WO2015037768A1 - 이종이합체 g 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서, 이의 제조 방법 - Google Patents

이종이합체 g 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서, 이의 제조 방법 Download PDF

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receptor
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홍승훈
송현석
진혜준
안세련
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Definitions

  • the present invention relates to a nanovesicle comprising a heterodimeric G protein-linked receptor, a method for preparing the same, and a field effect transistor based taste sensor including the same, and a method for manufacturing the same.
  • opsin acts as a receptor that accepts light signals for transmission to visual neurons (Fesenko, EE et al., Nature, 310-313 (1985); Nathans, J. et al. , Cell, 807-814 (1983); Berridge, MJ et al., Nature, 315-321 (1984); Nathans, J. et al., Science, 193-202 (1986)). It has recently been shown that olfactory receptors interact with odorant molecules at the surface of the villi (Buck, L. et al., Cell, 175-187 (1991)).
  • G proteins are heterotrimeric GTP-binding proteins that couple receptors and effectors in numerous signaling processes (Shapiro, RA et al., J. Biol. Chem., 18397-18403 (1988) Dixon, RAF et al., EMBO J., 3269-3275 (1987); Karnik, SS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8459-8463 (1988); Karnik, SS et al. , J. Biol. Chem., 17520-17524 (1990)).
  • G protein coupled proteins It has been accepted that visual and olfactory signaling is usually initiated by the action of G protein coupled proteins.
  • molecular biological studies of taste receptors have not been made compared to visual and olfactory senses, and physiological studies have shown that signals stimulated by tastetant molecules are primarily the fungiform of the tongue. It is known to begin in the taste pores on the surface of taste cells in papillae, folate papillae and citruvallate papillae.
  • taste ligands depolarize or hyperpolarize taste cells to regulate the release of neurotransmitters from taste cells, and adjacent taste cells are correlated with each other. It modulates the signals that are transmitted to the cardiac nerve.
  • Taste receptor proteins such as sweetness, is a type of G protein-linked receptor (GPCR) that is a protein that passes through the membrane seven times and may exist on the surface of, or within and across, the lipid bilayer.
  • GPCR G protein-linked receptor
  • Taste is categorized into four categories, namely, salty, sour, sweet, and bitter, depending on the stimulating taste.
  • the molecular mechanisms of the taste signal transmission are only partially known.
  • the salty taste is due to Na ions flowing through the Na channels, and the sourness is mediated by the H ion blockage of the K and Na channels, and in the case of bitter and sweet tastes, it depends on the guanine nucleotide-binding protein (G protein) dependent mechanism.
  • G protein guanine nucleotide-binding protein
  • bitter compounds as a G-linked receptor, bitter compounds induce Ca 2+ ion release from internal reservoirs, where G-proteins are known to be involved.
  • sweet compounds produce GTP-dependently cyclic AMP (cAMP) in the tongue membrane (Striem, BJ et al., Biochem, J., 121-126 (1989): Striem , BJ et al., Chem. Senses, 529-536 (1990)).
  • cAMP GTP-dependently cyclic AMP
  • Microinjecation of cAMP into micro cells not only inactivates the K + pathway but also causes depolarization (Gubler, U, et al., Gene (Amst.), 263-269 (1983); Hanahan, D., J. Mol. Biol., 557-580 (1983); Hattori, M. et al., Anal.
  • adenylyl cyclase adenylyl
  • cAMP-PDE phosphodiesterase
  • Korean Patent No. 10-09579722 which is an invention of a taste recognition device having a lipid molecular membrane and outputting an electric signal representing taste information.
  • Korean Patent No. 10-09579722 discloses a single-walled carbon nanotube-field effect transistor comprising a hTAS2R type bitter receptor protein.
  • An object of the present invention is to provide a nano-vesicle comprising a heterodimeric G protein-linked receptor as a sweet receptor protein and a method for producing the same in order to solve the above problems.
  • Another object of the present invention is to provide a field effect transistor based taste sensor including the nanovesicle and a method of manufacturing the same.
  • the present invention to solve the above problems
  • FIG. 1 shows a method for producing a nanovesicle comprising a heterodimeric G protein-linked receptor according to the present invention.
  • the heterodimeric G protein coupled receptor (heterodimeric G Protein coupled Receptor) is characterized in that it comprises two genes selected from the group consisting of hTAS1R1, hTAS1R2 and hTAS1R3.
  • the TAS1R taste receptor population known to encode sweet and umami receptors, consists of three genes: TAS1R1, TAS1R2, and TAS1R3.
  • genes form heterodimers and encode receptors for each taste, and isoforms of TAS1R1 and TAS1R3 genes are umami receptors, and variants of TAS1R2 and TAS1R3 genes are known to act as sweet receptors.
  • the heterodimeric G protein-linked receptor is a heterodimeric G protein-linked receptor consisting of hTAS1R2 and hTAS1R3.
  • the heterodimeric G protein linking receptor (heterodimeric GPCR) consisting of hTAS1R2 and hTAS1R3 comprises a signaling system such as G protein, adenylyl cyclase, ion channel.
  • the heterodimeric G protein-linked receptor causes intracellular signal transduction due to the binding of the sweetener and the sweet receptor to increase the level of cAMP, resulting in Ca 2+ accumulation in the nanovesicle. 2+ concentrations are known to increase.
  • the nanovesicle manufacturing method of the present invention may further comprise the step of adding a compound having an ester group in the step a), for example Fura 2-AM (acetoxymethyl) may be used.
  • a compound having an ester group in the step a for example Fura 2-AM (acetoxymethyl) may be used.
  • There is a non-specific esterase in the cell such non-specific esterase hydrolyzes the AM ester group to transform the cell into a form sensitive to Ca 2+ .
  • the compound of step b) is characterized in that the cytochalasin B (cytochalasin B).
  • the animal cell of step a) is characterized in that the human embryonic kidney-293 (HEK-293) cell line expressing a sweet substance receptor protein.
  • HEK-293 human embryonic kidney-293
  • the present invention also provides a nanovesicle comprising a heterodimeric G protein-linked receptor prepared by the production method of the present invention.
  • the size of the nano-vesicle is preferably 100 to 250nm. Within the range of the size of the nanovesicles, the nanovesicles can sufficiently adsorb the nanostructures, and a sufficient area for detecting sweet substances can be secured.
  • the nanovesicles of the present invention are much smaller in size than cells, but have similar intracellular signaling functions, and are easier to store than cells and are suitable for nanodevice fabrication.
  • the nanovesicles of 100 to 250nm size are immobilized on the substrate, and in the process, amide bonds of carbon nanotubes and nanovesicles are formed, and the size of the nanovesicles fixed during the formation of the bonds is nanovesicles. Becomes smaller at the stage of preparation.
  • the present invention also provides
  • a source electrode and a drain electrode formed spaced apart from each other on the substrate;
  • a nanostructure in electrical contact with the source electrode and the drain electrode and for surface modification of the substrate between the source electrode and the drain electrode;
  • a field effect transistor-based taste sensor comprising a; a nano-vesicle comprising a heterodimeric G protein coupled receptor (heterodimeric G Protein Coupled Receptor) according to the present invention fixed to the nanostructure.
