KR20110117695A - 신규한 세포주와 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 세포와 세포주, 그리고 이들을 만들고 이용하는 방법에 관계한다.

Description

신규한 세포주와 방법{NOVEL CELL LINES AND METHODS}
본 출원은 2009년 2월 2일 제출된 U.S. 가출원 No. 61/149,321; 2009년 2월 2일 제출된 U.S. 가출원 No. 61/149,318; 2009년 2월 2일 제출된 U.S. 가출원 No. 61/149,324; 2009년 2월 2일 제출된 U.S. 가출원 No. 61/149,311; 2009년 8월 19일 제출된 U.S. 가출원 No. 61/235,181; 그리고 2009년 7월 31일 제출된 U.S. 가출원 No. 61/230,536에 우선권을 주장하고, 이들 각각은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 제출되었고 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 서열 목록을 포함한다. 2010년 2월 1일 만들어진 상기 ASCII 사본은 0022980025SeqList.txt로 명명되고, 그리고 200,023 바이트 (byte) 크기를 갖는다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 신규한 세포와 세포주, 그리고 이들을 만들고 이용하는 방법에 관계한다. 특정한 구체예에서, 본 발명은 복수 표적을 안정적으로 발현하는 세포와 세포주에 관계한다. 본 발명에서는 또한, 이런 세포와 세포주를 만드는 방법을 제시한다. 본 발명에서 제시된 세포와 세포주는 이런 복수 표적의 조절제 (modulator)를 확인하는데 유용하다.
본 발명의 배경기술
현재, 제약 기업에서 약물 발견 프로그램에 대한 업계 평균 실패율은 대략 98%인 것으로 보고된다. 비록 여기에는 모든 공정 단계에서 실패가 포함되긴 하지만, 높은 실패율은 이러한 공정의 효율에서 향상이 절실히 요구된다는 것을 지시한다.
높은 실패율의 원인이 되는 한 가지 인자는 약물 발견 동안 세포-기초된 기능 분석에 이용되는 치료 표적을 발현하는 세포주의 부재이다. 이견 없이, 세포-기초된 분석을 이용한 연구, 특히 약물 발견 연구는 세포-기초된 분석에 이용되는 세포와 세포주로부터 이익을 얻을 것이다.
결과적으로, 새롭고 향상된 약물의 더욱 신속한 발견을 위한 세포 기초된 분석의 신속하고 효과적인 확립이 절실히 요구된다. 바람직하게는, 더욱 효과적인 약물 발견을 위하여, 이러한 분석 시스템은 생체내에서 조절제의 효과의 더욱 생리학적으로 적절한 예보자를 제공해야 한다.
세포-기초된 분석에 대한 요구 이외에, 단백질 생산, 세포-기초된 요법 및 다양한 다른 용도를 위한 향상된 세포가 요구된다.
따라서 목적의 기능 단백질 또는 RNA을 발현하는 세포와 세포주가 시급히 요구된다.
입 내에서, 미각 수용체 세포 (TRC)가 혀, 구개의 일부, 후두개, 후두와 인두를 비롯한 여러 특수화된 지역에서 관찰될 수 있다. 혀 상에서, TRC는 미뢰(taste bud)로 불리는 일군의 세포로 조직화된다. 미뢰는 단일 정축공 (apical pore)으로 구성되고, 여기서 TRC의 미세융모 (microvilli)가 구강 (oral cavity) 내에 존재하는 미각촉진제 (tastant)와 접촉한다. 혀 상에서, 미뢰는 3가지 유형의 특수화된 상피 구조 내에 박혀있다. 혀의 전방 2/3 부분까지 버섯 유두 (진균류form papillae)가 분포된다. 출생 시점에서 잘 발달하지만 나이를 먹으면서 퇴행하는 엽상 돌기 (foliate papillae)가 혀의 후방 1/3 부분에서 관찰된다. 7개 내지 9개의 성곽 유두 (circumvallate papillae)는 혀의 후방에서 멀리 뒤쪽에, 분계 고랑 (terminal sulcus)에 가깝게 위치한다. 미뢰 내에 조직된 '고전적인' TRC 이외에, 화학감각 세포 군집 또는 단독 화학감각 세포가 폐와 장 내에 비-혀 상피 에서 관찰된다.
단맛 수용체
단맛 지각은 2개의 아단위 TASR2 (T1R2)와 TASR3 (T1R3)으로 구성된 이절성 (heteromeric) G-단백질 결합된 수용체 (GPCR)에 의해 매개된다. 상기 수용체는 단맛 수용체로 명명된다. 상기 수용체의 양쪽 아단위는 부류 C GPCR 하위집단의 구성원이고, 그리고 종종 파리지옥 도메인 (Venus flytrap domain)으로 지칭되는 대형 N-말단 세포외 도메인을 보유한다. T1R 아단위는 G 단백질 알파 트랜스듀신 또는 알파 거스트듀신에 결합하고, 이를 통하여 포스포리파아제 C (PLC) β2-의존성 경로를 활성화시켜 세포내 Ca2+ 농도를 증가시킬 수 있다. 이들은 또한, cAMP-의존성 경로를 활성화시킬 수 있다.
단맛 수용체는 간단한 탄수화물 (가령, 당), 아미노산, 펩티드, 단백질, 그리고 합성 감미료를 비롯한 매우 다양한 단맛 화학물질을 검출한다. 단맛 수용체는 자연과 인공 감미료 둘 모두에 민감하다. 이들 수용체를 활성화시키는 것으로 공지된 화학 구조의 넓은 다양성을 고려하여, 막통과 영역 내에 부위, 그리고 감칠맛 수용체와 공유된 아단위로서 기능하는 T1R3 상에 부위를 비롯하여, 이들 수용체 내에서 복합 결합 부위가 제안되었다.
단맛 수용체는 또한, 비만과 당뇨병가 같은 질환에 관련되는데, 그 이유는 이들 수용체가 영양소 검출과 감지에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각되기 때문이다. 미각 수용체는 인간에서 전반부 소장 (proximal small intestine)의 영양소 검출 영역에서 발현되고, 여기서 이들은 소장 강 (intestinal lumen) 내에서 영양소의 검출에서 일정한 역할을 하는 것으로 증거에 의해 암시된다. 이러한 영역, 더욱 구체적으로, 장의 내분비 세포에서 단맛 수용체, 그리고 세포내 미각 신호 전달에 관여하는 G-단백질인 거스트듀신의 고도로 조화된 발현이 나타난다. 따라서 이들 단맛 수용체의 기능은 다른 G-단백질 결합된 수용체와 유사한 리간드-매개된 제어를 나타낼 수 있다, 다시 말하면, 이들은 그들의 리간드가 높은 농도로 존재하면, 활성 및/또는 발현을 상실할 것이다. 이는 혈액과 내강에서 글루코오스 농도의 동적 물질대사 변화 (dynamic metabolic change)에 반응하는 장내 '미각' 신호전달을 유발할 것이다. 따라서 단맛 수용체 및 장 내에서 그들의 조정은 식이요법, 식욕, 그리고 비만과 당뇨병과 같은 다양한 질환의 치료에서 중요한 역할을 할 수 있다.
자연 당과 인공 감미료에 의한 장내 단맛 수용체의 활성화는 또한, 정상 (apical) 글루코오스 수송체, GLUT2, 그리고 기타 글루코오스 수송체의 증가된 발현을 유발한다. 가령, 인공 감미료는 영양적으로 활동성인데, 그 이유는 이들이 기능적 미각 수용 시스템에게 신호하여 식사 동안 당 흡수 (sugar absorption)를 증가시킬 수 있기 때문이고, 이러한 발견은 영양 공급과 식욕에서, 따라서 영양 부족과 섭식 장애의 잠재적 치료에서 중요한 의미를 가질 수 있다. 지속적으로 상승된 정상 (apical) GLUT2 수준은 증가된 당 흡수를 유발하고 실험적 당뇨병, 그리고 프럭토오스와 지방에 의해 유도된 인슐린-내성 상태의 특징이다. 부가적으로, 신경내분비 세포에서 단맛 수용체 활성화는 글루카곤 유사 펩티드 (GLP-1) 및 소화의 다른 조절제의 방출을 유발한다. 전반적으로, 장 내에서 단맛 수용체는 장내 내용물 (luminal content)의 영양적 값의 감지에서 중요한 역할을 수행하고, 그리고 조절된 흡수와 소화를 통하여 신체 반응을 조화시키는데 도움을 준다. 이들 발견은 단맛 수용체가 비만과 당뇨병을 치료하는데 유용한 조절제에 대한 가능 표적으로서 기능할 수 있음을 암시한다.
감칠맛 수용체
감칠맛 (umami) 지각은 2개의 아단위 TASR1 (T1R1)과 TASR3 (T1R3)으로 구성된 이절성 GPCR에 의해 매개된다. 상기 수용체는 감칠맛 수용체로 명명된다. 상기 수용체의 양쪽 아단위는 부류 C GPCR 하위집단의 구성원이고, 그리고 종종 파리지옥 도메인으로 지칭되는 큰 N-말단 세포외 도메인을 보유한다. T1R 아단위는 G 단백질 알파 트랜스듀신 또는 알파 거스트듀신에 결합될 수 있고, 이들을 통하여 상기 아단위는 포스포리파아제 C (PLC) 2-의존성 경로를 활성화시켜 세포내 Ca2+ 농도를 증가시킬 수 있다. 이들은 또한, cAMP-의존성 경로를 활성화시킬 수 있다. 이들 수용체는 L-아미노산과 모노나트륨 글루타메이트 (MSG)를 비롯한 다양한 감칠맛 화학물질을 검출할 수 있다. T1R1은 또한, 감칠맛의 공지된 강화제인 이나트륨 5'-이노시네이트 (IMP) 및 기타 뉴클레오티드에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
감칠맛 수용체는 또한, 인간에서 전반부 소장의 영양소 검출 영역에서 발현되고, 여기서 이들은 장내 내강에서 영양소의 검출에서 일정한 역할을 하는 것으로 생각된다. 감칠맛 수용체, 그리고 이러한 영역 및 특정한 신경내분비 세포에서 세포내 미각 신호 전달에 관여하는 G-단백질인 거스트듀신의 고도로 조화된 발현이 존재한다. 아미노산에 의한 장내 감칠맛 수용체의 활성화는 정상 (apical) 올리고펩티드 수송체 PepT1의 조정을 유발한다. 전반적으로, 장내에서 감칠맛 수용체는 장내 내용물의 영양적 값의 감지에서 중요한 역할을 수행하고, 그리고 조절된 흡수와 소화를 통하여 신체 반응을 조화시키는데 도움을 준다. 이들 발견은 감칠맛 수용체가 비만과 당뇨병을 치료하는데 유용한 조절제에 대한 가능 표적으로서 기능할 수 있음을 암시한다.
쓴맛 수용체
쓴맛 수용체는 미각 수용체 세포의 표면에서 발현된 G 단백질 결합된 수용체 (GPCR)이고 이차 메신저 경로에 결합된다. TAS2R 수용체는 트랜스듀신 (가령, GNAT1, GNAT2, 그리고 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 G(t)) 또는 거스트듀신 (가령, GNAT3 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 및 α 트랜스듀신 3)에 결합될 수 있고, 예로써 이들을 통하여 상기 수용체는 포스포디에스테라아제와 포스포리파아제 C (PLC)β2-의존성 경로 둘 모두를 활성화시켜 세포내 Ca2+ 농도를 증가시킬 수 있다. TAS2R 수용체는 또한, 인간 GNA15 (구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 (G 단백질) α15 (Gq 부류; 동의어 GNA16)와 생쥐 Gα15, 그리고 이들의 키메라 단백질 Gα15-GNA15 (일명, Gα15-Gα16)에 결합될 수 있다.
인간 쓴맛은 인간 TAS2 수용체 (hTAS2R) 유전자 집단 중에서 대략 25개 구성원에 의해 매개된다. 미각에서 역할 이외에, 쓴맛 수용체는 또한, 일련의 생리학적 상황에서 중요하다. 가령, 미각 수용체 작동약은 시험관내에서 장내분비 세포에서 및 생체내에서 동물에서 분비 반응을 유도하고, 그리고 뉴런 활성화를 유도한다. 이런 이유로, 모든 쓴맛 수용체 집단 구성원은 쓴맛 미각촉진제의 검출과 연관된 다양한 질환을 관리하기 위한 중요한 임상적 표적이다. 미각 수용체 (가령, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 그리고 쓴맛 수용체)를 특이적으로 표적으로 하고, 따라서 이들의 활성을 조정하는 새롭고 향상된 화합물의 발견은 확고하고, 생리학적으로 적절한, 세포-기초된 시스템, 더욱 구체적으로 미각 수용체 조절제 (가령, 단맛 수용체 조절제, 감칠맛 수용체 조절제, 그리고 쓴맛 수용체 조절제)를 확인하고 조사하기 위한 고처리량 형식이 가능한 이런 시스템의 부재로 인하여 방해된다. 이런 세포-기초된 시스템은 약물 발견과 확증에 바람직한데, 그 이유는 이들이 단지 결합 분석만을 제공하는 세포-없는 시스템에 대조적으로, 화합물에 대한 기능 분석을 제공하기 때문이다. 게다가, 세포-기초된 시스템은 세포독성을 동시에 조사하는 이점을 갖는다. 이상적으로, 세포-기초된 시스템은 또한, 표적 단백질을 안정적으로 및 구조적으로 발현해야 한다. 또한, 세포-기초된 시스템이 재현가능하도록 하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 미각 수용체, 예를 들면, 단맛 수용체, 쓴맛 수용체, 또는 감칠맛 수용체를 생리학적으로 적절한 형태로 안정적으로 발현하는 세포와 세포주를 제공하는 상황에서 다양한 구체예, 그리고 미각 수용체, 예를 들면, 단맛 수용체, 쓴맛 수용체, 또는 감칠맛 수용체의 조절제를 확인하기 위하여 이들 세포와 세포주를 이용하는 방법에서 이들 문제점을 극복한다.
본 발명의 요약
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 이종이합체 단백질의 적어도 하나의 아단위를 인코딩하는 도입된 핵산으로부터 목적되는 이종이합체 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 상기 세포는 기능 분석에 이용하기 적합한 형태로, 목적되는 이종이합체 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 목적되는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나, 또는 상기 단백질은 상기 형태에서 일관되게 및 재현가능하게 생산되고, 따라서 상기 세포는 기능 분석에서 적어도 0.4의 Z' 인자를 갖고, 또는 상기 세포는 선별 압력 (selective pressure)의 부재에서 배양되고, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 이종이합체 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 여기서 상기 세포는 목적되는 이종이합체 단백질의 적어도 하나의 아단위를 인코딩하는 내생적 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작되고, 상기 세포는 기능 분석에 이용하기 적합한 형태로, 목적되는 이종이합체 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 목적되는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나, 또는 상기 단백질은 상기 형태에서 일관되게 및 재현가능하게 생산되고, 따라서 상기 세포는 기능 분석에서 적어도 0.4의 Z' 인자를 갖고, 또는 상기 세포는 선별 압력 (selective pressure)의 부재에서 배양되고, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 이종이합체 단백질의 적어도 하나의 아단위를 인코딩하는 도입된 핵산으로부터 목적되는 이종이합체 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 세포는 선별 압력의 부재에서 배양된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 이종이합체 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 여기서 상기 세포는 목적되는 이종이합체 단백질의 적어도 하나의 아단위를 인코딩하는 내생적 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작되고, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 세포는 선별 압력의 부재에서 배양된다.
일부 구체예에서, 목적되는 이종이합체 단백질의 두 번째 아단위를 인코딩하는 핵산은 내생적이다. 다른 구체예에서, 목적되는 이종이합체 단백질의 두 번째 아단위를 인코딩하는 핵산이 도입된다. 또 다른 구체예에서, 목적되는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 목적되는 이종이합체 단백질은 이온 채널, G 단백질 결합된 수용체 (GPCR), 티로신 수용체 키나아제, 사이토카인 수용체, 핵 스테로이드 호르몬 수용체, 항체, 생물학적 수용체 및 면역학적 수용체로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 이종이합체 단백질은 항체 또는 생물학적 약제이다. 일부 구체예에서, 목적되는 이종이합체 단백질은 단맛 수용체 및 감칠맛 수용체로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 목적되는 이종이합체 단백질은 공지된 리간드를 갖지 않는다. 다른 구체예에서, 목적되는 이종이합체 단백질의 기능적 발현을 검출하는 공지된 분석법이 존재하지 않는다.
일부 구체예에서, 목적되는 이종이합체 단백질은 동일한 유형의 세포에서 발현되지 않는다. 일정한 구체예에서, 이러한 세포는 포유동물 세포이다.
일부 구체예에서, 이러한 세포는 시간의 흐름 동안 안정적인 1 이상의 신호 대 잡음 비율 (signal to noise ratio), 발현의 상실 없이 선별 압력 없는 성장, 생리학적 EC50 값, 그리고 생리학적 IC50 값으로 구성된 군에서 선택되는 추가의 원하는 특성을 갖는 것으로 더욱 특징된다. 일부 구체예에서, 목적되는 이종이합체 단백질은 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 그리고 적어도 9개월에서 선택되는 기간 동안 일관되고 재현가능한 형태로 생산된다. 일부 구체예에서, 기능 분석은 세포-기초된 분석, 형광 세포-기초된 분석, 고처리량 스크리닝 분석, 리포터 세포-기초된 분석, G 단백질 매개된 세포-기초된 분석, 그리고 칼슘 유동 세포-기초된 분석으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 기능 분석은 막 전위 분석, ELISA, 질량 분석, 목적되는 단백질의 생물학적 특성화, 세포 성장 분석, 생존능 분석, 세포 명확화 분석, 또는 단백질 생산의 능력이다. 다른 구체예에서, 이러한 세포는 세포 기초된 고처리량 스크리닝에서 이용에 적합하다.
일부 구체예에서, 선별 압력은 항생제이다. 다른 구체예에서, 이러한 세포는 적어도 15일, 30일, 45일, 60일, 75일, 100일, 120일, 또는 150일 동안 선별 압력의 부재에서 이종이합체 단백질을 발현한다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 이종다합체성 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 상기 이종다합체성 단백질은 적어도 3개의 아단위를 포함하고, 여기서 목적되는 이종다합체성 단백질의 적어도 하나의 아단위는 도입된 핵산에 의해 인코딩되고, 상기 세포는 기능 분석에 이용하기 적합한 형태로 목적되는 이종다합체성 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 목적되는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나, 또는 상기 단백질은 상기 형태에서 일관되게 및 재현가능하게 생산되고, 따라서 상기 세포는 기능 분석에서 적어도 0.4의 Z' 인자를 갖고, 또는 상기 세포는 선별 압력 (selective pressure)의 부재에서 배양되고, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 이종다합체성 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 여기서 상기 이종다합체성 단백질은 적어도 3개의 아단위를 포함하고, 상기 세포는 목적되는 이종다합체성 단백질의 적어도 하나의 아단위를 인코딩하는 내생적 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작되고, 상기 세포는 기능 분석에 이용하기 적합한 형태로, 목적되는 이종다합체성 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 목적되는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나, 또는 상기 단백질은 상기 형태에서 일관되게 및 재현가능하게 생산되고, 따라서 상기 세포는 기능 분석에서 적어도 0.4의 Z' 인자를 갖고, 또는 상기 세포는 선별 압력 (selective pressure)의 부재에서 배양되고, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 이종다합체성 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 여기서 상기 이종다합체성 단백질은 적어도 3개의 아단위를 포함하고, 여기서 목적되는 이종다합체성 단백질의 적어도 하나의 아단위는 도입된 핵산에 의해 인코딩되고, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 이종다합체성 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 여기서 상기 이종다합체성 단백질은 적어도 3개의 아단위를 포함하고, 여기서 상기 세포는 목적되는 이종다합체성 단백질의 적어도 하나의 아단위를 인코딩하는 내생적 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작되고, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징된다.
일부 구체예에서, 목적되는 이종다합체성 단백질의 적어도 하나의 아단위를 인코딩하는 핵산은 내생적이다.
일부 구체예에서, 목적되는 이종다합체성 단백질의 적어도 하나의 아단위를 인코딩하는 핵산이 도입된다.
일부 구체예에서, 목적되는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 목적되는 이종다합체성 단백질은 이온 채널, G 단백질 결합된 수용체 (GPCR), 티로신 수용체 키나아제, 사이토카인 수용체, 핵 스테로이드 호르몬 수용체 및 면역학적 수용체로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 목적되는 이종다합체성 단백질은 항체 또는 생물학적 약제이다. 다른 구체예에서, 목적되는 이종다합체성 단백질은 GABA, ENaC 및 NaV로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 목적되는 이종다합체성 단백질은 공지된 리간드를 갖지 않는다. 다른 구체예에서, 목적되는 이종다합체성 단백질의 기능적 발현을 검출하는 공지된 분석법이 존재하지 않는다.
일부 구체예에서, 목적되는 이종다합체성 단백질은 동일한 유형의 세포에서 발현되지 않는다. 다른 구체예에서, 이러한 세포는 포유동물 세포이다.
일부 구체예에서, 이러한 세포는 시간의 흐름 동안 안정적인 1 이상의 신호 대 잡음 비율 (signal to noise ratio), 발현의 상실 없이 선별 압력 없는 성장, 생리학적 EC50 값, 그리고 생리학적 IC50 값으로 구성된 군에서 선택되는 추가의 원하는 특성을 갖는 것으로 더욱 특징된다. 다른 구체예에서, 목적되는 이종다합체성 단백질은 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 그리고 적어도 9개월에서 선택되는 기간 동안 일관되고 재현가능한 형태로 생산된다.
일부 구체예에서, 기능 분석은 세포-기초된 분석, 형광 세포-기초된 분석, 고처리량 스크리닝 분석, 리포터 세포-기초된 분석, G 단백질 매개된 세포-기초된 분석, 그리고 칼슘 유동 세포-기초된 분석으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 기능 분석은 막 전위 분석, ELISA, 질량 분석, 목적되는 단백질의 생물학적 특성화, 세포 성장 분석, 생존능 분석, 세포 명확화 분석, 또는 단백질 생산의 능력이다. 다른 구체예에서, 이종다합체성 단백질을 발현하는 세포는 세포 기초된 고처리량 스크리닝에서 이용에 적합하다.
일부 구체예에서, 이종다합체성 단백질을 발현하는 세포는 선별 압력의 부재에서 배양된다. 일부 구체예에서, 선별 압력은 항생제이다. 다른 구체예에서, 이러한 세포는 적어도 15일, 30일, 45일, 60일, 75일, 100일, 120일, 또는 150일 동안 선별 압력의 부재에서 이종다합체성 단백질을 발현한다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 적어도 하나의 목적되는 단백질을 인코딩하는 도입된 핵산으로부터 목적되는 2개 이상의 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 상기 세포는 기능 분석에 이용하기 적합한 형태로 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 목적되는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나, 또는 상기 단백질은 상기 형태에서 일관되게 및 재현가능하게 생산되고, 따라서 상기 세포는 기능 분석에서 적어도 0.4의 Z' 인자를 갖고, 또는 상기 세포는 선별 압력 (selective pressure)의 부재에서 배양되고, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 2개 이상의 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 여기서 상기 세포는 적어도 하나의 목적되는 단백질을 인코딩하는 내생적 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작되고, 상기 세포는 기능 분석에 이용하기 적합한 형태로, 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 목적되는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나, 또는 상기 단백질은 상기 형태에서 일관되게 및 재현가능하게 생산되고, 따라서 상기 세포는 기능 분석에서 적어도 0.4의 Z' 인자를 갖고, 또는 상기 세포는 선별 압력 (selective pressure)의 부재에서 배양되고, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 적어도 하나의 목적되는 단백질을 인코딩하는 도입된 핵산으로부터 목적되는 2개 이상의 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 2개 이상의 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 여기서 상기 세포는 적어도 하나의 목적되는 단백질을 인코딩하는 내생적 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작되고, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징된다.
일부 구체예에서, 목적되는 2개 이상의 단백질 중에서 적어도 하나는 이합체성 단백질이다. 다른 구체예에서, 목적되는 이합체성 단백질은 동종이합체성 단백질이다. 다른 구체예에서, 목적되는 이합체성 단백질은 이종이합체성 단백질이다. 일부 구체예에서, 목적되는 2개 이상의 단백질 중에서 적어도 하나는 다합체성 단백질이다. 다른 구체예에서, 목적되는 다합체성 단백질은 동종다합체성 단백질이다. 다른 구체예에서, 목적되는 다합체성 단백질은 이종다합체성 단백질이다.
이들 구체예 중에서 일부에서, 목적되는 2개 이상의 단백질 중에서 하나는 내생적 핵산에 의해 인코딩된다. 다른 구체예에서, 목적되는 2개 이상의 단백질 중에서 하나는 도입된 핵산에 의해 인코딩된다. 다른 구체예에서, 목적되는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 목적되는 2개 이상의 단백질 중에서 하나는 이온 채널, G 단백질 결합된 수용체 (GPCR), 티로신 수용체 키나아제, 사이토카인 수용체, 핵 스테로이드 호르몬 수용체 및 면역학적 수용체로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 목적되는 2개 이상의 단백질은 독립적으로 항체 또는 생물학적 약제이다. 다른 구체예에서, 목적되는 단백질 중에서 하나는 공지된 리간드를 갖지 않는다. 다른 구체예에서, 목적되는 2개 이상의 단백질의 기능적 발현을 검출하는 공지된 분석법이 존재하지 않는다.
일부 구체예에서, 목적되는 2개 이상의 단백질 중에서 하나는 동일한 유형의 세포에서 발현되지 않는다. 일부 구체예에서, 2개 이상의 단백질을 발현하는 세포는 포유동물 세포이다.
일부 구체예에서, 2개 이상의 단백질을 발현하는 세포는 시간의 흐름 동안 안정적인 1 이상의 신호 대 잡음 비율 (signal to noise ratio), 발현의 상실 없이 선별 압력 없는 성장, 생리학적 EC50 값, 그리고 생리학적 IC50 값으로 구성된 군에서 선택되는 추가의 원하는 특성을 갖는 것으로 더욱 특징된다.
일부 구체예에서, 목적되는 2개 이상의 단백질은 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 그리고 적어도 9개월에서 선택되는 기간 동안 일관되고 재현가능한 형태로 생산된다.
일부 구체예에서, 기능 분석은 세포-기초된 분석, 형광 세포-기초된 분석, 고처리량 스크리닝 분석, 리포터 세포-기초된 분석, G 단백질 매개된 세포-기초된 분석, 그리고 칼슘 유동 세포-기초된 분석으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 기능 분석은 막 전위 분석, ELISA, 질량 분석, 목적되는 단백질의 생물학적 특성화, 세포 성장 분석, 생존능 분석, 세포 명확화 분석, 또는 단백질 생산의 능력이다. 일부 구체예에서, 2개 이상의 단백질을 발현하는 세포는 세포 기초된 고처리량 스크리닝에서 이용에 적합하다.
일부 구체예에서, 2개 이상의 단백질을 발현하는 세포는 선별 압력의 부재에서 배양된다. 일부 구체예에서, 선별 압력은 항생제이다. 일부 구체예에서, 이러한 세포는 적어도 15일, 30일, 45일, 60일, 75일, 100일, 120일, 또는 150일 동안 선별 압력의 부재에서 2개 이상의 단백질을 발현한다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 적어도 하나의 목적되는 RNA를 발현하는 세포를 제시하고, 여기서 상기 목적되는 RNA는 도입된 핵산에 의해 인코딩되고, 상기 세포는 기능 분석에 이용하기 적합한 형태로, 적어도 하나의 목적되는 RNA를 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 목적되는 RNA는 태그를 포함하지 않거나, 또는 상기 RNA는 상기 형태에서 일관되게 및 재현가능하게 생산되고, 따라서 상기 세포는 기능 분석에서 적어도 0.4의 Z' 인자를 갖고, 또는 상기 세포는 선별 압력 (selective pressure)의 부재에서 배양되고, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 적어도 하나의 목적되는 RNA를 발현하는 세포를 제시하고, 여기서 상기 세포는 적어도 하나의 목적되는 RNA를 인코딩하는 내생적 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작되고, 상기 세포는 기능 분석에 이용하기 적합한 형태로, 적어도 하나의 목적되는 RNA를 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 목적되는 RNA는 태그를 포함하지 않거나, 또는 상기 RNA는 상기 형태에서 일관되게 및 재현가능하게 생산되고, 따라서 상기 세포는 기능 분석에서 적어도 0.4의 Z' 인자를 갖고, 또는 상기 세포는 선별 압력 (selective pressure)의 부재에서 배양되고, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구체예에서, 이러한 세포는 목적되는 적어도 2개의 RNA를 발현한다. 다른 구체예에서, 이러한 세포는 목적되는 적어도 3개의 RNA를 발현한다. 일부 구체예에서, 이러한 세포는 도입된 핵산에 의해 인코딩된 RNA를 더욱 발현한다. 일부 구체예에서, 목적되는 RNA는 이온 채널을 인코딩하는 RNA, G 단백질 결합된 수용체 (GPCR)를 인코딩하는 RNA, 티로신 수용체 키나아제를 인코딩하는 RNA, 사이토카인 수용체를 인코딩하는 RNA, 핵 스테로이드 호르몬 수용체를 인코딩하는 RNA 및 면역학적 수용체를 인코딩하는 RNA로 구성된 군에서 선택된다. 다른 구체예에서, 목적되는 RNA는 항체를 인코딩하는 RNA 또는 생물학적 약제를 인코딩하는 RNA이다.
일부 구체예에서, 목적되는 RNA는 동일한 유형의 세포에서 발현되지 않는다. 일부 구체예에서, 목적되는 RNA를 발현하는 세포는 포유동물 세포이다.
일부 구체예에서, 목적되는 RNA를 발현하는 세포는 시간의 흐름 동안 안정적인 1 이상의 신호 대 잡음 비율 (signal to noise ratio), 발현의 상실 없이 선별 압력 없는 성장, 생리학적 EC50 값, 그리고 생리학적 IC50 값으로 구성된 군에서 선택되는 추가의 원하는 특성을 갖는 것으로 더욱 특징된다. 일부 구체예에서, 목적되는 RNA는 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 그리고 적어도 9개월에서 선택되는 기간 동안 일관되고 재현가능한 형태로 생산된다.
일부 구체예에서, 기능 분석은 세포-기초된 분석, 형광 세포-기초된 분석, 고처리량 스크리닝 분석, 리포터 세포-기초된 분석, G 단백질 매개된 세포-기초된 분석, 그리고 칼슘 유동 세포-기초된 분석으로 구성된 군에서 선택된다. 다른 구체예에서, 기능 분석은 막 전위 분석, ELISA, 질량 분석, 목적되는 단백질의 생물학적 특성화, 세포 성장 분석, 생존능 분석, 세포 명확화 분석, 또는 단백질 생산의 능력이다.
일부 구체예에서, 목적되는 RNA를 발현하는 세포는 세포 기초된 고처리량 스크리닝에서 이용에 적합하다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 본 명세서에서 기술된 세포로부터 생산된 세포주를 제시한다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 단백질을 발현하는 세포를 생산하는 방법을 제시하고, 여기서 상기 세포는 시간의 흐름 동안 일정한 적어도 하나의 원하는 특성을 갖고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 목적되는 단백질을 인코딩하는 mRNA를 발현하는 복수의 세포를 제공하는 단계;
b) 이들 세포를 개별 배양 용기 내로 개별적으로 분산시켜 복수의 별개의 세포 배양액을 제공하는 단계;
c) 자동화 세포 배양 방법을 이용하여 일단의 원하는 배양 조건 하에 이들 세포를 배양하는 단계, 이들 조건은 별개의 세포 배양액 각각에 대하여 실질적으로 동일한 것으로 특징되고, 이러한 배양 기간 동안 별개의 세포 배양액에 대해 세포의 숫자가 표준화되고, 그리고 이들 별개의 배양액은 동일한 일정에서 계대배양되고;
d) 목적되는 단백질의 적어도 하나의 원하는 특징에 대하여 별개의 세포 배양액을 적어도 2회 평가하는 단계; 그리고
e) 양쪽 분석에서 원하는 특징을 갖는 별개의 세포 배양액을 확인하는 단계. 특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 생산된 세포는 분화된 세포이다. 특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 생산된 세포는 역분화된 세포이다. 특정한 구체예에서, 역분화된 세포는 다분화성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 암 줄기 세포, 장기-특이적 줄기 세포 및 조직-특이적 줄기 세포로 구성된 군에서 선택되는 줄기 세포이다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 단백질을 발현하는 세포를 생산하는 방법을 제시하고, 여기서 상기 세포는 시간의 흐름 동안 일정한 적어도 하나의 원하는 특성을 갖고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 목적되는 단백질을 인코딩하는 RNA를 발현하는 적어도 2개의 세포를 제공하는 단계;
b) 이들 세포를 개별 배양 용기 내로 개별적으로 분산시켜 복수의 별개의 세포 배양액을 제공하는 단계;
c) 자동화 세포 배양 방법을 이용하여 일단의 원하는 배양 조건 하에 이들 세포를 배양하는 단계, 이들 조건은 별개의 세포 배양액 각각에 대하여 실질적으로 동일한 것으로 특징되고, 이러한 배양 기간 동안 별개의 세포 배양액에 대해 세포의 숫자가 표준화되고, 그리고 이들 별개의 배양액은 동일한 일정에서 계대배양되고;
d) 목적되는 단백질의 적어도 하나의 원하는 특징에 대하여 별개의 세포 배양액을 적어도 2회 평가하는 단계; 그리고
e) 양쪽 분석에서 원하는 특징을 갖는 별개의 세포 배양액을 확인하는 단계. 특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 생산된 세포는 분화된 세포이다. 특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 생산된 세포는 역분화된 세포이다. 특정한 구체예에서, 역분화된 세포는 다분화성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 암 줄기 세포, 장기-특이적 줄기 세포 및 조직-특이적 줄기 세포로 구성된 군에서 선택되는 줄기 세포이다.
일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법의 단계 a)에서 복수의 세포는 단계 b)에서 분산에 앞서 일정한 기간 동안 배양된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 이용되는 개별 배양 용기는 멀티웰 (multi well) 평판의 개별 웰 및 바이알 (vial)로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 복수의 별개의 세포 배양액의 성장 속도를 결정하는 단계, 그리고 임의의 군에서 가장 빠른 성장 속도와 가장 느린 성장 속도 사이에 차이가 단계 b)와 c) 사이에 1, 2, 3, 4 또는 5시간 이하가 되도록 그들의 성장 속도에 따라 별개의 세포 배양액을 군으로 집단화 (grouping)하는 단계를 더욱 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 하나 이상의 별개의 배양액의 보관된 원액을 제조하는 단계를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 별개의 세포 배양액의 하나 이상의 복제물 세트를 제조하는 단계 및 공급원 별개의 세포 배양액으로부터 별개로 하나 이상의 복제물 세트를 배양하는 단계를 더욱 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법의 단계 d)에서 평가는 단백질에 대한 기능 분석이다.
일부 구체예에서, 단계 e)에서 일정하게 유지되는 적어도 하나의 특징은 단백질 기능이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법의 단계 c)에서 배양은 로봇식 세포 배양 장치이다. 일부 구체예에서, 로봇식 세포 배양 장치는 다중-채널 로봇식 피펫터를 포함한다. 일부 구체예에서, 다중-채널 로봇식 피펫터는 적어도 96개의 채널을 포함한다. 일부 구체예에서, 로봇식 세포 배양 장치는 신품-채집 팔 (cherry-picking arm)을 더욱 포함한다.
일부 구체예에서, 이들 자동화 방법은 배지 제거, 배지 교체, 세포 세척, 시약 첨가, 세포 제거, 세포 분산, 그리고 세포 계대배양 중에서 한 가지 이상을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 이용된 복수의 별개의 세포 배양액은 적어도 50개의 배양액이다. 다른 구체예에서, 복수의 별개의 세포 배양액은 적어도 100개의 배양액이다. 다른 구체예에서, 복수의 별개의 세포 배양액은 적어도 500개의 배양액이다. 또 다른 구체예에서, 복수의 별개의 세포 배양액은 적어도 1000개의 배양액이다.
일부 구체예에서, 성장 속도는 ATP 측정, 세포 포화도, 광 산란, 흡광도 측정으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 결정된다. 일부 구체예에서, 일군 내에서 가장 빠른 성장 속도와 가장 느린 성장 속도 사이에 차이는 1, 2, 3, 4, 또는 5시간 이하이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법의 단계 c)에서 배양 기간은 적어도 2일이다.
일부 구체예에서, 복수의 별개의 세포 배양액의 성장 속도는 세포를 분산시키고 세포 포화도를 측정함으로써 결정된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법의 별개의 세포 배양액 각각에서 세포는 세포 포화도를 측정하기에 앞서 분산된다. 일부 구체예에서, 분산 단계는 웰에 트립신을 첨가하고 덩어리를 제거하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 분산 단계는 세포 해리 시약을 웰에 첨가하고 덩어리를 제거하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 별개의 세포 배양액의 세포 포화도는 자동화 마이크로평판 판독기를 이용하여 측정된다.
일부 구체예에서, 성장 속도가 계산되기에 앞서, 적어도 2회의 포화도 측정이이루어진다. 일부 구체예에서, 세포 포화도는 자동화 평판 판독기에 의해 측정되고, 그리고 포화도 값은 성장 속도를 계산하는 소프트웨어 프로그램에 이용된다.
일부 구체예에서, 단계 d)에서 별개의 세포 배양액은 취성, 형태, 고체 표면에 부착, 고체 표면에 부착의 결여 및 단백질 기능 중에서 한 가지 이상에서 선택되는 원하는 형질에 대한 특성화 (characterization)이다. 다른 구체예에서, 원하는 형질은 UPR, 세포 생존능, 향상된 단백질 생산에 대한 능력, 수율, 접힘, 조립, 분비, 세포 막 내로 통합, 번역후 변형, 당화, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 이용되는 세포는 진핵 세포이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 이용되는 진핵 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구체예에서, 포유동물 세포주는 NS0 세포, CHO 세포, COS 세포, HEK-293 세포, HUVEC, 3T3 세포 및 HeLa 세포로 구성된 군에서 선택된다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포주는 Perc6이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법에서 발현되는 목적되는 단백질은 인간 단백질이다. 일부 구체예에서, 목적되는 단백질은 이종다합체이다. 일부 구체예에서, 목적되는 단백질은 G 단백질 결합된 수용체이다. 다른 구체예에서, 상기 단백질은 공지된 리간드를 갖지 않는다. 다른 구체예에서, 상기 단백질의 기능적 발현을 검출하는 공지된 분석법이 존재하지 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 확인 단계 이후에, 아래의 단계를 더욱 포함한다:
a) 원하는 배양 조건 하에 단계 e)에서 확인된 세포 배양액의 보관된 분취량 (aliquot)을 증식하는 단계; 그리고
b) a)의 증식된 세포 배양액이 원하는 특징을 갖는 지를 결정하는 단계.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 클론 세포주의 정합된 패널 (matched panel)을 제시하고, 여기서 이들 클론 세포주는 동일한 세포 유형이고, 그리고 여기서 상기 패널 내에 각 세포주는 목적되는 단백질을 발현하고, 그리고 여기서 상기 패널 내에 이들 클론 세포주는 병렬 처리 (parallel processing)를 가능하게 하는 동일한 생리학적 특성을 공유하도록 정합된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 클론 세포주의 정합된 패널을 제시하고, 여기서 이들 클론 세포주는 동일한 세포 유형이고, 그리고 여기서 패널 내에 적어도 2개의 세포주는 목적되는 단백질을 발현하고, 그리고 여기서 패널 내에 이들 클론 세포주는 병렬 처리를 가능하게 하는 동일한 생리학적 특성을 공유하도록 정합된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 클론 세포주의 조합 정합된 패널을 제시하고, 여기서 이들 클론 세포주는 동일한 유형이고, 그리고 여기서 패널 내에 적어도 2개의 세포주는 목적되는 다중-아단위 단백질을 발현하고, 그리고 여기서 상기 클론 세포주 각각은 목적되는 다중-아단위 단백질의 아단위의 상이한 조합을 포함하고; 그리고 여기서 상기 패널의 클론 세포주는 그들이 동일한 세포 배양 조건 하에 동시에 성장되도록 정합된다.
일부 구체예에서, 생리학적 특성은 성장 속도이다. 다른 구체예에서, 생리학적 특성은 조직 배양액 표면에 부착이다. 다른 구체예에서, 생리학적 특성은 Z' 인자이다. 다른 구체예에서, 생리학적 특성은 목적되는 단백질을 인코딩하는 RNA의 발현 수준이다. 또 다른 구체예에서, 생리학적 특성은 목적되는 단백질의 발현 수준이다. 또 다른 구체예에서, 생리학적 특성은 목적되는 단백질을 인코딩하는 RNA의 활성 수준이다. 일부 구체예에서, 패널 내에 이들 클론 세포주의 성장 속도는 서로, 1, 2, 3, 4, 또는 5시간 이내이다. 다른 구체예에서, 정합된 패널에 이용된 배양 조건은 패널 내에 모든 클론 세포주에 대하여 동일하다.
일부 구체예에서, 정합된 패널에서 이용되는 클론 세포주는 진핵 세포주이다. 일부 구체예에서, 진핵 세포주는 포유동물 세포주이다. 일부 구체예에서, 정합된 패널에서 이용되는 세포주 세포는 일차 세포 및 영속화 세포로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 정합된 패널에서 이용되는 세포주 세포는 원핵 또는 진핵이다. 일부 구체예에서, 정합된 패널에서 이용되는 세포주 세포는 진핵이고 진균류 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 효모 세포, 조류 (algae), 갑각류 세포, 절지동물 세포, 조류 (avian) 세포, 파충류 세포, 양서류 세포 및 식물 세포로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 정합된 패널에서 이용되는 세포주 세포는 포유류이고 인간, 비-인간 영장류, 소, 돼지, 고양이, 쥐, 유대류, 뮤린, 개, 양, 염소, 토끼, 기니 피그 및 햄스터로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 정합된 패널의 세포주 내에 세포는 목적되는 단백질을 발현하도록 조작된다. 일부 구체예에서, 정합된 패널의 세포주 내에 세포는 상기 단백질 또는, 다합체성 단백질의 경우에, 상기 단백질의 아단위를 인코딩하는 도입된 핵산으로부터 목적되는 단백질을 발현한다. 일부 구체예에서, 이들 세포는 내생적 핵산으로부터 목적되는 단백질을 발현하고, 그리고 여기서 상기 세포는 내생적 단백질의 전사를 활성화시키도록 또는, 다합체성 단백질의 경우에, 상기 단백질의 아단위의 전사를 활성화시키도록 조작된다.
일부 구체예에서, 패널은 적어도 4개의 클론 세포주를 포함한다. 다른 구체예에서, 패널은 적어도 6개의 클론 세포주를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 패널은 적어도 25개의 클론 세포주를 포함한다.
일부 구체예에서, 패널 내에 2개 이상의 클론 세포주가 동일한 목적되는 단백질을 발현한다. 다른 구체예에서, 패널 내에 2개 이상의 클론 세포주가 상이한 목적되는 단백질을 발현한다.
일부 구체예에서, 패널 내에 세포주는 목적되는 단백질의 상이한 형태를 발현하고, 여기서 이들 형태는 동종형, 아미노산 서열 변이체, 절단접합 변이체, 절두된 형태, 융합 단백질, 키메라, 또는 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 다른 구체예에서, 이들 형태는 활성 형태, 변형된 형태, 당화된 형태, 단백질분해된 형태, 또는 기능적 형태, 또는 이들의 조합이다. 또 다른 구체예에서, 이들 형태는 동종형, 아미노산 서열 변이체, 절단접합 변이체, 절두된 형태, 융합 단백질, 키메라, 활성 형태, 변형된 형태, 당화된 형태, 단백질분해된 형태, 기능적 형태 또는 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 패널 내에 세포주는 일군의 목적되는 단백질에서 상이한 단백질을 발현하고, 여기서 목적되는 단백질의 군은 동일한 신호전달 경로 내에 단백질, 유사한 단백질의 발현 라이브러리, 단일클론 항체 중쇄 라이브러리, 단일클론 항체 경쇄 라이브러리 및 SNP로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 패널에서 발현되는 목적되는 단백질은 단일 사슬 단백질이다. 일부 구체예에서, 단일 사슬 단백질은 G 단백질 결합된 수용체이다. 일부 구체예에서, G 단백질 결합된 수용체는 미각 수용체이다. 일부 구체예에서, 미각 수용체는 쓴맛 수용체, 단맛 수용체, 짠맛 수용체 및 감칠맛 수용체로 구성된 군에서 선택된다.
다른 구체예에서, 패널에서 발현되는 목적되는 단백질은 다합체성 단백질이다. 일부 구체예에서, 목적되는 단백질은 이종이합체 또는 이종다합체이다.
일부 구체예에서, 패널에서 발현되는 목적되는 단백질은 이온 채널, G 단백질 결합된 수용체 (GPCR), 티로신 수용체 키나아제, 사이토카인 수용체, 핵 스테로이드 호르몬 수용체 및 면역학적 수용체로 구성된 군에서 선택된다. 다른 구체예에서, 패널에서 발현되는 목적되는 단백질은 항체 또는 생물학적 약제이다. 일부 구체예에서, 정합된 패널에서 발현되는 단백질은 상피 나트륨 채널 (ENaC)이다. 일부 구체예에서, ENaC는 알파 아단위, 베타 아단위 및 감마 아단위를 포함한다. 다른 구체예에서, 패널 내에 세포주는 상이한 ENaC 동종형을 발현한다. 다른 구체예에서, 패널 내에 세포주는 ENaC의 상이한 단백질분해된 동종형을 포함한다. 일부 구체예에서, ENaC는 인간 ENaC이다. 일정한 구체예에서, 정합된 패널에서 발현된 단백질은 전압 개폐 나트륨 채널 (NaV)이다. 일부 구체예에서, NaV는 1개의 알파 아단위 및 2개의 베타 아단위를 포함한다. 일부 구체예에서, NaV는 인간 NaV이다.
일부 구체예에서, 정합된 패널에서 발현되는 단백질은 감마-아미노부티르산 A 수용체 (GABAA 수용체), 감마-아미노부티르산 B 수용체 (GABAB 수용체) 및 감마-아미노부티르산 C 수용체 (GABAC 수용체)로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 이러한 단백질은 GABAA 수용체이다. 일부 구체예에서, GABAA 수용체는 2개의 알파 아단위, 2개의 베타 아단위 및 1개의 감마 또는 델타 아단위를 포함한다.
일부 구체예에서, 패널 내에 클론 세포주는 동시에, 또는 서로 4주 이내에 생산된다. 다른 구체예에서, 패널 내에 클론 세포주는 상기 패널의 클론 세포주의 분리, 유지 또는 검사를 위한 실질적으로 동일한 방법을 이용하여 생산되었다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 단일체성 단백질을 인코딩하는 도입된 핵산으로부터 목적되는 단일체성 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 세포는 선별 압력의 부재에서 배양되고, 그리고 여기서 상기 단백질의 발현은 3개월 동안 5% 이상 변하지 않는다. 일정한 구체예에서, 상기 단백질의 발현은 6개월 동안 5% 이상 변하지 않는다. 일부 구체예에서, 목적되는 단일체성 단백질은 공지된 리간드를 갖지 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 단일체성 단백질을 인코딩하는 도입된 핵산으로부터 목적되는 단일체성 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 세포는 선별 압력의 부재에서 배양되고, 그리고 여기서 상기 단백질의 발현은 3개월 동안 30% 이상 변하지 않는다. 일정한 구체예에서, 상기 단백질의 발현은 6개월 동안 30% 이상 변하지 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 적어도 하나의 목적되는 RNA를 발현하는 세포를 제시하고, 여기서 상기 목적되는 RNA는 도입된 핵산에 의해 인코딩되고, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 RNA를 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 세포는 선별 압력의 부재에서 배양되고, 그리고 여기서 상기 RNA의 발현은 3개월 동안 30% 이상 변하지 않는다. 일정한 구체예에서, 상기 RNA의 발현은 6개월 동안 30% 이상 변하지 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 여기서 상기 목적되는 단백질은 도입된 핵산에 의해 인코딩되고, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 세포는 선별 압력의 부재에서 배양되고, 그리고 여기서 상기 단백질의 발현은 3개월 동안 30% 이상 변하지 않는다. 일정한 구체예에서, 상기 단백질의 발현은 6개월 동안 30% 이상 변하지 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 적어도 하나의 목적되는 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 여기서 목적되는 단백질은 공지된 리간드를 갖지 않거나, 또는 상기 목적되는 단백질의 기능적 발현을 검출하는 공지된 분석법이 존재하지 않고; 그리고 여기서 상기 목적되는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 단백질의 조절제를 확인하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 앞서 기술된 세포 구체예 중에서 임의의 한 가지에 따른 세포를 검사 화합물과 접촉시키는 단계; 그리고
b) 검사 화합물에 의해 접촉되지 않은 세포 내에서 단백질의 활성과 비교하여, 검사 화합물과 접촉된 세포 내에서 목적되는 단백질의 활성에서 변화를 검출하는 단계;
여기서 부재에서와 비교하여 존재에서 활성의 차이를 발생시키는 화합물은 목적되는 단백질의 조절제이다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 선행 단락의 방법에 의해 확인된 조절제를 제시한다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 적어도 하나의 목적되는 단백질을 인코딩하는 도입된 핵산으로부터 상기 적어도 하나의 목적되는 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 여기서 적어도 하나의 목적되는 단백질은 상기 세포의 생리학적 특성을 변화시키고, 그리고 여기서 상기 세포의 생리학적 특성은 일정한 세포 배양 조건 하에 3개월 동안 25% 이상 변하지 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 여기서 상기 세포는 목적되는 단백질을 인코딩하는 내생적 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작되고, 여기서 목적되는 단백질은 상기 세포의 생리학적 특성을 변화시키고, 그리고 여기서 상기 세포의 생리학적 특성은 일정한 세포 배양 조건 하에 3개월 동안 25% 이상 변하지 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 RNA를 발현하는 세포를 제시하고, 여기서 목적되는 RNA는 도입된 핵산에 의해 인코딩되고, 여기서 적어도 하나의 목적되는 RNA는 상기 세포의 생리학적 특성을 변화시키고, 그리고 여기서 상기 세포의 생리학적 특성은 일정한 세포 배양 조건 하에 3개월 동안 25% 이상 변하지 않는다.
적어도 하나의 목적되는 단백질을 인코딩하는 도입된 핵산으로부터 적어도 하나의 목적되는 단백질을 발현하는 세포, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 그리고 여기서 상기 세포는 일일 세포당 적어도 500, 2,500, 5,000, 또는 100,000 피코그람 (picogram)의 단백질을 일관되게 및 재현가능하게 발현한다.
목적되는 단백질을 발현하는 세포, 여기서 상기 세포는 목적되는 단백질을 인코딩하는 내생적 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작되고, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 그리고 여기서 상기 세포는 일일 세포당 적어도 500, 2,500, 5,000, 또는 100,000 피코그람의 단백질을 일관되게 및 재현가능하게 발현한다.
일부 구체예에서, 상기 세포는 1주 이하, 2주 이하, 3주 이하, 4주 이하, 1개월 이하, 2개월 이하, 3개월 이하, 4개월 이하, 5개월 이하, 6개월 이하, 7개월 이하, 8개월 이하 또는 9개월 이하에서 선택되는 기간 동안 생산된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 적어도 하나의 목적되는 단백질을 인코딩하는 도입된 핵산으로부터 적어도 하나의 목적되는 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 세포는 7개월 이하, 8개월 이하 또는 9개월 이하에서 선택되는 기간 동안 생산되고, 그리고 여기서 상기 세포는 적어도 0.5, 1.0, 5.0 또는 10 g/L의 단백질을 일관되게 및 재현가능하게 발현한다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 단백질을 발현하는 세포를 제시하고, 여기서 상기 세포는 목적되는 단백질을 인코딩하는 내생적 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작되고, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 세포는 7개월 이하, 8개월 이하 또는 9개월 이하에서 선택되는 기간 동안 생산되고, 그리고 여기서 상기 세포는 적어도 0.5, 1.0, 5.0 또는 10 g/L의 단백질을 일관되게 및 재현가능하게 발현한다.
일부 구체예에서, 상기 세포는 3개월 이하, 4개월 이하 또는 6개월 이하에서 선택되는 기간 동안 생산된다. 일부 구체예에서, 목적되는 단백질은 단일체성 단백질이다. 다른 구체예에서, 목적되는 단백질은 다합체성 단백질이다. 일부 구체예에서, 목적되는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나, 또는 상기 세포는 선별 압력의 부재에서 배양되거나, 또는 이들의 조합이다. 일부 구체예에서, 목적되는 다합체성 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아단위를 포함한다. 일부 구체예에서, 목적되는 다합체성 단백질은 이온 채널, G 단백질 결합된 수용체 (GPCR), 티로신 수용체 키나아제, 사이토카인 수용체, 핵 스테로이드 호르몬 수용체, 항체, 생물학적 수용체 및 면역학적 수용체로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 목적되는 다합체성 단백질은 이온 채널이고, 그리고 세포 생리학적 특성은 막 전위, UPR, 세포 생존능, 향상된 단백질 생산에 대한 능력, 수율, 접힘, 조립, 분비, 세포 막 내로 통합, 번역후 변형, 당화, 또는 이들의 임의의 조합에서 선택된다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 본 명세서에서 기술된 세포로부터 생산된 세포주를 제시한다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 단백질의 조절제를 확인하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 본 명세서에서 기술된 세포 (가령, 적어도 하나의 목적되는 단백질 또는 RNA를 발현하는 세포)를 검사 화합물과 접촉시키는 단계; 그리고
b) 검사 화합물에 의해 접촉되지 않은 세포 내에서 단백질의 활성과 비교하여, 검사 화합물과 접촉된 세포 내에서 목적되는 단백질의 활성에서 변화를 검출하는 단계;
여기서 부재에서와 비교하여 존재에서 활성의 차이를 발생시키는 화합물은 목적되는 단백질의 조절제이다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 본 명세서에서 기술된 적어도 2개의 세포 (가령, 적어도 하나의 목적되는 단백질 또는 RNA를 발현하는 세포) 또는 본 명세서에서 기술된 적어도 2개의 클론 세포주 (가령, 본 명세서에서 기술된 세포로부터 생산된 세포주)를 포함하는 세포 또는 클론 세포주의 정합된 패널을 제시하고, 여기서 적어도 2개의 세포 또는 적어도 2개의 클론 세포주는 그들이 동일한 세포 배양 조건 하에 동시에 성장되도록 정합된다.
일부 구체예에서, 정합된 패널은 적어도 10개의 세포 또는 적어도 10개의 클론 세포주를 포함하고, 그리고 적어도 10개의 세포 또는 적어도 10개의 클론 세포주는 그들이 동일한 세포 배양 조건 하에 동시에 성장되도록 정합된다. 다른 구체예에서, 패널은 적어도 100개의 세포 또는 적어도 100개의 클론 세포주를 포함하고, 그리고 적어도 100개의 세포 또는 적어도 100개의 클론 세포주는 동일한 세포 배양 조건 하에 동시에 성장된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 클론 세포주의 정합된 패널을 제시하고, 여기서 이들 클론 세포주는 동일한 유형이고 첫 번째와 두 번째 목적되는 단백질을 포함하고; 여기서 첫 번째 목적되는 단백질은 각 클론 세포주에서 동일하고; 여기서 두 번째 목적되는 단백질은 기능적 생물학적 경로의 성분이고; 그리고 여기서:
a) 상기 패널은 적어도 5개의 세포주를 포함하고;
b) 상기 패널은 6개월 이하 동안 생산되고;
c) 첫 번째와 두 번째 목적되는 단백질은 단백질 태그를 갖지 않고;
d) 이들 클론 세포주는 선별 압력의 부재에서 배양되고; 또는
e) a)-d)의 임의의 조합이다.
일부 구체예에서, 첫 번째 목적되는 단백질은 항체이고, 그리고 기능적 생물학적 경로는 당화 경로이다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 생체내 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관 (in vitro correlate)을 산출하는 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 이러한 생리학적 특성을 갖는 화합물 또는 복수의 화합물을 첫 번째 목적되는 단백질을 발현하는 첫 번째 세포와 접촉시키는 단계;
b) 기능 분석에서 첫 번째 단백질에 대한 상기 화합물 또는 복수의 화합물의 효과를 평가하는 단계;
c) 상기 화합물 또는 복수의 화합물을 두 번째 목적되는 단백질을 발현하는 두 번째 세포와 접촉시키는 단계;
d) 기능 분석에서 두 번째 단백질에 대한 상기 화합물 또는 복수의 화합물의 효과를 평가하는 단계;
여기서 첫 번째와 두 번째 단백질은 독립적으로 i) 단백질 태그를 포함하지 않고, ii) 이들 세포가 기능 분석에서 적어도 0.4의 Z' 인자를 갖도록 기능 분석에 이용하기 적합한 형태로 일관되게 및 재현가능하게 생산되고, iii) 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 발현되고, iv) 상기 세포의 생리학적 특성을 변화시키고, 그리고 여기서 상기 세포의 생리학적 특성은 일정한 세포 배양 조건 하에 3개월 동안 25% 이상 변하지 않고; v) 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 안정적으로 발현되고, 그리고 여기서 상기 단백질의 발현은 3개월 동안 30% 이상 변하지 않고, vi) 다른 단백질을 더욱 발현하는 세포에서 발현되고, 그리고 상기 세포는 선별 압력의 부재에서 배양되고, 또는 vii) 이들의 임의의 조합이고; 그리고 여기서 단계 a) 내지 d)에서 획득된 프로필은 생체내 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 제시한다.
일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 목적되는 단백질은 독립적으로 단일체성 단백질 또는 다합체성 단백질에서 선택된다. 일부 구체예에서, 다합체성 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아단위를 포함한다. 일부 구체예에서, 다합체성 단백질은 이종다합체성 단백질이다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 목적되는 단백질은 독립적으로 ENaC, NaV, GABAA, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 쓴맛 수용체, CFTR 및 GCC로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 첫 번째 세포 및 두 번째 세포는 적어도 하나의 다른 세포를 더욱 포함하는 세포의 패널 내에 세포이다; 세포의 패널 내에 각 세포는 상이한 단백질을 발현하도록 조작되고, 그리고 화합물 또는 복수의 화합물에 의해 접촉된다; 세포의 패널 내에 각 세포에서 발현된 각 단백질에 대한 상기 화합물 또는 복수의 화합물의 효과는 기능 분석에서 평가된다; 그리고 각 세포에서 상기 화합물 또는 복수의 화합물의 활성 프로필은 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 산출하는데 이용된다.
일부 구체예에서, 각 단백질은 단일체성 단백질 또는 다합체성 단백질에서 독립적으로 선택된다. 일부 구체예에서, 다합체성 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아단위를 포함한다. 일부 구체예에서, 다합체성 단백질은 이종다합체성 단백질이다. 일부 구체예에서, 각 단백질은 독립적으로 ENaC, NaV, GABAA, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 쓴맛 수용체, CFTR 및 GCC로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 검사 화합물의 생리학적 특성을 예측하는 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 본 명세서에서 앞서 기술된 첫 번째 목적되는 단백질 (가령, 생체내 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 산출하기 위한 방법에서 기술된 바와 같은 첫 번째 목적되는 단백질)을 발현하는 첫 번째 세포와 접촉시키는 단계;
b) 기능 분석에서 첫 번째 단백질에 대한 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 효과를 평가하는 단계;
c) 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 본 명세서에서 앞서 기술된 두 번째 목적되는 단백질 (가령, 생체내 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 산출하기 위한 방법에서 기술된 바와 같은 두 번째 목적되는 단백질)을 발현하는 두 번째 세포와 접촉시키는 단계;
d) 기능 분석에서 두 번째 단백질에 대한 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 효과를 평가하는 단계;
e) 단계 a) 내지 d)에서 획득된 화합물의 활성 프로필을 본 명세서에서 앞서 기술된 방법 (가령, 생체내 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 산출하는 방법)에 의해 산출된 바와 같은 시험관내 상관과 비교하는 단계,
여기서 첫 번째와 두 번째 단백질은 독립적으로 i) 단백질 태그를 포함하지 않고, ii) 이들 세포가 기능 분석에서 적어도 0.4의 Z' 인자를 갖도록 기능 분석에 이용하기 적합한 형태로 일관되게 및 재현가능하게 생산되고, iii) 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 발현되고, iv) 상기 세포의 생리학적 특성을 변화시키고, 그리고 여기서 상기 세포의 생리학적 특성은 일정한 세포 배양 조건 하에 3개월 동안 25% 이상 변하지 않고; v) 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 안정적으로 발현되고, 그리고 여기서 상기 단백질의 발현은 3개월 동안 30% 이상 변하지 않고, vi) 다른 단백질을 더욱 발현하는 세포에서 발현되고, 그리고 상기 세포는 선별 압력의 부재에서 배양되고, 또는 vii) 이들의 임의의 조합이고; 그리고 여기서 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물은 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 활성 프로필 및 시험관내 상관의 활성 프로필이 적어도 90% 동일하면, 시험관내 상관의 생리학적 특성을 갖는 것으로 예측된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 생리학적 특성을 확증하는 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 본 명세서에서 앞서 기술된 첫 번째 목적되는 단백질 (가령, 생체내 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 산출하기 위한 방법에서 기술된 바와 같은 첫 번째 목적되는 단백질)을 발현하는 첫 번째 세포와 접촉시키는 단계;
b) 기능 분석에서 첫 번째 단백질에 대한 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 효과를 평가하는 단계;
c) 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 본 명세서에서 앞서 기술된 두 번째 목적되는 단백질 (가령, 생체내 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 산출하기 위한 방법에서 기술된 바와 같은 두 번째 목적되는 단백질)을 발현하는 두 번째 세포와 접촉시키는 단계;
d) 기능 분석에서 두 번째 단백질에 대한 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 효과를 평가하는 단계;
e) 단계 a) 내지 d)에서 획득된 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 활성 프로필을 본 명세서에서 앞서 기술된 방법 (가령, 생체내 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 산출하는 방법)에 의해 산출된 바와 같은 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관과 비교하는 단계,
여기서 첫 번째와 두 번째 단백질은 독립적으로 i) 단백질 태그를 포함하지 않고, ii) 이들 세포가 기능 분석에서 적어도 0.4의 Z' 인자를 갖도록 기능 분석에 이용하기 적합한 형태로 일관되게 및 재현가능하게 생산되고, iii) 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 발현되고, iv) 상기 세포의 생리학적 특성을 변화시키고, 그리고 여기서 상기 세포의 생리학적 특성은 일정한 세포 배양 조건 하에 3개월 동안 25% 이상 변하지 않고; v) 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 안정적으로 발현되고, 그리고 여기서 상기 단백질의 발현은 3개월 동안 30% 이상 변하지 않고, vi) 다른 단백질을 더욱 발현하는 세포에서 발현되고, 그리고 상기 세포는 선별 압력의 부재에서 배양되고, 또는 vii) 이들의 임의의 조합이고; 그리고 여기서 상기 화합물은 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 활성 프로필 및 시험관내 상관의 활성 프로필이 적어도 90% 동일하면, 생리학적 특성을 갖는 것으로 확증된다.
일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 단백질은 독립적으로 단일체성 단백질 또는 다합체성 단백질에서 선택된다. 일부 구체예에서, 다합체성 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아단위를 포함한다. 일부 구체예에서, 다합체성 단백질은 이종다합체성 단백질이다.
일부 구체예에서, 첫 번째 세포 및 두 번째 세포는 적어도 하나의 다른 세포를 더욱 포함하는 세포의 패널 내에 세포이다; 세포의 패널 내에 각 세포는 상이한 단백질을 발현하도록 조작되고, 그리고 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물에 의해 접촉된다; 세포의 패널 내에 각 세포에서 발현된 각 목적되는 단백질에 대한 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 효과는 기능 분석에서 평가된다; 그리고 각 세포에서 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 활성 프로필은 시험관내 상관의 프로필과 비교하는데 이용된다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 첫 번째 목적되는 다합체성 단백질 및 두 번째 목적되는 다합체성 단백질은 이절성 단백질이다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 첫 번째 목적되는 단백질 및 두 번째 목적되는 단백질은 이합체성 단백질이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 첫 번째 목적되는 단백질 및 두 번째 목적되는 단백질은 삼합체성 단백질이다. 일부 구체예에서, 첫 번째 목적되는 단백질 및 두 번째 목적되는 단백질은 다합체성 단백질의 상이한 형태이다. 일부 구체예에서, 다합체성 단백질은 GABA A 수용체이다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 첫 번째 또는 두 번째 목적되는 단백질은 기능적 생물학적 경로의 일부이다. 일부 구체예에서, 기능적 생물학적 경로는 당화, 단백질 합성, UPR, ER, 리보솜, 미토콘드리아 활성, RNA 합성, 번역후 변형, 세포 신호전달, 세포 성장 및 세포 사멸로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 생리학적 특성은 치료 효과이다. 일부 구체예에서, 생리학적 특성은 역효과이다. 일부 구체예에서, 생리학적 특성에 대한 화합물 또는 복수의 화합물의 효과는 고처리량 스크리닝에 의해 평가된다. 일부 구체예에서, 본 명세서에서 앞서 기술된 비교 단계는 컴퓨터 시스템에서 수행된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 생리학적 특성을 결정하는 컴퓨터-수행된 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 첫 번째 활성 프로필을 수용하는 단계, 여기서 상기 첫 번째 활성 프로필은 본 명세서에서 앞서 기술된 방법에 의해 산출되고, 그리고 여기서 상기 첫 번째 활성 프로필은 상기 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 제공하고;
b) 상기 첫 번째 활성 프로필을 데이터베이스에 저장된 복수의 대표 활성 프로필에 비교하여 상기 첫 번째 활성 프로필 및 상기 복수의 대표 활성 프로필 내에 각각의 대표 활성 프로필 사이에 유사성 척도를 결정하는 단계, 여기서 각각의 대표 활성 프로필은 개별 공지된 화합물 또는 복수의 공지된 화합물의 공지된 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 제공하고;
c) 단계 (b)에서 결정된 유사성 척도에 기초하여, 상기 첫 번째 활성 프로필에 가장 유사한 하나 이상의 대표 활성 프로필을 결정하는 단계; 그리고
d) 단계 (c)에서 상기 첫 번째 활성 프로필과 가장 유사한 것으로 결정된 하나 이상의 대표 활성 프로필과 연관된 공지된 생리학적 특성을 상기 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 생리학적 특성으로서 확인하는 단계;
여기서 단계 (a), (b), (c), 그리고 (d)는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 대표 활성 프로필은 유사성 척도가 미리 결정된 역치 (predetermined threshold)를 초과하면, 첫 번째 활성 프로필에 가장 유사하다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 특정 생리학적 특성과 연관되는 것으로 특징짓기 위한 컴퓨터-수행된 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 첫 번째 활성 프로필을 수용하는 단계, 여기서 상기 첫 번째 활성 프로필은 본 명세서에서 앞서 기술된 방법에 의해 산출되고, 그리고 여기서 상기 첫 번째 활성 프로필은 상기 검사 화합물 또는 복수의 화합물의 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 제공하고;
b) 복수의 활성 프로필을 군집시키는 단계, 이러한 복수는 상기 첫 번째 활성 프로필 및 복수의 대표 활성 프로필을 포함하고, 여기서 각각의 대표 활성 프로필은 개별 공지된 화합물 또는 복수의 공지된 화합물의 공지된 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 제공하고;
c) 첫 번째 활성 프로필과 함께 군집하는 상기 복수의 대표 활성 프로필에서 하나 이상의 대표 활성 프로필을 확인하는 단계; 그리고
d) 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을, 단계 (c)에서 상기 첫 번째 활성 프로필과 함께 군집되는 것으로 확인된 하나 이상의 대표 활성 프로필에 상응하는 개별 공지된 화합물 또는 복수의 공지된 화합물의 상기 공지된 생리학적 특성과 연관되는 것으로 특징짓는 단계;
여기서 단계 (a), (b), (c), 그리고 (d)는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 식별자를 이용하여 생리학적 특성에 대하여 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 분류하는 컴퓨터-수행된 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 데이터베이스에 저장된 복수의 대표 활성 프로필을 이용하여 약리학적 특성에 대하여 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 분류하기 위하여 식별자를 훈련시키는 단계, 여기서 각각의 대표 활성 프로필은 개별 공지된 화합물 또는 복수의 공지된 화합물의 공지된 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 제공하고; 그리고
b) 상기 식별자를 이용하여, 본 명세서에서 앞서 기술된 방법에 의해 산출된 첫 번째 활성 프로필을 처리하여 생리학적 특성에 대하여 상기 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 분류하는 단계;
여기서 단계 (a)와 (b)는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 식별자를 이용하여 생리학적 특성에 대하여 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 분류하는 컴퓨터-수행된 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 데이터베이스에 저장된 복수의 대표 활성 프로필을 이용하여 약리학적 특성에 대하여 화합물 또는 복수의 화합물을 분류하기 위하여 식별자를 훈련시키는 단계, 여기서 각각의 대표 활성 프로필은 개별 화합물의 공지된 생체내 약리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 제공하고; 그리고
b) 상기 식별자를 이용하여, 본 명세서에서 앞서 기술된 방법에 의해 산출된 첫 번째 활성 프로필을 처리하여 생리학적 특성에 대하여 상기 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 분류하는 단계;
c) 데이터베이스에 저장된 복수의 대표 활성 프로필을 이용하여 생리학적 특성에 대하여 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 분류하기 위하여 상기 식별자를 훈련시키는 단계, 여기서 각각의 대표 활성 프로필은 개별 공지된 화합물 또는 복수의 공지된 화합물의 공지된 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 제공하고;
d) 여기서 단계 (a)와 (b)는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 세포 내에서 목적되는 다합체성 단백질의 활성 아단위 조합을 특징짓기 위한 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 목적되는 다합체성 단백질의 첫 번째 아단위를 발현하는 첫 번째 세포를 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물과 접촉시키는 단계;
b) 목적되는 다합체성 단백질의 두 번째 아단위를 발현하는 두 번째 세포를 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물과 접촉시키는 단계;
c) 목적되는 다합체성 단백질의 첫 번째 아단위 및 두 번째 아단위를 발현하는 세 번째 세포를 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물과 접촉시키는 단계;
d) 기능 분석에서, 목적되는 다합체성 단백질이 첫 번째 세포, 두 번째 세포, 그리고 세 번째 세포에서 발현될 때, 상기 다합체성 단백질에 대한 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 효과를 평가하는 단계;
e) 첫 번째 및/또는 두 번째 아단위가 생물학적으로 활성 다합체성 단백질의 일부인 지를 추론하는 단계,
여기서 단계 a) 내지 d)에서 획득된 프로필은 생체내 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 제공하고,
그리고 여기서 상기 다합체성 단백질의 첫 번째와 두 번째 아단위는 독립적으로 단백질 태그를 포함하지 않거나, 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 발현되거나, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구체예에서, 목적되는 다합체성 단백질은 이종이합체이다. 다른 구체예에서, 목적되는 다합체성 단백질은 이종삼합체이다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 세포 내에서 목적되는 다합체성 단백질의 활성 아단위 조합을 특징짓기 위한 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 목적되는 다합체성 단백질의 첫 번째 아단위를 발현하는 첫 번째 세포를 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물과 접촉시키는 단계;
b) 목적되는 다합체성 단백질의 두 번째 아단위를 발현하는 두 번째 세포를 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물과 접촉시키는 단계;
c) 목적되는 다합체성 단백질의 세 번째 아단위를 발현하는 세 번째 세포를 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물과 접촉시키는 단계;
d) 목적되는 다합체성 단백질의 첫 번째 아단위, 두 번째 아단위, 그리고 세 번째 아단위를 발현하는 네 번째 세포를 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물과 접촉시키는 단계;
e) 기능 분석에서, 목적되는 다합체성 단백질이 첫 번째 세포, 두 번째 세포, 세 번째 세포, 그리고 네 번째 세포에서 발현될 때, 상기 다합체성 단백질에 대한 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 효과를 평가하는 단계;
f) 첫 번째, 두 번째 및/또는 세 번째 아단위가 생물학적으로 활성 다합체성 단백질의 일부인 지를 추론하는 단계;
여기서 상기 다합체성 단백질의 첫 번째, 두 번째와 세 번째 아단위는 독립적으로 단백질 태그를 포함하지 않거나, 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 발현되거나, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구체예에서, 다합체성 단백질은 이종삼합체이다. 일부 구체예에서, 다합체성 단백질은 GABA A 수용체이다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 패널을 제시하고, 여기서 상기 패널은 첫 번째 세포 및 두 번째 세포를 포함하고, 여기서 첫 번째 세포 및 두 번째 세포는 목적되는 다합체성 단백질의 동일한 아단위를 발현하도록 조작되고, 여기서 첫 번째 세포에서 목적되는 다합체성 단백질의 생리학적 프로필은 두 번째 세포에서 다합체성 단백질의 생리학적 프로필과 상이하고, 그리고 여기서 첫 번째 세포 및 두 번째 세포는 동일한 호스트 세포주로부터 기원하고; 여기서 목적되는 다합체성 단백질의 아단위는 단백질 태그를 포함하지 않거나, 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 발현되거나, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 클론 세포주 패널을 제시하고, 여기서 각 세포주는 목적되는 다합체성 단백질의 동일한 아단위를 발현하도록 조작되고, 그리고 여기서 각 세포주에서 다합체성 단백질의 생리학적 프로필은 패널의 다른 세포주에서 목적되는 다합체성 단백질의 생리학적 프로필과 상이하고, 그리고 여기서 세포주 패널 내에 이들 세포주는 동일한 호스트 세포주로부터 기원하고; 여기서 목적되는 다합체성 단백질의 아단위는 단백질 태그를 포함하지 않거나, 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 발현되거나, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구체예에서, 패널은 2개의 세포주를 포함한다. 일부 구체예에서, 패널은 5개의 세포주를 포함한다. 일부 구체예에서, 패널은 10개의 세포주를 포함한다.
일부 구체예에서, 목적되는 다합체성 단백질은 NaV이다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 기능적 생물학적 경로의 모든 성분 단백질을 발현하도록 조작된 세포를 제시한다.
일부 구체예에서, 상기 경로는 적어도 5개의 단백질 성분을 보유한다. 일부 구체예에서, 상기 세포는 선별 압력의 부재에서 배양된다. 일부 구체예에서, 상기 생물학적 경로의 성분 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 복수의 클론 세포주를 포함하는 클론 세포주 패널을 제시하고, 여기서 복수의 클론 세포주의 각 클론 세포주는 상이한 후각 수용체를 발현하도록 조작된다; 여기서 후각 수용체는 단백질 태그를 포함하지 않고, 또는 후각 수용체는 이들 세포가 기능 분석에서 적어도 0.4의 Z' 인자를 갖도록 기능 분석에 이용하기 적합한 형태로 일관되게 및 재현가능하게 생산되고, 또는 클론 세포주는 선별 압력의 부재에서 배양되고, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구체예에서, 복수의 클론 세포주는 적어도 10개의 세포주를 포함한다. 일부 구체예에서, 상이한 후각 수용체는 인간 후각 수용체 또는 곤충 후각 수용체이다.
