기능화된 swCNT-FETs 상에 놓고 이에 9 ℓ의 인산염 완충 식염수(2 mM 칼슘 포함)를 도입한 후에 소스-드레인 전류(source-drain current)를 모니터링 하였고, 전기적 측정 중 모든 시간에서 100 mV의 바이어스 전압이 유지되었다. 모든 신호는 swCNT-FETs 센서의 소스-드레인 전류의 시간 의존성으로부터 얻어졌다.
도 8에서 보는 바와 같이 아밀부티레이트의 자극에 대하여 hOR2AG1을 포함하는 나노베지클로 기능화된 단일벽 탄소나노튜브-FETs는 10-15 M의 아밀부티레이트에 반응함으로서 펨토몰 농도(femto-molar concentration) 수준의 민감도를 보였다(도 8, 파란선). 이는 형광 측정기법을 이용한 나노베지클의 AB검출농도인 10-3 M보다 1012 M배가 더 높은 농도이다. 반면 hOR2AG1을 포함하지 않는 나노베지클로 기능화된 swCNT-FETs에서는 반응이 측정되지 않았다(도 8, 적색선).
또한 칼슘을 포함하지 않는 인산염 완충 식염수를 버퍼로 사용한 단일벽 탄소나노튜브-FETs 센서에서는 전기적 신호가 관찰되지 않음을 볼 때(도 8, 녹색선), 본 생체전자코에서 발생되는 전기적 신호는 아밀부티레이트(amyl butyrate, AB)의 자극에 의해 유도된 나노베지클의 신호전달에 의해 발생됨을 확인할 수 있었다.
또한 나노베지클에 신호전달에 의한 반응성을 확인하기 위해 칼슘채널의 저해제로 알려진 MgCl2(10 mM)를 처리한 후 아밀부티레이트(amyl butyrate, AB)를 자극하였다. 본 실험을 통해 전기적 신호가 발생하지 않음을 확인하였고 이는 아밀부티레이트(amyl butyrate, AB)와 hOR2AG1의 결합에 의한 신호전달에도 불구하고 MgCl2의 칼슘채널의 저해 작용에 의해 나노베지클 내로 칼슘의 유입이 억제되었기 때문으로 사료된다(도 8, 검은선).
따라서, 본 발명에 의한 생체전자코가 나노베지클 내의 신호전달에 의해 신호가 발생하며 이는 인간의 후각 시스템과 유사하게 후각을 재현함을 나타낸다. 또한 민감도 실험을 통해 종래의 생체전자코에 비하여 최소한 100배 우수한 검지능을 보임을 증명하였다.
<실험예 4> 후각수용체2AG1 을 포함한 나노베지클로 기능화된 swCNT - FET 소자의 선택도 확인
본 실시예에서는 hOR2AG1에 선택적으로 결합하는 아밀부티레이트(amyl butyrate, AB)외에 다른 향 물질의 자극에 의한 hOR2AG1이 포함된 나노베지클로 기능화된 swCNT-FET의 신호를 분석하여 생체전자코의 선택성을 확인하였다.
도 9는 선택도 실험에 사용한 분자 구조를 각각 나타낸 모식도이며, 도 10은 각각 프로필부티레이트(propyl butyrate), 부틸부티레이트(butyl butyrate), 펜틸발레레이트(pentyl valerate)의 자극에 의해 hOR2AG1으로 기능화된 swCNT-FETs로부터 측정된 신호를 나타낸다.
각각의 향 물질은 특이적으로 결합하는 아밀부티레이트(amyl butyrate, AB)와 매우 유사한 분자구조를 가지며, 탄소 원자의 수가 1-2개 차이 나는 분자구조를 가지고 있지만, 아밀부티레이트(amyl butyrate, AB)가 10-15 M의 검지한계를 보인 것에 비해, 밀리몰 수준의 자극에도 반응이 검출되지 않음을 확인할 때, 본 발명에 따른 생체전자코가 매우 높은 선택도를 갖고 있음을 증명하였다.
Claims (9)
- i)후각 수용체 단백질을 코딩하는 유전자로 동물 세포를 형질 전환하는 단계;
ii)상기 동물 세포를 화합물로 처리하여 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노베지클을 분비하도록 하는 단계; 및
iii)상기 분비된 나노베지클을 원심 분리에 의하여 동물 세포로부터 분리하는 단계로 구성되는 후각 수용체 단백질을 코딩하는 유전자로 형질 전환된 동물 세포로부터 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노 베지클을 제조하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 후각 수용체 단백질은 시스테인 잔기를 포함하며, 특정 냄새 물질이 결합하면 중성의 산 형태에서 음으로 대전된 염기 형태로 변화하는 인간 후각 수용체 hOR2AG1 단백질인 것인 후각 수용체 단백질을 코딩하는 유전자로 형질 전환된 동물 세포로부터 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노 베지클을 제조하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 ii)의 동물 세포를 화합물로 처리하여 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노베지클을 분비하도록 하는 단계에서의 상기 화합물은 사이토칼라신 B 이며, 상기 사이토칼라신을 10 내지 40 ㎍/ml되도록 첨가한 후, 0 내지 300 rpm 의 교반 속도로 10분 내지 40분간 배양하는 것인 후각 수용체 단백질을 코딩하는 유전자로 형질 전환된 동물 세포로부터 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노 베지클을 제조하는 방법. - 제1항 내지 제3항에 의하여 제조되고, 평균 입경 150 내지 250 nm 의 크기를 갖는 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노 베지클.
- 기판;
상기 기판 상에 서로 이격되어 형성된 소스 전극 및 드레인 전극;
상기 소스 전극 및 드레인 전극과 전기적으로 접촉하며 그 사이에 형성된
나노구조체; 및
상기 소스 전극의 표면, 상기 드레인 전극의 표면 및 상기 나노구조체 표면에 제4항의 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노 베지클이 고정화된 트랜지스터. - 제5항에 있어서,
상기 나노구조체는 나노튜브, 나노와이어, 나노로드, 나노리본, 나노필름 및 나노볼로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상의 형태인 트랜지스터. - 제5항에 있어서,
상기 나노구조체는 단일벽 탄소나노튜브인 것을 특징으로 하는 트랜지스터. - 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 트랜지스터를 이용하여 상기 후각 수용체 단백질에 결합되는 냄새물질을 검출하는 생체전자코.
- 제8항에 따른 생체전자코에 냄새물질을 노출시키는 단계; 및
상기 생체전자코에 냄새물질 함유 용액 또는 냄새물질 함유 기체를 접촉시킴으로써 상기 바이오센서의 후각 수용체 단백질과 상기 냄새물질의 결합에 의하여 발생하는 컨덕턴스(conductance) 변화를 측정하는 단계를 포함하는 제7항에 따른 생체전자코를 이용하는 냄새물질의 검출방법.
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| WO2015037768A1 (ko) * | 2013-09-16 | 2015-03-19 | 서울대학교 산학협력단 | 이종이합체 g 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서, 이의 제조 방법 |
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