  • a heterodimeric G protein coupled receptor heterodimeric G Protein Coupled Receptor
  • the present invention also provides
  • the method of manufacturing a field effect transistor based taste sensor according to the present invention may further include surface modifying the substrate surface with an amine group.
  • the surface modification of the amine group comprises 3-aminopropylmethyldimethoxysilane, 3- (2-aminoethyl) aminopropyltrimethoxysilane, 3- (2-aminoethyl) aminopropylmethyldimethoxysilane and 3-anyl Amine group-containing silane coupling selected from the group consisting of linopropyltrimethoxysilane, N-phenyl-3-aminopropyltrimethoxysilane, 3-aminopropylmethyldiethoxysilane, and 3-aminopropyltriethoxysilane Can be zeroed.
  • a field effect transistor based taste sensor it is possible to further include surface modifying the surface of the nanostructure with a material including a pyrene and an amine group structure.
  • the material containing the pyrene and amine group structure is selected from the group consisting of pyrene methylamine, 1-aminopyrene, pyrenebutyric succinimide ester (PSE) It can be characterized by one or more.
  • the surface-modified substrate may be immersed in a nanostructure-containing solution or exposed to a nanostructure-containing gas to form a nanostructure on the substrate.
  • the nanostructures may be in the form of nanotubes, nanowires, nanorods, nanoribbons, nanofilms or nanoballs.
  • a nanovesicle comprising a heterodimeric G Protein Coupled Receptor according to the present invention is immobilized on a surface of the surface-modified nanostructure. Let's do it.
  • the step of fixing the nanovesicle comprising a heterodimeric G Protein Coupled Receptor according to the present invention on the surface of the surface-modified nanostructure is a heterodimeric G Protein Coupled Receptor After spreading the nanovesicle-containing solution containing on the surface of the nanostructure surface, it can be made by fixing the sweet receptor protein by drying.
  • the present invention also comprises the steps of exposing a sweet substance to the taste sensor according to the;
  • the sweet substance can be detected by contacting the sweet substance containing solution or the sweet substance containing gas with a field effect transistor based taste sensor.
  • the G protein-linked receptor composed of the human taste receptors hTAS1R2 and hTAS1R3 and a sweet substance are combined to generate cations into the nanovesicle through the cAMP pathway, causing a change in conductance. .
  • Natural sugar sucrose, fructose, glucose, maltose, lactose
  • sweet amino acids D-tryptophan
  • various sweeteners such as asparmane, saccharin, acesulfame K, cyclamate and sucralose can be detected.
  • Field effect transistors and taste sensors functionalized with nano-vesicles comprising heterodimeric G protein-linked receptors according to the present invention have excellent sensitivity and selectivity using G protein-linked receptors and are highly specific sweet substances up to ⁇ M range in real time. Can be detected.
  • FIG. 1 illustrates a method of manufacturing a field effect transistor based taste sensor including a nanovesicle comprising a heterodimeric G protein linking receptor and a nanovesicle including a G protein linking receptor according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 (a) is a result of measuring the expression of G protein-linked receptors using Western blot analysis in nanovesicles and transformed cells containing heterodimeric G protein-linked receptors according to an embodiment of the present invention .
  • Figure 2 (b) is a fluorescent photograph of a confocal fluorescent microscope to express the expression of the heterodimeric G protein-linked receptor in the transformed cells and nanovesicles comprising a heterodimeric G protein-linked receptor according to an embodiment of the present invention It shows the measured a result.
  • Figure 2 (c) shows the magnitude of the response by sucrose stimulation of transformed cells comprising a heterodimeric G protein-linked receptor according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 (d) is measured by Western blot analysis whether the expression of the heterodimeric G protein-linked receptor in the transformed cells and nanovesicles comprising a heterodimeric G protein-linked receptor according to an embodiment of the present invention The results are shown.
  • Figure 2 (e) shows the size distribution of the nanovesicles containing the G-dimeric G protein-linked receptor measured using the DLS analysis according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 (f) shows the magnitude of the response by the stimulation of sugar (sucrose) of the nano-vesicle comprising a heterodimeric G protein-linked receptor prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 (a) is a schematic diagram showing the taste detection mechanism of the nano-vesicle-based field effect transistor comprising a heterodimeric G protein linking receptor prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 (b) shows a SEM photograph of the nano-vesicles immobilized on the carbon nanotubes in the nano-vesicle-based field effect transistor comprising a heterodimeric G protein-linked receptor prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 (c) shows the response results measured while varying the size of the taste stimulus over time in the nanovesicle-based field effect transistor comprising a heterodimeric G protein-linked receptor prepared according to an embodiment of the present invention will be.
  • Figure 3 (d) shows the response according to the concentration of sweet stimulation of the field effect transistor-based taste sensor manufactured according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 shows the selectivity experiment results of the field effect transistor-based taste sensor manufactured according to an embodiment of the present invention.
  • Example 1 Containing Sweet Matter Receptor Proteins (hTAS1R2 and hTAS1R3) Fabrication of Nano Vegicles
  • heterodimeric G protein-linked receptor consisting of hTAS1R2 and hTAS1R3 linked to the HA-tag gene at the N-terminus was inserted into the pCMV6 vector. This was rounded and amplified by PCR.
  • PCR was carried out using a Taq polymerase mixture (1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM dNTPs, 0.5 mM of each primer, 100 ng plasmid), followed by 35 cycles of 94 ° C. 5 min, 55 ° C. 30 sec, and 72 ° C. 1 min 35 times.
  • the obtained PCR products were separated by treatment with Kpn I and Xho I restriction enzymes and then dissolved by gel electrophoresis.
  • the gene of the heterodimeric receptor consisting of hTAS1R2 and hTAS1R3 containing the amplified HA-tag was subcloned into the pCMV6 vector.
  • the pCMV6 vector has a DsRed gene at the C-terminal multicloning site and the target gene is expressed as a DsRed binding protein. Correct cloning was confirmed by DNA sequencing.
  • Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) was used to transform HEK-293 cell lines with the pCMV6 vector cloned with hTAS1R2 and hTAS1R3 prepared in Example 1-1.
  • HEK-293 cell lines transformed with hTAS1R2 and hTAS1R3 stably expressing hTAS1R2 and hTAS1R3 were constructed by selective isolation process through G-418.
  • the transformed cells were replaced with a culture solution containing G-418 (1 mg / ml) after 1 day and incubated for 14 days.
  • Colonies expressing heterodimers consisting of hTAS1R2 and hTAS1R3 were generated and transferred only to these cultures containing G-418 (0.5 mg / ml) by DsRed fluorescence.
  • Cells stabilized and cultured in culture were resuspended in Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS; Gibco, USA) treated with Trypsine-EDTA (TE; Gibco, USA) for 5 minutes under cold conditions with ice (on time: 3 seconds, off time: 5 seconds).
  • the sonication was centrifuged at 12000 rpm, 4 ° C for 30 minutes, and the pellet was finally resuspended at a concentration of 1000 ng mL -1 and stored at -80 ° C.