일부 구체예에서, 상이한 인간 후각 수용체는 OR10A1, OR10A3, OR10A4, OR10A5, OR10A6, OR10A7, OR10C1, OR10C2, OR10D4, OR10G2, OR10G3, OR10G4, OR10G7, OR10G8, OR10G9, OR10H1, OR10H2, OR10H3, OR10H4, OR10H5, OR10J1, OR10J3, OR10J5, OR10J6, OR10K1, OR10K2, OR10Q1, OR10R2, OR10S1, OR10T2, OR10V1, OR10Z1, OR11A1, OR11G2, OR11H1, OR11H4, OR11H6, OR11H7P, OR11L1, OR12D3, OR13A1, OR13C2, OR13C3, OR13C4, OR13C5, OR13C7, OR13C8, OR13C9, OR13D1, OR13E2, OR13F1, OR13G1, OR13H1, OR13J1, OR14A16, OR14A2, OR14C36, OR14J1, OR1A1, OR1A2, OR1A2, OR1B1, OR1C1, OR1D2, OR1D4, OR1D5, OR1E1, OR1E2, OR1E2, OR1E5, OR1E5, OR1E6, OR1E7, OR1F1, OR1F10, OR1F11, OR1F12, OR1F2, OR1G1, OR1I1, OR1J1, OR1J2, OR1J2, OR1J4, OR1J5, OR1K1, OR1L1, OR1L3, OR1L4, OR1L6, OR1L8, OR1M1, OR1M1, OR1N1, OR1N2, OR1N3, OR1Q1, OR1S1, OR1S2, OR2A1, OR2A10, OR2A19, OR2A20, OR2A21, OR2A4, OR2A42, OR2A5, OR2A6, OR2A7, OR2AE1, OR2AJ1, OR2AK2, OR2B1, OR2B2, OR2B3, OR2B6, OR2B9, OR2C1, OR2D1, OR2D2, OR2D3, OR2F1, OR2F2, OR2F3, OR2G2, OR2G3, OR2H1, OR2H2, OR2H3, OR2J2, OR2J3, OR2K1, OR2K2, OR2L1, OR2L2, OR2L3, OR2L5, OR2L8, OR2M1, OR2M2, OR2M4, OR2S2, OR2T1, OR2T3, OR2T4, OR2T5, OR2T6, OR2T7, OR2T8, OR2V1, OR2V2, OR2V3, OR2W1, OR2W3, OR2Y1, OR2Z1, OR3A1, OR3A2, OR3A3, OR3A4, OR4A15, OR4A16, OR4A4, OR4A5, OR4B1, OR4C12, OR4C13, OR4C15, OR4C16, OR4C3, OR4C6, OR4D1, OR4D2, OR4D5, OR4D6, OR4D9, OR4E2, OR4F10, OR4F15, OR4F16, OR4F16, OR4F17, OR4F18, OR4F19, OR4F3, OR4F6, OR4K1, OR4K13, OR4K14, OR4K15, OR4K17, OR4K2, OR4K3, OR4K5, OR4L1, OR4M1, OR4M2, OR4N2, OR4N4, OR4N5, OR4P4, OR4Q3, OR4S1, OR4X1, OR4X2, OR51A2, OR51A4, OR51A7, OR51B2, OR51B4, OR51D1, OR51E1, OR51E2, OR51F2, OR51G1, OR51G2, OR51H1, OR51I1, OR51I2, OR51L1, OR51M1, OR51Q1, OR51S1, OR51T1, OR52A1, OR52A2, OR52B2, OR52B4, OR52B4, OR52B4, OR52B6, OR52D1, OR52E2, OR52E4, OR52E5, OR52E6, OR52E8, OR52H1, OR52I1, OR52I2, OR52J3, OR52K1, OR52K2, OR52L1, OR52L2, OR52N1, OR52N2, OR52N4, OR52N5, OR52P1, OR52R1, OR56A4, OR56A6, OR56B2, OR56B4, OR5A1, OR5A2, OR5AC2, OR5AK2, OR5AK3, OR5AN1, OR5AP2, OR5AR1, OR5AS1, OR5AU1, OR5AU1, OR5B13, OR5B16, OR5B17, OR5B2, OR5B3, OR5C1, OR5D13, OR5D14, OR5D16, OR5D18, OR5F1, OR5G3, OR5H1, OR5H2, OR5H6, OR5I1, OR5K1, OR5K2, OR5L1, OR5L2, OR5M1, OR5M10, OR5M11, OR5M11, OR5M3, OR5M3, OR5M8, OR5M9, OR5P2, OR5P3, OR5T2, OR5T3, OR5V1, OR6A1, OR6B1, OR6B2, OR6C1, OR6C2, OR6C3, OR6F1, OR6J2, OR6K3, OR6K6, OR6M1, OR6N1, OR6N2, OR6P1, OR6Q1, OR6S1, OR6T1, OR6V1, OR6X1, OR6Y1, OR7A10, OR7A17, OR7A2, OR7A5, OR7C1, OR7C2, OR7D2, OR7D2, OR7D4P, OR7E102, OR7E120, OR7G1, OR7G2, OR7G3, OR8A1, OR8B12, OR8B2, OR8B3, OR8B4, OR8B8, OR8D1, OR8D2, OR8D4, OR8G1, OR8G2, OR8H1, OR8H2, OR8H3, OR8I2, OR8J1, OR8J3, OR8K1, OR8K3, OR8K5, OR9A2, OR9A4, OR9G1, OR9G4, OR9G5, OR9I1, OR9K2, 그리고 OR9Q1로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 상이한 곤충 후각 수용체는 IOR100, IOR101, IOR102, IOR103, IOR104, IOR105, IOR106, IOR107, IOR108, IOR109, IOR110, IOR111, IOR112, IOR113, IOR114, IOR115, IOR116, IOR117, IOR118, IOR119, IOR120, IOR121, IOR122, IOR123, IOR124, IOR125, IOR126, IOR127, IOR49, IOR50, IOR51, IOR52, IOR53, IOR54, IOR55, IOR56, IOR57, IOR58, IOR59, IOR60, IOR61, IOR62, IOR63, IOR64, IOR65, IOR66, IOR67, IOR68, IOR69, IOR70, IOR71, IOR72, IOR73, IOR74, IOR75, IOR76, IOR77, IOR78, IOR79, IOR80, IOR81, IOR82, IOR83, IOR84, IOR85, IOR86, IOR87, IOR88, IOR89, IOR90, IOR91, IOR92, IOR93, IOR94, IOR95, IOR96, IOR97, IOR98, IOR99, ORL7077, ORL7078, ORL7079, ORL7080, ORL7081, ORL7082, ORL7083, ORL7084, ORL7085, ORL7086, ORL7087, ORL7088, ORL7089, ORL7090, ORL7091, ORL7092, ORL7093, ORL7094, ORL7095, ORL7096, ORL7097, ORL7098, ORL7099, ORL7100, ORL7101, ORL7102, ORL7103, ORL7104, ORL7105, ORL7106, ORL7107, ORL7108, ORL7109, ORL7110, ORL7111, ORL7112, ORL7113, ORL7114, ORL7115, ORL7116, ORL7117, ORL7118, ORL7119, ORL7120, ORL7121, ORL7122, ORL7123, ORL7124, ORL7125, TPR2307, TPR2308, TPR2309, TPR2310, TPR2312, TPR2314, TPR2315, TPR2316, TPR2317, TPR2318, TPR2319, TPR2320, TPR2321, TPR2321, TPR698, TPR699, TPR700, TPR701, TPR702, TPR703, TPR704, TPR705, TPR706, TPR707, TPR708, TPR709, TPR710, TPR711, TPR712, TPR713, TPR714, TPR715, TPR716, TPR717, TPR718, TPR719, TPR720, TPR721, TPR722, TPR723, TPR724, TPR725, TPR725, TPR726, TPR727, TPR728, TPR729, TPR730, TPR731, TPR732, TPR733, TPR734, TPR735, TPR736, TPR737, TPR738, TPR739, TPR740, TPR741, TPR742, TPR743, TPR744, TPR745, TPR746, TPR747, TPR748, TPR749, TPR750, TPR751, TPR752, TPR753, TPR754, TPR755, TPR756, TPR757, TPR758, TPR759, TPR760, TPR761, TPR762, TPR763, TPR764, TPR765, TPR766, TPR767, TPR768, TPR769, TPR770, TPR771, 그리고 TPR772로 구성된 군에서 선택되는 모기 후각 수용체이다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 산출하는 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
i. 본 명세서에서 기술된 패널 (가령, 복수의 클론 세포주를 포함하는 클론 세포주 패널, 여기서 복수의 클론 세포주의 각 클론 세포주는 상이한 후각 수용체를 발현하도록 조작된다)을 검사 화합물 또는 조성물과 접촉시키는 단계; 그리고
ii. 패널 내에 적어도 2개의 상이한 후각 수용체의 기능 분석에서 활성에 대한 검사 화합물 또는 조성물의 효과를 측정하는 단계,
여기서 단계 (ii)에서 측정된 활성은 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물의 향기를 모의하는 두 번째 검사 화합물을 확인하는 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
i. 본 명세서에서 기술된 패널 (가령, 복수의 클론 세포주를 포함하는 클론 세포주 패널, 여기서 복수의 클론 세포주의 각 클론 세포주는 상이한 후각 수용체를 발현하도록 조작된다)을 두 번째 검사 화합물과 접촉시키는 단계;
ii. 패널 내에 적어도 2개의 후각 수용체의 기능 분석에서 활성에 대한 두 번째 검사 화합물의 효과를 조사하는 단계;
iii. 단계 (ii)에서 획득된 두 번째 검사 화합물의 후각 활성 프로필을 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필과 비교하는 단계; 여기서 두 번째 검사 화합물은 두 번째 검사 화합물의 후각 활성 프로필이 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필에 유사하면 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물의 향기를 모의한다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 변경하는 두 번째 검사 화합물을 확인하는 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
i. 본 명세서에서 기술된 방법 (가령, 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 산출하는 방법)에 따라서, 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물의 존재에서 두 번째 검사 화합물의 후각 활성 프로필을 산출하는 단계;
ii. 단계 (i)에서 획득된 후각 활성 프로필을 두 번째 검사 화합물의 부재에서 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필과 비교하는 단계; 여기서 두 번째 검사 화합물은 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물 단독의 후각 활성 프로필이 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물의 존재에서 두 번째 검사 화합물의 후각 활성 프로필과 상이하면 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 변경한다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 검사 화합물과 연관된 향기를 확인하는 컴퓨터-수행된 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 검사 화합물의 첫 번째 후각 활성 프로필을 수용하는 단계, 여기서 상기 첫 번째 후각 활성 프로필은 본 명세서에서 기술된 방법 (가령, 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 산출하는 방법)에 의해 산출되고;
b) 상기 첫 번째 후각 활성 프로필을 데이터베이스에 저장된 복수의 대표 후각 활성 프로필에 비교하여 상기 첫 번째 후각 활성 프로필 및 상기 복수의 대표 후각 활성 프로필 내에 각각의 대표 후각 활성 프로필 사이에 유사성 척도를 결정하는 단계, 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 공지된 향기를 갖는 개별 공지된 화합물에 상응하고, 그리고 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 본 명세서에서 기술된 방법 (가령, 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 산출하는 방법)에 의해 산출되고;
c) 단계 (b)에서 결정된 유사성 척도에 기초하여, 상기 첫 번째 후각 활성 프로필에 가장 유사한 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필을 결정하는 단계; 그리고
d) 단계 (c)에서 상기 첫 번째 후각 활성 프로필에 가장 유사한 것으로 결정된 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필과 연관된 향기를 상기 공지된 화합물과 연관된 향기로서 확인하는 단계;
여기서 단계 (a), (b), (c), 그리고 (d)는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필은 유사성 척도가 미리 결정된 역치를 초과하면, 첫 번째 후각 활성 프로필에 가장 유사하다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 화합물을 특정 향기와 연관되는 것으로 특징짓기 위한 컴퓨터-수행된 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 상기 화합물의 첫 번째 후각 활성 프로필을 수용하는 단계, 여기서 상기 첫 번째 후각 활성 프로필은 본 명세서에서 기술된 방법 (가령, 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 산출하는 방법)에 의해 산출되고;
b) 복수의 후각 활성 프로필을 군집시키는 단계, 이러한 복수는 상기 첫 번째 후각 활성 프로필 및 복수의 대표 후각 활성 프로필을 포함하고, 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 공지된 향기를 갖는 개별 공지된 화합물에 상응하고, 그리고 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 본 명세서에서 기술된 방법 (가령, 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 산출하는 방법)에 의해 산출되고;
c) 첫 번째 후각 활성 프로필과 함께 군집하는 상기 복수의 대표 후각 활성 프로필 내에 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필을 확인하는 단계; 그리고
d) 상기 화합물을, 단계 (c)에서 상기 첫 번째 후각 활성 프로필과 함께 군집되는 것으로 확인된 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필에 상응하는 개별 화합물과 연관된 상기 공지된 향기와 연관되는 것으로 특징짓는 단계;
여기서 단계 (a), (b), (c), 그리고 (d)는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 식별자를 이용하여 향기에 대하여 검사 화합물을 분류하는 컴퓨터-수행된 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 데이터베이스에 저장된 복수의 대표 후각 활성 프로필을 이용하여 향기에 대하여 검사 화합물을 분류하기 위하여 식별자를 훈련시키는 단계, 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 공지된 향기를 갖는 개별 공지된 화합물에 상응하고, 그리고 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 본 명세서에서 기술된 방법 (가령, 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 산출하는 방법)에 의해 산출되고; 그리고
b) 상기 식별자를 이용하여, 본 명세서에서 기술된 방법 (가령, 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 산출하는 방법)에 의해 산출된 상기 화합물의 첫 번째 후각 활성 프로필을 처리하여 공지된 향기에 대하여 상기 화합물을 분류하는 단계;
여기서 단계 (a)와 (b)는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 식별자를 이용하여 향기에 대하여 검사 화합물을 분류하는 컴퓨터-수행된 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
상기 식별자를 이용하여, 본 명세서에서 기술된 방법 (가령, 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 산출하는 방법)에 의해 산출된 상기 화합물의 첫 번째 후각 활성 프로필을 처리하여 공지된 향기에 대하여 상기 화합물을 분류하는 단계, 여기서 상기 식별자는 아래의 단계를 포함하는 방법에 따라 훈련된다:
데이터베이스에 저장된 복수의 대표 후각 활성 프로필을 이용하여 향기에 대하여 검사 화합물을 분류하기 위하여 상기 식별자를 훈련시키는 단계, 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 공지된 향기를 갖는 개별 공지된 화합물에 상응하고, 그리고 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 본 명세서에서 기술된 방법 (가령, 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 산출하는 방법)에 의해 산출되고;
여기서 이러한 처리는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 하나 이상의 검사 화합물을 향기와 연관시키기 위한 컴퓨터-수행된 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 첫 번째 검사 화합물의 첫 번째 후각 활성 프로필을 수용하는 단계, 여기서 상기 첫 번째 후각 활성 프로필은 본 명세서에서 기술된 방법 (가령, 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 산출하는 방법)에 의해 산출되고, 그리고 여기서 상기 첫 번째 검사 화합물은 공지된 향기를 갖고;
b) 상기 첫 번째 후각 활성 프로필을 데이터베이스에 저장된 복수의 대표 후각 활성 프로필에 비교하여 상기 첫 번째 후각 활성 프로필 및 상기 복수의 대표 후각 활성 프로필 내에 각각의 대표 후각 활성 프로필 사이에 유사성 척도를 결정하는 단계, 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 개별 공지된 화합물에 상응하고, 그리고 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 본 명세서에서 기술된 방법 (가령, 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 산출하는 방법)에 의해 산출되고;
c) 단계 (b)에서 결정된 유사성 척도에 기초하여, 상기 첫 번째 후각 활성 프로필에 가장 유사한 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필을 결정하는 단계; 그리고
d) 단계 (c)에서 상기 첫 번째 후각 활성 프로필에 가장 유사한 것으로 결정된 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필에 상응하는 개별 검사 화합물을 상기 공지된 향기와 연관되는 것으로 특징짓는 단계;
여기서 단계 (a), (b), (c), 그리고 (d)는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필은 유사성 척도가 미리 결정된 역치를 초과하면 첫 번째 후각 활성 프로필에 가장 유사하다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 하나 이상의 검사 화합물을 특정 향기와 연관되는 것으로 특징짓기 위한 컴퓨터-수행된 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 첫 번째 검사 화합물의 첫 번째 후각 활성 프로필을 수용하는 단계, 여기서 상기 첫 번째 후각 활성 프로필은 본 명세서에서 기술된 방법 (가령, 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 산출하는 방법)에 의해 산출되고, 그리고 여기서 상기 첫 번째 검사 화합물은 공지된 향기를 갖고;
b) 복수의 후각 활성 프로필을 군집시키는 단계, 이러한 복수는 상기 첫 번째 후각 활성 프로필 및 복수의 대표 후각 활성 프로필을 포함하고, 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 개별 공지된 화합물에 상응하고, 그리고 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 본 명세서에서 기술된 방법 (가령, 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 산출하는 방법)에 의해 산출되고;
c) 첫 번째 후각 활성 프로필과 함께 군집하는 상기 복수의 대표 후각 활성 프로필 내에 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필을 확인하는 단계; 그리고
d) 단계 (c)에서 상기 첫 번째 후각 활성 프로필과 함께 군집되는 것으로 확인된 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필에 상응하는 개별 화합물을 상기 공지된 향기와 연관되는 것으로 특징짓는 단계;
여기서 단계 (a), (b), (c), 그리고 (d)는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 식별자를 이용하여 향기에 대하여 하나 이상의 검사 화합물을 분류하는 컴퓨터-수행된 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
상기 식별자를 이용하여, 본 명세서에서 기술된 방법 (가령, 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 산출하는 방법)에 의해 산출된 첫 번째 후각 활성 프로필을 처리하여 데이터베이스에 저장된 복수의 대표 후각 활성 프로필의 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필을 상기 공지된 향기에 대하여 분류하는 단계, 여기서 상기 첫 번째 후각 활성 프로필은 공지된 향기를 갖는 첫 번째 검사 화합물에 상응하고, 그리고 여기서 상기 식별자는 아래의 단계를 포함하는 방법에 따라 훈련된다:
향기에 대하여 상기 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필을 분류하기 위하여 상기 복수의 대표 후각 활성 프로필을 이용하여 상기 식별자를 훈련시키는 단계, 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 개별 공지된 화합물에 상응하고, 그리고 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 본 명세서에서 기술된 방법 (가령, 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 산출하는 방법)에 의해 산출되고;
여기서 이러한 처리는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
일부 구체예에서, 목적되는 RNA는 siRNA 또는 안티센스 RNA이다. 일부 구체예에서, 목적되는 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아단위를 포함한다.
일부 구체예에서, 목적되는 단백질은 BRS3, GPR42P, FPRL2, GPR81, OPN3, GPR52, GPR21, GPR78, GPR26, GPR37, GPR37L1, GPR63, GPR45, GPR83, GRCAe, GPR153, P2RY5, P2RY10, GPR174, GPR142, GPR139, ADMR, CMKOR1, LGR4, LGR5, LGR6, GPR85, GPR27, GPR173, CCRL2, MAS1, MAS1L, MRGPRE, MRGPRF, MRGPRG, MRGX3e, MRGX4e, GPR50, GPR87, TRAR3f, TRAR4, TRAR5, PNRe, GPR57g, GPR58, EBI2, GPR160, GPRe, GPR1, GPR101, GPR135, OPN5, GPR141, GPR146, GPR148, GPR149, GPR15, GPR150, GPR152, GPR161, GPR17, GPR171, GPR18, GPR19, GPR20, GPR22, GPR25, GPR31,GPR32, GPR33, GPR34, GPR55, GPR61, GPR62, GPR79h, GPR82, GPR84, GPR88, GPR92, P2RY8, GPR15, GPR64, GPR56, GPR115, GPR114, BAI1, BAI2, BAI3, CELSR1, CELSR2, CELSR3, EMR1, EMR2, GPR97, GPR110, GPR111, GPR112, GPR113, GPR116, MASS1, ELTD1, GPR123, GPR124, GPR125, GPR126, GPR128, GPR144, EMR3, EMR4b, CD97, LPHN2, LPHN3, LPHN1, GPR157, GPR51, GPR156, GPRC6A, GPRC5A, GPRC5B, GPRC5C, GPRC5D, GPR158 및 GPR158L1로 구성된 군에서 선택되는, 표 8에 제시된 바와 같은 인간 유전자 기호에 의해 확인되는 고아 수용체 (orphan receptor)이다.
일부 구체예에서, 목적되는 단백질의 적어도 하나의 아단위는 유전자 활성화에 의해 발현된다. 다른 구체예에서, 목적되는 단백질의 적어도 하나의 아단위는 도입된 핵산으로부터 발현된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 세포주를 산출하는 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 동일한 배양 조건 하에 복수의 병렬 배양액에서 복수의 세포주를 배양하는 단계, 그리고 시간의 흐름 동안 일정하게 유지되는 적어도 하나의 특성을 갖는 세포주를 확인하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 병렬 배양액은 적어도 50개의 세포 배양액을 포함한다. 다른 구체예에서, 복수의 병렬 배양액은 적어도 100개의 세포 배양액을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 복수의 병렬 배양액은 적어도 200개의 세포 배양액을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 생체내 단백질 또는 복수의 단백질에 대한 시험관내 상관인 단백질 또는 복수의 단백질을 제시하고, 여기서 시험관내 상관은 생체내에서 발현된 상응하는 목적되는 단백질 또는 복수의 단백질의 기능 또는 활성의 전조가 된다; 여기서 시험관내 상관은 시험관내에서 비-생리학적 조건 하에 발현된 생물학적으로 활성 단백질 또는 복수의 단백질이다; 여기서 시험관내 상관은 목적되는 생체내 단백질 또는 복수의 단백질에 상응하는 적어도 하나의 기능적 또는 약리학적 또는 생리학적 프로필을 포함한다; 그리고 여기서 상기 시험관내 상관을 이용하여 고처리량 스크리닝에서 확인된 화합물 중에서 적어도 10%는 생체내 치료 효과를 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 시험관내 상관은 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아단위를 포함한다. 일부 구체예에서, 시험관내 상관의 적어도 하나의 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아단위를 포함한다. 일부 구체예에서, 시험관내 상관은 이종다합체를 포함한다. 일부 구체예에서, 시험관내 상관의 적어도 하나의 단백질은 이종다합체를 포함한다. 일부 구체예에서, 시험관내 상관의 단백질 또는 복수의 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 시험관내 상관은 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 안정적으로 발현된다. 일부 구체예에서, 시험관내 상관은 세포독성을 유발하지 않으면서 세포주에서 발현된다. 일부 구체예에서, 시험관내 상관은 상기 단백질 또는 복수의 단백질을 내생적으로 발현하지 않는 세포에서 발현된다.
일부 구체예에서, 상기 단백질 또는 복수의 단백질은 본 발명의 세포에 의해 생산될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 본 명세서에서 앞서 기술된 바와 같은 단백질 또는 복수의 단백질을 발현하는 세포를 제시한다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 본 명세서에서 앞서 기술된 바와 같은 단백질 또는 복수의 단백질을 발현하는 세포로부터 생산된 세포주를 제시한다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 생체내 단백질의 조절제를 확인하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 본 명세서에서 앞서 기술된 바와 같은 단백질 또는 복수의 단백질을 발현하는 세포를 검사 화합물과 접촉시키는 단계; 그리고
b) 검사 화합물에 의해 접촉되지 않은 세포에서 시험관내 상관의 단백질 또는 복수의 단백질의 활성과 비교하여 검사 화합물과 접촉된 세포에서 시험관내 상관의 단백질 또는 복수의 단백질의 활성에서 변화를 검출하는 단계;
여기서 부재에서와 비교하여 존재에서 활성의 차이를 발생시키는 화합물은 목적되는 생체내 단백질의 조절제이다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 선행 단락에서 기술된 방법에 의해 확인된 조절제를 제시한다.
일부 구체예에서, 임의의 선행 단락에서 기술된 세포는 분화된 세포이다. 일부 구체예에서, 임의의 선행 단락에서 기술된 세포는 역분화된 세포이다. 진전된 구체예에서, 역분화된 세포는 다분화성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 암 줄기 세포, 장기-특이적 줄기 세포 및 조직-특이적 줄기 세포로 구성된 군에서 선택되는 줄기 세포이다.
특정한 구체예에서, 본 발명에서는 줄기 세포를 산출하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 분화된 세포를 줄기 세포로 역분화시키는 단계를 포함하고, 여기서 분화된 세포는 본 명세서에서 기술된 세포 또는 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 생산된 세포이다. 특정한 구체예에서, 줄기 세포는 다분화성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 암 줄기 세포, 장기-특이적 줄기 세포 및 조직-특이적 줄기 세포로 구성된 군에서 선택된다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서는 재분화된 세포를 산출하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 임의의 선행 단락에서 기술된 세포 또는 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 생산된 세포를 역분화시켜 줄기 세포를 생산하는 단계; 그리고
b) 상기 줄기 세포를 재분화시켜 재분화된 세포를 생산하는 단계. 특정한 구체예에서, 줄기 세포는 다분화성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 암 줄기 세포, 장기-특이적 줄기 세포 및 조직-특이적 줄기 세포로 구성된 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 재분화된 세포는 역분화를 겪지 않은 분화된 세포와 상이한 유형이다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서는 비-인간 생명체를 산출하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 본 명세서에서 기술된 분화된 세포 또는 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 생산된 분화된 세포를 역분화시켜 줄기 세포를 생산하는 단계, 여기서 줄기 세포는 배아 줄기 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포이고; 그리고
b) 상기 줄기 세포를 재분화시켜 비-인간 생명체를 생산하는 단계. 이러한 방법의 특정한 구체예에서, 생명체는 포유동물이다. 이런 방법의 다른 특정한 구체예에서, 포유동물은 생쥐이다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 생산된 재분화된 세포를 제시한다.
일정한 측면에서, 본 발명에서는 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 생산된 비-인간 생명체를 제시한다. 이런 방법의 일정한 구체예에서, 생명체는 포유동물이다. 이런 방법의 특정한 구체예에서, 포유동물은 생쥐이다.
일정한 구체예에서, 목적되는 단백질을 내생적으로 발현하는 세포는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 세포의 개체군으로부터 분리될 수 있다. 이런 분리된 세포는 본 명세서에서 기술된 방법과 조성물, 예를 들면, 스크리닝 방법과 패널에 이용될 수 있다.
일정한 측면에서, 단맛 수용체 T1R2 아단위 및 단맛 수용체 T1R3 아단위를 포함하는 단맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포 또는 세포주가 본 명세서에서 제시되고, 적어도 하나의 아단위의 발현은 호스트 세포 내로 아단위를 인코딩하는 핵산의 도입, 또는 호스트 세포 내에 이미 존재하는 아단위를 인코딩하는 핵산의 유전자 활성화에 기인하고, 상기 세포 또는 세포주는 호스트 세포로부터 유래된다. 선택적으로, 상기 세포 또는 세포주는 또한, G 단백질을 생산하도록 조작될 수 있다.
특정한 구체예에서, 적어도 하나의 단맛 수용체 아단위는 호스트 세포 내로 도입되는 아단위를 인코딩하는 핵산으로부터 발현된다. 다른 특정한 구체예에서, 적어도 하나의 단맛 수용체 아단위는 유전자 활성화에 의해, 호스트 세포 내에 존재하는 핵산으로부터 발현된다. 다른 특정한 구체예에서, 호스트 세포는 a) 진핵 세포이고; b) 포유동물 세포이고; c) 단맛 수용체의 적어도 하나의 아단위 또는 G 단백질을 내생적으로 발현하지 않고; 또는 d) (a), (b)와 (c)의 임의의 조합이다. 다른 특정한 구체예에서, 호스트 세포는 HEK-293 세포이다. 다른 특정한 구체예에서, 단맛 수용체는 a) 포유동물 유래이고; b) 인간 유래이고; c) 상이한 종으로부터 아단위를 포함하고; d) 키메라인 하나 이상의 아단위를 포함하고; 또는 e) (a) - (d)의 임의의 조합이다. 다른 특정한 구체예에서, 단맛 수용체는 기능적이다. 다른 특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 세포 또는 세포주는 분석에서 적어도 0.3의 Z' 값을 갖는다. 다른 특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 세포 또는 세포주는 분석에서 적어도 0.7의 Z' 값을 갖는다. 다른 특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 세포 또는 세포주는 선별 압력의 부재에서 배양 배지에서 단맛 수용체를 안정적으로 발현한다. 다른 특정한 구체예에서, 단맛 T1R2 수용체 아단위는
a) 서열 번호 34의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 포함하는 단맛 수용체 아단위;
b) 서열 번호 34의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열에 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단맛 수용체 아단위;
c) 엄격한 조건 하에 서열 번호 31에 혼성화되는 핵산, 또는 서열 번호 34의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 단맛 수용체 아단위; 그리고
d) 서열 번호 31에 적어도 85% 동일한 핵산, 또는 서열 번호 34의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 단맛 수용체 아단위로 구성된 군에서 선택된다.
특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 세포 또는 세포주의 단맛 수용체 아단위 T1R2는
a) 서열 번호 31을 포함하는 핵산:
b) 서열 번호 34의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산;
c) 엄격한 조건 하에 a) 또는 b)의 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 그리고
d) 서열 번호 31에 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 또는 서열 번호 34의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산으로 구성된 군에서 선택되는 핵산에 의해 인코딩된다. 다른 특정한 구체예에서, 단맛 수용체 아단위 T1R3은
e) 서열 번호 35의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 포함하는 단맛 수용체 아단위;
f) 서열 번호 35의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열에 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단맛 수용체 아단위;
g) 엄격한 조건 하에 서열 번호 32에 혼성화되는 핵산, 또는 서열 번호 35의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 단맛 수용체 아단위; 그리고
h) 서열 번호 32에 적어도 85% 동일한 핵산, 또는 서열 번호 35의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 단맛 수용체 아단위로 구성된 군에서 선택된다.
다른 특정한 구체예에서, 단맛 수용체 T1R3 아단위는
a) 서열 번호 32를 포함하는 핵산;
b) 서열 번호 35의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산;
c) 엄격한 조건 하에 a) 또는 b)의 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 그리고
d) 서열 번호 32에 적어도 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 또는 서열 번호 35의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산으로 구성된 군에서 선택되는 핵산에 의해 인코딩된다.
다른 특정한 구체예에서, G 단백질은
a) 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 포함하는 G 단백질;
b) 서열 번호 36 또는 37 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열에 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 G 단백질;
c) 엄격한 조건 하에 서열 번호 33에 혼성화되는 핵산, 또는 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 G 단백질; 그리고
d) 서열 번호 33에 적어도 85% 동일한 핵산 서열, 또는 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 G 단백질로 구성된 군에서 선택된다.
다른 특정한 구체예에서, G 단백질은
a) 서열 번호 33을 포함하는 핵산;
b) 서열 번호 36 또는 37의 폴리펩티드 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산;
c) 엄격한 조건 하에 a) 또는 b)의 핵산 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 그리고
d) 서열 번호 33에 적어도 95% 서열 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 또는 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로 구성된 군에서 선택되는 핵산에 의해 인코딩된다.
일정한 측면에서, 감칠맛 수용체 T1R1 아단위 및 감칠맛 수용체 T1R3 아단위를 포함하는 감칠맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포 또는 세포주가 본 발명에서 제시되고, 적어도 하나의 아단위의 발현은 호스트 세포 내로 아단위를 인코딩하는 핵산의 도입, 또는 호스트 세포 내에 이미 존재하는 아단위를 인코딩하는 핵산의 유전자 활성화에 기인하고, 상기 세포 또는 세포주는 호스트 세포로부터 유래된다. 선택적으로, 상기 세포 또는 세포주는 또한, G 단백질을 생산하도록 조작될 수 있다.
특정한 구체예에서, 적어도 하나의 감칠맛 수용체 아단위는 호스트 세포 내로 도입되는 아단위를 인코딩하는 핵산으로부터 발현된다. 다른 특정한 구체예에서, 적어도 하나의 감칠맛 수용체 아단위는 유전자 활성화에 의해, 호스트 세포 내에 존재하는 핵산으로부터 발현된다. 다른 특정한 구체예에서, 호스트 세포는 a) 진핵 세포이고; b) 포유동물 세포이고; c) 감칠맛 수용체의 적어도 하나의 아단위 또는 G 단백질을 내생적으로 발현하지 않고; 또는 d) (a), (b)와 (c)의 임의의 조합이다. 다른 특정한 구체예에서, 호스트 세포는 HEK-293 세포이다. 다른 특정한 구체예에서, 감칠맛 수용체는 a) 포유동물 유래이고; b) 인간 유래이고; c) 상이한 종으로부터 아단위를 포함하고; d) 키메라인 하나 이상의 아단위를 포함하고; 또는 e) (a) - (d)의 임의의 조합이다. 다른 특정한 구체예에서, 감칠맛 수용체는 기능적이다. 다른 특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 세포 또는 세포주는 분석에서 적어도 0.3의 Z' 값을 갖는다. 다른 특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 세포 또는 세포주는 분석에서 적어도 0.7의 Z' 값을 갖는다. 다른 특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 세포 또는 세포주는 선별 압력의 부재에서 배양 배지에서 감칠맛 수용체를 안정적으로 발현한다. 다른 특정한 구체예에서, 감칠맛 T1R1 수용체 아단위는
a) 서열 번호 42-45 중에서 한 가지의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 포함하는 감칠맛 수용체 아단위;
b) 서열 번호 42-45 중에서 한 가지의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열에 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 감칠맛 수용체 아단위;
c) 엄격한 조건 하에 서열 번호 41에 혼성화되는 핵산, 또는 서열 번호 42-45 중에서 한 가지의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 감칠맛 수용체 아단위; 그리고
d) 서열 번호 41에 적어도 85% 동일한 핵산, 또는 서열 번호 42-45 중에서 한 가지의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 감칠맛 수용체 아단위로 구성된 군에서 선택된다.
특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 세포 또는 세포주의 감칠맛 수용체 아단위 T1R1은
a) 서열 번호 41을 포함하는 핵산:
b) 서열 번호 42-45 중에서 한 가지의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산;
c) 엄격한 조건 하에 a) 또는 b)의 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 그리고
d) 서열 번호 41에 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 또는 서열 번호 42-45 중에서 한 가지의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산으로 구성된 군에서 선택되는 핵산에 의해 인코딩된다. 다른 특정한 구체예에서, 감칠맛 수용체 아단위 T1R3은
e) 서열 번호 35의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 포함하는 감칠맛 수용체 아단위;
f) 서열 번호 35의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열에 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 감칠맛 수용체 아단위;
g) 엄격한 조건 하에 서열 번호 32에 혼성화되는 핵산, 또는 서열 번호 35의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 감칠맛 수용체 아단위; 그리고
h) 서열 번호 32에 적어도 85% 동일한 핵산, 또는 서열 번호 35의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 감칠맛 수용체 아단위로 구성된 군에서 선택된다.
다른 특정한 구체예에서, 감칠맛 수용체 T1R3 아단위는
a) 서열 번호 32를 포함하는 핵산;
b) 서열 번호 35의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산;
c) 엄격한 조건 하에 a) 또는 b)의 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 그리고
d) 서열 번호 32에 적어도 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 또는 서열 번호 35의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산으로 구성된 군에서 선택되는 핵산에 의해 인코딩된다.
다른 특정한 구체예에서, G 단백질은
a) 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 포함하는 G 단백질;
b) 서열 번호 36 또는 37 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열에 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 G 단백질;
c) 엄격한 조건 하에 서열 번호 33에 혼성화되는 핵산, 또는 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 G 단백질; 그리고
d) 서열 번호 33에 적어도 85% 동일한 핵산 서열, 또는 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 G 단백질로 구성된 군에서 선택된다.
다른 특정한 구체예에서, G 단백질은
a) 서열 번호 33을 포함하는 핵산;
b) 서열 번호 36 또는 37의 폴리펩티드 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산;
c) 엄격한 조건 하에 a) 또는 b)의 핵산 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 그리고
d) 서열 번호 33에 적어도 95% 서열 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 또는 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로 구성된 군에서 선택되는 핵산에 의해 인코딩된다.
한 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 기능적이고 생리학적으로 적절한 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체를 생산한다. 따라서 이들은 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체의 조절제를 확인하고 선별하는데 유용하다.
다른 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 1 내지 4주, 1 내지 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간 동안 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체를 안정적으로 발현한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 1 내지 4주, 1 내지 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간 동안 실질적으로 동일한 수준에서 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체를 발현한다.
특정한 구체예에서, 발현 수준은 기능 분석을 이용하여 측정된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 세포와 세포주를 이용하여 확인된 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체의 조절제, 그리고 식품과 약제를 비롯한 제품의 미각 변경, 또는 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체가 관련되는, 당뇨병과 비만을 비롯한 질환의 치료에서 이들 조절제의 용도에 관계한다.
일정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 세포 또는 세포주 (가령, 단맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포 또는 세포주)를 생산하는 방법이 본 발명에서 제시되고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 단맛 수용체 T1R2 아단위를 인코딩하는 핵산을 포함하는 첫 번째 벡터, 단맛 수용체 T1R3 아단위를 인코딩하는 핵산을 포함하는 두 번째 벡터, 그리고 선택적으로, G 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세 번째 벡터를 호스트 세포 내로 도입하는 단계;
b) 단맛 수용체 T1R2 아단위의 발현을 검출하는 첫 번째 분자 표지, 단맛 수용체 T1R3 아단위의 발현을 검출하는 두 번째 분자 표지, 그리고 선택적으로, G 단백질의 발현을 검출하는 세 번째 분자 표지를 단계 a)에서 생산된 호스트 세포 내로 도입하는 단계; 그리고
c) T1R2 아단위, T1R3 아단위, 그리고 선택적으로, G 단백질을 발현하는 세포를 분리하는 단계.
일정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 세포 또는 세포주 (가령, 감칠맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포 또는 세포주)를 생산하는 방법이 본 발명에서 제시되고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 감칠맛 수용체 T1R1 아단위를 인코딩하는 핵산을 포함하는 첫 번째 벡터, 감칠맛 수용체 T1R3 아단위를 인코딩하는 핵산을 포함하는 두 번째 벡터, 그리고 선택적으로, G 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세 번째 벡터를 호스트 세포 내로 도입하는 단계;
b) 감칠맛 수용체 T1R1 아단위의 발현을 검출하는 첫 번째 분자 표지, 감칠맛 수용체 T1R3 아단위의 발현을 검출하는 두 번째 분자 표지, 그리고 선택적으로, G 단백질의 발현을 검출하는 세 번째 분자 표지를 단계 a)에서 생산된 호스트 세포 내로 도입하는 단계; 그리고
c) T1R1 아단위, T1R3 아단위, 그리고 선택적으로, G 단백질을 발현하는 세포를 분리하는 단계.
특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법 (가령, 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포 또는 세포주를 생산하는 방법)은 단계 c)에서 분리된 세포로부터 세포주를 산출하는 단계를 더욱 포함한다. 다른 특정한 구체예에서, 호스트 세포는
a) 진핵 세포이고;
b) 포유동물 세포이고;
c) 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체의 적어도 하나의 아단위 또는 G 단백질을 내생적으로 발현하지 않고; 또는
d) a), b)와 c)의 임의의 조합이다.
다른 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법 (가령, 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포 또는 세포주를 생산하는 방법)은 아래의 단계를 더욱 포함한다:
a) 1 내지 4주, 1 내지 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간에서 선택되는 일정한 기간 동안 이들 세포를 배양하는 단계;
b) 이들 기간 동안 주기적으로 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체 또는 이의 아단위의 발현을 평가하는 단계, 상기 발현은 RNA 또는 단백질 수준에서 평가되고; 그리고
c) 1 내지 4주, 1 내지 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간에서 선택되는 일정한 기간 동안 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체 또는 이의 아단위의 실질적으로 안정적인 발현으로 특징되는 세포 또는 세포주를 선별하는 단계.
다른 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법 (가령, 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포 또는 세포주를 생산하는 방법)은 아래의 단계를 더욱 포함한다:
a) 1 내지 4주, 1 내지 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간에서 선택되는 일정한 기간 동안 이들 세포를 배양하는 단계;
b) 이들 기간 동안 주기적으로 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체 또는 이의 아단위의 발현 수준을 측정하는 단계, 상기 발현은 RNA 또는 단백질 수준에서 평가되고; 그리고
c) 1 내지 4주, 1 내지 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간에서 선택되는 일정한 기간 동안 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체 또는 이의 아단위의 발현의 실질적으로 동일한 수준으로 특징되는 세포 또는 세포주를 선별하는 단계.
일정한 구체예에서, 단맛 수용체의 단백질 발현 수준의 측정은 기능 분석을 이용하여 수행된다. 일정한 구체예에서, 분리 단계는 형광 활성화된 세포 분류기 (Beckman Coulter, Miami, FL)를 이용한다.
특정한 구체예에서, 단맛 수용체 기능의 조절제를 확인하는 방법이 본 발명에서 제시되고, 상기 방법은 단맛 수용체를 안정적으로 발현하는 본 명세서에서 기술된 적어도 하나의 세포 또는 세포주를 적어도 하나의 검사 화합물에 노출시키는 단계 및 단맛 수용체 기능에서 변화를 검출하는 단계를 포함한다. 특정한 구체예에서, 조절제는 단맛 수용체 저해제, 단맛 수용체 길항약, 단맛 수용체 차단제, 단맛 수용체 활성제, 단맛 수용체 작동약 또는 단맛 수용체 강화제로 구성된 군에서 선택된다. 다른 특정한 구체예에서, 단맛 수용체는 인간 단맛 수용체이다. 다른 특정한 구체예에서, 검사 화합물은 소형 분자, 화학적 모이어티, 폴리펩티드, 또는 항체이다. 다른 특정한 화합물에서, 검사 화합물은 화합물의 라이브러리이다. 다른 특정한 구체예에서, 라이브러리는 소형 분자 라이브러리, 조합 라이브러리, 펩티드 라이브러리 또는 항체 라이브러리이다. 특정한 구체예에서, 조절제는 단맛 수용체의 효소에 의해 변형된 형태에 대하여 선별적이다
특정한 구체예에서, 감칠맛 수용체 기능의 조절제를 확인하는 방법이 본 발명에서 제시되고, 상기 방법은 감칠맛 수용체를 안정적으로 발현하는 본 명세서에서 기술된 적어도 하나의 세포 또는 세포주를 적어도 하나의 검사 화합물에 노출시키는 단계 및 감칠맛 수용체 기능에서 변화를 검출하는 단계를 포함한다. 특정한 구체예에서, 조절제는 감칠맛 수용체 저해제, 감칠맛 수용체 길항약, 감칠맛 수용체 차단제, 감칠맛 수용체 활성제, 감칠맛 수용체 작동약 또는 감칠맛 수용체 강화제로 구성된 군에서 선택된다. 다른 특정한 구체예에서, 감칠맛 수용체는 인간 감칠맛 수용체이다. 다른 특정한 구체예에서, 검사 화합물은 소형 분자, 화학적 모이어티, 폴리펩티드, 또는 항체이다. 다른 특정한 화합물에서, 검사 화합물은 화합물의 라이브러리이다. 다른 특정한 구체예에서, 라이브러리는 소형 분자 라이브러리, 조합 라이브러리, 펩티드 라이브러리 또는 항체 라이브러리이다. 특정한 구체예에서, 조절제는 감칠맛 수용체의 효소에 의해 변형된 형태에 대하여 선별적이다
특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법 (가령, 단맛 수용체 기능 또는 감칠맛 수용체 기능의 조절제를 확인하는 방법)에 의해 확인된 조절제가 본 발명에서 제시된다.
특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 세포 또는 세포주 (가령, 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포 또는 세포주)가 본 발명에서 제시되고, 상기 세포 또는 세포주는 이런 세포 또는 세포주를 생산하는 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 생산된다. 이런 방법의 특정한 구체예에서, 이런 방법의 세포 (가령, 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포)는 시간의 흐름 동안 일정한 적어도 하나의 원하는 특성을 갖고, 그리고 이런 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 미각 수용체 (가령, 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체)의 아단위, 그리고 선택적으로, G 단백질을 인코딩하는 mRNA를 발현하는 복수의 세포를 제공하는 단계;
b) 이들 세포를 개별 배양 용기 내로 개별적으로 분산시켜 복수의 별개의 세포 배양액을 제공하는 단계;
c) 자동화 세포 배양 방법을 이용하여 일단의 원하는 배양 조건 하에 이들 세포를 배양하는 단계, 이들 조건은 별개의 세포 배양액 각각에 대하여 실질적으로 동일한 것으로 특징되고, 이러한 배양 기간 동안 별개의 세포 배양액 각각에서 웰당 세포의 숫자가 표준화되고, 그리고 이들 별개의 배양액은 동일한 일정에서 계대배양되고;
d) 미각 수용체 (가령, 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체) 또는 상기 수용체를 생산하는 세포의 적어도 하나의 원하는 특징에 대하여 별개의 세포 배양액을 적어도 2회 평가하는 단계; 그리고
e) 양쪽 분석에서 원하는 특징을 갖는 별개의 세포 배양액을 확인하는 단계. 일정한 측면에서, 미각 수용체 (가령, 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체)를 생산하고 시간의 흐름 동안 일정한 적어도 하나의 원하는 특성을 갖는 세포 또는 세포주가 본 발명에서 제시되고, 상기 세포 또는 세포주는 이런 방법에 의해 생산된다.
일정한 구체예에서, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 및/또는 G 단백질을 내생적으로 발현하는 세포는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 세포의 개체군으로부터 분리될 수 있다. 이런 분리된 세포는 본 명세서에서 기술된 방법과 조성물, 예를 들면, 스크리닝 방법과 패널에 이용될 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따라서, 세포 또는 세포주는 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하도록 조작된다. 일부 구체예에서, 쓴맛 수용체는 세포 또는 세포주 내로 도입된 핵산으로부터 발현된다. 일부 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 조작된 유전자 활성화에 의해 내생적 핵산으로부터 발현된다. 일부 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 적어도 하나의 다른 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 다른 쓴맛 수용체는 내생적으로 발현된다. 일부 다른 구체예에서, 적어도 하나의 다른 쓴맛 수용체는 세포 또는 세포주 내로 도입된 핵산으로부터 발현된다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체 및 적어도 하나의 다른 쓴맛 수용체는 세포 또는 세포주 내로 도입된 별개의 핵산으로부터 발현된다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체 및 적어도 하나의 다른 쓴맛 수용체는 둘 모두, 세포 또는 세포주 내로 도입된 단일 핵산으로부터 발현된다.
일부 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 내생적 G 단백질을 안정적으로 발현한다. 일부 다른 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 이종기원 G 단백질을 안정적으로 발현한다. 또 다른 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 내생적 G 단백질 및 이종기원 G 단백질 둘 모두를 안정적으로 발현한다. 일부 구체예에서, G 단백질은 3개의 상이한 아단위를 포함하는 이종다합체성 G 단백질이다. 일부 구체예에서, 이종다합체성 G 단백질의 적어도 하나의 아단위는 세포 또는 세포주 내로 도입된 핵산으로부터 발현된다. 일부 다른 구체예에서, 적어도 2개의 상이한 아단위는 세포 또는 세포주 내로 도입된 상이한 핵산으로부터 발현된다. 또 다른 구체예에서, 적어도 2개의 상이한 아단위는 세포 또는 세포주 내로 도입된 동일한 핵산으로부터 발현된다. 또 다른 구체예에서, 이들 3개의 상이한 아단위는 각각, 세포 또는 세포주 내로 도입된 동일한 핵산으로부터 발현된다.
일부 구체예에서, 이러한 세포주 내에 세포 또는 세포들은 진핵 세포이다. 일부 다른 구체예에서, 이러한 세포주 내에 세포 또는 세포들은 포유동물 세포이다. 또 다른 구체예에서, 이러한 세포주 내에 세포 또는 세포들은 내생적 쓴맛 수용체를 발현하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 이러한 세포주 내에 세포 또는 세포들은 내생적 쓴맛 수용체를 발현하지 않는 세포 유형의 진핵 세포이다. 또 다른 구체예에서, 이러한 세포주 내에 세포 또는 세포들은 내생적 쓴맛 수용체를 발현하지 않는 세포 유형의 포유동물 세포이다. 일부 구체예에서, 이러한 세포주 내에 세포 또는 세포들은 인간 배아 신장 293T 세포이다.
일부 구체예에서, 쓴맛 수용체는 포유동물 기원이다. 일부 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 인간 기원이다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 아미노 말단 또는 카르복실 말단에서 폴리펩티드 태그를 갖지 않는다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 아미노 말단 또는 카르복실 말단에서 폴리펩티드 태그를 갖지 않는 포유동물 쓴맛 수용체이다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 아미노 말단 또는 카르복실 말단에서 폴리펩티드 태그를 갖지 않는 인간 쓴맛 수용체이다.
일부 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 세포-기초된 분석, 형광 세포-기초된 분석, 고처리량 스크리닝 분석, 리포터 세포-기초된 분석, G 단백질 매개된 세포-기초된 분석, 그리고 칼슘 유동 세포-기초된 분석으로 구성된 군에서 선택되는 분석에서 적어도 0.45의 Z' 값을 발생시킨다. 일부 다른 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 세포-기초된 분석, 형광 세포-기초된 분석, 고처리량 스크리닝 분석, 리포터 세포-기초된 분석, G 단백질 매개된 세포-기초된 분석, 그리고 칼슘 유동 세포-기초된 분석으로 구성된 군에서 선택되는 분석에서 적어도 0.5의 Z' 값을 발생시킨다. 또 다른 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 세포-기초된 분석, 형광 세포-기초된 분석, 고처리량 스크리닝 분석, 리포터 세포-기초된 분석, G 단백질 매개된 세포-기초된 분석, 그리고 칼슘 유동 세포-기초된 분석으로 구성된 군에서 선택되는 분석에서 적어도 0.6의 Z' 값을 발생시킨다.
일부 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 적어도 2주 동안, 항생제가 없는 배양 배지에서 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현한다. 일부 다른 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 적어도 4주 동안, 항생제가 없는 배양 배지에서 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현한다. 또 다른 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 적어도 6주 동안, 항생제가 없는 배양 배지에서 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현한다. 또 다른 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 적어도 3개월 동안, 항생제가 없는 배양 배지에서 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현한다. 또 다른 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 적어도 6개월 동안, 항생제가 없는 배양 배지에서 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현한다. 또 다른 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 적어도 9개월 동안, 항생제가 없는 배양 배지에서 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현한다.
일부 구체예에서, 쓴맛 수용체는 서열 번호 77-101 중에서 한 가지의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 서열 번호 77-101 중에서 한 가지의 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 엄격한 조건 하에 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 역-보체 서열을 포함하는 핵산에 혼성화되는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 대립형질 변이체인 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 쓴맛 수용체는 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 서열 번호 51-75 중에서 한 가지에 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 엄격한 조건 하에 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 역-보체 서열을 포함하는 핵산에 혼성화되는 핵산의 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 대립형질 변이체인 핵산의 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 쓴맛 수용체는 기능적 쓴맛 수용체이다. 일부 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 이소프로테레놀과 접촉될 때, 세포내 유리 칼슘 (free calcium)의 농도가 변한다. 일부 구체예에서, 이소프로테레놀은 이러한 세포 또는 세포주로 수행된 용량 반응 곡선에서 대략 1 nM 내지 대략 20 nM의 EC50 값을 갖는다. 일부 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 1 이상의 신호 대 잡음 비율을 갖는다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하도록 조작되는 세포 또는 세포주의 수집물 (collection)이 제시된다. 일부 구체예에서, 이러한 수집물은 2개 이상의 세포 또는 세포주를 포함하고, 각각의 세포 또는 세포주는 상이한 쓴맛 수용체 또는 이의 대립형질 변이체를 안정적으로 발현한다. 일부 구체예에서, 이러한 수집물은 공지된 리간드를 갖는 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하도록 조작된 세포 또는 세포주를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 대립형질 변이체는 단일-뉴클레오티드 다형체 (SNP)이다. 또 다른 구체예에서, 각각의 세포 또는 세포주는 이소프로테레놀과 접촉될 때 세포내 유리 칼슘의 농도가 변한다. 일부 구체예에서, 이소프로테레놀은 각각의 세포 또는 세포주로 수행된 용량 반응 곡선에서 대략 1 nM 내지 대략 20 nM의 EC50 값을 갖는다.
일부 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 병렬 처리를 가능하게 하는 동일한 생리학적 특성을 공유하도록 정합된다. 일부 구체예에서, 생리학적 특성은 성장 속도이다. 일부 다른 구체예에서, 생리학적 특성은 조직 배양액 표면에 부착이다. 또 다른 구체예에서, 생리학적 특성은 Z' 인자이다. 또 다른 구체예에서, 생리학적 특성은 쓴맛 수용체의 발현 수준이다.
본 발명의 일부 다른 구체예에서, 이러한 수집물은 2개 이상의 세포 또는 세포주를 포함하고, 각각의 세포 또는 세포주는 동일한 쓴맛 수용체 또는 이의 대립형질 변이체를 안정적으로 발현한다. 일부 구체예에서, 이러한 수집물은 공지된 리간드를 갖는 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하도록 조작된 세포 또는 세포주를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 대립형질 변이체는 단일-뉴클레오티드 다형체 (SNP)이다. 또 다른 구체예에서, 각각의 세포 또는 세포주는 이소프로테레놀과 접촉될 때 세포내 유리 칼슘의 농도가 변한다. 일부 구체예에서, 이소프로테레놀은 각각의 세포 또는 세포주로 수행된 용량 반응 곡선에서 대략 1 nM 내지 대략 20 nM의 EC50 값을 갖는다.
일부 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 병렬 처리를 가능하게 하는 동일한 생리학적 특성을 공유하도록 정합된다. 일부 구체예에서, 생리학적 특성은 성장 속도이다. 일부 다른 구체예에서, 생리학적 특성은 조직 배양액 표면에 부착이다. 또 다른 구체예에서, 생리학적 특성은 Z' 인자이다. 또 다른 구체예에서, 생리학적 특성은 쓴맛 수용체의 발현 수준이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라서, 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포를 생산하는 방법이 제시된다. 상기 방법은 a) 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산을 복수의 세포 내로 도입하는 단계; b) 쓴맛 수용체의 발현을 검출하는 분자 표지를 단계 (a)에서 제공된 복수의 세포 내로 도입하는 단계; 그리고 c) 쓴맛 수용체를 발현하는 세포를 분리하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 단계 (c)에서 분리된 세포로부터 세포주를 산출하는 단계를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 산출된 세포주는 적어도 2주 동안, 임의의 항생제 선별 없이 배양 배지에서 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현한다. 일부 다른 구체예에서, 산출된 세포주는 적어도 4주 동안, 임의의 항생제 선별 없이 배양 배지에서 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현한다. 또 다른 구체예에서, 산출된 세포주는 적어도 6주 동안, 임의의 항생제 선별 없이 배양 배지에서 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현한다. 또 다른 구체예에서, 산출된 세포주는 적어도 3개월 동안, 임의의 항생제 선별 없이 배양 배지에서 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현한다. 또 다른 구체예에서, 산출된 세포주는 적어도 6개월 동안, 임의의 항생제 선별 없이 배양 배지에서 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현한다. 또 다른 구체예에서, 산출된 세포주는 적어도 9개월 동안, 임의의 항생제 선별 없이 배양 배지에서 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현한다.
일부 구체예에서, 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포를 생산하는데 이용되는 세포는 진핵 세포이다. 일부 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포를 생산하는데 이용되는 세포는 포유동물 세포이다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포를 생산하는데 이용되는 세포는 내생적 쓴맛 수용체를 발현하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포를 생산하는데 이용되는 세포는 내생적 쓴맛 수용체를 발현하지 않는 세포 유형의 진핵 세포이다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포를 생산하는데 이용되는 세포는 내생적 쓴맛 수용체를 발현하지 않는 세포 유형의 포유동물 세포이다. 일부 구체예에서, 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포를 생산하는데 이용되는 세포는 인간 배아 신장 293T 세포이다.
일부 구체예에서, 쓴맛 수용체는 포유동물 기원이다. 일부 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 인간 기원이다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 아미노 말단 또는 카르복실 말단에서 폴리펩티드 태그를 갖지 않는다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 아미노 말단 또는 카르복실 말단에서 폴리펩티드 태그를 갖지 않는 포유동물 쓴맛 수용체이다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 아미노 말단 또는 카르복실 말단에서 폴리펩티드 태그를 갖지 않는 인간 쓴맛 수용체이다.
일부 구체예에서, 쓴맛 수용체는 서열 번호 77-101 중에서 한 가지의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 서열 번호 77-101 중에서 한 가지의 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 엄격한 조건 하에 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 역-보체 서열을 포함하는 핵산에 혼성화되는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 대립형질 변이체인 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 쓴맛 수용체는 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 서열 번호 51-75 중에서 한 가지에 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 엄격한 조건 하에 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 역-보체 서열을 포함하는 핵산에 혼성화되는 핵산의 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 대립형질 변이체인 핵산의 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 쓴맛 수용체는 기능적 쓴맛 수용체이다. 일부 구체예에서, 단계 (c)에서 분리된 세포는 이소프로테레놀과 접촉될 때, 세포내 유리 칼슘 (free calcium)의 농도가 변한다. 일부 구체예에서, 이소프로테레놀은 이러한 세포로 수행된 용량 반응 곡선에서 대략 1 nM 내지 대략 20 nM의 EC50 값을 갖는다.
일부 구체예에서, 분리는 형광 활성화된 세포 분류기를 이용한다.
일부 구체예에서, 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포를 생산하는데 이용되는 세포는 내생적 G 단백질을 안정적으로 발현한다. 일부 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포를 생산하는데 이용되는 세포는 이종기원 G 단백질을 안정적으로 발현한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포를 생산하는데 이용되는 세포는 내생적 G 단백질 및 이종기원 G 단백질을 안정적으로 발현한다.
일부 구체예에서, 쓴맛 수용체를 발현하는 세포주를 생산하는 방법은 세포 내로 G 단백질을 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, G 단백질을 인코딩하는 핵산은 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산을 도입하기 이전에 세포 내로 도입된다. 일부 다른 구체예에서, G 단백질을 인코딩하는 핵산은 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산을 도입한 이후에 세포 내로 도입된다. 또 다른 구체예에서, G 단백질을 인코딩하는 핵산은 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산을 도입하는 것과 동시에 세포 내로 도입된다. 일부 구체예에서, 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산 및 G 단백질을 인코딩하는 핵산은 단일 벡터 상에 존재한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 쓴맛 수용체의 발현을 검출하는 분자 표지를 도입하기 이전에, G 단백질의 발현을 검출하는 분자 표지를 세포 내로 도입하는 단계를 더욱 포함한다. 일부 다른 구체예에서, 상기 방법은 쓴맛 수용체의 발현을 검출하는 분자 표지를 도입한 이후에, G 단백질의 발현을 검출하는 분자 표지를 세포 내로 도입하는 단계를 더욱 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 쓴맛 수용체의 발현을 검출하는 분자 표지를 도입하는 것과 동시에, G 단백질의 발현을 검출하는 분자 표지를 세포 내로 도입하는 단계를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 쓴맛 수용체의 발현을 검출하는 분자 표지 및 G 단백질의 발현을 검출하는 분자 표지는 상이한 분자 표지이다. 일부 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체의 발현을 검출하는 분자 표지 및 G 단백질의 발현을 검출하는 분자 표지는 동일한 분자 표지이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 쓴맛 수용체를 발현하는 세포를 분리하기에 앞서 G 단백질을 발현하는 세포를 분리하고, 따라서 쓴맛 수용체와 G 단백질 둘 모두를 발현하는 세포를 분리하는 단계를 더욱 포함한다. 일부 다른 구체예에서, 상기 방법은 쓴맛 수용체를 발현하는 세포를 분리한 이후에 G 단백질을 발현하는 세포를 분리하고, 따라서 쓴맛 수용체와 G 단백질 둘 모두를 발현하는 세포를 분리하는 단계를 더욱 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 쓴맛 수용체를 발현하는 세포를 분리하는 것과 동시에 G 단백질을 발현하는 세포를 분리하고, 따라서 쓴맛 수용체와 G 단백질 둘 모두를 발현하는 세포를 분리하는 단계를 더욱 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라서, 쓴맛 수용체 기능의 조절제를 확인하는 방법은 아래의 단계를 포함한다: a) 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포 또는 세포주를 검사 화합물에 노출시키는 단계; 그리고 b) 쓴맛 수용체의 기능에서 변화를 검출하는 단계. 일부 구체예에서, 검출 단계는 세포내 유리 칼슘을 측정하는 분석법을 이용한다. 일부 구체예에서, 세포내 유리 칼슘은 하나 이상의 칼슘-민감성 형광 염료, 형광 현미경, 그리고 선택적으로, 형광 평판 판독기를 이용하여 측정되고, 여기서 적어도 하나의 형광 염료가 유리 칼슘에 결합한다. 일부 다른 구체예에서, 세포내 유리 칼슘은 하나 이상의 칼슘-민감성 형광 염료를 이용한 실시간 영상법 (real-time imaging)으로 모니터링되고, 여기서 적어도 하나의 형광 염료가 유리 칼슘에 결합된다.
일부 구체예에서, 이러한 세포주 내에 세포 또는 세포들은 진핵 세포이다. 일부 다른 구체예에서, 이러한 세포주 내에 세포 또는 세포들은 포유동물 세포이다. 또 다른 구체예에서, 이러한 세포주 내에 세포 또는 세포들은 내생적 쓴맛 수용체를 발현하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 이러한 세포주 내에 세포 또는 세포들은 내생적 쓴맛 수용체를 발현하지 않는 세포 유형의 진핵 세포이다. 또 다른 구체예에서, 이러한 세포주 내에 세포 또는 세포들은 내생적 쓴맛 수용체를 발현하지 않는 세포 유형의 포유동물 세포이다. 일부 구체예에서, 이러한 세포주 내에 세포 또는 세포들은 인간 배아 신장 293T 세포이다.
일부 구체예에서, 쓴맛 수용체는 서열 번호 77-101 중에서 한 가지의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 서열 번호 77-101 중에서 한 가지의 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 엄격한 조건 하에 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 역-보체 서열을 포함하는 핵산에 혼성화되는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 대립형질 변이체인 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 쓴맛 수용체는 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 서열 번호 51-75 중에서 한 가지에 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 엄격한 조건 하에 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 역-보체 서열을 포함하는 핵산에 혼성화되는 핵산의 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 대립형질 변이체인 핵산의 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 이소프로테레놀과 접촉될 때, 세포내 유리 칼슘 (free calcium)의 농도가 변한다. 일부 구체예에서, 이소프로테레놀은 이러한 세포 또는 세포주로 수행된 용량 반응 곡선에서 대략 1 nM 내지 대략 20 nM의 EC50 값을 갖는다.
일부 구체예에서, 검사 화합물은 쓴맛 수용체 저해제이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 이러한 세포 또는 세포주를 검사 화합물에 노출시키는 단계 이전에, 상기 세포 또는 세포주를 쓴맛 수용체의 공지된 작동약에 노출시키는 단계를 더욱 포함한다. 일부 다른 구체예에서, 상기 방법은 이러한 세포 또는 세포주를 검사 화합물에 노출시키는 단계와 동시에, 상기 세포 또는 세포주를 쓴맛 수용체의 공지된 작동약에 노출시키는 단계를 더욱 포함한다.
일부 구체예에서, 검사 화합물은 쓴맛 수용체 작동약이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 이러한 세포 또는 세포주를 검사 화합물에 노출시키는 단계 이전에, 상기 세포 또는 세포주를 쓴맛 수용체의 공지된 저해제에 노출시키는 단계를 더욱 포함한다. 일부 다른 구체예에서, 상기 방법은 이러한 세포 또는 세포주를 검사 화합물에 노출시키는 단계와 동시에, 상기 세포 또는 세포주를 쓴맛 수용체의 공지된 저해제에 노출시키는 단계를 더욱 포함한다.
일부 구체예에서, 검사 화합물은 소형 분자이다. 일부 구체예에서, 검사 화합물은 화학적 모이어티이다. 일부 구체예에서, 검사 화합물은 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 검사 화합물은 항체이다. 일부 구체예에서, 검사 화합물은 식품 추출물이다.
본 발명의 다른 측면에서, 쓴맛 수용체 기능의 조절제를 확인하는 방법은 a) 세포주의 수집물을 상이한 검사 화합물의 라이브러리에 노출시키는 단계, 여기서 세포주의 수집물은 2개 이상의 세포주를 포함하고, 각 세포주는 동일한 쓴맛 수용체 또는 이의 대립형질 변이체를 안정적으로 발현하고, 그리고 여기서 각 세포주는 라이브러리 내에 하나 이상의 검사 화합물에 노출되고; 그리고 b) 각 세포주에 의해 안정적으로 발현되는 쓴맛 수용체 또는 이의 대립형질 변이체의 기능에서 변화를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 검출 단계는 세포내 유리 칼슘을 측정하는 분석법을 이용한다. 일부 구체예에서, 세포내 유리 칼슘은 하나 이상의 칼슘-민감성 형광 염료, 형광 현미경, 그리고 선택적으로 형광 평판 판독기를 이용하여 측정되고, 여기서 적어도 하나의 형광 염료가 유리 칼슘에 결합한다. 일부 다른 구체예에서, 세포내 유리 칼슘은 하나 이상의 칼슘-민감성 형광 염료를 이용한 실시간 영상법에 의해 모니터링되고, 여기서 적어도 하나의 형광 염료가 유리 칼슘에 결합한다.
일부 구체예에서, 라이브러리는 소형 분자 라이브러리이다. 일부 구체예에서, 라이브러리는 조합 라이브러리이다. 일부 구체예에서, 라이브러리는 펩티드 라이브러리이다. 일부 구체예에서, 라이브러리는 항체 라이브러리이다.
일부 구체예에서, 검사 화합물은 소형 분자이다. 일부 구체예에서, 검사 화합물은 화학적 모이어티이다. 일부 구체예에서, 검사 화합물은 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 검사 화합물은 항체이다. 일부 구체예에서, 검사 화합물은 식품 추출물이다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 단계 (a) 이전에 또는 단계 (a)와 동시에, 세포주의 수집물을 공지된 쓴맛 수용체 작동약에 노출시키는 단계를 더욱 포함한다. 일부 다른 구체예에서, 상기 방법은 단계 (a) 이전에 또는 단계 (a)와 동시에, 세포주의 수집물을 공지된 쓴맛 수용체 저해제에 노출시키는 단계를 더욱 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라서, 쓴맛 수용체 기능의 조절제를 확인하는 방법은 a) 세포주의 수집물을 검사 화합물에 노출시키는 단계, 여기서 세포주의 수집물은 2개 이상의 세포주를 포함하고, 각 세포주는 상이한 쓴맛 수용체 또는 이의 대립형질 변이체를 안정적으로 발현하고; 그리고 b) 각 세포주에 의해 안정적으로 발현되는 쓴맛 수용체의 기능에서 변화를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 검출 단계는 세포내 유리 칼슘을 측정하는 분석법을 이용한다. 일부 구체예에서, 세포내 유리 칼슘은 하나 이상의 칼슘-민감성 형광 염료, 형광 현미경, 그리고 선택적으로 형광 평판 판독기를 이용하여 측정되고, 여기서 적어도 하나의 형광 염료가 유리 칼슘에 결합한다. 일부 다른 구체예에서, 세포내 유리 칼슘은 하나 이상의 칼슘-민감성 형광 염료를 이용한 실시간 영상법에 의해 모니터링되고, 여기서 적어도 하나의 형광 염료가 유리 칼슘에 결합한다.
일부 구체예에서, 검사 화합물은 소형 분자이다. 일부 구체예에서, 검사 화합물은 화학적 모이어티이다. 일부 구체예에서, 검사 화합물은 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 검사 화합물은 항체이다. 일부 구체예에서, 검사 화합물은 식품 추출물이다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 단계 (a) 이전에 또는 단계 (a)와 동시에, 세포주의 수집물을 공지된 쓴맛 수용체 작동약에 노출시키는 단계를 더욱 포함한다. 일부 다른 구체예에서, 상기 방법은 단계 (a) 이전에 또는 단계 (a)와 동시에, 세포주의 수집물을 공지된 쓴맛 수용체 저해제에 노출시키는 단계를 더욱 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라서, 쓴맛 수용체를 시간의 흐름 동안 일정한 수준에서 안정적으로 발현하도록 조작된 세포는 아래의 단계를 포함하는 방법에 의해 만들어진다: a) 쓴맛 수용체를 인코딩하는 mRNA를 발현하는 복수의 세포를 제공하는 단계; b) 이들 세포를 개별 배양 용기 내로 개별적으로 분산시켜 복수의 별개의 세포 배양액을 제공하는 단계; c) 자동화 세포 배양 방법을 이용하여 일단의 원하는 배양 조건 하에 이들 세포를 배양하는 단계, 이들 조건은 별개의 세포 배양액 각각에 대하여 실질적으로 동일한 것으로 특징되고, 이러한 배양 기간 동안 별개의 세포 배양액에 대해 세포의 숫자가 표준화되고, 그리고 여기서 이들 별개의 배양액은 동일한 일정에서 계대배양되고; d) 쓴맛 수용체의 발현을 측정하기 위하여 별개의 세포 배양액을 적어도 2회 평가하는 단계; 그리고 e) 양쪽 분석에서 쓴맛 수용체를 일정한 수준에서 발현하는 별개의 세포 배양액을 확인하여 상기 세포를 획득하는 단계.
일정한 구체예에서, 쓴맛 수용체를 내생적으로 발현하는 세포는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 세포의 개체군으로부터 분리될 수 있다. 이런 분리된 세포는 본 명세서에서 기술된 방법과 조성물, 예를 들면, 스크리닝 방법과 패널에 이용될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서는 단백질 복합체를 조정하는 화합물의 화학 세계 (chemical space)를 정의하는 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 복수의 화학적으로 다양한 화합물을 개별적으로, 단백질 복합체를 발현하도록 조작된 세포와 접촉시키는 단계;
b) 단백질 복합체의 활성에 대한 이들 화합물의 효과를 평가하는 단계;
c) 단계 b)에서 획득된 효과를 이들 화합물의 구조적 공통성 (structural commonality)과 상관시키는 단계.
일정한 구체예에서, 본 발명에서는 단백질 복합체를 조정하는 화합물의 사이에서 구조적 공통성 (structural commonality)을 확인하는 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 앞서 기술된 방법의 단계 a)와 b)에 따라서, 상기 단백질 복합체를 조정하는 화합물을 확인하는 단계;
b) 개별 화합물의 분자 표현 (molecular representation) 및 개별 화합물의 활성 프로필을 이용하여 상기 화합물 각각에 대한 구조-활성 상관관계 (SAR) 모형을 구축하는 단계, 여기서 상기 화합물 각각의 상기 분자 표현은 개별 화합물의 구조 서술자 (structural descriptor)를 포함하고, 여기서 상기 활성 프로필 각각은 단백질 복합체의 생물학적 활성에 대한 개별 화합물의 효과의 정량적 치수를 포함하고, 그리고 여기서 상기 SAR 모형 각각은 개별 화합물의 구조적 특징 (structural feature)을 개별 화합물의 활성 프로필과 상관시키고;
c) 개별 화합물에 대한 상기 SAR 모형에 기초하여, 개별 화합물의 활성 프로필과 상관하는 상기 화합물 각각의 한 가지 이상의 구조적 특징을 확인하는 단계; 그리고
d) 단계 (c)에서 확인된 상기 화합물 각각의 한 가지 이상의 구조적 특징 중에서 이들 화합물에 공통된 적어도 하나의 구조적 특징을 확인하는 단계.
일정한 구체예에서, 본 발명에서는 단백질 복합체를 조정하는 화합물의 사이에서 구조적 공통성을 확인하는 방법을 제시하고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 복수의 후보 화합물을 개별적으로, 단백질 복합체를 발현하도록 조작된 세포와 접촉시키는 단계;
b) 단백질 복합체의 활성에 대한 상기 복수의 화합물의 각 후보 화합물의 효과를 평가하여 상기 후보 화합물 각각의 활성 프로필을 제공하는 단계, 여기서 상기 활성 프로필 각각은 단백질 복합체의 생물학적 활성에 대한 개별 후보 화합물의 효과의 정량적 치수를 포함하고;
c) 상기 후보 화합물의 활성 프로필에 기초하여, 상기 단백질 복합체의 활성을 조정하는 하나 이상의 후보 화합물을 확인하는 단계;
d) 개별 후보 화합물의 분자 표현 및 개별 후보 화합물의 활성 프로필을 이용하여, 단계 (c)에서 확인된 상기 하나 이상의 후보 화합물 각각에 대한 구조-활성 상관관계 (SAR) 모형을 구축하는 단계, 여기서 상기 하나 이상의 후보 화합물 각각의 상기 분자 표현은 개별 후보 화합물의 구조 서술자를 포함하고, 그리고 여기서 상기 SAR 모형 각각은 개별 후보 화합물의 구조적 특징을 개별 후보 화합물의 활성 프로필과 상관시키고;
e) 개별 후보 화합물에 대한 상기 SAR 모형에 기초하여, 개별 후보 화합물의 활성 프로필과 상관하는 상기 하나 이상의 후보 화합물 각각의 한 가지 이상의 구조적 특징을 확인하는 단계; 그리고
f) 단계 (e)에서 확인된 상기 개별 후보 화합물 각각의 한 가지 이상의 구조적 특징 중에서 상기 하나 이상의 후보 화합물에 공통된 적어도 하나의 구조적 특징을 확인하는 단계.
더욱 특정한 구체예에서, 상기 화합물 각각의 상기 분자 표현은 개별 화합물의 물리화학적 데이터, 개별 화합물의 공간적 데이터, 개별 화합물의 위상적 데이터, 또는 이들의 조합을 더욱 포함한다.
더욱 특정한 구체예에서, 단백질 복합체는 쓴맛 수용체이다.
더욱 특정한 구체예에서, 상기 화합물 각각에 대한 SAR 모형의 구축은 개별 화합물의 분자 표현 및 개별 화합물의 활성 프로필 사이에 상관관계를 결정하기 위하여 회귀 방법을 적용하는 것을 포함한다.
더욱 특정한 구체예에서, 상기 화합물 각각에 대한 SAR 모형은 독립적으로, 수용체-의존성 유리 에너지 포스 필드 QSAR (FEFF-QSAR) 모형, 수용체-독립성 3-차원 QSAR (3D-QSAR), 또는 수용체-의존성 또는 수용체-독립성 4-차원 QSAR (4D-QSAR)이다.
일정한 측면에서, 본 명세서에서 기술된 방법에 이용될 수 있는 키트가 본 발명에서 제시된다. 특히, 하나 이상의 복수 표적을 안정적으로 발현하는 하나 이상의 세포 또는 세포주를 포함하는 키트가 본 발명에서 제시된다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 키트는 본 명세서에서 기술된 하나 이상의 신호전달 프로브를 포함한다. 특정한 구체예에서, 키트는 하나 이상의 복수 표적을 인코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 키트는 하나 이상의 복수 표적을 안정적으로 발현하는 세포를 스크리닝하고 선별하는 기능적 세포-기초된 분석 (가령, 칼슘 유동 분석, 막 전위 분석)에 이용되는 하나 이상의 염료를 포함한다.
일정한 측면에서, 본 명세서에서 기술된 하나 이상의 시약 및/또는 세포, 예를 들면, 본 명세서에서 기술된 하나 이상의 세포, 벡터, 및/또는 신호전달 프로브로 채워진 하나 이상의 그릇을 포함하는 키트가 본 발명에서 제시된다. 선택적으로, 이런 그릇(들)에는 키트 내에 성분을 이용하기 위한 사용설명서를 포함하는 전단지가 동봉될 수 있다.
상세한 설명
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 비록 본 명세서에서 기술된 것들에 유사하거나 동등한 방법과 물질 역시 본 발명의 실시 또는 시험에 이용될 수 있긴 하지만, 예시적인 방법과 물질이 하기에 기술된다. 상충되는 경우에, 정의를 비롯한 본 명세서가 우선할 것이다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 기타 참고문헌은 순전히 참조로서 편입된다. 비록 다수의 문헌이 본 명세서에서 인용되긴 하지만, 이러한 인용은 이들 문서가 당분야에서 일반 상식의 일부를 구성한다는 것을 인정하는 것으로 간주되지 않는다.
본 명세서 및 특허청구범위 전반에서, 단어 "포함한다," 또는 이형, 예를 들면, "포함한다" 또는 "포함하는"은 정의된 완전체 또는 완전체의 군을 포함하지만 임의의 다른 완전체 또는 완전체의 군을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
달리 명시되지 않으면, 단수형은 복수형을 포함하고, 그리고 복수형은 단수형을 포함한다. 이들 물질, 방법, 그리고 실례는 예시를 목적으로 하고 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명을 더욱 충실하게 이해하기 위하여, 일정한 용어가 먼저 정의된다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에서 기술된다.
용어 "안정적인" 또는 "안정적으로 발현하는" 은 용어 "안정적인 발현" 및 "일시적인 발현"이 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 단백질을 일시적으로 발현하는 세포로부터 본 발명의 세포와 세포주를 구별하도록 의도된다. 본 명세서에서, "동일한 유형의 세포에서 발현되지 않는"은 임의의 다른 동일한 유형의 세포에서, 또는 적어도 99%의 동일한 유형의 세포에서, 또는 적어도 99%의 동일한 유형의 세포에서, 또는 적어도 98%의 동일한 유형의 세포에서, 또는 적어도 97%의 동일한 유형의 세포에서, 또는 적어도 96%의 동일한 유형의 세포에서, 또는 적어도 95%의 동일한 유형의 세포에서, 또는 적어도 94%의 동일한 유형의 세포에서, 또는 적어도 93%의 동일한 유형의 세포에서, 또는 적어도 92%의 동일한 유형의 세포에서, 또는 적어도 91%의 동일한 유형의 세포에서, 또는 적어도 90%의 동일한 유형의 세포에서, 또는 적어도 85%의 동일한 유형의 세포에서, 또는 적어도 80%의 동일한 유형의 세포에서, 또는 적어도 75%의 동일한 유형의 세포에서, 또는 적어도 70%의 동일한 유형의 세포에서, 또는 적어도 60%의 동일한 유형의 세포에서, 또는 적어도 50%의 동일한 유형의 세포에서 발현되지 않음을 포함한다.
본 명세서에서, 목적되는 "기능적" RNA 또는 단백질은 세포 기초된 분석에서 1:1 이상의 신호 대 잡음 비율을 갖는 것이다. 일부 구체예에서, 목적되는 "기능적" RNA 또는 단백질은 2 이상의 신호 대 잡음 비율을 갖는다. 일부 구체예에서, 목적되는 "기능적" RNA 또는 단백질은 3 이상의 신호 대 잡음 비율을 갖는다. 일부 구체예에서, 목적되는 "기능적" RNA 또는 단백질은 4 이상의 신호 대 잡음 비율을 갖는다. 일부 구체예에서, 목적되는 "기능적" RNA 또는 단백질은 5 이상의 신호 대 잡음 비율을 갖는다. 일부 구체예에서, 목적되는 "기능적" RNA 또는 단백질은 10 이상의 신호 대 잡음 비율을 갖는다. 일부 구체예에서, 목적되는 "기능적" RNA 또는 단백질은 15 이상의 신호 대 잡음 비율을 갖는다. 일부 구체예에서, 목적되는 "기능적" RNA 또는 단백질은 20 이상의 신호 대 잡음 비율을 갖는다. 일부 구체예에서, 목적되는 "기능적" RNA 또는 단백질은 30 이상의 신호 대 잡음 비율을 갖는다. 일부 구체예에서, 목적되는 "기능적" RNA 또는 단백질은 40 이상의 신호 대 잡음 비율을 갖는다. 일부 구체예에서, 신호 대 잡음 비율은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 70% 이상 변하지 않는다. 일부 구체예에서, 신호 대 잡음 비율은 실험에서 실험으로 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 70% 이상 변하지 않는다. 일부 구체예에서, 신호 대 잡음 비율은 실험에서 실험으로 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 이상 변하지 않는다. 일부 구체예에서, 신호 대 잡음 비율은 실험의 2 내지 20회 별개의 반복에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 70% 이상 변하지 않는다. 일부 구체예에서, 신호 대 잡음 비율은 실험의 2 내지 20회 별개의 반복에서 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 이상 변하지 않는다. 일부 구체예에서, 신호 대 잡음 비율은 1 내지 5일, 5 내지 10일, 10 내지 15일, 15 내지 20일, 20 내지 25일, 25 내지 30일, 30 내지 40일, 40 내지 50일, 50 내지 60일, 60 내지 70일 또는 70일 이상 동안 시험되는 세포의 경우에 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 70% 이상 변하지 않고, 여기서 이들 세포는 연속 배양된다. 일부 구체예에서, 신호 대 잡음 비율은 1 내지 5일, 5 내지 10일, 10 내지 15일, 15 내지 20일, 20 내지 25일, 25 내지 30일, 30 내지 40일, 40 내지 50일, 50 내지 60일, 60 내지 70일 또는 70일 이상 동안 시험되는 세포의 경우에 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 이상 변하지 않고, 여기서 이들 세포는 연속 배양된다. 일부 구체예에서, 목적되는 기능적 단백질 또는 RNA는 자연 발생 또는 내생적으로 발현된 단백질 또는 RNA의 생물학적 활성 중에서 한 가지 이상을 갖는다.
용어 "세포주" 또는 "클론 세포주"는 단일 기원 세포의 후손인 세포의 개체군을 지칭한다. 본 명세서에서, 세포주는 세포 배양 동안 시험관내 유지되고, 그리고 클론 세포의 은행을 확립하기 위하여 분취량으로 동결될 수 있다.
용어 "엄격한 조건" 또는 "엄격한 혼성화 조건"은 하나 이상의 핵산 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키고, 그리고 시료 내에서 표적 핵산에 특이적으로 결합되지 않은 프로브를 세척하기 위한 온도와 염 조건을 기술한다. 엄격한 조건은 당업자에게 공지되어 있고, 그리고 예로써 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6에서 찾아볼 수 있다. 수성과 비-수성 방법은 상기 문헌에서 기술되고 어느 것이든 이용될 수 있다. 엄격한 혼성화 조건의 한 가지 실례는 대략 45℃에서 6X SSC에서 혼성화, 그 이후에 60℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 적어도 1회 세척이다. 엄격한 혼성화 조건의 다른 실례는 대략 45℃에서 6X SSC에서 혼성화, 그 이후에 65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 적어도 1회 세척이다. 엄격한 혼성화 조건에는 또한, 65℃에서 0.5M 인산나트륨, 7% SDS에서 혼성화, 그 이후에 65℃에서 0.2X SSC, 1% SDS에서 적어도 1회 세척이 포함된다.
아미노산 및/또는 핵산 서열과 관련하여 구(句) "동일한 비율" 또는 "동일성 비율"은 적어도 2개의 상이한 서열 사이에 유사성을 지칭한다. 동일성 비율은 표준 정렬 알고리즘 (standard alignment algorithm), 예를 들면, Altshul 등 ((1990) J. Mol. Biol., 215: 403410)에 의해 기술된 Basic Local Alignment Tool (BLAST); Needleman 등 ((1970) J. Mol. Biol., 48: 444453)의 알고리즘; 또는 Meyers 등 ((1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 1117)의 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 일단의 파라미터는 12의 갭 페널티 (gap penalty), 4의 갭 확장 페널티 (gap extend penalty), 그리고 5의 구조이동 갭 페널티 (frameshift gap penalty)를 갖는 Blosum 62 스코어링 매트릭스 (scoring matrix)일 수 있다. 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이에 동일성 비율은 또한, PAM120 가중 잔기 테이블 (weight residue table), 12의 갭 길이 페널티 (gap length penalty) 및 4의 갭 페널티 (gap penalty)를 이용하여, ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합된 E. Meyers와 W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17)의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 동일성 비율은 통상적으로, 유사한 길이의 서열을 비교함으로써 계산된다.
단백질 분석 소프트웨어는 보존성 아미노산 치환을 비롯하여 다양한 치환, 결실 및 기타 변형에 부여된 유사성 척도를 이용하여 유사한 아미노산 서열을 정합한다. 가령, GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc.)는 밀접하게 관련된 폴리펩티드, 예를 들면, 상이한 종으로부터 이종동형 폴리펩티드 사이에, 또는 야생형 단백질 및 이의 뮤테인 사이에 서열 동일성을 결정하기 위하여 디폴트 파라미터로 이용될 수 있는 "Gap" 및 "Bestfit"와 같은 프로그램을 포함한다. 예로써, GCG 버전 6.1을 참조한다. 폴리펩티드 서열 역시 디폴트 또는 권장 파라미터를 이용한 FASTA에 의해 비교될 수 있다. GCG 버전 6.1. FASTA (가령, FASTA2와 FASTA3)에서 프로그램은 질문 서열 (query sequence)과 검색 서열 (search sequence) 사이에 최적 중복의 영역의 정렬 및 서열 동일성 비율을 제공한다 (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)).
동일성을 위하여 비교되는 폴리펩티드 서열의 길이는 일반적으로, 적어도 대략 16개의 아미노산 잔기, 통상적으로 적어도 대략 20개의 잔기, 더욱 통상적으로 적어도 대략 24개의 잔기, 전형적으로 적어도 대략 28개의 잔기, 그리고 바람직하게는 대략 35개 이상의 잔기일 것이다. 동일성을 위하여 비교되는 DNA 서열의 길이는 일반적으로, 적어도 대략 48개의 핵산 잔기, 통상적으로 적어도 대략 60개의 핵산 잔기, 더욱 통상적으로 적어도 대략 72개의 핵산 잔기, 전형적으로 적어도 대략 84개의 핵산 잔기, 그리고 바람직하게는 대략 105개 이상의 핵산 잔기일 것이다.
아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과 관련하여 구(句) "실질적으로 설명된 바와 같은," "실질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 이종동형"은 관련된 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 비교기 서열과 동일하거나, 또는 비교기 서열과 비교하여 미미한 차이 (가령, 보존된 아미노산 치환 또는 이런 치환을 인코딩하는 핵산)를 갖는다는 것을 의미한다. 미미한 차이는 중요하지 않은 아미노산 변화, 예를 들면, 특정된 영역의 50개 아미노산 서열 및 이들 서열을 인코딩하는 핵산에서 1 또는 2개의 치환을 포함한다.
조절제에는 목적되는 단백질, 예를 들면, 미각 수용체 (가령, 쓴맛 수용체, 감칠맛 수용체, 또는 단맛 수용체)의 활성을 변화시키는 임의의 물질 또는 화합물이 포함된다. 조절제는 부분 작동약 또는 길항약, 선별적 작동약 또는 길항약 및 역작동약을 비롯한 작동약 (강화제 또는 활성제) 또는 길항약 (저해제 또는 차단제)일 수 있고, 또한 알로스테릭한 조절제일 수 있다. 물질 또는 화합물은 이의 조정 활성이 상이한 조건 또는 농도 하에, 또는 상이한 형태의 목적되는 단백질, 예를 들면, 미각 수용체 (가령, 쓴맛 수용체, 감칠맛 수용체, 또는 단맛 수용체)에 대하여 변하면, 조절제이다. 다른 측면에서, 조절제는 다른 조절제의 능력을 변화시켜 목적되는 단백질, 예를 들면, 미각 수용체 (가령, 쓴맛 수용체, 감칠맛 수용체, 또는 단맛 수용체)의 기능에 영향을 줄 수 있다. 특정한 구체예에서, 조절제는 능동적으로 또는 수동적으로, 미각 수용체 (가령, 쓴맛 수용체, 감칠맛 수용체, 또는 단맛 수용체)의 구조, 배좌, 생화학적 또는 생물물리학적 특성 또는 기능성을 변화시킬 수 있다.
용어 "강화제", "작동약" 또는 "활성제"는 목적되는 단백질, 예를 들면, 미각 수용체 (가령, 쓴맛 수용체, 감칠맛 수용체, 또는 단맛 수용체)의 한 가지 이상의 활성을 증가시키는 화합물 또는 물질을 지칭한다. 특정한 구체예에서, 미각 수용체의 상황에서 용어 "강화제", "작동약" 또는 "활성제"는 미각 수용체 (가령, 쓴맛 수용체, 감칠맛 수용체, 또는 단맛 수용체)와 연관된 하류 신호전달 반응을 증가시키는 화합물 또는 물질을 지칭한다. 특정한 구체예에서, 미각 수용체 활성의 증가는 세포내 분자의 양 또는 분포에서, 또는 쓴맛 수용체에 대한 세포내 신호전달 경로의 일부인 효소의 활성에서 변화를 유발할 수 있다. 세포내 분자의 실례에는 유리 칼슘, 환상 아데노신 모노포스페이트 (cAMP), 이노시톨 모노-, 디- 또는 트리-포스페이트가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 효소의 실례에는 아데닐레이트 사이클라아제, 포스포리파아제-C, G-단백질 결합된 수용체 키나아제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
용어 "저해제", "길항약" 또는 "차단제"는 목적되는 단백질, 예를 들면, 미각 수용체 (가령, 쓴맛 수용체, 감칠맛 수용체, 또는 단맛 수용체)의 한 가지 이상의 활성을 감소시키거나 차단하는 화합물 또는 물질을 지칭한다. 특정한 구체예에서, 미각 수용체의 상황에서 용어 "저해제", "길항약" 또는 "차단제"는 미각 수용체 (가령, 쓴맛 수용체, 감칠맛 수용체, 또는 단맛 수용체)와 연관된 하류 신호전달 반응을 감소시키는 화합물 또는 물질을 지칭한다. 특정한 구체예에서, 미각 수용체 활성의 감소는 세포내 분자의 양 또는 분포에서, 또는 쓴맛 수용체에 대한 세포내 신호전달 경로의 일부인 효소의 활성에서 변화를 유발할 수 있다. 세포내 분자의 실례에는 유리 칼슘, 환상 아데노신 모노포스페이트 (cAMP), 이노시톨 모노-, 디- 또는 트리-포스페이트가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 효소의 실례에는 아데닐레이트 사이클라아제, 포스포리파아제-C, G-단백질 결합된 수용체 키나아제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
단맛 수용체는 입, 폐와 장의 상피 세포를 비롯한 많은 포유동물 조직 내에 존재하는 단백질이다. 이론에 한정됨 없이, 단맛 수용체 조절곤란 또는 기능장애는 당뇨병과 비만을 비롯한 많은 질병 상태 (disease state)에 관련될 수 있는 것으로 생각된다.
구(句) "기능적 단맛 수용체"는 적어도 하나의 T1R2와 T1R3 아단위를 포함하고, 그리고 상기 수용체를 생산하기 위한 유전자 조작 없이 이를 정상적으로 발현하는 세포에서 생산된 단맛 수용체와 유사한 (즉, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%와 95% 동일한) 방식으로, 공지된 활성제, 예를 들면, 프럭토오스, 글루코오스, 수크로오스, 모넬린/미라쿨린, 모그로시드 (mogroside), 스테비아, 레바우디오시드(rebaudioside) A, 사카린, 아스파테임, 사이클라민산나트륨, 수크랄로스, 소르비탈, 아세설팜 K 또는 김네마 실베스타 (Gymnema Sylvestre), 또는 공지된 저해제, 예를 들면, 메틸 4,6-디클로로-4,6-디데옥시-α-D-갈락토피라노시드 (MAD-diCl-Gal), PNP/락티솔 (이는 상이한 농도에서 다르게 작용할 수 있다), 김네마산 (Gymnemic acid) 1, 호둘로시드 (hoduloside), 지지핀 (Ziziphin), 그리고 구르마린 (gurmarin)에 반응하는 단맛 수용체를 지칭한다. 단맛 수용체 행태는 예로써, 생리학적 활성 또는 약리학적 반응에 의해 결정될 수 있다. 생리학적 활성에는 G 단백질의 활성화 및 연관된 하류 신호전달이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 약리학적 반응에는 상기 수용체의 저해, 활성화, 그리고 조정이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 반응은 예로써, 활성화된 단맛 수용체에 의한 Gαq 단백질 활성화 시에 소포체 (endoplasmic reticulum)로부터 세포내 칼슘 방출을 모니터링하는 분석에서 평가될 수 있다.
감칠맛 수용체는 입, 폐와 장의 상피 세포를 비롯한 많은 포유동물 조직 내에 존재하는 단백질이다. 이론에 한정됨 없이, 감칠맛 수용체 조절곤란 또는 기능장애는 당뇨병과 비만을 비롯한 많은 질병 상태 (disease state)에 관련될 수 있는 것으로 생각된다.
구(句) "기능적 감칠맛 수용체"는 적어도 하나의 T1R1과 T1R3 아단위를 포함하고, 그리고 상기 수용체를 생산하기 위한 유전자 조작 없이 이를 정상적으로 발현하는 세포에서 생산된 감칠맛 수용체와 유사한 (즉, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%와 95% 동일한) 방식으로, 공지된 활성제, 예를 들면, 모노나트륨 글루타메이트 (MSG), 또는 공지된 저해제, 예를 들면, 락티솔 (이는 특정한 농도에서 감칠맛 수용체 저해제로서 기능하는 것으로 알려져 있다), 또는 PMP (2-(4-메톡시페녹시)-프로피온산)에 반응하는 감칠맛 수용체를 지칭한다. 감칠맛 수용체 행태는 예로써, 생리학적 활성 또는 약리학적 반응에 의해 결정될 수 있다. 생리학적 활성에는 G 단백질의 활성화 및 연관된 하류 신호전달이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 약리학적 반응에는 상기 수용체의 저해, 활성화, 그리고 조정이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 반응은 예로써, 활성화된 감칠맛 수용체에 의한 Gαq 단백질 활성화 시에 소포체 (endoplasmic reticulum)로부터 세포내 칼슘 방출을 모니터링하는 분석에서 평가될 수 있다.
구(句) "기능적 쓴맛 수용체"는 조작 없이 쓴맛 수용체를 정상적으로 발현하는 세포에서 쓴맛 수용체와 실질적으로 동일한 방식으로, 공지된 활성제 또는 공지된 저해제에 반응하는 쓴맛 수용체를 지칭한다. 쓴맛 수용체 행태는 예로써, 생리학적 활성 및 약리학적 반응에 의해 결정될 수 있다. 생리학적 활성에는 쓴맛의 느낌이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 약리학적 반응에는 세포내 분자의 양 또는 분포, 또는 쓴맛 수용체가 조절제와 접촉될 때 쓴맛 수용체에 대한 세포내 신호전달 경로의 일부인 효소의 활성에서 변화가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 가령, 약리학적 반응에는 쓴맛 수용체가 활성화될 때 세포내 유리 칼슘에서 증가, 또는 쓴맛 수용체가 차단될 때 세포내 유리 칼슘에서 감소가 포함된다.
본 명세서에서, 용어 "쓴맛 수용체"는 미각 수용체 세포의 표면에서 발현되고 이차 메신저 경로를 통한 쓴맛 지각을 매개하는 G 단백질 결합된 수용체 중에서 임의의 한 가지를 지칭한다.
목적되는 "이종기원" 또는 "도입된" 단백질, 예를 들면, 미각 수용체 아단위 (가령, 쓴맛 수용체 아단위, 감칠맛 수용체 아단위, 또는 단맛 수용체 아단위) 또는 G 단백질은 목적되는 단백질, 예를 들면, 미각 수용체 아단위 (가령, 쓴맛 수용체 아단위, 감칠맛 수용체 아단위, 또는 단맛 수용체 아단위) 또는 G 단백질이 호스트 세포 내로 도입된 핵산에 의해 인코딩된다는 것을 의미한다.
목적되는 "유전자 활성화된" 단백질, 예를 들면, 미각 수용체 아단위 (가령, 쓴맛 수용체 아단위, 감칠맛 수용체 아단위, 또는 단맛 수용체 아단위) 또는 G 단백질은 상기 아단위 또는 단백질을 인코딩하는 내생적 핵산이 이러한 핵산에 발현 제어 서열의 도입과 작동가능한 연결에 의해 발현에 대하여 활성화된다는 것을 의미한다.
본 발명에서는 최초로, 목적되는 기능적 RNA, 또는 복합 단백질, 예를 들면, 이종다합체성 단백질 및 리간드가 알려져 있지 않은 단백질을 비롯한 목적되는 기능적 단백질을 안정적으로 발현하는 세포에 대한 시급한 요구를 충족시키는 세포로부터 생산된 신규한 세포와 세포주를 제시한다. 본 발명의 세포와 세포주는 목적되는 RNA 또는 단백질의 지속저인 기능적 발현이 바람직한 임의의 용도에 적합하다. 본 출원인은 막 단백질, 세포질 단백질, 분비된 단백질, 그리고 이들의 다양한 조합을 비롯하여 단일 아단위 및 이종다합체성 아단위 (2개 이상의 상이한 아단위를 보유하는 이종이합체와 단백질 포함)를 보유하는 다양한 단백질에 대한 이러한 명세를 충족하는 세포주를 생산하였다.
목적되는 단백질의 실례에는 수용체 (가령, 사이토카인 수용체, 면역글로불린 수용체 집단 구성원, 리간드-개폐 이온 채널, 단백질 키나아제 수용체, G-단백질 결합된 수용체 (GPCR), 핵 호르몬 수용체, 그리고 기타 수용체), 신호전달 분자 (가령, 사이토카인, 성장 인자, 펩티드 호르몬, 케모카인, 막-결합된 신호전달 분자, 그리고 기타 신호전달 분자), 키나아제 (가령, 아미노산 키나아제, 탄수화물 키나아제, 뉴클레오티드 키나아제, 단백질 키나아제, 그리고 기타 키나아제), 포스파타아제 (가령, 탄수화물 포스파타아제, 뉴클레오티드 포스파타아제, 단백질 포스파타아제, 그리고 기타 포스파타아제), 프로테아제 (가령, 아스파르트산 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제, 세린 프로테아제, 그리고 기타 프로테아제), 조절 분자 (가령, G-단백질 조절제, 큰 G-단백질, 작은 GTPase, 키나아제 조절제, 포스파타아제 조절제, 프로테아제 저해제, 그리고 기타 효소 조절제), 칼슘 결합 단백질 (가령, 아넥신, 칼모듈린 관련된 단백질, 그리고 기타 선택된 칼슘 결합 단백질), 전사 인자 (가령, 핵 호르몬 수용체, 기초 전사 인자, 염기성 나선-루프-나선 전사 인자, creb 전사 인자, hmg-box 전사 인자, homeobox 전사 인자, 기타 전사 인자, 전사 보조인자 및 아연 핑거 전사 인자), 핵산 결합 단백질 (가령, 헬리카아제, DNA 리가아제, DNA 메틸트랜스퍼라아제, RNA 메틸트랜스퍼라아제, 이중-가닥 DNA 결합 단백질, 엔도데옥시리보뉴클레아제 (endodeoxyribonuclease), 복제 기원 결합 단백질, 역전사효소, 리보뉴클레오단백질, 리보솜 단백질, 단일-가닥 DNA-결합 단백질, 동원체 DNA-결합 단백질, 염색질/염색질-결합 단백질, DNA 글리코실라아제 (glycosylase), DNA 포토리아제 (photolyase), DNA 중합효소 진행도 인자, DNA 가닥-대합 단백질, DNA 국소이성화효소, DNA-유도된 DNA 중합효소, DNA-유도된 RNA 중합효소, 손상된 DNA-결합 단백질, 히스톤, 프리마아제 (primase), 엔도리보뉴클레아제 (endoribonuclease), 엑소데옥시리보뉴클레아제 (exodeoxyribonuclease), 엑소리보뉴클레아제 (exoribonuclease), 번역 신장 인자, 번역 개시 인자, 번역 방출 인자, mRNA 폴리아데닐화 인자, mRNA 절단접합 인자, 기타 DNA-결합 단백질, 기타 RNA-결합 단백질, 그리고 기타 핵산 결합 단백질), 이온 채널 (가령, 음이온 채널, 리간드-개폐 이온 채널, 전압-개폐 이온 채널, 그리고 기타 이온 채널), 수송체 (가령, 양이온 수송체, ATP-결합 카세트 (ABC) 수송체, 아미노산 수송체, 탄수화물 수송체, 그리고 기타 수송체), 이동/담체 단백질 (가령, 아포리포단백질, 미토콘드리아 담체 단백질, 그리고 기타 이동/담체 단백질), 세포 부착 분자 (가령, cam 집단 부착 분자, 카드헤린, 그리고 기타 세포 부착 분자), 세포골격 단백질 (가령, 액틴과 액틴 관련된 단백질, 액틴 결합 운동 단백질, 비-운동 액틴 결합 단백질, 기타 액틴 집단 세포골격 단백질, 중간 섬유, 미세소관 집단 세포골격 단백질, 그리고 기타 세포골격 단백질), 세포외 기질 (가령, 세포외 기질 당단백질, 세포외 기질 링커 단백질, 세포외 기질 구조 단백질, 그리고 기타 세포외 기질), 세포 연접 단백질 (가령, 갭 연접 단백질, 치밀 연접 단백질, 그리고 기타 세포 연접 단백질), 신타아제 (synthase), 신스에타아제 (synthetase), 옥시도리덕타아제 (가령, 데하이드로게나아제, 하이드록실라아제, 옥시다아제, 옥시게나아제, 페록시다아제, 리덕타아제, 그리고 기타 옥시도리덕타아제), 트랜스퍼라아제 (가령, 메틸트랜스퍼라아제, 아세틸트랜스퍼라아제, 아실트랜스퍼라아제, 글리코실트랜스퍼라아제, 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제, 포스포릴라아제, 트랜스알돌라아제, 트랜스아미나아제, 트랜스케톨라아제, 그리고 기타 트랜스퍼라아제), 하이드롤라아제 (가령, 데아세틸라아제, 데아미나아제, 에스테라아제, 갈락토시다아제, 글루코시다아제, 글리코시다아제, 리파아제, 포스포디에스테라아제, 피로포스파타아제, 아밀라아제, 그리고 기타 하이드롤라아제), 리아제 (가령, 아데닐레이트 사이클라아제, 구아닐레이트 사이클라아제, 알돌라아제, 데카르복실라아제, 데하이드라타아제, 하이드라타아제, 그리고 기타 리아제), 이성화효소 (가령, 에피메라아제 (epimerase)/라세마아제 (racemase), 무타아제 (mutase), 그리고 기타 이성화효소), 리가아제 (가령, DNA 리가아제, 유비퀴틴-단백질 리가아제, 그리고 기타 리가아제), 방어/면역 단백질 (가령, 항균성 반응 단백질, 보체 성분, 면역글로불린, 면역글로불린 수용체 집단 구성원, 주요 조직적합성 복합체 항원, 그리고 기타 방어와 면역 단백질), 막 통행 단백질 (가령, 막 통행 조절 단백질, SNARE 단백질, 소포 외피 단백질, 그리고 기타 막 통행 단백질), 샤프롱 (가령, 샤페로닌, hsp 70 집단 샤프롱, hsp 90 집단 샤프롱, 그리고 기타 샤프롱), 바이러스 단백질 (가령, 바이러스 외피 단백질 및 기타 바이러스 단백질), 미엘린 단백질, 기타 잡다한 기능 단백질, 저장 단백질, 구조 단백질, 계면활성제, 그리고 막통과 수용체 조절/어댑터 단백질이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 단백질 및 그들의 기능의 다른 실례에는 Paul D. Thomas, Michael J. Campbell, Anish Kejariwal, Huaiyu Mi, Brian Karlak, Robin Daverman, Karen Diemer, Anushya Muruganujan, Apurva Narechania. 2003. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res., 13: 2129-2141에서 확인된 것들이 포함되고, 상기 문헌은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
GPCR의 실례에는
5-하이드록시트립타민 수용체 (가령, HTR1A, HTR1B, HTR1D, HTR1E, HTR1F, HTR2A, HTR2B, HTR2C, HTR4, HTR5A, HTR6, 그리고 HTR7), 무스카린성 아세틸콜린 수용체 (가령, CHRM1, CHRM2, CHRM3, CHRM4, 그리고 CHRM5), 아데노신 수용체 (가령, ADORA1, ADORA2A, ADORA2B, 그리고 ADORA3), 알파-아드레날린수용체 (가령, ADRA1A, ADRA1B, ADRA1D, ADRA2A, ADRA2B, 그리고 ADRA2C), 베타-아드레날린수용체 (가령, ADRB1,ADRB2, 그리고 ADRB3), 아나필라톡신 수용체 (가령, GPR77, C5R1, 그리고 C3AR1), 앤지오텐신 수용체 (가령, AGTR1 및 AGTR2), 아펠린 수용체 (가령, AGTRL1), 담즙 산 수용체 (가령, GPBAR1), 봄베신 수용체 (가령, NMBR, GRPR, 그리고 BRS3), 브래디키닌 수용체 (가령, BDKRB1 및 BDKRB2), 칸나비노이드 수용체 (가령, CNR1 및 CNR2), 케모카인 수용체-인터류킨 (가령, 8IL8RA 및 IL8RB), 케모카인 수용체 (가령, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CX3CR1, XCR1, 그리고 CXCR6), 콜레시스토키닌 수용체 (가령, CCKAR 및 CCKBR), 도파민 수용체 (가령, DRD1, DRD2, DRD3, DRD4, 그리고 DRD5), 엔도텔린 수용체 (가령, EDNRA 및 EDNRB), 에스트로겐 수용체 (가령, GPER), 포르밀펩티드 수용체 (가령, FPR2, FPR3, 그리고 FPR1), 유리 지방산 수용체 (가령, FFAR1, FFAR3, FFAR2, 그리고 GPR42), 갈라닌 수용체 (가령, GALR1, GALR2, 그리고 GALR3), 그렐린 수용체 (가령, GHSR), 당단백질 호르몬 수용체 (가령, FSHR, LHCGR, 그리고 TSHR), 생식선 자극 호르몬-방출 호르몬 수용체 (가령, GNRHR 및 GNRHR2), 히스타민 수용체 (가령, HRH1, HRH2, HRH3, 그리고 HRH4), KiSS1-유래된 펩티드 수용체 (가령, KISS1R), 류코트리엔 수용체 (가령, LTB4R2, FPRL1, OXER1, LTB4R, CYSLTR1, 그리고 CYSLTR2), 리소인지질 수용체 (가령, LPAR1, LPAR2, LPAR3, S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4, 그리고 S1PR5), 멜라닌-농축 호르몬 수용체 (가령, MCHR1 및 MCHR2), 멜라노코르틴 수용체 (가령, MC1R, MC2R, MC3R, MC4R, 그리고 MC5R), 멜라토닌 수용체 (가령, MTNR1A 및 MTNR1B), 모틸린 수용체 (가령, MLNR), 뉴로메딘 U 수용체 (가령, NMUR1 및 NMUR2), 신경펩티드 FF/신경펩티드 AF 수용체 (가령, NPFFR1 및 NPFFR2), 신경펩티드 S 수용체 (가령, NPSR1), 신경펩티드 W/신경펩티드 B 수용체 (가령, NPBWR1 및 NPBWR2), 신경펩티드 Y 수용체 (가령, NPY1R, NPY2R, PPYR1, 그리고 NPY5R), 뉴로텐신 수용체 (가령, NTSR1 및 NTSR2), 니코틴산 수용체 집단 (가령, GPR109B, GPR109A, 그리고 GPR81), 비-신호전달 7TM 케모카인-결합 단백질 (가령, DARC, CCBP2, 그리고 CCRL1), 오피오이드 수용체 (가령, OPRM1, OPRD1, OPRK1, 그리고 OPRL1), 오렉신 수용체 (가령, HCRTR1 및 HCRTR2), P2Y 수용체 (가령, P2RY1, P2RY2, P2RY4, P2RY6, P2RY11, P2RY12, P2RY14, 그리고 P2RY13), 펩티드 P518 수용체 (가령, QRFPR), 혈소판-활성화 인자 수용체 (가령, PTAFR), 프로키네티신 수용체 (가령, PROKR1 및 PROKR2), 프롤락틴-방출 펩티드 수용체 (가령, PRLHR), 프로스타노이드 수용체 (가령, PTGDR, PTGER1, PTGER2, PTGER3, PTGER4, PTGFR, PTGIR, TBXA2R, 그리고 GPR44), 프로테아제-활성화된 수용체 (가령, 트롬빈 (F2R)), 프로테아제-활성화된 수용체 (가령, F2RL1, F2RL2, 그리고 F2RL3), 릴랙신 집단 펩티드 수용체 (가령, RXFP1, RXFP2, RXFP3, 그리고 RXFP4), 소마토스타틴 수용체 (가령, SSTR2, SSTR5, SSTR3, SSTR1, 그리고 SSTR4), 타키키닌 수용체 (가령, TACR1, TACR2, 그리고 TACR3), 갑상선 자극 호르몬-방출 호르몬 수용체 (가령, TRHR), 미량 아민 수용체 (가령, TAAR1), 유로텐신 수용체 (가령, UTS2R), 바소프레신과 옥시토신 수용체 (가령, AVPR1A, AVPR2, AVPR1B, 그리고 OXTR), 부류 A 고아 (가령, GPR82, GPR182, CCRL2, CMKLR1, CMKOR1, GPR183, GPR1, GPR3, GPR4, GPR6, GPR12, GPR15, GPR17, GPR18, GPR19, GPR20, GPR21, GPR22, GPR23, GPR25, GPR26, GPR27, GPR31, GPR32, GPR33, GPR34, GPR35, GPR37, GPR37L1, GPR39, GPR45, GPR50, GPR52, GPR55, GPR61, GPR62, GPR63, GPR65, GPR68, GPR75, GPR78, GPR79, GPR83, GPR84, GPR85, GPR87, GPR88, GPR92, GPR101, GPR119, GPR120, GPR132, GPR135, GPR139, GPR141, GPR142, GPR146, GPR148, GPR149, GPR150, GPR151, GPR152, GPR153, GPR160, GPR161, GPR171, GPR173, GPR174, GPR162, LGR4, LGR5, LGR6, MAS1, MAS1L, MRGPRD, MRGPRE, MRGPRF, MRGPRG, MRGPRX1, MRGPRX2, MRGPRX3, MRGPRX4, OPN3, OPN5, OXGR1, P2RY10, P2RY5, P2RY8, SUCNR1, TAAR2, TAAR3, TAAR5, TAAR6, TAAR8, TAAR9, 그리고 GPR42)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 부류 A GPCR;
칼슘-감지 수용체 (가령, CASR 및 GPRC6A), GABA-B 수용체 (가령, GABBR1 및 GABBR2), GPRC5 수용체 (가령, GPRC5A, GPRC5B, GPRC5C, 그리고 GPRC5D), 대사자극성 글루타메이트 수용체 (가령, GRM1, GRM2, GRM3, GRM4, GRM5, GRM6, GRM7, 그리고 GRM8), 부류 C 고아 (가령, GPR156, GPR158, GPR179, GPRC5A, GPRC5B, GPRC5C, 그리고 GPRC5D)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 부류 B GPCR;
칼시토닌 수용체 (가령, CALCR/CT, AMY1, AMY2, AMY3, CALCRL, CGRP, AM1, 그리고 AM2), 부신피질 자극 호르몬-방출 인자 수용체 (가령, CRHR1 및 CRHR2), 글루카곤 수용체 집단 (가령, GCGR, GLP1R, GLP2R, GIPR, SCTR, 그리고 GHRHR), 부갑상선 호르몬 수용체 (가령, PTH1R 및 PTHR2), VIP와 PACAP 수용체 (가령, ADCYAP1R1, VIPR1, 그리고 VIPR2), 부류 B 고아 (가령, BAI1, BAI2, BAI3, CD97, CELSR1, CELSR2, CELSR3, ELTD1, EMR1, EMR2, EMR3, EMR4, GPR56, GPR64, GPR97, GPR110, GPR111,GPR112, GPR113, GPR114, GPR115, GPR116, GPR123, GPR124, GPR125, GPR126, GPR128, GPR133, GPR143, GPR144, GPR157, LPHN1, LPHN2, LPHN3, 그리고 GPR98)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 부류 C GPCR;
진균류 교배 페로몬 수용체 (가령, STE2 및 STE3)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 부류 D GPCR;
cAMP 수용체 (가령, 딕티오스텔리움)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 부류 E GPCR; 곱슬곱슬한 (frizzled) 수용체 (가령, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, 그리고 SMO)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 부류 F GPCR; 그리고
분류되지 않은 GPCR (가령, OPCML, OGFR, OGFRL1, 그리고 OPRS1)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
전압-개폐 이온 채널의 실례에는
KCNMA1, KCNN1,KCNN2, KCNN3, KCNN4, KCNT1, KCNT2, 그리고 KCNU1이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 칼슘-활성화된 칼륨 채널;
CATSPER1, CATSPER2, CATSPER3, CATSPER4, TPCN1, 그리고 TPCN2가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 CatSper와 2-구멍 채널;
CNGA1, CNGA2, CNGA3, CNGA4, CNGB1, CNGB3, HCN1, HCN2, HCN3, 그리고 HCN4가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 환상 뉴클레오티드-조절된 채널;
KCNJ1, KCNJ2, KCNJ12, KCNJ4, KCNJ14, KCNJ3, KCNJ6, KCNJ9, KCNJ5, KCNJ10, KCNJ15, KCNJ16, KCNJ8, KCNJ11, 그리고 KCNJ13이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 내부 정류 칼륨 채널;
TRPA1, TRPC1, TRPC2, TRPC3, TRPC4, TRPC5, TRPC6, TRPC7, TRPM1, TRPM2, TRPM3, TRPM4, TRPM5, TRPM6, TRPM7, TRPM8, MCOLN1, MCOLN2, MCOLN3, PKD2, PKD2L1, PKD2L2, TRPV1, TRPV2, TRVP3, TRPV4, TRPV5, 그리고 TRPV6이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 일시적인 수용체 가능 채널;
KCNK1, KCNK2, KCNK3, KCNK4, KCNK5, KCNK6, KCNK7, KCNK9, KCNK10, KCNK12, KCNK13, KCNK15, KCNK16, KCNK17, 그리고 KCNK18이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 2-P 칼륨 채널;
CACNA1S, CACNA1C, CACNA1D, CACNA1F, CACNA1A, CACNA1B, CACNA1E, CACNA1G, CACNA1H, 그리고 CACNA1I가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 전압-개폐 칼슘 채널;
KCNA1, KCNA2, KCNA3, KCNA4, KCNA5, KCNA6, KCNA7, KCNA10, KCNB1, KCNB2, KCNC1, KCNC2, KCNC3, KCNC4, KCND1, KCND2, KCND3, KCNF1, KCNG1, KCNG2, KCNG3, KCNG4, KCNQ1, KCNQ2, KCNQ3, KCNQ4, KCNQ5, KCNV1, KCNV2, KCNS1, KCNS2, KCNS3, KCNH1, KCNH5, KCNH2, KCNH6, KCNH7, KCNH8, KCNH3, 그리고 KCNH4가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 전압-개폐 칼륨 채널;
SCN1A, SCN2A, SCN3A, SCN4A, SCN5A, SCN8A, SCN9A, SCN10A, 그리고 SCN11A가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 전압-개폐 나트륨 채널; 그리고
KCNE1, KCNE1L, KCNE2, KCNE3, KCNIP1, KCNIP2, KCNIP3, KCNIP4, KCNMB1, KCNMB2, KCNMB3, CNMB3L, 그리고 KCNMB4가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 기타 전압-개폐 이온 채널이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
리간드 개폐 이온 채널의 실례에는
5HT3Acapo, 5HT3Ahosa, 5HT3Amumu, 5HT3Amupu, 5HT3Aorcu, 5HT3Apatr, 5HT3Arano, 5HT3Bhosa, 5HT3Bmumu, 5HT3Borcu, 5HT3Bpatr, 5HT3Brano, 5HT3Chosa, 5HT3Cpatr, 5HT3Dhosa, 5HT3Dpatr, 5HT3Ehosa, 5HT3gaga, 그리고 5HTmod1cael이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 세로토닌 수용체 아단위;
5-HT1A; 5-HT1B; 5-HT1D; 5-HT1E; 5-HT1F; 5-HT2A; 5-HT2B; 5-HT2C; 5HT4 절단접합 동종형 a, b, c, d, e, f, g, n; 5-HT5A; 5-HT6; 5-HT7 절단접합 형태 a, b, c를 비롯한 5-HT 수용체;
ACHa10gaga, ACHa10hosa, ACHa10mumu, ACHa10patr, ACHa10rano, ACHa1anga, ACHa1apca, ACHa1ataru, ACHa1axela, ACHa1bota, ACHa1btaru, ACHa1bxela, ACHa1cafa, ACHa1dare, ACHa1gaga, ACHa1hevi, ACHa1hosa, ACHa1lomi, ACHa1mumu, ACHa1mype, ACHa1naha, ACHa1nana, ACHa1nate, ACHa1patr, ACHa1rano, ACHa1toca, ACHa1toma, ACHa2anga, ACHa2apca, ACHa2apgo, ACHa2dare, ACHa2gaga, ACHa2hevi, ACHa2hosa, ACHa2lomi, ACHa2mamu, ACHa2mumu, ACHa2mype, ACHa2patr, ACHa2rano, ACHa2taru, ACHa3anga, ACHa3apme, ACHa3bota, ACHa3caau, ACHa3drme, ACHa3gaga, ACHa3hevi, ACHa3hosa, ACHa3lomi, ACHa3mamu, ACHa3mumu, ACHa3mype, ACHa3patr, ACHa3rano, ACHa3taru, ACHa4anga, ACHa4drme, ACHa4gaga, ACHa4hosa, ACHa4mamu, ACHa4mumu, ACHa4mype, ACHa4patr, ACHa4rano, ACHa4taru, ACHa5anga, ACHa5drme, ACHa5gaga, ACHa5hosa, ACHa5mamu, ACHa5mumu, ACHa5mype, ACHa5patr, ACHa5rano, ACHa6ataru, ACHa6btaru, ACHa6drme, ACHa6gaga, ACHa6hosa, ACHa6mamu, ACHa6mumu, ACHa6patr, ACHa6rano, ACHa7_1hevi, ACHa7_2hevi, ACHa7anga, ACHa7ataru, ACHa7bota, ACHa7btaru, ACHa7ctaru, ACHa7dare, ACHa7drme, ACHa7gaga, ACHa7hosa, ACHa7mamu, ACHa7mumu, ACHa7patr, ACHa7rano, ACHa7rasp, ACHa8ataru, ACHa8btaru, ACHa8gaga, ACHa9ataru, ACHa9btaru, ACHa9ctaru, ACHa9dare, ACHa9dtaru, ACHa9gaga, ACHa9hosa, ACHa9mumu, ACHa9patr, ACHa9rano, ACHaassu, ACHacr10cael, ACHacr11cael, ACHacr12cael, ACHacr13cael, ACHacr14cael, ACHacr15cael, ACHacr16cael, ACHacr17cael, ACHacr18cael, ACHacr19cael, ACHacr20cael, ACHacr21cael, ACHacr22cael, ACHacr23cael, ACHacr2cael, ACHacr3cael, ACHacr4cael, ACHacr5cael, ACHacr6cael, ACHacr7cael, ACHacr8cael, ACHacr9cael, ACHahaco, ACHal1acdo, ACHal1scgr, ACHalsdrme, ACHalsmase, ACHalyst, ACHarddrme, ACHb1ataru, ACHb1bota, ACHb1btaru, ACHb1hevi, ACHb1hosa, ACHb1mase, ACHb1mumu, ACHb1patr, ACHb1rano, ACHb1toca, ACHb1xela, ACHb2caau, ACHb2gaga, ACHb2hosa, ACHb2mamu, ACHb2mumu, ACHb2patr, ACHb2rano, ACHb3acaau, ACHb3adare, ACHb3bcaau, ACHb3gaga, ACHb3hosa, ACHb3mamu, ACHb3mumu, ACHb3patr, ACHb3rano, ACHb4bota, ACHb4gaga, ACHb4hosa, ACHb4mamu, ACHb4mumu, ACHb4patr, ACHb4rano, ACHb4taru, ACHb5taru, ACHb6taru, ACHb7taru, ACHblomi, ACHblyst, ACHc04c3_2cael, ACHc15a7_1cael, ACHcg7589drme, ACHclyst, ACHcup4cael, ACHdbota, ACHddare, ACHdeg3cael, ACHdgaga, ACHdhosa, ACHdlyst, ACHdmumu, ACHdpatr, ACHdrara, ACHdtaru, ACHdtoca, ACHdxela, ACHeat2cael, ACHebota, ACHehosa, ACHelyst, ACHemumu, ACHepatr, ACHerara, ACHetaru, ACHexela, ACHf11c7_1cael, ACHf17e9_7cael, ACHf17e9_8cael, ACHf18g5_4cael, ACHf21a3_7cael, ACHf58h7_3cael, ACHflyst, ACHgbota, ACHggaga, ACHghosa, ACHglyst, ACHgmumu, ACHgpatr, ACHgrara, ACHgtaru, ACHgtoca, ACHgxela, ACHhlyst, ACHilyst, ACHjlyst, ACHklyst, ACHlev1cael, ACHllyst, ACHnaapca, ACHr03e1_3cael, ACHr13a5_4cael, ACHronvo, ACHsaddrme, ACHsbddrme, ACHssu1osci, ACHssu2osci, ACHt01h10_1cael, ACHt01h10_2cael, ACHt01h10_3cael, ACHt01h10_5cael, ACHt01h10_6cael, ACHt01h10_7cael, ACHt05b4_1cael, ACHtar1trco, ACHunc29cael, ACHunc38cael, ACHunc63cael, ACHy44a6e_1cael, ACHy57g11c_2cael, ACHy57g11c_49cael, ACHy58g8a_1cael, ACHy73b6bl_26cael, 그리고 ACHy73f8a_30cael이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 아세틸콜린 수용체 아단위;
GABa1bota, GABa1gaga, GABa1hosa, GABa1mumu, GABa1rara, GABa2bota, GABa2hosa, GABa2mumu, GABa2rara, GABa3bota, GABa3hevi, GABa3hosa, GABa3mumu, GABa3rara, GABa4bota, GABa4hosa, GABa4mumu, GABa4rara, GABa5hosa, GABa5rara, GABa6caau, GABa6hosa, GABa6mumu, GABa6rara, GABb1bota, GABb1hosa, GABb1mumu, GABb1rasp, GABb2dare, GABb2hosa, GABb2mumu, GABb2rasp, GABb3gaga, GABb3hosa, GABb3mumu, GABb3rasp, GABb4gaga, GABbdrme, GABblyst, GABbseof, GABc09g5_1cael, GABc27h5_4cael, GABc39b10_2cael, GABc53d6_3cael, GABdhosa, GABdmumu, GABdrara, GABehosa, GABemumu, GABerano, GABf09c12_1cael, GABf11h8_2cael, GABf47a4_1cael, GABf55d10_5cael, GABf58g6_4cael, GABg1gaga, GABg1hosa, GABg1mumu, GABg1rano, GABg2bota, GABg2gaga, GABg2hosa, GABg2mumu, GABg2rara, GABg3hosa, GABg3mumu, GABg3rano, GABg4gaga, GABg4hosa, GABg4mumu, GABgbr2cael, GABgrddrme, GABhg1haco, GABk10d6_1cael, GABphosa, GABpmumu, GABr1amoam, GABr1bmoam, GABr1hosa, GABr1mumu, GABr1rano, GABr2amoam, GABr2bmoam, GABr2hosa, GABr2mumu, GABr2rara, GABr3hosa, GABr3moam, GABr3mumu, GABr3rano, GABrdlaeae, GABrdlceca, GABrdldrme, GABt20b12_9cael, GABt21f2_1cael, GABt24d8_1cael, GABthosa, GABtmumu, GABtrano, GABunc49bcael, GABunc49cael, 그리고 GABzlyst가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 GABAA 수용체 아단위;
GLYa1dare, GLYa1hosa, GLYa1mumu, GLYa1rano, GLYa2dare, GLYa2hosa, GLYa2mumu, GLYa2rano, GLYa3dare, GLYa3hosa, GLYa3moam, GLYa3mumu, GLYa3rano, GLYa4adare, GLYa4bdare, GLYa4hosa, GLYa4mumu, GLYbdare, GLYbhosa, GLYbmumu, GLYbrano, 그리고 HIScl1drme가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 글리신/히스타민 수용체 아단위;
ATPp2x1hosa, ATPp2x1rano, ATPp2x2capo, ATPp2x2hosa, ATPp2x2mumu, ATPp2x2rano, ATPp2x3hosa, ATPp2x3mumu, ATPp2x3rano, ATPp2x4bota, ATPp2x4gaga, ATPp2x4hosa, ATPp2x4mumu, ATPp2x4orcu, ATPp2x4rano, ATPp2x5bota, ATPp2x5hosa, ATPp2x5mumu, ATPp2x5rano, ATPp2x6hosa, ATPp2x6mumu, ATPp2x6rano, ATPp2x7bota, ATPp2x7hosa, ATPp2x7mumu, ATPp2x7rano, 그리고 ATPp2xscma가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 ATP 수용체 아단위;
GLU1_1arth, GLU1_2arth, GLU1_3arth, GLU1_4arth, GLU2_1arth, GLU2_2arth, GLU2_3arth, GLU2_4arth, GLU2_5arth, GLU2_6arth, GLU2_7arth, GLU2_8arth, GLU2_9arth, GLU3_1arth, GLU3_2arth, GLU3_3arth, GLU3_4arth, GLU3_5arth, GLU3_6arth, GLU3_7arth, GLUd1hosa, GLUd1mumu, GLUd1rano, GLUd2hosa, GLUd2mumu, GLUd2rano, GLUglr10cael, GLUglr1cael, GLUglr2cael, GLUglr4cael, GLUglr5cael, GLUglr6cael, GLUglr7cael, GLUglr8cael, GLUglr9cael, GLUk10d3_1cael, GLUka1hosa, GLUka1mumu, GLUka1rano, GLUka2hosa, GLUka2mumu, GLUka2rano, GLUka4mumu, GLUkbpacaau, GLUkbpansp, GLUkbpbcaau, GLUkbpgaga, GLUkbprapi, GLUkbpxela, GLUnr1anpl, GLUnr1aple, GLUnr1caau, GLUnr1drme, GLUnr1hosa, GLUnr1mumu, GLUnr1rano, GLUnr1susc, GLUnr1xela, GLUnr2ahosa, GLUnr2amumu, GLUnr2arano, GLUnr2bhosa, GLUnr2bmumu, GLUnr2brano, GLUnr2chosa, GLUnr2cmumu, GLUnr2crano, GLUnr2dhosa, GLUnr2dmumu, GLUnr2drano, GLUnr3ahosa, GLUnr3amumu, GLUnr3arano, GLUnr3bhosa, GLUnr3bmumu, GLUnr3brano, GLUr0, GLUr1gaga, GLUr1hosa, GLUr1moch, GLUr1mumu, GLUr1rano, GLUr2acorni, GLUr2borni, GLUr2coli, GLUr2gaga, GLUr2hosa, GLUr2mumu, GLUr2rano, GLUr3aormo, GLUr3caau, GLUr3coli, GLUr3gaga, GLUr3hosa, GLUr3mumu, GLUr3rano, GLUr4caau, GLUr4coli, GLUr4gaga, GLUr4hosa, GLUr4mumu, GLUr4rano, GLUr5daae, GLUr5hosa, GLUr5mumu, GLUr5rano, GLUr6hosa, GLUr6mumu, GLUr6rano, GLUr6xela, GLUr7hosa, GLUr7mumu, GLUr7rano, GLUrIdrme, GLUrIIAdrme, GLUrIIBdrme, GLUrIIlyst, GLUrIlyst, GLUrk1lyst, GLUcl3cael, GLUclacael, GLUclbcael, GLUclbhaco, GLUcldrme, GLUclhaco, GLUclxcael, 그리고 GLUclxonvo가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 글루타메이트 수용체 아단위가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
기타 채널 단백질의 실례에는
SCNN1A, SCNN1B, SCNN1G, SCNN1D, ACCN2, ACCN1, ACCN3, ACCN4, 그리고 ACCN5가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 ENaC/DEG 집단 단백질;
AQP1, AQP2, AQP3, AQP4, AQP5, AQP6, AQP7, AQP7P1, AQP7P2, AQP7P3, AQP7P4, AQP8, AQP9, AQP10, AQP11, AQP12A, 그리고 AQP12B가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 아쿠아포린; 그리고
CLCA1, CLCA2, CLCA3P, CLCA4, CLCC1, CLCF1, CLCN1, CLCN2, CLCN3, CLCN4, CLCN5, CLCN6, CLCN7, CLCNKA, 그리고 CLCNKB가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 염화물 채널이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
막 담체/수송체 단백질의 실례에는
ABCA1, ABCA2, ABCA3, ABCA4, ABCA5, ABCA6, ABCA7, ABCA8, ABCA9, ABCA10, ABCA11P, ABCA12, ABCA13, ABCA17P, ABCB1, ABCB4, ABCB5, ABCB6, ABCB7, ABCB8, ABCB9, ABCB10, ABCB10P1, ABCB11, ABCC1, ABCC2, ABCC3, ABCC4, ABCC5, ABCC6, ABCC6P1, ABCC6P2, ABCC8, ABCC9, ABCC10, ABCC11, ABCC12, ABCC13, ABCD1, ABCD1P1, ABCD1P2, ABCD1P3, ABCD1P4, ABCD2, ABCD3, ABCD4, ABCE1, ABCF1, ABCF2, ABCF3, ABCG1, ABCG2, ABCG4, ABCG5, ABCG8, TAP1, TAP2, CFTR TAPBP, 그리고 TAPBPL이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 ABCC 집단의 단백질;
SLC1A1, SLC1A2, SLC1A3, SLC1A4, SLC1A5, SLC1A6, SLC1A7, SLC2A1, SLC2A2, SLC2A3, SLC2A3P1, SLC2A3P2, SLC2A3P4, SLC2A4, SLC2A4RG, SLC2A5, SLC2A6, SLC2A7, SLC2A8, SLC2A9, SLC2A10, SLC2A11, SLC2A12, SLC2A13, SLC2A14, SLC2AXP1, SLC3A1, SLC3A2, SLC4A1, SLC4A1AP, SLC4A2, SLC4A3, SLC4A4, SLC4A5, SLC4A7, SLC4A8, SLC4A9, SLC4A10, SLC4A11, SLC5A1, SLC5A2, SLC5A3, SLC5A4, SLC5A5, SLC5A6, SLC5A7, SLC5A8, SLC5A9, SLC5A10, SLC5A11, SLC5A12, SLC6A1, SLC6A2, SLC6A3, SLC6A4, SLC6A5, SLC6A6, SLC6A6P, SLC6A7, SLC6A8, SLC6A9, SLC6A10P, SLC6A11, SLC6A12, SLC6A13, SLC6A14, SLC6A15, SLC6A16, SLC6A17, SLC6A18, SLC6A19, SLC6A20, SLC6A21P, SLC7A1, SLC7A2, SLC7A3, SLC7A4, SLC7A5, SLC7A5P1, SLC7A6, SLC7A6OS, SLC7A7, SLC7A8, SLC7A9, SLC7A10, SLC7A11, SLC7A13, SLC7A14, SLC8A1, SLC8A2, SLC8A3, SLC9A1, SLC9A2, SLC9A3, SLC9A3P, SLC9A3P2, SLC9A3P3, SLC9A3P4, SLC9A3R1, SLC9A3R2, SLC9A4, SLC9A5, SLC9A6, SLC9A7, SLC9A8, SLC9A9, SLC9A10, SLC9A11, SLC10A1, SLC10A2, SLC10A3, SLC10A4, SLC10A5, SLC10A6, SLC10A7, SLC11A1, SLC11A2, SLC12A1, SLC12A2, SLC12A3, SLC12A4, SLC12A5, SLC12A6, SLC12A7, SLC12A8, SLC12A9, SLC13A1, SLC13A2, SLC13A3, SLC13A4, SLC13A5, SLC14A1, SLC14A2, SLC15A1, SLC15A2, SLC15A3, SLC15A4, SLC15A5, SLC16A1, SLC16A2, SLC16A3, SLC16A4, SLC16A5, SLC16A6, SLC16A7, SLC16A8, SLC16A9, SLC16A10, SLC16A11, SLC16A12, SLC16A13, SLC16A14, SLC17A1, SLC17A2, SLC17A3, SLC17A4, SLC17A5, SLC17A6, SLC17A7, SLC17A8, SLC17A9, SLC18A1, SLC18A2, SLC18A3, SLC19A1, SLC19A2, SLC19A3, SLC20A1, SLC20A1P1, SLC20A2, SLC22A1, SLC22A2, SLC22A3, SLC22A4, SLC22A5, SLC22A6, SLC22A7, SLC22A8, SLC22A9, SLC22A10, SLC22A11, SLC22A12,SLC22A13, SLC22A14, SLC22A15, SLC22A16, SLC22A17, SLC22A18, SLC22A18AS, SLC22A20, SLC22A23, SLC22A24, SLC22A25, SLC23A1, SLC23A2, SLC23A3, SLC23A4, SLC24A1, SLC24A2, SLC24A3, SLC24A4, SLC24A5, SLC24A6, SLC25A1, SLC25A2, SLC25A3, SLC25A4, SLC25A5, SLC25A5P1, SLC25A5P2, SLC25A5P3, SLC25A5P4, SLC25A5P5, SLC25A5P6, SLC25A5P7, SLC25A5P8, SLC25A5P9, SLC25A6, SLC25A6P1, SLC25A10, SLC25A11, SLC25A12, SLC25A13, SLC25A14, SLC25A15, SLC25A15P, SLC25A16, SLC25A17, SLC25A18, SLC25A19, SLC25A20, SLC25A20P, SLC25A21, SLC25A22, SLC25A23, SLC25A24, SLC25A25, SLC25A26, SLC25A27, SLC25A28, SLC25A29, SLC25A30, SLC25A31, SLC25A32, SLC25A33, SLC25A34, SLC25A35, SLC25A36, SLC25A37, SLC25A38, SLC25A39, SLC25A40, SLC25A41, SLC25A42, SLC25A43, SLC25A44, SLC25A45, SLC25A46, SLC26A1, SLC26A2, SLC26A3, SLC26A4, SLC26A5, SLC26A6, SLC26A7, SLC26A8, SLC26A9, SLC26A10, SLC26A11, SLC27A1, SLC27A2, SLC27A3, SLC27A4, SLC27A5, SLC27A6, SLC28A1, SLC28A2, SLC28A3, SLC29A1, SLC29A2, SLC29A3, SLC29A4, SLC30A1, SLC30A2, SLC30A3, SLC30A4, SLC30A5, SLC30A6, SLC30A7, SLC30A8, SLC30A9, SLC30A10, SLC31A1, SLC31A1P, SLC31A2, SLC32A1, SLC33A1, SLC34A1, SLC34A2, SLC34A3, SLC35A1, SLC35A2, SLC35A3, SLC35A4, SLC35A5, SLC35B1, SLC35B2, SLC35B3, SLC35B4, SLC35C1, SLC35C2, SLC35D1, SLC35D2, SLC35D3, SLC35E1, SLC35E2, SLC35E3, SLC35E4, SLC35F1, SLC35F2, SLC35F3, SLC35F4, SLC35F5, SLC36A1, SLC36A2, SLC36A3, SLC36A4, SLC37A1, SLC37A2, SLC37A3, SLC37A4, SLC38A1, SLC38A2, SLC38A3, SLC38A4, SLC38A5, SLC38A6, SLC38A7, SLC38A8, SLC38A9, SLC38A10, SLC38A11, SLC39A1, SLC39A2, SLC39A3, SLC39A4, SLC39A5, SLC39A6, SLC39A7, SLC39A8, SLC39A9, SLC39A10, SLC39A11, SLC39A12, SLC39A13, SLC39A14, SLC40A1, SLC41A1, SLC41A2, SLC41A3,SLC43A1, SLC43A2, SLC43A3, LC44A1, SLC44A2, SLC44A3, SLC44A4, SLC44A5, SLC45A1, SLC45A2, SLC45A3, SLC45A4, SLC46A1, SLC46A2, SLC46A3, SLC47A1, SLC47A2, SLC48A1, SLCO1A2, SLCO1B1, SLCO1B3, SLCO1C1, SLCO2A1, SLCO2B1, SLCO3A1, SLCO4A1,SLCO4C1,SLCO5A1, 그리고 SLCO6A1이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 가용성 담체 집단의 단백질;
ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B1, ATP1B2, ATP1B3, ATP1B3P1, ATP1B4, ATP1L1, ATP2A1, ATP2A2, ATP2A3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4, ATP2C1, ATP2C2, ATP3, ATP4A, ATP4B, ATP5A1, ATP5AL1, ATP5AP1, ATP5AP2, ATP5AP3, ATP5AP4, ATP5B, ATP5BL1, ATP5BL2, ATP5C1, ATP5C2, ATP5D, ATP5E, ATP5EP1, ATP5EP2, ATP5F1, ATP5G1, ATP5G2, ATP5G3, ATP5GP1, ATP5GP2, ATP5GP3, ATP5GP4, ATP5H, ATP5HP1, ATP5I, ATP5J, ATP5J2, ATP5J2LP, ATP5J2P2, ATP5J2P3, ATP5J2P4, ATP5J2P5, ATP5J2P6, ATP5L, ATP5LP1, ATP5LP2, ATP5LP3, ATP5O, ATP5S, ATP5SL, ATP6AP1, ATP6AP1L, ATP6AP2, ATP6V1A, ATP6V1B1, ATP6V1B2, ATP6V1C1, ATP6V1C2, ATP6V1D, ATP6V1E1, ATP6V1E2, ATP6V1EL1, ATP6V1EP1, ATP6V1EP2, ATP6V1F, ATP6V1G1, ATP6V1G2, ATP6V1G3, ATP6V1GP1, ATP6V1GP2, ATP6V1H, ATP6V0A1, ATP6V0A2, ATP6V0A4, ATP6V0B, ATP6V0C, ATP6V0D1,ATP6V0D2, ATP6V0E1,ATP6V0E2, ATP7A, ATP7B, 그리고 ATP8A1이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 ATP 수송체;
FABP1, FABP2, FABP3, FABP3P2, FABP4, FABP5, FABP5L1, FABP5L2, FABP5L3, FABP5L4, FABP5L5, FABP5L6, FABP5L7, FABP5L8, FABP5L9, FABP5L10, FABP5L11, FABP5L12, FABP6, FABP7, FABP9, 그리고 FABP12가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 지방산 결합 단백질;
IGF1, IGF1R, IGF2, IGF2AS, IGF2BP1, IGF2BP2, IGF2BP3, IGF2R, IGFALS, IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP4, IGFBP5, IGFBP6, IGFBP7, IGFBPL1, IGFL1, IGFL1P1, IGFL1P2, IGFL2, IGFL3, IGFL4, 그리고 IGFN1이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 인슐린-유사 성장 인자;
TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TGFBRAP1, TGFBRE, LEFTY1, LEFTY2, BMPR1A, BMPR1APS1, BMPR1APS2, BMPR1B, BMPR2, ACVR1, ACVR1B, ACVR1C, ACVR2A, ACVR2B, 그리고 ACVRL1이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 전환 성장 인자;
NR1D1, NR1D2, NR1H2, NR1H3, NR1H4, NR1H5P, NR1I1,NR1I2, NR1I3, NR1I4, NR2A1, NR2A2, NR2B1, NR2B2, NR2B3, NR2C1, NR2C2, NR2C2AP, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR2F6, NR3C1, NR3C1P, NR3C2, NR3C3, NR3C4, NR4A1, NR4A2, NR4A3, NR5A1, NR5A2, NR6A1, NRAP, NRARP, NR0B1, NR0B2, NRBF2, NRBP1, NRBP2, NRCAM, NRIP1, NRIP2, 그리고 NRIP3이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 핵 수용체;
RARA, RARB, RARG, RARRES1, RARRES2, 그리고 RARRES3이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 레티노인산 수용체;
ROR1, ROR2, RORA, RORB, 그리고 RORC가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 수용체 티로신 키나아제 고아 및 RAR 관련된 단백질;
PPARA, PPARD, PPARG, PPARGC1A, 그리고 PPARGC1B가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 과산화소체 증식 활성화 수용체;
THRA, THRAP3, THRAP3L, THRB, 그리고 THRSP가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 갑상선 호르몬 수용체;
ESR1, ESR2, ESRP1, ESRP2, ESRRA, ESRRAP1, ESRRAP2, ESRRB, 그리고 ESRRG가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 에스트로겐 수용체, 상피 절단접합 조절 단백질, 그리고 에스트로겐 관련된 수용체;
ERBB2, ERBB2IP, ERBB3, ERBB4, 그리고 EGFR이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 적백혈병 바이러스 종양유전자;
PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD, PDGFRA, PDGFRB, 그리고 PDGFRL이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 혈소판 유래된 성장 인자;
FGFR1, FGFR1OP, FGFR1OP2, FGFR2, FGFR3, FGFR3P, FGFR4, FGFR6, 그리고 FGFRL1이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 섬유아세포 유래된 성장 인자;
LTBP1, LTBP2, LTBP3, 그리고 LTBP4가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 잠재 전환 성장 인자 β 결합 단백질;
RBP1, RBP2, RBP3, RBP4, RBP5, RBP7, RBPJ, RBPJL, RBPJP1, RBPJP2, RBPJP3, RBPJP4, RBPMS, RBPMS2, 그리고 RBPMSLP가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 비타민 담체 단백질;
STAR, STARD3, STARD3NL, STARD4, STARD5, STARD6, STARD7, STARD8, STARD9, STARD10,STARD13, 그리고 STARP1이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 스테로이드생성 급성 조절 단백질;
SCP2 및 SCPEP1이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 스테롤 담체 단백질;
GLTP, GLTPD1, GLTPD2, 그리고 GLTPP1이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 당지질 이동 단백질; 그리고
다른 수송 단백질, 예를 들면, CETP가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
목적되는 단백질의 다른 실례에는
TRBC1, TRBC2, TRBD1, TRBD2, TRBJ1-1, TRBJ1-2, TRBJ1-3, TRBJ1-4, TRBJ1-5, TRBJ1-6, TRBJ2-1, TRBJ2-2, TRBJ2-2P, TRBJ2-3, TRBJ2-4, TRBJ2-5, TRBJ2-6, TRBJ2-7, TRBV1, TRBV2, TRBV3-1, TRBV3-2, TRBV4-1, TRBV4-2, TRBV4-3, TRBV5-1, TRBV5-2, TRBV5-3, TRBV5-4, TRBV5-5, TRBV5-6, TRBV5-7, TRBV5-8, TRBV6-1, TRBV6-2, TRBV6-3, TRBV6-4, TRBV6-5, TRBV6-6, TRBV6-7, TRBV6-8, TRBV6-9, TRBV7-1, TRBV7-2, TRBV7-3, TRBV7-4, TRBV7-5, TRBV7-6, TRBV7-7, TRBV7-8, TRBV7-9, TRBV8-1, TRBV8-2, TRBV9, TRBV10-1, TRBV10-2, TRBV10-3, TRBV11-1, TRBV11-2, TRBV11-3, TRBV12-1, TRBV12-2, TRBV12-3, TRBV12-4, TRBV12-5, TRBV13, TRBV14, TRBV15, TRBV16, TRBV17, TRBV18, TRBV19, TRBV20-1, TRBV20OR9-2, TRBV21-1, TRBV21OR9-2, TRBV22-1, TRBV22OR9-2, TRBV23-1, TRBV23OR9-2, TRBV24-1, TRBV24OR9-2, TRBV25-1, TRBV25OR9-2, TRBV26, TRBV26OR9-2, TRBV27, TRBV28, TRBV29-1, TRBV29OR9-2, TRBV30, TRBVA, TRBVAOR9-2, TRBVB, 그리고 TRBVOR9가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 T 세포 수용체 β 불변 1;
ADAM1, ADAM2, ADAM3A, ADAM3B, ADAM5P, ADAM6, ADAM7, ADAM8, ADAM9, ADAM10, ADAM11, ADAM12, ADAM15, ADAM17, ADAM18, ADAM19, ADAM20, ADAM21, ADAM21P, ADAM22, ADAM23, ADAM28, ADAM29, ADAM30, ADAM32, ADAM33, ADAMDEC1, ADAMTS1, ADAMTS2, ADAMTS3, ADAMTS4, ADAMTS5, ADAMTS6, ADAMTS7, ADAMTS8, ADAMTS9, ADAMTS10, ADAMTS12, ADAMTS13, ADAMTS14, ADAMTS15, ADAMTS16, ADAMTS17, ADAMTS18, ADAMTS19, ADAMTS20, ADAMTSL1, ADAMTSL2, ADAMTSL3, ADAMTSL4, 그리고 ADAMTSL5가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 디스인테그린;
ITGA1, ITGA2,ITGA2B, ITGA3, ITGA4, ITGA5, ITGA6, ITGA7, ITGA8, ITGA9, ITGA10, ITGA11, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAV, ITGAW, ITGAX, ITGB1, ITGB1BP1, ITGB1BP2, ITGB1BP3, ITGB2, ITGB3, ITGB3BP, ITGB4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, ITGB8, 그리고 ITGBL1이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 인테그린;
NCAM1, NCAM2, VCAM1, ICAM1, ICAM2, ICAM3, ICAM4, ICAM5, PECAM1, L1CAM, CHL1, MAG, CADM1, CADM2, CADM3, 그리고 CADM4가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 세포 부착 분자;
OR10A1, OR10A3, OR10A4, OR10A5, OR10A6, OR10A7, OR10C1, OR10C2, OR10D4, OR10G2, OR10G3, OR10G4, OR10G7, OR10G8, OR10G9, OR10H1, OR10H2, OR10H3, OR10H4, OR10H5, OR10J1, OR10J3, OR10J5, OR10J6, OR10K1, OR10K2, OR10Q1, OR10R2, OR10S1, OR10T2, OR10V1, OR10Z1, OR11A1, OR11G2, OR11H1, OR11H4, OR11H6, OR11H7P, OR11L1, OR12D3, OR13A1, OR13C2, OR13C3, OR13C4, OR13C5, OR13C7, OR13C8, OR13C9, OR13D1, OR13E2, OR13F1, OR13G1, OR13H1, OR13J1, OR14A16, OR14A2, OR14C36, OR14J1, OR1A1, OR1A2, OR1A2, OR1B1, OR1C1, OR1D2, OR1D4, OR1D5, OR1E1, OR1E2, OR1E2, OR1E5, OR1E5, OR1E6, OR1E7, OR1F1, OR1F10, OR1F11, OR1F12, OR1F2, OR1G1, OR1I1, OR1J1, OR1J2, OR1J2, OR1J4, OR1J5, OR1K1, OR1L1, OR1L3, OR1L4, OR1L6, OR1L8, OR1M1, OR1M1, OR1N1, OR1N2, OR1N3, OR1Q1, OR1S1, OR1S2, OR2A1, OR2A10, OR2A19, OR2A20, OR2A21, OR2A4, OR2A42, OR2A5, OR2A6, OR2A7, OR2AE1, OR2AJ1, OR2AK2, OR2B1, OR2B2, OR2B3, OR2B6, OR2B9, OR2C1, OR2D1, OR2D2, OR2D3, OR2F1, OR2F2, OR2F3, OR2G2, OR2G3, OR2H1, OR2H2, OR2H3, OR2J2, OR2J3, OR2K1, OR2K2, OR2L1, OR2L2, OR2L3, OR2L5, OR2L8, OR2M1, OR2M2, OR2M4, OR2S2, OR2T1, OR2T3, OR2T4, OR2T5, OR2T6, OR2T7, OR2T8, OR2V1, OR2V2, OR2V3, OR2W1, OR2W3, OR2Y1, OR2Z1, OR3A1, OR3A2, OR3A3, OR3A4, OR4A15, OR4A16, OR4A4, OR4A5, OR4B1, OR4C12, OR4C13, OR4C15, OR4C16, OR4C3, OR4C6, OR4D1, OR4D2, OR4D5, OR4D6, OR4D9, OR4E2, OR4F10, OR4F15, OR4F16, OR4F16, OR4F17, OR4F18, OR4F19, OR4F3, OR4F6, OR4K1, OR4K13, OR4K14, OR4K15, OR4K17, OR4K2, OR4K3, OR4K5, OR4L1, OR4M1, OR4M2, OR4N2, OR4N4, OR4N5, OR4P4, OR4Q3, OR4S1, OR4X1, OR4X2, OR51A2, OR51A4, OR51A7, OR51B2, OR51B4, OR51D1, OR51E1, OR51E2, OR51F2, OR51G1, OR51G2, OR51H1, OR51I1, OR51I2, OR51L1, OR51M1, OR51Q1, OR51S1, OR51T1, OR52A1, OR52A2, OR52B2, OR52B4, OR52B4, OR52B4, OR52B6, OR52D1, OR52E2, OR52E4, OR52E5, OR52E6, OR52E8, OR52H1, OR52I1, OR52I2, OR52J3, OR52K1, OR52K2, OR52L1, OR52L2, OR52N1, OR52N2, OR52N4, OR52N5, OR52P1, OR52R1, OR56A4, OR56A6, OR56B2, OR56B4, OR5A1, OR5A2, OR5AC2, OR5AK2, OR5AK3, OR5AN1, OR5AP2, OR5AR1, OR5AS1, OR5AU1, OR5AU1, OR5B13, OR5B16, OR5B17, OR5B2, OR5B3, OR5C1, OR5D13, OR5D14, OR5D16, OR5D18, OR5F1, OR5G3, OR5H1, OR5H2, OR5H6, OR5I1, OR5K1, OR5K2, OR5L1, OR5L2, OR5M1, OR5M10, OR5M11, OR5M11, OR5M3, OR5M3, OR5M8, OR5M9, OR5P2, OR5P3, OR5T2, OR5T3, OR5V1, OR6A1, OR6B1, OR6B2, OR6C1, OR6C2, OR6C3, OR6F1, OR6J2, OR6K3, OR6K6, OR6M1, OR6N1, OR6N2, OR6P1, OR6Q1, OR6S1, OR6T1, OR6V1, OR6X1, OR6Y1, OR7A10, OR7A17, OR7A2, OR7A5, OR7C1, OR7C2, OR7D2, OR7D2, OR7D4P, OR7E102, OR7E120, OR7G1, OR7G2, OR7G3, OR8A1, OR8B12, OR8B2, OR8B3, OR8B4, OR8B8, OR8D1, OR8D2, OR8D4, OR8G1, OR8G2, OR8H1, OR8H2, OR8H3, OR8I2, OR8J1, OR8J3, OR8K1, OR8K3, OR8K5, OR9A2, OR9A4, OR9G1, OR9G4, OR9G5, OR9I1, OR9K2, 그리고 OR9Q1이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 인간 후각 수용체; 그리고
IOR100, IOR101, IOR102, IOR103, IOR104, IOR105, IOR106, IOR107, IOR108, IOR109, IOR110, IOR111, IOR112, IOR113, IOR114, IOR115, IOR116, IOR117, IOR118, IOR119, IOR120, IOR121, IOR122, IOR123, IOR124, IOR125, IOR126, IOR127, IOR49, IOR50, IOR51, IOR52, IOR53, IOR54, IOR55, IOR56, IOR57, IOR58, IOR59, IOR60, IOR61, IOR62, IOR63, IOR64, IOR65, IOR66, IOR67, IOR68, IOR69, IOR70, IOR71, IOR72, IOR73, IOR74, IOR75, IOR76, IOR77, IOR78, IOR79, IOR80, IOR81, IOR82, IOR83, IOR84, IOR85, IOR86, IOR87, IOR88, IOR89, IOR90, IOR91, IOR92, IOR93, IOR94, IOR95, IOR96, IOR97, IOR98, IOR99, ORL7077, ORL7078, ORL7079, ORL7080, ORL7081, ORL7082, ORL7083, ORL7084, ORL7085, ORL7086, ORL7087, ORL7088, ORL7089, ORL7090, ORL7091, ORL7092, ORL7093, ORL7094, ORL7095, ORL7096, ORL7097, ORL7098, ORL7099, ORL7100, ORL7101, ORL7102, ORL7103, ORL7104, ORL7105, ORL7106, ORL7107, ORL7108, ORL7109, ORL7110, ORL7111, ORL7112, ORL7113, ORL7114, ORL7115, ORL7116, ORL7117, ORL7118, ORL7119, ORL7120, ORL7121, ORL7122, ORL7123, ORL7124, ORL7125, TPR2307, TPR2308, TPR2309, TPR2310, TPR2312, TPR2314, TPR2315, TPR2316, TPR2317, TPR2318, TPR2319, TPR2320, TPR2321, TPR2321, TPR698, TPR699, TPR700, TPR701, TPR702, TPR703, TPR704, TPR705, TPR706, TPR707, TPR708, TPR709, TPR710, TPR711, TPR712, TPR713, TPR714, TPR715, TPR716, TPR717, TPR718, TPR719, TPR720, TPR721, TPR722, TPR723, TPR724, TPR725, TPR725, TPR726, TPR727, TPR728, TPR729, TPR730, TPR731, TPR732, TPR733, TPR734, TPR735, TPR736, TPR737, TPR738, TPR739, TPR740, TPR741, TPR742, TPR743, TPR744, TPR745, TPR746, TPR747, TPR748, TPR749, TPR750, TPR751, TPR752, TPR753, TPR754, TPR755, TPR756, TPR757, TPR758, TPR759, TPR760, TPR761, TPR762, TPR763, TPR764, TPR765, TPR766, TPR767, TPR768, TPR769, TPR770, TPR771, 그리고 TPR772가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 모기 (아노펠레스 감비아) 후각 수용체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
목적되는 단백질의 다른 실례는 하기 표 7-22에서 찾아볼 수 있다. 특정한 구체예에서, 표 7-22에 제시된 단백질의 절단접합된 형태 및/또는 SNP가 발현될 수 있다. 특정한 구체예에서, 표 7-22에 제시된 단백질의 임의의 조합이 세포 내에서 공동-발현될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 세포와 세포주는 세포-기초된 분석에서 이용하기 적합하다. 이런 세포와 세포주는 시간의 흐름 동안 목적되는 단백질의 일관되고 재현가능한 발현을 제공하고, 따라서 이런 분석에서 특히 유익하다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 생물학적 분자의 생산에 적합한 세포와 세포주를 제시한다. 이런 용도를 위한 세포와 세포주는 예로써, 기능성이거나 기능성화될 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드의 일관된 발현으로 특징된다. 본 발명에서는 목적되는 RNA 또는 단백질을 안정적으로 발현하는 세포와 세포주를 생산하는 방법을 더욱 제시한다. 본 발명의 방법을 이용하여, 복합 단백질, 예를 들면, 다합체성 단백질 (가령, 이종다합체성 단백질) 및 세포독성인 단백질을 비롯하여, 임의의 원하는 단백질을 기능적 형태로 발현하는 세포와 세포주를 생산할 수 있다. 본 명세서에서 기술된 방법은 본 발명 이전에 생산되지 못했던 기능적 단백질을 안정적으로 발현하는 조작된 세포와 세포주의 생산을 가능하게 한다. 이론에 한정됨 없이, 이러한 방법은 원하는 일단의 조건 하에 매우 많은 숫자의 세포 또는 세포주의 조사를 가능하게 하기 때문에, 더욱 작은 개체군에서 생산되지 못하거나, 또는 달리 관찰될 수 없었고, 그리고 원하는 조건 하에 원하는 단백질을 기능적 형태로 발현하는데 최적으로 적합한 희귀한 세포의 확인을 가능하게 하는 것으로 생각된다. 이론에 한정됨 없이, 다수의 목적되는 RNA와 단백질은 특수화된 세포 (가령, 특정 조직의 세포, 특수화된 조직의 세포, 특수화된 기능의 세포, 특수화된 세포 도메인 또는 구획을 보유하는 세포, 감각 세포, 뉴런, 미뢰, 상피 세포, 줄기 세포, 암 세포, 근육 세포, 눈의 세포, 항체를 생산하는 세포, 높은 수준의 단백질을 생산하는 세포, 그리고 본 명세서에서 기술된 다양한 세포 유형)에서 정상적으로 발현된다. 이들 특수화된 세포는 목적되는 RNA 또는 단백질의 비-세포독성 또는 고유 기능적 또는 생리학적 발현을 위한 특정한 생물학적 또는 세포 상황, 배경 또는 유전적 구성 (genetic make-up)을 제공할 수 있다. 가령, 이들 특수화된 세포는 목적되는 RNA 또는 단백질의 충분한, 적절한 또는 최적의 발현, 화학량론, 생산, 접힘, 조립, 번역후 변형, 표적화, 막 통합, 분비, 기능, 약리학 또는 생리 기능을 위하여, 부속 인자 또는 샤프롱 또는 특수화된 세포 구획을 비롯한 인자를 제공할 수 있다. 정상적으로 발현되지 않는 목적되는 RNA 또는 단백질을 발현하도록 세포 또는 세포주의 조작은 이들 조건이 연관된 세포독성 없이 목적되는 RNA 또는 단백질의 최적 발현 또는 기능을 위하여 재현되지도 접근되지도 않는 세포 또는 세포주의 생산을 유발할 수 있다.
목적되는 RNA 또는 단백질을 발현하도록 조작될 수 있는 많은 세포 개체군은 개별 세포의 유전적으로 다양한 개체군으로 구성되고, 여기서 심지어 세포 간에 염색체의 숫자가 서로 다를 수 있다. 이들 개체군에 포함된 희귀한 세포 (이런 개체군의 평균 집단에 비하여)는 세포 개체군의 평균 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 목적되는 RNA 또는 단백질의 고유 또는 비-세포독성 발현, 기능, 약리학 또는 생리 기능을 위한 충분한, 바람직한, 평균 초과인, 향상된, 또는 최적인 생물학적 또는 세포 상황, 배경 또는 유전적 구성 (genetic make-up)을 제공할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 목적되는 RNA 또는 단백질의 발현과 양립하는 개별 세포가 세포 개체군 내에서 극히 희귀한 세포일지라도 신속하게 또는 개별적으로 검출되거나 분리될 수 있도록, 목적되는 RNA 또는 단백질을 포함하도록 조작된 세포 개체군의 수백만 개의 개별 세포의 분석을 가능하게 한다. 일부 구체예에서, 목적되는 RNA 또는 단백질을 발현하도록 조작된 세포 개체군의 평균 세포에서 세포독성 또는 세포 사멸을 정상적으로 유발하는 목적되는 RNA 또는 단백질의 생존가능, 비-세포독성, 기능적 또는 고유 발현과 양립하는 희귀한 세포가 검출되고 분리될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따라서, 목적되는 RNA 또는 단백질을 발현하도록 조작된 세포 개체군으로부터 검출되거나 분리되는 각각의 양성 세포는 목적되는 RNA 또는 단백질 각각의 상이한 절대적인 또는 상대적인 수준을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 각 양성 세포는 목적되는 RNA 또는 단백질의 발현 또는 기능을 위한 세포 배경으로서 상이한 세포 또는 유전자 상황 (가령, 상이한 숫자의 염색체 또는 염색체 단편, 유전자, 유전자 서열, 발현 프로필, 또는 mRNA 또는 siRNA를 비롯한 내생적으로 발현된 단백질 또는 RNA, 또는 이들 목적되는 RNA 또는 단백질에 대한 부속 인자)을 더욱 제공하거나 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에서는 배양동안 분리된 세포의 유지를 가능하게 하는 신규한 방법으로 결합된 목적되는 RNA 또는 단백질의 발현에 양성인 다수의 조작된 세포의 분리를 제공한다. 일부 구체예에서, 배양동안 분리된 세포의 유지는 유지되는 전체 세포에 실질적으로 동일한 조건을 이용하여 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 이는 차례로, 목적되는 발현된 RNA 또는 단백질의 원하는 또는 향상된 발현, 기능, 생리 기능 또는 약리학을 포함하는 기능적이고 안정적인 세포 또는 세포주를 확인하고 생산하기 위한, 배양 동안 시간의 흐름 동안, 분리된 세포의 기능적 검사를 비롯한 검사를 가능하게 한다. 일부 구체예에서, 목적되는 RNA 또는 단백질의 발현에 양성인 다수의 세포를 분리하고, 유지하고, 그리고 기능적으로 시험으로써, 이들 방법은 목적되는 RNA 또는 단백질을 발현하도록 조작된 세포 개체군의 평균 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 목적되는 RNA 또는 단백질의 경우에도 이들 목적되는 RNA 또는 단백질을 기능적으로, 생존가능하게, 그리고 안정적으로 발현하는 세포의 확인 또는 생산을 가능하게 한다.
실제로, 일정한 구체예에서, 이들 방법은 조작된 세포에서 발현될 때, 세포독성인 것으로 이전에 간주되었던 RNA 또는 단백질의 기능적이고 안정적인 발현을 유발하는 것으로 밝혀졌고, 또한 이들 방법은 요구되는 조건을 포함하고, 그리고 조작된 세포에서 이전에 모델링 (modeling)될 수 없었던 이런 단백질의 비-세포독성 발현과 기능과 양립하는 세포를 생산하는데 효과적으로 이용될 수 있는 것으로 증명되었다.
진전된 측면에서, 본 발명에서는 세포주의 정합된 패널, 다시 말하면, 한 가지 이상의 생리학적 특성을 위하여 정합되는 클론 세포주의 수집물을 제시한다. 본 발명의 방법이 동일한 조건 하에 다수의 세포주의 유지와 특성화를 가능하게 하기 때문에, 유사한 생리학적 특성을 갖는 다수의 세포주를 확인하는 것이 가능하다. 본 발명의 방법을 이용하면, 임의의 원하는 숫자의 세포주 또는 구성을 포함하는 정합된 패널을 만드는 것이 가능하다. 이런 정합된 패널은 세포 밀도를 비롯한 동일한 조건 하에 유지될 수 있고, 따라서 고처리량 스크리닝 및 세포주 간에 차이를 비교하고 확인하는 것이 요구되는 기타 용도에 유용하다. 성장 속도를 위하여 정합되는 세포주의 정합된 패널 역시 본 발명에 포함된다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 이전에 기능이 알려지지 않은 단백질을 발현하고 및/또는 이전에 어떤 리간드도 확인되지 않았던 세포 또는 세포주를 생산하는 방법을 제시한다. 이런 단백질은 공지된 자연 발생 단백질, 이전에 알려지지 않은 자연 발생 단백질, 공지된 자연 발생 단백질의 이전에 알려지지 않은 형태, 또는 이들 중에서 한 가지의 변형된 형태일 수 있다.
임의의 원하는 세포 유형이 본 발명의 세포에 이용될 수 있다. 이들 세포는 원핵 또는 진핵일 수 있다. 이들 세포는 그들의 고유 상태에서, 목적되는 단백질을 발현하거나, 또는 발현하지 못할 수 있다. 이용될 수 있는 진핵 세포에는 진균류 세포, 예를 들면, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 및 동물 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이용될 수 있는 동물 세포에는 포유동물 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일차 또는 영속화 세포는 진핵 생명체의 중배엽 (mesoderm), 외배엽 (ectoderm) 또는 내배엽 (endoderm) 층으로부터 유래될 수 있다. 이들 세포는 내피, 외피, 중간엽, 신경, 신장, 간, 조혈, 또는 면역 세포일 수 있다. 가령, 이들 세포는 장내 장샘 또는 융모 세포, 클라라 세포, 결장 세포, 장내 세포, 배상 세포, 창자크롬친화 세포, 장내분비 세포일 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 포유동물 세포에는 인간, 비-인간 영장류, 소, 말, 염소, 양, 돼지, 설치류 (쥐, 생쥐, 햄스터, 기니 피그 포함), 유대류, 토끼, 개와 고양이가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이들 세포는 분화된 세포, 또는 배아 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포일 수 있다.
본 발명의 세포는 조직 절편, 동물, 식물, 진균류, 원생생물, 시원세균과 진정세균, 포유동물, 새, 어류, 파충류, 양서류, 그리고 절지동물, 조류, 닭, 파충류, 양서류, 개구리, 도마뱀, 뱀, 어류, 벌레, 오징어, 바닷가재, 성게, 시 슬러그 (sea slug), 멍게, 파리, 오징어, 히드라, 절지동물, 딱정벌레, 닭, 칠성장어, 송사리, 제브라 핀치 (zebra finch), 복어, 그리고 제브라피쉬의 일차, 형질전환된, 종양에 의해 형질전환된, 바이러스에 의해 형질전환된, 영속화된, 조건부로 형질전환된, 외식된 세포일 수 있다.
부가적으로, 세포, 예를 들면, 혈액/면역 세포, 내분비선 (갑상선, 부갑상선, 부신), GI (입, 위, 장), 간, 췌장, 담낭, 호흡기 (폐, 호흡관, 인두), 연골, 뼈, 근육, 피부, 머리카락, 비뇨기 (신장, 방광), 생식기 (정자, 난자, 고환, 자궁, 난소, 음경, 질), 감각 (눈, 귀, 코, 입, 혀, 감각 뉴런), 혈액/면역 세포, 예를 들면, B 세포, T 세포 (세포독성 T 세포, 자연 킬러 T 세포, 조절 T 세포, T 보조 세포, γδ T 세포, 자연 킬러 세포; 과립구 (호염기성 과립구, 호산구성 과립구, 호중구성 과립구/과다분획 호중구성), 단핵구/대식세포, 적혈구 세포 (망상적혈구), 비만 세포, 혈소판/거대핵세포, 수상돌기 세포; 내분비 세포, 예를 들면, 갑상선 (갑상선 상피 세포, 소포곁세포), 부갑상선 (부갑상선 주세포, 호산성 세포), 부신 (크롬친화세포), 신경계 세포, 예를 들면, 아교 세포 (성상세포, 소교세포), 거대세포 신경분비 세포, 성상 세포, 핵 사슬 세포, 뵈트허 세포 (boettcher cell), 뇌하수체 (생식선자극세포, 코르티코트로프성세포, 갑상선자극세포, 성장자극세포, 프로락틴분비세포), 호흡기 계통 세포, 예를 들면, 허파꽈리세포 (I형 허파꽈리세포, II형 허파꽈리세포), 클라라 세포, 배상 세포; 순환기 계통 세포, 예를 들면, 심장근육세포 혈관주위세포; 소화기 계통 세포, 예를 들면, 위 (위 주세포, 벽세포), 배상 세포, 호산성과립세포, G 세포, D 세포, ECL 세포, I 세포, K 세포, 장내분비 세포, 창자크롬친화 세포, APUD 세포, 간 (간세포, 쿠퍼 세포), 췌장 (베타 세포, 알파 세포), 담낭; 연골/뼈/근육/피부 계통 세포, 예를 들면, 조골세포, 골세포, 파골세포, 치아 세포 (시멘트질모세포, 에나멜모세포), 연골 세포: 연골모세포, 연골세포, 피부/유모 세포: 모낭모세포, 켈틴 생성 세포, 멜라닌세포, 근육 세포: 근육세포, 지방세포, 섬유아세포, 비뇨기 계통 세포, 예를 들면, 발세포, 사구체곁세포, 사구체내 혈관사이세포/사구체밖 혈관사이세포, 신장 근위 요세관 솔 변연 세포 (proximal tubule brush border cell), 치밀 반점 세포 (macula densa cell); 생식기 계통 세포, 예를 들면, 정자, 버팀 세포, 라이디히 세포, 난세포, 난소 여포 세포; 감각 세포, 예를 들면, 코르티 기관 세포, 후각 상피세포, 온도 민감성 감각 뉴런, 메르켈 세포, 후각 수용체 뉴런, 통증 민감성 뉴런, 광수용체 세포, 미뢰 세포, 전정 기관 (vestibular apparatus)의 유모 세포, 경동맥 소체 세포가 본 발명의 세포 또는 세포주를 만드는데 유용하다.
유용한 식물 세포에는 뿌리, 줄기와 잎이 포함되고, 그리고 식물 조직에는 분열조직 (meristematic tissue), 연조직 (parenchyma), 후각조직 (collenchyma), 후막조직 (sclerenchyma), 분비 조직, 목질부 (xylem), 체관부 (phloem), 외피 (표피), 주피 (periderm) (나무껍질)가 포함된다.