  • Transformed cells with hTAS1R2 and hTAS1R3 cultured in Example 1-2 were treated with cytochalasin B (20 g / ml) and incubated for 20 minutes at 37 ° C. at 300 rpm.
  • Centrifugation was carried out for 20 minutes at 1,000 ⁇ g to separate the remaining cell body and nanovesicles.
  • the obtained supernatant contains nanovesicles, and the pellet obtained by centrifugation at 15,000 ⁇ g for 30 minutes was added with DPBS to add a protease inhibitor cocktail (Sigma Aldrich, USA). Resuspended by The nanovesicles thus produced were used immediately or stored at -80 ° C for use within a few weeks.
  • the diameters of the nanovesicles were 100 nm to 250 nm, and the average was 150 nm.
  • Transformed cells were mixed with sample buffer (10% dosium dodecyl sulfate, 10% ⁇ -mercaptanol, 0.3 M Tris-HCl (pH 6.8), 0.05% bromophenol blue, 50% glycerol) and mixed at 0 ° C., at 50 ° C. Incubated for 2 hours.
  • sample buffer 10% dosium dodecyl sulfate, 10% ⁇ -mercaptanol, 0.3 M Tris-HCl (pH 6.8), 0.05% bromophenol blue, 50% glycerol
  • the sample was loaded onto a 10% PAGE gel and set to a constant voltage of 80 V upon electrophoresis. Proteins in the gels were represented by 0.02% coomassie-blue staining solution.
  • the protein in the gel was transferred to a nitrocellulose membrane and incubated for 2 hours in PBS-T (PBS dissolved in 0.1% Tween-20) in which 5% skim milk was dissolved for
  • Blocked membranes were incubated with anti-GST antibody (diluted 1% skim milk on PBS-Tween at 1: 2000) for 1 hour at room temperature, and the After washing with PBS-Tween for 10 minutes 5 times.
  • the membrane-treated antibody was incubated with HRP-conjugated antibody (diluted 5% skim milk on PBS-T at 1: 2,500), and then washed 5 times with PBS-Tween for 10 minutes.
  • Western blots were shown using an improved chemiluminescence detection kit (ECL: GE helthcare).
  • the transformed HEK-293 cell line was incubated for at least 3 days, and 5 ⁇ m Fura 2-AM (acetoxymethyl) (calcium indicator, Invitrogen) was added to the imaging buffer solution (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, MgCl 2 1 mM, CaCl 2 2 mM, HEPES). 10 mM, Glucose 10 mM, 0.1% Pluronic F-127, pH 7.4).
  • Nonspecific esterases present in cells hydrolyze the AM ester groups to convert them into forms sensitive to Ca 2+ . After incubation at 37 ° C. for 30 minutes, the cells were washed three times with the same buffer solution and incubated at 37 ° C. for 1 hour to remove AM ester groups by intracellular esterase.
  • the ligand and ATP (100 uM) for Ca 2+ dependent fluorescence signal were given double stimulation (340 nm, 380 nm) and the fluorescence signal by Ca 2+ at 510 nm was spectrophotometer It was measured by a (spectrofluorophotometer). The fluorescence signal was obtained at 2 second intervals, and the final result was expressed as the ratio of fluorescence intensity obtained by giving a double stimulus.
  • FIG. 1 The structure of the field effect transistor based taste sensor manufactured by the present invention is schematically illustrated in FIG.
  • Single-walled carbon nanotubes (swCNT) (2.5mg, Hanwha) were dispersed in 1,2-dichlorobenzene (50ml) using ultrasonic vibration for 20 minutes, and the suspension of 0.05mg / ml Prepared.
  • An octadecyltrichlorosilane (OTS) self-assembled monolayer (SAM) having a nonpolar end group was patterned by photolithography on a SiO 2 (1000 A) substrate. The patterned substrate was placed in the single wall carbon nanotube suspension for about 10 seconds and rinsed with 1,2-dichlorobenzene. In this process, a single layer of single-walled carbon nanotubes was selectively adsorbed onto exposed SiO 2 substrates without OTS formation.
  • Contact electrodes were fabricated by Pd / Au (10 nm / 30 nm) evaporation and lift-off methods. The gap spacing between the source electrode and the drain electrode was 20 mm. Passivation of the electrode with photoresist (AZ 5214) using photolithography, and modification of single-walled carbon nanotube surfaces with amine groups using pyrenebutyric acid succinimide ester (PSE) The cleats were immobilized. The pyrenyl group of the pyrenebutyric acid succinimide ester (PSE) interacts with graphite on the sidewalls of the carbon nanotubes through ⁇ stacking. Nanovesicles containing the sweet substance receptor according to the present invention is fixed to the surface of the carbon nanotubes modified on the field effect transistor substrate surface by the peptide bond.
  • Nanovesicles containing the sweetener receptor proteins (hTAS1R2 and hTAS1R3) collected in Example 1 were evenly spread out to cover the single-walled carbon nanotubes and the electrode and vacuum dried for about 4 hours to give the sweetener receptor proteins (hTAS1R2 and hTAS1R3)
  • field effect transistors functionalized with human sweet substance receptors were prepared.
  • the surface of the nano-vesicle-based field effect transistor prepared in Example 2 was lyophilized with Pt and shown in FIG. 3 (b) using a field-emission scanning electron microscope (FE-SEM). It was. It can be seen from FIG. 3 (b) that the spherical nanovesicles were immobilized on the single-walled carbon nanotubes, and the diameter of the immobilized nanovesicles was reduced compared to when the cells were separated from the cells.
  • FE-SEM field-emission scanning electron microscope
  • the dilutions were exposed to the nanovesicle-based field effect transistor prepared in Example 2, and the magnitude of the reaction was confirmed by measuring the current flowing between the source electrode and the drain electrode in real time.
  • Sensitivity to the sweet substance was measured in real time ⁇ G / G 0 value of the nano-vesicle-based field effect transistor for sugar (sucrose), the results are shown in Figure 3 (c).
  • the signal generated by the taste sensor according to the present invention decreased at 100 uM sucrose concentration and rapidly decreased at 500 uM sucrose concentration.
  • the response curves of the nano-vesicle based field effect transistors with various concentrations of sugar were matched with the hill equation shown below in the range of 100 uM to 10 mM and the results are shown in FIG. It was.
  • the solid line in FIG. 3 (d) represents a conventionally known hill equation, and the reaction according to the concentration according to the embodiment of the present invention is represented by a dot in FIG. 3 (d).
  • the nano-vesicle-based field effect transistor when using the nano-vesicle-based field effect transistor can be detected at a concentration about 10 times lower than the cell-based sweet substance detection results, it can be seen that the sensitivity is improved.
  • sugar sucrose
  • aspartame cell
  • cellobios cellobios
  • saccharin saccharin
  • D- A glucuronic acid material was prepared and exposed to the field effect transistor based taste sensor prepared in Example 2 above.
  • a reaction similar to that of human sweetness can be exhibited. It can be used in various fields such as medical industry, medicine, food and environment.