본 발명의 세포와 세포주에 유용한 세포에는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 확립된 뉴런 세포주, 크롬친화세포종, 신경아세포종 섬유아세포, 횡문근육종, 척수신경절 세포, NS0 세포, CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), L-세포, HEK-293 (ATCC CRL1573)과 PC12 (ATCC CRL-1721), HEK293T (ATCC CRL-11268), RBL (ATCC CRL-1378), SH-SY5Y (ATCC CRL-2266), MDCK (ATCC CCL-34), SJ-RH30 (ATCC CRL-2061), HepG2 (ATCC HB-8065), ND7/23 (ECACC 92090903), CHO (ECACC 85050302), Vero (ATCC CCL 81), Caco-2 (ATCC HTB 37), K562 (ATCC CCL 243), Jurkat (ATCC TIB-152), Per.C6 (Crucell, Leiden, The Netherlands), Huvec (ATCC 인간 일차 PCS 100-010, 생쥐 CRL 2514, CRL 2515, CRL 2516), HuH-7D12 (ECACC 01042712), 293 (ATCC CRL 10852), A549 (ATCC CCL 185), IMR-90 (ATCC CCL 186), MCF-7 (ATC HTB-22), U-2 OS (ATCC HTB-96), T84 (ATCC CCL 248), 또는 임의의 확립된 세포주 (극성 또는 비극성) 또는 American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Blvd. Manassas, Va. 20110-2209 USA) 또는 European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury Wiltshire SP4 0JG England)와 같은 기탁기관으로부터 입수가능한 임의의 세포주 역시 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
게다가, 본 발명의 방법에 유용한 세포는 혈청 포함 배지, 혈청 없는 배지, 임의의 동물-유래된 산물이 없는 완전하게 정의된 배지, 그리고 이들 조건 중에서 한 가지로부터 다른 것으로 전환될 수 있는 세포에서 성장될 수 있는 포유동물 세포이다.
본 발명의 세포에는 목적되는 단백질을 인코딩하는 핵산 (또는 이종다합체성 단백질의 경우에, 상기 단백질의 하나 이상의 아단위를 인코딩하는 핵산)이 도입된 세포가 포함된다. 조작된 세포에는 또한, 목적되는 단백질을 인코딩하는 내생적 서열의 전사 활성화 (또는 이종다합체성 단백질의 하나 이상의 아단위를 인코딩하는 내생적 서열의 전사 활성화)를 위한 핵산이 도입된 세포가 포함된다. 조작된 세포에는 또한, 활성화 화합물과의 접촉에 의해, 또는 번역후 변형 이후에, 프로테아제가 포함되지만 이에 국한되지 않는 효소로 처리 또는 이러한 효소와의 접촉에 의해 활성화되는 목적되는 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포가 포함된다. 조작된 세포에는 전술한 것들의 조합, 다시 말하면, 이종다합체성 단백질을 인코딩하는 도입된 핵산으로부터 이러한 이종다합체성 단백질의 하나 이상의 아단위를 발현하고 유전자 활성화에 의해 상기 단백질의 하나 이상의 아단위를 발현하는 세포가 더욱 포함된다.
임의의 핵산이 공지된 수단을 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 핵산을 세포 내로 도입하는 기술은 당분야에 널리 공지되어 있고 당업자에 의해 이의 없이 인식된다. 이들 방법에는 형질감염, 바이러스 전달, 단백질 또는 펩티드 매개된 삽입, 공동침전 방법, 지질 기초된 전달 시약 (lipofection), 사이토펙션 (cytofection), 리포폴리아민 전달, 덴드리머 (dendrimer) 전달 시약, 전기천공 또는 기계적 전달이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 형질감염 시약의 실례는 GENEPORTER, GENEPORTER2, LIPOFECTAMINE, LIPOFECTAMINE 2000, FUGENE 6, FUGENE HD, TFX-10, TFX-20, TFX-50, OLIGOFECTAMINE, TRANSFAST, TRANSFECTAM, GENESHUTTLE, TROJENE, GENESILENCER, X-TREMEGENE, PERFECTIN, CYTOFECTIN, SIPORT, UNIFECTOR, SIFECTOR, TRANSIT-LT1, TRANSIT-LT2, TRANSIT-EXPRESS, IFECT, RNAI SHUTTLE, METAFECTENE, LYOVEC, LIPOTAXI, GENEERASER, GENEJUICE, CYTOPURE, JETSI, JETPEI, MEGAFECTIN, POLYFECT, TRANSMESSANGER, RNAiFECT, SUPERFECT, EFFECTENE, TF-PEI-KIT, CLONFECTIN, 그리고 METAFECTINE이다.
2개 이상의 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 이종다합체성 단백질의 2개 이상의 아단위를 인코딩하는 서열 또는 목적되는 2개 이상의 상이한 단백질을 인코딩하는 서열이 도입되는 경우에, 이들 서열은 동일한 벡터 상에 또는, 바람직하게는, 별개의 벡터 상에 도입될 수 있다. DNA는 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 일부 구체예에서, 목적되는 단백질 또는 목적되는 부분 단백질을 인코딩하는 핵산은 목적되는 단백질이 상기 단백질의 생리학적 기능과 비교하여 세포의 기능을 변화시키는 추가의 아미노산과 함께 발현되도록 하는 추가적인 서열을 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 목적되는 단백질을 인코딩하는 핵산은 야생형 단백질을 인코딩하는 핵산 서열과 비교하여, 하나 이상의 치환, 삽입, 돌연변이 또는 결실을 포함한다. 돌연변이를 포함하는 핵산을 포함하는 구체예에서, 이러한 돌연변이는 무작위 돌연변이 또는 특정 부위 돌연변이일 수 있다. 이들 핵산 변화는 아미노산 치환을 유발하거나 유발하지 않을 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산은 목적되는 단백질을 인코딩하는 핵산의 단편이다. 단편이거나 이런 변형을 보유하는 핵산은 목적되는 단백질의 적어도 한 가지의 생물학적 특성을 유지하는 폴리펩티드를 인코딩한다.
본 발명은 또한, 목적되는 단백질을 인코딩하는 "야생형" 서열, 또는 인간 이외의 종으로부터 유래된 대응물 핵산, 또는 이들 핵산 중에서 한 가지와 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 적어도 대략 85% 동일한 서열을 갖는 핵산을 안정적으로 발현하는 세포와 세포주를 포함한다. 일부 구체예에서, 서열 동일성은 이들 서열과 비교하여 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이다. 본 발명은 또한, 목적되는 단백질을 인코딩하는 핵산이 엄격한 조건 하에, 야생형 서열, 또는 인간 이외의 종으로부터 유래된 대응물 핵산, 또는 이들 핵산 중에서 한 가지와 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 혼성화되는 세포와 세포주를 포함한다.
일부 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 야생형 서열, 또는 인간 이외의 종으로부터 유래된 대응물 핵산, 또는 이들 핵산 중에서 한 가지와 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산과 비교하여, 적어도 하나의 치환을 포함하는 단백질-인코딩 핵산 서열을 포함한다. 이러한 치환은 10, 20, 30, 또는 40개 이하의 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 서열의 최대 1%, 5%, 10% 또는 20%를 구성할 수 있다. 일부 구체예에서, 치환된 서열은 야생형 서열, 또는 인간 이외의 종으로부터 유래된 대응물 핵산, 또는 이들 핵산 중에서 한 가지와 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 실질적으로 동일하거나 (가령, 그것에 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열), 또는 엄격한 조건 하에, 야생형 서열, 또는 인간 이외의 종으로부터 유래된 대응물 핵산, 또는 이들 핵산 중에서 한 가지와 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 혼성화될 수 있는 서열일 수 있다.
일부 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 야생형 서열, 또는 인간 이외의 종으로부터 유래된 대응물 핵산, 또는 이들 핵산 중에서 한 가지와 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 내로 삽입 또는 이러한 핵산으로부터 결실을 포함하는 단백질-인코딩 핵산 서열을 포함한다. 이러한 삽입 또는 결실은 10, 20, 30, 또는 40개 이하의 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 서열의 최대 1%, 5%, 10% 또는 20%를 구성할 수 있다. 일부 구체예에서, 삽입 또는 결실의 서열은 야생형 서열, 또는 인간 이외의 종으로부터 유래된 대응물 핵산, 또는 이들 핵산 중에서 한 가지와 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 실질적으로 동일하거나 (가령, 그것에 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열), 또는 엄격한 조건 하에, 야생형 서열, 또는 인간 이외의 종으로부터 유래된 대응물 핵산, 또는 이들 핵산 중에서 한 가지와 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 혼성화될 수 있는 서열일 수 있다.
일부 구체예에서, 핵산 치환 또는 변형은 아미노산 변화, 예를 들면, 아미노산 치환을 유발한다. 가령, 목적되는 야생형 단백질 또는 인간 이외의 종으로부터 유래된 대응물 아미노산의 아미노산 잔기가 보존성 또는 비-보존성 치환에 의해 대체될 수 있다. 일부 구체예에서, 최초 아미노산 서열과 변형된 아미노산 서열 사이에 서열 동일성은 상기 폴리펩티드 서열 또는 그것에 실질적으로 동일한 서열 (가령, 그것에 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열)로부터 대략 1%, 5%, 10% 또는 20% 다를 수 있다.
"보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 부모 아미노산 잔기에 유사한 화학적 특성 (가령, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 R 기를 보유하는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존성 치환에 의해 서로 달라지는 경우에, 서열 동일성 비율 또는 유사성 정도는 이러한 치환의 보존성을 보완하기 위하여 상향 조정될 수 있다. 이러한 조정을 달성하는 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있다 (참조: Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994)).
유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 보유하는 아미노산 그룹의 실례에는 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 그리고 이소류신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린과 트레오닌; 3) 아미드-포함 측쇄: 아스파라긴과 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 그리고 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 그리고 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파라긴산과 글루타민산; 그리고 7) 황-포함 측쇄: 시스테인과 메티오닌이 포함된다. 선호되는 보존성 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트, 그리고 아스파라긴-글루타민이다. 대안으로, 보존성 아미노산 치환은 Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992)에서 기술된 PAM250 대수-우도 행렬 (log-likelihood matrix)에서 양성 값을 갖는 임의의 변화이다. "중간 정도로 보존성" 치환은 PAM250 대수-우도 행렬에서 비-음성 값을 갖는 임의의 변화이다.
목적되는 단백질에서 보존성 변형은 변형되지 않은 단백질의 것들과 유사한 (즉, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일한) 기능적 및 화학적 특징을 갖는 단백질을 생산할 것이다.
한 구체예에서, 호스트 세포는 목적되는 단백질을 생산하는 유전자도입 동물의 산출을 위한 기초로서 이용되는 배아 줄기 세포이다. 목적되는 기능적 단백질을 안정적으로 발현하는 배아 줄기 세포가 생명체 내로 직접적으로 이식되거나, 또는 그들의 핵이 다른 수용자 세포 내로 이동되고 이들 세포가 이후, 이식되거나, 또는 이들이 유전자도입 동물을 산출하는데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 상기 단백질은 원하는 시간적 및/또는 조직 특이적 발현으로, 동물 내에서 발현될 수 있다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 선택된 호스트 세포와 함께 이용하기 적합한 임의의 벡터는 목적되는 단백질을 인코딩하는 핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 예로써, 목적되는 2개 이상의 상이한 아단위 또는 2개 이상의 단백질을 도입하기 위하여 하나 이상의 벡터가 이용되는 경우에, 이들 벡터는 동일한 유형 또는 상이한 유형일 수 있다.
이들 핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있는 벡터의 실례에는 플라스미드, 레트로바이러스와 렌티바이러스를 비롯한 바이러스, 코스미드, 인공 염색체가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 그리고 예로써, pCMVScript, pcDNA3.1 Hygro, pcDNA3.1neo, pcDNA3.1puro, pSV2neo, pIRES puro, pSV2 zeo가 포함된다. 본 발명의 세포와 세포주를 만드는데 유용한 예시적인 포유동물 발현 벡터에는 pFN11A (BIND) Flexi®, pGL4.31, pFC14A (HaloTag® 7) CMV Flexi®, pFC14K (HaloTag® 7) CMV Flexi®, pFN24A (HaloTag® 7) CMVd3 Flexi®, pFN24K (HaloTag® 7) CMVd3 Flexi®, HaloTag™ pHT2, pACT, pAdVAntage™, pALTER®-MAX, pBIND, pCAT®3-Basic, pCAT®3-Control, pCAT®3-Enhancer, pCAT®3-Promoter, pCI, pCMVTNT™, pG5luc, pSI, pTARGET™, pTNT™, pF12A RM Flexi®, pF12K RM Flexi®, pReg neo, pYES2/GS, pAd/CMV/V5-DEST Gateway® 벡터, pAd/PL-DEST™ Gateway® 벡터, Gateway® pDEST™27 벡터, Gateway® pEF-DEST51 벡터, Gateway® pcDNA™-DEST47 벡터, pCMV/Bsd 벡터, pEF6/His A, B, & c, pcDNA™6.2-DEST, pLenti6/TR, pLP-AcGFP1-C, pLPS-AcGFP1-N, pLP-IRESneo, pLP-TRE2, pLP-RevTRE, pLP-LNCX, pLP-CMV-HA, pLP-CMV-Myc, pLP-RetroQ 및 pLP-CMVneo가 포함된다.
일부 구체예에서, 이들 벡터는 발현 제어 서열, 예를 들면, 구조성 또는 조건부 프로모터를 포함하고, 바람직하게는 구조성 프로모터가 이용된다. 당업자는 이런 서열을 선택할 수 있을 것이다. 가령, 적절한 프로모터에는 CMV, TK, SV40 및 EF-1α가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일부 구체예에서, 이들 프로모터는 유도성, 온도 조절된, 조직 특이적, 억제성, 열-쇼크, 발달성, 세포 계통 특이적, 진핵, 원핵 또는 일시적 프로모터, 또는 이들 중에서 한 가지 이상의 변형되지 않은 또는 돌연변이된, 무작위화된, 뒤섞인 서열의 조합 또는 재조합이다. 다른 구체예에서, 목적되는 단백질은 유전자 활성화에 의해 또는 에피솜으로 발현된다.
일부 구체예에서, 벡터는 선별가능 마커 또는 약물 내성 유전자가 없다. 다른 구체예에서, 벡터는 선택적으로, 선별가능 마커, 예를 들면, 약물 또는 항생제 내성을 공여하는 단백질, 또는 더욱 일반적으로, 세포에 대한 선별 압력을 발휘하는 임의의 산물을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 하나 이상의 벡터가 이용되는 경우에, 각 벡터는 동일한 또는 상이한 약물 내성 또는 기타 선별 압력 마커를 보유할 수 있다. 하나 이상의 약물 내성 또는 선별 압력 마커가 동일하면, 약물의 수준을 증가시킴으로써 동시 선별이 달성될 수 있다. 적절한 마커는 당업자에게 공지되어 있고, 그리고 여기에는 네오마이신/G418, 퓨로마이신, 하이그로마이신, 제오신, 메토트렉세이트 및 블라스티시딘 중에서 한 가지에 내성을 공여하는 폴리펩티드 산물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 비록 약물 선별 (또는 임의의 다른 적절한 선별 마커를 이용한 선별)이 본 발명의 세포와 세포주를 생산할 때 필수적인 단계가 아니긴 하지만, 이는 안정적으로 형질감염된 세포에 대한 형질감염된 세포 개체군을 농축하는데 이용될 수 있고, 단서로써 이들 형질감염된 구조체는 약물 내성을 공여하도록 설계된다. 목적되는 단백질을 발현하는 세포의 차후 선별이 신호전달 프로브를 이용하여 달성되면, 형질감염 이후에 너무 이른 선별은 단지 일시적으로 형질감염되고 안정적으로 형질감염되지 않은 다소의 양성 세포를 유발할 수 있다. 하지만, 이러한 효과는 형질감염된 세포에서 일시적인 발현의 희석을 가능하게 하는 충분한 세포 계대배양을 허용함으로써 최소화될 수 있다.
선별 압력은 당업자에게 공지될 다양한 화합물 또는 처리를 이용하여 세포에 가해질 수 있다. 이론에 한정됨 없이, 선별 압력은 세포 성장, 세포 주기의 진행 또는 생존능에 차선이거나 해로운 조건에 세포를 노출시킴으로써 가해질 수 있고, 따라서 이들 조건에 내성이 아닌 세포에 비하여 이들 조건에 내성인 세포가 선별된다. 선별 압력을 발휘하거나 가하는데 이용될 수 있는 조건에는 항생제, 약물, 돌연변이원, 세포 성장 또는 생물학적 빌딩 블록의 합성을 지연시키거나 중단시키는 화합물, RNA, DNA 또는 단백질 합성을 파괴하는 화합물, 세포 성장 또는 배양 배지로부터 세포 성장과 생존능에 필요한 영양소, 아미노산, 탄수화물 또는 화합물의 결핍 또는 제한, 세포 성장에 차선인 조건 하에, 예를 들면, 차선 온도, 공기 조건 (가령, 이산화탄소, 산소 또는 질소% 또는 습도)에서 또는 결핍된 배지 조건에서 세포의 성장 또는 유지와 같은 처리가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 이론에 한정됨 없이, 선별 압력은 선별 압력에 대한 내성을 공여하거나 인코딩하는 마커, 인자 또는 유전자를 선별하는데 이용될 수 있다. 가령, (i) 세포 개체군은 먼저, 선별 압력에 대한 내성을 공여하는 이런 마커, 인자 또는 유전자에 노출되거나, 또는 이런 마커가 도입되고, 따라서 각 세포는 이러한 마커, 인자 또는 유전자를 흡수하거나, 또는 상이한 수준으로 포함하거나 포함하지 않도록 변형되고, 그리고 (ii) 개체군은 이후, 이러한 마커, 인자 또는 유전자에 의해 내성이 공여되는 선별 압력에 노출되고, 따라서 상기 마커, 인자 또는 유전자를 포함하는 세포는 그렇지 못한 세포에 비하여 성장 이점을 포함한다. 이론에 한정됨 없이, 증가된 수준의 마커, 인자 또는 유전자를 포함하는 세포는 상응하는 선별 압력에 비례적으로 증가된 내성을 나타낼 것이다. 선별 압력은 원하는 특성, 상기 특성과 관련된 목적되는 RNA 또는 단백질, 상응하는 선별 압력에 내성을 공여하는 마커, 인자 또는 유전자를 보유하는 RNA 또는 단백질을 포함하는 세포를 선별하는데 이용될 수 있다. 이론에 한정됨 없이, 목적되는 원하는 특성, RNA 또는 단백질의 비례적으로 증가된 수준을 갖는 세포는 선별 과정 동안 비례적으로 증가된 수준 또는 양 또는 선별 압력을 적용함으로써 선별될 수 있다. 복합 특성, RNA 또는 단백질을 포함하는 세포가 요망되는 경우에, 이들 각각은 선별 압력의 동일한 또는 상이한 형태에 내성을 공여하는 마커, 인자 또는 유전자와 관련될 수 있고, 그리고 이들 선별 압력 전부를 이용한 선별은 목적되는 원하는 특성, RNA 또는 단백질 전부를 포함하는 세포를 선별하는데 이용될 수 있다. 목적되는 원하는 특성, RNA 또는 단백질을 보유하는 세포의 선별후, 선별된 세포는 선별 동안 이용된 선별 압력의 동일한, 증가된 또는 감소된 수준, 농도, 용량, 또는 처리 하에 유지될 수 있다. 일부 경우에, 선별 압력의 수준, 농도, 용량, 또는 처리의 주기적인 증가가 목적되는 원하는 특성, RNA 또는 단백질의 상응하게 증가하는 수준을 포함하는 세포의 증폭을 위한 선별에 이용될 수 있다. 일부 경우에, 선별 압력을 이용한 세포의 선별 이후에, 선별된 세포는 선별된 원하는 특성, RNA 또는 단백질이 유지되는 세포 내에서 유지되도록 담보하는데 도움이 되도록, 선별 압력의 감소된 수준, 농도, 용량, 또는 처리를 이용하여 유지된다. 이용되는 선별 압력의 수준은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 이는 예로써, 사멸 곡선 실험 (kill curve experiment)을 수행함으로써 실시될 수 있는데, 여기서 대조 세포 및 내성 마커, 인자 또는 유전자를 포함하는 세포는 선별 압력의 증가하는 수준, 용량, 농도 또는 처리로, 그리고 단지 음성 세포에 대하여 선택된 범위 또는 바람직하게는, 원하는 시간 범위 (가령, 1 내지 24시간, 1 내지 3일, 3 내지 5일, 4 내지 7일, 5 내지 14일, 1 내지 3주, 2 내지 6주, 1 내지 2개월, 1 내지 3개월, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개월 이상)에서 조사되었다. 이용될 수 있는 선별 압력의 정확한 수준, 농도, 용량, 또는 처리는 이용되는 세포, 원하는 특성 자체, 선별 압력에 내성을 공여하는 마커, 인자 또는 유전자, 그리고 선별되는 세포에서 요망되는 원하는 특성의 수준에 좌우되고, 그리고 당업자는 이들 고려사항에 기초하여 적절한 범위를 결정하는 방법을 즉시 인지할 것이다. 일부 경우에, 선별후 선별 과정 동안 이용된 선별 압력의 수준, 농도, 용량, 또는 처리의 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% 이하가 선별되는 세포의 차후 유지에 이용된다. 복수의 상이한 선별 압력이 이용되는 일부 경우에, 선별 과정 동안 이용된 각 선별 압력의 수준, 농도, 용량, 또는 처리는 선별되는 세포의 차후 유지에서, 예로써 선별 과정 자체 동안 이용된 것들의 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% 이하로 감소될 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 감소된 수준, 농도, 용량, 또는 처리는 원하는 특성, RNA 또는 단백질을 포함하는 선별되는 세포가 배양 기간 동안 원하는 특성을 계속 포함하도록 선택된다. 일부 구체예에서, 선별된 세포에서 원하는 특성의 상실 또는 감소를 예방하는데 필요한 만큼의 수준, 농도, 용량, 또는 처리가 예로써, 이들 세포가 선별되는 특성, RNA 또는 단백질을 유지하기 위하여 필요한 것보다 높은 수준, 농도, 용량, 또는 처리가 이용될 때 발생하는 임의의 가능한 유해 효과에 대한 이들 세포의 노출이 최소화되도록 배양 기간 동안 세포의 유지 동안 이용된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 선별 압력의 부재에서 (가령, 목적되는 단백질 또는 RNA의 발현) 적어도 15일, 30일, 45일, 60일, 75일, 100일, 120일, 또는 150일 동안, 그들이 선별되는 특성, RNA 또는 단백질을 유지할 수 있다. 이런 세포와 세포주는 선별 과정에서 이용된 것들과 비교하여, 선별 압력의 동일한, 증가된, 또는 감소된 수준, 농도, 용량, 또는 처리의 존재에서 배양될 수 있다. 이런 세포와 세포주는 또한, 임의의 선별 압력의 부재에서 배양될 수 있다. 수준, 농도, 용량 또는 처리가 감소되는 경우에, 이들은 선별 과정 동안 이용된 개별 수준, 농도, 용량 또는 처리의 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% 이하로 감소될 수 있다. 세포와 세포주가 하나 이상의 목적되는 단백질 또는 RNA를 발현하고, 그리고 각각의 목적되는 단백질 또는 RNA의 발현이 상이한 선별 압력을 이용하여 선별되는 경우에, 각 선별 압력의 수준, 농도, 용량 또는 처리는 선별후 이들 세포와 세포주의 배양 동안 독립적으로 선택될 수 있다, 가령, 각각의 선별 압력은 세포 배양액 내에서 부재, 또는 선별 과정 동안 이용된 개별 수준, 농도, 용량 또는 처리와 비교하여 동일하거나, 또는 증가된 또는 감소된 수준, 농도, 용량 또는 처리에서 독립적으로 선택될 수 있다. 수준, 농도, 용량 또는 처리가 감소되는 경우에, 이들은 선별 과정 동안 이용된 개별 수준, 농도, 용량 또는 처리의 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% 이하로 감소될 수 있다.
일부 구체예에서, 단백질-인코딩 핵산 서열은 태그 (tag)를 더욱 포함한다. 이런 태그는 예로써, HIS 태그, myc 태그, 적혈구응집소 (hemagglutinin, HA) 태그, 단백질 C, VSV-G, FLU, 황색 형광 단백질 (YFP), 녹색 형광 단백질, FLAG, BCCP, 말토오스 결합 단백질 태그, Nus-태그, Softag-1, Softag-2, Strep-태그, S-태그, 티오레독신 (thioredoxin), GST, V5, TAP 또는 CBP를 인코딩할 수 있다. 태그는 단백질 발현 수준, 세포내 국부화, 단백질-단백질 상호작용, 목적되는 단백질의 조절, 또는 상기 단백질의 기능을 결정하기 위한 마커로서 이용될 수 있다. 태그는 또한, 단백질을 정제하거나 분별하는데 이용될 수 있다.
목적되는 RNA를 발현하는 세포와 세포주의 경우에, 상기 RNA는 안티센스 RNA, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이동 RNA (tRNA), 구조 RNA, 리보솜 RNA, 이종성 핵 RNA (hnRNA) 및 소형 핵 RNA (snRNA), 메신저 RNA (mRNA), 스템-루프 (stem-loop) 구조를 채용하는 RNA, 헤어핀 구조를 채용하는 RNA, 단일 가닥 RNA를 포함하는 RNA, 이중 가닥 RNA를 포함하는 RNA, 단백질에 결합하는 RNA, 형광 화합물에 결합하는 RNA, 생물학적 활성을 갖는 RNA, 생물학적으로 활성 산물을 인코딩하는 RNA, 촉매성 RNA, RNA 올리고뉴클레오티드, 적어도 두 번째 RNA의 수준 또는 활성을 조절할 수 있는 RNAi 또는 RNA를 매개할 수 있는 RNA를 비롯한 임의의 유형일 수 있다.
본 발명의 세포와 세포주가 목적되는 기능적 단백질을 발현하는 구체예에서, 상기 단백질은 단일 사슬 단백질, 다중-사슬 단백질, 이종다합체성 단백질이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 단백질일 수 있다. 다합체성 단백질의 경우에, 일정한 구체예에서, 이들 세포는 고유 단백질을 구성하는 아단위 전부를 발현한다. 상기 단백질은 "야생형" 서열을 갖거나, 또는 변이체일 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 세포는 대립형질 변이체, 절단접합 변이체, 절두된 형태, 동종형, 상이한 화학량론의 아단위, 아단위의 상이한 조립체, 차별적 접힘 형태, 차별적 활성 형태, 상이한 기능을 갖는 형태, 상이한 결합 특성을 갖는 형태, 상이한 부속 인자와 연관된 형태, 상이한 세포 배경에서 발현된 형태, 상이한 세포 유전자 배경에서 발현된 형태, 상이한 내생적 발현 프로필을 갖는 세포에서 발현된 형태, 차별적 국부화 형태, 키메라 또는 화학적으로 변형된 형태, 효소에 의해 변형된 형태, 번역후 변형된 형태, 당화된 형태, 단백질분해된 형태, 아미노산 치환 (보존성 또는 비-보존성)을 포함하는 키메라 아단위 및 돌연변이된 형태, 화학적으로 변형된 아미노산을 보유하는 변형된 아미노산, 그리고 비-자연 발생 아미노산, 그리고 이들의 조합을 비롯한 하나 이상의 아단위의 변이체를 포함하는 단백질을 발현한다. 본 발명의 세포 또는 세포주에 의해 발현된 이종다합체성 단백질은 2가지 이상의 종, 예를 들면, 목적되는 단백질의 종 동족체로부터 아단위를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포는 목적되는 2개 이상의 기능적 단백질을 발현한다. 본 발명에 따라서, 이런 발현은 목적되는 단백질의 전부 또는 일부를 인코딩하는 핵산의 도입, 내생적 서열로부터 목적되는 단백질의 전부 또는 일부의 전사를 활성화시키는 핵산의 도입, 또는 이들의 임의의 조합에 기인할 수 있다. 이들 세포는 임의의 원하는 숫자의 목적되는 단백질을 발현할 수 있다. 다양한 구체예에서, 이들 세포는 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 그 이상의 목적되는 단백질을 발현한다. 가령, 본 발명에서는 목적되는 경로에서 기능적 단백질, 효소 경로, 신호전달 경로, 조절 경로 등을 비롯한 교차하는 경로로부터 단백질을 안정적으로 발현하는 세포와 세포주와 계획된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 목적되는 생물학적 경로에 관여하는 하나 이상의 기능적 RNA 및/또는 단백질, 예를 들면, 상기 생물학적 경로의 단백질 및/또는 RNA 성분, 그리고 상기 생물학적 경로 및/또는 하나 이상의 이의 성분의 단백질 및/또는 RNA 조절제를 안정적으로 발현한다. 일부 구체예에서, 생물학적 경로는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 적어도 50개의 단백질 성분으로 구성된다. 일부 구체예에서, 생물학적 경로는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 적어도 50개의 RNA 성분으로 구성된다. 기능적 단백질이 본 발명의 세포와 세포주에 의해 안정적으로 발현될 수 있는 생물학적 경로의 실례에는 2-아라키도노일글리세롤 생합성 경로, 5-하이드록시트립타민 생합성 경로, 5-하이드록시트립타민 분해 경로, 5ht1 유형 수용체 매개된 신호전달 경로, 5ht2 유형 수용체 매개된 신호전달 경로, 5ht3 유형 수용체 매개된 신호전달 경로, 5ht4 유형 수용체 매개된 신호전달 경로, 아세테이트 이용 경로, 아데닌과 하이포크산틴 회수 경로, 아드레날린 및 노르아드레날린 생합성 경로, 알라닌 생합성 경로, 알란토인 분해 경로, 알파 아드레날린성 수용체 신호전달 경로, 알츠하이머병-아밀로이드 세크레타제 경로, 알츠하이머병-프레세닐린 경로, 아미노부티레이트 분해 경로, 아난다미드 생합성 경로, 아난다미드 분해 경로, 안드로겐/에스트로겐/프로게스테론 생합성 경로, 혈관신생 경로, G 단백질 및 베타-아레스틴을 통한 앤지오텐신 ii-자극된 신호전달 경로, 아폽토시스 신호전달 경로, 아르기닌 생합성 경로, 아스코르베이트 분해 경로, 아스파라긴 및 아스파르테이트 생합성 경로, ATP 합성 경로, 네트린 (netrin)에 의해 매개된 측삭돌기 유도 (axon guidance), 세마포린 (semaphorin)에 의해 매개된 측삭돌기 유도, slit/robo에 의해 매개된 측삭돌기 유도, B 세포 활성화 경로, 베타1 아드레날린성 수용체 신호전달 경로, 베타2 아드레날린성 수용체 신호전달 경로, 베타3 아드레날린성 수용체 신호전달 경로, 비오틴 생합성 경로, 혈액 응고 경로, 부프로피온 (bupropion) 분해 경로, 카드헤린 신호전달 경로, 카르니틴 대사 경로, 세포 주기 경로, 콜레스테롤 생합성 경로, 코리스메이트 (chorismate) 생합성 경로, 하루 주기 (circadian clock) 시스템 경로, 코발라민 생합성 경로, 조효소 A 생합성 경로, 조효소 A 연계된 카르니틴 대사 경로, 부신피질 자극 호르몬 방출 인자 수용체 신호전달 경로, 시스테인 생합성 경로, rho gtpase에 의한 세포골격 조절, de novo 퓨린 생합성 경로, de novo 피리미딘 데옥시리보뉴클레오티드 생합성 경로, de novo 피리미딘 리보뉴클레오티드 생합성 경로, DNA 복제, 도파민 수용체 매개된 신호전달 경로, egf 수용체 신호전달 경로, 내생적 칸나비노이드 신호전달 경로, 엔도텔린 신호전달 경로, 엔케팔린 방출 경로, fas 신호전달 경로, fgf 신호전달 경로, 플라빈 생합성 경로, 포르밀테트라하이드로포르메이트 생합성 경로, 프럭토오스 갈락토오스 대사 경로, GABA-b 수용체 ii 신호전달 경로, 감마-아미노부티르산 합성 경로, RNA 중합효소 I에 의한 일반 전사, 일반 전사 조절, 글루타민 글루타메이트 전환 경로, 당분해 경로, hedgehog 신호전달 경로, gpa (heme) 생합성 경로, 이종삼합체성 G-단백질 신호전달 경로-gi 알파 및 gs 알파 매개된 경로, 이종삼합체성 G-단백질 신호전달 경로-gq 알파 및 go 알파 매개된 경로, 이종삼합체성 G-단백질 신호전달 경로-관상체 외분절 광전도 (rod outer segment phototransduction) 경로, 히스타민 h1 수용체 매개된 신호전달 경로, 히스타민 h2 수용체 매개된 신호전달 경로, 히스타민 합성 경로, 히스티딘 생합성 경로, 헌팅턴병, hif 활성화를 통한 저산소증 반응, 케모카인 및 사이토카인 신호전달 경로에 의해 매개된 염증, 인슐린/igf 경로-유사분열물질 활성화된 단백질 키나아제 키나아제/map 키나아제 캐스케이드, 인슐린/igf 경로-단백질 키나아제 B 신호전달 캐스케이드, 인테그린 신호전달 경로, 인터페론-감마 신호전달 경로, 인터류킨 신호전달 경로, 이온통로성 (ionotropic) 글루타메이트 수용체 경로, 이소류신 생합성 경로, jak/stat 신호전달 경로, 류신 생합성 경로, 리포에이트 (lipoate) 생합성 경로, 리신 생합성 경로, 만노오스 대사 경로, 대사자극성 글루타메이트 수용체 그룹 i 경로, 대사자극성 글루타메이트 수용체 그룹 ii 경로, 대사자극성 글루타메이트 수용체 그룹 iii 경로, 메티오닌 생합성 경로, 메틸시트레이트 사이클, 메틸말로닐 경로, mRNA 절단접합, 무스카린성 아세틸콜린 수용체 1 및 3 신호전달 경로, 무스카린성 아세틸콜린 수용체 2 및 4 신호전달 경로, n-아세틸글루코사민 대사, 니코틴 분해 경로, 니코틴성 아세틸콜린 수용체 신호전달 경로, 노치 (notch) 신호전달 경로, o-항원 생합성 경로, 오피오이드 프로디노프린 (prodynorphin) 경로, 오피오이드 프로엔케팔린 경로, 오피오이드 프로오피오멜라노코르틴 (proopiomelanocortin) 경로, 오르니틴 분해 경로, 산화 스트레스 반응 경로, 옥시토신 수용체 매개된 신호전달 경로, p38 mapk 경로, p53 경로, 글루코오스 결핍에 의한 p53 경로, p53 경로 피드백 루프 1, p53 경로 피드백 루프 2, 판토테네이트 생합성 경로, 파킨슨병, PDGF 신호전달 경로, 펜토스 포스페이트 경로, 펩티도글리칸 생합성 경로, 페닐아세테이트 분해 경로, 페닐알라닌 생합성 경로, 페닐에틸아민 분해 경로, 페닐프로피오네이트 분해 경로, pi3 키나아제 경로, 플라스미노겐 활성화 캐스케이드, 프롤린 생합성 경로, prpp 생합성 경로, 퓨린 대사, 피리독살 포스페이트 회수 경로, 피리독살-5-포스페이트 생합성 경로, 피리미딘 대사, 피루베이트 대사, ras 경로, s-아데노실메티오닌 생합성 경로, 회수 피리미딘 데옥시리보뉴클레오티드, 회수 피리미딘 리보뉴클레오티드, 세린 글리신 생합성 경로, 숙시네이트에서 프로피오네이트로 전환, 설페이트 동화 (sulfate assimilation) 경로, 시냅스 소포 운송 (synaptic vesicle trafficking), T 세포 활성화 경로, TCA 사이클, 테트라하이드로폴레이트 생합성 경로, TGF-베타 신호전달 경로, 티아민 생합성 경로, 티아민 대사, 트레오닌 생합성 경로, 갑상선 자극 호르몬-방출 호르몬 수용체 신호전달 경로, 톨 (toll) 수용체 신호전달 경로, bzip 전사 인자에 의한 전사 조절, 트리아실글리세롤 대사, 트립토판 생합성 경로, 티로신 생합성 경로, 유비퀴틴 프로테아솜 경로, 발린 생합성 경로, 바소프레신 합성 경로, VEGF 신호전달 경로, 비타민 B6 생합성 경로, 비타민 B6 대사, 비타민 D 대사 및 경로, wnt 신호전달 경로, 그리고 크산틴 및 구아닌 회수 경로가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
기능적 단백질이 본 발명의 세포와 세포주에 의해 안정적으로 발현될 수 있는 생물학적 경로의 다른 실례에는 아래의 생물학적 과정이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: 아미노산 대사 (가령, 아미노산 생합성, 아미노산 이화, 아미노산 대사 조절, 아미노산 수송, 그리고 기타 아미노산 대사), 수송 (가령, 아미노산 수송, 탄수화물 수송, 비타민/보조인자 수송, 음이온 수송, 양이온 수송, 지질 및 지방산 수송, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 및 핵산 수송, 포스페이트 수송, 세포외 수송 및 수입, 소형 분자 수송, 그리고 기타 수송), 아폽토시스 (가령, 아폽토시스의 유도, 아폽토시스의 저해, 그리고 기타 아폽토시스 과정), 혈액 순환 (blood circulation)과 가스 교환 (gas exchange), 탄수화물 대사 (가령, 탄수화물 수송, 이당류 대사, 글루코스신합성 (gluconeogenesis), 글리코겐 대사, 당분해, 단당류 대사, 기타 탄수화물 대사, 기타 다당류 대사, 펜토스-포스페이트 측로 (shunt), 탄수화물 대사의 조절, 그리고 트리카르복실산 경로), 세포 부착, 세포 주기 (가령, 세포 주기 제어, DNA 복제, 유사분열, 그리고 기타 세포 주기 과정), 세포 증식 및 분화, 세포 구조 및 운동, 조효소 및 보결분자단 (prosthetic group) 대사 (가령, 조효소 대사, 포르피린 대사, 프테린 대사, 비타민/보조인자 수송, 비타민 생합성, 비타민 이화, 그리고 기타 조효소 및 보결분자단 대사), 발달 과정 (가령, 외배엽 발달, 전-후축 패턴 형성 (anterior/posterior patterning), 등-배축 (dorsal/ventral axis)의 결정, 배아발생, 내배엽 발달, 수정, 감수분열, 중배엽 발달, 분절 특정화 (segment specification), 성별 결정, 난형성, 정자형성 및 운동, 그리고 기타 발달 과정), 전자 수송 (가령, 페러독신 대사, 산화 인산화, 그리고 전자 수송의 기타 경로), 항상성 (칼슘 이온 항상성, 글루코오스 항상성, 성장 인자 항상성, 그리고 기타 항상성 활성), 면역 및 방어 (가령, 항산화 및 유리 라디칼 제거, B-세포- 및 항체-매개된 면역, 혈액 응고, 보체-매개된 면역, 사이토카인/케모카인 매개된 면역, 해독, 과립구-매개된 면역, 인터페론-매개된 면역, 대식세포-매개된 면역, 자연 킬러 세포 매개된 면역, 스트레스 반응, T-세포 매개된 면역, 그리고 기타 면역 및 방어 과정), 세포내 단백질 통행 (가령, 세포외유출, 세포 이물 흡수, 일반적인 소포 수송, 리소솜 수송, 미토콘드리아 수송, 핵 수송, 과산화소체 수송, 그리고 기타 세포내 단백질 통행), 지질, 지방산 및 스테로이드 대사 (가령, 아실-coa 대사, 지방산 베타-산화, 지방산 생합성, 지방산 불포화, 지질 및 지방산 결합, 지질 및 지방산 수송, 지질 대사, 그리고 기타 기질, 지방산 및 스테로이드 대사, 인지질 대사, 지질의 조절, 지방산 및 스테로이드 대사, 담즙산 대사, 콜레스테롤 대사, 스테로이드 호르몬 대사, 그리고 기타 스테로이드 대사), 근육 수축, 뉴런 활성 (가령, 활동 전위 전파 (action potential propagation), 신경-신경 시냅스 전달 (nerve-nerve synaptic transmission), 신경근 시냅스 전달 (neuromuscular synaptic transmission), 신경전달물질 방출, 그리고 기타 뉴런 활성), 질소 대사 (가령, 산화질소 생합성, 질소 이용, 그리고 기타 질소 대사), 비-척추동물 과정, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 및 핵산 대사 (가령, DNA 복제, DNA 분해, DNA 재조합, DNA 수복, 염색질 포장 및 재구축, 환상 뉴클레오티드의 대사, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 및 핵산 수송, 기타 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 및 핵산 대사, 퓨린 대사, 피리미딘 대사, RNA 이화, RNA 국부화, 뉴클레오시드의 조절, 뉴클레오티드 대사, 역전사, RNA 대사, tRNA 대사, mRNA 캡핑 (capping), mRNA 말단-가공 (end-processing) 및 안정성, mRNA 폴리아데닐화, mRNA 절단접합, 일반적인 mRNA 전사 활성, 기타 mRNA 전사, mRNA 전사 신장, mRNA 전사 개시, mRNA 전사 조절, 그리고 mRNA 전사 종결), 종양형성 (가령, 종양유전자, 종양 억제자, 그리고 기타 종양형성-관련된 과정), 포스페이트 대사 (가령, 포스페이트 수송, 폴리포스페이트 생합성, 폴리포스페이트 이화, 포스페이트 대사의 조절, 그리고 기타 포스페이트 대사), 단백질 대사 및 변형 (가령, 단백질분해, 아미노산 활성화, 그리고 기타 단백질 대사, 단백질 생합성, 단백질 복합체 조립, 단백질 접힘, 번역 조절, 단백질 ADP-리보실화, 단백질 아세틸화, 단백질 이황화-이성화효소 반응, 단백질 당화, 단백질 메틸화, 단백질 인산화, 단백질-지질 변형), 단백질 표적화 및 국부화 (가령, 비대칭 단백질 국부화, 그리고 기타 단백질 표적화 및 국부화), 감각 지각 (가령, 후각, 미각, 청각, 통각, 페로몬 반응, 시각, 그리고 기타 감각 지각), 황 대사 (가령, 황 산화환원 대사 및 기타 황 대사), 세포 커뮤니케이션 (가령, 세포 부착-매개된 신호전달, 세포외 기질 단백질-매개된 신호전달, 리간드-매개된 신호전달, 그리고 스테로이드 호르몬-매개된 신호전달), 세포 표면 수용체 매개된 신호 전달 (가령, 사이토카인 및 케모카인 매개된 신호전달 경로, G-단백질 매개된 신호전달, 수용체 단백질 세린/트레오닌 키나아제 신호전달 경로, 수용체 단백질 티로신 키나아제 신호전달 경로, 그리고 기타 수용체 매개된 신호전달 경로), 세포내 신호전달 캐스케이드 (가령, 칼슘 매개된 신호전달, jak-stat 캐스케이드, JNK 캐스케이드, MAPKKK 캐스케이드, NF-카파B 캐스케이드, NO 매개된 신호 전달, 그리고 기타 세포내 신호전달 캐스케이드), 그리고 기타 신호 전달 과정.
본 명세서에서 기술된 다양한 생물학적 경로의 단백질 및/또는 RNA 성분, 그리고 서로에 대한 그들의 상관관계는 당업자에게 공지되어 있고, 그리고 예로써, 인터넷 (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html) 상에서 KEGG 경로 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 생물학적 경로에 관여하는 적어도 하나의 기능적 RNA 또는 단백질을 발현한다. 일부 구체예에서, 목적되는 RNA 또는 단백질을 발현하는 본 발명의 세포 또는 세포주는 또한, 생물학적 경로의 적어도 하나의 기능적 RNA 또는 단백질 성분을 발현한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 조작되지 않은 동일한 유형의 세포 또는 세포주에서 발현되거나 발현되지 않는 생물학적 경로의 적어도 하나의 기능적 RNA 또는 단백질 성분을 발현한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 본 명세서에서 "기능적 생물학적 경로의 발현"으로 지칭되는, 이들 세포 또는 세포주에서 경로 중에서 적어도 하나의 활성을 제공할 만큼 충분한 생물학적 경로의 적어도 2개의 기능적 RNA 또는 단백질 성분을 발현한다. 일부 구체예에서, 생물학적 경로의 발현은 이러한 생물학적 경로의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10가지 성분의 발현을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 생물학적 경로의 발현은 이러한 생물학적 경로의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 또는 전체 성분의 발현을 포함할 수 있다. 생물학적 경로가 자연적으로 존재하지 않는 세포 또는 세포주에서 이러한 생물학적 경로의 적어도 하나의 기능적 RNA 또는 단백질 성분의 발현은 상기 세포 또는 세포주에서 상기 기능적 생물학적 경로의 적어도 하나의 활성의 재구성을 유발할 수 있다. 생물학적 경로가 자연적으로 존재하는 세포 또는 세포주에서 이러한 생물학적 경로의 적어도 하나의 기능적 RNA 또는 단백질 성분의 발현은 상기 세포 또는 세포주에서 상기 기능적 생물학적 경로의 적어도 하나의 활성의 증가를 유발할 수 있다. 생물학적 경로가 자연적으로 존재하는 세포 또는 세포주에서 이러한 생물학적 경로의 적어도 하나의 기능적 RNA 또는 단백질 성분의 발현은 상기 세포에서 상기 경로의 알짜 또는 전체 활성에서 변경을 유발할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주에서 발현된 목적되는 단백질은 변형되거나, 번역후 변형되거나, 당화되거나, 또는 생물학적 경로의 적어도 하나의 RNA 또는 단백질 성분의 공동-발현에 의해 변경될 수 있다. 일정한 구체예에서, 목적되는 단백질은 IgG 또는 항체이고, 그리고 경로는 당화 경로이다. 일부 구체예에서, 동일한 목적되는 단백질 (가령, 항체)을 각각 발현하는 세포주 패널 내에 세포주는 또한, 생물학적 경로 (가령, 당화 경로)의 적어도 하나의 RNA 또는 단백질 성분을 각각 발현한다. 일부 구체예에서, 생물학적 경로의 적어도 하나의 기능적 RNA 또는 단백질 성분은 세포 내에서, 발현된 목적되는 단백질과 상호작용한다 (가령, 일시적으로 또는 연장된 기간 동안, 상기 단백질을 변형, 변경 또는 당화시키거나, 또는 상기 단백질에 결합한다). 하지만, 발현된 기능적 단백질 사이에 단백질-단백질 상호작용은 필요조건이 아니다. 가령, 본 발명의 세포와 세포주는 동일한 생물학적 경로의 성분인 것으로 서로 관련되지만 서로 직접적으로 상호작용하지 않는 2개 이상의 기능적 단백질을 발현할 수 있다. 생물학적 경로는 이러한 생물학적 경로의 2개 이상의 기능적 단백질 성분을 발현하는 본 발명의 세포 또는 세포주 내에 자연적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 첫 번째 경우에, 생물학적 경로의 2개 이상의 기능적 단백질 성분의 발현은 세포 또는 세포주 내에서 생물학적 경로의 적어도 하나의 활성에서 증가를 유발할 수 있다. 후자 경우에, 생물학적 경로의 2개 이상의 기능적 단백질 성분의 발현은 세포 또는 세포주 내에서 적어도 하나의 활성 또는 전체 생물학적 경로의 재구성을 유발할 수 있다. 일부 구체예에서, 생물학적 경로의 적어도 하나 이상의 성분은 세포 또는 세포주에 의해 자연적으로 발현된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 생물학적 경로에 관여하는 적어도 하나의 기능적 단백질을 안정적으로 발현하는 세포 또는 세포주를 제시하고, 여기서 상기 세포 또는 세포주는 선별 압력의 부재에서 배양되고, 그리고 여기서 상기 세포 또는 세포주는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 적어도 하나의 기능적 단백질을 일시적으로 발현한다. 본 발명에 따라서 이용될 수 있는 생물학적 경로의 실례에는 접힘되지 않은 단백질 반응 ("UPR"); 세포 성장, 세포 생존능, 세포 사멸, 세포 건강; 단백질 발현, 생산, 접힘, 분비, 막 통합, 변형, 또는 당화 또는 효소 변형을 비롯한 번역후 변형에 관여하는 생물학적 경로; 다른 세포 유형에 비하여, 항체 생산 세포, 유선 세포, 타액 세포, 또는 조작된 단백질을 고도로 발현하는 세포가 풍부하거나, 또는 더욱 고도로 발현되거나 활성인 경로가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 명세서에서 기술된 임의의 세포가 생물학적 경로에 관여하는 기능적 RNA 또는 단백질을 발현하는 호스트 세포로서 이용될 수 있다. 생물학적 경로에 관여하는 적어도 하나의 기능적 RNA 또는 단백질을 발현하는데 이용될 수 있는 세포의 실례에는 CHO, CHOK1, CHOKiSV, PerC6, NS0, 293, 293T 및 곤충 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일부 구체예에서, CHO 세포는 UPR 경로의 적어도 하나의 성분을 발현하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, CHO 세포는 당화 경로의 적어도 하나의 성분을 발현하는데 이용될 수 있다. 일부 다른 구체예에서, 이들 세포는 당화되는 목적되는 단백질 (가령, 항체)을 더욱 발현한다.
일부 구체예에서, 생물학적 경로에 관여하는 목적되는 기능적 단백질을 인코딩하거나 이의 전사를 활성화시키는 핵산의 호스트 세포 내로의 도입에 앞서, 상기 호스트 세포는 상기 경로의 성분을 발현하지 않는다. 다른 구체예에서, 생물학적 경로에 관여하는 목적되는 기능적 단백질을 인코딩하거나 이의 전사를 활성화시키는 핵산의 호스트 세포 내로의 도입에 앞서, 상기 호스트 세포는 상기 경로의 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 또는 적어도 25가지 성분을 발현한다.
일부 구체예에서, 생물학적 경로의 하나 이상의 기능적 단백질 성분을 발현하는 것 이외에, 본 발명의 세포와 세포주는 또한, 예로써 이러한 생물학적 경로에서 하나 이상의 기능적 단백질 성분의 발현 또는 기능에 영향을 줌으로써 상기 생물학적 경로 및/또는 이의 성분 중에서 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 기능적 단백질을 발현한다. 이런 효과(들)에는 생물학적 경로에서 하나 이상의 기능적 단백질의 번역후 변형 (가령, 당화), 수율, 접힘, 조립 및/또는 분비가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 생물학적 경로 (가령, UPR, 세포 생존능, 단백질 생산, 접힘, 조립, 변형, 당화, 단백질분해, 분비, 세포 막 내로 통합, 세포 표면 제시 또는 이들의 조합에 관련되는 것들)에 관여할 수 있는 유전자 또는 RNA (돌연변이된, 절단접합된, 그리고 가공된 형태 포함), 그리고 이들에 의해 인코딩되는 발현 산물의 실례에는 절단접합된 ATF6a, IRE1a, IRE1b, PERCDC, ATF4, YYI, NF-YA, NF-YB, NF-YC, 절단접합된 XBP1, 그리고 EDEM1 (UPR 유전자); NRF2, HERP, XIAP, GADD34, PPI a, b와 g, 그리고 DNAJC3 (스위치-오프 유전자); 절단접합된 BLIMP-1 및 XBP1 (B 세포에서 발현된 유전자); CRT (CaBP3), CNX, ERp57 (PDIA3), BiP, BAP, ERdj3, CaBP1, GRP94 (CaBP4), ERp72 (PDIA4), 그리고 사이클로필린 B (접힘/분비 유전자 - 부류 1 샤프롱); BiP, BAP, ERdj3, CaBP1, GRP94 (CaBP4), ERp72 (PDIA4) 및 사이클로필린 B (부류 2 샤프롱); SDF2-L (당화 유전자); ERO1a 및 b, ERAD, 만노시다아제 (mannosidase) 1, HRD1 (산화 유전자); STC1 및 2, SERCA1 및 2, COD1 (칼슘 펌프); INO1, SREBP1DC, SREBP2DC, 그리고 PYC (지방형성/대사 유전자); Sec61Pa,b 및 g (수송/막 통합 유전자); 그리고 Bcl-2sp, Bcl-xL, Bim, Ku70, VDAC2, BAP31 및 14-3-3 (세포 생존능/항-아폽토시스 유전자)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
일부 구체예에서, 첫 번째 목적되는 단백질, 또는 기능적 생물학적 경로 또는 이의 하나 이상의 성분의 발현 이외에, 본 발명의 세포와 세포주는 또한, 적어도 두 번째 목적되는 단백질을 발현하고, 여기서 두 번째 목적되는 단백질의 발현은 첫 번째 목적되는 단백질 또는 기능적 생물학적 경로 또는 이의 하나 이상의 성분의 발현에 의해 영향을 받거나 변경된다. 이런 효과의 실례에는 mRNA 전사, 절단접합, 수송, 단백질 번역, 번역후 변형 (가령, 당화), 그리고 단백질 수송, 접힘, 조립, 막 통합, 분비 및 전체 생산 (수율)의 수준에서 효과가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 가령, 첫 번째 목적되는 단백질 또는 기능적 생물학적 경로 또는 이의 하나 이상의 성분의 발현은 두 번째 목적되는 단백질의 증가된 또는 더욱 효율적인 또는 정확한 mRNA 전사, 절단접합, 수송, 단백질 번역, 번역후 변형 (가령, 당화), 그리고 단백질 수송, 접힘, 조립, 막 통합, 분비 및/또는 전체 생산 (수율)을 유발할 수 있다. 일부 구체예에서, 두 번째 목적되는 단백질은 생물학적 약제이다. 생물학적 약제의 실례는 하기에 더욱 제시된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 항체 및 당화 경로를 공동-발현한다.
일부 구체예에서, 특히, 본 발명의 방법에 이용된 세포 또는 세포주에 의해 발현된 단백질은 세포 또는 유전자 조작 없이 상기 단백질을 정상적으로 발현하지 못하는 세포 유형의 세포에서 기능적 세포주가 이전에 가용하지 않았던 단백질이다. 이론에 한정됨 없이, 이런 세포주가 지금까지 가능하지 못했던 이유에는 이러한 단백질이 세포 또는 유전자 조작의 부재에서 고도로 복잡하거나, 또는 특수화된 또는 희귀한 세포에서만 발현되고, 그리고 이러한 단백질을 발현하는 다수의 세포를 준비하지 않으면, 상기 단백질이 적절하게 발현되거나, 조립되거나, 변형되거나, 국부화되거나, 기능적이거나, 부속 인자와 결합되거나, 또는 세포독성과 연관되지 않는 가능한 희귀한 조작된 세포 중에서 한 가지를 확인하는 것이 가능하지 않다는 점; 또는 이러한 단백질을 기능적 형태로 발현하는 세포 또는 세포주를 확인하는데 이용되는 상기 단백질의 리간드 또는 조절제가 공지되어 있지 않다는 점; 또는 이러한 단백질이 자연 환경의 범위를 넘어, 예를 들면, 자연적으로 발현되지 않는 양으로 발현될 때 세포독성이라는 점이 포함되는 것으로 생각된다.
세포질 내에 위치하는 단백질, 세포의 적어도 하나의 막과 통합되거나 결합되는 단백질, 세포-표면에 위치하는 단백질, 분비되는 단백질, 또는 이들의 임의의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 목적되는 단백질을 일관되게 발현하는 본 발명의 세포와 세포주가 만들어질 수 있다. 이런 단백질에는 이종다합체성 이온 채널, 리간드 개폐 (가령, GABA A 수용체), 이온 채널 (가령, CFTR), 이종다합체성 이온 채널, 전압 개폐 (가령, NaV), 이종다합체성 이온 채널, 비-리간드 개폐 (상피 나트륨 채널, ENaC), 이종이합체 GPCR (가령, 오피오이드 수용체, 단맛, 감칠맛 및 쓴맛을 비롯한 미각 수용체), 기타 GPCR, 고아 GPCR, GCC, 오피오이드 수용체, 성장 호르몬 수용체, 에스트로겐/hgh, 핵 또는 막 결합된 TGF 수용체, PPAR 핵 호르몬 수용체, 니코틴제/Ach, 면역 수용체, 예를 들면, B-세포/T-세포 수용체, 화학감각 수용체, 예를 들면, 신, 시원한, 차가운, 따뜻한, 뜨거운, 기름진, 지방산 또는 지질 맛 또는 느낌, 크림질 (creamyness), 촉감, 통증, 입맛 및 따끔거림에 대한 수용체가 포함된다.
본 발명의 세포와 세포주는 표 7-22에 열거된 임의의 단백질 또는 단백질 조합 (포유동물 G 단백질, 인간 고아 GPCR, 인간 오피오이드 수용체, 인간 후각 수용체, 개 후각 수용체, 모기 후각 수용체, 기타 이종다합체성 수용체 및 GABA 수용체)을 비롯한 기능적 단백질을 발현할 수 있다.
본 발명의 세포와 세포주는 세포가 시간의 흐름 동안 목적되는 기능적 단백질의 일관된 발현을 제공하는 것이 바람직한 임의의 용도에서, 그들을 특히 적합하게 만드는 다수의 속성을 갖는다. 단백질 및 상기 단백질의 기능의 발현에 적용되는 용어 "안정적인" 또는 "일관된" 은 용어 "안정적인 발현" 및 "일시적인 발현"이 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 일시적인 발현 또는 가변 기능을 갖는 세포로부터 본 발명의 세포와 세포주를 구별하도록 의도된다. 본 발명의 세포 또는 세포주는 적어도 2-4일 동안 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 20% 이하의 이형을 갖는 기능적 단백질의 안정적인 또는 일관된 발현을 나타낸다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주의 안정성이 일시적인 발현으로부터 구별될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주의 안정성은 하나 이상의 목적되는 RNA 또는 단백질에 대한 선별 압력의 부재에서 유지될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주의 안정성은 정상적으로 이용되거나, 또는 조작되는 세포 개체군 내로 목적되는 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 핵산의 도입 직후에 이용되거나, 또는 이들 핵산의 증폭된 사본 수 (copy number)를 갖는 세포 또는 세포주를 선별하는 방법 동안 정상적으로 이용되는 수준 또는 양에 비하여, 선별 압력 또는 약물의 최소 또는 감소된 수준 또는 양에서 유지될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주에서 관찰되는 안정성의 수준은 동일한 세포 유형의 평균 또는 대부분의 세포에서 생산된 세포 또는 세포주에서 달성될 수 있는 정상 수준에 비하여 더욱 높다. 일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주에서 관찰되는 안정성의 수준은 동일한 세포 유형의 평균 또는 대부분의 세포에서 생산된 세포 또는 세포주에서 달성될 수 있는 정상적인 값에 비하여, 목적되는 RNA 또는 단백질의 발현 수준, 활성 또는 기능에서 더욱 낮은 가변성 (variability)으로 특징된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주에서 목적되는 RNA 또는 단백질의 발현의 안정성의 지속 기간 동안 시간 길이는 동일한 세포 유형의 평균 또는 대부분의 세포에서 달성될 수 있는 정상적인 값에 비하여 더욱 길다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주의 안정성은 동일한 세포 유형의 정상적인 또는 대부분의 세포에서 달성될 수 있는 값에 비하여, 목적되는 RNA 또는 단백질의 발현과 관련하여 관찰되는 최소의 세포독성 또는 세포독성의 부재에서 유지될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주의 안정성은 동일한 세포 유형의 정상적인 또는 대부분의 세포에서 달성될 수 있는 값에 비하여, 배양 기간 동안 목적되는 RNA 또는 단백질의 기능적 형태, 기능, 생리 기능, 약리학, 조립, 국부화, 번역후 변형, 당화, 효소 변형, 단백질분해 변형 또는 화학량론의 최소 변경으로 또는 변경 없이 유지될 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 특성은 목적되는 RNA 또는 단백질의 발현 또는 기능을 조정하는 화합물을 이용한 세포 기초된 분석에서 세포 또는 세포주의 약리학적 프로필 또는 반응을 특성화함으로써 결정될 수 있다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 목적되는 기능적 RNA 또는 단백질을 발현한다, 즉, 이들 세포는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200일 동안 성장후 일관되게 기능적이고, 여기서 일관된 발현 또는 일관된 기능은 2 내지 4일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 이상; 5 내지 15일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10% 또는 12% 이상; 16 내지 20일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% 또는 20% 이상; 21 내지 30일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22% 또는 24% 이상; 30 내지 40일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 41 내지 45일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 45 내지 50일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 45 내지 50일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28%, 30% 또는 35% 이상; 50 내지 55일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 50 내지 55일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28%, 30% 또는 35% 이상; 55 내지 75일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이상; 75 내지 100일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 101 내지 125일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 126 내지 150일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 151 내지 175일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 176 내지 200일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 200일 이상의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상 변하지 않는 발현 수준을 지칭한다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 안정적이다, 즉, 이들 세포 또는 세포주는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200일 동안 목적되는 RNA 또는 단백질의 일관된 발현, 양, 수율, 기능 또는 활성을 유지하고, 여기서 "일관된"은 2 내지 4일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 이상; 5 내지 15일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10% 또는 12% 이상; 16 내지 20일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% 또는 20% 이상; 21 내지 30일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22% 또는 24% 이상; 30 내지 40일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 41 내지 45일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 45 내지 50일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 45 내지 50일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28%, 30% 또는 35% 이상; 50 내지 55일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 50 내지 55일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28%, 30% 또는 35% 이상; 55 내지 75일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이상; 75 내지 100일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 101 내지 125일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 126 내지 150일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 151 내지 175일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 176 내지 200일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 200일 이상의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상 변하지 않는 목적되는 RNA 또는 단백질의 발현, 양, 수율, 기능 또는 활성의 수준을 지칭한다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 안정적이다, 즉, 이들 세포 또는 세포주는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200일 동안 적어도 2개의 목적되는 RNA 또는 단백질의 일관된 발현, 양, 수율, 기능 또는 활성을 유지하고, 여기서 "일관된"은 2 내지 4일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 이상; 5 내지 15일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10% 또는 12% 이상; 16 내지 20일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% 또는 20% 이상; 21 내지 30일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22% 또는 24% 이상; 30 내지 40일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 41 내지 45일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 45 내지 50일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 45 내지 50일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28%, 30% 또는 35% 이상; 50 내지 55일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 50 내지 55일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28%, 30% 또는 35% 이상; 55 내지 75일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이상; 75 내지 100일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 101 내지 125일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 126 내지 150일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 151 내지 175일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 176 내지 200일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 200일 이상의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상 변하지 않는 목적되는 RNA 또는 단백질의 발현, 화학량론, 양, 수율, 기능 또는 활성의 수준을 지칭한다.
기능적 단백질의 안정적인 발현 이외에, 원하는 특성을 갖는 세포가 선별될 수 있다. 검출될 수 있는 임의의 원하는 특성에 대하여 선별될 수 있다. 당업자는 이런 특징을 인지할 것이다. 무제한적 실례로써, 이런 특성에는 취성, 형태 및 고체 표면에 부착, 트립신 또는 세포 해리 시약에 의한 단분산 (monodispersion), 자동화 배양 조건에 적응성 (순응성), 혈청-포함 조건 하에 성능, 혈청-없는 조건에서 성능, 혈청-없는 현탁 조건으로 전환가능성 (convertability), 덩어리를 형성하는 성향, 계대배양 이후에 단분산 세포 층을 형성하는 성향, 회복력 (resilience), 상이한 힘의 유체 첨가 단계 하에 성장 챔버 표면에 부착된 상태로 유지되는 성향, 비-단편화된 핵, 세포내 액포 (vacuole)의 부재, 미생물 오염의 부재, 미코플라스마 (mycoplasma)의 부재, 바이러스 오염의 부재, 클론형성능 (clonality), 웰 내에서 세포의 전체적인 물리적 특성의 일관성, 실온 미만/실온에서/실온 초과에서 성장의 성향, 다양한 기간 동안 다양한 온도의 내성에 대한 성향, 플라스미드/올리고뉴클레오티드/형광 프로브/펩티드/단백질/화합물을 균등하게 흡수하는 세포의 성향, DMSO/EtOH/MeOH와 함께 배양을 견뎌내는 세포의 성향, 유기 용매/세정제, 유지된 UPR 유도를 견뎌내는 세포의 성향, DTT에 노출을 견뎌내는 세포의 성향, 바이러스/렌티바이러스/코스미드 벡터로 감염되는 세포의 성향, 원하는 RNA(들)/단백질(들)의 내생적 발현 또는 이들의 결핍, 염색체 수, 염색체 변형, 5/6/7/8/9pH에서 성장에 순응성, UV/돌연변이원/방사에 내성, 변경된/수동/규모 확대된 성장 조건 (즉, 반응기 포함)하에 상기 특징을 유지하는 능력이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 발명의 세포와 세포주는 전통적인 방법에 의해 만들어진 세포와 세포주에 비하여 증진된 특성을 갖는다. 가령, 본 발명의 세포와 세포주는 발현 및/또는 발현 수준의 증진된 안정성을 갖는다 (심지어, 예로써, 항생제 및 기타 약물을 비롯한 선별 압력 없이 배양액에서 유지될 때). 다른 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 다양한 분석에서 높은 Z' 값을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 더욱 전통적으로 조작된 세포에 비하여, 생리학적으로 적절한 단백질 활성의 발현의 맥락에서 향상된다. 이들 특성은 조절제를 확인하는 분석, 세포 요법, 단백질 생산 또는 기타 용도 인지에 상관없이, 임의의 용도에 이용되는 본 발명의 세포와 세포주의 능력을 증진시키고 향상시키며, 그리고 확인된 조절제의 기능적 속성을 향상시킨다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주의 추가의 유익한 특성은 이들이 전형적으로 이용되거나, 또는 목적되는 단백질을 인코딩하는 핵산의 세포 내로의 도입 직후에 이용될 수 있거나, 또는 핵산의 증폭된 사본 수를 갖는 세포를 선별하는 절차 동안 이용될 수 있는 감소된 약물 또는 기타 선별 압력으로, 또는 이러한 선별 압력의 부재에서 목적되는 단백질을 안정적으로 발현한다는 점이다. 이론에 한정됨 없이, 목적되는 RNA 또는 단백질을 정상적으로 발현하지 않는 세포 유형의 세포에서 목적되는 RNA 또는 단백질의 발현과 연관된 세포독성은 목적되는 RNA 또는 단백질의 비-세포독성 발현에 충분한 조건이 조작된 세포에서 근사되거나 재현되지 않는다는 것을 반영할 수 있다. 일정한 구체예에서, 이런 목적되는 RNA 또는 단백질의 발현과 연관된 세포독성이 감소하거나 부재하는 조작된 세포가 바람직한데, 그 이유는 감소된 또는 부재하는 세포독성이 목적되는 RNA 또는 단백질의 발현 또는 기능을 위한 향상된 조건이 달성되었음을 지시할 수 있기 때문이다. 일정한 구체예에서, 조작된 세포 또는 세포주는 자연적으로 발현되지 않거나, 또는 세포 또는 유전자 조작의 부재에서 동일한 유형의 세포에서 연관된 세포독성 없이 자연적으로 발현되지 않는 목적되는 RNA 또는 단백질을 발현할 수 있다. 일정한 구체예에서, 조작된 세포 또는 세포주는 세포 또는 유전자 조작의 부재에서 동일한 유형의 세포에서 자연적으로, 기능적으로 또는 적절하게 발현되거나, 접힘되거나, 조립되거나, 변형되거나, 번역후 변형되거나, 국부화되거나 또는 활성적이지 않은 목적되는 RNA 또는 단백질을 발현할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 동일한 세포 유형의 평균 또는 대부분의 세포에서 발현될 때 이전에 세포독성인 것으로 간주되었던 목적되는 RNA 또는 단백질의 기능적, 안정적인, 생존가능 또는 비-세포독성 발현을 포함하는 세포 또는 세포주를 산출한다. 따라서 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 임의의 선별 압력 없이 배양 동안 유지된다. 진전된 구체예에서, 세포와 세포주는 임의의 약물 또는 항생제 없이 유지된다. 본 명세서에서, 세포 유지는 단백질 발현에 대하여 앞서 기술된 바와 같이 선별된 이후에, 세포를 배양하는 것을 지칭한다. 유지는 세포 내로 도입된 마커(들)가 혼성 개체군에서 안정적인 형질감염체의 농축을 가능하게 하는 세포 분류에 앞서, 선별 압력 (가령, 항생제) 하에 세포를 성장시키는 선택적 단계를 지칭하지 않는다.
본 발명의 세포와 세포주의 약물-없는 및 선별 압력-없는 세포 유지는 다수의 이점을 제공한다. 가령, 약물-내성 세포는 목적되는 공동-형질감염된 도입유전자를 적절한 수준으로 발현하지 못할 수도 있는데, 그 이유는 이러한 선별이 도입유전자와 함께 또는 도입유전자 없이, 약물 내성 유전자를 흡수하는 세포의 생존에 의존하기 때문이다. 게다가, 목적되는 RNA 또는 단백질의 발현 또는 기능을 유지하기 위한 약물 선별 또는 기타 선별 압력에 대한 필요조건의 세포독성은 목적되는 RNA 또는 단백질의 발현 또는 기능을 위한 최적 조건이 달성되지 않았음을 지시할 수 있다. 게다가, 선별 약물 및 기타 선별 압력 인자는 종종, 돌연변이유발성이거나, 또는 세포의 생리를 달리 간섭하여 세포-기초된 분석에서 편중된 결과를 유발한다. 가령, 선별 약물은 아폽토시스에 대한 감수성을 감소시키고 (Robinson et al., Biochemistry, 36(37):11169-11178 (1997)), DNA 수복 및 약물 대사를 증가시키고 (Deffie et al., Cancer Res. 48(13):3595-3602 (1988)), 세포 pH를 증가시키고 (Thiebaut et al., J Histochem Cytochem. 38(5):685-690 (1990); Roepe et al., Biochemistry. 32(41):11042-11056 (1993); Simon et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 91(3):1128-1132 (1994)), 리소솜과 엔도솜 pH를 감소시키고 (Schindler et al., Biochemistry. 35(9):2811-2817 (1996); Altan et al., J Exp Med. 187(10):1583-1598 (1998)), 원형질 막 전위를 감소시키고 (Roepe et al., Biochemistry. 32(41):11042-11056 (1993)), 염화물 (Gill et al., Cell. 71(1):23-32 (1992)) 및 ATP (Abraham et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 90(1):312-316 (1993))에 대한 원형질 막 전도성을 증가시키고, 그리고 소포 수송 속도를 증가시킨다 (Altan et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 96(8):4432-4437 (1999)). 따라서 본 발명의 세포와 세포주는 선별 압력에 의해 유발된 인공물 (artifact)로부터 자유로운 스크리닝 분석을 가능하게 한다. 일부 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 원하는 특성을 갖는 세포와 세포주가 농축된 세포 개체군으로 시작되지 않을 때에도 분류에 의해 분리되도록, 세포 분류 이전에 또는 이후에 선별 압력 인자, 예를 들면, 항생제와 함께 배양되지 않는다.
본 발명의 세포와 세포주는 발현 및 발현 수준 (RNA 또는 단백질)의 맥락에서 전통적인 방법에 의해 생산된 세포와 세포주에 비하여 증진된 안정성을 갖는다. 이런 안정적인 발현에 의해 특징되는 세포와 세포주를 확인하기 위하여, 목적되는 단백질의 세포 또는 세포주의 발현이 시간 경과 동안 측정되고, 그리고 발현 수준이 비교된다. 안정적인 세포주는 이러한 시간 경과 내내 지속적으로 발현할 것이다 (RNA 또는 단백질). 본 발명의 일부 측면에서, 이러한 시간 경과는 적어도 1주, 2주, 3주 등, 또는 적어도 1개월, 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개월, 또는 그 사이에 임의의 시간 기일일 수 있다.
분리된 세포와 세포주는 발현되는 (RNA) 절대적 양 및 상대적 양 (목적되는 다중아단위 단백질 또는 복합 단백질의 경우에)을 결정하기 위하여 예로써, PCR, RT-PCR, qRT-PCR 및 단일 종점 RT-PCR에 의해 더욱 특성화될 수 있다. 바람직하게는, 다중-아단위 단백질의 아단위의 확장 수준은 본 발명의 세포와 세포주에서 실질적으로 동일하다.
다른 구체예에서, 목적되는 기능적 단백질의 발현은 시간의 흐름 동안 평가된다. 이들 구체예에서, 안정적인 발현은 시간 경과 동안 기능 분석의 결과를 비교함으로써 측정된다. 기능 분석에 기초된 세포 및 세포주 안정성의 분석은 단백질 (RNA 또는 단백질)을 안정적으로 발현할 뿐만 아니라 상기 단백질을 안정적으로 생산하고 적절하게 가공 (가령, 번역후 변형, 아단위 조립, 그리고 세포 내에서 국부화)하여 기능적 단백질을 생산하는 세포와 세포주를 확인하는 이점을 제공한다.
본 발명의 세포와 세포주는 그들의 Z' 인자에 의해 입증되는 바와 같이, 높은 재현성 (reproducibility)을 갖는 분석법을 제공하는 추가의 유익한 특성을 갖는다 (참조: Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR, "A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays." J. Biomol. Screen. 1999;4(2):67-73, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). Z' 값은 세포 또는 세포주의 품질에 관계하는데, 그 이유는 이것이 세포 또는 세포주가 조절제에 일관되게 반응하는 정도를 반영하기 때문이다. Z'는 멀티웰 평판 전역에서 참고 화합물에 대한 기능적 반응의 신호-대-잡음 범위 (signal-to-noise range) 및 신호 가변성 (즉, 웰에서부터 웰까지)을 고려하는 통계학적 계산 결과이다. Z'는 양성 대조를 갖는 멀티웰 및 음성 대조를 갖는 멀티웰로부터 획득된 데이터를 이용하여 계산된다. 평균 값에서, 차이 인자에 3이 곱셈된 통합 표준 편차 (combined standard deviation)의 비율은 하기 방정식에 따라서, Z' 인자를 제공하기 위하여 1로부터 뺄셈된다:
Z' 인자 = 1 - ((3σ양성 대조 + 3σ음성 대조)/ (μ양성 대조 - μ음성 대조))
상기 인자가 1.0이면, 이는 이론적 최대 Z' 가변성 없음 및 무제한의 동적 범위 (dynamic range)를 갖는 이상적인 분석법을 지시할 것이다. 본 명세서에서, "높은 Z'"는 적어도 0.6, 적어도 0.7, 적어도 0.75 또는 적어도 0.8, 또는 0.6과 1.0 사이에 임의의 소수의 Z'의 Z' 인자를 지칭한다. 복수 표적의 경우에, 높은 Z'는 적어도 0.4 또는 그 이상의 Z'를 의미한다. 0에 가까운 스코어는 바람직하지 않은데, 그 이유는 이것이 양성 대조와 음성 대조 사이에 겹침이 존재한다는 것을 지시하기 때문이다. 업계에서, 단순한 세포-기초된 분석의 경우에, 0.3까지 Z' 스코어는 한계 스코어 (marginal score)인 것으로 간주되고, 0.3과 0.5 사이의 Z' 스코어는 조건에 맞는 것으로 간주되고, 그리고 0.5 초과의 Z' 스코어는 우수한 것으로 간주된다. 세포-없는 또는 생화학적 분석은 더욱 높은 Z' 스코어에 접근할 수 있지만, 세포-기초된 시스템에 대한 Z' 스코어는 세포-기초된 시스템이 복잡하기 때문에 더욱 낮아지는 경향이 있다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 단일 사슬 단백질을 발현하는 전통적인 세포를 이용한 세포-기초된 분석도 전형적으로, 0.5 내지 0.6보다 높은 Z'를 달성하지 못한다. 다중-아단위 단백질의 조작된 발현 (도입된 코딩 서열 또는 유전자 활성화로부터)을 갖는 세포는 당해 분야에서 보고된 바와 같이, 그들의 추가된 복잡성 (complexity)으로 인하여 더욱 낮아질 수 있을 것이다. 이런 세포는 분석에 이용하기에는 신뢰성이 없는데, 그 이유는 그 결과가 재현성이 없을 것이기 때문이다. 다른 한편, 본 발명의 세포와 세포주는 더욱 높은 Z' 값을 갖고, 그리고 분석에서 일관된 결과를 유리하게 산출한다. 실제로, 본 발명의 세포와 세포주는 고처리량 스크리닝 (HTS) 적합성 분석을 위한 기초를 제공하는데, 그 이유는 이들이 일반적으로, 전통적으로 생산된 세포와 다른 값을 갖기 때문이다. 본 발명의 일부 측면에서, 이들 세포와 세포주는 적어도 0.3, 적어도 0.4, 적어도 0.5, 적어도 0.6, 적어도 0.7, 또는 적어도 0.8의 Z'를 산출한다. 심지어, 본 발명의 세포와 세포주에 대한 적어도 0.3 - 0.4의 Z' 값이 유리한데, 그 이유는 목적되는 단백질이 다중유전자 표적 (multigene target)이기 때문이다. 본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 세포와 세포주는 이들 세포가 복수 계대배양, 예를 들면, 5 내지 20 사이에 임의의 정수를 비롯한 5 내지 20회 계대배양 동안 유지된 이후에도 적어도 0.7, 적어도 0.75 또는 적어도 0.8의 Z'를 산출한다. 본 발명의 일부 측면에서, 이들 세포와 세포주는 1, 2, 3, 4 또는 5주, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간 동안 유지된 세포와 세포주에서 적어도 0.7, 적어도 0.75 또는 적어도 0.8의 Z'를 산출한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 한 가지 이상의 생리학적 특성이 시간의 흐름 동안 실질적으로 일정하게 존속하는 목적되는 단백질을 발현한다.
생리학적 특성에는 목적되는 단백질의 발현과 별개로, 세포 또는 세포주의 임의의 관찰가능, 검출가능 또는 측정가능 특성이 포함된다.
일부 구체예에서, 목적되는 단백질의 발현은 한 가지 이상의 생리학적 특성을 변경할 수 있다. 생리학적 특성의 변경은 목적되는 단백질의 발현에 기인한 생리학적 특성의 임의의 변화, 예를 들면, 생리학적 특성의 자극, 활성화, 또는 증가, 또는 생리학적 특성의 저해, 차단, 또는 감소를 포함한다. 이론에 한정됨 없이, 이들 구체예에서, 한 가지 이상의 일정한 생리학적 특성은 목적되는 단백질의 기능적 발현 역시 일정하다는 것을 지시한다. 특정한 구체예에서, 하기에 더욱 상세하게 논의되는 미각 수용체 (가령, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 또는 쓴맛 수용체)와 연관된 한 가지 이상의 일정한 물리적 특성은 기능적 미각 수용체의 발현을 모니터링하는데 이용될 수 있다. 이론에 한정됨 없이, 본 발명에서는 일정한 배양 조건 하에 목적되는 단백질을 발현하는 복수의 세포 또는 세포주를 배양하는 방법을 제시하고, 여기서 한 가지 이상의 원하는 특성, 예를 들면, 목적되는 단백질의 안정적인 발현 및/또는 한 가지 이상의 실질적으로 일정한 생리학적 특성을 갖는 세포 또는 세포주가 선별될 수 있다.
생리학적 특성이 측정될 수 있는 일정한 구체예에서, 생리학적 특성은 복수의 세포 또는 한 가지 세포주의 복수의 세포에서 측정된 생리학적 특성의 평균으로서 결정된다. 특정한 구체예에서, 생리학적 특성은 적어도 10; 100; 1,000; 10,000; 100,000; 1,000,000; 또는 적어도 10,000,000개의 세포에서 측정되고, 그리고 평균은 시간의 흐름 동안 실질적으로 일정하다.
일부 구체예에서, 생리학적 특성의 평균은 복수의 세포 또는 한 가지 세포주의 복수의 세포에서 생리학적 특성을 측정함으로써 결정되고, 여기서 상기 세포는 세포 주기의 상이한 단계에 있다. 다른 구체예에서, 이들 세포는 세포 주기에 대하여 동기화된다.
일부 구체예에서, 생리학적 특성은 단일 세포 수준에서 관찰되거나, 검출되거나, 측정되거나, 또는 모니터링된다. 일정한 구체예에서, 생리학적 특성은 단일 세포 수준에서 시간의 흐름 동안 실질적으로 일정하다.
일정한 구체예에서, 생리학적 특성은 12시간 동안 0.1%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이상 변하지 않으면 시간의 흐름 동안 실질적으로 일정하다. 일정한 구체예에서, 생리학적 특성은 1일 동안 0.1%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이상 변하지 않으면 시간의 흐름 동안 실질적으로 일정하다. 일정한 구체예에서, 생리학적 특성은 2일 동안 0.1%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이상 변하지 않으면 시간의 흐름 동안 실질적으로 일정하다. 일정한 구체예에서, 생리학적 특성은 5일 동안 0.1%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이상 변하지 않으면 시간의 흐름 동안 실질적으로 일정하다. 일정한 구체예에서, 생리학적 특성은 10일 동안 0.1%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이상 변하지 않으면 시간의 흐름 동안 실질적으로 일정하다. 일정한 구체예에서, 생리학적 특성은 20일 동안 0.1%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이상 변하지 않으면 시간의 흐름 동안 실질적으로 일정하다. 일정한 구체예에서, 생리학적 특성은 30일 동안 0.1%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이상 변하지 않으면 시간의 흐름 동안 실질적으로 일정하다. 일정한 구체예에서, 생리학적 특성은 40일 동안 0.1%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이상 변하지 않으면 시간의 흐름 동안 실질적으로 일정하다. 일정한 구체예에서, 생리학적 특성은 50일 동안 0.1%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이상 변하지 않으면 시간의 흐름 동안 실질적으로 일정하다. 일정한 구체예에서, 생리학적 특성은 60일 동안 0.1%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이상 변하지 않으면 시간의 흐름 동안 실질적으로 일정하다. 일정한 구체예에서, 생리학적 특성은 70일 동안 0.1%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이상 변하지 않으면 시간의 흐름 동안 실질적으로 일정하다. 일정한 구체예에서, 생리학적 특성은 80일 동안 0.1%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이상 변하지 않으면 시간의 흐름 동안 실질적으로 일정하다. 일정한 구체예에서, 생리학적 특성은 90일 동안 0.1%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이상 변하지 않으면 시간의 흐름 동안 실질적으로 일정하다. 일정한 구체예에서, 생리학적 특성은 1회 계대배양, 2회 계대배양, 3회 계대배양, 5회 계대배양, 10회 계대배양, 25회 계대배양, 50회 계대배양, 또는 100회 계대배양의 과정 동안 0.1%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이상 변하지 않으면 시간의 흐름 동안 실질적으로 일정하다.