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Abstract

본 발명은 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서, 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클로 기능화된 전계효과 트랜지스터 및 미각 센서는 이종이합체 G 단백질 연결 수용체 및 이를 포함하는 나노베지클을 이용하여, 민감도 및 선택도가 우수하고 실시간으로 고특이적으로 단맛 물질을 검출할 수 있다.

Description

이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서, 이의 제조 방법
본 발명은 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서, 이의 제조 방법에 관한 것이다.
인간의 여러 다양한 감각체계는 수많은 자극을 인지하며 자극의 세기 또한 구별할 수 있다. 시각 체계에서는 옵신(opsin)이 시각 뉴론으로 전달하기 위한 빛의 신호를 받아들이는 수용체(receptor)로서 작용하며 (Fesenko, E.E. et al., Nature , 310-313(1985); Nathans, J. et al., Cell , 807-814(1983); Berridge, M.J. et al., Nature , 315-321(1984); Nathans, J. et al., Science , 193-202(1986)), 후각에서는 취기물질(odorant)분자와 융모표면에서 상호 작용하는 후각 수용체가 존재한다는 것이 최근 밝혀졌다(Buck, L. et al., Cell , 175-187(1991)). 이들 시각 및 후각 체계 수용체의 특징은 7개의 막통과 도메인 모티프(transmembrane domain motifs)를 가진다는 것과 GTP-결합 단백질(G 단백질)과 결합되어 있다는 것이다. G 단백질들은 수많은 신호전달 과정에서 수용체와 효과기 (effector)를 연결(couple)시키는 이종삼원성(heterotrimeric) GTP-결합 단백질이다(Shapiro, R.A. et al., J. Biol. Chem. , 18397-18403(1988); Dixon, R.A. F. et al., EMBO J. , 3269-3275(1987); Karnik, S.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 8459-8463(1988); Karnik, S.S. et al., J. Biol. Chem. , 17520-17524 (1990)).
시각 및 후각 신호 전달은 일반적으로 G 단백질-연결 수용체(G protein coupled protein) 들의 작용에 의해 시작된다는 제안이 받아들여지고 있다. 그러나, 미각 수용체들에 대한 분자 생물학적 연구는 시각 및 후각에 비해 이루어지지 않고 있으며, 생리학적 연구에 의해 밝혀진 것에 따르면 미각 촉진물질(tastant) 분자들에 의해 자극된 신호는 우선 혀의 용상유두(fungiform papillae), 엽상유두(foliate papillae) 및 유곽유두 (cirumvallate papillae)에 있는 미각 세포(taste cell)들 표면의 미공(taste pore)에서 시작되는 것으로 알려져 있다. 이곳에서 여러 미각 리간드(taste ligand)들이 미각 세포들로부터 신경전달물질(neurotransmitter)의 방출을 조절하기 위해 미각 세포들을 탈분극(depolariza tion)시키거나 과분극(hyperpolarization)시키며, 인접 미각 세포들이 상호연관되어 구심성 미신경으로 전달되는 신호를 조절한다. 단맛 등의 미각 수용체 단백질은 G 단백질 연결 수용체(GPCR)의 한 종류로, 막을 일곱 번 통과하는 단백질로서, 지질 이중막의 표면, 또는 내부 또는 표면과 내부에 걸쳐 존재할 수 있다.
맛은 자극하는 맛에 따라 짠맛, 신맛, 단맛, 쓴맛 등 4가지로 크게 분류되는데, 이들의 맛 신호 전달에 대한 분자적 기작은 부분적으로 알려져 있을 뿐이다. 짠맛의 경우 Na 통로(channels)를 통해 흐르는 Na 이온 때문이며, 신맛은 K , Na 통로의 H 이온 봉쇄(blockage)에 의해 매개되며, 쓴맛과 단맛의 경우에는 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질(G 단백질) 의존적 메카니즘에 의해 매개된다 (Kinnamon, S.C., Trends Neurosci, , 491-496(1988); Avenet, P. et al., J. Membrane Biol. , 1-8(1989); Roper, S.D., Ann. Rev. Neurosci. , 329-353(1989)).
쓴맛의 경우는 G-결합된 수용체로서, 쓴 화합물은 내부 저장소에서 Ca2+ 이온 방출을 유도하며 이때 G-단백질이 관련되는 것으로 알려졌다.
단맛의 경우, 단맛 화합물은 설막(tongue membrane)에서 사이클릭(cyclic) AMP(cAMP)를 GTP-의존적으로 생성시킨다(Striem, B.J. et al., Biochem, J. , 121-126(1989): Striem, B.J. et al., Chem. Senses , 529-536(1990)). cAMP를 미세포에 미량주입 (microinjec tion)하면 K+ 통로를 불활성화시킬 뿐만 아니라 탈분극을 일으키며(Gubler, U, et al., Gene(Amst.) , 263-269(1983); Hanahan, D., J. Mol. Biol. , 557-580(1983); Hattori, M. et al., Anal. Biochem. , 232-238(1986)), 미조직(taste tissue)에서는 매우 높게 아데닐릴 사이클라제(adenylyl cyclase)와 cAMP- PDE(phosphodiesterase)가 발견되는데, 이것은 단맛 수용체의 활성화가 미각 G 단백질과 관련하여 세포를 탈분극시키는 변환 경로(transduction pathway)를 통해 cAMP의 수준을 증가시킨다는 것을 시사한다.
미각 센서로는 지질 분자막을 가지며, 맛 정보를 나타내는 전기 신호를 출력하는 맛 인식 장치에 대한 발명인 대한민국 등록특허 10-09579722가 공지되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 10-09579722에는 hTAS2R류 쓴맛 수용체 단백질을 포함하는 단일벽 탄소나노튜브-전계효과 트랜지스터가 공지되어 있다.