세포 생리학적 특성의 실례에는 성장 속도, 크기, 형상, 형태, 체적; DNA, RNA, 단백질, 지질, 이온, 탄수화물 또는 물의 프로필 또는 함량; 내생적, 조작된, 도입된, 유전자-활성화된 또는 전체 유전자, RNA 또는 단백질 발현 또는 함량; 부착, 현탁, 혈청-포함, 혈청-없는, 동물-성분 없는, 진탕된, 정적 또는 생물반응기 성장 조건에서 성장에 대한 성향 또는 순응성; 칩, 어레이, 마이크로어레이, 슬라이드, 접시, 평판, 멀티웰 평판, 고밀도 멀티웰 평판, 플라스크, 롤러 배양병, 백 또는 탱크 내에서 또는 상에서 성장에 대한 성향 또는 순응성; 수동 또는 자동화 또는 로봇식 세포 배양 방법을 이용한 성장에 대한 성향 또는 순응성; 세포질, 핵인, 핵, 리보솜, 조면 소포체, 골지체, 세포골격, 활면 소포체, 미토콘드리아, 액포, 세포질, 리소솜, 중심소체, 원형질체, 세포 막, 형질 세포 막, 핵 막, 핵 외피, 소포 (가령, 분비 소포), 또는 적어도 하나의 소기관의 막이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 적어도 하나의 세포 소기관, 구획 또는 막의 존재비 (abundance), 수준, 총수, 양 또는 조성; 줄기 세포, 다능성 세포, 전능성 세포 또는 간, 폐, 피부, 근육 (심장 근육, 골격 근육, 횡문근 포함), 췌장, 뇌, 고환, 난소, 혈액, 면역계, 신경계, 골, 심혈관계, 중추신경계, 위장관, 위, 갑상선, 혀, 담낭, 신장, 코, 눈, 손발톱, 머리카락, 미뢰 세포 또는 미각 세포 중에서 한 가지를 포함하는 특수화된 또는 조직 특이적 세포, 뉴런, 피부, 췌장, 혈액, 면역, 적혈구 세포, 적혈구 세포, 킬러 T-세포, 장내분비 세포, 분비 세포, 신장, 상피 세포, 내피 세포, 인간, 동물 또는 식물 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 하나 이상의 특정한 세포 유형 또는 분화된, 분화되지 않은 또는 역분화된 세포 유형에 의해 공유되는 적어도 하나의 기능적 또는 유전자 발현 프로필 (하나 이상의 유전자의)을 획득하는 능력 또는 성향; 핵산, RNA, DNA, 단백질, 소형 분자, 프로브, 염료, 올리고뉴클레오티드 (변형된 올리고뉴클레오티드 포함) 또는 형광 올리고뉴클레오티드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 자연 또는 합성 화학물질 또는 분자를 흡수하는 능력 또는 수용력; 감염, 약물, 화학물질, 병원균, 세정제, UV, 유해한 조건, 차가움, 뜨거움, 극한의 온도, 진탕, 교반, 와동, 산소 결핍 또는 낮은 수준의 산소, 영양소 결핍 또는 낮은 수준의 영양소, 독소, 독액, 바이러스 또는 화합물, 세포 또는 세포 성장에 부정적인 영향을 주는 처리 또는 작인에 내성이 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 세포 성장, 기능 또는 생존능에 부정적인 영향을 주는 화학물질 또는 물질의 부정적인 또는 유해한 효과에 내성, 또는 이들 효과에 저항하는 능력; 대규모 세포 배양액, 축소된 세포 배양액, 자동화 세포 배양액, 로봇식 세포 배양액, 표준화된 세포 배양액, 약물 발견, 고처리량 스크리닝, 세포 기초된 분석, 기능적 세포 기초된 분석 (막 전위 분석, 칼슘 유동 분석, 리포터 분석, G-단백질 리포터 분석 포함), ELISA, 시험관내 분석, 생체내 적용, 이차 시험, 화합물 시험, 결합 분석, 패닝 (panning) 분석, 항체 패닝 분석, 파지 전시, 영상 연구, 현미경 영상 분석, 면역형광 연구, RNA, DNA, 단백질 또는 생물학적 생산 또는 정제, 백신 개발, 세포 요법, 생명체, 동물, 인간 또는 식물 내로 이식, 세포에 의해 분비된 인자의 분리, cDNA 라이브러리의 제조, 또는 병원균, 바이러스 또는 기타 병원체에 의한 감염이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 시험관내 검사, 세포 기초된 분석, 생화학적 또는 생물학적 검사, 이식, 세포 요법 또는 이차 분석에서 이용의 적합성; 그리고 다른 관찰가능, 측정가능, 또는 검출가능 생리학적 특성, 예를 들면, 적어도 하나의 대사산물, 지질, DNA, RNA 또는 단백질의 생합성; 염색체 침묵, 활성화, 이질 염색질 형성 (heterochromatization), 진정 염색질 형성 (euchromoatinization) 또는 재조합; 유전자 발현, 유전자 침묵, 유전자 절단접합, 유전자 재조합 또는 유전자-활성화; RNA 생산, 발현, 전사, 가공 절단접합, 수송, 국부화 또는 변형; 단백질 생산, 발현, 분비, 접힘, 조립, 수송, 국부화, 세포 표면 제시, 분비, 또는 세포 또는 세포 소기관 막 내로 통합; 번역후 변형, 가공, 효소 변형, 단백질분해, 당화, 인산화, 탈인산화가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 단백질 변형; 유사분열, 감수분열 또는 분열 또는 세포 융합을 비롯한 세포 분열; 높은 수준 RNA 또는 단백질 생산 또는 수율이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
생리학적 특성은 Current Protocols 연속 간행물과 같은 참고 가이드와 매뉴얼에서 기술된 검사 방법이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 당분야에서 공지된 일과적인 분석을 이용하여 관찰되거나, 검출되거나, 또는 측정될 수 있다. 이러한 연속 간행물은 다양한 분야에서 일반 프로토콜을 포함하고, 그리고 Wiley Publishing House를 통해 구입가능하다. 이들 참고 가이드에서 프로토콜은 세포의 생리학적 특성을 관찰하거나, 검출하거나, 또는 측정하는데 이용될 수 있는 방법의 예시이다. 이들 방법 중에서 한 가지 이상이 본 명세서에 개시된 생리학적 특성을 관찰하거나, 검출하거나, 또는 측정하는데 이용될 수 있음은 당업자에 의해 이의 없이 인지될 것이다.
세포 내에서 리보솜, 미토콘드리아, ER, rER, 골지, TGN, 소포, 엔도솜 및 원형질 막이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 세포 구획 또는 세포 소기관의 수준, 활성 또는 함량을 측정하는데 이용될 수 있는, 자가형광 단백질을 포함하는 융합 단백질로서 발현된 단백질 마커를 비롯한 많은 마커, 염료 또는 리포터는 개별 생존가능 세포의 검사에 적합하다. 일정한 구체예에서, 형광 활성화된 세포 분류 또는 세포 분류기가 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 목적되는 RNA 또는 단백질을 포함하는 분리되거나 생산된 세포 또는 세포주는 목적되는 RNA 또는 단백질을 포함하는 세포 또는 세포주의 분리, 검사 또는 생산과 동일한 시점에, 이후에, 또는 이전에 이들 마커, 염료 또는 리포터를 이용하여 조사될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 구획 또는 세포 소기관 중에서 하나 이상의 수준, 활성 또는 함량은 목적되는 RNA 또는 단백질의 향상된, 증가된, 고유, 비-세포독성, 생존가능 또는 최적 발현, 기능, 활성, 접힘, 조립 변형, 번역후 변형, 분비, 세포 표면 제시, 막 통합, 약리학, 수율 또는 생리 기능과 상관될 수 있다. 일부 구체예에서, 목적되는 RNA 또는 단백질의 향상된, 증가된, 고유, 비-세포독성, 생존가능 또는 최적 발현, 기능, 활성, 접힘, 조립 변형, 번역후 변형, 분비, 세포 표면 제시, 막 통합, 약리학, 수율 또는 생리 기능과 상관되는 적어도 하나의 세포 구획 또는 세포 소기관의 수준, 활성 또는 함량을 포함하는 세포 또는 세포주가 분리될 수 있다. 일부 구체예에서, 목적되는 RNA 또는 단백질 및 목적되는 RNA 또는 단백질의 향상된, 증가된, 고유, 비-세포독성, 생존가능 또는 최적 발현, 기능, 활성, 접힘, 조립 변형, 번역후 변형, 분비, 세포 표면 제시, 막 통합, 약리학, 수율 또는 생리 기능과 상관되는 적어도 하나의 세포 구획 또는 세포 소기관의 수준, 활성 또는 함량을 포함하는 세포 또는 세포주가 분리될 수 있다. 일정한 구체예에서, 세포의 분리는 세포 분류 또는 형광 활성화된 세포 분류를 이용하여 수행된다.
일부 구체예에서, 목적되는 RNA 또는 단백질을 포함하도록 조작될 수 있는 다양한 세포의 개체군은 목적되는 RNA 또는 단백질을 포함하도록 조작된 세포 또는 세포주의 분리, 검사 또는 생산과 동일한 시점에, 이전에 또는 이후에, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175 또는 200개의 추가 핵산 서열에 노출되거나, 이들 핵산 서열이 도입되거나, 또는 이들 핵산 서열을 포함하도록 조작될 수 있다. 일정한 구체예에서, 추가 핵산은 접힘되지 않은 단백질 반응 (UPR)의 조절제를 인코딩하는 RNA, DNA 또는 유전자; UPR 동안 또는 UPR의 상태에서 조절되는 RNA, DNA, 또는 유전자; 세포 성장, 세포 생존능, 세포 사멸, 세포 건강을 조절하는 RNA, DNA, 또는 유전자; RNA 또는 단백질 발현, 생산, 접힘, 분비, 수율, 막 통합, 변형, 또는 당화 또는 효소 변형을 비롯한 번역후 변형을 조절하는 RNA, DNA, 또는 유전자; 다른 세포 유형에 비하여 항체 생산 세포가 풍부한 RNA, DNA 또는 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
일부 구체예에서, 세포 내에서 적어도 하나의 핵산의 발현은 목적되는 RNA 또는 단백질의 향상된, 증가된, 고유, 비-세포독성, 생존가능 또는 최적 발현, 기능, 활성, 접힘, 조립 변형, 번역후 변형, 분비, 세포 표면 제시, 막 통합, 약리학, 수율 또는 생리 기능과 상관될 수 있다. 일부 구체예에서, 목적되는 RNA 또는 단백질의 향상된, 증가된, 고유, 비-세포독성, 생존가능 또는 최적 발현, 기능, 활성, 접힘, 조립 변형, 번역후 변형, 분비, 세포 표면 제시, 막 통합, 약리학, 수율 또는 생리 기능과 상관되는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 세포 또는 세포주가 분리될 수 있다. 목적되는 RNA 또는 단백질을 포함하도록 조작될 수 있는 다양한 세포의 개체군은 목적되는 RNA 또는 단백질을 포함하도록 조작된 세포 또는 세포주의 분리, 검사 또는 생산과 동일한 시점에, 이전에 또는 이후에, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175 또는 200개의 추가 핵산 서열에 노출되거나, 이들 핵산 서열이 도입되거나, 또는 이들 핵산 서열을 포함하도록 조작될 수 있고, 그리고 목적되는 RNA 또는 단백질 및 목적되는 RNA 또는 단백질의 향상된, 증가된, 고유, 비-세포독성, 생존가능 또는 최적 발현, 기능, 활성, 접힘, 조립 변형, 번역후 변형, 분비, 세포 표면 제시, 막 통합, 약리학, 수율 또는 생리 기능과 상관되는 적어도 하나의 세포 구획 또는 세포 소기관의 수준, 활성 또는 함량을 포함하는 세포 또는 세포주가 분리될 수 있다. 일정한 구체예에서, 세포의 분리는 세포 분류 또는 형광 활성화된 세포 분류를 이용하여 수행된다.
세포 또는 세포로부터 만들어진 조직 표본은 예로써, 기능적, 생존가능 또는 안정적인 발현, 또는 세포-생리학적 특성에 영향을 줌으로써 발현되면 표적의 발현에 영향을 주거나, 이익을 주거나, 또는 악영향을 주는 하나 이상의 유전자의 발현 프로필을 확인하기 위한 염기서열분석, PCR, RT-PCR, qRT-PCR을 비롯한 PCR 방법, RACE, 노던과 서던 블롯, FISH, in situ 혼성화를 비롯한 혼성화 방법, 형광, 전자, 공초점 또는 면역형광 검경을 비롯한 검경, 또는 어레이 또는 마이크로어레이 검사, 예를 들면, 유전자칩 또는 단백질 어레이를 비롯한 방법과 검사를 이용하여, DNA, RNA, 단백질 함량, 조직, 발현 또는 프로필을 분석하기 위하여 조사될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이런 검사는 목적되는 단백질의 기능적, 생존가능 또는 안정적인 발현, 또는 목적되는 생리학적 특성에 영향을 주거나, 이익을 주거나, 또는 악영향을 주는 하나 이상의 내생적 인자를 확인하기 위하여 수행된다.
세포 또는 세포로부터 만들어진 조직 표본은 원심분리, 초원심분리, 부유, 수크로오스 농도차, HPLC, FPLC, 세포하 분획, 대사산물 분석, 화학적 조성물 분석, 염색체 전개, DAPI 라벨링, NMR, 효소 분석, ELISA를 비롯한 방법과 검사를 이용하여, 대사산물, DNA, RNA, 단백질, 막, 지질, 탄수화물 또는 세포 소기관을 비롯한 세포 내용물을 분석하거나 특성화하기 위하여 조사될 수 있다.
세포에 의해 생산된 단백질은 염기서열분석, 항체 결합 ELISA 또는 활성 분석을 이용하여, 이의 서열, 기능, 형태, 접힘, 막 통합, 존재비, 수율, 번역후 변형, 당화, 인산화, 절단, 단백질분해 또는 분해를 평가하기 위하여 조사될 수 있다.
세포는 세포 성장, 유사분열, 감수분열, 유전자 통합, 유전자 활성화, 유전자 도입 또는 유전자 발현 또는 침묵에 대한 검사에 의해 조사되고 특성화될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이런 검사는 세포의 게놈 내에 임의의 도입유전자의 통합 부위를 확인하기 위하여 수행된다.
일부 구체예에서, 본 발명에 따른 세포 또는 세포주의 발현 프로필 (가령, 유전자 발현 또는 단백질 발현의 프로필)은 참고 세포 또는 세포주의 발현 프로필에 비교될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 방법이 하나 이상의 핵산 또는 아미노산 서열의 발현 프로필을 측정하는데 이용될 수 있다. 예시적인 방법은 유전자 칩, 단백질 칩 등이다. 일부 구체예에서, 게놈 내에 유전자 중에서 적어도 0.1%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100%의 발현이 평가된다. 일부 구체예에서, 세포 내에 핵산 또는 아미노산 서열 중에서 적어도 0.1%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100%가 평가된다. 일부 구체예에서, 게놈 내에 유전자 중에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 또는 그 이상의 발현이 평가된다. 일부 구체예에서, 세포 내에서 핵산 또는 아미노산 서열 중에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 또는 그 이상이 평가된다.
일부 구체예에서, 참고 세포 또는 세포주는 본 발명에 따른 세포 또는 세포주가 산출된 호스트 세포이다. 다른 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주 및 참고 세포 또는 세포주는 동일한 부모 클론으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주 및 참고 세포 또는 세포주는 동일한 부모 세포로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 참고 세포 또는 세포주는 본 발명에 따른 세포 또는 세포주가 근사하도록 설계된 세포 유형의 세포 또는 세포주이다. 이런 세포 유형에는 외피 켈틴 생성 세포 (분화성 외피 세포), 외피 기초세포 (줄기 세포), 손톱과 발톱의 켈틴 생성 세포, 손톱 바닥 기초세포 (줄기 세포), 골수 모간 세포, 외피 모간 세포, 표피 모간 세포, 표피 모근초 세포, 헉슬리층 (Huxley's layer)의 모근초 세포, 헨레층 (Henle's layer)의 모근초 세포, 외부 모근초 세포, 털기질 세포 (줄기 세포), 각막, 혀, 구강, 식도, 항문, 하부 요도 및 질의 중층 편평 상피세포의 표면 상피 세포, 각막, 혀, 구강, 식도, 항문, 하부 요도 및 질의 상피의 기초세포 (줄기 세포), 비뇨기 상피세포 (방광 및 요도 내층), 타액선 점액 세포 (다당류-풍부한 분비), 타액선 장액 세포 (당단백질 효소-풍부한 분비), 혀에서 폰 에브너선 (von Ebner's gland) 세포 (미뢰 세척), 유선 세포 (모유 분비), 누액선 세포 (눈물 분비), 귀에서 귀지선 세포 (왁스 분비), 에크린한선 (eccrine sweat gland) 어두운 세포 (당단백질 분비), 에크린한선 밝은 세포 (소형 분자 분비), 아포크린한선 (apocrine sweat gland) 세포 (냄새나는 분비, 성-호르몬 민감성), 눈꺼풀에서 Moll 세포의 선 (특수화된 한선), 피지선 세포 (지질-풍부한 피지 분비), 코에서 보우만선 (bowman's gland) 세포 (후각 상피세포 세척), 십이지장에서 부르너선 (Brunner's gland) 세포 (효소 및 알칼리성 점액), 정낭 세포 (수영하는 정자를 위한 프럭토오스를 비롯한 정액 성분을 분비한다), 전립선 세포 (정액 성분을 분비한다), 요도구선 (bulbourethral gland) 세포 (점액 분비), 바르톨린선 (Bartholin's gland) 세포 (질 윤활제 분비), Littre 세포의 선 (점액 분비), 자궁 내막 세포 (탄수화물 분비), 기도와 소화관의 분리된 배상 세포 (점액 분비), 장 내층 점액 세포 (점액 분비), 위액 분비선 발효성 세포 (펩시노겐 분비), 위액 분비선 산분비 세포 (염산 분비), 췌장 선방 세포 (중탄산염 및 소화 효소 분비), 소장의 호산성과립세포 (리소자임 분비), 폐의 II형 허파꽈리세포 (계면활성제 분비), 폐의 클라라 세포, 전방 뇌하수체 세포, 성장자극세포, 락틴분비세포, 갑상선자극세포, 생식선자극세포, 코르티코트로프성세포, 중간 뇌하수체 세포, 분비성 멜라닌세포-자극 호르몬, 거대세포 신경분비 세포 (분비 옥시토신 및/또는 분비성 바소프레신), 장과 기도 세포 (분비 세로토닌, 분비성 엔도르핀, 분비성 소마토스타틴, 분비성 가스트린, 분비성 세크레틴, 분비성 콜레시스토키닌, 분비성 인슐린, 분비성 글루카곤, 및/또는 분비성 봄베신), 갑상선 세포, 갑상선 상피 세포, 난포방 세포, 부갑상선 세포, 부갑상선 주세포, 호산 세포, 부신 세포, 크롬친화성 세포, 부신 분비 스테로이드 호르몬 (광물부신겉질호르몬 및 글루코코르티코이드), 고환 분비성 테스토스테론의 라이디히 세포, 난포 분비성 에스트로겐의 난포막 세포, 파열된 난포 분비성 프로게스테론의 황체 세포 (과립층 황체 세포, 그리고 난포막 황체 세포), 사구체곁세포 (레닌 분비), 신장의 밀집반 세포, 신장의 혈관극주위 세포, 신장의 혈관사이 세포, 간세포 (liver cell), 백색 지방 세포, 갈색 지방 세포, 간 지방세포, 신장 사구체 벽세포, 신장 사구체 발세포, 신장 근위 요세관 솔 변연 세포, 헬렌 (Henle) 고리 얇은 부분 세포, 신장 원위 요세관 세포, 신장 집합관 세포, I형 허파꽈리세포 (폐의 내층 기실), 췌장관 세포 (샘포중심세포), 민무늬관 세포 (한선, 타액선, 유선 등의), 예를 들면, 주세포 및 사이세포, 관 세포 (정낭, 전립선 등의), 장내 솔 변연 세포 (미세융모 보유), 외분비선 줄무늬 관 세포, 담낭 상피 세포, 고환수출세관 무섬모 세포, 부고환 주세포, 부고환 기초세포, 혈관과 림프관 내피 창문세포, 혈관과 림프관 내피 연속세포, 혈관과 림프관 내피 비장 세포, 활액 세포 (내층 관절강, 히알루론산 분비), 장막 세포 (내층 복막, 흉막, 그리고 심막 강), 편평 세포 (귀의 내층 바깥림프 공간), 편평 세포 (귀의 내층 내림프 공간), 미세융모를 보유하는 내림프낭의 원주세포 (귀의 내층 내림프 공간), 미세융모가 없는 내림프낭의 원주세포 (귀의 내층 내림프 공간), 어두운 세포 (귀의 내층 내림프 공간), 전정막 세포 (귀의 내층 내림프 공간), 혈관줄무늬 기초세포 (귀의 내층 내림프 공간), 혈관줄무늬 변연 세포 (귀의 내층 내림프 공간), Claudius 세포 (귀의 내층 내림프 공간), 뵈트허 세포 (귀의 내층 내림프 공간), 맥락얼기 세포 (뇌척수액 분비), 연질막-거미막 편평 세포, 눈의 색소 섬모 상피세포, 눈의 무색소 섬모 상피세포, 각막 내피 세포, 기도 섬모 세포, 난관 섬모 세포 (여성에서), 자궁 내막 섬모 세포 (여성에서), 고환 그물 섬모 세포 (남성에서), 고환수출세관 섬모 세포 (남성에서), 중추신경계섬모 뇌실막 세포 (내층 뇌강), 에나멜모세포 상피 세포 (치아 에나멜 분비), 귀의 전정 기관의 반달면 상피 세포 (프로테오글리칸 분비), 코르티 기관 치간 상피 세포 (유모 세포를 덮는 분비성 덮개막), 느슨한 연결 조직 섬유아세포, 각막 섬유아세포 (각막 세포), 힘줄 섬유아세포, 골수 망상 조직 섬유아세포, 다른 비-상피 섬유아세포, 혈관주위세포, 추간판의 수핵 세포, 시멘트질모세포/시멘트질세포 (치근 골유사 시멘트질 분비), 상아질모세포/치골세포 (odontocyte) (치아 상아질 분비), 유리질 연골 연골세포, 섬유연골 연골세포, 탄력 연골 연골세포, 골아세포/골세포, 전골모세포 (조골세포의 줄기 세포), 눈의 유리체의 유리체세포, 귀의 바깥림프 공간의 성상 세포, 간 성상 세포 (Ito 세포), 췌장 성상 세포, 골격근 세포 (가령, 적색 골격근 세포 (느림), 백색 골격근 세포 (빠름), 중간 골격근 세포, 근방추의 핵 주머니 세포, 그리고 근방추의 핵 사슬 세포), 위성 세포 (줄기 세포), 심장 근육 세포 (가령, 통상의 심장 근육 세포, 결절 심장 근육 세포, 그리고 퍼킨제 (purkinje) 섬유 세포), 평활근 세포 (다양한 유형), 홍채의 근상피 세포, 외분비선의 근상피 세포, 적혈구 (red blood cell), 거대핵세포 (혈소판 선구세포), 단핵구, 연결 조직 대식세포 (다양한 유형), 외피 랑게르한스 (Langerhans) 세포, 파골세포 (골 내에서), 수상돌기 세포 (림프 조직 내에서), 미세아교 세포 (중추신경계 내에서), 호중구성 과립구, 호산구성 과립구, 호염기성 과립구, 비만 세포, 보조 T 세포, 억제 T 세포, 세포독성 T 세포, 자연 킬러 T 세포, B 세포, 자연 킬러 세포, 망상적혈구, 혈액과 면역계에 대한 줄기 세포 및 수임된 선조 (commited progenitor) (다양한 유형), 코르티 기관의 청각 바깥 유모 세포, 후각 상피세포의 기초세포 (후각 뉴런에 대한 줄기 세포), 냉기-민감성 일차 감각 뉴런, 열기-민감성 일차 감각 뉴런, 표피의 메켈 (merkel) 세포 (접촉 센서), 후각 수용체 뉴런, 통증-민감성 일차 감각 뉴런 (다양한 유형), 눈에서 망막의 광수용체 세포 (가령, 광수용체 막대 세포, 눈의 광수용체 청색-민감성 원뿔세포, 눈의 광수용체 녹색-민감성 원뿔세포, 눈의 광수용체 적색-민감성 원뿔세포), 고유수용성 일차 감각 뉴런 (다양한 유형), 접촉-민감성 일차 감각 뉴런 (다양한 유형), I형 경동맥 소체 세포 (혈액 pH 센서), II형 경동맥 소체 세포 (혈액 pH 센서), 귀의 전정 기관의 I형 유모 세포 (가속과 중력), 귀의 전정 기관의 II형 유모 세포 (가속과 중력), I형 미뢰 세포, 콜린성 신경 세포 (다양한 유형), 아드레날린성 신경 세포 (다양한 유형), 펩티드성 신경 세포 (다양한 유형), 코르티 기관의 속 기둥 세포, 코르티 기관의 바깥 기둥 세포, 코르티 기관의 속 손가락 세포, 코르티 기관의 바깥 손가락 세포, 코르티 기관의 경계 세포, 코르티 기관 전정 기관 지지 세포의 헨센 (hensen) 세포, I형 미뢰 지지 세포, 후각 상피세포 지지 세포, 슈반 (schwann) 세포, 위성 세포 (말초 신경 세포체 캡슐화), 장 아교 세포, 성상세포 (다양한 유형), 뉴런 세포 (매우 다양한 유형, 여전히 불완전하게 분류됨), 희소돌기아교세포, 방추 뉴런, 전방 수정체 상피 세포, 크리스탈린 (crystallin)-포함 수정체 섬유 세포, 멜라닌세포, 망막 색소 상피 세포, 난조 세포/난포 세포, 정자 세포, 정모 세포, 정원 세포 (정모 세포에 대한 줄기 세포), 정자, 난포 세포, 버팀 세포 (고환에서), 흉선 상피 세포, 그리고 간질성 신장 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 가령, 세포 또는 세포주에서 발현되는 목적되는 단백질이 특정 유형의 뉴런에서 정상적으로 발현되는 이온 채널이면, 참고 세포는 상기 특정 유형의 뉴런일 수 있다. 뉴런의 특정 유형에는 감각 뉴런, 중추신경계의 뉴런, 단극 뉴런, 가성단극 뉴런, 양극 뉴런, 다극 뉴런, 골지 I 뉴런, 피라미드 세포, 퍼킨제 (purkinje) 세포, 척수 전각 세포, 골지 II 뉴런, 과립 세포, 바구니 세포, 베츠 (betz) 세포, 큰 운동 뉴런, 중간 가시 뉴런, Renshaw 세포, 알파 운동 뉴런, 구심성 뉴런, 원심성 뉴런, 운동 뉴런 및 인터뉴런이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
일부 구체예에서, 참고 세포는 유전자 조작 없이, 목적되는 RNA 또는 단백질을 정상적으로 발현하거나 기능적으로 발현하는 세포 유형의 세포이다. 일부 구체예에서, 참고 세포는 목적되는 RNA 또는 단백질을 안정적으로 발현하는 능력을 갖는 세포이다. 일정한 구체예에서, 참고 세포는 연관된 세포독성 없이, 목적되는 RNA 또는 단백질을 발현하는 능력을 갖는 세포이다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 본 발명의 세포와 세포주를 생산하는 방법을 제시한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 목적되는 RNA을 발현하거나, 또는 목적되는 단백질을 인코딩하는 mRNA를 발현하는 적어도 2개의 복수의 세포를 제공하는 단계;
b) 이들 세포를 개별 배양 용기 내로 개별적으로 분산시켜 복수의 별개의 세포 배양액을 제공하는 단계;
c) 자동화 세포 배양 방법을 이용하여 일단의 원하는 배양 조건 하에 이들 세포를 배양하는 단계, 이들 조건은 별개의 세포 배양액 각각에 대하여 실질적으로 동일한 것으로 특징되고, 이러한 배양 기간 동안 별개의 세포 배양액 각각에서 세포의 숫자가 표준화되고, 그리고 이들 별개의 배양액은 동일한 일정에서 계대배양되고;
d) 목적되는 RNA 또는 목적되는 단백질의 적어도 하나의 원하는 특징에 대하여 별개의 세포 배양액을 적어도 2회 평가하는 단계; 그리고
e) 양쪽 분석에서 원하는 특징을 갖는 별개의 세포 배양액을 확인하는 단계.
상기 방법에 따라서, 이들 세포는 일단의 원하는 배양 조건 하에 배양된다. 이들 조건은 임의의 원하는 조건일 수 있다. 당업자는 일단의 배양 조건 내에 어떤 파라미터가 포함되는 지를 이해할 것이다. 가령, 배양 조건에는 배지 (기초 배지 (DMEM, MEM, RPMI, 혈청-없는, 혈청 포함, 완전하게 화학적으로 정의된, 동물-유래된 성분이 없는), 일가와 이가 이온 (나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘) 농도, 첨가되는 추가 성분 (아미노산, 항생제, 글루타민, 글루코오스 또는 기타 탄소 공급원, HEPES, 채널 차단제, 다른 표적의 조절제, 비타민, 미량 원소, 중금속, 보조-인자, 성장 인자, 항-아폽토시스 시약), HEPES를 포함하는 새로운 또는 조건 배지, pH, 일정한 영양소 (아미노산, 탄소 공급원)의 고갈 또는 제한, 분할/계대배양에 앞서 세포가 달성하도록 허용되는 포화도 수준, 세포의 영양층 (feeder layer), 또는 감마-조사된 세포, CO2, 3가지 가스 시스템 (산소, 질소, 이산화탄소), 습도, 온도, 정지 또는 교반기 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
세포 배양 조건은 편의적으로, 또는 세포의 원하는 특정 용도에 맞게 선택될 수 있다. 유리하게는, 본 발명에서는 원하는 특정 용도에 최적으로 적합한 세포와 세포주를 제시한다. 다시 말하면, 세포가 원하는 특정 용도를 위한 조건 하에 배양되는 본 발명의 구체예에서, 원하는 용도를 위한 조건 하에 원하는 특징을 갖는 세포가 선별된다.
예시로써, 부착성 세포가 요구되는 평판에서 분석에 세포가 이용되면, 상기 분석의 조건 하에 부착성을 나타내는 세포가 선별될 수 있다. 유사하게, 세포가 단백질 생산에 이용되면, 세포는 단백질 생산에 적합한 조건 하에 배양되고 이러한 용도를 위한 유익한 특성에 대하여 선별될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 별개의 세포 배양액의 성장 속도를 측정하는 추가 단계를 포함한다. 성장 속도는 당업자에게 공지되어 있는 다양한 기술 수단을 이용하여 결정될 수 있다. 이런 기술에는 ATP, 세포 포화도, 광 산란, 흡광도 (가령, DNA의 경우에 OD 260) 측정이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 바람직하게는, 성장 속도는 선택된 배양 조건을 벗어나는 배양 동안 소모되는 시간의 양을 최소화시키는 수단을 이용하여 결정된다.
일부 구체예에서, 세포 포화도가 측정되고, 그리고 성장 속도가 포화도 값으로부터 계산된다. 일부 구체예에서, 세포가 분산되고, 그리고 향상된 정확도를 위하여 세포 포화도를 측정하기에 앞서 덩어리가 제거된다. 세포를 단분산시키는 수단은 널리 공지되어 있고, 그리고 예로써, 측정되는 배양액에 분산제 (dispersing reagent)의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 분산제는 널리 공지되어 있고 용이하게 구입가능하며, 그리고 여기에는 효소 분산제, 예를 들면, 트립신 또는 기타 프로테아제, 그리고 비-효소 세포 해리 시약, 예를 들면, EDTA-기초된 분산제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 성장 속도는 HAMILTON VECTOR와 같은 상업적으로 가용한 소프트웨어를 이용하여 포화도 데이터로부터 계산될 수 있다. 예로써, 자동화 현미경 평판 판독기를 이용한 자동화 포화도 측정이 특히 유용하다. 포화도를 측정하는 평판 판독기는 상업적으로 가용하고, 그리고 여기에는 CLONE SELECT IMAGER (Genetix)가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 전형적으로, 세포 포화도의 적어도 2회 측정이 성장 속도를 계산하기에 앞서 수행된다. 성장 속도를 결정하는데 이용되는 포화도 값의 숫자는 배양에 편의하거나 적합한 임의의 숫자일 수 있다. 가령, 포화도는 예로써, 1주, 2주, 3주 또는 임의의 기간 동안, 그리고 임의의 원하는 빈도로 수회 측정될 수 있다.
성장 속도가 알려져 있을 때, 본 발명의 방법에 따라서, 복수의 별개의 세포 배양액은 성장 속도의 유사성에 의해 여러 군으로 분류된다. 배양액을 성장 속도 빈 (growth rate bin)으로 집단화 (grouping)함으로써, 군 내에 배양액을 함께 조작할 수 있고, 따라서 배양액 간에 편차를 감소시키는 다른 수준의 표준화를 제공할 수 있다. 가령, 빈 (bin) 내에 배양액은 동일한 시점에서 계대배양되고, 동일한 시점에서 원하는 시약으로 처리될 수 있다. 게다가, 기능 분석 결과는 전형적으로, 분석 웰 내에서 세포 밀도에 좌우된다. 일부 구체예에서, 개별 클론의 진정한 비교는 이들을 동일한 밀도로 도말하고 평가할 때에만 달성된다. 특정한 성장 속도 코호트로의 집단화는 이들이 고처리량 형식으로 기능적으로 특성화될 수 있도록 하는 특정 밀도에서 클론의 도말을 가능하게 한다.
각 군에서 성장 속도의 범위는 임의의 편의한 범위일 수 있다. 세포가 동일한 시점에서 계대배양될 수 있도록 하고 세포 수의 빈번한 재표준화 (renormalization)를 예방하는 성장 속도의 범위를 선택하는 것이 특히 유리하다. 성장 속도 군은 엄격한 집단화를 위한 매우 좁은 범위, 예를 들면, 서로 간에 1시간 내에 평균 배가 시간을 포함할 수 있다. 하지만, 본 발명의 방법에 따라서, 상기 범위는 서로 간에 최대 2시간, 최대 3시간, 최대 4시간, 최대 5시간 또는 최대 10시간, 또는 더욱 넓은 범위일 수 있다. 재표준화의 요구는 빈 (bin)에서 성장 속도가 동일하지 않고, 따라서 일부 배양액에서 세포의 숫자가 다른 것보다 빠르게 증가할 때 발생한다. 빈 내에 모든 배양액에 대한 실질적으로 동일한 조건을 유지하기 위하여, 빈 전역에서 숫자를 재표준화하기 위하여 세포를 주기적으로 제거하는 것이 필요하다. 성장 속도가 더욱 상이하면, 재표준화가 더욱 빈번하게 요구된다.
단계 d)에서, 세포와 세포주는 게놈에 의해 인코딩된 세포 과정에서 변화; 게놈에 의해 조절된 세포 과정에서 변화; 염색체 활성의 패턴에서 변화; 염색체 침묵의 패턴에서 변화; 유전자 침묵의 패턴에서 변화; 유전자 활성화의 패턴 또는 효율에서 변화; 유전자 발현의 패턴 또는 효율에서 변화; RNA 발현의 패턴 또는 효율에서 변화; RNAi 발현의 패턴 또는 효율에서 변화; RNA 가공의 패턴 또는 효율에서 변화; RNA 수송의 패턴 또는 효율에서 변화; 단백질 번역의 패턴 또는 효율에서 변화; 단백질 접힘의 패턴 또는 효율에서 변화; 단백질 조립의 패턴 또는 효율에서 변화; 단백질 변형의 패턴 또는 효율에서 변화; 단백질 수송의 패턴 또는 효율에서 변화; 막 단백질의 세포 표면으로의 수송의 패턴 또는 효율에서 변화; 성장 속도에서 변화; 세포 크기에서 변화; 세포 형상에서 변화; 세포 형태에서 변화; % RNA 함량에서 변화; % 단백질 함량에서 변화; % 물 함량에서 변화; % 지질 함량에서 변화; 리보솜 함량에서 변화; 미토콘드리아 함량에서 변화; ER 질량에서 변화; 원형질 막 표면적에서 변화; 세포 체적에서 변화; 원형질 막의 지질 조성에서 변화; 핵 외피의 지질 조성에서 변화; 원형질 막의 단백질 조성에서 변화; 핵 외피의 단백질 조성에서 변화; 분비 소포의 숫자에서 변화; 리소솜의 숫자에서 변화; 액포의 숫자에서 변화; 단백질 생산, 단백질 분비, 단백질 접힘, 단백질 조립, 단백질 변형, 단백질의 효소 변형, 단백질 당화, 단백질 인산화, 단백질 탈인산화, 대사산물 생합성, 지질 생합성, DNA 합성, RNA 합성, 단백질 합성, 영양소 흡수, 세포 성장, 유사분열, 감수분열, 세포 분열, 탈분화, 줄기 세포로 변환, 다능성 세포로 변환, 전능성 세포로 변환, 임의의 장기 (즉, 간, 폐, 피부, 근육, 췌장, 뇌, 고환, 난소, 혈액, 면역계, 신경계, 골, 심혈관계, 중추신경계, 위장관, 위, 갑상선, 혀, 담낭, 신장, 코, 눈, 손발톱, 머리카락, 미뢰)의 줄기 세포 유형으로 변환, 임의의 분화된 세포 유형 (즉, 근육, 심장 근육, 뉴런, 피부, 췌장, 혈액, 면역, 적혈구 세포, 적혈구 세포, 킬러 T-세포, 장내분비 세포, 미각, 분비 세포, 신장, 상피 세포, 내피 세포, 또한 핵산 서열의 도입에 이용될 수 있는 것으로 이미 열거된 임의의 동물 또는 인간 세포 유형 포함)으로 변환, DNA 흡수, 소형 분자 흡수, 형광 프로브 흡수, RNA 흡수, 고형 표면에 부착, 혈청-없는 조건에 적응, 혈청-없는 현탁 조건에 적응, 규모 확대된 세포 배양에 적합, 대규모 세포 배양에 이용, 약물 발견에서 이용, 고처리량 스크리닝에서 이용, 기능적 세포 기초된 분석에서 이용, 막 전위 분석에서 이용, 칼슘 유동 분석에서 이용, G-단백질 리포터 분석에서 이용, 리포터 세포 기초된 분석에서 이용, ELISA 연구에서 이용, 시험관내 분석에서 이용, 생체내 적용에 이용, 이차 검사에 이용, 화합물 검사에서 이용, 결합 분석에서 이용, 패닝 (panning) 분석에서 이용, 항체 패닝 분석에서 이용, 영상 분석에서 이용, 현미경 영상 분석에서 이용, 멀티웰 평판에서 이용, 자동화 세포 배양에 적합, 축소된 자동화 세포 배양에 적합, 대규모 자동화 세포 배양에 적합, 멀티웰 평판 (6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 또는 더욱 높은 밀도)에서 세포 배양에 적합, 세포 칩에서 이용, 슬라이드에서 이용, 유리 슬라이드에서 이용, 슬라이드 또는 유리 슬라이드에서 마이크로어레이, 면역형광 연구, 단백질 정제에서 이용, 생물학적 생산에서 이용, 산업용 효소의 생산에서 이용, 연구용 시약의 생산에서 이용, 백신 개발에서 이용, 세포 요법에서 이용, 동물 또는 인간으로 이식에서 이용, 세포에 의해 분비된 인자의 분리에서 이용, cDNA 라이브러리의 준비, RNA의 정제, DNA의 정제, 병원균, 바이러스 또는 기타 병원체에 의한 감염, 병원균, 바이러스 또는 기타 병원체에 의한 감염에 내성, 내약성, 자동화 축소된 세포 배양 조건 하에 유지에 적합성, 단백질 결정학, 백신 개발, 면역계의 자극, 항체 생산 또는 산출, 또는 항체의 검사를 비롯한 특성화를 위한 단백질의 생산에서 이용을 위한 세포의 능력 또는 잠재력에서 변화가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 생리학적 특성에 대하여 조사되고 선별될 수 있다. 당업자는 앞서 열거된 임의의 특성에 대한 적절한 검사법을 이의 없이 인지할 것이다.
본 발명의 세포와 세포주 및/또는 본 발명의 정합된 패널을 특성화하는데 이용될 수 있는 검사에는 아미노산 분석, DNA 염기서열분석, 단백질 염기서열분석, NMR, 단백질 수송에 대한 검사, 핵세포질 수송에 대한 검사, 단백질의 세포하 국부화에 대한 검사, 핵산의 세포하 국부화에 대한 검사, 현미경 분석, 초현미경 분석, 형광 검경, 전자 검경, 공초점 검경, 레이저 박리 기술, 세포수 계산 및 투석이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 당업자는 앞서 열거된 임의의 검사법을 어떻게 이용하는 지를 이해할 것이다.
세포 또는 세포주의 수집물 또는 패널이 예로써, 약물 스크리닝을 위하여 생산될 때, 상기 수집물 또는 패널 내에 세포 또는 세포주는 그들이 하나 이상의 선별적 생리학적 특성에 대하여 동일 (실질적인 동일 포함)하도록 정합될 수 있다. 이러한 배경에서 "동일한 생리학적 특성"은 세포 수집물 또는 패널이 약물 스크리닝 분석에서 신뢰성 있는 결과를 산출할 수 있을 만큼, 선별된 생리학적 특성이 상기 수집물 또는 패널 내에 구성원 간에 충분히 유사하는 것을 의미한다; 가령, 약물 스크리닝 분석에서 해독 정보 (readout)에서 편차는 세포에서 고유의 편차에 기인하기 보다는, 예로써 단백질의 상이한 형태를 발현하는 세포에서 검사 화합물의 상이한 생물학적 활성에 기인할 것이다. 가령, 세포 또는 세포주는 세포 수집물 또는 패널의 구성원 간에 동일한 성장 속도, 다시 말하면, 단지 1, 2, 3, 4, 또는 5시간 차이를 갖는 성장 속도를 갖도록 정합될 수 있다. 일부 구체예에서, 이는 예로써, 세포를 그들의 성장 속도에 의해 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 군으로 비닝 (binning)하고, 그리고 동일한 또는 상이한 비닝된 군으로부터 세포를 이용하여 패널을 산출함으로써 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 성장 속도에 의해 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 군으로 비닝될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 성장 속도에 의해 적어도 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 이상의 군으로 비닝될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포주 패널은 성장 속도에 기초하여 동일한 군으로 비닝된 세포주를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 세포주 패널은 성장 속도에 기초하여 상이한 군으로 비닝된 세포주를 포함할 수 있다. 세포 성장 속도를 결정하는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 패널 내에서 세포 또는 세포주는 또한, 동일한 Z' 인자 (가령, 0.1 이상 차이가 나지 않는 Z' 인자), 단백질 발현 수준 (가령, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 또는 30% 이상 차이가 나지 않는 CFTR 발현 수준), RNA 발현 수준, 조직 배양액 표면에 부착 등을 갖도록 정합될 수 있다. 정합된 세포와 세포주는 선별된 생리학적 특성을 유지하기 위하여, 예로써 자동화 병렬 처리에 의해 달성된 동일한 조건 하에 성장될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 성장 속도가 포함되지만 이에 국한되지 않는 세포 또는 세포주의 생리학적 특성에 기초하여 군으로 비닝될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 또는 세포주의 정합된 패널은 성장 속도가 포함되지만 이에 국한되지 않는 세포의 적어도 한 가지의 생리학적 특성에 의해 분류된 하나 이상의 빈 (bin)의 세포 또는 세포주를 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 패널은 동일한 일단의 조건 하에 성장 속도에 대하여 정합된다. 본 명세서에서 정합된 패널로 지칭되는 이런 패널은 2개 이상의 세포주를 교차하여 실험적 변수의 효과를 비교하는 것이 바람직한 폭넓은 범위의 세포-기초된 연구에서 이용에 매우 바람직하다. 성장 속도에 대하여 정합되는 세포주는 시간의 흐름 동안 웰당 거의 동일한 숫자의 세포를 유지하고, 따라서 성장 조건, 예를 들면, 패널 내에 세포주 간에 영양소 함량에서 편차를 감소시킨다.
본 발명에 따라서, 정합된 패널은 세포의 특징, 패널의 의도된 용도, 패널의 크기, 배양 조건 등을 비롯한 다수의 인자에 따라, 임의의 원하는 범위 내에 성장 속도를 가질 수 있다. 이런 인자는 당업자에 의해 이의 없이 인식될 것이다.
성장 속도는 임의의 적절하고 편의한 수단에 의해 결정될 수 있는데, 유일한 필요조건은 정합된 패널에서 모든 세포주에 대한 성장 속도가 동일한 수단에 의해 결정되어야 한다는 것이다. 성장 속도를 결정하는 다수의 수단이 본 명세서에서 기술된 바와 같이 공지되어 있다.
본 발명의 정합된 패널은 임의의 숫자의 클론 세포주를 포함할 수 있다. 패널 내에 클론 세포주의 최대수는 각 용도 및 사용자 마다 달라지고, 그리고 가능한 많게 유지될 수 있다. 다양한 구체예에서, 패널은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 클론 세포주, 예를 들면, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 48, 적어도 50, 적어도 75, 적어도 96, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 384, 적어도 400개 또는 그 이상의 클론 세포주를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 정합된 패널은 적어도 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 350, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 또는 1,000개의 클론 세포주를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 정합된 패널은 적어도 1,100, 1,250, 1,500, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000 또는 10,000개의 클론 세포주를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 정합된 패널은 적어도 11,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000 또는 100,000개의 클론 세포주를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 정합된 패널은 적어도 100,000, 150,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000 또는 1,000,000개의 클론 세포주 또는 그 이상의 클론 세포주를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 정합된 패널은 적어도 1,000개의 클론 세포주를 포함할 수 있다.
본 발명에 따라서, 패널은 복수의 클론 세포주를 포함한다, 다시 말하면, 복수의 세포주는 상이한 단일 부모 세포로부터 산출된다. 일정한 구체예에서, 세포주 패널 내에 복수의 세포주는 동일한 유형이다. 일정한 구체예에서, 세포주 패널 내에 복수의 세포주는 적어도 2개의 상이한 유형이다. 임의의 원하는 세포 유형이 정합된 패널의 생산에 이용될 수 있다. 패널은 모두 동일한 세포 유형의 세포주 또는 상이한 세포 유형의 세포주를 포함할 수 있다.
패널 내에서 클론 세포주는 하나 이상의 목적되는 단백질을 안정적으로 발현한다. 안정적인 발현은 패널의 원하는 용도에 적합한 임의의 시간 길이 동안, 하지만 최소한, 선별 및 정합된 패널에서 이용을 허용할 만큼 충분히 길게 달성될 수 있다.
정합된 패널 내에 클론 세포주는 모두 동일한 하나 이상의 목적되는 단백질을 발현하거나, 또는 패널 내에 일부 클론 세포주는 상이한 목적되는 단백질을 발현할 수 있다.
일부 구체예에서, 정합된 패널은 상이한 목적되는 단백질을 발현하는 하나 이상의 클론 세포주를 포함한다. 다시 말하면, 패널 내에 첫 번째 클론 세포주는 첫 번째 목적되는 단백질을 발현하고, 패널 내에 두 번째 클론 세포주는 두 번째 목적되는 단백질을 발현하고, 세 번째 세포주는 세 번째 목적되는 단백질을 발현하고, 그리고 원하는 만큼 많은 상이한 목적되는 단백질에 대하여 그러하다. 상이한 목적되는 단백질은 상이한 동종형, 대립형질 변이체, 절단접합 변이체, 또는 돌연변이 (서열 돌연변이 또는 절두가 포함되지만 이들에 국한되지 않음), 상이한 아단위 화학량론, 상이한 아단위 조립, 차별적 접힘 형태, 차별적 활성 형태, 상이한 기능성을 갖는 형태, 상이한 결합 특성을 갖는 형태, 상이한 부속 인자와 연관된 형태, 상이한 세포 배경에서 발현된 형태, 상이한 세포 유전자 배경에서 발현된 형태, 상이한 내생적 발현 프로필을 갖는 세포에서 발현된 형태, 차별적 국부화 형태, 키메라 또는 화학적으로 변형된 형태, 효소에 의해 변형된 형태, 번역후 변형된 형태, 당화된 형태, 단백질분해된 형태, 또는 목적되는 단백질의 이들의 조합일 수 있다. 일정한 구체예에서, 상이한 단백질은 단백질의 기능적으로 정의된 군, 예를 들면, 쓴맛 수용체의 패널 또는 키나아제의 패널의 구성원일 수 있다. 일정한 구체예에서, 상이한 단백질은 동일한 또는 상관된 신호전달 경로의 일부일 수 있다. 이종다합체성 단백질 (이종이합체 포함)을 포함하는 다른 패널에서, 상기 패널은 아단위의 모든 가능한 조합까지 아단위의 2개 이상의 상이한 조합을 포함할 수 있다. 이들 조합은 아단위 서열 변이체, 아단위 동종형 조합, 아단위의 종간 조합 및 아단위 유형의 조합을 포함할 수 있다.
실례로써, 감마-아미노부티르산 (GABA)A 수용체는 전형적으로, 2개의 알파 아단위, 2개의 베타 아단위 및 1개의 감마 아단위를 포함한다. 6가지 알파 동종형, 5가지 베타 동종형, 4가지 감마 동종형, 그리고 델타, 파이, 세타 및 엡실론 아단위가 존재한다. 본 발명에서는 알파, 베타, 감마, 델타, 파이, 엡실론 및 세타 아단위의 모든 가능한 조합을 포함하는 패널을 비롯한, 이들 아단위 중에서 2개 이상의 조합을 포함하는 패널을 계획한다. 게다가, GABA 수용체 집단에는 GABAB 및 GABAC 수용체 역시 포함된다. 본 발명에서는 또한, GABAA, GABAB 및 GABAC 아단위의 임의의 조합을 포함하는 패널을 계획한다. 일부 구체예에서, 이런 패널은 인간 GABA 아단위를 포함한다. 다른 구체예에서, 포유동물 GABA 수용체 패널은 비-인간 영장류 (가령, 필리핀 원숭이) GABA 수용체, 생쥐, 쥐 또는 인간 GABA 수용체 패널 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
다른 실례에서, 본 발명에서는 임의의 포유동물 ENaC 패널, 예를 들면, 비-인간 영장류 (가령, 필리핀 원숭이) ENaC, 생쥐, 쥐 또는 인간 ENaC 패널 또는 이들의 혼합물을 비롯한 하나 이상의 상피 나트륨 채널 (ENaC) 패널을 계획한다. GABA 수용체와 유사하게, 본래 ENaC는 복수 아단위: 알파 또는 델타, 베타 및 감마를 포함한다. 본 발명에서는 ENaC 아단위의 적어도 2개의 상이한 조합을 보유하는 패널을 계획하고, 또한 상이한 종으로부터 아단위의 조합, 동종형, 대립형질 변이체, SNP, 키메라 아단위의 조합, 변형된 및/또는 비-자연 아미노산 및 화학적으로 변형된, 예를 들면, 효소에 의해 변형된 아단위를 포함하는 형태를 비롯한 ENaC 아단위의 모든 가능한 조합을 계획한다. 본 발명에서는 또한, International Application PCT/US09/31936에서 기술된 임의의 ENaC 형태를 포함하는 패널을 계획하고, 이의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
다른 특정 구체예에서, 표 10에 제시된 고유 (태그 없음) 기능적 쓴맛 수용체를 발현하는 세포주를 포함하는 25가지 쓴맛 수용체의 정합된 패널이 제시된다. 일부 구체예에서, 패널은 성장 속도에 대하여 정합된다. 일정한 구체예에서, 패널은 성장 속도 및 목적되는 추가의 생리학적 특성에 대하여 정합된다. 일정한 구체예에서, 패널 내에 세포주는 동시에 산출되고 및/또는 동시에 스크리닝되었다.
패널 및 그들의 용도의 추가의 예시적인, 하지만 무제한적 실례는 아래와 같다: 예로써, 방향의 프로필 또는 조절제의 발견에 후각 수용체 (곤충, 개, 인간, 베드버그)의 패널; 예로써, 화물, 예를 들면, 항체, 단일클론 항체 또는 비-단백질 약물을 비롯한 단백질을 세포 내로 내재화시키는 기능을 하는 펩티드를 찾기 위하여, 검사 펩티드에 융합된 유전자를 발현하는 세포의 패널 (상기 화물은 리포터, 예를 들면, GFP 또는 AP일 수 있다). 이러한 구체예와 관련하여, 상기 패널의 세포로부터 상층액은 내재화 (internalization)의 평가를 위하여 다른 세포에 첨가될 수 있다. 이런 구체예에서, 패널은 세포-유형 특이적 전달을 평가하기 위한 상이한 세포 유형을 포함할 수 있다. 활성 항체 또는 단일클론 항체를 확인하기 위하여 상이한 항체 또는 단일클론 항체 중쇄/경쇄 조합을 발현하는 세포주 패널. 항체 패널은 또한, 향상된 특징, 예를 들면, 혈청에서 안정성, 결합 친화성 등을 갖는 것을 확인하기 위한 항체 또는 단일클론 항체의 일련의 유도체화된 변형을 제공할 수 있다. 또 다른 패널은 다양한 신호전달 분자, 예를 들면, 상이한 G-단백질의 존재에서 표적 단백질을 발현하는데 이용될 수 있다. 패널의 또 다른 유형은 향상된 활성/안정성에 대하여 표적 단백질의 변이체를 조사하는데 이용될 수 있다. 패널은 일부, 다수 또는 모든 형태에 작용하는 조절제를 선별하기 위하여 표적 단백질의 단일 뉴클레오티드 다형체 (SNP) 또는 다른 돌연변이된 형태를 포함할 수 있다. 다른 패널은 단백질 집단 또는 단백질의 동종형 (가령, GABAA 또는 기타 CNS 이온 채널)에서 검사 화합물의 활성의 패턴을 정의하는데 이용될 수 있다. 상이하게 작용하는 화합물은 이후, 생체내에서 상응하는 아단위 조합의 기능/역할/국부화를 결정하기 위한 추가 연구에 이용될 수 있다. 검사 화합물은 유해한 부정확한 효과 (off-target effect)와 상관하는 아단위 조합을 결정하기 위하여, 임상에서 실패한 공지된 조절제, 또는 이들 유해한 효과를 갖는 것들일 수 있다. 또 다른 패널은 원하는 표적에서 활성이고 최소의 부정확한 효과를 갖는 화합물을 찾는데 도움이 되는, 복수 표적 아류형에서 화합물의 활성의 신뢰성 있는 평가를 위한 병렬 스크리닝에 대한 HTS에 이용될 수 있다.
이들 패널은 임의의 원하는 단백질 군을 발현하도록 조작된 세포를 포함할 수 있고, 그리고 이와 같은 모든 패널은 본 발명에 의해 계획된다.
이들 패널은 임의의 원하는 RNA 군을 발현하도록 조작된 세포를 포함할 수 있고, 그리고 이와 같은 모든 패널은 본 발명에 의해 계획된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 세포 또는 세포주 패널을 제시하고, 여기서 상기 패널은 상이한 후각 수용체를 각각 발현하는 복수의 세포 또는 세포주를 포함한다. 이들 후각 수용체 패널은 목적되는 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 산출하는데 이용될 수 있다. 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필은 복수의 후각 수용체의 활성에 대한 상기 화합물 또는 조성물의 효과를 지칭한다. 목적되는 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 산출하기 위하여, 상기 화합물 또는 조성물은 각각 상이한 후각 수용체를 발현하는 복수의 세포 또는 세포주와 접촉된다.
일부 구체예에서, 후각 수용체 세포 패널은 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 변경, 증진, 또는 감소시키는 화합물을 확인하는데 이용된다. 다른 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 변경, 증진, 또는 감소시키는 것으로 확인된 화합물은 또 다른 화합물 또는 조성물의 후각 효과를 변경, 증진, 또는 감소시킬 것으로 예측된다.
일부 구체예에서, 후각 수용체 세포 패널은 목적되는 화합물 또는 조성물과 유사한 후각 활성 프로필을 갖는 화합물을 확인하는데 이용된다. 목적되는 화합물 또는 조성물과 유사한 후각 활성 프로필을 갖는 것으로 확인된 화합물은 다른 화합물 또는 조성물과 유사한 후각 효과, 다시 말하면, 유사하거나 동일한 냄새를 가질 것으로 예측된다. 후각 활성 프로필은 하기에 기술된 바와 같이 비교될 수 있다.
유용한 후각 수용체에는 표 10-12에서 제시된 후각 수용체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일정한 구체예에서, 후각 수용체는 클래스 I 인간 후각 수용체 또는 클래스 II 인간 후각 수용체, 또는 이들의 조합이다. 본 발명의 후각 수용체 패널은 각각 상이한 후각 수용체를 발현하는 적어도 2, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 또는 적어도 2500개의 상이한 세포 또는 세포주를 보유할 수 있다. 상이한 후각 수용체는 상이한 종 또는 동일한 종일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 세포, 패널 및 방법과 함께 이용되는 후각 수용체는 위유전자 (pseudogene)에 의해 인코딩될 수 있다.
후각 수용체에 대한 목적되는 화합물 또는 조성물의 활성은 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 측정될 수 있다. 후각 수용체의 활성에 대한 목적되는 화합물 또는 조성물의 효과를 측정하는 분석법에는 세포 기초된 분석, 형광 세포 기초된 분석, 영상 분석, 칼슘 유동 분석, 막 전위 분석, 고처리량 스크리닝 분석, 형광 분석, 그리고 이들의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 방법과 함께 이용되는 임의의 분석은 고처리량 형식으로 실시될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 임의의 세포 또는 세포주가 본 발명에 따른 후각 수용체 패널을 산출하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 후각 수용체 패널의 산출을 위한 호스트 세포는 후각 수용체의 기능적 발현에 바람직한 신호전달 또는 기타 단백질 인자를 내생적으로 발현하는 것으로 조사되고 확증된 세포일 수 있다. RT-PCR을 비롯한 검사 및 유전자칩 분석을 비롯한 마이크로어레이 방법에 의한 세포의 RNA 또는 단백질 특성화가 이런 세포를 확인하는데 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포 패널은 복수의 세포 또는 세포주를 포함하고, 여기서 각각의 세포 또는 세포주는 하나 이상의 곤충 후각 수용체를 발현하도록 조작된다. 결과의 세포 패널은 취기제 (odorant)를 특성화하는 세포 기초된 분석에서, 그리고 후각 수용체 조절제를 확인하기 위한 고처리량 스크리닝 ("HTS")에 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 세포 또는 세포주 패널은 한 가지 종 (가령, 모기 종)으로부터 후각 수용체의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 세포 또는 세포주 패널은 적어도 2개의 상이한 곤충 종으로부터 적어도 하나의 후각 수용체를 포함할 수 있다. 모기, 바퀴, 딱정벌레, 베드버그, 나방, 나비, 파리, 개미, 귀뚜라미, 꿀벌, 장수말벌, 과일파리, 진드기, 이, 사면발이, 전갈, 노래기, 지네, 메뚜기, 사마귀, 그리고 거미가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 인간 또는 동물 질환을 전염시키는 곤충, 농작물을 괴롭히는 곤충, 또는 농업 피해 또는 식물 피해를 유발하는 곤충을 비롯한 임의의 곤충 종으로부터 곤충 후각 수용체가 이용될 수 있다.
단백질을 후각 수용체로서 확인하는 통상의 방법은 공지된 후각 수용체에 대한 서열 비교에 기초된다. 일부 구체예에서, 세포 기초된 분석은 또한, 후각 수용체로서 막통과 단백질의 역할을 결정하기 위하여, 공지된 휘발성 또는 후각 화합물에 대한 상기 막통과 단백질의 반응성을 조사하는데 이용될 수 있다.
곤충을 유인하거나 격퇴시키는 화합물과 추출물을 비롯한 물질은 반응성 수용체, 또는 활성이 검사 물질에 의해 조정되는 수용체를 확인하기 위하여 본 발명에서 제시된 패널에 대하여 조사될 수 있다. 이들 물질은 예로써, 식물, 꽃, 식품 (가령, 치즈), 동물, 연기, 폐기물, 분비물, 땀 (인간 땀, 예를 들면, 남자 땀 또는 여자 땀 포함), 공업 산물, 자연과 합성 화학물질, 그리고 생물학적 조직 표본으로부터 수집될 수 있다. 물질은 모든 조사된 수용체에서 화합물의 활성 프로필을 확인하기 위하여 일부 또는 모든 후각 수용체 세포주에 대하여 조사될 수 있다. 후각 수용체 세포주에 대한 물질의 검사로부터 산출되는 활성 패턴은 "지문"을 특성화하는데 이용되거나, 또는 진단제로서 기능할 수 있다.
HTS는 유사한, 증가된 또는 감소된 활성을 갖는 다른 물질을 확인하기 위하여, 물질에 반응하는 것으로 확인된 곤충 후각 수용체를 포함하는 세포주 또는 패널을 스크리닝하는데 이용될 수 있다. HTS는 물질의 존재에서 곤충 후각 수용체의 활성을 조정, 차단 또는 강화시키는 화합물을 확인하기 위하여, 상기 물질에 반응하는 곤충 후각 수용체를 포함하는 세포주 또는 패널을 스크리닝하는데 이용될 수 있다. HTS는 물질의 존재에서 후각 수용체의 반응 또는 활성을 유발하는 화합물을 확인하기 위하여, 상기 물질에 반응하지 않는 후각 수용체를 포함하는 세포주 또는 패널을 스크리닝하는데 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 곤충 후각 수용체에 대한 공지된 물질 (가령, 공지된 화합물)과 유사한 활성을 갖는 화합물 또는 화합물의 혼합물을 확인하는데 이용된다. 더욱 특정한 구체예에서, 본 발명의 방법은 DEET 및/또는 다른 곤충 구충제와 유인물질의 후각 수용체 활성을 모방하는 화합물을 확인하는데 이용된다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 방법은 곤충 구충제로서 이용될 수 있는 화합물을 확인하는데 이용된다. 일정한 구체예에서, 곤충 구충제로서 확인된 화합물은 휘발성이고 주변 환경, 인간, 동물 및/또는 농작물에 비-독성이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 방법은 곤충 유인물질로서 이용될 수 있는 화합물을 확인하는데 이용된다. 일정한 구체예에서, 곤충 유인물질로서 확인된 화합물은 휘발성 화합물이고 주변 환경, 인간, 동물 및/또는 농작물에 비-독성이다. 이런 곤충 유인물질은 곤충 덫에 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 곤충 유인물질 또는 구충제는 특정 곤충 종에 대하여 특유할 수 있다.
특정한 구체예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 후각 수용체에 대한 특정 물질의 활성을 차단하는 화합물 또는 화합물의 혼합물을 확인하는데 이용된다. 더욱 특정한 구체예에서, 이들 방법은 땀, 인간 또는 동물 분비물, 또는 이들의 성분 또는 이산화탄소에 대한 수용체 반응을 차단하는 화합물을 확인하는데 이용된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 후각 수용체에 대한 특정 물질 (가령, 특정 화합물), 예를 들면, 곤충을 유인하거나 격퇴하는 화합물의 활성을 강화시키는 화합물 또는 화합물의 혼합물을 확인하는데 이용된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 후각 수용체에 대한 특정 물질 (가령, 특정 화합물)의 활성을 변경하는 화합물 또는 화합물의 혼합물을 확인하는데 이용된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 적어도 2개의 화합물의 조합을 확인하는데 이용될 수 있고, 여기서 적어도 2개의 화합물은 조합되면 후각 수용체만을 활성화시키고, 그리고 여기서 적어도 2개의 화합물 각각은 후각 수용체를 개별적으로 활성화시키지 않는다. 상기 수용체는 곤충 구충제 또는 곤충 유인물질을 검출하는 수용체일 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 반응성 수용체를 확인하기 위하여 남자 및/또는 여자로부터 획득된 인간 땀 시료 및 이들의 분획물 또는 이들로부터 분리된 화합물의 후각 활성 프로필을 산출하고, 그리고 곤충 격퇴 또는 유인과 상관하는 활성 또는 화합물을 확인하기 위하여 이러한 데이터를 예로써, 하나 이상의 곤충 종에 대한 동일한 물질의 검사에 대한 결과를 포함하는 다른 데이터와 상관시키는데 이용된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 적어도 2개의 시료의 후각 활성 프로필을 조사하고 비교하는데 이용된다. 특정한 구체예에서, 시료는 상이한 식물; 식물 또는 동물의 상이한 종, 또는 상이한 꽃으로부터 획득된 휘발성 물질일 수 있다. 상이한 시료의 후각 활성 프로필은 이후, 반응성 수용체 (가령, 활성이 상이한 시료에 의해 영향을 받는 수용체)를 확인하기 위하여 비교된다. 이들 반응성 수용체는 이들 시료의 화학적 조성에 대한 지시자이다. 비교되는 시료의 후각 활성 프로필의 유사성은 이들 상이한 시료의 화학적 유사성에 대한 척도이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 적어도 한 가지 화합물을 무력화시키는 잠재적인 곤충 적응 또는 진화를 해결하기 위하여, 통합된 또는 순차적 이용 또는 도입을 위한 유사한 활성을 갖는 다수의 화학적으로 다양한 화합물을 확인하는데 이용된다.
각각 하나 이상의 인간 후각 수용체를 포함하는 세포주 패널은 취기제를 특성화하는 세포 기초된 분석에서, 그리고 후각 수용체 조절제를 확인하기 위한 HTS에 이용을 위하여 생산될 수 있다.
냄새, 악취, 방향 또는 향기를 갖는 화합물과 추출물을 비롯한 물질은 반응성 수용체, 또는 활성이 검사 물질에 의해 조정되는 수용체를 확인하기 위하여 인간 후각 수용체의 패널에 대하여 조사될 수 있다. 이들 화합물 또는 혼합물은 식물, 꽃, 식품, 동물, 궐련, 담배, 트러플, 사향, 바닐라, 박하, 폐기물, 분비물, 땀 (인간 땀, 예를 들면, 남자 땀 또는 여자 땀 포함), 공업 산물, 자연과 합성 화학물질, 그리고 질병 조직과 종양을 비롯한 생물학적 조직 표본으로부터 수집될 수 있다. 화합물은 모든 조사된 수용체에서 화합물의 활성 프로필을 확인하기 위하여 일부 또는 모든 인간 후각 수용체 세포주에 대하여 조사될 수 있다. 인간 후각 수용체 세포주에 대한 물질의 검사로부터 산출되는 활성 패턴은 "지문"을 특성화하는데 이용되거나, 또는 진단제로서 기능할 수 있다.
HTS는 유사한, 증가된 또는 감소된 활성을 갖는 다른 물질을 확인하기 위하여, 물질에 반응하는 것으로 확인된 인간 후각 수용체를 포함하는 세포주 또는 패널을 스크리닝하는데 이용될 수 있다. HTS는 물질의 존재에서 인간 후각 수용체의 활성을 조정, 차단 또는 강화시키는 화합물을 확인하기 위하여, 상기 물질에 반응하는 인간 후각 수용체를 포함하는 세포주를 스크리닝하는데 이용될 수 있다. HTS는 물질의 존재에서 인간 후각 수용체의 반응 또는 활성을 유발하는 화합물을 확인하기 위하여, 상기 물질에 반응하지 않는 인간 후각 수용체를 포함하는 세포주를 스크리닝하는데 이용될 수 있다.
후각 수용체 패널의 예시적인 용도에는 아래가 포함된다:
하나 이상의 후각 수용체에 대한 유사한 활성을 갖는 화합물 또는 화합물의 혼합물을 공지된 물질, 예를 들면, 사향의 활성을 모방할 수 있는 합성 화합물로서 확인한다.
하나 이상의 후각 수용체에 대한 공지된 물질의 활성을 차단하는 화합물 또는 화합물의 혼합물, 예를 들면, 악취가 나는 물질 (인간 또는 동물 폐기물)을 차단하는 화합물을 확인한다.
하나 이상의 후각 수용체에 대한 공지된 물질의 활성을 강화시키는 화합물 또는 화합물의 혼합물, 예를 들면, 장미 향 또는 불고기 향을 모방하는 화합물을 확인한다.
하나 이상의 후각 수용체에 대한 공지된 물질의 활성을 변경하는 화합물 또는 화합물의 혼합물, 예를 들면, 정상적으로 이러한 효과가 발생하지 않는 담배 연기와 같은 물질의 존재에서 악취를 검출하는 수용체의 활성화를 유발하는 화합물을 확인한다.
하나 이상의 후각 수용체에 대한 공지된 물질의 활성을 변경하는 화합물 또는 화합물의 혼합물, 예를 들면, 바람직한 향에 상응하는 수용체가 아닌 다른 수용체가 정상적으로 활성화되는 악취가 나는 물질과 같은 물질의 존재에서 바람직한 향을 검출하는 수용체의 활성화를 유발하는 화합물을 확인한다.
반응성 수용체를 확인하기 위하여 남자와 여자로부터 획득된 인간 땀 시료 및 이들의 분획물 또는 이들로부터 분리된 화합물을 프로파일링 (profiling)하고, 그리고 지각된 악취 또는 유인과 상관하는 활성 또는 화합물을 확인하기 위하여 이러한 데이터를 예로써, 인간 정신물리학 연구를 포함하는 다른 데이터와 상관시킨다.
방향에 반응성인 공통의 또는 특유한 수용체를 확인하기 위하여, 비교될 수 있는 일단의 시료 (가령, 상이한 종의 장미로부터 획득된 방향, 또는 상이한 꽃으로부터 획득된 방향, 또는 이러한 물질의 분획물)를 조사한다.
본 명세서에서 기술된 세포, 패널 및 방법은 인간, 비-인간 영장류, 소, 돼지, 고양이, 쥐, 유대류, 뮤린, 개, 양, 염소, 토끼, 기니 피그 및 햄스터로 구성된 군에서 선택되는 포유동물 종; 또는 학질모기 (Anopheles) (아노펠레스 감비아이 (Anopheles gambiae) 및 모든 모기 하위-종 포함), 에이데스 (Aedes) (에이데스 에집티 (Aedes Aegypti) 및 모든 하위-종 포함), 모기 (Culex) 및 에이데스 모기 (Aedes)를 비롯한 모기, 시물륨속 (Simulium), 먹파리 (black fly), 플레보토무스속 (Phlebotomus), 모래파리 (sand fly), 등에속 (Tabanus), 말파리 (horse fly), 크리옵스 (Chryops), 대모등에붙이 (deer fly), 체체파리속 (Glossina), 체체파리 (tsetse fly), 벼룩목 (Order Siphonaptera), 벼룩, 쥐벼룩속 (Xenopsylla), 노소실루스속 (Nosopsyllus), 노린재목 (Order Hemiptera), 원추형코노린재속 (Triatoma) 및 로드니우스 (Rhodnius) (키스 버그 (kissing bug)), 이목 (Order Anoplura), 흡혈 이, 사람이 (Pediculus humanis), 이, 먹파리 (black fly), 털진드기, 눈 각다귀 (Eye Gnat), 침파리 (stable fly), 대모등에붙이와 말파리, 진디, 이주성 메뚜기 (Migratory locust), 옥수수 멸구 (Maize planthopper), 삽주벌레 (Thrips), 파리, 인시류 (Lepidoptera), 선충류 (Nematode), 매미목 (Homoptera), 갑충류 (Coleoptera), 진드기, 흰개미, 독일 바퀴를 비롯한 바퀴, 개미, 진딧물과 (Aphididae), 메뚜기 (Acrididae), 풀고로모르파 (Fulgoromorpha), 꽃매미상과 (Fulgoroidea), 총채벌레과 (Thripidae), 관총채벌레과 (Phlaeothripidae), 잎말이나방과 (Tortricidae), 밤나방과 (Noctuidae), 포충나방과 (Crambidae), 밤나방과 (Noctuidae), 좀나방과 (Plutellidae), 명나방과 (Pyralidae), 씨스트선충과 (Heteroderidae), 가루이과 (Aleyrodidae), 잎벌레과 (Chrysomelidae), 거저리과 (Tenebrionidae), 바구미상과 (Curculionoidea), 곡물바구니 (grain weevil), 그라나리아바구미 (Sitophilus granarius), 쌀바구미 (rice weevil), 쌀바구미 (Sitophilus oryzae), 알팔파바구미 (Alfalfa weevil), 히페라 포스티카 (Hypera postica), 완두콩에서 씨앗 바구미 (Seed weevil), 콩 씨앗에서 완두콩바구미 (Bruchus pisorum), 강낭콩바구미 (Acanthoscelides obtectus), 점박이응애 (Tetranychidae), 흰개미과 (Rhinotermitidae), 건재흰개미 (Kalotermitidae), 바퀴과 (Blattellidae), 개미과 (Formicidae), 딱정벌레와 베드버그, 그리고 나방으로 구성된 군에서 선택되는 곤충 종이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다른 종으로부터 후각 수용체에 적용될 수 있다.
목적되는 화합물의 후각 활성 프로필 및 대표 후각 활성 프로필은 후각 활성 프로필 간에 상관의 계산, 예를 들면, 후각 활성 프로필 간에 유사성 척도의 계산을 통하여 비교될 수 있다. 대표 후각 활성 프로필은 데이터베이스에서 일군의 후각 활성 프로필 중에서의 하나일 수 있다. 대표 후각 활성 프로필은 역사 프로필일 수 있다. 목적되는 화합물의 후각 활성 프로필은 패널 내에 2개 이상의 후각 수용체의 활성에 대한 화합물의 효과를 표시하는 측정된 양을 포함할 수 있다. 각각의 대표 후각 활성 프로필은 패널 내에 2개 이상의 후각 수용체의 활성에 대한 개별 화합물의 효과를 표시하는 측정된 양을 포함한다.
일부 구체예에서, 대표 후각 활성 프로필에 상응하는 각각의 개별 화합물은 공지된 향기와 연관될 수 있다. 다시 말하면, 패널 내에 2개 이상의 후각 수용체의 활성에 대한 개별 화합물의 효과의 측정된 양은 공지된 향기와 연관될 수 있는 대표 전사체 프로필을 산출하기 위하여 조합될 수 있다. 대표 후각 활성 프로필의 데이터베이스는 컴퓨터 판독가능 저장 매체에 저장될 수 있다. 특정한 구체예에서, 데이터베이스는 적어도 10개의 대표 후각 활성 프로필, 적어도 50개의 대표 후각 활성 프로필, 적어도 100개의 대표 후각 활성 프로필, 적어도 500개의 대표 후각 활성 프로필, 적어도 1,000개의 대표 후각 활성 프로필, 적어도 10,000개의 대표 후각 활성 프로필, 또는 적어도 50,000개의 대표 후각 활성 프로필을 포함하고, 각각의 대표 후각 활성 프로필은 적어도 2, 적어도 10, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 2000, 적어도 2500, 적어도 7500, 적어도 10,000, 적어도 20,000, 적어도 25,000, 또는 적어도 35,000개의 성분의 측정된 양을 포함한다. 상기 구체예에서, 목적되는 화합물의 후각 활성 프로필은 목적되는 화합물의 후각 활성 프로필과 상관하는 (가령, 가장 유사한) 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필을 결정하기 위하여 복수의 대표 후각 활성 프로필에 비교될 수 있고, 그리고 목적되는 화합물은 이들 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필에 상응하는 개별 화합물과 연관된 공지된 향기(들)를 갖는 것으로 특성화될 수 있다.
다른 구체예에서, 목적되는 화합물은 공지된 향기와 연관될 수 있다. 상기 구체예에서, 목적되는 화합물의 후각 활성 프로필은 목적되는 화합물의 후각 활성 프로필과 상관하는 (가령, 가장 유사한) 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필을 결정하기 위하여 복수의 대표 후각 활성 프로필에 비교될 수 있고, 그리고 이들 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필에 상응하는 개별 화합물은 목적되는 화합물과 연관된 공지된 향기를 갖는 것으로 특성화될 수 있다.
일정한 구체예에서, 상관은 목적되는 화합물의 후각 활성 프로필 및 데이터베이스에 저장된 복수의 대표 후각 활성 프로필의 각각의 대표 후각 활성 프로필 사이에 비교될 수 있다. 상관은 패널 내에 2개 이상의 후각 수용체의 선별 활성에 대한 목적되는 화합물의 효과를 나타내는 목적되는 화합물의 후각 활성 프로필에서 측정된 양을 패널 내에 2개 이상의 후각 수용체의 동일한 선별 활성에 대한 상이한 화합물의 효과를 나타내는 대표 후각 활성 프로필에서 상응하는 측정된 양에 비교함으로써 계산될 수 있다. 목적되는 화합물의 후각 활성 프로필은 대표 후각 활성 프로필에서 측정된 양이 목적되는 화합물의 후각 활성 프로필에서 측정된 양의 대략 2%, 대략 5%, 대략 8%, 대략 10%, 대략 12%, 대략 15%, 대략 20%, 대략 25%, 대략 30%, 또는 대략 35% 내에 있으면, 대표 후각 활성 프로필과 상관하는 것으로 간주될 수 있다.
목적되는 화합물의 후각 활성 프로필은 목적되는 화합물의 후각 활성 프로필 및 대표 후각 활성 프로필 사이에 유사성 척도가 미리 결정된 역치를 초과하면, 대표 후각 활성 프로필에 가장 유사한 것으로 간주될 수 있다. 특정한 구체예에서, 미리 결정된 역치는 대표 후각 활성 프로필에서 측정된 양이 목적되는 화합물의 후각 활성 프로필에서 측정된 양의 대략 2%, 대략 5%, 대략 8%, 대략 10%, 대략 12%, 대략 15%, 대략 20%, 대략 25%, 대략 30%, 또는 대략 35% 내에 있음을 지시하는 유사성 척도의 값으로서 결정될 수 있다.
일부 구체예에서, 목적되는 화합물의 후각 활성 프로필은 벡터 p로 표시될 수 있다:
p = [ p 1, . . . p i , . . . p n]
여기서 p i 는 i'번째 성분의 측정된 양, 예를 들면, 패널 내에 소정의 후각 수용체의 i'번째 생물학적 활성에 대한 목적되는 화합물의 효과이다. 특정한 구체예에서, n은 2 이상, 10 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 1000 이상, 2000 이상, 2500 이상, 7500 이상, 10,000 이상, 20,000 이상, 25,000 이상, 또는 35,000 이상이다. 각각의 대표 후각 활성 프로필 역시, 벡터 p로 표시될 수 있다. 상관을 계산할 때, 목적되는 화합물에 대한 후각 활성 프로필을 나타내는 벡터에서 i'번째 성분의 측정된 양은 각 성분 i = 1 … n에 대한 대표 후각 활성 프로필을 나타내는 벡터의 i'번째 성분의 상응하는 측정된 양에 비교될 수 있다.
상관은 목적되는 화합물의 후각 활성 프로필 및 대표 후각 활성 프로필 사이에 상관이 존재하는 지를 확인하기 위하여, 2개의 데이터세트가 관련되는 확률 (probability)이 본 발명의 방법에 따라서 이용될 수 있는 지를 결정하기 위한 당분야에서 임의의 통계학적 방법을 이용하여 계산될 수 있다. 가령, 목적되는 화합물의 후각 활성 프로필 (pi 1) 및 각각의 대표 후각 활성 프로필 (pi 2) 사이에 상관은 유사성 측정 규준 sim(pi 1, pi 2)을 이용하여 계산될 수 있다. 유사성 측정 규준 sim(pi 1, pi 2)을 계산하는 한 가지 방법은 유클리드 거리 (Euclidean distance)의 음의 제곱근 (negative square)을 계산하는 것이다. 대안적 구체예에서, 유클리드 거리 이외의 측정 규준, 예를 들면, 맨하탄 거리 (Manhattan distance), 체비쉐프 거리 (Chebychev distance), 벡터 간에 각도, 상관 거리, 표준화된 유클리드 거리, 마할라노비스 거리 (Mahalanobis distance), 제곱된 피어슨 상관 계수 (squared Pearson correlation coefficient), 또는 민코우스키 거리 (Minkowski distance)가 sim(pi 1, pi 2)을 계산하는데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 피어슨 상관 계수, 유클리디안 제곱 거리, 유클리디안 제곱 합, 또는 제곱된 피어슨 상관 계수가 유사성을 결정하는데 이용된다. 이들 측정 규준은 예로써, SAS (Statistics Analysis Systems Institute, Cary, North Carolina) 또는 S-Plus (Statistical Sciences, Inc., Seattle, Washington)를 이용하여 계산될 수 있다. 이들 측정 규준의 이용은 Draghici, 2003, Data Analysis Tools for DNA Microarrays, Chapman & Hall, CRC Press London, chapter 11에서 기술되고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
상관은 또한, 행렬 (rank)에 기초하여 계산될 수 있는데, 여기서 x i 와 y i 는 오름차순 또는 내림차순으로, 측정된 양의 값의 행렬이다. 예로써, Conover, Practical Nonparametric Statistics, 2nd ed., Wiley, (1971)를 참조한다. 또한, 새년 상호 정보량 (Shannon mutual information)이 유사성 척도로서 이용될 수 있다. 예로써, Pierce, An Introduction To Information Theory: Symbols, Signals, and Noise, Dover, (1980)를 참조하고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
당분야에 공지된 다양한 식별자 (classifier)는 본 출원에서 기술된 방법에 따라서 훈련 (training)되고, 그리고 목적되는 화합물을 향기에 대하여 분류 (classification)하는데 이용될 수 있다. 목적되는 화합물의 후각 활성 프로필을 이용하여 목적되는 화합물의 향기를 예측할 수 있는 식별자를 산출하는데 알고리즘이 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 식별자는 이전에 특성화된 화합물의 대표 후각 활성 프로필에서 측정된 양 및 이전에 특성화된 화합물과 연관된 공지된 향기를 이용하여, 향기에 대하여 화합물을 분류하기 위하여 훈련될 수 있다. 대표 후각 활성 프로필에 상응하는 각각의 개별 화합물은 공지된 향기와 연관될 수 있다. 식별자는 이전에 특성화된 화합물의 대표 후각 활성 프로필에서 측정된 양 및 이전에 특성화된 화합물과 연관된 공지된 향기를 평가하는 비-감독된 또는 감독된 학습 알고리즘을 적용함으로써 분류에 이용되는 알고리즘일 수 있다. 목적되는 화합물의 후각 활성 프로필은 목적되는 화합물을 향기에 대하여 분류하는 식별자를 이용하여 처리될 수 있다. 다시 말하면, 식별자는 이러한 부류를 훈련하는데 이용되는 복수의 대표 후각 활성 프로필과 연관된 하나 이상의 공지된 향기에 대하여 목적되는 화합물을 분류하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 목적되는 화합물은 공지된 향기와 연관될 수 있다. 상기 구체예에서, 식별자는 목적되는 화합물의 후각 활성 프로필에 기초하여, 목적되는 화합물의 공지된 향기와 연관될 수 있는 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필을 확인하도록 훈련될 수 있다. 식별자는 개별 화합물의 대표 후각 활성 프로필에서 측정된 양을 평가하고, 그리고 목적되는 화합물의 후각 활성 프로필에 기초하여 목적되는 화합물의 공지된 향기와 연관될 수 있는 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필을 확인하는 비-감독된 또는 감독된 학습 알고리즘을 적용함으로써 분류에 이용되는 알고리즘일 수 있다.
당분야에 공지된 임의의 표준 비-감독된 또는 감독된 학습 기술이 식별자를 산출하는데 이용될 수 있다. 하기는 당분야에 공지된 비-감독된 및 감독된 알고리즘의 무제한적 실례이다. 본 출원에서 개시를 고려하면, 당업자는 다른 패턴 분류 또는 회귀 기술 및 알고리즘이 식별자에 이용될 수 있고, 그리고 본 발명이 이와 같은 모든 기술을 포괄한다는 것을 인지할 것이다.
신경 네트워크. 일부 구체예에서, 식별자는 신경 네트워크를 이용하여 학습된다. 신경 네트워크는 2-단계 회귀 또는 분류 결정 규칙이다. 신경 네트워크는 출력 단위 (output unit)의 층에 가중치 (weight)에 의해 연결된 입력 단위 (input unit)의 층 (및 치우침 (bias))을 포함하는 층상 구조를 갖는다. 회귀의 경우에, 출력 단위의 층은 전형적으로, 단지 1개의 출력 단위를 포함한다. 하지만, 신경 네트워크는 한결같은 방식으로 복합 정량적 반응을 처리할 수 있다.
다중층 신경 네트워크에서, 입력 단위 (입력 층), 숨은 단위 (숨은 층), 그리고 출력 단위 (출력 층)가 존재한다. 더 나아가, 입력 단위 이외에 각 단위에 연결되는 단일 치우침 단위 (bias unit)가 존재한다. 신경 네트워크는 Duda et al., 2001, Pattern Classification, Second Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York; 그리고 Hastie et al., 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer-Verlag, New York에서 기술되고, 이들 각각은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 신경 네트워크는 또한, Draghici, 2003, Data Analysis Tools for DNA Microarrays, Chapman & Hall/CRC; 그리고 Mount, 2001, Bioinformatics: sequence and genome analysis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York에서 기술되고, 이들 각각은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 하기에 논의되는 것은 신경 네트워크의 일부 예시적인 형태이다. 신경 네트워크의 이용에 기본적인 접근법은 훈련되지 않은 네트워크로 시작하고, 입력 층에 훈련 패턴 (training pattern)을 제공하고, 망을 통하여 신호를 통과시키고, 그리고 출력 층에서 출력을 결정하는 것이다. 이들 출력은 이후, 표적 값에 비교된다; 임의의 차이는 오차에 해당한다. 분류의 경우에, 이러한 오차는 제곱 오차 (squared error) 또는 교차-엔트로피 (cross-entropy) (편차)일 수 있다. 예로써, Hastie et al., 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer-Verlag, New York을 참조하고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
통상적으로 이용되는 3가지 훈련 프로토콜은 추계 (stochastic), 배치 (batch), 그리고 온-라인 (on-line)이다. 추계 훈련에서, 패턴은 훈련 세트로부터 무작위로 선택되고, 그리고 네트워크 가중치 (network weight)는 각 패턴 표현에 대하여 업데이트된다. 기울기 하강 (gradient descent) 방법, 예를 들면, 추계 역전파 (stochastic back-propagation)에 의해 훈련된 다중층 비선형 네트워크는 네트워크 위상 (network topology)에 의해 정의된 식별자에서 가중치 값의 최대 우도 추정 (maximum-likelihood estimation)을 수행한다. 배치 훈련에서, 모든 패턴은 학습이 발생하기 이전에, 네트워크에 제공된다. 전형적으로, 배치 훈련에서, 훈련 데이터를 통하여 여러 통로가 만들어진다. 온-라인 훈련에서, 각 패턴은 망에 1회, 그리고 단지 1회 제공된다.
3가지-층 네트워크의 이용에서 재현되는 문제점은 네트워크에 이용되는 숨은 단위의 최적 숫자이다. 3가지-층 네트워크의 입력 및 출력의 숫자는 상기 문제점이 해결되면 결정된다. 본 발명에서, 소정의 신경 네트워크에 대한 입력의 숫자는 Y로부터 선별된 생물마커 (biomarker)의 숫자에 동등할 것이다. 신경 네트워크에 대한 출력의 숫자는 전형적으로, 단지 1일 것이다. 너무 많은 숨은 단위가 신경 네트워크에 이용되면, 상기 네트워크는 너무 많은 자유도 (degree of freedom)를 갖게 될 것이고, 그리고 너무 길게 훈련되면, 상기 네트워크가 데이터를 오버피팅 (overfitting)하는 위험이 있다. 너무 적은 숨은 단위가 존재하면, 훈련 세트가 학습될 수 없다. 하지만, 일반적으로 말하면, 숨은 단위는 너무 적은 것보다는 너무 많은 것이 더 낮다. 숨은 단위가 너무 적은 경우에, 식별자가 데이터 내에서 비선형성 (nonlinearity)을 포착할 만큼 충분한 융통성 (flexibility)을 갖지 못할 수도 있다; 숨은 단위가 너무 많은 경우에, 하기에 기술된 바와 같은 적절한 정규화 (regularization) 또는 가지치기 (pruning)가 이용되면, 추가 가중치 (extra weight)가 0으로 축소될 수 있다. 전형적인 구체예에서, 숨은 단위의 숫자는 5 내지 100의 범위 내에 있고, 그리고 입력의 숫자 및 훈련 사례의 숫자가 증가함에 따라 증가한다.
군집화 (clustering). 일부 구체예에서, 식별자는 군집화를 이용하여 학습된다. 일부 구체예에서, 대표 후각 활성 프로필을 나타내는 벡터의 선택 성분 i가 후각 활성 프로필을 군집시키는데 이용된다. 일부 구체예에서, 군집화에 앞서, 측정된 양은 0의 평균 값 및 단위 분산 (unit variance)을 갖도록 표준화된다.
훈련 개체군 전역에서 측정된 양의 유사한 패턴을 보이는 대표 후각 활성 프로필은 함께 군집될 것이다. 성분 i의 측정된 양의 특정 조합은 이들 벡터가 특정 공지된 향기에 대한 군집을 형성할 때, 본 발명의 이러한 측면에서 우수한 식별자인 것으로 간주될 수 있다. 예로써, Duda and Hart, Pattern Classification and Scene Analysis, 1973, John Wiley & Sons, Inc., New York (이하, "Duda 1973")의 페이지 211-256을 참조하고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. Duda 1973의 섹션 6.7에 기술된 바와 같이, 군집화 문제점은 데이터세트에서 자연 집단화 (natural grouping)를 발견하는 것으로 기술된다. 자연 집단화 (nature grouping)를 확인하기 위하여, 2가지 문제점이 다뤄진다. 먼저, 2개의 후각 활성 프로필 사이에 유사성 (또는 부동성)을 측정하는 방법이 결정된다. 이러한 측정 규준 (유사성 척도)은 한 군집에서 후각 활성 프로필이 다른 후각 활성 프로필에 비하여 서로 더욱 유사하도록 담보하는데 이용된다. 둘째, 이러한 유사성 척도를 이용하여 데이터를 군집 내로 분배 (partition)하기 위한 메커니즘이 결정된다.
유사성 척도는 Duda 1973의 섹션 6.7에서 논의되고, 여기서 군집화 조사를 시작하는 한 가지 방법이 거리 함수를 규정하고 후각 활성 프로필의 쌍 사이에 거리의 매트릭스 (matrix of distance)를 계산하는 것이라고 언급된다. 거리가 우수한 유사성 척도이면, 동일한 군집 내에 후각 활성 프로필 간에 거리는 상이한 군집 내에 후각 활성 프로필 간에 거리보다 훨씬 적을 것이다. 하지만, Duda 1973의 페이지 215에 언급된 바와 같이, 군집화는 거리 측정 규준의 이용을 필요로 하지 않는다. 가령, 비계측 유사성 함수 s(x, x′)가 2개의 벡터 x와 x′를 비교하는데 이용될 수 있다. 전통적으로, s(x, x′)는 x와 x′가 다소간 "유사"할 때 값이 큰 대칭 함수이다. 비계측 유사성 함수 s(x, x′)의 실례는 Duda 1973의 페이지 216에 제공된다.
데이터세트 내에 포인트 간에 "유사성" 또는 "부동성"을 측정하는 방법이 일단 선택되면, 군집화는 상기 데이터의 분배의 군집화 질을 측정하는 기준 함수 (criterion function)를 필요로 한다. 기준 함수를 극단화 (extremization)시키는 데이터세트의 분배가 상기 데이터를 군집시키는데 이용된다. 예로써, Duda 1973의 페이지 217을 참조한다. 기준 함수는 Duda 1973의 섹션 6.8에서 논의된다. 더욱 최근에, Duda et al., Pattern Classification, 2nd edition, John Wiley & Sons, Inc. New York가 발간되었다. 페이지 537-563에서는 군집화를 상세하게 기술한다. 군집화 기술에 관한 추가 정보는 Kaufman and Rousseeuw, 1990, Finding Groups in Data: An Introduction to Cluster Analysis, Wiley, New York, NY; Everitt, 1993, Cluster analysis (3d ed.), Wiley, New York, NY; 그리고 Backer, 1995, ComputerReasoning in Cluster Analysis, Prentice Hall, Upper Saddle River, New Jersey에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 특정한 예시적인 군집화 기술에는 계층 군집화 (hierarchical clustering) (최근린 알고리즘 (nearest-neighbor algorithm), 완전 연결 알고리즘 (farthest-neighbor algorithm), 평균 연결 알고리즘 (average linkage algorithm), 중심 알고리즘 (centroid algorithm), 또는 제곱 합 알고리즘을 이용한 병합식 군집화), k-평균 군집화, 불분명 k-평균 군집화 알고리즘, 그리고 Jarvis-Patrick 군집화가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
주성분 분석 (principal component analysis). 일부 구체예에서, 식별자는 주성분 분석을 이용하여 학습된다. 주성분 분석은 데이터를 상기 데이터의 특징을 요약하는 새로운 일단의 변수 (주성분)로 변환시킴으로써 데이터세트의 차원 (dimensionality)을 감소시키는 고전적인 기술이다. 예로써, Jolliffe, 1986, Principal Component Analysis, Springer, New York을 참조하고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 주성분 분석은 또한, Draghici, 2003, Data Analysis Tools for DNA Microarrays, Chapman & Hall/CRC에서 기술되고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 하기는 주성분 분석의 무제한적 실례이다.
주성분 (PC)은 서로 관련이 없고, 그리고 k th PC가 PC 사이에 k th 최대 분산 (largest variance)을 갖도록 정돈된다. k th PC는 첫 번째 k - 1 PC에 직각이 되도록 데이터 포인트 (data point)의 돌출 (projection)의 편차를 극대화시키는 방향으로서 해석될 수 있다. 첫 번째 소수의 PC는 데이터세트 내에서 대부분의 편차를 포획한다. 대조적으로, 마지막 남은 소수의 PC는 종종, 데이터 내에서 잔여 '소음'만을 포획하는 것으로 추정된다.
식별자를 학습하기 위하여 PCA를 이용하는 한 가지 접근법에서, 대표 후각 활성 프로필을 나타내는 벡터는 상기 군집화에서 기술된 동일한 방식으로 고안될 수 있다. 실제로, 각 벡터가 대표 후각 활성 프로필을 나타내는 일단의 벡터는 매트릭스 (matrix)로서 간주될 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 매트릭스는 단위체 (monomer)의 정성적 이원 설명 (qualitative binary description)의 Free-Wilson 방법으로 표현되고 (Kubinyi, 1990, 3D QSAR in drug design theory methods and applications, Pergamon Press, Oxford, pp 589-638, 이는 본 발명에 참조로서 편입됨), 그리고 첫 번째 주성분 (PC)이 가능한 최대량의 분산 정보를 포획하고, 두 번째 주성분 (PC)이 모든 분산 정보의 두 번째 최대량을 포획하고, 그리고 매트릭스 내에 모든 분산 정보가 고려될 때까지 그러하도록 PCA를 이용하여 최대로 압축된 공간 내에 분포된다.
이후, 훈련 개체군 (가령, 대표 후각 활성 프로필)의 구성원을 나타내는 각각의 벡터는 플롯팅 (plotting)된다. 많은 상이한 유형의 플롯 (plot)이 가능하다. 일부 구체예에서, 1-차원 플롯 (one-dimensional plot)이 만들어진다. 이러한 1-차원 플롯에서, 훈련 개체군의 각 구성원으로부터 첫 번째 주성분에 대한 값이 플롯팅된다. 이러한 형태의 플롯에서, 향기에 상응하는 후각 활성 프로필은 첫 번째 주성분 값의 범위 내에 군집하고, 그리고 다른 향기에 상응하는 프로필은 첫 번째 주성분 값의 두 번째 범위 내에 군집할 것으로 예상된다.
일부 구체예에서, 훈련 개체군의 구성원은 하나 이상의 주성분에 대하여 플롯팅된다. 가령, 일부 구체예에서, 훈련 개체군의 구성원은 2-차원 플롯 상에 플롯팅되는데, 여기서 첫 번째 차원은 첫 번째 주성분이고 두 번째 차원은 두 번째 주성분이다.
최근린 분석. 일부 구체예에서, 식별자는 최근린 분석을 이용하여 학습된다. 최근린 식별자는 기억-기초되고, 그리고 피팅 (fitting)되는 식별자를 필요로 하지 않는다. 쿼리 포인트 (query point) x 0을 고려하면, x 0에 최단 거리인 k 훈련 포인트 x ( r ), r, …, k가 확인되고, 이후 포인트 x 0가 k 최근린을 이용하여 분류된다. 유대는 무작위로 깨질 수 있다. 일부 구체예에서, 특징 공간 (feature space) 내에 유클리드 거리는
Figure pct00001
로서 거리를 결정하는데 이용된다.
전형적으로, 최근린 알고리즘이 이용될 때, 선형 판별식 (linear discriminant)을 계산하는데 이용된 Y로부터 존재비 데이터는 0 평균 및 1 분산을 갖도록 표준화된다. 본 발명에서, 훈련 개체군의 구성원은 훈련 세트 및 검사 세트로 무작위로 분할된다. 가령, 한 구체예에서, 훈련 개체군의 구성원 중에서 2/3가 훈련 세트에 배치되고, 그리고 훈련 개체군의 구성원 중에서 1/3이 검사 세트에 배치된다. 벡터 성분 i의 선택 조합은 검사 세트의 구성원이 플롯팅되는 특징 공간을 나타낸다. 이후, 검사 세트의 구성원을 정확하게 특성화하는 훈련 세트의 능력이 계산된다. 일부 구체예에서, 최근린 계산은 벡터 성분 i의 소정의 조합에 대하여 수회 수행된다. 이러한 계산의 각 반복에서, 훈련 개체군의 구성원은 훈련 세트 및 검사 세트에 무작위로 지정된다.
이러한 최근린 규칙은 불평등 클래스 우선 (unequal class prior), 차별적 미스클래스 비용 (differential misclass cost), 그리고 특징 선택 (feature selection)의 문제점을 다루기 위하여 정밀화 (refinement)될 수 있다. 이들 정밀화 중에서 다수는 이웃에 대한 일부 형태의 가중된 투표 (weighted voting)를 수반한다. 최근린 분석에 관한 더욱 많은 정보를 위하여, Duda, Pattern Classification, Second Edition, 2001, John Wiley & Sons, Inc; 그리고 Hastie, 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer, New York를 참조하고, 이들 각각은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
선형 판별식 분석. 일부 구체예에서, 식별자는 선형 판별식 분석을 이용하여 학습된다. 선형 판별식 분석 (LDA)은 일정한 객체 특성에 기초하여, 주체 (subject)를 2가지 범주 중에서 하나로 분류하는 것을 시도한다. 다시 말하면, LDA는 실험 동안 측정된 객체 속성이 이들 객체의 범주화 (categorization)를 예언하는 지를 조사한다. LDA는 전형적으로, 연속 독립 변수 (continuous independent variable) 및 2분 범주 종속 변수 (dichotomous categorical dependent variable)를 필요로 한다. 본 발명에서, 훈련 개체군의 부분집합 전역에서 벡터 성분 i의 선택 조합에 대한 존재비 값은 필수 연속 독립 변수로서 기능한다. 훈련 개체군의 구성원 각각의 형질 부분군 분류 (가령, 향기)는 2분 범주 종속 변수로서 기능한다.
LDA는 집단화 정보를 이용함으로써 군간 분산 및 군내 분산의 비율을 극대화시키는 변수의 선형 조합을 찾는다. 암묵적으로, LDA에 의해 이용되는 선형 가중치 (linear weight)는 훈련 세트 전역에서 벡터 성분 i의 측정된 양이 향기의 군 내에서 어떻게 분리하는 지에 좌우된다. 일부 구체예에서, LDA는 훈련 개체군 내에 구성원의 데이터 매트릭스에 적용된다. 이후, 훈련 개체군의 각 구성원의 선형 판별식이 플롯팅된다. 이상적으로, 향기를 나타내는 훈련 개체군의 구성원은 선형 판별식 값 (가령, 음성)의 범위 내로 군집하고, 그리고 다른 향기를 나타내는 훈련 개체군의 구성원은 선형 판별식 값 (가령, 양성)의 두 번째 범위 내로 군집할 것이다. LDA는 판별식 값의 군집 간에 분리가 더욱 클 때, 더욱 성공적인 것으로 간주된다. 선형 판별식 분석에 관한 더욱 많은 정보를 위하여, 예로써, Duda, Pattern Classification, Second Edition, 2001, John Wiley & Sons, Inc; Hastie, 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer, New York; 그리고 Venables & Ripley, 1997, Modern Applied Statistics with s-plus, Springer, New York를 참조하고, 이들 각각은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
2차 판별식 분석. 일부 구체예에서, 식별자는 2차 판별식 분석을 이용하여 학습된다. 2차 판별식 분석 (QDA)은 LDA와 동일한 입력 파라미터를 취하고 동일한 결과를 보고한다. QDA는 결과를 산출하기 위하여, 선형 방정식 보다는 2차 방정식을 이용한다. LDA 및 QDA는 호환가능하고, 그리고 어떤 것을 이용할 것인가는 선호도 (preference) 및/또는 분석을 뒷받침하는 소프트웨어의 이용가능성 (availability)의 문제이다. 로지스틱 회구분석 (logistic regression)은 LDA 및 QDA와 동일한 입력 파라미터를 취하고 동일한 결과를 보고한다.
서포트 벡터 머신 (support vector machine). 일부 구체예에서, 식별자는 서포트 벡터 머신을 이용하여 학습된다. SVM는 예로써, Cristianini and Shawe-Taylor, 2000, An Introduction to Support Vector Machines, Cambridge University Press, Cambridge; Boser et al., 1992, "A training algorithm for optimal margin classifiers," in Proceedings of the 5 th Annual ACM Workshop on Computational Learning Theory, ACM Press, Pittsburgh, PA, pp. 142-152; Vapnik, 1998, Statistical Learning Theory, Wiley, New York; Mount, 2001, Bioinformatics: sequence and genome analysis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Duda, Pattern Classification, Second Edition, 2001, John Wiley & Sons, Inc.; Hastie, 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer, New York; 그리고 Furey et al., 2000, Bioinformatics 16, 906-914에서 기술되고, 이들 각각은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 분류에 이용될 때, SVM은 소정의 일단의 이원 표지된 데이터 훈련 데이터로부터 최대한으로 떨어진 초평면 (hyper-plane)으로 이들 데이터를 분리한다. 선형 분리 (linear separation)가 가능하지 않은 경우에, SVM은 특징 공간에 비-선형 맵핑 (mapping)을 자동적으로 실현시키는 'kernels'의 기술과 공동으로 작동할 수 있다. 특징 공간 내에서 SVM에 의해 발견된 초평면은 입력 공가 내에서 비-선형 결정 경계 (decision boundary)에 해당한다. 서포트 벡터 머신에 관한 더욱 많은 정보를 위하여, 예로써, Furey et al., 2000, Bioinformatics 16, page 906-914를 참조하고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
결정 트리 (decision tree). 한 구체예에서, 식별자는 결정 트리이다. 결정 트리는 Duda, 2001, Pattern Classification, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 395-396에서 전반적으로 기술되고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 이용될 수 있는 한 가지 특정한 알고리즘은 분류 및 회귀 트리 (CART). 다른 특정한 알고리즘에는 ID3, C4.5, MART, 그리고 Random Forests. CART, ID3, 그리고 C4.5가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들 각각은 Duda, 2001, Pattern Classification, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 396-408 및 pp. 411-412에서 기술되고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. CART, MART, 그리고 C4.5는 또한, Hastie et al., 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer-Verlag, New York, Chapter 9에서 기술되고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. Random Forests 기술은 Breiman, 1999, "Random Forests - Random Features," Technical Report 567, Statistics Department, University of California at Berkeley, September 1999에서 기술되고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
각 분할이 상응하는 벡터 성분 i에 대한 측정된 양, 또는 벡터 성분 i의 상대적인 측정된 양에 기초하는 단변량 결정 트리 이외에, 식별자는 다변량 결정 트리일 수 있다. 이런 다변량 결정 트리에서, 이들 결정의 일부 또는 전부는 실제로, 복수의 벡터 성분 i에 대한 측정된 양의 선형 조합을 포함한다. 다변량 결정 트리는 Duda, 2001, Pattern Classification, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 408-409에서 기술되고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
다변량 적응 회귀 스플라인 (multivariate adaptive regression spline). 쌍대 확률 (pairwise probability) 함수 g pq (X, W pq )를 학습하는데 이용될 수 있는 다른 접근법은 다변량 적응 회귀 스플라인 (MARS)을 이용한다. MARS는 회귀에 대한 적응 절차이고, 그리고 본 발명에 의해 해결되는 고-차원 문제에 매우 적합하다. MARS는 회귀 환경에서 CART의 성능을 향상시키기 위하여 CART 방법의 단계별 선형 회귀 또는 변형의 일반화 (generalization)로서 간주될 수 있다. MARS는 Hastie et al., 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer-Verlag, New York, pp. 283-295에서 기술되고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
중심 식별자 기술. 한 구체예에서, 최근 중심 (nearest centroid) 식별자 기술이 이용된다. 이런 기술은 상이한 향기에 대하여, 훈련 개체군 (대표 후각 활성 프로필) 내에 벡터 성분 i의 평균 측정된 양에 의해 제공된 중심을 계산하고, 이후 목적되는 화합물을 나타내는 벡터를 중심이 최근인 부류에 지정한다. 이러한 접근법은 군집이 공지된 부류에 의해 대체되는 점을 제외하고, k-평균 군집화와 유사하다. 이러한 접근법의 실례는 Prediction Analysis of Microarray, 또는 PAM이다. 예로써, Tibshirani et al., 2002, Proceedings of the National Academy of Science USA 99; 6567-6572를 참조하고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
회귀. 일부 구체예에서, 식별자는 회귀 식별자, 예를 들면, 로지스틱 회귀 식별자이다. 이런 회귀 식별자는 식별자를 고안하는데 이용된 각각의 후각 활성 프로필에 대한 계수를 포함한다. 이런 구체예에서, 회귀 식별자에 대한 이들 계수는 예로써, 최대 우도 접근법 (maximum likelihood approach)을 이용하여 계산된다. 이런 계산에서, 벡터 성분 i의 측정된 양이 이용된다.
기타 방법. 일부 구체예에서, 식별자는 k-최근린 (k-NN), 인공 신경 네트워크 (ANN), 파라메트릭 선형 방정식 (parametric linear equation), 파라메트릭 2차 방정식 (parametric quadratic equation), Naive Bayes 분석, 선형 판별식 분석, 결정 트리, 또는 방사 기저 함수 (radial basis function)를 이용하여 학습된다.
본 발명의 일부 구체예에서는 도 1에 도시된 프로그램 모듈 중에서 한 가지 또는 모두를 포함하는 컴퓨터 프로그램 산물을 제시한다. 이들 프로그램 모듈의 양상은 하기에 더욱 기술된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 생물학적 약제, 예를 들면, 분비된 단백질을 발현하는 세포 또는 세포주, 또는 세포 또는 세포주 패널을 제시한다. 분비된 단백질에는 항체 및 이의 활성 단편, 예를 들면, 중쇄와 경쇄를 포함하는 항체, 단일 사슬 항체, 면역계에서 활성을 갖는 단백질, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 단백질 또는 이들의 활성 단편, 효소, 응고 인자 또는 호르몬, 또는 이들 중에서 한 가지의 단편에 상응하는 단백질이 포함될 수 있다. 생물학적 약제에는 또한, FDA-승인된 생물학적 약제, 공지된 생물학적 약제, 치료 활성인 단백질, 또는 치료 생물학적 약제가 포함된다. 생물학적 약제의 실례 및 이들의 상품명에는 카나키누맙 (Ilaris), Abo 보툴리눔 독소 A (Dysport), 골리무맙 (Simponi), 로미플로스팀 (NPLATE), 세톨리주맙페골 (Cimzia), 릴로나셉트 (Arcalyst), 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-에포에틴 베타 (Mircera), 에쿨리주맙 (Soliris), 파니투무맙 (Vectibix), 이두설파아제 (Elaprase), 라니비주맙 (Lucentis), 알글루코시다아제 알파 (Myozyme), 아바타셉트 (Orencia), 갈설파제 (Naglazyme), 팔리페르민 (Kepivance), 나탈리주맙 (Tysabri), 베바시주맙 (Avastin), 세툭시맙 (Erbitux), 노페투모맙 (Verluma), 카프로맙 펜데티드 (ProstaScint), 에포에틴 알파 (Procrit, Epogen), 테르네툼 파놀레소맙 (NeutroSpec), 알시투모맙 (CEA-Scan), 다베포에틴 알파 (Aranesp), 우로키나아제 (Abbokinase), 이브리투모맙 티욱세탄(Zevalin), 리툭시맙 (Rituxan), 알데스류킨 (Proleukin), 데닐류킨 디프티톡스 (Ontak), 페가스파가제 (Oncaspar), 필그라스팀 (Neupoen), 오프렐베킨 (Neumega), 페그필그래스팀 (Nuelasta), 사그라모스팀 (Leukine), 팔리페르민 (Kepivance), 트라스투주맙 (Herceptin), 세툭시맙 (Eribitux), 아스파르기나아제 (Elspar), 라스부리카제 (Elitek), 알렘투주맙 (Campath), 토시투모맙 (Bexxar), 팔리비주맙 (Synagis), 인터페론 알파-2a (Roferon-A), 페그인터페론 알파-2b (Peg-인트론), 페그인터페론 알파-2a (Pegasys), 인터페론 알파-2b (인트론 A), 인터페론 알파콘-1 (Infergen), 페그인터페론 알파-2 (Copasys Copegus), 다클리주맙 (Zenapax), 바실릭시맙 (Simulect), 무로모납-CD3 (Orthocolone, OKT3), 인터페론 감마-1b (Actimmune), 드로트레코긴 알파-활성화된 (Xigris), 콜라게나아제 (Santyl), 베카플레르민 (Regranex), 에팔리주맙 (Raptiva), 알레파셉트 (Amevive), 인터페론 알파-n3 (Alferon N), 갈설파아제 (Naglazyme), 아갈시다아제 베타 (Fabrazyme), 라로니다제 (Aldurazyme), 인플릭시맙 (Remicade), 아바타셉트 (Orencia), 아나킨라 (Kineret), 아달리무맙 (Humira), 엔테라셉트 (Enbrel), 오말주맙 (Xolair), 도르나제 알파 (Pulmozyme), 나탈리주맙 (Tysabri), 인터페론 베타-1-a (Rebif), 보툴리눔 독소 유형 B (Myobloc), 보툴리눔 독소 유형 A (Botox), 인터페론 베타-1-b (Betaseron), 인터페론 베타-1-a (Avonex), 테넥테플라제 (TNKase), 스트렙토키나아제 (Streptase), 레테플라제 (Retavase), 압식시맙 (ReoPro), 알테플라제 (Cathflo Activase, Activase), Epo 알파 (Abseamed, Binocrit), 이두로네이트 2-설파타제 (Elaprase), 인슐린 (Exubera), HPV 백신 (Gardasil), 페가타닙 (Macugen), 인간 산-a-글루코시다아제 (Myozyme), 갈설파아제 (Naglazyme), 인간 성장 호르몬 (Omnitrope), 부갑상선 호르몬 (Preotach), 인간 성장 호르몬 (Valtropin), 안티트롬빈 (Atryn), HPV로부터 주요 캡시드 L1 단백질 (Cervarix), erythropoietin alfa (Epotein alfa hexal), 메카세르민 인간 IGF-1 (Increlex), 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-에포에틴 베타 (MIrcera), 폴리트로핀 알파/루트로핀 알파 퍼고베리스, 에포에틴 제타 (Retacrit, Silapo), 리바비린 및 인터페론 알파-2b (Rebetron Combination Therapy), 알글루세라제 (Ceredase), 이미글루세라제 (Cerezyme), 인간 인슐린 (Humulin, Novolin), 소마트로핀 (Humatrope, Nutropin/Nutropin AQ), 세르모렐린 (Geref), 소마트렘 (Protopin), 인간 알부민 (Albutein), 그리고 젬투주맙 (Mylotarg)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
분비된 단백질의 발현을 위하여 최적 특성을 갖는 세포와 세포주는 번역후 가공 또는 변형, 수율, 활성 산율 백분, 일정한 특성의 안정성 (가령, 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 하지만 시간의 흐름 동안 이들 특성을 조사함으로써), 그리고 화학량론 (가령, RT-PCR 또는 단백질 분석에 의해)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 특성에 대하여 클론을 특성화시키는 공지된 검사를 이용하여 선별될 수 있다.
분비된 단백질의 번역후 가공 또는 변형은 단백질 염기서열분석, 질량분석법, 당화 또는 인산화를 조사하는 방법, 또는 분비된 단백질 산물의 특정한 또는 원하는 형태를 산출하는 세포주 및 조건을 선별하기 위한 화학적 기 또는 잔기의 공유 부가가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 당분야에 공지된 검사법에 의해 특성화될 수 있다. 세포와 세포주는 예로써, 번역후 가공 또는 변형을 촉매하는 효소에 상응하는 서열을 도입함으로써, 또는 세포주를 조사하여 이들을 내생적으로 발현하는 또는 이들을 발현하도록 유전자-활성화되는 것들을 선별함으로써, 분비된 산물의 번역후 가공 또는 변형을 달성하는 하나 이상의 인자를 발현하도록 설계되거나 선별될 수 있다.
분비된 산물의 최대 생산 또는 수율을 갖는 세포와 세포주는 분비된 단백질 산물 수준을 평가하는 방법, 예를 들면, ELISA 방법 (가령, FC 단편을 검출하여 항체 수율을 평가하는 ELISA)을 이용하여, 분리된 클론을 조사함으로써 생산될 수 있다.
분비된 산물의 총 수율과 비교하여 활성 분비된 단백질 최대 백분을 산출하는 세포와 세포주는 상기 단백질의 활성 또는 결합을 평가하는 방법, 예를 들면, 활성 분석, 기능 분석, 또는 결합 분석, 예를 들면, 기능적 세포 기초된 분석, 결합 에피토프를 포함하는 포획 시약을 이용한 ELISA, 이차 검사, 상기 단백질의 결합 또는 활성을 측정하는데 이용되는 동물 연구 또는 검사를 이용하여, 분리된 클론을 조사함으로써 생산될 수 있다.
동물 성분 없는 배지 조건에서 및/또는 규모 확대된 생산을 위한 반응기에서 이용되는 바와 같은 현탁 조건에서 성장을 위하여 부가적으로 최적화되는 세포주는 이들 및/또는 유사한 조건 하에 세포주 생산에 이용되는 방법을 수행함으로써, 또는 원하는 특성을 갖는 세포주를 확인하기 위한 원하는 조건 하에 클론을 조사함으로써 생산될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 성장을 정상적으로 지체시키거나 방해하는 화합물로 보충된 배지에서 성장을 위하여 부가적으로 최적화되는 세포주는 동일한 세포 유형의 대부분의 세포와 비교하여 이들 조건 하에 정상적인 또는 향상된 성장을 보이는 세포를 선별함으로써 생산될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에 따른 목적되는 단백질을 발현하는 세포 또는 세포주는 목적되는 단백질을 생산하는데 이용될 수 있다. 단백질 생산에 유리한 일정한 생리학적 특성을 갖고 및/또는 하나 이상의 단백질 발현 부속 인자를 발현하도록 조작된 세포를 이용한 단백질 생산 방법은 본 발명에 포함된다. 일정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 목적되는 단백질 일관되게 및 재현가능하게 (가령, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 그리고 적어도 9개월에서 선택되는 기간 동안) 발현하는 세포는 단백질 생산을 향상된 환경을 제공하기 위하여 더욱 변형되고 및/또는 선별된다. 일정한 구체예에서, 목적되는 단백질 및 단백질 발현 부속 인자를 발현하도록 조작된 세포가 목적되는 단백질의 생산에 이용될 수 있다. 더욱 특정한 구체예에서, 목적되는 단백질 및/또는 단백질 발현 부속 인자는 일관되게 및 재현가능하게 발현된다.
일정한 구체예에서, 목적되는 단백질은 생물학적 약제, 예를 들면, 치료 용도의 항체이다. 막 단백질, 막통과 단백질, 구조 단백질, 막-고정된 단백질, 세포 표면 수용체, 분비된 단백질, 세포질 단백질, 이종다합체성 단백질, 동종다합체성 단백질, 이합체성 단백질, 단일체성 단백질, 번역후 변형된 단백질, 당화된 단백질, 인산화된 단백질, 그리고 단백질분해에 의해 가공된 단백질이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 목적되는 단백질 또는 이의 단편은 본 명세서에서 기술된 방법에 따라서 생산될 수 있다. 이런 단백질의 특정한 실례에는 항체 (Fab와 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb 등과 같은 항체 단편, 단일 사슬 항체 (scFv), 단일 도메인 항체, 중쇄, 경쇄, 그리고 모든 항체 부류, 즉, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 포함), 효소, 응고 인자, 호르몬, 사이토카인, 이온 채널, G-단백질 결합된 수용체 (GPCR), 그리고 수송체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다른 예시적인 생물학적 약제에는 상기에 개시된 것들이 포함된다.
일정한 구체예에서, 단백질 생산에 유리한 세포는 참고 세포보다 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 250%, 500%, 또는 적어도 1000% 많은 목적되는 단백질을 생산한다. 일정한 구체예에서, 단백질 생산에 유리한 세포는 참고 세포에서 발현된 동일한 목적되는 단백질보다 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 250%, 500%, 또는 적어도 1000% 많은 활성을 갖는 목적되는 단백질을 생산한다. 활성은 예로써, 목적되는 단백질의 결합 상대에 대한 효소 활성 또는 결합 활성 또는 치료 활성을 지칭한다. 일정한 구체예에서, 단백질 생산에 유리한 세포는 참고 세포에 비하여 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 250%, 500%, 또는 적어도 1000% 많은 목적되는 단백질이 분비될 때 목적되는 단백질을 생산한다. 일정한 구체예에서, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 적어도 99%의 목적되는 단백질은 세포하 구획 내에 국부화되고, 여기서 목적되는 단백질은 유전자 조작 없이 목적되는 단백질을 발현하는 세포 내에 위치한다. 세포 내에서 단백질 발현을 평가하는 파라미터에는 단백질 수율의 정량/분석, 가공, 변형, 세포 내에 국부화 또는 분비, 최적으로 접힘되고/가공되는 총 단백질 백분이 포함된다. 참고 세포는 목적되는 단백질을 발현하는 세포가 산출된 호스트 세포일 수 있다. 본 명세서에서 기술된 임의의 세포가 참고 세포로서 이용될 수 있다.
본 발명에서 제시된 방법에 따라서 생산된 단백질은 단백질 염기서열분석, 질량분석법, 면역세포화학, 당화 및/또는 인산화의 정도 또는 유형을 분석하는 방법, 그리고 생산되는 단백질에 화학적 기 및/또는 잔기의 공유 부가를 결정하는 방법을 비롯한 당분야에 공지된 방법을 이용하여 특성화될 수 있다.
최대 전체량의 단백질을 산출하는 세포는 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, ELISA를 이용하여 확인될 수 있다. 게다가, 단백질의 총 수율에 비하여 최대 비율의 활성 단백질을 산출하는 세포는 상기 단백질의 활성 또는 상기 단백질의 결합을 검출하는 분석, 예를 들면, 활성 분석, 기능 분석, 결합 분석 (가령, ELISA), 이차 검사, 동물 연구, 또는 세포 기초된 분석을 이용하여 확인될 수 있다.
일정한 구체예에서, 목적되는 단백질을 발현하는 세포에서 단백질 발현은 검사 단백질을 이용하여 조사되고, 여기서 검사 단백질이 참고 세포에서보다 더욱 높은 수준으로 발현되면, 동일한 세포에서 목적되는 단백질은 참고 세포에서와 비교하여 더욱 높은 수준으로 발현될 것으로 예측된다. 검사 단백질에는 임의의 단백질, 막 단백질, 막통과 단백질, 막 고정된 단백질, 세포 표면 수용체, 분비된 단백질, 세포질 단백질, 이종다합체성 단백질, 동종다합체성 단백질, 이합체성 단백질, 단일체성 단백질, 번역후 변형되는 단백질, 당화된/인산화된/단백질분해에 의해 가공되는 단백질, 그리고 이들의 임의의 가능한 조합이 포함될 수 있다. 일정한 구체예에서, 특정한 검사 단백질에는 항체, 이온 채널, GPCR, 수송체가 포함될 수 있다. 세포는 단지 1개 또는 복수 검사 단백질로 조사될 수 있다. 복수 검사 단백질의 경우에, 이들은 단수 또는 복수 유형 (가령, 복수 GPCR 단독, 또는 GPCR, 이온 채널 및 항체)일 수 있다.
단백질의 생산에 유리한 생리학적 특성을 갖는 세포 (가령, 증가된 소포체 질량을 갖는 세포), 그리고 단백질의 생산에 최적화되도록 조작된 세포 (가령, 단백질 생산에 유익한 단백질을 인코딩하는 유전자의 도입에 의해)는 당분야에 공지된 방법, 본 명세서에서 기술된 방법, 또는 이들의 조합을 이용하여 확인될 수 있다. 일단 이런 세포가 확인되면, 이들 세포는 배양될 수 있고, 그리고 단백질 생산에 유익한 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 안정적으로 발현하는 세포주는 본 명세서에서 기술된 방법에 따라서 산출될 수 있다. 이런 세포주는 단백질 생산에 유리한 세포의 선별 이전에 또는 이후에 도입유전자의 도입에 의해 또는 유전자 활성화에 의해, 목적되는 단백질을 발현하도록 조작될 수 있다. 목적되는 단백질을 생산하는 세포는 이후, 당분야에 공지된 방법 및/또는 본 명세서에서 기술된 방법을 이용하여 확인될 수 있다.
단백질의 생산에 유리한 생리학적 특성을 갖는 세포에는 향상된 생존능; 증가된 세포 크기; 내생적으로 발현된 단백질의 증가된 생산; 증가된 미토콘드리아 활성; 향상된 안정성; 그들이 선별되었던 특성을 유지하는 능력; 단백질 가공에 관여하는 하나 이상의 세포 소기관 (가령, 소포체 및 리보솜)의 증가된 크기; 그리고 단백질 가공에 관여하는 하나 이상의 세포 소기관 (가령, 리소솜 및 엔도솜)의 증가된 함량을 갖는 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이들 생리학적 특성은 참고 세포, 또는 참고 세포에 대한 과거 값에 비교될 수 있다.
단백질의 생산에 유리한 생리학적 특성을 갖는 세포는 형광 표지된 프로브에 대한 표준 접근법과 공동으로, FACS 분석을 이용하여 확인될 수 있다. 특히, 일정한 생리학적 특성에 대한 마커는 단백질 발현에 관련된 생리학적 특성을 정량하고 이들을 참고 세포에 비교하는데 이용된다. 이런 마커에는 단백질 발현에 관련된 세포 구조를 검출하는 분자, 예를 들면, 리보솜, 미토콘드리아, ER, rER, 골지, TGN, 소포, 엔도솜, 그리고 원형질 막이 포함된다. 이런 마커는 형광 색소일 수 있다. 가령, 일정한 세포 소기관의 활성, 예를 들면, 미토콘드리아 활성은 형광 대사산물을 분석함으로써 평가될 수 있다. 세포 소기관/구획의 활성 (가령, 미토콘드리아 활성, 또는 당류의 단백질 상에 통합 (이는 예로써, 형광 렉틴을 이용하여 검출될 수 있다)을 보고하는 형광 대사산물이 이용될 수 있다. 단백질 가공에 관여하는 하나 이상의 세포 소기관에 특이적인 단백질 마커는 자가-형광발광 단백질 태그, 예를 들면, 녹색 형광 단백질 (GFP)과의 융합 단백질로서 발현될 수 있다; 그리고 막 단백질 및/또는 분비된 단백질은 형광 프로브로 표지될 수 있다. 내생적으로 발현된 단백질에 프로브 (가령, 항체)는 세포 소기관/구획의 출력에 대한 마커로서 이용될 수 있다. 구체적으로, 이종다합체성 막 단백질은 세포 내에서 단백질 발현 활성의 해독 정보로서 이용될 수 있다.
이론에 한정됨 없이, FACS에 의해 측정된 형광에서 증가는 세포가 단백질의 생산에 유리한 속성을 갖고, 그리고 이런 세포가 차후 이용을 위하여 분리될 수 있음을 암시할 것이다. 이들 표준 기술에 더하여, 본 명세서에서 기술된 방법은 단백질의 생산에 유리한 생리학적 특성을 자연적으로 갖는 세포를 확인하는데 이용될 수 있다. 가령, 소포체 마커의 표적 서열에 상보적인 신호전달 프로브 (가령, ERp29, 시토크롬 P450, NADPH-시토크롬 c 환원효소, 칼레티쿨린)가 증가된 소포체 크기를 갖는 세포를 확인하기 위하여 본 명세서에서 기술된 방법에 따라서 이용될 수 있다. FACS에 의한 측정에서, 높은 정도의 형광을 보이는 세포는 아마도, 증가된 ER 크기 및/또는 함량을 가질 것이고, 따라서 단백질의 생산에 유리한 속성을 가질 것이다.
한 구체예에서, 단백질의 생산에 유리한 생리학적 특성을 갖는 세포가 확인되고, 그리고 목적되는 단백질(들)을 생산하는데 이용되는 안정적인 세포주를 개발하기 위하여 차후에 이용된다. 다른 구체예에서, 세포는 목적되는 단백질을 발현하도록 조작되고, 그 이후에 목적되는 단백질을 발현하는 세포가 확인된다. 그 다음, 목적되는 단백질을 발현하고, 또한 단백질의 생산에 유리한 생리학적 특성을 갖는 세포가 확인된다. 이들 세포는 목적되는 단백질(들)을 생산하는 안정적인 세포주를 개발하는데 이용된다.
예시적인 구체예에서, 세포는 목적되는 단백질을 인코딩하는 핵산으로 형질감염된다; 상기 핵산의 전사체를 검출할 수 있는 형광 올리고뉴클레오티드가 상기 세포 내로 도입된다; 단백질 발현에 관련된 생리학적 특성의 마커에 대한 형광 프로브가 상기 세포 내로 도입된다; 목적되는 단백질을 발현하고, 그리고 단백질 발현에 관련된 생리학적 특성의 증가된 수준을 갖는 세포의 선별. 목적되는 단백질을 일관되게 및 재현가능하게 발현하는 세포주는 이후, 확립될 수 있다.
본 발명에서 제시된 단백질 생산 방법에 이용되는 세포는 단백질 발현 부속 인자 또는 2개 이상의 단백질 발현 부속 인자의 조합을 발현하도록 조작될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이들 세포는 단백질 발현 부속 인자의 절단접합 변이체, 돌연변이체, 또는 단편을 발현하도록 조작된다. 일정한 구체예에서, 세포는 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 또는 150개의 단백질 발현 부속 인자를 발현하도록 조작된다. 예시적인 단백질 발현 부속 인자에는 접힘되지 않은 단백질 반응 (UPR)을 조절하는 단백질 및 UPR에서 조절되는 단백질 (가령, ATF6α (절단접합됨), IRE1α, IRE1β, PERCΔC, ATF4, YYI, NF-YA, NF-YB, NF-YC, XBP1 (절단접합됨), EDEM1)을 인코딩하는 유전자; UPR에 의해 유도된 아폽토시스 경로를 스위치-오프 (switch-off)하는 단백질 (가령, NRF2, HERP XIAP, GADD34, PPIα, PPIβ, PPIγ, DNAJC3)을 인코딩하는 유전자; 세포의 성장, 세포의 생존능, 세포 사멸, 그리고 세포 크기에 영향을 주는 단백질을 인코딩하는 유전자; B-세포 유전자 (가령, BLIMP-1, XBP1 (절단접합됨)); 단백질 수송에 관련된 단백질 (가령, Sec61Pα, Sec61Pβ, Sec61Pγ)을 인코딩하는 유전자; 당화에 관련된 단백질 (가령, SDF2-L)을 인코딩하는 유전자; 산화에 관련된 단백질 (가령, ERO1α, ERO1β)을 인코딩하는 유전자; 항-아폽토시스 단백질 (가령, Bcl-2sp, Bcl-xL, Bim trunk. Mut., Ku70, 14-3-3q mut., VDAC2, BAP31 mut.)을 인코딩하는 유전자; 소포체-연관된 분해에 관련된 단백질 (가령, 만노시다아제 1, HRD1)을 인코딩하는 유전자; 칼슘 수송에 관련된 단백질 (가령, STC1, STC2, SERCA1, SERCA2, COD1)을 인코딩하는 유전자; 지방형성/대사에 관련된 단백질 (가령, INO1, PYC, SREBP1ΔC, SREBP2ΔC)을 인코딩하는 유전자; 그리고 단백질 접힘과 분비, 단백질 조립, 단백질의 막 내로 통합, 단백질의 세포 표면 제시, 그리고 단백질의 번역후 변형에 관련된 단백질 (가령, CRT (CaBP3), CNX, ERp57 (PDIA3), BiP, BAP, ERdj3, CaBP1, GRP94 (CaBP4), ERp72 (PDIA4), 사이클로필린 B)을 인코딩하는 유전자가 포함된다. 특정 구체예에서, 세포는 UPR에 관련되는 유전자 중에서 임의의 하나 또는 조합을 발현하도록 조작된다. 다른 특정한 구체예에서, 세포는 UPR에 관련되는 유전자 중에서 임의의 하나 또는 조합, 그리고 단백질 생산에 유리하는 것으로 공지된 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 다른 유전자를 발현하도록 조작된다. UPR을 조절하거나 UPR에서 조절되는 유전자; 세포 성장, 생존능, 아폽토시스, 세포 사멸, 세포 크기를 변경하는 유전자; 샤프롱, 또는 단백질 접힘, 조립, 막 통합, 세포 표면 제시 또는 분비, 당화/인산화/단백질분해를 비롯한 번역후 변형에 관련되는 인자를 인코딩하는 유전자가 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 단백질 발현 부속 인자는 세포 생리학적 특성을 변경한다.
단백질 생산에 유익한 것으로 공지된 단백질을 인코딩하는 유전자 중에서 하나 또는 조합을 발현하는 세포의 확인은 본 명세서에서 기술된 방법을 이용하여 달성될 수 있다, 가령, 목적되는 유전자/mRNA 내에 표적 서열에 결합하는 신호전달 프로브가 산출될 수 있고, 이후 목적되는 유전자/mRNA의 존재가 FACS 분석에 의해 확증될 수 있다.
예시적인 구체예에서, 세포는 목적되는 단백질을 인코딩하는 첫 번째 핵산 및 단백질 발현 부속 인자를 인코딩하는 두 번째 핵산으로 형질감염된다; 첫 번째 핵산의 전사체를 검출할 수 있는 형광 올리고뉴클레오티드 및 두 번째 핵산의 전사체를 검출할 수 있는 형광 올리고뉴클레오티드가 상기 세포 내로 도입된다; 목적되는 단백질 및 단백질 발현 부속 인자를 발현하는 세포의 선별. 목적되는 단백질을 일관되게 및 재현가능하게 발현하는 세포주는 이후, 확립될 수 있다. 상기 세포주는 앞서 논의된 바와 같이, 단백질 발현에 관련된 생리학적 특성에 대하여 더욱 조사될 수 있다.
한 구체예에서, 세포는 먼저, 단백질 발현 부속 인자를 발현하도록 조작된다; 단백질 발현 부속 인자를 발현하는 세포주가 확립된다. 상기 세포주의 세포는 이후, 목적되는 단백질을 발현하도록 조작된다. 다른 구체예에서, 세포는 먼저, 목적되는 단백질을 발현하도록 조작된다; 목적되는 단백질을 발현하는 세포주가 확립된다. 상기 세포주의 세포는 이후, 단백질 발현 부속 인자를 발현하도록 조작된다. 또 다른 구체예에서, 세포는 목적되는 단백질 및 단백질 발현 부속 인자를 발현하도록 공동으로 조작된다. 목적되는 단백질 및/또는 단백질 발현 부속 인자를 일관되게 및 재현가능하게 발현하는 세포주는 이후, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 확립될 수 있다.
일정한 구체예에서, 목적되는 단백질을 발현하도록 조작된 복수의 세포가 제시된다. 이후, 이들 세포는 단백질 발현 부속 인자를 발현하도록 조작되고 및/또는 단백질 발현에 가장 유리한 세포는 앞서 논의된 바와 같이, 단백질 발현에 관련된 생리학적 특성에 대한 마커를 이용함으로써 복수로부터 선별된다.
일정한 구체예에서, 이들 세포주는 본 발명에서 제시된 방법에 따라서, 동물 성분 없는 배지 조건에서 및/또는 규모 확대된 생산을 위한 반응기에서 이용되는 바와 같은 현탁 조건에서 성장을 위하여 최적화될 수 있다. 특정한 구체예에서, 이들 세포주는 성장을 지연시키는 성분을 포함하는 배지에서 성장을 위하여 최적화될 수 있다.
다른 예시적인 구체예에서, (i) 단백질의 생산에 유리한 생리학적 특성을 갖는 세포를 확인하는 단계; (ii) 목적되는 단백질을 발현하도록 상기 세포를 조작하는 단계; (iii) 목적되는 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 산출하는 단계; (iv) 목적되는 단백질의 생산에 적합한 조건 하에 이들 세포를 배양하는 단계; 그리고 (v) 목적되는 단백질의 분리를 포함하는 단백질 생산 방법이 제시된다.
다른 구체예에서, (i) 단백질 발현 부속 인자를 인코딩하는 적어도 하나의 유전자를 세포에 도입하는 단계; (ii) 단백질 발현 부속 인자를 발현하는 세포를 확인하는 단계; (iii) 목적되는 단백질을 발현하도록 상기 세포를 조작하는 단계; (iv) 목적되는 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 산출하는 단계; (v) 목적되는 단백질의 생산에 적합한 조건 하에 이들 세포를 배양하는 단계; 그리고 (vi) 목적되는 단백질의 분리를 포함하는 단백질 생산 방법이 제시된다.
다른 구체예에서, (i) 단백질 발현 부속 인자를 인코딩하는 적어도 하나의 유전자를 세포에 도입하는 단계; (ii) 단백질 발현 부속 인자를 발현하는 세포를 확인하는 단계; (iii) 단백질의 생산에 유리한 생리학적 특성을 갖는 세포를 확인하는 단계; (iv) 목적되는 단백질을 발현하도록 상기 세포를 조작하는 단계; (v) 목적되는 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 산출하는 단계; (vi) 목적되는 단백질의 생산에 적합한 조건 하에 이들 세포를 배양하는 단계; 그리고 (vii) 목적되는 단백질의 분리를 포함하는 단백질 생산 방법이 제시된다. 이러한 구체예의 한 측면에서, 단계 (ii) 및 (iii)은 순차적으로 수행된다. 다른 측면에서, 단계 (ii) 및 (iii)은 동시에 수행된다.
다른 구체예에서, (i) 단백질 발현 부속 인자를 인코딩하는 적어도 하나의 유전자를 세포에 도입하고, 그리고 목적되는 단백질을 발현하도록 이들 세포를 조작하는 단계; (ii) 단백질 발현 부속 인자 및 목적되는 단백질을 발현하는 세포를 확인하는 단계; (iii) 단백질 발현 부속 인자 및 목적되는 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 산출하는 단계; (iv) 목적되는 단백질의 생산에 적합한 조건 하에 이들 세포를 배양하는 단계; 그리고 (v) 목적되는 단백질의 분리를 포함하는 단백질 생산 방법이 제시된다.
다른 구체예에서, (i) 단백질 발현 부속 인자를 인코딩하는 적어도 하나의 유전자를 세포에 도입하고, 그리고 목적되는 단백질을 발현하도록 이들 세포를 조작하는 단계; (ii) 단백질 발현 부속 인자 및 목적되는 단백질을 발현하는 세포를 확인하는 단계; (iii) 단백질의 생산에 유리한 생리학적 특성을 갖는 세포를 확인하는 단계; (iv) 단백질 발현 부속 인자 및 목적되는 단백질을 일관되게 및 재현가능하게 발현하는 세포주를 산출하는 단계; (v) 목적되는 단백질의 생산에 적합한 조건 하에 이들 세포를 배양하는 단계; 그리고 (vi) 목적되는 단백질의 분리를 포함하는 단백질 생산 방법이 제시된다. 이러한 구체예의 한 측면에서, 단계 (ii) 및 (iii)은 순차적으로 수행된다. 다른 측면에서, 단계 (ii) 및 (iii)은 동시에 수행된다.
단백질 생산에 적합한 세포를 산출하는데 이용될 수 있는 호스트 세포에는 일차 세포 및 영속화 세포가 포함된다. 특정한 구체예에서, 호스트 세포는 예로써, CHO 세포, NS0 세포, PerC6 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 293 세포, CACO 세포, HUVEC, CHOK1, CHOKiSV, NS0, 293T 세포, 그리고 곤충 세포일 수 있다.
일부 구체예에서, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1 내지 1.5, 1.5 내지 2.0, 2.0 내지 2.5, 2.5 내지 3.0, 3.0 내지 3.5, 3.5 내지 4.0, 4.0 내지 4.5, 4.5 내지 5.0, 5.0 내지 5.5, 5.5 내지 6.0, 6.5 내지 7.0, 7.0 내지 7.5, 7.5 내지 8.0, 8.0 내지 8.5, 8.5 내지 9.0, 9.0 내지 9.5, 9.5 내지 10.0, 10 내지 11, 11 내지 12, 12 내지 13, 13 내지 14, 14 내지 15, 15 내지 16, 16 내지 17, 17 내지 18, 18 내지 19, 19 내지 20, 20 내지 25 그람/ℓ 또는 그 이상의 목적되는 단백질을 생산하거나 생산할 수 있는 세포 또는 세포주가 1, 2, 3, 또는 5주 이내에 생산된다. 일부 구체예에서, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1 내지 1.5, 1.5 내지 2.0, 2.0 내지 2.5, 2.5 내지 3.0, 3.0 내지 3.5, 3.5 내지 4.0, 4.0 내지 4.5, 4.5 내지 5.0, 5.0 내지 5.5, 5.5 내지 6.0, 6.5 내지 7.0, 7.0 내지 7.5, 7.5 내지 8.0, 8.0 내지 8.5, 8.5 내지 9.0, 9.0 내지 9.5, 9.5 내지 10.0, 10 내지 11, 11 내지 12, 12 내지 13, 13 내지 14, 14 내지 15, 15 내지 16, 16 내지 17, 17 내지 18, 18 내지 19, 19 내지 20, 20 내지 25 그람/ℓ 또는 그 이상의 목적되는 단백질을 생산하거나 생산할 수 있는 세포 또는 세포주가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개월 이내에 생산된다. 일부 구체예에서, 이들 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개월 동안 안정하고, 여기서 단백질 생산의 수준이 30% 이상 변하지 않는다. 일부 구체예에서, 이들 세포는 연속 배양에서 1년, 2년 또는 그 이상 동안 안정하고, 여기서 단백질 생산의 수준이 30% 이상 변하지 않는다. 일부 구체예에서, 목적되는 단백질은 생물학적 약제, 또는 임상적 적용에 이용될 수 있는 단백질이다. 일부 구체예에서, 목적되는 단백질은 항체이다. 일부 구체예에서, 목적되는 단백질은 변형되거나, 번역후 변형되거나, 또는 당화된다. 일부 구체예에서, 세포에 의해 생산된 단백질은 이들 세포가 포함하도록 조작되는 두 번째 단백질에 의해 변형되거나, 번역후 변형되거나, 또는 당화된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 짧은 기간 내에 기존의 생물학적 산물 (가령, 생체-동등성 또는 생체유사성 생물학적 약제)의 특성에 필적하는 동등한 생물학적 산물을 생산하는 방법을 제시한다.
본 발명의 정합된 패널은 패널에 대한 상이한 세포주를 순차적으로, 동시에 또는 양쪽의 조합으로 산출함으로써 생산될 수 있다. 가령, 각 세포주를 개별적으로 만들고, 이후 이들을 비교할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 세포주 간에 차이를 최소화시키기 위하여, 순차적으로 산출된 세포주는 동일한 단계 또는 계대배양 횟수에서 동결되고, 그리고 동시에 해동될 수 있다. 이보다 더욱 바람직하게는, 이들 세포주는 동시에 만들어진다. 일부 구체예에서, 정합된 패널은 실질적으로 동일한 조건, 프로토콜 또는 세포 배양액 단계를 이용하여 상기 패널의 각 세포를 생산함으로써 만들어질 수 있다.
바람직한 구체예에서, 패널 내에 세포주는 동시에 스크리닝되거나 분석된다.
본 발명에 따라서, 정합된 패널의 세포주는 동일한 배양 배지, 온도 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 동일한 세포 배양 조건 하에 유지된다. 패널 내에 모든 세포주는 동일한 빈도에서 계대배양되고, 상기 빈도는 세포 유형 및 성장 속도를 비롯한 다수의 인자에 의존하는 임의의 원하는 빈도일 수 있다. 인지되는 바와 같이, 세포주 패널마다 거의 동등한 숫자의 세포를 유지하기 위하여, 세포의 숫자는 주기적으로 표준화되어야 한다.
상기 방법에 따라서, 세포는 이들 세포 또는 세포주가 성장 속도를 측정하는 단계에 앞서, 개별 배양액에서 분산되기만 하면, 임의의 세포 배양 형식으로 배양될 수 있다. 가령, 편의를 위하여, 세포는 원하는 조건 하에 배양을 위하여 초기에 합동되고, 이후 개별 세포가 웰 또는 용기마다 1개의 세포로 분리될 수 있다.
세포는 임의의 편의한 숫자의 웰을 보유하는 다중-웰 조직 배양 평판에서 배양될 수 있다. 이런 평판은 이의 없이 상업적으로 가용하고, 그리고 당업자에게 널리 공지되어 있다. 일부 경우에, 세포는 바람직하게는, 바이알 또는 임의의 다른 편의한 형식에서 배양될 수 있고, 이들 다양한 형식은 당업자에게 공지되어 있고 이의 없이 상업적으로 가용하다.
성장 속도를 측정하는 단계를 포함하는 구체예에서, 성장 속도를 측정하기에 앞서, 세포는 그들이 배양 조건에 순응할 만큼 충분한 시간 길이 동안 배양된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 이러한 시간 길이는 다수의 인자, 예를 들면, 세포 유형, 선택된 조건, 배양 형식에 따라 변할 것이고, 그리고 1일 내지 수일, 1주 또는 그 이상의 시간의 양일 수 있다.
바람직하게는, 복수의 별개의 세포 배양액에서 각 개별 배양액은 표준화된 유지 일정 (maintenance schedule)을 비롯한, 하기에 논의된 바와 같은 실질적으로 동일한 조건 하에 유지된다. 본 발명의 방법의 다른 유리한 특징은 많은 숫자의 개별 배양액이 동시에 유지될 수 있다는 점이고, 따라서 원하는 일단의 형질을 갖는 세포는 심지어 극히 드물게 존재하는 경우에도 확인될 수 있다. 이런 저런 이유로, 본 발명에 따라서, 복수의 별개의 세포 배양액은 각 웰에 대한 조건이 실질적으로 동일하도록 자동화 세포 배양 방법을 이용하여 배양된다. 자동화 세포 배양은 수동 세포 배양에 내재된 필연적인 가변성을 예방한다.
임의의 자동화 세포 배양 시스템이 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 다수의 자동화 시스템은 상업적으로 가용하고, 그리고 당업자에게 널리 공지되어 있다. 일부 구체예에서, 이들 시스템은 세포 또는 세포주의 복수의 별개의 배양액의 배양을 자동화 또는 표준화시키는 용도에 맞게 적합될 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 시스템은 실질적으로 동일한 조건 하에 세포 또는 세포주의 복수의 별개의 배양액의 배양을 자동화 또는 표준화시키는 용도에 맞게 적합될 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 시스템은 실질적으로 동일한 조건 하에 세포 또는 세포주의 복수의 별개의 배양액의 병렬 배양 (parallel culture)을 자동화 또는 표준화시키는 용도에 맞게 적합될 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 시스템은 세포의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50가지 또는 그 이상의 생리학적 특성이 배양 동안 유지되도록, 세포 또는 세포주의 복수의 별개의 배양액의 배양을 자동화 또는 표준화시키는 용도에 맞게 적합될 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 시스템은 목적되는 RNA 또는 단백질이 세포 또는 세포주에 의해 안정적으로 발현되도록, 이들 세포 또는 세포주의 복수의 별개의 배양액의 배양을 자동화 또는 표준화시키는 용도에 맞게 적합될 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 시스템은 세포의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50가지 또는 그 이상의 생리학적 특성이 배양 동안 유지되고, 그리고 목적되는 RNA 또는 단백질이 세포 또는 세포주에 의해 안정적으로 발현되도록, 이들 세포 또는 세포주의 복수의 별개의 배양액의 배양을 자동화 또는 표준화시키는 용도에 맞게 적합될 수 있다. 일부 구체예에서, 자동화 시스템은 로봇식 시스템이다. 바람직하게는, 상기 시스템은 독립적으로 이동 채널 (moving channel), 다중채널 헤드 (가령, 96-팁 헤드), 그리퍼 (gripper) 또는 신품-채집 팔 (cherry-picking arm), 그리고 이러한 절차 동안 무균을 유지시키는 HEPA 여과 장치를 포함한다. 피펫터 내에서 채널의 숫자는 배양의 형식에 적합해야 한다. 편의한 피펫터는 예로써, 96 또는 384 채널을 보유한다. 이런 시스템은 공지되어 있고 상업적으로 가용하다. 가령, MICROLAB STAR™ 기구 (Hamilton)가 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 자동화 시스템은 다양한 원하는 세포 배양 과제를 수행할 수 있어야 한다. 이런 과제는 당업자에게 공지되어 있다. 여기에는 배지 제거, 배지 대체, 시약 첨가, 세포 세척, 세척액 제거, 분산제 첨가, 배양 용기로부터 세포 이전, 배양 용기에 세포 첨가 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 발명의 세포 또는 세포주의 생산은 임의의 숫자의 별개의 세포 배양액을 포함할 수 있다. 하지만, 본 발명의 방법에 의해 제공된 이점은 세포의 숫자가 증가함에 따라 증가한다. 이러한 방법에 이용될 수 있는 세포 또는 별개의 세포 배양액의 숫자에 이론적 상한선은 없다. 본 발명에 따라서, 별개의 세포 배양액의 숫자는 2 이상일 수 있지만 더욱 유리하게는, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상, 예를 들면, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 48, 적어도 50, 적어도 75, 적어도 96, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 384, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 500,000 또는 그 이상의 별개의 세포 배양액이다.
일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 배양되는 본 발명의 세포와 세포주는 그들 중에서 적어도 2개가 목적되는 단백질의 전부 또는 일부를 인코딩하는 도입된 핵산 또는 목적되는 단백질의 전부 또는 일부를 인코딩하는 서열의 전사를 활성화시키는 도입된 핵산일 수 있는 목적되는 핵산에 대하여 양성으로 사전에 선별된 세포이다. 일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 배양되는 세포는 그들 중에서 적어도 2개가 목적되는 RNA 또는 목적되는 단백질을 인코딩하는 RNA에 대하여 양성으로 선별된 세포이다.
본 발명의 세포와 세포주를 만들기 위하여, 예로써 U.S. Patent 6,692,965 및 WO/2005/079462에서 기술된 기술이 이용될 수 있다. 이들 문헌은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 이러한 기술은 수백만 개의 세포, 예를 들면, 원하는 숫자의 (수백 개 내지 수천 개의 클론)의 실시간 평가를 제공한다. 세포 분류 기술, 예를 들면, 유세포분석 세포 분류 (가령, FACS 머신 이용) 또는 자기 세포 분류 (가령, MACS 머신 이용)를 이용하여, 웰당 1개의 세포가 배양 용기 (가령, 96 웰 배양 평판) 내에 높은 통계학적 신뢰도 (statistical confidence)로 자동적으로 집어넣어진다. 상기 기술의 속도와 자동화는 다중유전자 재조합 세포주가 용이하게 분리될 수 있도록 한다. 일정한 구체예에서, 원하는 신호에 대하여 양성 세포 (즉, 원하는 RNA를 발현하는 세포)는 합동된다. 세포 풀 (pool)은 이후, 두 번째 라운드의 선별에 종속될 수 있다. 일정한 구체예에서, 세포 풀은 총계로, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 적어도 50 라운드의 선별에 종속된다.
이러한 기술을 이용하여, 목적되는 단백질에 대한 RNA 서열이 분자 표지 또는 형광 프로브로 지칭되는 신호전달 프로브를 이용하여 검출될 수 있다. 일부 구체예에서, 코딩 서열을 포함하는 벡터는 RNA 태그 서열을 코딩하는 추가 서열을 포함한다. "태그 서열"은 신호전달 프로브에 의해 검출되는 발현된 RNA 또는 RNA의 일부인 핵산 서열을 지칭한다. 신호전달 프로브는 앞서 기술된 펩티드와 단백질 태그를 인코딩하는 것들을 비롯하여, 태그로서 이용될 수 있는 다양한 RNA 서열을 검출할 수 있다. 신호전달 프로브는 태그 서열에 상보적인 부분을 포함하도록 상기 프로브를 설계함으로써 상기 태그에 지향될 수 있다. 태그 서열은 목적되는 단백질의 전사체와 공동-전사되고 신호전달 프로브 결합을 위한 표적 서열을 포함하는 플라스미드의 3' 비번역 영역일 수 있다. 태그 서열은 생산된 단백질에 태그표식을 원하는 지의 여부에 따라, 유전자의 메시지의 단백질-코딩 부분과의 프레임 (frame) 내부에 또는 외부에 존재할 수 있다. 따라서 태그 서열은 신호전달 프로브에 의한 검출을 위하여 번역될 필요가 없다. 태그 서열은 동일하거나 상이한 복수 표적 서열을 포함할 수 있고, 여기서 하나의 신호전달 프로브가 각 표적 서열에 혼성화 (hybridization)된다. 태그 서열은 목적되는 유전자를 인코딩하는 RNA 내에 위치하거나, 또는 태그 서열은 5'- 또는 3'-비번역 영역 내에 위치할 수 있다. 태그 서열은 이차 구조를 갖는 RNA일 수 있다. 상기 구조는 3개의 팔 연접 구조일 수 있다. 일부 구체예에서, 신호전달 프로브는 목적되는 단백질에 대한 코딩 서열 내에 서열을 검출한다. 태그 서열은 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 태그 서열은 2005년 9월 1일 공개된 International Patent Application Publication No. WO2005/079462 (Application No. PCT/US05/005080)에서 기술된 바와 같이 산출되고 이용될 수 있다.
DNA 구조체의 세포 내로 형질감염 및 차후 약물 선별 (이용되면) 이후에, 또는 유전자 활성화 이후에, 상이한 태그 서열에 표적화되고 차별적으로 표지된 각각의 분자 표지 (가령, 형광 프로브)가 세포 내로 도입될 수 있고, 그리고 유세포분석 세포 분류기가 그들의 신호에 대하여 양성인 세포를 분리하는데 이용된다 (복수 라운드의 분류가 수행될 수도 있다). 한 구체예에서, 유세포분석 세포 분류기는 FACS 머신이다. 레이저-가능된 분석과 가공을 이용한 음성 세포의 MACS (자기 세포 분류) 또는 레이저 박리 역시 이용될 수 있다. 고처리량 스크리닝과 양립하는 것들을 비롯한 다른 형광 평판 판독기 역시 이용될 수 있다. 신호-양성 세포는 도입된 서열(들)의 적어도 하나의 사본을 수용하고 이들 사본을 그들의 게놈 내로 통합할 수 있다. 이후, 목적되는 단백질에 대한 메시지가 도입된 세포가 확인된다. 실례로써, 코딩 서열은 세포 내에서 게놈의 상이한 위치에 통합될 수 있다. 도입된 서열의 발현 수준은 사본 수 또는 통합 부위에 기초하여 변할 수 있다. 게다가, 목적되는 단백질을 포함하는 세포는 하나 이상의 도입된 핵산이 에피솜이거나, 또는 유전자 활성화로부터 기인할 때 획득될 수 있다.
본 발명에 유용한 신호전달 프로브는 당분야에 공지되어 있고, 그리고 일반적으로, 표적 서열에 상보적인 서열, 그리고 프로브가 표적 서열에 결합되지 않을 때 신호가 방출되지 않고 프로브가 표적 서열에 결합될 때 신호가 방출되도록 정렬된 신호 방출 시스템을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 무제한적 예시로써, 신호전달 프로브는 소광제 및 형광단이 결합되지 않은 프로브 내에서 서로 묶이도록 상기 프로브 내에 위치하는 형광단 및 소광제를 포함할 수 있다. 프로브와 표적 서열 사이에 결합 시에, 소광제 및 형광단은 분리되고 신호의 방출을 유발한다. 예로써, International publication WO/2005/079462에서는 본 발명의 세포와 세포주의 생산에 이용될 수 있는 다수의 신호전달 프로브를 기술한다. 핵산을 세포 내로 도입하기 위한 앞서 기술된 방법은 신호전달 프로브를 도입하는데 이용될 수 있다.
태그 서열이 이용되는 경우에, 각 벡터 (여기서 복수 벡터가 이용된다)는 동일한 또는 상이한 태그 서열을 포함할 수 있다. 태그 서열이 동일한 지 또는 상이한 지에 상관없이, 신호전달 프로브는 각 아단위의 발현이 개별적으로 검출될 수 있도록 상이한 신호 방출체, 예를 들면, 상이한 착색된 형광단 등을 포함할 수 있다. 예시로써, 목적되는 첫 번째 RNA (가령, mRNA, siRNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드)를 특이적으로 검출하는 신호전달 프로브는 적색 형광단을 포함할 수 있고, 목적되는 두 번째 RNA (가령, mRNA, siRNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드)를 검출하는 프로브는 녹색 형광단을 포함할 수 있고, 그리고 목적되는 세 번째 RNA (가령, mRNA, siRNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드)를 검출하는 프로브는 청색 형광단을 포함할 수 있다. 당업자는 삼중으로 형질감염된 세포에서 신호전달 프로브로, 3개의 아단위의 발현을 차별적으로 검출하는 다른 수단을 인지할 것이다.
한 구체예에서, 신호전달 프로브는 목적되는 단백질을 인코딩하는 RNA의 일부 또는 5' 또는 3' 비번역 영역의 일부에 상보적이도록 설계된다. 비록 목적되는 메신저 RNA를 인식하도록 설계된 신호전달 프로브가 가짜로 내생적으로 발현된 표적 서열을 검출할 수 있다고 하더라도, 형질감염된 세포에 의해 생산된 목적되는 서열의 비율에 비하여 이들 서열의 비율은 분류기가 이들 2가지 세포 유형을 구별할 수 있을 만큼의 비율이다.
목적되는 단백질의 발현 수준은 세포마다 또는 세포주마다 다를 수 있다. 세포 또는 세포주에서 발현 수준은 또한, 후성 사건 (epigenetic event), 예를 들면, DNA 메틸화, 유전자 침묵, 그리고 도입유전자 사본의 상실로 인하여, 시간의 흐름 동안 감소할 수 있다. 이들 변화는 다양한 인자, 예를 들면, 세포에 의해 흡수된 도입유전자의 사본 수, 도입유전자의 게놈 통합 부위, 그리고 게놈 통합 이후에 도입유전자의 완전성 (integrity)에 기인할 수 있다. 발현 수준을 평가하기 위하여 FACS 또는 기타 세포 분류 방법 (즉, MACS)이 이용될 수 있다. 예로써, 그들이 최초에 분리되었던 하나 이상의 RNA에 대하여 세포가 시간의 흐름 동안 양성으로 존속하는 지와 어느 정도 존속하는 지를 결정하기 위하여, 추가 라운드의 신호전달 프로브 도입이 이용될 수 있다.
선택적으로, 하나 이상의 성장 속도 군에 대한 배양액의 하나 이상의 복제물 세트가 준비될 수 있다. 일부 경우에, 예로써 동결 스톡 (frozen stock)으로서 기능하는 하나 이상의 성장 빈 (bin)의 복제물 세트를 동결하는 것이 유리할 수 있다. 하지만, 본 발명의 방법에 따라서, 동결된 세포 스톡은 그들의 생산 동안 원하는 만큼 종종, 임의의 시점에서, 그리고 많은 시점에서 만들어질 수 있다. 세포 배양액을 동결하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 실례로써, 복제물 세트는 임의의 온도, 예를 들면, -70℃ 내지 -80℃에서 동결될 수 있다. 한 구체예에서, 세포는 70-100% 포화도가 도달될 때까지 배양되었다. 그 다음, 배지가 흡출되고, 그리고 90% FBS와 10% 배지의 용액이 평판에 첨가되고, 격리되고, 동결되었다.
본 발명에서는 상이한 배양 조건을 이용하여 임의의 숫자의 복제물 세트로 상기 방법을 실시하는 것으로 계획한다. 다시 말하면, 상기 방법은 첫 번째 일단의 배양 조건 하에 첫 번째 복수 (세트)의 별개의 세포 배양액, 첫 번째 조건과 상이한 두 번째 일단의 조건 하에 배양되는 두 번째 일단의 별개의 세포 배양액, 그리고 임의의 원하는 숫자의 조건 세트에 대하여 그렇게 실시될 수 있다.
상이한 세트의 조건을 이용한 이들 방법은 동시에 또는 순차적으로, 또는 양쪽의 조합 (가령, 동시에 2개의 세트, 그 이후에 2개의 여분의 세트 등)으로 실시될 수 있다. 목적되는 단백질의 일관된 기능적 발현을 갖는 세포를 선별하기 위한 본 명세서에서 기술된 방법의 한 가지 이점은 세포가 세포 내에 특정 핵산의 존재가 아닌 기능에 의해 선별된다는 점이다. 목적되는 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포는 이를 발현하지 않거나, 또는 상기 단백질이 생산된다 하더라도, 여러 가지 이유로, 상기 단백질은 기능적이지 못하거나, 또는 "고유" 기능, 다시 말하면, 상기 단백질을 자연적으로 발현하는 정상적인 환경에서 세포에서 기능에 비하여 변경된 기능을 가질 수 있다. 기능에 기초하여 세포를 선별함으로써, 본 명세서에서 기술된 방법은 신규한 기능적 형태를 확인하는 것이 가능하다. 가령, 예로써, 동일한 검사 화합물 또는 일련의 화합물을 이용한 동일한 분석에서 다양한 정도의 기능을 갖는 복수 세포를 확인하는 것이 가능하다. 이러한 차별적 기능은 일련의 기능적 "프로필 (profile)"을 제공한다. 이런 프로필은 예로써, 단백질의 상이한 기능적 형태에 차별적으로 영향을 주는 화합물을 확인하는데 유용하다. 이런 화합물은 특정 조직 또는 질병 상태 등에서 단백질의 기능적 형태를 확인하는데 유용하다.
복합 단백질 또는 복수의 목적되는 단백질을 발현하는 세포를 비롯한 본 발명의 세포와 세포주를 만드는 방법의 다른 이점은 이들 세포가 전통적인 방법에 의해 훨씬 적은 시간 내에 생산될 수 있다는 점이다. 가령, 기능 분석에 필요한 세포의 숫자, 성장 속도 비닝 (binning)이 수행되는 지의 여부 및 기타 인자를 비롯한 다수의 인자에 따라서, 명백하게 기능적 단백질을 발현하는 세포가 짧게는 2일, 또는 1주 이내에 생산될 수 있긴 하지만, 복합 또는 복수 단백질의 경우에 심지어 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월 또는 6개월의 생산 시간도 전통적인 방법으로 가능했던 것보다 훨씬 빠르다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 본 발명의 세포와 세포주를 이용하는 방법을 제시한다.
본 발명의 세포와 세포주는 목적되는 기능적 단백질이 요구되는 임의의 적용에서 이용될 수 있다. 이들 세포와 세포주는 예로써, 조절제를 스크리닝하고; 결정학 및 결합 연구를 위한 단백질을 생산하고; 그리고 화합물 선택성 (selectivity)과 용량 (dosing), 수용체/화합물 결합 동역학과 안정성, 그리고 세포 생리 기능 (가령, 전기생리학, 단백질 운송, 단백질 접힘, 그리고 단백질 조절)에 대한 수용체 발현의 효과를 조사하기 위하여, 시험관내 세포-기초된 분석 또는 생체내 분석 (여기서, 이들 세포는 동물 (가령, 비-인간 포유동물)에 이식된다)에 이용될 수 있다. 본 발명의 세포와 세포주는 또한, 목적되는 단백질의 역할을 조사하기 위한 녹다운 (knock down) 연구에 이용될 수 있다.