그러나, 상기와 같은 종래 기술의 경우 미각 수용체 단백질로서 단일 G 단백질만을 포함하였을 뿐, 이종이합체 G 단백질 연결 수용체(heterodimeric GPCR)를 포함하는 미각 센서에 대해서는 알려진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 단맛 수용체 단백질로서 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클 및 이의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 나노베지클을 포함하는 전계 효과 트랜지스터 기반 미각 센서 및 이의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여
a) 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 코딩하는 유전자로 동물 세포를 형질전환 하는 단계;
b) 상기 동물 세포를 화합물로 처리하여 미각 수용체 단백질을 포함하는 나노베지클을 분비하도록 하는 단계; 및
c) 상기 분비된 나노베지클을 동물 세포로부터 분리하는 단계;를 포함하는 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 의한 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클의 제조방법을 도 1에 나타내었다
본 발명에 의한 미각 센서에 있어서, 상기 이종이합체 G 단백질 연결 수용체(heterodimeric G Protein coupled Receptor)는 hTAS1R1, hTAS1R2 및 hTAS1R3로 이루어진 그룹에서 선택되는 2개의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다. 단맛과 감칠맛 수용체를 암호화 한다고 알려져 있는 TAS1R 맛 수용체 집단은 TAS1R1, TAS1R2, 그리고 TAS1R3 총 3 개의 유전자로 이루어져 있다. 통상 유전자들은 이종이합체(heterodimer) 형태를 이루어 각 맛의 수용체를 암호화하는데, TAS1R1 유전자와 TAS1R3 유전자의 이형체는 감칠맛 수용체로, TAS1R2 유전자와 TAS1R3 유전자의 이형체는 단맛 수용체로 작용하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 이종이합체 G 단백질 연결 수용체는 hTAS1R2 및 hTAS1R3으로 이루어지는 이종이합체 G 단백질 연결 수용체 인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 실시예에서 hTAS1R2 및 hTAS1R3으로 이루어지는 이종이합체 G 단백질 연결 수용체(heterodimeric GPCR) 는 G 단백질, 아데닐릴 사이클라제, 이온 채널과 같은 신호 시스템을 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 이종이합체 G 단백질 연결 수용체는 단맛 물질과 단맛 수용체의 결합에 따른 세포 내 신호 전달이 일어나 cAMP의 레벨을 높여주어, 결과적으로 나노베지클 내 Ca2+ 이 축적되어 Ca2+ 농도가 높아지는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 나노베지클 제조 방법에 있어서, 상기 a) 단계에 에스테르기를 가지는 화합물을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어 Fura 2-AM(acetoxymethyl) 를 사용할 수 있다. 세포내에는 비특이적인 에스테라제가 존재하며, 이와 같은 비특이적인 에스테라제는 AM 에스테르기를 가수분해하여 세포를 Ca2+에 민감한 형태로 바꾸어준다.
본 발명의 나노베지클 제조 방법에 있어서, 상기 b) 단계의 화합물은 사이토칼라신 B(cytochalasin B)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 나노베지클 제조 방법에 있어서, 상기 a) 단계의 동물 세포는 단맛 물질 수용체 단백질을 발현하는 인간배아신장-293(human embryonic kidney-293, HEK-293) 세포주인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 제조 방법에 의하여 제조된 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 나노베지클의 크기는 100 내지 250nm 인 것이 바람직하다. 나노베지클의 크기가 상기 범위 내에서 나노베지클이 나노구조체에 충분히 흡착할 수 있으며, 단맛 물질을 검출하기 위한 영역을 충분히 확보할 수 있다.
본 발명의 나노베지클은 세포에 비해 사이즈가 훨씬 작지만 세포와 유사한 세포 내 신호전달 기능을 가지고 있으며, 세포보다 보관이 용이하고 나노디바이스 제작에 적합하다. 100 내지 250nm 크기의 나노베지클을 기판상에 고정화하고, 이후 공정에서 탄소나노튜브 및 나노베지클의 아미드 결합이 형성되어, 상기 결합이 형성되는 과정 동안 고정된 나노베지클의 크기는 나노베지클을 제조하는 단계에서 보다 작아진다.
본 발명은 또한,
기판;
상기 기판 상에 서로 이격되어 형성된 소스 전극 및 드레인 전극;
상기 소스 전극 및 드레인 전극과 전기적으로 접촉하며 상기 소스 전극 및 드레인 전극 사이의 기판을 표면 개질하는 나노구조체; 및
상기 나노구조체에 고정된 본 발명에 의한 이종이합체 G 단백질 연결 수용체(heterodimeric G Protein Coupled Receptor)을 포함하는 나노베지클;을 포함하는 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서를 제공한다.
도 3(a) 에 본 발명에 의한 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서의 구조를 모식적으로 나타내었다.
본 발명은 또한,
a) 기판을 준비하는 단계;
b) 상기 기판의 표면에 나노구조체를 형성하는 단계;
c) 상기 기판 상에 서로 이격되어 배치되며, 상기 나노구조체와 전기적으로 접촉하도록 소스 전극 및 드레인 전극을 형성하는 단계; 및
d) 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클을 상기 나노구조체 표면에 고정화하는 단계; 를 포함하는 본 발명에 의한 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 의한 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서의 제조 방법은 상기 기판 표면을 아민기로 표면 개질하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 아민기로 표면 개질하는 단계는 3-아미노프로필메틸디메톡시실란, 3-(2-아미노에틸)아미노프로필트리메톡시실란, 3-(2-아미노에틸)아미노프로필메틸디메톡시실란 및 3-아닐리노프로필트리메톡시실란, N-페닐-3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필메틸디에톡시실란, 및 3-아미노프로필트리에톡시실란으로 이루어진 군으로부터 선택된 아민기-함유 실란 커플링제로 처리될 수 있다.
본 발명에 의한 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서의 제조 방법에서 상기 나노 구조체의 표면을 파이렌 및 아민기 구조를 포함하는 물질로 표면 개질하는 단계를 더 포함하는 것이 가능하다. 상기 파이렌 및 아민기 구조를 포함하는 물질은 파이렌 메틸 아민(Pyrene methylamine), 아미노 파이렌(1-Aminopyrene), 파이렌부티릭 석신이미드 에스테르(pyrenebutyric succinimide ester, PSE)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 의한 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서의 제조 방법에 있어서, 상기 표면 개질된 기판을 나노구조체 함유 용액에 침지시키거나 또는 나노구조체 함유 기체에 노출시켜, 기판 상에 나노구조체를 형성할 수 있다.
본 발명에 의한 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서의 제조 방법에 있어서, 상기 나노 구조체는 나노튜브, 나노와이어, 나노로드, 나노리본, 나노필름 또는 나노볼 형태일 수 있다.
본 발명에 의한 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서의 제조 방법에 있어서, 상기 표면 개질된 나노구조체의 표면에 본 발명에 의한 이종이합체 G 단백질 연결 수용체(heterodimeric G Protein Coupled Receptor)을 포함하는 나노베지클을 고정시킨다. 상기 표면 개질된 나노구조체의 표면에 본 발명에 의한 이종이합체 G 단백질 연결 수용체(heterodimeric G Protein Coupled Receptor)을 포함하는 나노베지클을 고정시키는 단계는 이종이합체 G 단백질 연결 수용체(heterodimeric G Protein Coupled Receptor)을 포함하는 나노베지클 함유 용액을 나노구조체 표면의 표면 상에 퍼지게 한 후, 건조하여 단맛 수용체 단백질을 고정시킴으로써 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 따른 미각 센서에 단맛 물질을 노출시키는 단계; 및
상기 미각 센서에 단맛 물질 함유 용액 또는 단맛 물질 함유 기체를 접촉시킴으로써, 단맛 수용체 단백질과 단맛 물질이 결합하여 발생하는 컨덕턴스(conductance) 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 단맛 물질 검출방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서, 단맛 물질 함유 용액 또는 단맛 물질 함유 기체를 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서와 접촉시킴으로써 단맛 물질을 검출할 수 있다.