본 발명의 세포와 세포주는 또한, 기능 분석, 바이오-패닝 (bio-panning) (가령, 파지 전시 라이브러리 이용), 유전자 발현에서 결과적 변화를 평가하는 유전자 칩 연구, 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 2-하이브리드 연구, 이의 역할을 평가하는 세포주에서 특정 아단위의 녹다운, 전기생리학, 단백질 운송의 연구, 단백질 접힘의 연구, 단백질 조절의 연구, 단백질에 대한 항체의 생산, 단백질에 대한 프로브의 분리, 단백질에 대한 형광 프로브의 분리, 전반적인 유전자 발현/가공에 대한 단백질의 발현 효과의 연구, 전반적인 단백질 발현과 가공에 대한 단백질의 발현 효과의 연구, 그리고 세포 구조, 특성, 특징에 대한 단백질의 발현 효과의 연구를 위한 가용성 생물학적 경쟁자를 확인하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 세포와 세포주는 또한, 이들의 모든 성분이 세포 내로 도입된 하나 이상의 표적 유전자에 의해, 또는 도입된 및 내생적으로 발현된 서열의 임의의 조합에 의해 제공되는 지에 상관없이, DNA, RNA 또는 단백질 화학량론, 단백질 접힘, 조립, 막 통합 또는 표면 표현, 배좌, 활성 상태, 활성화 전위, 반응, 기능, 그리고 세포 기초된 분석 기능을 비롯하여 목적되는 단백질 (DNA, RNA 또는 단백질)을 특성화하는데 유용하고, 여기서 목적되는 단백질은 다중유전자 시스템, 복합체 또는 경로를 포함한다.
다합체성 (이합체성, 삼합체성 또는 더욱 높은 등급의 다합체화) 단백질의 하나 이상의 아단위를 발현하도록 조작된 세포와 세포주는 이러한 다합체성 단백질의 상이한 형태를 생산할 수 있다. 본 발명에서는 다합체성 단백질의 상이한 형태를 갖는 세포들을 구별하는 방법을 제시한다. 다합체성 단백질의 기능적 형태는 세포의 생리학적 상태, 단백질분해를 비롯한 표적의 대안적 절단접합 또는 번역후 변형, 부속 또는 상호작용 인자와 이의 결합 또는 이의 접힘, 조립 또는 세포 막에 통합에 따라 달라질 수 있다. 상이한 아단위 조립 및 화학량론은 이종다합체성 표적에 대한 가능한 기능적 형태의 숫자를 더욱 증가시킨다. 기능적 형태는 시간의 흐름 동안, 검사 화합물에 대한 그들의 반응 또는 그들의 활성의 동역학에 관하여 상이할 수 있다. 다합체성 단백질의 상이한 기능적 형태를 발현하는 세포들의 비교 분석은 특정한 기능적 형태를 포함하는 세포들이 확인될 수 있도록 한다.
일부 구체예에서, 다합체성 단백질은 적어도 2개의 단백질 아단위의 물리적 또는 생화학적 결합이다. 일부 구체예에서, 다합체성 단백질은 한 가지 단백질 아단위 및 상기 단백질 아단위의 부속 인자의 물리적 또는 생화학적 결합이다. 일부 구체예에서, 다합체성 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아단위를 보유한다. 이들 아단위는 동일한 폴리펩티드 또는 상이한 폴리펩티드, 또는 이들의 조합일 수 있다. 다합체성 단백질은 본 명세서에서 기술된 임의의 다합체성 단백질일 수 있다.
본 명세서에서 기술된 바와 같은 기능적 활성, 또는 약리학적 프로필은 목적되는 표적을 발현하는 세포주에서 표적의 활성에 대한 하나 이상의 화합물의 효과를 조사함으로써 이들 세포주에 대하여 정의될 수 있다. 이들 약리학적 프로필에 따른 클론의 집단화 또는 범주화는 표적의 각 가능한 형태를 나타내는 세포주 패널을 산출하는데 이용될 수 있다. 모든 가능한 기능적 형태의 표현은 스크린 (screen)을 포화시킴으로써, 다시 말하면, 약리학적 프로필에 의해 정의되는 각 형태가 적어도 2, 3, 5, 10, 25, 50, 또는 적어도 100개의 세포주에 의해 대표되도록 적어도 다수의 세포주를 조사함으로써 추구될 수 있다.
일부 구체예에서, 목적되는 표적에 대한 화합물의 효과는 세포 주기의 특정 시점 (가령, M, S, G1, 또는 G2 단계)에서 평가된다. 다른 구체예에서, 목적되는 표적에 대한 화합물의 효과는 시간의 흐름 동안 (가령, 1, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50초 동안; 1, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50분 동안; 1, 5, 10, 15, 20시간, 1, 2, 5, 10, 20, 30일, 또는 1, 2, 5, 10개월 동안) 모니터링된다.
일부 구체예에서, 이종다합체성 단백질의 경우에, 각각 전체 아단위를 포함하는 복수의 세포주는 목적되는 이절성 단백질의 복수의 약리학적 프로필, 다시 말하면, 세포주당 1개의 프로필을 산출하는데 이용될 수 있다. 세포주 간에 약리학적 프로필에서 차이는 이절성 목적되는 단백질의 상이한 형태, 예를 들면, 이들 아단위의 가변 조립 또는 화학량론을 구별한다.
상이한 또는 전체보다 적은 아단위를 발현하는 세포에 비교는 개별 아단위에 기능성을 돌리는데 이용될 수 있다.
상이한 아단위 조합이 획득되고 기능적으로 조사될 수 있는 이종다합체성 단백질의 실례에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다:
GABA(A) 수용체 이종다합체성 조합 (참조: Olsen and Sieghart, "International Union of Pharmacology. LXX. Subtypes of γ-Aminobutryic AcidA Receptors: Classification of the Basis of Subunit Composition, Pharmacology, and Function. Update", Pharmacological Reviews, 60:243-260, 2008, 이는 본 발명에서 참조로서 편입됨):
GABA(A) 아단위에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: GABRA1 (α1), GABRA2 (α2), GABRA3 (α3), GABRA4 (α4), GABRA5 (α5), GABRA6 (α6), GABRB1 (β1), GABRB2 (β2), GABRB3(β3), GABRG1 (γ1), GABRG2 (γ2), GABRG3 (γ3), GABRD (δ), GABRE (ε), GABRP π), 그리고 GABRQ (θ);
GABA(A) 아단위 조합에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: α1β2γ2, α2βγ2, α3βγ2, α4βγ2, α4β2δ, α4β3δ, α5βγ2, α6βγ2, α6β2δ, α6β3δ, ρ, α1β3γ2, α1βδ, α5β3γ2, αβ1γ, αβ1δ, αβ, α1α6βγ, α1α6βδ, ρ1, ρ2, ρ3, αβγ1, αβγ3, αβθ, αβε, 그리고 αβπ.
nAChR 이종다합체성 수용체 조합 (참조: Gotti, Zoli and Clementi, "Brain nicotinic acetylcholine receptors: native subtypes and their relevance", Trends in Pharmacological Sciences, 27:482-491, 2006, 그리고 N. Millar Neuropharmacology Volume 56, Issue 1, January 2009, Pages 237-246, 이들의 전체 내용은 본 발명에 참조로서 편입됨):
nAChR 아단위에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: CHRNA1 (α1), CHRNA2 (α2), CHRNA3 (α3), CHRNA4 (α4), CHRNA5 (α5), CHRNA6 (α6), CHRNA7(α7), CHRNA8(α8), CHRNA9(α9), CHRNA10(α10), CHRNB1 (β1), CHRNB2 (β2), CHRNB3(β3), CHRNB4(β4), CHRND (δ), 그리고 CHRNE (ε);
nAChR 아단위 조합에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: α1β1γδ, α1β1δ, α1β1δε, α2α4β2, α2α5β2, α2β2, α2β4, α2α6β2, α3α4β2, α3α4α6β2, α3α5β2, α3α4β4, α3α5β2β4, α3α5β4, α3α6β2, α3β2, α3β3, α3β2β3, α3β2β4, α3β3β4, α3β4, α4α5β2, α4α6β2β3, α4β2, α4β4, α6β2, α6β2β3, α6α4β2, α6β2β3, α6β3β4, α6β4, α7, α7α8, α8, 그리고 α9α10;
5-HT3 이절성 수용체 (참조: N.M. Barnes et al., Neuropharmacology 56 (2009) 273-284, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨):
5-HT3 아단위에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: HTR3A (A), HTR3B (B), HTR3C (C), HTR3D (D), 그리고 HTR3E (E);
5-HT3 아단위 조합에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: AB, AC, AD, 그리고 AE;
글리신 이절성 수용체 (참조: JW Lynch Neuropharmacology 56 (2009) 303-309, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨):
글리신 수용체 아단위에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: GLRA1 (α1), GLRA2 (α2), GLRA3 (α3), GLRA4 (α4), 그리고 GLRB (β);
글리신 수용체 아단위 조합에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: α1α3, α1β, α2β, α3β, 그리고 α4β;
글루타메이트 이절성 수용체 (참조: Perrais, Neuropharmacology 56 (2009) 131-140; Jane, Neuropharmacology 56 (2009) 90-113; 그리고 W. Lu, Neuron, 62, (2009) 2, 254-268, 이들의 전체 내용은 본 발명에 참조로서 편입됨):
글루타메이트 수용체 아단위에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: GRIK1 (K1), GRIK2 (K2), GRIK3 (K3), GRIK5 (K5), GRIA1 (A1), GRIA2 (A2), 그리고 GRIA3 (A3);
글루타메이트 수용체 아단위 조합에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: K2K3, K1K2, K1K5, K2K5, A1A2, A1A3, 그리고 A2A3;
ATP-개폐 P2X 이절성 수용체 (참조: M.F. Jarvis, B.S. Khakh, Neuropharmacology 56 (2009) 208-215; 그리고 S Robertson, Current Opinion in Neurobiology 11, 2001, 378-386, 이들의 전체 내용은 본 발명에 참조로서 편입됨):
ATP-개폐 P2X 수용체 아단위에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: P2RX1 (X1), P2RX2 (X2), P2RX3 (X3), P2RX4 (X4), P2RX5 (X5), P2RX6 (X6), 그리고 P2RX7 (X7);
ATP-개폐 P2X 수용체 아단위 조합에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: X1/X2, X1/X4, X1/X5, X2/X3, X2/X6, X4/X6, 그리고 X4/X7;
미각 수용체:
미각 수용체 아단위에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: TAS1R1 (T1R1), TAS1R2 (T1R2), TAS1R3 (T1R3);
미각 수용체 아단위 조합에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: T1R2/T1R3 (단맛 수용체), T1R1/T1R3 (감칠맛 수용체);
GPCR 이종다합체, 예를 들면, GPCR 이종이합체 (참조: Prinster, Hague and Hall, "Heterodimerization of G Protein-Coupled Receptors: Specificity and Functional Significance", Pharmacological Reviews, 57:289-298, 2005, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨)에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: HTR1B (5-HT1B) / HTR1D (5HT1D), ADORA1 (아데노신 A1)/ DRD1(도파민 D1), ADORA1 (아데노신 A1)/ P2RY1 (P2Y1), ADORA1 (아데노신 A1)/ GRM1(mGluR1{알파}), ADORA2a(아데노신 A2A)/ DRD2 (도파민 D2), ADORA2a(아데노신 A2A)/ GRM5 (mGluR5), AGTR1 (앤지오텐신 1)/ AGTR2 (앤지오텐신 2), AGTR1 (앤지오텐신 1)/ ADRB2({베타}2AR), AGTR1 (앤지오텐신 1)/ BDKRB2 (브래디키닌 B2), CASR (칼슘 감지 수용체) / GRM1(mGluR1), CASR (칼슘 감지 수용체) / GRM5(mGluR5), CCR2 /CXCR4, CCR2 / CCR5, CCR5/OPRD1 (오피오이드 수용체 델타), CCR5/OPRK1 (오피오이드 수용체 카파), CCR5/OPRM1 (오피오이드 수용체 뮤), CCKRA (콜레시스토키닌 A)/ CCKRB (콜레시스토키닌 B), DRD1(도파민 D1) / DRD2(도파민 D2), DRD2(도파민 D2) /SSTR5, DRD2(도파민 D2) / DRD3 도파민 D3, EDNRA (엔도텔린 A)/ EDNRB (엔도텔린 B), GABABR1 /GABABR2, MTNR1A (멜라토닌 MT1)/ MTNR1B (멜라토닌 MT2), CHRM2 (무스카린성 M2)/ CHRM3 (무스카린성 M3), OXTR(옥시토신)/AVPR1A (바소프레신 V1a), OXTR(옥시토신)/AVPR2(바소프레신 V2), S1PR1 (S1P1)/ S1PR2 (S1P2), S1PR1 (S1P1)/ S1PR3 (S1P3), SSTR1 /SSTR5, SSTR2A /SSTR3, SSTR2A /OPRM1 (μ-OPR), TACR1(물질 P)/OPRM1 (μ-OPR), TRHR1 /TRHR2, AVPR1A (바소프레신 V1a)/ AVPR2(바소프레신 V2), ADRA1B(알파1BAR)/ADRA1A (알파1AAR), ADRA1B(알파1BAR)/HRH1 (히스타민 H1), ADRA1B(알파1BAR)/ ADRA1D(알파1DAR), ADRA1D(알파1DAR)/ ADRB2D(베타2AR), ADRA2A(알파2AAR)/ ADRB1(베타1AR), ADRA2A(알파2AAR)/OPRM1 (μ-OPR), ADRB1(베타1AR) /ADRB2(베타2AR), ADRB2(베타2AR)/OPRD1 (δ-OPR), ADRB2(베타2AR)/ OPRK1(κ-OPR), ADRB2(베타2AR)/ADRB3(베타3AR), ADRB2(베타2AR)/ M71-OR, OPRK1(κ-OPR)/ OPRD1 (δ-OPR), 그리고 OPRM1 (μ-OPR)/OPRD1
(δ-OPR );
전압-개폐 칼슘 채널 (CaV) 다중아단위 복합체 (참조: WA Catterall et al. Pharmacol Rev 2005 57 411-425, 그리고 J Arikkath and K Campbell, Current Opinion in Neurobiology 2003, 13:298-307, 이들의 전체 내용은 본 발명에 참조로서 편입됨):
CaV 아단위에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: CACNA1S (α1S), CACNA1C (α1C), CACNA1D (α1D), CACNA1F (α1F), CACNA1A (α1A), CACNA1B (α1B), CACNA1E (α1E), CACNB1 (β1), CACNB2 (β2), CACNB3 (β3), CACNB4 (β4), CACNA2D1 (α2δ), CACNG1 (γ1), 그리고 CACNG2 (γ2);
CaV 아단위 조합에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: α1Sβ1aα2δγ1, α1Sβ1aα2δ, α1Cβ2α2δγ, α1Cβ3α2δγ, α1Dβα2δ, α1Fβ3α2δ, α1Fβ2α2δ, α1Aβ3α2δ, α1Aβ4α2δ, α1Aβ3α2δγ1, α1Aβ3α2δγ2, α1Aβ4α2δγ1, α1Aβ4α2δγ2, α1Bβ1α2δ, α1Bβ3α2δ, α1Bβ4α2δ, α1Bβ3α2δγ2, 그리고 α1Eβα2δ;
전압-개폐 나트륨 채널 (NaV) 다중아단위 복합체 (참조: WA Catterall et al. Pharmacol. Rev., 2005 57 397-409, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨):
NaV 아단위에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: SCN1A (α1), SCN2A (α2), SCN3A (α3), SCN4A (α4), SCN5A (α5), SCN8A (α6), SCN9A (α7), SCN1B (β1), SCN2B (β2), SCN3B(β3), 그리고 SCN4B (β4);
NaV 아단위 조합에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: α1 /β1, α1 /β2, α1 /β3, α1 /β4, α1 /β1/β2, α1 /β1/β3, α1 /β1/β4, α1 /β2/β3, α1 /β2/β4, α1 /β3/β4, α2 /β1, α2 /β2, α2 /β3, α2 /β4, α2 /β1/β2, α2 /β1/β3, α2 /β1/β4, α2 /β2/β3, α2 /β2/β4, α2 /β3/β4, α3 /β1, α3 /β3, α4 /β1, α5 /β1, α5 /β2, α5 /β3, α5 /β4, α5 /β1/β2, α5/β1/β3, α5 /β1/β4, α5 /β2/β3, α5 /β2/β4, α5 /β3/β4, α6 /β1, α6 /β2, α6 /β1/β2, α7 /β1, α7 /β2, 그리고 α7/β1/β2;
내향 정류 칼륨 채널 - 이절/다중아단위 복합체 (참조: Y Kubo et al. Pharmacol. Rev., 2005 57 509-526, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨):
내향 정류 칼륨 채널 아단위에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: KCNJ2 (Kir2.1), KCNJ12 (Kir2.2), KCNJ4 (Kir2.3), KCNJ14 (Kir2.4), KCNJ3 (Kir3.1), KCNJ6 (Kir3.2), KCNJ9 (Kir3.3), KCNJ5 (Kir3.4), 그리고 KCNJ10 (Kir4.1);
내향 정류 칼륨 채널 아단위 조합에는 하기 표 (표 1)에서 열거된 것들이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다:
Figure pct00002
전압-개폐 칼륨 채널 - 이절/다중아단위 복합체 (참조: G Gutman et al . Pharmacol. Rev., 2005 57 473-508, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨):
전압-개폐 칼륨 채널 아단위에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: KCNA1 (Kv1.1), KCNA2 (Kv1.2), KCNA3 (Kv1.3), KCNA5 (Kv1.5), KCNA6 (Kv1.6), KCNA10 (Kv1.8), KCNB1 (Kv2.1) KCNB2 (Kv2.2), KCNC4(Kv3.4), KCND1(Kv4.1), KCND2 (Kv4.2), KCND3 (Kv4.3), KCNF1 (Kv5.1) KCNG1(Kv6.1), KCNG2 (Kv6.2), KCNG3(Kv6.3), KCNG4 (Kv6.4), KCNQ1(Kv7.1), KCNQ2 (Kv7.2), KCNQ3(Kv7.3), KCNQ4 (Kv7.4), KCNQ5 (Kv7.5), KCNV1(Kv8.1), KCNV2 (Kv8.2), KCNS1 (Kv9.1), KCNS2 (Kv9.2), KCNS3 (Kv9.3), KCNH1 (Kv10.1), KCNH5 (Kv10.2), KCNH2 (Kv11.1), KCNH6 (Kv11.2), KCNH7 (Kv11.3), KCNAB1 (Kvβ1), KCNAB2 (Kvβ2), KCNAB3 (Kvβ3), KCNE1 (minK), KCNE2 (MiRP1), KCNE3 (MiRP2), KCNE4(MiRP3), KCNE1L (KCNE1-유사), KCNIP1, KCNIP2, KCNIP3, 그리고 KCNIP4;
전압-개폐 칼륨 채널 아단위 조합에는 하기 표 (표 2)에서 열거된 것들이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다:
Figure pct00003
Figure pct00004

Figure pct00005
칼슘-활성화된 칼륨 채널 - 이절성 및 다중아단위 복합체 (참조: A Wei et al. Pharmacol. Rev., 2005; 57: 463-472, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨):
칼슘-활성화된 칼륨 채널 아단위에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: KCNMA1 (KCa1.1), KCNN1(KCa2.1), KCNN2 (KCa2.2), KCNN3 (KCa2.3), KCNN4 (KCa3.1), KCNT1(KCa4.1), KCNT2 (KCa4.2), 그리고 KCNU1(KCa5.1);
칼슘-활성화된 칼륨 채널 아단위 조합에는 하기 표 (표 3)에서 열거된 것들이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다:
Figure pct00006
일시적인 수용체 전위 채널 - 이절/다중아단위 복합체 (참조: DE Clapham et al. Pharmacol. Rev., 2005; 57(4): 427-450, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨):
일시적인 수용체 전위 채널 아단위에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: TRPC1, TRPC3, TRPC4, TRPC5, TRPC6, TRPC7, TRPV-5, TRPM1, 그리고 TRPM1-S;
일시적인 수용체 전위 채널 아단위 조합에는 하기 표 (표 4)에서 열거된 것들이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다:
Figure pct00007
환상 뉴클레오티드-조절된 채널 - 이절/다중아단위 복합체 (참조: F Hofmann et al. Pharmacol. Rev., 2005; 57(4): 455-462, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨);
환상 뉴클레오티드-조절된 채널 아단위에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: CNGA, CNGB1a, CNGA2, CNGB1b, CNGA4, CNGA3, CNGB3, CNG4A, 그리고 CNGA1;
환상 뉴클레오티드-조절된 채널 아단위 조합에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: CNGA1/CNGB1a, CNGA2/CNGB1b/ CNGA4, CNGA3/CNGB3, CNG4A/CNGA2/CNGB1b, CNGB1a/CNGA1, CNGB1b/CNGA2/CNGA4, 그리고 CNGB3/CNGA3;
상피 나트륨 채널/디제네린 (Degenerin) - 이절/다중아단위 복합체 (참조: A Staruschenko et al Biophys J, 2005; 88, 3966-3975, H Yamamura et al European J Pharm., 2008, 600, 32-36, 그리고 S Kellenberger and L Schild Physiol Rev, 2002, 82, 735-767, 이들의 전체 내용은 본 발명에 참조로서 편입됨):
상피 나트륨 채널/디제네린 아단위에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: SCNN1A (ENaCα); SCNN1B (β), SCNN1G (γ), SCNN1D (ENaCδ), ACCN1 (ASIC2, 2개의 절단접합 변이체 2a와 2b), ACCN3 (ASIC3);
상피 나트륨 채널/디제네린 아단위 조합에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: ENaCαβγ, ENaCαδβγ, ENaCδβγ, ASIC2a/ASIC2b, ASIC2a/ASIC3, 그리고 ASIC2b/ASIC3.
앞서 열거된 이절성 단백질 및 본 명세서의 다른 부분에서 기술된 것들의 경우에, 아직 규정되지 못한 아단위의 더욱 많은 조합이 존재할 수 있다. 앞서 열거된 조합을 포함하는 세포주는 신규한 조합을 발현하는 세포주에 대한 참고물로서 이용되고, 따라서 이들 신규한 조합이 확인될 수 있다. 가령, 상이한 아단위 조합은 동일한 일단의 화합물에 대한 동일한 일단의 아단위를 발현하는 각각의 상이한 세포주의 상이한 반응 프로필에 의해 특성화될 수 있다 (참조: 하기 실시예 23).
대형 유전자 집단 (가령, GABA 또는 아세틸콜린 이온 채널)에 의해 정의된 이종다합체성 표적에 적용된 방법의 대규모 적용은 가능한 아단위 조합 중에서 모두 또는 일부에 대한 복수 세포주의 교차 비교 분석을 가능하게 한다.
일정한 구체예에서, 유전자 활성화가 본 발명의 방법, 세포, 그리고 세포주에 이용된다. 유전자 활성화는 예로써, International Application Publication WO 94/12650에서 기술되고, 이는 본 발명에 참조로서 편입된다. 일정한 구체예에서,
ENaC (상피 나트륨 채널), GABAA (감마-아미노부티르산 유형 A), NaV (전압-개폐 나트륨 이온 채널), 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 쓴맛 수용체, CFTR (낭포성 섬유증 막통과-전도성 조절자), 또는 GCC (구아닐릴 사이클라아제 C)의 수용체 또는 수용체 아단위를 인코딩하는 세포에서 하나 이상의 내생적 유전자의 조절 영역을 유전적으로 변형하여, 이러한 유전자 변형이 유전자 변형 이전의 세포에서 수용체 또는 수용체 아단위의 발현 수준에 비하여 ENaC, GABAA, NaV, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 쓴맛 수용체, CFTR, 또는 GCC의 수용체 또는 수용체 아단위의 증가된 발현을 유발하는데 이종동형 재조합이 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 유전자 변형은 발현의 적어도 10%, 50%, 100%, 500%, 1000%, 5000%, 또는 적어도 10,000% 증가를 유발한다. 일정한 구체예에서, 세포는 유전자 활성화 이전에 배경 수준에서 수용체 또는 수용체 아단위를 발현한다.
일정한 구체예에서, ENaC, GABAA, NaV, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 쓴맛 수용체, CFTR, 또는 GCC의 수용체 또는 하나 이상의 수용체 아단위에 대한, 세포에 내생적인 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 프로모터가 이종동형 재조합을 통해 도입된다. 프로모터는 구조적 활성 프로모터일 수 있다. 특히, 프로모터는 세포 내에서 구조적으로 활성인 프로모터일 수 있다. 다른 구체예에서, 프로모터는 조건 프로모터일 수 있다. 이들 방법과 함께 이용될 수 있는 세포는 상기에 기술된다. 일정한 구체예에서, 프로모터는 세포의 게놈 내로 무작위로 삽입될 수 있다. 형광 올리고뉴클레오티드는 이후, 무작위로 삽입된 프로모터가 목적되는 RNA의 발현을 활성화시키는 세포를 선별하는데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 목적되는 RNA는 ENaC, GABAA, NaV, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 쓴맛 수용체, CFTR, 또는 GCC의 수용체 또는 수용체의 하나 이상의 아단위를 대상으로 할 수 있다. 일정한 구체예에서, 조절 DNA 요소, 예를 들면, 인핸서 또는 리프레서가 게놈 내로 무작위 위치에 삽입되고, 그리고 목적되는 RNA가 상향 조절되거나 하향 조절되는 세포가 선별된다.
일정한 구체예에서, 내생적 유전자가 발현되도록 세포의 게놈 내로 DNA를 도입하는데 이종동형 재조합이 이용된다. 일부 구체예에서, 내생적 유전자는 ENaC, GABAA, NaV, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 쓴맛 수용체, CFTR, 또는 GCC의 수용체 또는 하나 이상의 수용체 아단위를 인코딩하는 유전자일 수 있다. 일정한 구체예에서, 도입된 DNA는 선별가능 마커, 예를 들면, 항생제 내성 (가령, DHFR)을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 일정한 구체예에서, 내생적 유전자는 세포의 게놈 내에서 증폭된다. 일정한 구체예에서, 세포의 게놈이 내생적 유전자의 2개 사본, 3개 사본, 4개 사본, 5개 사본, 6개 사본, 7개 사본, 8개 사본, 9개 사본, 10개 사본, 적어도 2개의 사본, 적어도 5개의 사본, 적어도 10개의 사본, 적어도 15개의 사본, 적어도 20개의 사본, 또는 적어도 25개의 사본을 포함하도록 내생적 유전자가 증폭된다. 일정한 구체예에서, 증폭된 유전자의 안정적인 기능적 발현을 갖는 세포가 선별된다.
조절 서열 역시 변형되고 발현이 하기에 기술된 유전적 변이 방법에 의해 달성될 수 있다. 유전적 변이성 (genetic variability)이 세포주에서 산출될 수 있고, 이후 ENaC, GABAA, NaV, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 쓴맛 수용체, CFTR, 또는 GCC의 수용체 또는 수용체의 하나 이상의 아단위를 발현하는 세포가 본 명세서에서 기술된 바와 같이 형광 올리고뉴클레오티드를 이용하여 선별된다.
일정한 구체예에서, 세포는 유전자 활성화의 적용 또는 유전적 변이성의 산출 이전에, ENaC, GABAA, NaV, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 쓴맛 수용체, CFTR, 또는 GCC의 수용체 또는 하나 이상의 수용체 아단위를 발현한다. 이후, 유전자 활성화 및/또는 유전적 변이성의 산출 및 선별이 동일한 수용체의 다른 수용체 또는 적어도 하나의 추가 아단위를 발현하고 및/또는 유전자 활성화의 적용 또는 유전적 변이성의 산출 이전에 발현된 수용체 또는 하나 이상의 수용체 아단위의 감소된 발현 수준을 갖는 세포를 산출하고 선별하는데 이용된다.
일정한 구체예에서, 부속 인자 역시 세포 내에서 발현된다. 부속 인자는 유전자 변형 없이 세포 내에서 발현될 수 있다; 부속 인자는 도입유전자로서 발현될 수 있다; 또는 부속 인자는 앞서 기술된 바와 같은 유전자 활성화 및/또는 유전적 변이성의 산출 및 선별을 통해 발현될 수 있다. 부속 인자는 목적되는 수용체 또는 수용체의 아단위의 전사 및/또는 번역 및/또는 접힘 및/또는 세포하 국부화 및/또는 기능을 조장하는 인자일 수 있다. 부속 인자는 다중-아단위 수용체의 조립을 조장할 수 있다.
일정한 구체예에서, 완전 수용체를 발현하거나, 또는 목적되는 다중아단위 수용체의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아단위를 발현하는 세포주가 본 발명에서 제시된다. 목적되는 다중아단위 수용체는 예로써, ENaC, GABAA, NaV, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 또는 쓴맛 수용체일 수 있다. 일정한 구체예에서, 목적되는 수용체 및 다중아단위 수용체의 수용체 아단위는 도입유전자로부터 발현되지 않는다. 일정한 구체예에서, 목적되는 다중아단위 수용체의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아단위는 도입유전자로부터 발현되지 않는다. 일정한 구체예에서, 완전 수용체, 또는 목적되는 다중아단위 수용체의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아단위는 상기 수용체 또는 수용체 아단위(들)를 인코딩하는 내생적 유전자의 증폭된 게놈 영역으로부터 발현된다.
일정한 구체예에서, 게놈 DNA가 세포 개체군 내로 형질감염되거나 미세주입되고, 그리고 목적되는 RNA를 발현하는 세포가 선별된다. 일부 구체예에서, 목적되는 RNA는 ENaC, GABAA, NaV, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 쓴맛 수용체, CFTR, 또는 GCC의 수용체 또는 수용체의 하나 이상의 아단위를 대상으로 할 수 있다. 게놈 DNA는 목적되는 RNA를 발현하는 세포로부터 획득될 수 있다. 일정한 구체예에서, 게놈 DNA의 공여자 세포는 수용자 세포와 동일한 종이다. 일정한 구체예에서, 공여자 세포는 수용자 세포와 상이한 종이다.
일정한 구체예에서, 게놈 DNA의 공여자 세포는 인간, 생쥐, 곤충, 개, 당나귀, 말, 쥐, 기니 피그, 조류 또는 원숭이 세포일 수 있다. 일정한 구체예에서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10가지의 상이한 종으로부터 게놈 DNA가 도입된다. 더욱 특정한 구체예, 게놈 DNA의 상이한 공여자 종은 목적되는 유전자의 오르토로그 (ortholog)를 보유한다. 다른 구체예에서, 공여자 종은 목적되는 유전자의 오르토로그를 보유하지 않는다.
일정한 구체예에서, 게놈 DNA 단편은 게놈의 정의된 영역이고, 그리고 목적되는 유전자를 포함한다. 일정한 구체예에서, 게놈 DNA 단편은 적어도 1 kb, 5 kb, 10 kb, 100 kb, 500 kb, 또는 1000 kb의 크기를 갖는다.
당업자에게 공지된 임의의 방법이 세포로부터 게놈 DNA를 추출하는데 이용될 수 있다. 게놈 DNA를 분리하는 예시적인 방법은 Short Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (editors), John Wiley & Sons, Inc., 1999의 Unit 2.2.에서 기술된다. 일정한 구체예에서, 게놈 DNA는 상기 DNA의 전단 (shearing)을 피하기 위하여 매우 조심스럽게 처리된다. 다른 구체예에서, 게놈 DNA는 더욱 작은 DNA 단편을 획득하기 위하여 전단된다. 일정한 구체예에서, DNA는 상기 DNA로부터 임의의 단백질성 물질을 제거하기 위하여 DNAse-없는 프로테아제로 처리된다. 다른 구체예에서, 게놈 DNA는 프로테아제로 처리되지 않고, 그리고 그 대신에, 게놈 DNA와 연관된 단백질이 파괴되지 않도록 배려된다. 일정한 구체예에서, DNA는 DNAse 없는 RNAse로 처리된다.
게놈 DNA는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 일정한 구체예에서, 게놈 DNA는 세포 내로 형질감염된다. 더욱 특정한 구체예에서, 게놈 DNA는 리포펙션 (lipofection)을 이용하여 세포 내로 형질감염된다. 게놈 DNA를 세포 내로 도입하기 위한 예시적인 방법은 Short Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (editors), John Wiley & Sons, Inc., 1999의 Chapter 9에서 기술된다.
세포 내로 도입되는 게놈 DNA의 최적 양은 목적되는 RNA를 발현하는 세포의 숫자를 확인함으로써 결정될 수 있다. 일정한 구체예에서, 세포당 도입된 게놈 DNA의 양은 적어도 1 당량의 게놈, 적어도 10-1 당량의 게놈, 적어도 10-2 당량의 게놈, 적어도 10-3 당량의 게놈, 적어도 10-4 당량의 게놈, 적어도 10-5 당량의 게놈, 적어도 10-6 당량의 게놈, 또는 적어도 10-7 당량의 게놈에 상응한다. 일정한 구체예에서, 세포당 도입된 게놈 DNA의 양은 많아야 1 당량의 게놈, 많아야 10-1 당량의 게놈, 많아야 10-2 당량의 게놈, 많아야 103 당량의 게놈, 많아야 10-4 당량의 게놈, 많아야 105 당량의 게놈, 많아야 10-6 당량의 게놈, 또는 많아야 10-7 당량의 게놈에 상응한다.
일정한 구체예에서, 게놈 DNA는 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 증폭될 수 있다. 더욱 특정한 구체예에서, 게놈 DNA는 완전 게놈 증폭에 의해 증폭된다.
게놈 DNA가 도입된 세포를 확인하고 분리하기 위하여 임의의 방법이 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 마커 유전자를 인코딩하는 DNA는 게놈 DNA와 공동으로 세포 내로 도입된다. 마커 유전자에 양성인 세포 역시 게놈 DNA를 품는다. 당업자에게 공지된 임의의 마커 유전자가 이용될 수 있다. 마커 유전자의 예시적인 실례에는 유전자 산물이 특정 항생제에 대한 내성 (가령, 네오마이신 내성)을 세포에 공여하는 유전자, 유전자 산물이 성장을 위하여 세포에 의해 정상적으로 요구되는 물질이 결핍된 배지에서 상기 세포가 성장할 수 있도록 하는 유전자, 또는 유전자 산물이 가시적 마커 (visual marker)를 인코딩하는 유전자가 포함된다. 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 가시적 마커는 예로써, GFP이다. 가시적 마커를 인코딩하는 DNA 및 게놈 DNA가 도입된 세포는 FACS를 이용하여 분리될 수 있다.
일정한 구체예에서, 게놈 DNA는 미세주입을 이용하여 세포 내로 도입된다.
일정한 구체예에서, 게놈 DNA의 단편은 게놈 DNA의 증식을 위하여 벡터 내로 패키징 (packaging)된다. 이런 벡터에는 박테리오파지, 코스미드 또는 YAC가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 당업자에게 공지된 임의의 방법이 게놈 DNA를 패키징하고 증식하는데 이용될 수 있다.
일정한 구체예에서, 비-재조합 생명체에서 목적되는 다중아단위 수용체의 아단위의 화학량론과 동일한 화학량론의 아단위를 보유하는 목적되는 다중아단위 수용체를 발현하는 세포주가 본 발명에서 제시되고, 여기서 상기 세포주가 유래된 세포는 목적되는 다중아단위 수용체를 발현하지 않는다. 일정한 구체예에서, 다중아단위 수용체를 발현하는 세포를 비롯하여, 수용체를 발현하는 세포주가 본 발명에서 제시되고, 여기서 상기 세포주에서 수용체의 약리학적 프로필은 생명체에서 표적을 정상적으로 발현하는 세포에서 상기 수용체의 약리학적 프로필에 필적한다. 목적되는 수용체 또는 다중아단위 수용체는 예로써, ENaC, GABAA, NaV, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 쓴맛 수용체, CFTR, 또는 GCC일 수 있다. 일정한 구체예에서, 세포주는 본 명세서에서 앞서 기술된 바와 같이 선별 압력의 부재에서, 수용체 또는 다중아단위 수용체를 안정적으로 발현한다.
일정한 측면에서, 본 발명에서는 자연 발생하고 ENaC, GABAA, NaV, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 또는 쓴맛 수용체, CFTR, 또는 GCC의 수용체 또는 하나 이상의 수용체 아단위를 발현하는 세포를 확인하고, 분리하고, 그리고 농축하는 방법을 제시한다. 일부 구체예에서, 자연 발생 세포는 ENaC, GABAA, NaV, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 또는 쓴맛 수용체, CFTR, 또는 GCC의 수용체 또는 하나 이상의 수용체 아단위를 자연적으로 발현한다.
일정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 자연적으로 존재하는 유전적 변이성 및 다양성에 의존한다. 일정한 구체예에서, 분리된 세포는 세포 개체군 내에서 10에서 1, 100에서 1, 1000에서 1, 10,000에서 1, 100,000에서 1, 1,000,000에서 1 또는 10,000,000에서 1개 이하의 세포로 표시된다. 세포 개체군은 생명체로부터 수확된 일차 세포일 수 있다. 일정한 구체예에서, 유전적 변이성 및 다양성은 또한, 당업자에게 공지 자연 과정을 이용하여 증가될 수 있다. 유전적 변이성 및/또는 다양성을 산출하거나 증가시키기 위한 임의의 적절한 방법이 호스트 세포에서 수행될 수 있다. 이론에 한정됨 없이, 유전적 변이성의 이런 산출은 예로써, ENaC, GABAA, NaV, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 또는 쓴맛 수용체, CFTR, 또는 GCC의 수용체 또는 수용체 아단위를 인코딩하는 유전자의 조절 영역에서 변형을 유발한다. 이런 아단위를 발현하는 세포는 이후, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 선별될 수 있다. 일정한 구체예에서, 목적되는 단백질을 내생적으로 발현하는 세포는 적어도 50, 100, 500, 750, 또는 적어도 1000회 계대배양에 종속되는; 또는 적어도 1, 2, 5, 또는 10개월, 또는 적어도 1, 2, 5, 10년의 연속 성장에 종속되는 클론 세포주로부터 분리된다.
다른 구체예에서, 유전적 변이성은 세포를 UV 광 및/또는 x-선 (가령, 감마-선)에 노출시킴으로써 달성될 수 있다. 또한, 유전적 변이성은 게놈 DNA, cDNA, 및/또는 mRNA를 세포 개체군의 세포 내로 도입함으로써 세포 개체군에서 달성될 수 있다. 특정한 구체예에서, 게놈 DNA의 단편은 앞서 논의된 바와 같이 도입된다. 특정한 구체예에서, 게놈 DNA의 라이브러리가 도입된다. 특정한 구체예에서, cDNA 라이브러리가 도입된다. 특정한 구체예에서, 발현 DNA 라이브러리가 도입된다. 일정한 구체예에서, 게놈 DNA, cDNA, 및/또는 mRNA는 수용자 세포의 세포 유형으로부터 상이한 세포 유형으로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 게놈 DNA, cDNA, 및/또는 mRNA는 미각 세포로부터 유래된다.
다른 구체예에서, 유전적 변이성은 세포를 EMS (에틸 메탄 설포네이트, ethyl methane sulfonate)에 노출시킴으로써 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, 유전적 변이성은 세포를 돌연변이원, 발암물질, 또는 화학적 작용제에 노출시킴으로써 달성될 수 있다. 이런 작용제의 무제한적 실례에는 아질산, 삽입성 물질 (intercalating agent), 그리고 알킬화제와 같은 탈아미노화제 (deaminating agent)가 포함된다. 이런 작용제의 다른 무제한적 실례에는 브롬, 나트륨 아지드, 그리고 벤젠이 포함된다.
특정한 구체예에서, 유전적 변이성은 세포를 최적 이하의 성장 조건, 예를 들면, 낮은 산소, 낮은 영양소, 산화 스트레스 또는 낮은 질소에 노출시킴으로써 달성될 수 있다.
일정한 구체예에서, DNA 손상을 유발하거나, 또는 DNA 복제 또는 수복 (가령, 미스매치 수복)의 충실도 (fidelity)를 감소시키는 효소가 유전적 변이성을 증가시키는데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, DNA 수복에 관여하는 효소의 저해제가 이용된다. 일정한 구체예에서, DNA 복제에 관여하는 효소의 충실도를 감소시키는 화합물이 이용된다. 일정한 구체예에서, DNA 손상을 유발하고 및/또는 DNA 복제 또는 수복의 충실도를 감소시키는 단백질이 세포 내로 도입된다 (공동-발현된, 주입된, 형질감염된, 전기천공된).
일정한 조건 또는 작용제에 대한 노출의 지속 기간은 이용된 조건 또는 작용제에 좌우된다. 일부 구체예에서, 수초 또는 수분의 노출이면 충분하다. 다른 구체예에서, 수시간, 수일 또는 수개월의 기간 동안 노출이 필요하다. 당업자는 상기 조건의 얼마만큼의 지속 기간과 강도가 이용될 수 있는 지를 인지할 것이다.
이론에 한정됨 없이, 유전적 변이성을 증가시키는 방법은 유전자의 프로모터 영역에서 돌연변이 또는 변경을 유발하고, 이는 유전자의 전사 조절에서 변화, 예를 들면, 유전자 활성화를 발생시키고, 여기서 상기 유전자는 변경되지 않은 프로모터 영역을 보유하는 유전자보다 더욱 고도로 발현된다. 일정한 구체예에서, 유전자는 ENaC, GABAA, NaV, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 또는 쓴맛 수용체, CFTR, 또는 GCC의 수용체 또는 수용체 아단위를 인코딩한다. 일반적으로, 프로모터 영역은 유전자 전사를 조절하는 전사 출발 부위의 상류에 게놈 DNA 서열을 포함하고, 그리고 최소 프로모터 및/또는 인핸서 및/또는 리프레서 영역을 포함할 수 있다. 프로모터 영역은 대략 20개 염기쌍 (basepair, bp) 내지 대략 10,000 bps 또는 그 이상의 범위를 갖는다. 특정한 구체예에서, 유전자 가변성을 증가시키는 방법은 목적되는 유전자의 인트론에서 돌연변이 또는 변경을 유발하고, 이는 유전자의 전사 조절에서 변화, 예를 들면, 유전자 활성화를 발생시키고, 여기서 상기 유전자는 변경되지 않은 인트론을 보유하는 유전자보다 더욱 고도로 발현된다.
일정한 구체예에서, 전사되지 않은 게놈 DNA가 변형된다. 가령, 프로모터, 인핸서 (enhancer), 수정자 (modifier), 또는 리프레서 (repressor) 영역이 부가, 결실, 또는 변형된다. 이들 경우에, 변형된 조절 영역의 제어 하에 전사체의 전사는 해독 정보로서 이용될 수 있다. 가령, 리프레서가 결실되면, 상기 리프레서에 의해 억제되는 유전자의 전사체는 증가된 전사 수준에 대하여 조사된다.
일정한 구체예에서, 세포 또는 생명체의 게놈은 특정 부위 돌연변이유발 또는 이종동형 재조합에 의해 돌연변이될 수 있다. 일정한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드- 또는 삼중나선 (triplex)-매개된 재조합이 이용될 수 있다 (참조: Faruqi et al., 2000, Molecular and Cellular Biology 20:990-1000, 그리고 Schleifman et al., 2008, Methods Molecular Biology 435:175-90).
일정한 구체예에서, 형광 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 분자 표지는 유전자 변형이 성공적이었던 세포, 다시 말하면, 도입유전자 또는 목적되는 유전자가 발현되는 세포를 선별하는데 이용될 수 있다. 돌연변이유발성 또는 이종동형 재조합 사건이 성공적이었던 세포를 확인하기 위하여, 돌연변이된 또는 재조합된 전사체에 특이적으로 혼성화되는 형광 올리고뉴클레오티드가 이용될 수 있다. 목적되는 단백질을 내생적으로 발현하는 세포가 선별되고, 그리고 상기 세포가 목적되는 단백질을 발현하지 않는 세포 유형인 일정한 구체예에서, 원하는 단백질을 발현하는 세포를 분리하기 위하여, 목적되는 단백질을 인코딩하는 RNA에 특이적으로 혼성화되는 형광 올리고뉴클레오티드가 이용될 수 있다. 세포의 분리는 2004년 2월 17일 허여된 U.S. Patent No. 6,692,965 (Shekdar et al.), 그리고 International Application No. PCT/US2005/005080 (WO/2005/079462)에서 기술된 바와 같이 실시될 수 있다. 일정한 구체예에서, 원하는 신호에 양성인 세포 (즉, 원하는 RNA를 발현하는 세포)는 합동된다. 이런 풀 (pool)은 이후, 두 번째 라운드의 선별에 종속될 수 있다. 일정한 구체예에서, 세포 풀은 총계로, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 적어도 50 라운드의 선별에 종속된다.
다합체성 단백질을 발현하도록 조작된 세포와 세포주는 다합체성 단백질의 다양한 상이한 기능적 형태를 포함할 수 있다. 다합체성 단백질 복합체를 포함하도록 조작된 동일한 세포 또는 세포주는 상이한 세포 배양 조건에서 배양될 때, 상이한 기능적 형태, 또는 상이한 정도의 동일한 또는 상이한 기능적 형태를 포함할 수 있다. 배양 조건은 온도, 영양소 농도, 혈청 부가, 이온 농도, 세포 밀도, 세포 주기의 동기화 (synchronization), pH, 산도, 탄산화, 공기 조건, 이산화탄소 백분, 진탕, 교반, UV 노출, 대사산물의 활성 또는 농도, 혈청, 아미노산, 당류, 탄수화물, 단백질, 지질, 세정제, 성장 인자, 보조-인자, 비타민, 돌연변이원, 화학물질, 화합물 또는 미량 물질에 대하여 변할 수 있다. 동일한 표적을 포함하도록 조작된 상이한 세포 또는 세포주는 상이한 기능적 형태, 또는 상이한 정도의 동일한 또는 상이한 기능적 형태를 포함할 수 있다. 기술된 이들 방법은 동일한 또는 상이한 세포 배양 조건에서 배양된 동일한 또는 상이한 다합체성 단백질을 포함하도록 조작된 세포 또는 세포주의 비교 분석에 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 다합체성 단백질을 특성화하고, 그리고 목적되는 다합체성 단백질의 상이한 형태를 발현하는 세포 또는 세포주 패널을 만드는 방법에 이용되는 세포 또는 세포주는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 세포 또는 세포주, 예를 들면, 실질적으로 일정한 생리학적 특성을 갖는 세포 또는 세포주, 단백질 태그를 포함하지 않는 목적되는 단백질을 발현하는 세포 또는 세포주, 또는 기능 분석에서 적어도 0.4의 Z' 인자를 갖는 세포 또는 세포주, 또는 선별 압력의 부재에서 배양되는 세포 또는 세포주, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구체예에서, 이용되는 상이한 세포주는 실질적으로 동일한 배양 조건 하에 동시에 유지된다. 본 명세서에서 기술된 로봇식 방법은 목적되는 다합체성 단백질의 상이한 형태를 발현하는 세포 또는 세포주를 유지하고 조작하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 다합체성 (이합체성, 삼합체성 또는 더욱 높은 등급의 다합체화) 단백질 또는 이의 하나 이상의 아단위를 인코딩하는 도입된 핵산으로부터 상기 목적되는 다합체성 단백질을 발현하는 세포 또는 세포주를 제시하고, 여기서 상기 세포는 선별 압력의 부재에서 배양되고 및/또는 상기 단백질은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 일관되게 발현된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 복수의 세포주를 포함하는 세포주 패널을 산출하는 방법을 제시하고, 여기서 각각의 복수의 세포주는 목적되는 다합체성 단백질의 상이한 형태를 합성한다. 목적되는 다합체성 단백질의 실례는 상기에서 더욱 개시된다. 이론에 한정됨 없이, 다합체성 단백질의 상이한 형태는 예로써, 그들의 아단위 조합, 개별 아단위의 번역후 변형, 및/또는 세포하 국부화에서 상이하다 (가령, 세포골격; 막통과 단백질의 경우: 막 통합/국부화, 소포체의 이출, 골지체의 이출; 그리고 분비된 단백질의 경우: 소포체의 이출, 골지체의 이출에 대하여). 일부 구체예에서, 이런 패널은 호스트 세포의 특정한 클론 또는 세포주로 시작하고, 그리고 목적되는 다합체성 단백질의 하나 이상의 아단위를 발현하도록 상기 호스트 세포를 조작함으로써 산출될 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 아단위를 인코딩하는 도입유전자가 도입된다. 다른 구체예에서, 유전자 활성화가 이용된다. 하나 이상의 아단위를 발현하도록 성공적으로 조작된 세포는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 선별될 수 있다. 일부 구체예에서, 양성 세포는 형광 올리고뉴클레오티드 또는 분자 표지를 이용하여 선별된다 (참조: International Application No. PCT/US2005/005080 (WO/2005/079462)). 확인된 세포로부터 세포주가 확립된다. 일부 구체예에서, 결과의 세포주는 동일한 물질 (가령, 동일한 호스트 부모 클론, 하나 이상의 아단위의 발현을 조작하기 위한 동일한 핵산) 및 동일한 프로토콜 (가령, 동일한 세포 배양 방법, 동일한 유전자 조작 방법)로부터 산출된다. 이론에 한정됨 없이, 결과의 세포주는 호스트 세포의 게놈 내에서 임의의 도입유전자의 삽입 부위 및/또는 게놈 내에서 임의의 도입유전자의 사본 수에 대하여 변할 수 있다. 놀랍게도, 결과의 세포주는 다합체성 단백질의 상이한 형태를 합성할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 다합체성 단백질의 상이한 형태를 합성하는 세포주는 각 세포주의 약리학적 프로필을 확립함으로써 확인될 수 있다. 일정한 화합물은 다양한 세포주에서 다합체성 단백질에 대한 그들의 효과에 대하여 조사된다. 활성은 시간의 흐름 동안 모니터링될 수 있다. 용량-반응 곡선 (dose-response curve)이 확립될 수 있다. 일정한 구체예에서, 특정 세포주에 의해 합성된 다합체성 단백질에 대한 약리학적 지문 (pharmacological fingerprint)을 산출하기 위하여, 세포주당 적어도 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 7500, 또는 적어도 10000개의 상이한 화합물이 조사된다. 이후, 각 세포주에 대한 결과의 약리학적 지문이 서로 비교된다. 약리학적 지문이 실질적으로 동일하면, 세포주 내에서 다합체성 단백질의 형태가 동일하다. 약리학적 지문이 실질적으로 동일하지 않으면, 이들 세포주 내에서 다합체성 단백질의 형태가 상이하다.
일정한 구체예에서, 이들 형태는 다합체성 단백질의 반응의 성질이 각 화합물에 대하여 동일하면 동일하다 (가령, 활성화된, 저해된, 또는 중성).
다른 구체예에서, 이들 형태는 반응의 양이 50%, 25%, 10%, 5%, 1%, 또는 0.5%의 한계 내에서 각 화합물에 대하여 동일하면 동일하다.
일정한 구체예에서, 이들 형태는 다합체성 단백질의 반응의 양이 적어도 1 화합물에 대하여 상이하면 상이하다 (가령, 활성화된, 저해된, 또는 중성). 일정한 구체예에서, 이들 형태는 다합체성 단백질의 반응의 성질이 조사된 화합물의 적어도 50%, 25%, 10%, 5%, 1%, 또는 0.5%에서 상이하면 상이하다 (가령, 활성화된, 저해된, 또는 중성). 다른 구체예에서, 이들 형태는 적어도 1 화합물의 반응의 양이 적어도 50%, 25%, 10%, 5%, 1%, 또는 0.5%의 한계 내에 있지 않으면 상이하다. 다른 구체예에서, 이들 형태는 조사된 화합물의 적어도 50%, 25%, 10%, 5%, 1%, 또는 0.5%의 반응의 양이 적어도 50%, 25%, 10%, 5%, 1%, 또는 0.5%의 한계 내에 있지 않으면 상이하다. 당업자에게 공지된 임의의 알고리즘이 상이한 세포주에서 다합체성 단백질의 약리학적 지문을 정량하고 비교하는데 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 첫 번째 아단위 및 두 번째 아단위를 공동-발현하는 세포에서 목적되는 생물학적으로 활성 다합체성 단백질의 조성은 첫 번째 아단위 약리학적 프로필, 두 번째 아단위 약리학적 프로필, 그리고 혼성 아단위 약리학적 프로필을 비교함으로써 분류될 수 있다. 첫 번째 아단위 약리학적 프로필은 다합체성 단백질의 첫 번째 아단위를 발현하지만 두 번째 아단위를 발현하지 않는 세포에서 발현될 것이기 때문에, 상기 다합체성 단백질의 생물학적 활성에 대한 화합물의 효과를 표시하는 측정된 양을 포함할 수 있다. 두 번째 아단위 약리학적 프로필은 다합체성 단백질의 두 번째 아단위를 발현하지만 첫 번째 아단위를 발현하지 않는 세포에서 발현될 것이기 때문에, 상기 다합체성 단백질의 생물학적 활성에 대한 화합물의 효과를 표시하는 측정된 양을 포함할 수 있다. 혼성 아단위 약리학적 프로필은 다합체성 단백질의 첫 번째 아단위 및 두 번째 아단위 둘 모두를 발현하는 세포에서 발현될 것이기 때문에, 상기 다합체성 단백질의 생물학적 활성에 대한 화합물의 효과를 표시하는 측정된 양을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 목적되는 생물학적으로 활성 다합체성 단백질은 (i) 첫 번째 아단위 약리학적 프로필이 혼성 아단위 약리학적 프로필에 높은 유사성을 갖고, 그리고 두 번째 아단위 약리학적 프로필이 혼성 아단위 약리학적 프로필에 낮은 유사성을 가지면, 첫 번째 아단위의 동종이합체; (ii) 두 번째 아단위 약리학적 프로필이 혼성 아단위 약리학적 프로필에 높은 유사성을 갖고, 그리고 첫 번째 아단위 약리학적 프로필이 혼성 아단위 약리학적 프로필에 낮은 유사성을 가지면, 두 번째 아단위의 동종이합체; (iii) 첫 번째 아단위 약리학적 프로필이 혼성 아단위 약리학적 프로필에 낮은 유사성을 갖고, 그리고 두 번째 아단위 약리학적 프로필이 혼성 아단위 약리학적 프로필에 낮은 유사성을 가지면, 첫 번째 아단위 및 두 번째 아단위의 이종이합체; 또는 (iv) 혼성 아단위 약리학적 프로필이 첫 번째 아단위 약리학적 프로필 및 두 번째 아단위 약리학적 프로필의 조합이면, 첫 번째 아단위의 동종이합체 및 두 번째 아단위의 동종이합체의 조합으로 분류될 수 있다.
다른 구체예에서, 첫 번째 아단위 및 두 번째 아단위를 공동-발현하는 세포에서 목적되는 생물학적으로 활성 다합체성 단백질의 조성은 목적되는 세포의 약리학적 프로필을 첫 번째 아단위 약리학적 프로필, 두 번째 아단위 약리학적 프로필, 그리고 혼성 아단위 약리학적 프로필과 비교함으로써 분류될 수 있다. 일부 구체예에서, 목적되는 생물학적으로 활성 다합체성 단백질은 (i) 상기 첫 번째 약리학적 프로필이 상기 두 번째 아단위 약리학적 프로필에 낮은 유사성을 갖고, 그리고 상기 첫 번째 아단위 약리학적 프로필 및 상기 혼성 아단위 약리학적 프로필 둘 모두에 높은 유사성을 가지면, 첫 번째 아단위의 동종이합체; (ii) 상기 첫 번째 약리학적 프로필이 상기 첫 번째 아단위 약리학적 프로필에 낮은 유사성을 갖고, 그리고 상기 두 번째 아단위 약리학적 프로필 및 상기 혼성 아단위 약리학적 프로필 둘 모두에 높은 유사성을 가지면, 두 번째 아단위의 동종이합체; (iii) 상기 첫 번째 약리학적 프로필이 상기 첫 번째 아단위 약리학적 프로필에 낮은 유사성을 갖고, 상기 두 번째 아단위 약리학적 프로필에 낮은 유사성을 갖고, 그리고 상기 혼성 아단위 약리학적 프로필에 낮은 유사성을 가지면, 첫 번째 아단위 및 두 번째 아단위의 이종이합체; 또는 (iv) 상기 첫 번째 약리학적 프로필이 상기 혼성 아단위 약리학적 프로필에 높은 유사성을 갖고, 그리고 상기 첫 번째 약리학적 프로필이 상기 첫 번째 아단위 약리학적 프로필 및 상기 두 번째 아단위 약리학적 프로필의 조합이면, 첫 번째 아단위의 동종이합체 및 두 번째 아단위의 동종이합체의 조합으로서 분류될 수 있다.
일정한 구체예에서, 세포 내에서 다합체성 단백질의 생물학적 활성에 대한 아단위의 효과는 목적되는 아단위를 발현하는 세포로부터 약리학적 프로필을 목적되는 아단위를 발현하지 않는 세포로부터 약리학적 프로필에 비교함으로써 특성화될 수 있다. 일부 구체예에서, 검사 약리학적 프로필은 상기 효과를 특성화하기 위하여 기초 약리학적 프로필에 비교될 수 있다. 상기 구체예에서, 검사 약리학적 프로필은 아단위의 미리-선택된 조합 및 이에 더하여, 목적되는 아단위를 발현하는 세포에서 생물학적으로 활성 다합체성 단백질에 대한 화합물의 효과를 표시하는 측정된 양을 포함할 수 있다; 기초 약리학적 프로필은 미리-선택된 조합을 발현하지만 목적되는 아단위를 발현하지 않는 세포에서 생물학적으로 활성 다합체성 단백질에 대한 화합물의 효과를 표시하는 측정된 양을 포함할 수 있다. 목적되는 아단위는 아단위의 미리-선택된 조합의 아단위 중에서 하나가 아니다. 목적되는 아단위는 검사 약리학적 프로필이 기초 약리학적 프로필에 낮은 유사성을 가지면 다합체성 단백질의 생물학적 활성에 대한 효과를 갖는 것으로, 또는 검사 약리학적 프로필이 기초 약리학적 프로필에 높은 유사성을 가지면 다합체성 단백질의 생물학적 활성에 대한 효과를 갖지 않는 것으로 특성화될 수 있다.
약리학적 프로필은 이들 약리학적 프로필 간에 상관을 계산함으로써, 예를 들면, 이들 약리학적 프로필 간에 유사성 척도를 계산함으로써 비교될 수 있다.
일정한 구체예에서, 2개의 약리학적 프로필은 약리학적 프로필 중에서 하나에서 측정된 양이 다른 약리학적 프로필에서 측정된 양의 대략 2%, 대략 5%, 대략 8%, 대략 10%, 대략 12%, 대략 15%, 대략 20%, 대략 25%, 대략 30%, 또는 대략 35% 내에 있으면, 상관되는 것으로 간주될 수 있다.
일정한 구체예에서, 2개의 약리학적 프로필은 그들 간에 계산된 유사성 척도가 미리 결정된 역치 초과이면 서로에 높은 유사성을 갖는 것으로 간주될 수 있고, 또는 그들 간에 계산된 유사성 척도가 미리 결정된 역치 미만이면 서로에 낮은 유사성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 일부 구체예에서, 미리 결정된 역치는 약리학적 프로필 중에서 하나에서 측정된 양이 다른 약리학적 프로필에서 측정된 양의 대략 2%, 대략 5%, 대략 8%, 대략 10%, 대략 12%, 대략 15%, 대략 20%, 대략 25%, 대략 30%, 또는 대략 35% 내에 있음을 지시하는 유사성 척도의 값으로서 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 목적되는 화합물의 약리학적 프로필은 벡터 p로 표시될 수 있다:
p = [ p 1, . . . p i , . . . p n]
여기서 p i 는 i'번째 성분의 측정된 양, 예를 들면, 다합체성 단백질의 목적되는 아단위를 발현하는 세포의 i번째 생물학적 활성에 대한 화합물의 효과이다. 일부 구체예에서, n은 2 이상, 10 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 1000 이상, 2000 이상, 2500 이상, 7500 이상, 10,000 이상, 20,000 이상, 25,000 이상, 또는 35,000 이상이다. 각각의 약리학적 프로필 역시, 벡터 p로 표시될 수 있다. 상관을 계산할 때, 목적되는 화합물에 대한 약리학적 프로필을 나타내는 벡터에서 i'번째 성분의 측정된 양은 각 성분 i = 1 … n에 대한 약리학적 프로필을 나타내는 벡터의 i'번째 성분의 상응하는 측정된 양에 비교될 수 있다. 하지만, 상관이 계산될 수 있는 다수의 방법이 존재한다. 실제로, 목적되는 화합물의 약리학적 프로필 및 약리학적 프로필 사이에 상관이 존재하는 지를 확인하기 위하여, 2개의 데이터세트가 관련되는 확률 (probability)을 결정하기 위한 당분야에서 임의의 통계학적 방법이 본 발명의 방법에 따라서 이용될 수 있다. 가령, 목적되는 화합물의 약리학적 프로필 (pi 1) 및 각각의 약리학적 프로필 (pi 2) 사이에 상관은 유사성 측정 규준 sim(pi 1, pi 2)을 이용하여 계산될 수 있다. 유사성 측정 규준 sim(pi 1, pi 2)을 계산하는 한 가지 방법은 유클리드 거리 (Euclidean distance)의 음의 제곱근 (negative square)을 계산하는 것이다. 대안적 구체예에서, 유클리드 거리 이외의 측정 규준, 예를 들면, 맨하탄 거리 (Manhattan distance), 체비쉐프 거리 (Chebychev distance), 벡터 간에 각도, 상관 거리, 표준화된 유클리드 거리, 마할라노비스 거리 (Mahalanobis distance), 제곱된 피어슨 상관 계수 (squared Pearson correlation coefficient), 또는 민코우스키 거리 (Minkowski distance)가 sim(pi 1, pi 2)을 계산하는데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 피어슨 상관 계수, 유클리디안 제곱 거리, 유클리디안 제곱 합, 또는 제곱된 피어슨 상관 계수가 유사성을 결정하는데 이용된다. 이들 측정 규준은 예로써, SAS (Statistics Analysis Systems Institute, Cary, North Carolina) 또는 S-Plus (Statistical Sciences, Inc., Seattle, Washington)를 이용하여 계산될 수 있다. 이들 측정 규준의 이용은 Draghici, 2003, Data Analysis Tools for DNA Microarrays, Chapman & Hall, CRC Press London, chapter 11에서 기술되고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
상관은 또한, 행렬 (rank)에 기초하여 계산될 수 있는데, 여기서 x i 와 y i 는 오름차순 또는 내림차순으로, 측정된 양의 값의 행렬이다. 예로써, Conover, Practical Nonparametric Statistics, 2nd ed., Wiley, (1971)를 참조한다. 또한, 새년 상호 정보량 (Shannon mutual information)이 유사성 척도로서 이용될 수 있다. 예로써, Pierce, An Introduction To Information Theory: Symbols, Signals, and Noise, Dover, (1980)를 참조하고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
본 발명의 일부 구체예에서는 도 2에 도시된 프로그램 모듈 중에서 임의의 한 가지 또는 모두를 포함하는 컴퓨터 프로그램 산물을 제시한다.
프로그램 모듈의 양상은 하기에서 더욱 기술된다. 목적되는 다합체성 단백질의 활성을 평가하여 약리학적 지문을 확립하기 위하여 당업자에게 공지된 임의의 분석이 이용될 수 있다. 이런 분석의 실례는 하기에서 더욱 기술된다. 본 발명의 방법과 함께 이용되는 임의의 분석은 고처리량 형식으로 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 패널은 하나 또는 일단의 표적에 선별적인 화합물을 조사하고 확인하기 위하여; 특히, 활성이 목적되는 또는 활성의 일정한 패턴 또는 프로필을 갖는 다합체성 단백질의 특정 형태에 특이적인 화합물을 확인하기 위하여 HTS에서, 또는 의약 화학 (medicinal chemistry)과 공동으로 이용될 수 있다. 이들 화합물을 이용한 생체내 검사를 비롯한 이차 검사는 생체내에서 상응하는 표적 또는 표적들의 존재, 역할과 기능, 또는 생물마커로서 이의 적절성을 결정하는데 이용될 수 있다 (검사 방법은 다양하고, 여기에는 뇌 영상 연구, 동물 연구, 결합 연구, 행동 모형, PET 스캔, NMRI 등이 포함된다).
본 발명에서는 다합체성 단백질의 조성을 특성화하는 것을 제시한다. 이론에 한정됨 없이, 기능적 기준에 의해 특성화된 다합체성 단백질은 다합체성 단백질 또는 조합의 특정한 화학량론, 또는 상이한 특정한 화학량론의 수준을 반영할 수 있다. 일정한 구체예에서, 다합체성 단백질은 이러한 다합체성 단백질을 발현하도록 조작된 세포에서 발현된다.
일부 구체예에서, 이합체의 조성은 본 발명의 방법을 이용하여 결정된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 특정 세포에서 이합체가 a) 첫 번째 아단위의 동종이합체; b) 두 번째 아단위의 동종이합체; 또는 c) 첫 번째와 두 번째 아단위의 이종이합체인 지를 결정하는 것을 가능하게 한다. 가령, 이런 방법은 아래의 단계를 포함할 수 있다:
단계 A) 두 번째 아단위를 발현하지 않는 세포에서 첫 번째 아단위의 활성이 조사된다.
단계 B) 첫 번째 아단위를 발현하지 않는 세포에서 두 번째 아단위의 활성이 조사된다.
단계 C) 첫 번째와 두 번째 아단위 둘 모두를 발현하는 세포에서 첫 번째 아단위 및 두 번째 아단위의 활성이 조사된다.
단계 A, B, 그리고 C에서 획득된 활성은 비교되고, 그리고 첫 번째와 두 번째 아단위를 모두 발현하는 세포에서 이합체성 단백질의 조성이 추론된다. 단계 A에서 결정된 활성이 단계 C에서 결정된 활성에 동등하면, 첫 번째와 두 번째 아단위를 공동-발현하는 세포에서 형성되는 이합체는 첫 번째 아단위의 동종이합체이다. 단계 B에서 결정된 활성이 단계 C에서 결정된 활성에 동등하면, 첫 번째와 두 번째 아단위를 공동-발현하는 세포에서 형성되는 이합체는 두 번째 아단위의 동종이합체이다. 단계 A에서 결정된 활성 및 단계 B에서 결정된 활성 둘 모두 단계 C에서 결정된 활성과 상이하면, 첫 번째와 두 번째 아단위를 공동-발현하는 세포에서 형성되는 이합체는 첫 번째와 두 번째 아단위의 이종이합체이다. 단계 C에서 결정된 활성이 단계 A 및 단계 B에서 관찰된 활성의 조합이면, 첫 번째와 두 번째 아단위를 공동-발현하는 세포는 첫 번째 아단위의 동종이합체 및 두 번째 아단위의 동종이합체를 생산한다.
일부 구체예에서, 시간의 흐름 동안 화합물의 활성 프로필이 측정된다. 삼합체 및 더욱 높은 등급의 다합체화를 갖는 기타 다합체성 단백질의 아단위 조합을 결정하기 위하여 유사한 단계가 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에서는 복수의 세포주를 포함하는 세포주 패널을 제시하고, 여기서 복수의 세포주의 각 세포주는 동일한 프로토콜 및 동일한 호스트 세포를 이용하여 다합체성 단백질의 동일한 아단위 또는 아단위들을 발현하도록 조작되고, 여기서 결과의 다합체성 단백질은 이들 세포주 간에 상이하다. 다합체성 단백질 간에 차이는 상이한 아단위 조합, 상이한 아단위 화학량론, 단백질분해를 비롯한 상이한 번역후 변형, 및/또는 하나 이상의 아단위의 상이한 절단접합일 수 있다. 이론에 한정됨 없이, 세포주 간에 다합체성 단백질에서 이들 차이는 예로써, 아단위(들)의 상이한 삽입 부위, 또는 세포 내로 도입되는 도입된 서열의 사본 수에 기인할 수 있다. 일부 구체예에서, 다합체성 단백질은 이러한 다합체성 단백질에 대한 적어도 2, 5, 10, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000, 5000, 또는 적어도 10,000개의 화합물의 활성을 측정하여 약리학적 프로필을 산출함으로써 특성화된다. 각 세포주의 약리학적 프로필은 서로 비교된다. 약리학적 프로필이 동일하면, 이들 다합체성 단백질의 조성은 동일할 것으로 예측된다. 약리학적 프로필이 상이하면, 이들 다합체성 단백질의 조성은 상이할 것으로 예측된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 세포주 패널을 제시하고, 여기서 각 패널은 앞서 논의된 바와 같은 상이한 약리학적 프로필에 의해 정의되는 상이한 다합체성 단백질을 각각 발현하는 복수의 세포주를 포함하고, 여기서 이들 상이한 세포주는 동일한 프로토콜 및 동일한 호스트 세포주를 이용하여 산출되었다. 일부 구체예에서, 세포 배양을 위한 실질적으로 동일한 프로토콜이 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 세포주 패널은 동시에 또는 상이한 시점에서, 하지만 일관된 또는 유사한 세포, 조건 또는 프로토콜을 이용하여 처리될 수 있다.
일부 구체예에서, 이들 방법은 상이한 호스트 세포주로부터 생산된 클론에 적용될 수 있다. 특정한 구체예에서, 호스트 세포주는 그들의 유전자 발현 프로필에서 상이하다. 이들 구체예에서, 일정한 형태의 목적되는 다합체성 단백질의 형성에 대한 특정한 보조-인자 또는 내생적으로 제공된 인자의 효과를 특성화하기 위하여 상이한 세포주가 이용될 수 있다.
특정한 구체예에서, 다합체성 단백질의 활성은 다합체성 단백질을 발현하는 세포를 이러한 다합체성 단백질을 활성화시키거나 저해하는 화합물과 접촉시킴으로써 조사될 수 있다.
일부 구체예에서, 일정한 조건 하에 다합체성 단백질의 활성 프로필이 결정된다. 이론에 한정됨 없이, 동일한 조건이 다합체성 단백질의 상이한 형태에 대한 상이한 효과를 나타낼 수 있는 것으로 생각된다. 가령, 복수의 상이한 조건이 다합체성 단백질에 대한 그들에 효과에 대하여 조사된다. 예시적인 조건에는 온도, 세포 배지에서 이온 농도, CO2 농도, 세포 밀도, 세포 주기의 동기화, pH, 산도, 탄산화, 공기 조건, 이산화탄소 백분, 진탕, 교반, UV 노출, 대사산물의 활성 또는 농도, 영양소, 혈청, 아미노산, 당류, 탄수화물, 단백질, 지질, 세정제, 성장 인자, 보조-인자, 비타민, 돌연변이원, 화학물질, 화합물 또는 미량 물질이 포함된다. 이들 활성 프로필은 이후, 다합체성 단백질의 조성을 추론하는데 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 다합체성 단백질의 약리학적 프로필이 결정된다. 가령, 복수의 상이한 화합물이 다합체성 단백질에 대한 그들의 효과에 대하여 조사된다. 예시적인 화합물에는 상기 단백질 또는 동일한 부류 또는 집단의 단백질을 조정하는 것으로 공지된 화합물, 임상 연구에서 부작용을 갖는 것으로 공지된 화합물, 임상적 효능을 자는 화합물, 약리학적으로 활성인 화합물, 조합 화합물 라이브러리의 화합물, 화학적 화합물, 합성 화합물, 자연 화합물, 펩티드, 지질, 세정제, 돌연변이원, 형광 화합물 또는 중합체가 포함된다. 이들 약리학적 프로필은 이후, 다합체성 단백질의 조성을 추론하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 목적되는 단백질을 발현하는 복수 세포주의 생산을 가능하게 만든다. 본 발명의 클론 세포주는 이런 발현의 상이한 절대적인 및 상대적인 수준을 가질 것이다. 이런 클론의 큰 패널은 다수의 공지된 참고 화합물로 활성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 이러한 방식으로, 각각의 분리된 세포주는 상기 단백질의 차별적 기능적 발현의 활성을 나타내는 검사 화합물에 대한 반응의 "지문"을 가질 것이다. 이들 세포주는 이후, 이들 화합물에 대한 이런 반응의 유사성에 기초하여 집단화될 수 있다. 각각의 기능적으로 상이한 발현 프로필을 나타내는 적어도 하나의 세포주가 추가 연구를 위하여 선택될 수 있다. 이들 세포주의 수집물은 이후, 다수의 화합물을 스크리닝하는데 이용될 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 단백질의 상응하는 별개의 기능적 형태 중에서 하나 이상을 선별적으로 조정하는 화합물이 확인될 수 있다. 이후, 이들 조절제는 이차 분석 또는 생체내 모형에서, 어떤 것이 활성을 나타내는 지를 결정하기 위하여 조사될 수 있다. 덧붙여 말하면, 이들 조절제는 상기 단백질의 어떤 상응하는 기능적 형태가 존재하는 지, 또는 이용된 이차 분석 또는 모형 시스템에서 일정한 역할을 하는 지를 확인하기 위한 참고 화합물로서 이용될 것이다. 이런 검사는 생체내에서 존재하는 단백질의 기능적 형태, 그리고 생리학적으로 적절한 것들을 결정하는데 이용될 수 있다. 이들 조절제는 이들 기능적으로 별개의 형태 중에서 어떤 것이 특정 표현형 또는 생리학적 기능, 예를 들면, 질환에 관여하는 지를 식별하는데 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 목적되는 생체내 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관 (in-vitro-correlate, "IVC")을 산출하는 방법을 제시한다. IVC는 상이한 단백질에 대한 생체내 생리학적 특성을 갖는 화합물의 활성 프로필, 예를 들면, 상이한 단백질의 생리학적 특성에 대한 화합물의 효과의 프로필을 확립함으로써 산출된다. 이러한 활성 프로필은 생체내 생리학적 특성의 전형이고, 따라서 상기 생리학적 특성에 대한 지문의 IVC이다.
일부 구체예에서, 시험관내 상관은 약물의 부정적인 부작용에 대한 시험관내 상관이다. 다른 구체예에서, 시험관내 상관은 약물의 유익한 효과에 대한 시험관내 상관이다.
일부 구체예에서, IVC는 목적되는 화합물의 한 가지 이상의 생리학적 특성을 예측하거나 확증하는데 이용될 수 있다. 화합물은 상이한 단백질에 대한 활성에 대하여 조사될 수 있고, 그리고 결과의 활성 프로필은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 산출된 IVC의 활성 프로필에 비교된다. 목적되는 화합물의 활성 프로필에 가장 유사한 활성 프로필을 갖는 IVC의 생리학적 특성은 상기 목적되는 화합물의 생리학적 특성을 갖는 것으로 예측되고 및/또는 확증된다.
일부 구체예에서, IVC는 상이한 단백질 또는 생물학적 경로, 또는 이들의 조합에 대한 화합물의 활성을 평가함으로써 확립된다. 유사하게, 화합물의 생리학적 활성을 예측하거나 확증하기 위하여, 상기 화합물의 활성이 상이한 단백질 또는 생물학적 경로, 또는 이들의 조합에 대하여 조사될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 목적되는 화합물에 의해 특정 생리학적 효과가 어느 정도로 유발되는 지를 결정 및/또는 예측 및/또는 확증하는데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 방법은 목적되는 화합물의 생리학적 효과의 조직 특이성을 결정 및/또는 예측 및/또는 확증하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 방법과 함께 이용되는 세포주는 유전자 활성화 (참조: PCT Application Publication WO/1994/012650) 또는 도입유전자의 도입을 이용하여 조작될 수 있다. 목적되는 단백질을 발현하는 세포는 분자 표지 또는 형광 올리고뉴클레오티드를 이용하여 확인될 수 있다 (참조: 2004년 2월 17일 허여된 U.S. Patent No. 6,692,965 (Shekdar et al.), 그리고 International Application No. PCT/US2005/005080 (WO/2005/079462)). 일부 구체예에서, 세포 또는 세포주는 다합체성 단백질의 일부인 단백질 아단위를 발현하도록 조작된다. 더욱 특정한 구체예에서, 세포 또는 세포주는 다합체성 단백질의 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 또는 적어도 12개의 아단위를 발현하도록 조작된다. 특정한 구체예에서, 활성 프로필은 다합체성 단백질의 아단위의 상이한 조합을 발현하도록 각각 조작된 복수의 세포주에 대하여 산출된다.
일부 구체예에서, IVC를 산출하는 방법과 함께 이용되는 세포 또는 세포주는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 세포 또는 세포주, 예를 들면, 실질적으로 일정한 생리학적 특성을 갖는 세포 또는 세포주, 단백질 태그를 포함하지 않는 목적되는 단백질을 발현하는 세포 또는 세포주, 또는 기능 분석에서 적어도 0.4의 Z' 인자를 갖는 세포 또는 세포주, 또는 선별 압력의 부재에서 배양되는 세포 또는 세포주, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 구체예에서, 이용되는 상이한 세포 또는 세포주는 실질적으로 동일한 배양 조건 하에 동시에 유지된다. 본 명세서에서 기술된 로봇식 방법은 IVC를 산출하기 위한 세포 또는 세포주를 유지하고 조작하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에서는 IVC를 산출하기 위한 세포 또는 세포주를 제시하고, 여기서 상기 세포 또는 세포주는 선별 압력의 부재에서 배양되고 그리고 여기서 상기 세포의 적어도 하나의 단백질의 발현은 3개월 동안 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 30% 35% 또는 40% 이상 변하지 않는다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 단백질의 발현은 4, 5, 6개월 또는 그 이상 동안 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 30% 35% 또는 40% 이상 변하지 않는다.
더욱 특정한 구체예에서, 목적되는 화합물의 활성 프로필은 다합체성 단백질을 발현하도록 조작된 세포주를 이용한 복수의 시험관내 분석에서 상기 화합물의 활성을 조사함으로써 확립되고, 여기서 적어도 2개의 세포주가 상이한 다합체성 단백질을 발현한다. 특정한 구체예에서, 이들 상이한 다합체성 단백질은 다합체성 단백질의 아단위의 상이한 조합이다. 특정한 구체예에서, IVC는 다합체성 단백질의 가능한 아단위 조합의 적어도 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 적어도 99%에 대하여 목적되는 화합물을 조사함으로써 산출된다. 이보다 더욱 특정한 구체예에서, 모든 가능한 아단위 조합이 조사된다. 일정한 구체예에서, 적어도 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 7500, 또는 적어도 10000개의 아단위 조합이 조사된다.
일부 구체예에서, 상이한 세포주의 상이한 다합체성 단백질은 다합체성 단백질의 상이한 형태이고, 여기서 상이한 형태는 조합, 화학량론, 절단접합, 및/또는 단백질분해를 비롯한 그들의 아단위의 번역후 변형에서 상이하다.
일부 구체예에서, 표적 또는 관련된 표적의 복수의 기능적 형태를 대표하는 패널에 대한 실패한 및 성공한 후보 약물의 검사는 특정 표적을 임상 동안 관찰된 유해하거나 원치 않는 부작용, 또는 치료 효능에 상관시키는데 이용될 수 있다. 이러한 정보는 HTS에서, 또는 최대 원하는 및 최소 부정확한 (off-target) 활성을 갖는 약물을 향한 화합물 개발 동안 충분히 정의된 표적을 선별하는데 이용될 수 있다.
더욱 특정한 구체예에서, 화합물의 IVC는 다합체성 단백질의 상이한 아단위 조합을 발현하는 상이한 세포주에 대하여 상기 화합물을 조사함으로써 산출된다. 더욱 특정한 구체예에서, 이런 다합체성 단백질에는 수용체 단백질 복합체, 예를 들면, GABAA; NaV; GABAB; ENaC; 단맛 수용체; 감칠맛 수용체 및 본 명세서에서 기술된 기타 다합체성 단백질이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
일정한 구체예에서, IVC는 ENaC, GABAA, NaV, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 쓴맛 수용체, CFTR, 또는 GCC를 이용하여 산출된다. 하기에 기술된 바와 같이, 화합물의 IVC는 특정 생리학적 파라미터에 대한 상기 화합물의 효과를 대표할 수 있다. 일정한 구체예에서, 생리학적 파라미터는 기능적 자기 공명 영상 ("fMRI")을 이용하여 측정된다. 다른 영상 방법 역시 이용될 수 있다. 이런 다른 영상 방법에는 전산화 단층촬영 (computed tomography, CT); 전산화 축 단층촬영 (Computed Axial Tomography, CAT) 스캐닝; 확산 광학 영상 (diffuse optical imaging, DOI); 확산 광학 단층촬영 (diffuse optical tomography, DOT); 사건관련 광 신호 (event-related optical signal, EROS); 근적외선 분광법 (near infrared spectroscopy, NIRS); 자기 공명 영상 (magnetic resonance imaging, MRI); 뇌자도 (magnetoencephalography, MEG); 양전자 방출 단층촬영 (positron emission tomography, PET) 및 단일 광자 방출 전산화 단층촬영 (single photon emission computed tomography, SPECT)이 포함된다. 일정한 구체예에서, IVC가 중추신경계 ("CNS")에 대한 화합물의 효과를 나타내면, CNS에서 fMRI 패턴과 상관하는 IVC가 확립될 수 있다. 인간과 동물 (가령, 가축과 반려동물) 검사 모형을 비롯한 다양한 검사 및 모형에서 화합물의 활성과 상관하는 IVC가 산출될 수 있다. 인간 질환과 장애는 예로써, The Merck Manual 18th Edition (Hardcover) Mark H. Beers (Author) Robert S. Porter (Editor), Thomas V. Jones (Editor)에서 열거된다. 정신 질환과 장애는 예로써, American Psychiatric Association (Corporate Author)에 의한 Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders DSM-IV-TR Fourth Edition (Text Revision)에서 열거된다.