본 발명의 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서에서는 상기 인간 미각 수용체 hTAS1R2 및 hTAS1R3 로 구성되는 G 단백질 연결 수용체와 단맛 물질이 결합하여 cAMP 경로를 통해 나노베지클 내로 양이온이 유입되어 컨덕턴스 변화를 일으키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 미각 센서를 이용하여 천연 당(설탕(sucrose), 과당(fructose), 포도당(glucose), 엿당(maltose), 젖당(lactose)), 단맛 아미노산(D-트립토판), 및 인공 감미료(아스파탐(asparmane), 사카린(saccharin), 아세설팜 K(acesulfame K), 시클라메이트(cyclamate), 수크랄로스(sucralose)) 와 같은 다양한 감미료를 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클로 기능화된 전계효과 트랜지스터 및 미각 센서는 G 단백질 연결 수용체를 이용하여 민감도 및 선택도가 우수하고 실시간으로 μM 범위까지 고특이적으로 단맛 물질을 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클 및 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클을 포함하는 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 2(a)는 본 발명의 일 실시예에 따라 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 형질 전환된 세포 및 나노베지클에서 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 G 단백질 연결 수용체의 발현 여부를 측정한 결과이다.
도 2(b)는 본 발명의 일 실시예에 따라 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 형질 전환된 세포 및 나노베지클에서 이종이합체 G 단백질 연결 수용체의 발현 여부를 공초점형광현미경의 형광 사진으로 측정한 ㄱ결과를 나타낸다.
도 2(c)는 본 발명의 일 실시예에 따라 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 형질 전환된 세포의 설탕(sucrose) 자극에 의한 반응의 크기를 나타낸 것이다.
도 2(d)는 본 발명의 일 실시예에 따라 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 형질 전환된 세포 및 나노베지클에서 이종이합체 G 단백질 연결 수용체의 발현 여부를 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2(e)는 본 발명의 일 실시예에 따라 DLS 분석을 이용하여 측정한 G이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클의 크기 분포를 나타낸 것이다.
도 2(f)는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클의 설탕(sucrose) 자극에 의한 반응의 크기를 나타낸 것이다.
도 3(a)는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클 기반의 전계 효과 트랜지스터의 미각 검출 기작을 나타내는 모식도이다.
도 3(b)는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클 기반의 전계효과 트랜지스터 내 탄소나노튜브에 고정화된 나노베지클의 SEM 사진을 나타낸 것이다.
도 3(c)는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클 기반의 전계효과 트랜지스터에서 시간에 따른 미각 자극의 크기를 변화시키면서 측정한 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 3(d)는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서의 단맛 자극의 농도에 따른 반응을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서의 선택도 실험 결과를 나타낸다.
이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이하의 실시예에 의하여 더욱 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 단맛 물질 수용체 단백질(hTAS1R2 및 hTAS1R3)을 포함하는 나노베지클의 제작
<실시예 1-1> 미각 수용체 hTAS1R2 및 hTAS1R3 플라스미드 제작
N말단에 HA-tag유전자가 연결된 hTAS1R2 및 hTAS1R3로 구성되는 이종이합체 G 단백질 연결 수용체(heterodimeric GPCR)의 cDNA를 pCMV6 벡터 안에 삽입하였다. 이를 원형으로 하여 PCR로 증폭하였다.
PCR은 Taq polymerase mixture (1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 각각의 프라이머 0.5 mM, 100 ng 플라스미드)를 사용하여서 94 ℃ 5분, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 1분을 35번 반복하는 순서로 진행되었고 얻어진 PCR 생산물은 KpnⅠ과 XhoⅠ제한효소로 처리한 후 겔 전기영동으로 녹여서 분리하였다.
증폭된 HA-tag이 들어간 hTAS1R2 및 hTAS1R3로 구성되는 이종이합체 수용체의 유전자는 pCMV6 벡터에 서브클로닝(subcloning)하였다. 상기 pCMV6 벡터는 C말단 멀티 클로닝 사이트에 DsRed 유전자를 가지고 있고 타겟 유전자는 DsRed 결합 단백질로 발현된다. 클로닝이 올바르게 되었는지는 DNA sequencing을 통해 확인하였다.
<실시예 1-2> hTAS1R2 및 hTAS1R3을 안정하게 발현하는 HEK-293 세포주 제작
Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA)을 사용하여 상기 실시예 1-1 에서 제조된 hTAS1R2 및 hTAS1R3이 클로닝 되어있는 pCMV6 벡터로 HEK-293 세포주를 형질전환 하였다. hTAS1R2 및 hTAS1R3로 형질전환되어 hTAS1R2 및 hTAS1R3을 안정하게 발현하는 HEK-293 세포주는 G-418을 통한 선택적 분리과정을 통해 제작되었다.
형질 전환된 세포는 1일 후에 G-418 (1mg/ml)이 포함된 배양액으로 교체해 주고 14일 동안 배양하였다. hTAS1R2 및 hTAS1R3로 구성되는 이종이합체가 발현된 콜로니들이 생성되었고 DsRed 형광발광을 통해 이 콜로니들만 선택적으로 G-418 (0.5 mg/ml)이 포함된 배양액으로 옮겼다. 배양액에서 안정화되고 배양된 세포들을 Trypsine-EDTA (TE; Gibco, USA) 처리하여 Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS; Gibco, USA)로 재부유시켜 얼음이 있는 차가운 조건에서 5분 (on time : 3초, off time : 5초) 동안 음파처리 (sonication) 하였다. 음파처리는 12000 rpm, 4 ℃, 30분 동안 원심분리 한 후, 침전물(pellet)을 1000 ng mL-1 의 농도로 마지막으로 재부유시켜 -80 ℃에서 보관하였다.
<실시예 1-3> hTAS1R2 및 hTAS1R3 을 포함하는 나노베지클의 제작
상기 실시예 1-2 에서 배양된 hTAS1R2 및 hTAS1R3로 형질전환 세포를 사이토칼라신 B(cytochalasin B) (20g/ml) 처리하여 300 rpm으로 37 ℃ 조건하에서 20분 동안 배양(incubation)하였다.
남은 세포체와 나노베지클을 분리하기 위해 1,000×g 으로 20분간 원심 분리하였다. 얻어진 상청액(supernatant)에 나노베지클이 포함되어 있고 이를 다시 15,000×g으로 30분간 원심분리하여 얻은 침전물(pellet)을 DPBS로 단백질 분해효소 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail) (Sigma Aldrich, USA)을 첨가하여 재부유 해주었다. 이렇게 생산된 나노베지클을 바로 사용하거나 -80 ℃에서 몇 주 안에 사용되도록 보관하였다.
나노베지클의 직경을 DLS(Dynamic Light Scattering) 방법으로 분석한 결과 도 2(e)에서 보는 바와 같이 나노베지클의 직경이 100nm 내지 250nm 이고, 평균적으로 150nm인 것을 확인하였다.
<실험예 1> 재조합 단백질 발현의 확인
형질전환된 세포에서 단맛 물질 수용체 단백질(hTAS1R2 및 hTAS1R3)이 발현되고 있음을 웨스턴 블롯(western blot) 방법을 사용하여 확인하였다.
형질전환된 세포들을 샘플 버퍼(10% dosium dodecyl sulfate, 10% β-mercaptanol, 0.3 M Tris-HCl (pH 6.8), 0.05% bromophenol blue, 50% glycerol)를 섞고 0 ℃에서 혼합하고, 50℃에서 2시간 동안 배양하였다. 상기 샘플을 10% PAGE 겔에 로딩하고, 전기영동 시 80 V의 일정한 전압으로 설정하여 주었다. 겔 내 단백질은 0.02% 쿠마시-블루(coomassie-blue) 염색 솔루션으로 나타내었다. 겔 내 단백질을 니트로섬유소막(nitrocellulose membrane)으로 옮기고, 블로킹하기 위해 5% skim milk를 녹여준 PBS-T(0.1% Tween-20을 녹여준 PBS)에서 2시간 동안 배양하였다. 블로킹(Blocking)된 막(memebrane)을 항-GST 항체(anti-HA mouse antibody) (1 : 2000으로 PBS-Tween상에 1% skim milk를 희석 시켜줌)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하고, 그 후 PBS-Tween으로 10분씩 5번 씻어주었다. 막 처리된 항체를 HRP-conjugated 항체(1:2,500으로 PBS-T상에 5% skim milk 를 희석 시켜줌)와 배양하고, 그 후 PBS-Tween으로 10분씩 5번 씻어주었다. 웨스턴 블롯은 향상된 화학발광 검출 키트(ECL: GE helthcare)를 이용하여 나타내었다.
웨스턴 블롯 분석 결과를 도 2(a)에, 형광현미경으로 관찰한 결과는 도 2(b)에 나타내었다. 도 2(a) 및 도 2(b)에서 재조합 단백질의 크기는 95 kDa 및 180 kDa의 두 개의 밴드가 검출되어, 모노머와 다이머 형태의 단백질의 크기와 일치함을 확인하였다.
<실험예 2> 형질 전환 세포 및 나노베지클에서의 신호 전달 확인
실시예 1에서 제작된 hTAS1R2 및 hTAS1R3의 이종이합체 수용체가 발현된 HEK-293 세포 및 이로부터 분리된 나노베지클 각각의 단맛 물질에 의한 신호전달을 확인하였다.
형질전환된 HEK-293 세포주를 3일 이상 배양하고, 5㎛ Fura 2- AM(acetoxymethyl) (calcium indicator, Invitrogen)을 이미징 버퍼 솔루션(NaCl 140mM, KCl 5 mM, MgCl2 1mM, CaCl2 2mM, HEPES 10mM, Glucose 10mM, 0.1% Pluronic F-127, pH 7.4) 내 세포에 로딩하였다. 세포 내 존재하는 비특이적인 에스테라제는 AM 에스테르기를 가수분해하여 Ca2+에 민감한 형태로 바꾸어준다. 37℃에서 30분 동안 배양한 후, 세포를 동일한 버퍼 솔루션으로 세번 씻고, 세포 내 에스테라제에 의해 AM 에스테르기가 제거되도록 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
각 솔루션으로 세번 헹군 후, Ca2+ 의존적인 형광 신호에 대한 리간드 및 ATP(100uM)을 주입하였을 때 이중 자극 (340 nm, 380nm)을 주고 510 nm에서 Ca2+에 의한 형광신호를 분광형광 광도계(spectrofluorophotometer)로 측정하였다. 형광신호를 2초 간격으로 얻었고, 최종 결과는 이중자극을 주어 얻은 형광 세기의 비율로 나타내었다.
도 2(c)로부터 형질전환된 HEK-293 세포주에 10 mM의 설탕(sucrose)을 첨가한 경우, 형광 방출 세기가 상대적으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한 도 2(f)에서 형질전환된 HEK-293 세포주로부터 분리된 TAS1R2 및 TAS1R3를 포함하는 나노베지클에 10 mM의 설탕(sucrose)을 첨가한 경우, 형광방출세기가 상대적으로 증가하는 것을 확인하였다.
<실시예 2> 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서의 제작
본 발명에 의하여 제조된 전계 효과 트랜지스터 기반 미각 센서의 구조를 도 3(a)에 모식적으로 나타내었다.
단일벽 탄소나노튜브(swCNT)(2.5mg, 한화)를 20분 동안 초음파 진동을 이용하여 1,2-디클로로벤젠(1,2-dichlorobenzene)(50ml)에 분산시켜, 0.05mg/ml의 서스펜션을 제조하였다. 비극성 말단기를 가지는 옥타데실트리클로로실란(octadecyltrichlorosilane, OTS) 자기조립단층 (self-assembled monolayer, SAM) 을 SiO2 (1000 A) 기판상에 포토리소그래피를 이용하여 패터닝하였다. 상기 패터닝된 기판을 상기 단일벽 탄소나노튜브 서스펜젼에 약 10초 동안 넣고, 1,2-디클로로벤젠으로 헹구었다. 이 과정에서, 단일벽 탄소나노튜브의 단일층은 OTS가 형성되지 않은 노출된 SiO2 기판 상에 선택적으로 흡착되었다.
접촉 전극을 Pd/Au (10nm/30nm) 증발 및 리프트-오프(lift-off) 방법에 의하여 제작하였다. 소스 전극과 드레인 전극 사이의 갭 간격은 20mm이었다. 포토리소그래피를 이용하여 포토레지스트(AZ 5214)로 전극을 패시베이션하고, 파이렌부티릭 석신이미드 에스테르(PSE,pyrenebutyric acid succinimide ester)를 이용하여 아민기로 단일벽 탄소나노튜브 표면을 개질하고, 나노베지클을 고정화하였다. 상기 파이렌부티릭 석신이미드 에스테르(PSE,pyrenebutyric acid succinimide ester)의 피레닐기(pyrenyl group)는 π 스태킹을 통해 탄소나노튜브의 측벽에 그래파이트와 상호작용한다. 본 발명에 의한 단맛 물질 수용체를 포함하는 나노베지클은 펩티드 결합으로 전계효과 트랜지스터 기판 표면을 개질한 탄소나노튜브 표면에 고정된다.
실시예 1에서 수집된 단맛 물질 수용체 단백질(hTAS1R2 및 hTAS1R3) 함유 나노베지클을 상기 단일벽 탄소나노튜브와 전극을 덮도록 고르게 펼쳐서 약 4 시간 동안 진공 건조하여, 단맛 물질 수용체 단백질(hTAS1R2 및 hTAS1R3) 함유 나노베지클을 단일벽 탄소나노튜브에 고정시킴으로써, 인간 단맛 물질 수용체로 기능화된 전계효과 트랜지스터를 제조하였다.
<실험예 3> 전계효과 트랜지스터의 특성 분석
상기 실시예 2에서 제조된 나노베지클 기반의 전계효과 트랜지스터의 표면을 Pt로 동결 건조하고, 전계 방사형 주사전자현미경 (field-emission scanning electron, FE-SEM)을 사용하여 도 3(b)에 나타내었다. 도 3(b)로부터 단일벽 탄소나노튜브 상에 구형의 나노베지클이 고정화되었으며, 고정된 나노베지클의 직경이 세포로부터 분리된 때보다 감소하였음을 알 수 있다.
<실험예 4> 미각 센서의 신호 측정
2mM CaCl2가 포함된 PBS(phosphate buffered saline; Gibco, USA)에 단맛 물질(Sigma Aldrich, USA)을 1 mM 농도로 녹인 후, 순차적으로 1/10씩 희석시킨 희석액을 제조하였다.
상기 희석액들을 실시예 2에서 제작한 나노베지클 기반의 전계효과 트랜지스터에 노출시키고, 실시간으로 소스 전극 및 드레인 전극 사이에 흐르는 전류를 측정하여 반응의 크기를 확인하였다.
<실험예 5> 미각 센서의 민감도 측정
단맛 물질에 대한 민감도는 설탕(sucrose)에 대한 나노베지클 기반의 전계효과 트랜지스터의 ΔG/G0 값을 실시간으로 측정하고, 그 결과를 도 3(c)에 나타내었다.
도 3(c)에서 보는 바와 같이 본 발명에 의한 미각 센서에서 발생하는 신호는 100 uM 설탕(sucrose) 농도에서 감소하고, 500uM 설탕(sucrose) 농도에서 급격히 감소하였다. 다양한 농도의 설탕(sucrose)에 따른 나노베지클 기반의 전계효과 트랜지스터의 반응 곡선은 100uM 내지 10mM의 범위에서 아래와 같이 표시되는 힐식(hill equation)과 대응시켰으며 그 결과를 도 3(d)에 나타내었다. 도 3(d)에서 실선은 종래 알려진 힐식(hill equation)을 나타내며, 본 발명의 실시예에 의한 농도에 따른 반응은 도 3(d)에서 점으로 표시하였다.
Figure PCTKR2013008376-appb-I000001
도 3(d)에서 본 발명에 의한 미각 센서에서 발생하는 반응 신호와 자극의 농도는 힐 식(hill equation)의 관계를 만족시키는 것을 알 수 있다.
또한, 상기 나노베지클 기반의 전계효과 트랜지스터를 사용하는 경우 세포 기반 단맛 물질 검출 결과 보다 약 10배 낮은 농도에서 검출할 수 있어, 민감도가 향상된 것을 알 수 있다.
<실험예 6> 미각 센서의 선택도 측정
본 발명에 의한 전계 효과 트랜지스터 기반 미각 센서의 단맛 물질에 대한 선택도를 확인하기 위하여, 설탕(sucrose), 아스파탐(aspartame), 셀로비오스(cellobios), 과당(fructose), 사카린(saccharin), D-글루쿠론산(D-glucuronic acid) 물질을 준비하여, 상기 실시예 2에서 제조된 전계 효과 트랜지스터 기반 미각 센서에 노출시켰다.
도 4(b)를 살펴보면, 500uM 설탕(sucrose)을 첨가하였을 때 반응의 세기가 약 5% 정도 감소되었으나, 100mM 셀로비오스 및 D-글루쿠론산을 첨가하였을 때 아무런 신호 변화가 없는 것으로 나타났다. 도 4(c)를 살펴보면, 단맛 설탕 및 과당, 인공 단맛 물질(사카린 및 아스파탐), 맛이 없는 설탕을 첨가하였을 때, 단맛 설탕, 인공 단맛 물질에서 신호 변화가 있으며, 단맛 설탕 및 과당, 인공 단맛 물질 자극에 대한 나노베지클 기반의 전계효과 트랜지스터의 신호는 힐식(hill equation model)을 따른다.
반면, 맛이 없는 설탕을 첨가하였을 때 아무런 신호 변화가 없는 것으로 나타났다. 또한, 인공 단맛 물질은 아스파탐, 사카린은 작용 물질로서 설탕보다 민감한 것으로 나타났다. 도 4(d)를 살펴보면, 실생활에서 사용되는 다즐링 차 및 커피 내 설탕의 1mM 농도에서도 검출되었으며, 다즐링 및 커피 샘플에서도 도 4(c)와 같은 힐식(hill equation model)을 따른다.
상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 아울러, 본 발명의 범위는 상기의 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어진다. 또한, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에 따른 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클로 기능화된 전계효과 트랜지스터 및 미각 센서를 이용하여 인간이 단맛을 느끼는 것과 매우 유사한 반응을 나타낼 수 있고, 이를 통해 여러 가지 맛 물질의 선별과 의료산업, 약품, 식품, 환경 분야 등 다양한 분야에 활용할 수 있다.

Claims (14)

  1. a) 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 코딩하는 유전자로 동물 세포를 형질전환하는 단계;
    b) 상기 동물 세포를 화합물로 처리하여 미각 수용체 단백질을 포함하는 나노베지클을 분비하도록 하는 단계; 및
    c) 상기 분비된 나노베지클을 동물 세포로부터 분리하는 단계;를 포함하는 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 이종이합체 G 단백질 연결 수용체는 hTAS1R1, hTAS1R2 및 hTAS1R3로 이루어진 그룹에서 선택되는 2개의 유전자인 것을 특징으로 하는 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클의 제조방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 이종이합체 G 단백질 연결 수용체는 hTAS1R2 및 hTAS1R3 인 것을 특징으로 하는 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 a) 단계에는 에스테르기를 가지는 화합물을 첨가하는 것을 특징으로 하는 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클의 제조방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 에스테르기를 가지는 화합물은 Fura 2-acetoxymethyl인 것을 특징으로 하는 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 동물 세포는 인간배아신장-293(human embryonic kidney-293, HEK-293) 세포주인 것을 특징으로 하는 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클의 제조방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 b) 단계의 화합물은 사이토칼라신 B인 것을 특징으로 하는 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클의 제조방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 하나의 항에 의하여 제조된 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 나노베지클의 크기는 100 nm 내지 200 nm 인 것인 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클.
  10. 기판;
    상기 기판 상에 서로 이격되어 형성된 소스 전극 및 드레인 전극;
    상기 소스 전극 및 드레인 전극과 전기적으로 접촉하며 상기 소스 전극 및 드레인 전극 사이의 기판에 형성된 나노구조체; 및
    상기 나노구조체 표면에 고정된 제 8 항에 의한 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클;을 포함하는 전계 효과 트랜지스터 기반 미각 센서.
  11. a) 기판을 준비하는 단계;
    b) 상기 기판의 표면에 나노구조체를 형성하는 단계;
    c) 상기 기판 상에 서로 이격되어 배치되며, 상기 나노구조체와 전기적으로 접촉하도록 소스 전극 및 드레인 전극을 형성하는 단계; 및
    d) 이종이합체 G 단백질 연결 수용체를 포함하는 나노베지클을 상기 나노구조체 표면에 고정화하는 단계; 를 포함하는 제 10 항에 의한 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서의 제조방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 기판 표면을 아민기로 표면 개질하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서의 제조방법.
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 나노구조체의 표면을 파이렌 메틸 아민(Pyrene methylamine), 아미노 파이렌(1-Aminopyrene), 파이렌부티릭 석신이미드 에스테르(pyrenebutyric succinimide ester, PSE)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 종 이상으로 표면 개질하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서의 제조방법.
  14. 제 11 항에 있어서,
    상기 나노구조체는 나노튜브, 나노와이어, 나노로드, 나노리본, 나노필름 또는 나노볼 형태인 것을 특징으로 하는 전계효과 트랜지스터 기반 미각 센서의 제조방법.
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