GABA를 이용하여 산출된 IVC는 CNS 질환, 불안, 진정, 외상후 스트레스 장애 (post-traumatic stress disorder, PTSD), 기억, 학습, 자폐증, 간질, 알코올 중독, 기분 장애 (mood disorder), CNS 기능, CNS 생리 기능, CNS 발달, 및/또는 CNS의 노화에 대한 화합물의 생리학적 효과를 대상으로 할 수 있다. 이러한 생리학적 효과는 상기 질환의 적어도 한 가지 증상의 증가 또는 감소일 수 있다.
GABA에 대한 IVC는 또한, 행복, 만족, 도취, 열광, 흥분, 기대, 만족, 불안, 우울, 분노, 두려움, 공포, 의심, 사랑, 증오, 감정의 교차, 무관심, 무기력, 죄책감, 헌신, 슬픔, 불행, 언짢음, 과민성, 충동, 욕구, 공격성, 적의, 격노, 거만, 자신감 또는 이의 부족, 확신, 확신의 부족, 불쾌감, 망설임; 긍정적인, 부정적인, 협조적, 비협조적, 도움적 또는 비도움적 태도; 해방, 행복, 성취, 충분, 불충분 또는 한계의 느낌; 매력적인, 매력 없는, 성적 매력이 있는, 성적 매력이 없는, 마음에 드는, 마음에 들지 않는, 사랑스러운, 사랑스럽지 않은, 호감이 가는, 또는 호감이 가지 않는 느낌; 고립된 또는 포함된 느낌; 사교 단체에 속하거나 속하지 않는 느낌; 갇힌, 속임을 당하는, 조종당하는, 미혹된, 도움을 받는, 고무된 또는 낙담한 느낌; 자살을 생각하는 느낌; 위험을 감수하는, 범죄를 저지르는, 법규를 위반하는, 책임을 회피하는 느낌; 또는 살인을 저지르는 느낌을 비롯한 감정, 기분, 정신 상태, 느낌, 감각, 또는 지각에 대하여 산출될 수 있다.
GABA에 대한 IVC는 또한, 긍정적인 또는 부정적인 기분을 자극하는 감각 자극에 대하여 산출될 수 있다. 긍정적인 감각 자극에는 향기 감각, 예를 들면, 해풍 (sea breeze), 산림, 식품 등이 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, GABA에 대한 IVC는 평온한, 중단없는, 깊은, 얕은 또는 REM 수면, 평온함, 수면 부족, 불면증, 수면 장애, 수면 방해, 또는 수면 동안 걷기, 말하기 또는 먹기를 비롯한 진정 또는 수면; 기억, 학습, 해석, 분석, 사고, 회고, 상황 파악, 연상하기, 과거 회상, 단기 기억, 장기 기억 또는 인식; 알코올 의존 또는 상습 또는 알코올 중독; CNS 징후, 만성 통증, 간질, 경련, 마약중독, 마약의존; 내분비물/호르몬 징후, 눈 깜박임 조건형성 범례 (eye blink conditioning paradigm), 폐 암, 전립선 암, 유방 암 및 기타 암과 암종; 글루코오스 대사 반응, 무산소증, 프로스타글란딘 유도된 열발생 (thermogenesis), 심장 압-수용체 반사 (cardiac baro-receptor reflex) 및 기타 반사 비정상 (reflex abnormality); 그리고 자폐증을 비롯한 정신 장애에 대하여 산출될 수 있다.
쓴맛 수용체를 이용하여 산출된 IVC는 비만, 당 흡수, 글루카곤-유사 펩티드 (GLP) 분비, 또는 혈당 조절에 대한 생리학적 효과를 대상으로 할 수 있다. 이러한 생리학적 효과는 식욕, 전반적인 영양 공급, 영양소 흡수의 정도 또는 비율, 비만 (증가 또는 감소), 당 흡수의 정도 또는 비율, GLP 분비, 또는 혈당 조절의 상향 조절 또는 하향 조절일 수 있다. 대안으로, IVC는 또한, 식품 및/또는 약물에서 쓴맛과 상관될 수 있다.
일부 구체예에서, 쓴맛 수용체를 이용한 IVC는 장 내에서 활성 (가령, GLP 분비 또는 다른 장 호르몬의 분비), 혈당 제어 또는 균형, 당뇨병, 급식, 굶주림, 식욕, 영양소 흡수, 체중 감소, 에너지에 대하여 산출될 수 있다. 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체를 이용한 IVC는 일반의약품 (over the counter drug) 및 약물의 상이한 입체이성체를 비롯한 음료, 식품 또는 약물 원료의 원하는 또는 원치 않는 쓴맛 / 맛없음; 편식 (food preference); 섭식 장애 (가령, 다식증, 식욕부진 또는 식이요법); 화합물의 감각 또는 미각 지각; 또는 음료, 식품 또는 약물 원료의 미각 또는 쓴맛 수용체 또는 GPCR 활성의 성질 제어에 대하여 산출될 수 있다. 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체를 이용한 IVC는 활성 화합물에 응하여 뉴런 발사 (neuronal firing) 또는 CNS 활성; 메스꺼움, 구토 (약물 또는 다른 화합물에 의해 유발된 메스꺼움, 예를 들면, 화학요법-유도된 메스꺼움과 구토 (CINV) 포함); 비-쓴맛 GPCR에서 화합물의 활성; 구강에서 활성적이지만 다른 곳에서는 그렇지 않은 (가령, 장에서 활성적이지 않은) 쓴맛 또는 쓴맛 조정 화합물 등에 대하여 산출될 수 있다. 일정한 구체예에서, 조직-특이적 방식으로 쓴맛 수용체를 활성화시키거나, 저해하거나, 또는 조정하는 화합물은 혈당 수준, 글루코오스 흡수를 조정하고, 및/또는 구토 또는 CINV를 예방하는데 이용될 수 있고, 여기서 조정 활성은 장에서 바람직하지만 구강에서는 그렇지 않다. 일정한 구체예에서, 구강에서만 활성적인 쓴맛 조정 화합물은 장에서 생리학적 활성이 바람직하지 않은 풍미 적용에 이용될 수 있다. 단맛 수용체를 이용하여 산출된 IVC는 식욕, 영양 공급, 영양소 흡수, 비만, 당 흡수, GLP 분비, 또는 혈당 조절에 대한 생리학적 효과를 대상으로 할 수 있다. 이러한 생리학적 효과는 식욕, 전반적인 영양 공급, 영양소 흡수의 정도 또는 비율, 비만 (증가 또는 감소), 당 흡수의 정도 또는 비율, GLP 분비, 또는 혈당 조절의 상향 조절 또는 하향 조절일 수 있다.
단맛 수용체를 이용한 IVC는 아래에 대하여 산출될 수 있다: 천연 및 인공 고강도 감미료 (가령, 사카린, 아스파테임, 사이클라메이트, 나한과, 스테비아와 이의 성분, 아세설팜 K, 네오탐, 수크랄로스 및 이들의 혼합물)를 비롯한 단맛 화합물의 오래 끄는 / 오래 지속되는 / 연장된 기간 / 맛없음 또는 뒷맛; 편식 (food preference); 섭식 장애 (가령, 다식증, 식욕부진 또는 식이요법); 장 내에서 활성 (가령, GLP 분비 또는 다른 장 호르몬의 분비), 혈당 제어 또는 균형, 당뇨병, 급식, 굶주림, 식욕, 영양소 흡수, 체중 감소 또는 에너지; 일반의약품 (over the counter drug) 및 약물의 상이한 입체이성체를 비롯한 음료, 식품 또는 약물 원료의 원하는 또는 원치 않는 맛 / 맛없음; 화합물의 감각 또는 미각 지각; 활성 화합물에 응하여 뉴런 발사 (neuronal firing) 또는 CNS 활성; 메스꺼움 / 구토 (약물 또는 다른 화합물에 의해 유발된 메스꺼움 (가령, CINV) 포함); 구강에서 활성적이지만 다른 곳에서는 그렇지 않은 (가령, 장에서 활성적이지 않은) 단맛 또는 단맛 조정 화합물 등. 일정한 구체예에서, 조직-특이적 방식으로 단맛 수용체를 활성화시키거나, 저해하거나, 또는 조정하는 화합물은 혈당 수준, 글루코오스 흡수를 조정하고, 및/또는 구토 또는 CINV를 예방하는데 이용될 수 있고, 여기서 조정 활성은 장에서 바람직하지만 구강에서는 그렇지 않다. 일정한 구체예에서, 구강에서만 활성적인 단맛 조정 화합물은 장에서 생리학적 활성이 바람직하지 않은 풍미 적용에 이용될 수 있다.
감칠맛 수용체가 IVC를 산출하는데 이용되면, 상기 IVC는 식욕, 영양 공급, 영양소 흡수, 비만, 당 흡수, GLP 분비, 혈당 조절 또는 아미노산 흡수에 대한 생리학적 효과를 대상으로 할 수 있다. 이러한 생리학적 효과는 식욕, 전반적인 영양 공급, 영양소 흡수의 정도 또는 비율, 비만 (증가 또는 감소), 당 흡수의 정도 또는 비율, GLP 분비, 또는 혈당 조절의 상향 조절 또는 하향 조절일 수 있다.
감칠맛 수용체를 이용한 IVC는 아래에 대하여 산출될 수 있다: 편식 (food preference); 섭식 장애 (가령, 다식증, 식욕부진 또는 식이요법); 장 내에서 활성 (가령, GLP 분비 또는 다른 장 호르몬의 분비), 혈당 제어 또는 균형, 당뇨병, 급식, 굶주림, 식욕, 영양소 흡수, 체중 감소 또는 에너지; 일반의약품 (over the counter drug) 및 약물의 상이한 입체이성체를 비롯한 음료, 식품 또는 약물 원료의 원하는 또는 원치 않는 맛 / 맛없음; 화합물의 감각 또는 미각 지각; 활성 화합물에 응하여 뉴런 발사 (neuronal firing) 또는 CNS 활성; 메스꺼움 / 구토 (약물 또는 다른 화합물에 의해 유발된 메스꺼움 (가령, CINV) 포함); 음료, 식품 또는 약물 원료의 미각 또는 GPCR 유발 활성의 성질 제어; 구강에서 활성적이지만 다른 곳에서는 그렇지 않은 (가령, 장에서 활성적이지 않은) 감칠맛 또는 감칠맛 조정 화합물 등. 일정한 구체예에서, 조직-특이적 방식으로 감칠맛 수용체를 활성화시키거나, 저해하거나, 또는 조정하는 화합물은 혈당 수준, 글루코오스 흡수를 조정하고, 및/또는 구토 또는 CINV를 예방하는데 이용될 수 있고, 여기서 조정 활성은 장에서 바람직하지만 구강에서는 그렇지 않다. 일정한 구체예에서, 구강에서만 활성적인 감칠맛 조정 화합물은 장에서 생리학적 활성이 바람직하지 않은 풍미 적용에 이용될 수 있다.
ENaC를 이용하여 산출된 IVC는 COPD (만성 폐쇄성 폐 질환), CF (낭포성 섬유증), 생식, IBS (과민성 장 증후군), 크론병, 폐 부종 또는 고혈압에 대한 화합물의 생리학적 효과를 대상으로 할 수 있다. 이러한 생리학적 효과는 상기 질환의 악화, 또는 상기 질환의 적어도 한 가지 증상의 감소 또는 개선일 수 있다. IVC는 또한, 화합물의 상이한 짠맛을 나타낼 수 있다.
ENaC를 이용한 IVC는 또한, 아래에 대하여 산출될 수 있다: 편식 (food preference); 섭식 장애 (가령, 다식증, 식욕부진 또는 식이요법); 점액의 조절, 분비, 품질, 제거, 생산, 점성, 또는 두께; 물 흡수, 보유, 균형, 통과, 또는 상피 조직 (특히, 폐, 신장, 혈관 조직, 눈, 장, 소장 및 대장)을 통한 수송; 활성 화합물에 응하여 뉴런 발사 또는 CNS 활성; 폐 징후; 위장 징후, 예를 들면, 장 청소 (bowel cleansing), 과민성 장 증후군 (IBS), 약물-유도된 (즉, 오피오이드) 변비, 누워서만 지내는 환자의 변비/CIC, 급성 감염성 설사, 대장균, 콜레라, 바이러스 위장염, 로타바이러스, 기능부전 증후군의 조정, 소아 설사 (바이러스, 세균, 원생동물), HIV, 또는 작은 창자 증후군; 생식 징후, 예를 들면, 정자 운동 또는 정자 수정능 (sperm capacitation); 여성 생식 징후, 예를 들면, 경관 점액/질 분비 점성 (즉, 비우호적인 경관 점액 (hostile cervical mucus)); 피임, 예를 들면, 정자 운동 또는 정자 운동에 관련된 경관 점액 품질에 부정적인 영향을 주는 화합물; 또는 구강건조증, 안구건조증, 녹내장 또는 콧물.
ENaC를 이용한 IVC는 또한, 화합물의 감각 또는 미각 지각에 대하여 산출될 수 있다. 특히, IVC는 짠맛, 예를 들면, 마그네슘, 나트륨, 칼륨, 및/또는 칼슘 염의 미각을 대상으로 할 수 있다. 이들 염은 상이한 반대 이온 (counter ion), 예를 들면, 설페이트, 염화물 또는 다른 할로겐화합물, 브롬화물, 포스페이트, 락테이트 등을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 염은 칼륨 염화물 또는 칼륨 락테이트이다. 일정한 구체예에서, IVC는 상이한 염의 조합의 미각 지각을 나타낸다.
CFTR을 이용하여 산출된 IVC는 COPD (만성 폐쇄성 폐 질환), CF (낭포성 섬유증), 생식, IBS (과민성 장 증후군), 크론병, 폐 부종 또는 고혈압에 대한 화합물의 생리학적 효과를 대상으로 할 수 있다. 이러한 생리학적 효과는 상기 질환의 적어도 한 가지 증상의 증가 또는 감소일 수 있다.
CFTR을 이용한 IVC는 또한, 아래에 대하여 산출될 수 있다: 점액의 조절, 분비, 품질, 제거, 생산, 점성, 또는 두께; 물 흡수, 보유, 균형, 통과, 또는 상피 조직 (특히, 폐, 신장, 혈관 조직, 눈, 장, 소장 및 대장)을 통한 수송; 화합물의 감각 또는 미각 지각; 활성 화합물에 응하여 뉴런 발사 또는 CNS 활성; 폐 징후; 위장 징후, 예를 들면, 장 청소 (bowel cleansing), 과민성 장 증후군 (IBS), 약물-유도된 (즉, 오피오이드) 변비, 누워서만 지내는 환자의 변비/CIC, 급성 감염성 설사, 대장균, 콜레라, 바이러스 위장염, 로타바이러스, 기능부전 증후군의 조정, 소아 설사 (바이러스, 세균, 원생동물), HIV, 또는 작은 창자 증후군; 생식 징후, 예를 들면, 정자 운동 또는 정자 수정능 (sperm capacitation); 여성 생식 징후, 예를 들면, 경관 점액/질 분비 점성 (즉, 비우호적인 경관 점액 (hostile cervical mucus)); 피임, 예를 들면, 정자 운동 또는 정자 운동에 관련된 경관 점액 품질에 부정적인 영향을 주는 화합물; 구강건조증, 안구건조증, 녹내장, 콧물; 또는 내분비 징후, 다시 말하면, CF 환자에서 췌장 기능.
NaV를 이용하여 산출된 IVC는 통증에 대한 생리학적 효과를 대상으로 할 수 있다. 이러한 생리학적 효과는 통증의 증가 또는 감소일 수 있다.
NaV를 이용한 IVC는 또한, 아래에 대하여 산출될 수 있다: 통증 (만성 통증, 급성 통증, 심장 통증, 근육 통증, 골 통증, 장기 통증, 피로, 과자극, 찰과상, 신체 손상 또는 내부 손상에 의해 유발된 통증, 암으로부터 통증, 물리적 손상으로부터 통증, 지각된 통증, 환상 통증, 그리고 쇠약성 통증 (debilitating pain) 포함); 작용 전위 (action potential)의 발생 또는 전파, 뉴런 신호전달, 또는 뉴런 정보의 전송; 또는 근육 또는 심장 징후, 또는 생체내에서 근육 또는 심장 근육에 대한 화합물의 활성.
GCC를 이용하여 산출된 IVC는 아래를 대상으로 할 수 있다: 위장 징후: 변비, IBS-C (변비), IBS-D (설사) 또는 IBS-M (혼성)을 비롯한 IBS (과민성 장 증후군), 만성 특발성 변비, 오피오이드 또는 약물 유도된 변비, 누워서만 지내는 또는 노인 환자에서 변비, 급성 감염성 설사 (가령, 세균, 대장균, 살모넬라, 콜레라에 의해 매개된, 특히 여행자 설사), 바이러스 위장염, 로타바이러스의 임상 징후, 기능부전 증후군, 소아 설사 (바이러스, 세균, 원생동물), 작은 창자 증후군, 대장염 (교원성, 림프성), 크론병, UC, 게실염, 낭포성 섬유증 또는 소화성 궤양 (petic ulcer)을 비롯한 궤양; 점액 및/또는 상피액 흡수와 분비의 조절/조정; 폐 징후, 예를 들면, 낭포성 섬유증, 신장 기능, 심장 섬유증, 심장 비대, 고혈압, 눈 질환 (가령, 상염색체 우성 망막세포변성 (autosomal dominant retinitis pigmentosa) 및 레버 선천성 흑암시 (Leber congenital amaurosis)), 성장 질환, 단신, 발작 및 기타 혈관 손상; CNS 징후, 예를 들면, 기억 또는 우울증; 또는 염증 질환 (가령, 류머티스 관절염).
후각 수용체는 긍정적인 또는 부정적인 기분을 자극하는 감각 자극에 대한 IVC를 산출하는데 이용될 수 있다. 긍정적인 기분을 자극하는 감각 자극에는 유쾌한 향기, 예를 들면, 해풍 (sea breeze), 숲 냄새, 식품 냄새가 포함될 수 있다. 긍정적인 기분을 자극하는 감각 자극에는 불쾌한 향기가 포함될 수 있다. IVC는 아래의 긍정적인 또는 부정적인 감정을 자극하는 감각 자극에 대하여 산출될 수 있다: 행복, 만족, 도취, 열광, 흥분, 기대, 만족, 불안, 우울, 분노, 두려움, 공포, 의심, 사랑, 증오, 감정의 교차, 무관심, 무기력, 죄책감, 헌신, 슬픔, 불행, 언짢음, 과민성, 충동, 욕구, 공격성, 적의, 격노, 거만, 자신감 또는 이의 부족, 확신, 확신의 부족, 불쾌감, 망설임; 긍정적인, 부정적인, 협조적, 비협조적, 도움적 또는 비도움적 태도; 해방, 행복, 성취, 충분, 불충분 또는 한계의 느낌; 매력적인, 매력 없는, 성적 매력이 있는, 성적 매력이 없는, 마음에 드는, 마음에 들지 않는, 사랑스러운, 사랑스럽지 않은, 호감이 가는, 또는 호감이 가지 않는 느낌; 고립된 또는 포함된 느낌; 사교 단체에 속하거나 속하지 않는 느낌; 갇힌, 속임을 당하는, 조종당하는, 미혹된, 도움을 받는, 고무된 또는 낙담한 느낌; 자살을 생각하는 느낌; 위험을 감수하는, 범죄를 저지르는, 법규를 위반하는, 책임을 회피하는 느낌; 또는 살인을 저지르는 느낌.
아세틸콜린 수용체 역시 긍정적인 또는 부정적인 기분을 자극하는 감각 자극에 대한 IVC를 산출하는데 이용될 수 있다. 감각 자극에는 냄새가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. IVC는 행복, 만족, 도취, 열광, 흥분, 기대, 만족, 불안, 우울, 분노, 두려움, 공포, 의심, 사랑, 증오, 감정의 교차, 무관심, 무기력, 죄책감, 헌신, 슬픔, 불행, 언짢음, 과민성, 충동, 욕구, 공격성, 적의, 격노, 거만, 자신감 또는 이의 부족, 확신, 확신의 부족, 불쾌감, 망설임; 긍정적인, 부정적인, 협조적, 비협조적, 도움적 또는 비도움적 태도; 해방, 행복, 성취, 충분, 불충분 또는 한계의 느낌; 매력적인, 매력 없는, 성적 매력이 있는, 성적 매력이 없는, 마음에 드는, 마음에 들지 않는, 사랑스러운, 사랑스럽지 않은, 호감이 가는, 또는 호감이 가지 않는 느낌; 고립된 또는 포함된 느낌; 사교 단체에 속하거나 속하지 않는 느낌; 갇힌, 속임을 당하는, 조종당하는, 미혹된, 도움을 받는, 고무된 또는 낙담한 느낌; 자살을 생각하는 느낌; 위험을 감수하는, 범죄를 저지르는, 법규를 위반하는, 책임을 회피하는 느낌; 또는 살인을 저지르는 느낌을 비롯한 긍정적인 또는 부정적인 감정, 기분, 정신 상태, 느낌, 감각, 또는 지각을 자극하는 감각 자극에 대하여 산출될 수 있다.
아세틸콜린 수용체에 대한 IVC는 또한, CNS 질환, 불안, 진정, 외상후 스트레스 장애 (post-traumatic stress disorder, PTSD), 기억, 학습, 자폐증, 간질, 알코올 중독, 기분 장애 (mood disorder), CNS 기능, CNS 생리 기능, CNS 발달, 및/또는 CNS의 노화에 대한 화합물의 생리학적 효과에 대하여 산출될 수 있다. 이러한 생리학적 효과는 상기 질환의 적어도 한 가지 증상의 증가 또는 감소일 수 있다. 아세틸콜린을 이용하여 산출된 IVC는 또한, 아래에 대하여 산출될 수 있다: 평온한, 중단없는, 깊은, 얕은 또는 REM 수면, 평온함, 수면 부족, 불면증, 수면 장애, 수면 방해, 또는 수면 동안 걷기, 말하기 또는 먹기를 비롯한 진정 또는 수면; 기억, 학습, 해석, 분석, 사고, 회고, 상황 파악, 연상하기, 과거 회상, 단기 기억, 장기 기억 또는 인식; 알코올 의존 또는 상습 또는 알코올 중독; CNS 징후, 만성 통증, 간질, 경련, 마약중독, 마약의존; 내분비물/호르몬 징후, 눈 깜박임 조건형성 범례 (eye blink conditioning paradigm), 폐 암, 전립선 암, 유방 암 및 기타 암과 암종; 글루코오스 대사 반응, 무산소증, 프로스타글란딘 유도된 열발생 (thermogenesis), 심장 압-수용체 반사 (cardiac baro-receptor reflex) 및 기타 반사 비정상 (reflex abnormality); 그리고 자폐증을 비롯한 정신 장애.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법과 함께 이용되는 세포 또는 세포주는 본 명세서에서 표 6 및 7-22에서 제시된 바와 같이 하나 이상의 단백질을 발현하도록 조작된다.
일부 구체예에서, IVC는 생명체의 조직, 생명체의 장기, 생명체의 세포외 기질, 생명체의 시스템 (가령, 생명체의 면역계), 또는 완전 생명체에서 화합물의 생리학적 특성을 나타낸다. 생명체는 척추동물일 수 있다. 생명체는 포유동물일 수 있다. 더욱 특정한 구체예에서, 생명체는 생쥐, 쥐, 개, 고양이, 소, 말, 당나귀, 염소, 원숭이, 또는 인간이다. 생리학적 특성은 특정 세포 유형, 조직, 장기, 또는 장기 시스템에 대한 효과일 수 있다. 가령, 생리학적 특성은 포유동물 조직, 건강한 조직, 조직, 병든 조직, 암 조직, 배아 조직, 성체 조직, 이식된 조직, 장기 조직, 간 조직, 뉴런 조직, 위장 조직, 근육 조직, 지방 조직, 피부, 비뇨생식기 조직, 뉴런 조직, 중추신경계, 심혈관 조직, 내분비계, 골격 조직, 골 조직, 골, 면역계, 장기, 세포 또는 특수화된 세포, 그리고 본 명세서에 기술된 임의의 다른 세포에 대한 효과일 수 있다. 일부 구체예에서, 생리학적 특성은 조직 보호 활성, 소염 활성, 신경-자극 활성이거나, 또는 아다만탄 (adamantane) 항바이러스제, 아드레날린성 기관지확장제, 고혈압성 응급 (hypertensive emergency)에 대한 약제, 폐 고혈압에 대한 약제, 아메바구제제 (amebicide), 진통성 복합제, 진통제, 안드로겐 및 동화작용 스테로이드, 앤지오텐신 II 저해제, 식욕감퇴제, 제산제, 구충제, 항혈관신생 안약, 항감염제, 항협심증제, 항부정맥제, 항천식성 복합제, 항생제/항종양제, 항콜린성 제토제, 항콜린성 항파킨슨제, 항콜린성 기관지확장제, 항콜린제/진경제, 항응고제, 항경련제, 항우울제, 항당뇨병제, 항당뇨병성 복합제, 지사제, 해독제, 제토제/항현기증제, 항진균제, 항통풍제, 항히스타민제, 항고지질혈증제, 항고지질혈증성 복합제, 항고혈압성 복합제, 항고뇨산혈증제 (antihyperuricemic agent), 항말라리아제, 항말라리아성 복합제, 항말라리아성 퀴놀린, 항대사산물, 항편두통제, 항종양성 해독제, 항종양성 인터페론, 항종양성 단일클론 항체, 항종양제, 항파키슨제, 항혈소판제, 항슈도모나스 페니실린, 항건선제, 항정신병제, 항류머티스제, 소독제 및 살균제, 항독소 및 항사독소, 항결핵제, 항결핵성 복합제, 진해제, 항바이러스제, 항바이러스성 복합제, 항바이러스성 인터페론, 불안완화제, 진정제 및 최면제, 담즙산 격리제, 기관지확장제, 심장 압박제 (cardiac stressing agent), 킬레이트화제, 콜린성 근육 흥분제, CNS 흥분제, 응고 조절제, 피임제, 울혈제거제, 소화 효소, 이뇨제, 도파민성 항파키슨제, 알코올 의존에 이용되는 약물, 거담제, 인자 Xa 저해제, 지방산 유도성 항경련제, 기능성 대장 질환 치료제, 담석 용해제, 전신 마취제, 비뇨생식기 약제, GI 흥분제, 글루코오스 상승제, 당단백질 혈소판 저해제, 성장 호르몬 수용체 차단제, 조혈 줄기 세포 동원제, 헤파린 길항약, 호르몬 대체 요법, 호르몬/항종양제, 면역억제제, 발기부전 치료제, 생체내 진단적 생물학적 약제, 인크레틴 모방제, 수축촉진제, 하제, 정라약 (leprostatics), 국소 주사가능 마취제, 폐 계면활성제, 림프관 착색제 (lymphatic staining agent), 리소솜 효소, 점액용해제, 근육 이완제, 동공확대제, 안과용 녹내장제, 안과용 윤활제 및 관주제, 살정자제, 혈관확장제, 또는 혈압상승제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 물질 또는 화합물의 활성과 유사한 활성을 갖는다.
일부 구체예에서, IVC는 바이러스, 세균, 진균류, 또는 효모에 대한 목적되는 화합물의 생리학적 효과를 나타낸다. 이들 화합물은 예로써, 바이러스, 세균, 진균류, 및/또는 효모에 대한 항생제로서 유용하다.
목적되는 특정 다합체성 단백질에 대한 목적되는 화합물의 활성을 조사 및/또는 확증하는 분석은 상기 다합체성 단백질의 생물학적 활성에 의존한다. 본 발명의 방법과 함께 이용되는 임의의 분석은 고처리량 형식으로 수행될 수 있다.
예시적인 단백질, 그들의 참고물질, 그리고 가능한 분석물은 하기 표 (표 5)에서 제시된다. 이들 실례는 무제한적이고, 따라서 열거된 분석물은 열거된 것들에 추가하여 표적에 대하여 이용될 수 있고, 그리고 열거된 표적은 열거된 것들 이외의 분석에 의해 조사될 수 있다.
Figure pct00008
Figure pct00009
목적되는 화합물의 활성 프로필 및 대표 활성 프로필은 이들 활성 프로필 간에 상관, 예를 들면, 이들 활성 프로필 간에 유사성 척도를 계산함으로써 비교될 수 있다. 대표 활성 프로필은 데이터베이스에서 일군의 활성 프로필 중에서 하나일 수 있다. 대표 활성 프로필은 역사 프로필일 수 있다. 대표 활성 프로필의 데이터베이스는 컴퓨터 판독가능 저장 매체에 저장될 수 있다. 특정한 구체예에서, 데이터베이스는 적어도 10개의 대표 활성 프로필, 적어도 50개의 대표 활성 프로필, 적어도 100개의 대표 활성 프로필, 적어도 500개의 대표 활성 프로필, 적어도 1,000개의 대표 활성 프로필, 적어도 10,000개의 대표 활성 프로필, 또는 적어도 50,000개의 대표 활성 프로필을 포함하고, 각각의 대표 활성 프로필은 적어도 2, 적어도 10, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 2000, 적어도 2500, 적어도 7500, 적어도 10,000, 적어도 20,000, 적어도 25,000, 또는 적어도 35,000개의 성분의 측정된 양을 포함한다. 목적되는 화합물의 활성 프로필은 상이한 다합체성 단백질, 예를 들면, 첫 번째 단백질 아단위 및 두 번째 단백질 아단위의 생물학적 활성에 대한 목적되는 화합물의 효과를 표시하는 측정된 양을 포함할 수 있다. 대표 활성 프로필은 이전에 특성화된 화합물의 공지된 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 제시한다. 생리학적 특성은 약물의 부정적인 부작용 또는 약물의 유익한 효과와 같은 약리학적 특성일 수 있다. 각각의 대표 활성 프로필은 상이한 다합체성 단백질, 예를 들면, 다합체성 단백질의 첫 번째 단백질 아단위 및 두 번째 단백질 아단위의 생물학적 활성에 대한 개별 이전에 특성화된 화합물의 효과를 표시하는 측정된 양을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상관은 목적되는 화합물의 활성 프로필 및 데이터베이스에 저장된 복수의 대표 활성 프로필의 각각의 대표 활성 프로필 사이에 비교될 수 있다. 상관은 소정의 다합체성 단백질의 생물학적 활성에 대한 목적되는 화합물의 효과를 나타내는 목적되는 화합물의 활성 프로필에서 측정된 양을 동일한 다합체성 단백질의 생물학적 활성에 대한 이전에 특성화된 화합물의 효과를 나타내는 대표 활성 프로필에서 상응하는 측정된 양에 비교함으로써 계산될 수 있다. 목적되는 화합물의 활성 프로필은 대표 활성 프로필에서 측정된 양이 목적되는 화합물의 활성 프로필에서 측정된 양의 대략 2%, 대략 5%, 대략 8%, 대략 10%, 대략 12%, 대략 15%, 대략 20%, 대략 25%, 대략 30%, 또는 대략 35% 내에 있으면, 대표 활성 프로필과 상관하는 것으로 간주될 수 있다.
목적되는 화합물의 활성 프로필은 목적되는 화합물의 활성 프로필 및 대표 활성 프로필 사이에 유사성 척도가 미리 결정된 역치를 초과하면, 대표 활성 프로필에 가장 유사한 것으로 간주될 수 있다. 특정한 구체예에서, 미리 결정된 역치는 대표 활성 프로필에서 측정된 양이 목적되는 화합물의 활성 프로필에서 측정된 양의 대략 2%, 대략 5%, 대략 8%, 대략 10%, 대략 12%, 대략 15%, 대략 20%, 대략 25%, 대략 30%, 또는 대략 35% 내에 있음을 지시하는 유사성 척도의 값으로서 결정될 수 있다.
일부 구체예에서, 목적되는 화합물의 활성 프로필은 벡터 p로 표시될 수 있다:
p = [ p 1, . . . p i , . . . p n]
여기서 p i 는 i'번째 성분의 측정된 양, 예를 들면, 소정의 다합체성 단백질의 i'번째 생물학적 활성에 대한 목적되는 화합물의 효과이다. 특정한 구체예에서, n은 2 이상, 10 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 1000 이상, 2000 이상, 2500 이상, 7500 이상, 10,000 이상, 20,000 이상, 25,000 이상, 또는 35,000 이상이다. 각각의 대표 활성 프로필 역시, 벡터 p로 표시될 수 있다. 상관을 계산할 때, 목적되는 화합물에 대한 활성 프로필을 나타내는 벡터에서 i'번째 성분의 측정된 양은 각 성분 i = 1 … n에 대한 대표 활성 프로필을 나타내는 벡터의 i'번째 성분의 상응하는 측정된 양에 비교될 수 있다. 하지만, 상관이 계산될 수 있는 다수의 방법이 존재한다. 실제로, 목적되는 화합물의 활성 프로필 및 대표 활성 프로필 사이에 상관이 존재하는 지를 확인하기 위하여, 2개의 데이터세트가 관련되는 확률 (probability)을 결정하기 위한 당분야에서 임의의 통계학적 방법이 본 발명의 방법에 따라서 이용될 수 있다. 가령, 목적되는 화합물의 활성 프로필 (pi 1) 및 각각의 대표 활성 프로필 (pi 2) 사이에 상관은 유사성 측정 규준 sim(pi 1, pi 2)을 이용하여 계산될 수 있다. 유사성 측정 규준 sim(pi 1, pi 2)을 계산하는 한 가지 방법은 유클리드 거리 (Euclidean distance)의 음의 제곱근 (negative square)을 계산하는 것이다. 대안적 구체예에서, 유클리드 거리 이외의 측정 규준, 예를 들면, 맨하탄 거리 (Manhattan distance), 체비쉐프 거리 (Chebychev distance), 벡터 간에 각도, 상관 거리, 표준화된 유클리드 거리, 마할라노비스 거리 (Mahalanobis distance), 제곱된 피어슨 상관 계수 (squared Pearson correlation coefficient), 또는 민코우스키 거리 (Minkowski distance)가 sim(pi 1, pi 2)을 계산하는데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 피어슨 상관 계수, 유클리디안 제곱 거리, 유클리디안 제곱 합, 또는 제곱된 피어슨 상관 계수가 유사성을 결정하는데 이용된다. 이들 측정 규준은 예로써, SAS (Statistics Analysis Systems Institute, Cary, North Carolina) 또는 S-Plus (Statistical Sciences, Inc., Seattle, Washington)를 이용하여 계산될 수 있다. 이들 측정 규준의 이용은 Draghici, 2003, Data Analysis Tools for DNA Microarrays, Chapman & Hall, CRC Press London, chapter 11에서 기술되고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
상관은 또한, 행렬 (rank)에 기초하여 계산될 수 있는데, 여기서 x i 와 y i 는 오름차순 또는 내림차순으로, 측정된 양의 값의 행렬이다. 예로써, Conover, Practical Nonparametric Statistics, 2nd ed., Wiley, (1971)를 참조한다. 또한, 새년 상호 정보량 (Shannon mutual information)이 유사성 척도로서 이용될 수 있다. 예로써, Pierce, An Introduction To Information Theory: Symbols, Signals, and Noise, Dover, (1980)를 참조하고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
당분야에 공지된 다양한 식별자 (classifier)는 본 출원에서 기술된 방법에 따라서 훈련 (training)되고, 그리고 목적되는 화합물을 생리학적 특성, 예를 들면, 약리학적 특성에 대하여 분류 (classification)하는데 이용될 수 있다. 목적되는 화합물의 활성 프로필을 이용하여 목적되는 화합물의 생리학적 특성을 예측할 수 있는 식별자를 산출하는데 알고리즘이 이용될 수 있다. 전형적인 식별자는 앞서 기술된다. 일부 구체예에서, 식별자는 이전에 특성화된 화합물의 대표 활성 프로필에서 측정된 양 및 이전에 특성화된 화합물과 연관된 공지된 생리학적 특성을 이용하여 훈련될 수 있다.
식별자는 이전에 특성화된 화합물의 대표 활성 프로필에서 측정된 양 및 이전에 특성화된 화합물과 연관된 공지된 생리학적 특성을 평가하는 비-감독된 또는 감독된 학습 알고리즘을 적용함으로써 분류에 이용되는 알고리즘일 수 있다. 당분야에 공지된 임의의 표준 비-감독된 또는 감독된 학습 기술이 식별자를 산출하는데 이용될 수 있다. 하기는 당분야에 공지된 비-감독된 및 감독된 알고리즘의 무제한적 실례이다. 본 출원에서 개시를 고려하면, 당업자는 다른 패턴 분류 또는 회귀 기술 및 알고리즘이 식별자에 이용될 수 있고, 그리고 본 발명이 이와 같은 모든 기술을 포괄한다는 것을 인지할 것이다.
신경 네트워크. 신경 네트워크 (가령, 2-단계 회귀 또는 분류 결정 규칙)는 본 명세서에서 앞서 기술된다.
군집화 (clustering). 일부 구체예에서, 식별자는 군집화를 이용하여 학습된다. 일부 구체예에서, 대표 활성 프로필을 나타내는 벡터의 선택 성분 i가 활성 프로필을 군집시키는데 이용된다. 일부 구체예에서, 군집화에 앞서, 측정된 양은 0의 평균 값 및 단위 분산 (unit variance)을 갖도록 표준화된다.
훈련 개체군 전역에서 측정된 양의 유사한 패턴을 보이는 대표 활성 프로필은 함께 군집될 것이다. 성분 i의 측정된 양의 특정 조합은 이들 벡터가 생리학적 특성으로 군집할 때, 본 발명의 이러한 측면에서 우수한 식별자인 것으로 간주될 수 있다. 군집화는 Duda 1973의 페이지 211-256에서 기술된다. Duda 1973의 섹션 6.7에 기술된 바와 같이, 군집화 문제점은 데이터세트에서 자연 집단화 (natural grouping)를 발견하는 것으로 기술된다. 자연 집단화 (nature grouping)를 확인하기 위하여, 2가지 문제점이 다뤄진다. 먼저, 2개의 활성 프로필 사이에 유사성 (또는 부동성)을 측정하는 방법이 결정된다. 이러한 측정 규준 (유사성 척도)은 한 군집에서 활성 프로필이 다른 활성 프로필에 비하여 서로 더욱 유사하도록 담보하는데 이용된다. 둘째, 이러한 유사성 척도를 이용하여 데이터를 군집 내로 분배 (partition)하기 위한 메커니즘이 결정된다.
유사성 척도는 Duda 1973의 섹션 6.7에서 논의되고, 여기서 군집화 조사를 시작하는 한 가지 방법이 거리 함수를 규정하고 활성 프로필의 쌍 사이에 거리의 매트릭스 (matrix of distance)를 계산하는 것이라고 언급된다. 거리가 우수한 유사성 척도이면, 동일한 군집 내에 활성 프로필 간에 거리는 상이한 군집 내에 활성 프로필 간에 거리보다 훨씬 적을 것이다. 하지만, Duda 1973의 페이지 215에 언급된 바와 같이, 군집화는 거리 측정 규준의 이용을 필요로 하지 않는다. 가령, 비계측 유사성 함수 s(x, x′)가 2개의 벡터 x와 x′를 비교하는데 이용될 수 있다. 전통적으로, s(x, x′)는 x와 x′가 다소간 "유사"할 때 값이 큰 대칭 함수이다. 비계측 유사성 함수 s(x, x′)의 실례는 Duda 1973의 페이지 216에 제공된다.
군집화의 다른 양상은 상기에 더욱 기술된다.
주성분 분석 ("PCA"). 일부 구체예에서, 식별자는 주성분 분석을 이용하여 학습된다. PCA는 본 명세서에서 앞서 기술된다.
식별자를 학습하기 위하여 PCA를 이용하는 한 가지 접근법에서, 대표 활성 프로필을 나타내는 벡터는 상기 군집화에서 기술된 동일한 방식으로 고안될 수 있다. 실제로, 각 벡터가 대표 활성 프로필을 나타내는 일단의 벡터는 매트릭스 (matrix)로서 간주될 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 매트릭스는 단위체 (monomer)의 정성적 이원 설명 (qualitative binary description)의 Free-Wilson 방법으로 표현되고 (Kubinyi, 1990, 3D QSAR in drug design theory methods and applications, Pergamon Press, Oxford, pp 589-638, 이는 본 발명에 참조로서 편입됨), 그리고 첫 번째 주성분 (PC)이 가능한 최대량의 분산 정보를 포획하고, 두 번째 주성분 (PC)이 모든 분산 정보의 두 번째 최대량을 포획하고, 그리고 매트릭스 내에 모든 분산 정보가 고려될 때까지 그러하도록 PCA를 이용하여 최대로 압축된 공간 내에 분포된다.
이후, 훈련 개체군 (가령, 대표 활성 프로필)의 구성원을 나타내는 각각의 벡터는 플롯팅 (plotting)된다. 많은 상이한 유형의 플롯 (plot)이 가능하다. 일부 구체예에서, 1-차원 플롯 (one-dimensional plot)이 만들어진다. 이러한 1-차원 플롯에서, 훈련 개체군의 각 구성원으로부터 첫 번째 주성분에 대한 값이 플롯팅된다. 이러한 형태의 플롯에서, 생리학적 특성에 상응하는 활성 프로필은 첫 번째 주성분 값의 범위 내에 군집하고, 그리고 다른 생리학적 특성에 상응하는 프로필은 첫 번째 주성분 값의 두 번째 범위 내에 군집할 것으로 예상된다.
일부 구체예에서, 훈련 개체군의 구성원은 하나 이상의 주성분에 대하여 플롯팅된다. 가령, 일부 구체예에서, 훈련 개체군의 구성원은 2-차원 플롯 상에 플롯팅되는데, 여기서 첫 번째 차원은 첫 번째 주성분이고 두 번째 차원은 두 번째 주성분이다.
최근린 분석. 최근린 분석은 본 명세서에서 앞서 기술된다.
선형 판별식 분석. 일부 구체예에서, 식별자는 선형 판별식 분석을 이용하여 학습된다. 선형 판별식 분석 (LDA)은 일정한 객체 특성에 기초하여, 주체 (subject)를 2가지 범주 중에서 하나로 분류하는 것을 시도한다. 다시 말하면, LDA는 실험 동안 측정된 객체 속성이 이들 객체의 범주화 (categorization)를 예언하는 지를 조사한다. LDA는 전형적으로, 연속 독립 변수 (continuous independent variable) 및 2분 범주 종속 변수 (dichotomous categorical dependent variable)를 필요로 한다. 본 발명에서, 훈련 개체군의 부분집합 전역에서 벡터 성분 i의 선택 조합에 대한 존재비 값은 필수 연속 독립 변수로서 기능한다. 훈련 개체군의 구성원 각각의 형질 부분군 분류 (가령, 생리학적 특성)는 2분 범주 종속 변수로서 기능한다.
LDA는 집단화 정보를 이용함으로써 군간 분산 및 군내 분산의 비율을 극대화시키는 변수의 선형 조합을 찾는다. 암묵적으로, LDA에 의해 이용되는 선형 가중치 (linear weight)는 훈련 세트 전역에서 벡터 성분 i의 측정된 양이 생리학적 특성의 군 내에서 어떻게 분리하는 지에 좌우된다. 일부 구체예에서, LDA는 훈련 개체군 내에 구성원의 데이터 매트릭스에 적용된다. 이후, 훈련 개체군의 각 구성원의 선형 판별식이 플롯팅된다. 이상적으로, 생리학적 특성을 나타내는 훈련 개체군의 구성원은 선형 판별식 값 (가령, 음성)의 범위 내로 군집하고, 그리고 다른 생리학적 특성을 나타내는 훈련 개체군의 구성원은 선형 판별식 값 (가령, 양성)의 두 번째 범위 내로 군집할 것이다. LDA는 판별식 값의 군집 간에 분리가 더욱 클 때, 더욱 성공적인 것으로 간주된다. 선형 판별식 분석에 관한 더욱 많은 정보를 위하여, 예로써, Duda, Pattern Classification, Second Edition, 2001, John Wiley & Sons, Inc; Hastie, 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer, New York; 그리고 Venables & Ripley, 1997, Modern Applied Statistics with s-plus, Springer, New York를 참조하고, 이들 각각은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
2차 판별식 분석. 2차 판별식 분석은 본 명세서에서 앞서 기술된다.
서포트 벡터 머신. 서포트 벡터 머신은 본 명세서에서 앞서 기술된다.
결정 트리. 결정 트리는 본 명세서에서 앞서 기술된다.
다변량 적응 회귀 스플라인. 다변량 적응 회귀 스플라인은 본 명세서에서 앞서 기술된다.
중심 식별자 기술. 한 구체예에서, 최근 중심 (nearest centroid) 식별자 기술이 이용된다. 이런 기술은 상이한 생리학적 특성에 대하여, 훈련 개체군 (대표 활성 프로필) 내에 벡터 성분 i의 평균 측정된 양에 의해 제공된 중심을 계산하고, 이후 목적되는 화합물을 나타내는 벡터를 중심이 최근인 부류에 지정한다. 이러한 접근법은 군집이 공지된 부류에 의해 대체되는 점을 제외하고, k-평균 군집화와 유사하다. 이러한 접근법의 실례는 Prediction Analysis of Microarray, 또는 PAM이다. 예로써, Tibshirani et al., 2002, Proceedings of the National Academy of Science USA 99; 6567-6572를 참조하고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
회귀. 일부 구체예에서, 식별자는 회귀 식별자, 예를 들면, 로지스틱 회귀 식별자이다. 이런 회귀 식별자는 식별자를 고안하는데 이용된 각각의 활성 프로필에 대한 계수를 포함한다. 이런 구체예에서, 회귀 식별자에 대한 이들 계수는 예로써, 최대 우도 접근법 (maximum likelihood approach)을 이용하여 계산된다. 이런 계산에서, 벡터 성분 i의 측정된 양이 이용된다.
식별자를 학습하는 다른 방법은 상기에 더욱 기술된다.
본 발명은 컴퓨터-판독가능 저장 매체에 장착된 컴퓨터 프로그램 메커니즘을 포함하는 컴퓨터 프로그램 산물로서 수행될 수 있다. 게다가, 본 발명의 방법은 하나 이상의 컴퓨터 또는 다른 형태의 장치에서 수행될 수 있다. 장치의 실례에는 컴퓨터, 그리고 측정 장치 (가령, 분석 판독기 또는 스캐너)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 더 나아가, 본 발명의 방법은 하나 이상의 컴퓨터 프로그램 산물에서 수행될 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서는 본 명세서에 개시된 임의의 또는 모든 방법을 암호화하는 컴퓨터 프로그램 산물을 제시한다. 이런 방법은 CD-ROM, DVD, 자기 디스크 저장 산물, 또는 임의의 다른 컴퓨터-판독가능 데이터 또는 프로그램 저장 산물에서 저장될 수 있다. 이런 컴퓨터 판독가능 저장 매체는 실체적인 물체 (반송파에 대립됨)인 것으로 의도된다. 이런 방법은 또한, 영구 저장소, 예를 들면, ROM, 하나 이상의 프로그램가능 칩, 또는 하나 이상의 주문형 집적회로 (application specific integrated circuit, ASIC)에 장착될 수 있다. 이런 영구 저장소는 서버, 802.11 액세스 포인트, 802.11 무선 브리지/스테이션, 중계기, 라우터, 휴대전화, 또는 기타 전자 장치 내에 위치될 수 있다. 컴퓨터 프로그램 산물에서 암호화된 이들 방법은 또한, 인터넷 또는 다른 경로를 통하여, 디지털로 또는 반송파 (명백하게, 반송파의 이런 이용은 저장이 아닌 배포를 위한 것이다)에서 컴퓨터 데이터 신호 (여기에 소프트웨어 모듈이 장착된다)의 전송에 의해 전자적으로 배포될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서는 도 3에 도시된 프로그램 모듈 중에서 한 가지 또는 모두를 포함하는 컴퓨터 프로그램 산물을 제시한다. 이들 프로그램 모듈은 CD-ROM, DVD, 자기 디스크 저장 산물, 또는 임의의 다른 컴퓨터-판독가능 데이터 또는 프로그램 저장 산물에서 저장될 수 있다. 이들 프로그램 모듈은 또한, 영구 저장소, 예를 들면, ROM, 하나 이상의 프로그램가능 칩, 또는 하나 이상의 주문형 집적회로 (application specific integrated circuit, ASIC)에 장착될 수 있다. 이런 영구 저장소는 서버, 802.11 액세스 포인트, 802.11 무선 브리지/스테이션, 중계기, 라우터, 휴대전화, 또는 기타 전자 장치 내에 위치될 수 있다. 컴퓨터 프로그램 산물에서 이들 소프트웨어 모듈은 또한, 인터넷 또는 다른 경로를 통하여, 디지털로 또는 반송파에서 컴퓨터 데이터 신호 (여기에 소프트웨어 모듈이 장착된다)의 전송에 의해 전자적으로 배포될 수 있다.
특정 구체예에서, 이러한 컴퓨터 프로그램은 청구된 방법의 결과를 사용자, 사용자 인터페이스 장치, 컴퓨터 판독가능 저장 매체, 모니터, 로컬 컴퓨터, 또는 네트워크의 일부인 컴퓨터에 출력한다. 이런 컴퓨터 판독가능 저장 매체는 실체적인 물체 (반송파에 대립됨)인 것으로 의도된다.
본 발명에서는 또한, 충분히 특성화되지 않은 단백질에 대한 세포주를 산출하는 방법을 제시한다. 이런 단백질의 경우에, 종종 공지된 화합물에 대한 그들의 기능적 반응의 성격에 관한 정보가 거의 없다. 클론의 활성을 평가하기 위한 확립된 기능적 벤치마크의 이와 같은 부족은 생리학적으로 적절한 세포주를 생산하는데 난제일 수 있다. 앞서 기술된 방법은 이런 정보가 부족한 충분히 특성화되지 않은 단백질에 대해서도 생리학적으로 적절한 세포주를 획득하는 방법을 제시한다. 생리학적으로 적절한 형태의 단백질을 포함하는 세포주는 단백질을 포함하는 유전자의 발현에 기인하는 다수의 또는 모든 기능적 형태를 대표하는 클론을 추구함으로써 획득될 수 있다.
본 발명의 세포와 세포주는 다양한 조절제에 대한 반응에 기초하여, 목적되는 단백질의 생체내 형태의 실체를 상기 단백질의 공지된 형태의 실체와 상관시킴으로써, 상이한 병리에서 목적되는 단백질의 상이한 형태의 역할을 확인하는데 이용될 수 있다. 이는 상기 단백질과 연관된 병리의 고도로 표적화된 치료를 위한 질병- 또는 조직-특이적 조절제의 선별을 가능하게 한다.
조절제를 확인하기 위하여, 본 발명의 세포 또는 세포주는 상기 단백질이 기능할 것으로 예상되는 조건 하에 검사 화합물에 노출되고, 이후 적절한 대조, 예를 들면, 검사 화합물에 노출되지 않은 세포와 비교하여 단백질 활성에서 통계학적으로 유의한 변화 (가령, p<0.05)가 검출된다. 공지된 작동약 또는 길항약 및/또는 목적되는 단백질을 발현하는 세포를 이용한 양성 및/또는 음성 대조 역시 이용될 수 있다. 당업자는 다양한 분석 파라미터, 예를 들면, 신호 대 잡음 비율이 최적화될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 하나 이상의 세포 또는 세포주는 복수의 검사 화합물, 예를 들면, 검사 화합물의 라이브러리에 노출된다. 검사 화합물의 이런 라이브러리는 하나 이상의 목적되는 단백질의 조절제를 확인하기 위하여 본 발명의 세포주를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 검사 화합물은 소형 분자, 폴리펩티드, 펩티드, 펩티드 모방체, 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 자연 화합물, 합성 화합물, 추출물, 지질, 세정제 등을 비롯한 화학적 모이어티일 수 있다. 항체의 경우에, 이들은 비-인간 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 항체는 항체 단편 (가령, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb 등), 단일 사슬 항체 (scFv), 단일 도메인 항체, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 전부 또는 항원-결합 부분을 비롯하여, 중쇄와 경쇄의 완전 보체 또는 임의의 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 완전한 항체일 수 있다.
일부 구체예에서, 검사 화합물에 노출에 앞서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 예로써, 포유동물 또는 다른 동물 효소, 식물 효소, 세균 효소, 단백질 수정 효소 및 지질 수정 효소를 비롯한 효소로 전처리 (pretreatment)에 의해 변형될 수 있다. 이런 효소에는 예로써, 키나아제, 프로테아제, 포스파타아제, 글리코시다아제, 산화환원효소, 트랜스퍼라아제, 하이드롤라아제, 리아제, 이성화효소, 리가아제 세균 프로테아제, 장으로부터 프로테아제, GI 관으로부터 프로테아제, 구강내 타액에서 프로테아제, 리졸 세포/세균으로부터 프로테아제 등이 포함될 수 있다. 대안으로, 이들 세포와 세포주는 먼저, 검사 화합물에 노출되고, 그 이후에 효소 처리가 수행되어 상기 처리에 의한 단백질의 변형을 변경하는 화합물이 확인될 수 있다.
일부 구체예에서, 광범위한 화합물 수집물이 예로써, 96-웰, 384-웰, 1536-웰 또는 더욱 높은 밀도 형식을 이용한 세포-기초된, 기능적, 고처리량 스크린 (HTS)에서 단백질 조정 활성에 대하여 조사된다. 일부 구체예에서, 검사 화합물, 또는 검사 화합물의 라이브러리를 비롯한 복수의 검사 화합물은 본 발명의 하나 이상의 세포 또는 세포주를 이용하여 스크리닝될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 목적되는 단백질의 조절제에 증가된 민감도를 갖는다. 본 발명의 세포와 세포주는 또한, 상기 단백질에 대하여 생리학적 범위 EC50 또는 IC50 값으로 조절제에 반응한다. 본 명세서에서, EC50은 세포 또는 세포주에서 반-극대 (half-maximal) 활성화 반응을 유도하는데 필요한 화합물 또는 물질의 농도를 지칭한다. 본 명세서에서, IC50은 세포 또는 세포주에서 반-극대 (half-maximal) 저해 반응을 유도하는데 필요한 화합물 또는 물질의 농도를 지칭한다. EC50 및 IC50 값은 당분야에 널리 공지된 기술, 예를 들면, 화합물 또는 물질의 농도를 단백질-발현 세포주의 반응에 상관시키는 용량-반응 곡선 (dose-response curve)을 이용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 세포와 세포주의 더욱 유익한 특성은 이들 세포와 세포주를 이용한 최초 스크리닝에서 확인된 조절제가 이차 기능 분석에서 기능적이라는 점이다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 최초 스크리닝 분석에서 확인된 화합물은 전형적으로, 그들의 유도체 또는 유사체가 이차 기능 분석에서 기능적이도록, 예로써 조합 화학, 의화학 또는 합성 화학에 의해 변형되어야 한다. 하지만, 본 발명의 세포와 세포주의 높은 생리학적 적절성으로 인하여, 이들 세포와 세포주를 이용하여 확인된 다수의 화합물이 추가 변형 없이도 기능적이다. 일부 구체예에서, 최초 분석에서 확인된 조절제 중에서 적어도 25%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상이 이차 분석에서 기능적이다. 게다가, 본 발명의 세포주는 "황금 표준 (gold standard)" 분석과 동등하게 기능 분석에서 작동한다. 가령, GABA A 수용체를 발현하는 본 발명의 세포주는 막 전위 분석 및 전기생리학에서 실질적으로 동일하게 작동한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명에 따라 산출된 분화된, 성숙 또는 특수화된 세포는 줄기 세포를 산출하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 본 발명의 방법에 의해 확인된 세포 (여기서, 세포 유형 또는 명세는 분화된, 성숙 또는 특수화된 세포이다)는 다분화성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 ("iPS") 세포, 배아 줄기 세포, 암 줄기 세포, 그리고 장기 또는 조직 특이적 줄기 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 줄기 세포로 역분화될 수 있다. 역분화 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (참조: Panagiotis A. Tsonis; Stem Cells from Differentiated Cells; Molecular Interventions 4:81-83, (2004). 본 발명의 세포 또는 본 발명의 방법에 의해 확인된 세포로부터 산출된 줄기 세포는 분화된, 성숙, 또는 특수화된 세포 유형 또는 명세의 하나 이상의 세포로 분화될 수 있다. 본 발명의 세포 또는 본 발명의 방법에 의해 확인된 세포로부터 산출된 배아 줄기 세포 및 iPS 세포는 완전한 비-인간 생명체, 예를 들면, 생쥐를 생산하는데 이용될 수 있다. 생쥐 배아 줄기 세포를 이용하여 생쥐를 생산하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (참조: Smith, "EMBRYO-DERIVED STEM CELLS: Of Mice and Men", Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2001, 17:435-62, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). iPS 세포를 이용하여 생쥐를 생산하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (참조: Kang et al., "iPS Cells Can Support Full-Term Development of Tetraploid Blastocyst-Complemented Embryos", Cell stem Cell, Jul 22, 2009 [Epub ahead of print], 그리고 Zhao et al., "iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation", Nature, July 23, 2009 [Epub ahead of print]).
일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 본 발명의 방법에 의해 확인된 세포 (여기서, 세포 유형 또는 명세는 분화된, 성숙 또는 특수화된 세포이다)는 다분화성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 ("iPS") 세포, 배아 줄기 세포, 암 줄기 세포, 그리고 장기 또는 조직 특이적 줄기 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 줄기 세포로 역분화될 수 있고, 그리고 이렇게 생산된 줄기 세포는 분화된, 성숙, 또는 특수화된 세포 유형 또는 명세의 하나 이상의 세포로 분화될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 본 발명의 방법에 의해 확인된 세포 (여기서 세포 유형 또는 명세는 분화된, 성숙 또는 특수화된 세포이다)는 배아 줄기 세포 또는 iPS 세포로 역분화될 수있고, 그리고 이렇게 생산된 줄기 세포는 완전한 생명체, 예를 들면, 생쥐를 생산하는데 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 본 발명의 방법에 의해 확인된 세포 (여기서, 세포 유형 또는 명세는 분화된, 성숙 또는 특수화된 세포이다)는 배아 줄기 세포 또는 iPS 세포로 역분화될 수 있고, 그리고 이렇게 생산된 줄기 세포는 완전한 생명체, 예를 들면, 생쥐를 생산하는데 이용될 수 있고, 여기서 동일한 세포 유형 또는 명세의 생명체에서 이들 세포는 본 발명의 세포가 선별되었던 특성과 동일한 특성, 예를 들면, 목적되는 단백질 또는 RNA의 발현을 포함한다.
일부 구체예에서, RNA 또는 단백질, 또는 상기 RNA 또는 단백질의 기능적 또는 생리학적 형태를 포함하는 특수화된 세포 또는 조직 유형의 세포는 생명체, 예를 들면, 생쥐를 생산하는데 이용될 수 있는 배아 줄기 세포 또는 iPS 세포를 생산하는데 이용될 수 있고, 여기서 동일한 유형의 생명체의 세포 또는 조직이 상기 RNA 또는 단백질, 또는 상기 RNA 또는 단백질의 기능적 또는 생리학적 형태를 포함한다. 일부 구체예에서, 이렇게 생산된 생명체는 동일한 종의 RNA 또는 단백질을 포함한다. 다른 구체예에서, 이렇게 생산된 생명체는 상이한 종의 RNA 또는 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, 생명체는 생쥐이고, 그리고 RNA 또는 단백질은 인간 기원이다. 일부 구체예에서, 이렇게 생산된 생명체는 본 발명의 시험관내 상관을 포함한다. 일부 구체예에서, 이렇게 생산된 생명체는 전임상 시험을 비롯한 시험에 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 검사 또는 전임상 검사는 인간에서 검사 화합물의 활성을 예측하는데 이용된다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 생체내 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 산출하는 방법을 제시한다. 생체내 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관은 생체내에서 하나 이상의 약리학적 특성에 대한 하나 이상의 화합물의 효과(들)에 상관하는, 본 발명의 세포 또는 세포주에서 발현된 (즉, 시험관내에서 발현된) 하나 이상의 단백질 또는 RNA에 대한 하나 이상의 화합물의 효과(들)를 포함한다. 이론에 한정됨 없이, 검사 화합물은 참고 화합물과 비교하여 시험관내에서 발현된 하나 이상의 단백질 또는 RNA에 대한 유사한 또는 실질적으로 동일한 효과(들)를 갖는 것으로 밝혀지면, 참고 화합물과 비교하여 하나 이상의 생체내 생리학적 특성에 대한 유사한 또는 실질적으로 동일한 효과(들)를 갖는 것으로 간주될 수 있다, 다시 말하면, 검사 화합물은 참고 화합물과 비교하여 유사한 또는 실질적으로 동일한 (가령, 적어도 90% 동일한) 시험관내 상관을 갖는 것으로 간주된다. 일부 구체예에서, 검사 화합물은 참고 화합물과 비교하여 유사한 또는 실질적으로 동일한 (가령, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80% 또는 90% 동일한) 시험관내 상관을 갖는 것으로 간주된다. 시험관내 상관은 화합물의 하나 이상의 활성 프로필을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명의 세포 또는 세포주에 의해 발현된 단백질 또는 복수의 단백질은 목적되는 생체내 단백질 또는 복수의 목적되는 생체내 단백질에 대한 시험관내 상관을 제공한다. 본 발명의 세포와 세포주는 하나 이상의 단백질을 발현하기 위한 정확하게 동일한 조건을 제공함에 있어서 생체내에서 이들 세포를 정확하게 재현하지 못할 수도 있다, 가령, 생체내에서 발현된 단백질과 비교하여 번역후 변형, 접힘, 조립, 아단위 조합, 수송 및/또는 본 발명의 세포 또는 세포주에서 발현된 단백질 사이에 막 통합에서 차이(들)가 존재할 수 있다. 이에 더하여, 시험관내에서 발현된 단백질의 기능을 조사하는데 이용되는 파라미터는 생체내에서 이들 파라미터를 정확하게 재현하지 못할 수도 있다, 가령, 시험관내에서 실시된 일정한 단백질 기능 분석은 비-생리학적인 것으로 간주되는 일정한 pH 또는 염 농도 하에 실시될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 세포 또는 세포주에 의해 발현된 단백질은 이들 비-생리학적 조건에서 생물학적으로 활성일 수 있고, 그리고 시험관내에서 분석될 때 적어도 하나의 기능적 또는 약리학적 또는 생리학적 프로필을 제공할 수 있다. 이런 기능적 또는 약리학적 또는 생리학적 프로필은 생체내 단백질에 상응할 수 있다. 가령, 생체내에서 단백질과 연관된 생리학적 특성을 조절하거나 변경하는 화합물은 시험관내에서 분석될 때 본 발명의 세포 또는 세포주에 의해 발현된 상응하는 단백질의 생물학적 활성을 변경할 수 있고, 따라서 본 발명의 세포 또는 세포주에 의해 발현된 단백질 및 생체내에서 발현된 단백질 사이에 상관을 확립하고, 여기서 본 발명의 세포 또는 세포주에 의해 발현된 단백질은 생체내에서 발현된 단백질의 "시험관내 상관"으로서 간주된다. 가령, 각각 동일한 일단의 Nav 아단위 (α, β1과 β2)를 발현하는 상이한 세포주가 동일한 일단의 화합물에 다르게 반응할 수 있는 것으로 밝혀졌다 (하기 실시예 23 참조). 이들 별개의 기능적 프로필은 이들 세포주에서 상이한 아단위 조합을 지시하고, 그리고 각각의 상이한 아단위 조합은 생체내에서 상응하는 아단위 조합의 시험관내 상관으로서 간주될 수 있다. 이에 더하여, 쓴맛 수용체를 발현하는 세포주 패널에 대한 화합물 활성의 프로필이 획득되었다. 상기 패널에 대한 화합물 활성의 어떤 패턴이 생체내에서 원하는 맛 또는 맛없음과 상관하는 지를 확인하기 위하여, 화합물 활성 프로필을 비교하는 감각 인간 미각 검사가 이용되었다.
화합물에 대한 반응과 별개로, 본 발명의 시험관내 상관은 또한, 본 발명의 세포에 발현된 단백질에 다른 처리 및/또는 조건을 적용함으로써 산출되고 및/또는 범주화될 수 있다. 가령, 단백질분해에 의해 ENaC의 시험관내 상관이 산출되고 (가령, ENac의 상이한 단백질분해된 형태의 산출), 그리고 상이한 배지 조건을 적용함으로써 단맛/감칠맛 수용체의 시험관내 상관이 산출되었다.
시험관내 상관은 단백질 또는 복수의 단백질을 포함할 수 있다. 이런 시험관내 상관은 생체내에서 상응하는 단백질(들)의 기능 또는 활성을 예언할 수 있다. 이런 시험관내 상관은 본 발명의 세포 또는 세포주에 의해 발현된 단백질의 하나 이상의 생물학적 활성 (즉, 시험관내 상관)의 조절제를 확인하는 고처리량 스크리닝에 이용될 수 있고, 그리고 시험관내 상관의 조절제로서 확인된 화합물 중에서 일부 또는 전부는 생체내에서 발현된 단백질 역시 조정할 수 있다 (가령, 생체내에서 치료 효과를 갖는다). 다양한 구체예에서, 고처리량 스크리닝에서 확인된 전체 화합물 중에서 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%가 치료 효과를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 시험관내 상관은 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아단위를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 시험관내 상관은 이종다합체일 수 있다. 일부 구체예에서, 시험관내 상관은 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 안정적으로 발현된다. 일부 구체예에서, 시험관내 상관은 세포독성을 유발하지 않으면서 세포주에서 발현된다. 일부 구체예에서, 시험관내 상관은 단백질 또는 복수의 단백질을 내생적으로 발현하지 않는 세포에서 발현된다.
일부 구체예에서, 본 발명에 따른 시험관내 상관을 발현하는 세포 또는 세포주는 예로써, 이들 세포 또는 세포주를 검사 화합물과 접촉시키고, 그리고 검사 화합물에 의해 접촉되지 않은 세포 내에서 시험관내 상관의 단백질 또는 복수의 단백질의 활성과 비교하여, 검사 화합물과 접촉된 세포 또는 세포주 내에서 시험관내 상관의 단백질 또는 복수의 단백질의 활성에서 변화를 검출함으로써 목적되는 생체내 단백질의 조절제를 확인하는데 이용될 수 있고, 여기서 부재에서와 비교하여 존재에서 활성의 차이를 발생시키는 화합물은 목적되는 생체내 단백질의 조절제이다
일정한 측면에서, 본 발명에서는 본 명세서에서 기술된 방법에 이용될 수 있는 키트를 제시한다. 한 구체예에서, 키트는 본 명세서에서 기술된 방법에 이용되는 하나 이상의 시약을 포함하는 하나 이상의 그릇을 포함한다.
일정한 측면에서, 본 명세서에서 기술된 방법에 이용될 수 있는 키트가 본 발명에서 제시된다. 특히, 하나 이상의 복수 표적을 안정적으로 발현하는 하나 이상의 세포 또는 세포주를 포함하는 키트가 본 발명에서 제시된다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 키트는 본 명세서에서 기술된 하나 이상의 신호전달 프로브를 포함한다. 특정한 구체예에서, 키트는 하나 이상의 복수 표적을 인코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 키트는 하나 이상의 복수 표적을 안정적으로 발현하는 세포를 스크리닝하고 선별하는 기능적 세포-기초된 분석 (가령, 칼슘 유동 분석, 막 전위 분석)에 이용되는 하나 이상의 염료를 포함한다. 일정한 측면에서, 본 명세서에서 기술된 하나 이상의 시약 및/또는 세포, 예를 들면, 본 명세서에서 기술된 하나 이상의 세포, 벡터, 및/또는 신호전달 프로브로 채워진 하나 이상의 그릇을 포함하는 키트가 본 발명에서 제시된다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 키트는 대조 시약 (가령, 대조 신호전달 프로브, 염료, 세포, 및/또는 벡터)을 더욱 포함하고, 여기서 대조 시약은 양성 대조 또는 음성 대조 시약일 수 있다. 선택적으로, 이런 그릇(들)에는 키트 내에 성분을 이용하기 위한 사용설명서를 포함하는 전단지가 동봉될 수 있다.
단맛 수용체 및 감칠맛 수용체
본 발명은 단맛 수용체의 T1R2 및 T1R3 아단위, 그리고 선택적으로 G 단백질을 안정적으로 발현하도록 조작된 신규한 세포와 세포주에 관계한다. 본 발명은 또한, 감칠맛 수용체의 T1R1 및 T1R3 아단위, 그리고 선택적으로 G 단백질을 안정적으로 발현하도록 조작된 신규한 세포와 세포주에 관계한다. 일부 구체예에서, 이들 세포와 세포주에서 생산된 미각 수용체 (가령, 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체)는 기능적이고 생리학적으로 적절하다. 다른 측면에서, 본 발명에서는 이들 세포와 세포주를 만들고 이용하는 방법을 제시한다. 미각 수용체, 예를 들면, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체를 포함하는 본 발명의 세포와 세포주는 미각 수용체, 예를 들면, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체의 조절제를 확인하는데 이용될 수 있다. 이들 조절제는 예로써, 식품과 약제의 미각 변경, 그리고 미각 수용체, 예를 들면, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체가 관련되는 질환, 예를 들면, 비만과 당뇨병의 치료에 유용하다.
본 발명의 일부 구체예에 따라서, 이들 신규한 세포와 세포주는 단맛 수용체 T1R2 아단위를 인코딩하는 핵산 및/또는 단맛 수용체 T1R3 아단위를 인코딩하는 핵산으로 단일 또는 이중 형질감염된다. 일부 특정한 구체예에서, 이들 신규한 세포와 세포주는 감칠맛 수용체 T1R1 아단위를 인코딩하는 핵산 및/또는 감칠맛 수용체 T1R3 아단위를 인코딩하는 핵산으로 단일 또는 이중 형질감염된다. 나머지 아단위는 세포 내에서 내생적 핵산으로부터 발현될 수 있다. 이들 2개의 핵산은 존재하면, 동일한 또는 별개의 벡터 내에 존재할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 신규한 세포와 세포주는 단맛 수용체 T1R2 아단위, 단맛 수용체 T1R3 아단위 및 G 단백질을 인코딩하는 핵산으로 단일, 이중 또는 삼중 형질감염된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 신규한 세포와 세포주는 감칠맛 수용체 T1R1 아단위, 감칠맛 수용체 T1R3 아단위 및 G 단백질을 인코딩하는 핵산으로 단일, 이중 또는 삼중 형질감염된다. 상기한 바와 같이, 이들 핵산은 동일한 또는 별개의 벡터 내에 존재할 수 있다. 가령, 3개의 벡터가 이용될 수 있다; 1개의 벡터가 이용될 수 있다; 또는 2개의 벡터가 이용될 수 있다. 나머지 아단위, 그리고 선택적 G 단백질은 세포 내에서 내생적 핵산으로부터 발현될 수 있다. 다른 구체예에서, 이들 신규한 세포와 세포주는 유전자 활성화에 의한 발현을 위하여 활성화된 적어도 하나의 미각 수용체 아단위, 예를 들면, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위를 보유한다. 나머지 미각 수용체 아단위, 예를 들면, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위, 및/또는 선택적으로 G 단백질은 필요한 경우에, 이들 단백질을 인코딩하는 도입된 핵산 서열로부터 발현되거나, 또는 내생적으로 활성 핵산으로부터 이미 발현될 수 있다. 본 발명의 신규한 세포주는 도입된 및/또는 유전자 활성화된 미각 수용체 아단위, 예를 들면, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위, 그리고 선택적으로 G 단백질을 안정적으로 발현한다.
앞서 기술된 바와 같이, 본 발명의 일정한 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 미각 수용체, 예를 들면, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체의 2개의 아단위를 생산하는 것에 더하여, G 단백질을 생산하도록 조작된다. 이들 세포와 세포주는 활성화된 미각 수용체, 예를 들면, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체로부터 하류 신호전달을 유인하는데 필요한 G 단백질이 조작되기 전 상태에서 생산되지 않기 때문에, 또는 G 단백질이 미각 수용체 유도된 신호전달, 예를 들면, 감칠맛 수용체 유도된 신호전달 또는 단맛 수용체 유도된 신호전달을 위한 충분한 양으로 생산되지 않기 때문에, G 단백질을 생산하도록 조작된다.
첫 번째 측면에서, 본 발명에서는 미각 수용체, 예를 들면, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체를 발현하는 세포와 세포주를 제시하고, 이들 세포와 세포주는 전통적인 방법에 의해 만들어진 세포와 세포주에 비하여 증진된 특성을 갖는다. 가령, 본 발명의 미각 수용체 세포와 세포주, 예를 들면, 감칠맛 수용체 세포와 세포주 또는 단맛 수용체 세포와 세포주는 발현 및/또는 발현 수준의 증진된 안정성을 갖는다 (예로써, 항생제 및 기타 약물을 비롯한 선별 압력 없이 배양 동안 유지될 때에도). 다른 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 다양한 분석에서 높은 Z' 값을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 더욱 전통적으로 조작된 세포에 비하여, 생리학적으로 적절한 미각 수용체 활성, 예를 들면, 감칠맛 수용체 활성 또는 단맛 수용체 활성의 발현의 맥락에서 향상된다. 이들 특성은 미각 수용체, 예를 들면, 감칠맛 수용체 및/또는 단맛 수용체의 조절제를 확인하는 분석에 이용되는 본 발명의 세포와 세포주의 능력을 증진하고 개선하며, 그리고 확인된 조절제의 기능적 속성을 개선한다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200일 또는 그 이상 동안 일관된 발현 수준으로 감칠맛 수용체 T1R1 및 T1R3 아단위, 또는 단맛 수용체 T1R2 및 T1R3 아단위를 발현하고, 여기서 일관된 발현은 2 내지 4일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 이상; 5 내지 15일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10% 또는 12% 이상; 16 내지 20일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% 또는 20% 이상; 21 내지 30일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22% 또는 24% 이상; 30 내지 40일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 41 내지 45일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 45 내지 50일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 45 내지 50일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28%, 30% 또는 35% 이상; 50 내지 55일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 50 내지 55일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28%, 30% 또는 35% 이상; 55 내지 75일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이상; 75 내지 100일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 101 내지 125일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 126 내지 150일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 151 내지 175일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 176 내지 200일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 200일 이상의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상 변하지 않는 발현 수준을 지칭한다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 세포 또는 세포주에 의해 발현된 미각 수용체, 예를 들면, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체는 쥐, 생쥐, 토끼, 염소, 개, 소, 돼지 또는 영장류를 비롯한 임의의 포유동물로부터 유래될 수 있다. 발현된 단맛 수용체를 함께 형성하는 T1R2 및 T1R3 아단위는 동일한 또는 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 가령, 임의의 종으로부터 단맛 수용체 T1R2 아단위는 본 발명의 세포 또는 세포주에서, 동일한 종 또는 임의의 다른 종으로부터 단맛 수용체 T1R3 아단위와 공동-발현될 수 있다. 또한, 발현된 감칠맛 수용체를 함께 형성하는 T1R1 및 T1R3 아단위는 동일한 또는 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 가령, 임의의 종으로부터 감칠맛 수용체 T1R1 아단위는 본 발명의 세포 또는 세포주에서, 동일한 종 또는 임의의 다른 종으로부터 감칠맛 수용체 T1R3 아단위와 공동-발현될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 세포와 세포주에서 G 단백질 역시 발현되는 구체예에서, G 단백질은 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 이들 G 단백질에는 표 7에 열거된 것들이 포함된다. 키메라 G 단백질 (Gα15- Gα16; GNA15-GNA16) 역시 본 발명의 세포와 세포주에서 발현될 수 있다. 임의의 종으로부터 G 단백질은 임의의 종으로부터 단맛 수용체 T1R2 아단위, 그리고 임의의 종으로부터 단맛 수용체 T1R3 아단위와 공동-발현되거나, 또는 이들 3가지의 임의의 조합이 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 단맛 수용체는 인간 단맛 수용체이고, 바람직하게는 인간 T1R2 및 T1R3 아단위로 특징된다. 다른 특정한 구체예에서, 감칠맛 수용체는 인간 감칠맛 수용체이고, 바람직하게는 인간 T1R1 및 T1R3 아단위로 특징된다. 본 발명의 한 측면에서는 각각 동일한 미각 수용체, 예를 들면, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체, 또는 상이한 미각 수용체, 예를 들면, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체를 발현하는 클론 세포와 세포주의 수집물을 제시한다. 이러한 수집물은 예로써, 상이한 아단위의 조합, 또는 이들 아단위의 전장 또는 단편을 발현하는 세포 또는 세포주를 포함할 수 있다.
미각 수용체 아단위, 예를 들면, 감칠맛 수용체 아단위 T1R1 및 T1R2 또는 단맛 수용체 아단위 T1R2 및 T1R3을 인코딩하는 핵산, 그리고 선택적 G 단백질을 인코딩하는 핵산은 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 일부 구체예에서, 미각 수용체 (가령, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체) 아단위-인코딩 핵산 서열, 그리고 선택적으로, G 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 태그를 더욱 포함한다. 이런 태그는 예로써, HIS 태그, myc 태그, 적혈구응집소 (HA) 태그, 단백질 C, VSV-G, FLU, 황색 형광 단백질 (YFP), 녹색 형광 단백질, FLAG, BCCP, 말토오스 결합 단백질 태그, Nus-태그, Softag-1, Softag-2, Strep-태그, S-태그, 티오레독신, GST, V5, TAP 또는 CBP를 인코딩할 수 있다. 태그는 미각 수용체 (가령, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체) 아단위 및 G 단백질 발현 수준, 세포내 국부화, 단백질-단백질 상호작용, 미각 수용체 (가령, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체) 조절, 또는 미각 수용체 (가령, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체) 기능을 결정하는 마커로서 이용될 수 있다. 태그는 또한, 미각 수용체 (가령, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체) 또는 G 단백질을 정제하거나 분별하는데 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 인간 단맛 수용체 T1R2 아단위를 인코딩하는 핵산 (서열 번호 31)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 인간 감칠맛 수용체 T1R1 아단위를 인코딩하는 핵산 (서열 번호 41)을 포함할 수 있다. 본 발명의 세포 또는 세포주는 또한, 인간 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체 T1R3 아단위를 인코딩하는 핵산 (서열 번호 32)을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 T1R3 및 T1R1 또는 T1R2를 인코딩하는 양쪽 핵산을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 T1R1 및 T1R3 아단위 또는 T1R2 및 T1R3 아단위를 인코딩하는 핵산 이외에, 핵산 서열 (서열 번호 33)을 포함할 수 있다. 서열 번호 33은 생쥐 Gα15 단백질을 인코딩한다. 다른 구체예에서, G 단백질은 인간 Gα15이다 (서열 번호 37 참조).
일부 구체예에서, 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) 및 선택적 G 단백질을 인코딩하는 핵산은 야생형 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) 또는 G 단백질을 인코딩하는 핵산 서열과 비교하여, 하나 이상의 치환, 삽입, 돌연변이 또는 결실을 포함한다. 돌연변이를 포함하는 핵산을 포함하는 구체예에서, 상기 돌연변이는 무작위 돌연변이 또는 특정 부위 돌연변이일 수 있다. 이들 핵산 변화는 아미노산 치환을 유발하거나 유발하지 않을 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산은 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) 또는 G 단백질을 인코딩하는 핵산의 단편이다. 단편이거나 이런 변형을 보유하는 핵산은 각각, 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) 또는 G 단백질의 적어도 한 가지의 생물학적 특성, 예를 들면, 다른 아단위와 함께 G 단백질을 활성화시키는 능력, 또는 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체)에 의해 활성화되는 능력을 유지하는 폴리펩티드를 인코딩한다.
본 발명은 또한, 아단위-인코딩 핵산을 안정적으로 발현하는 세포와 세포주를 포함하고, 상기 핵산의 서열은 서열 번호 31, 서열 번호 41, 서열 번호 32, 인간 이외의 종으로부터 유래된 대응물 핵산, 또는 이들 핵산 중에서 한 가지와 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산의 군에서 선택되는 아단위 서열에 적어도 대략 85% 동일하다.
일부 구체예에서, 아단위-인코딩 서열 동일성은 이들 아단위 서열과 비교하여 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이다. 본 발명은 또한, 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위)를 인코딩하는 핵산이 서열 번호 31, 서열 번호 41, 서열 번호 32, 인간 이외의 종으로부터 유래된 대응물 핵산, 또는 이들 핵산 중에서 한 가지와 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산의 군에서 선택되는 아단위 서열에 엄격한 조건 하에 혼성화되는 세포와 세포주를 포함한다.
일부 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 서열 번호 31, 서열 번호 41, 서열 번호 32, 인간 이외의 종으로부터 유래된 대응물 핵산, 또는 이들 핵산 중에서 한 가지와 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산과 비교하여, 적어도 하나의 치환을 포함하는 미각 수용체 아단위-인코딩 핵산 서열 (가령, 감칠맛 수용체 아단위-인코딩 핵산 서열 또는 단맛 수용체 아단위-인코딩 핵산 서열)을 포함한다. 이러한 치환은 10, 20, 30, 또는 40개 이하의 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 서열의 최대 1%, 5%, 10% 또는 20%를 구성할 수 있다. 일부 구체예에서, 치환된 서열은 서열 번호 31, 서열 번호 41, 서열 번호 32, 인간 이외의 종으로부터 유래된 대응물 핵산, 또는 이들 핵산 중에서 한 가지와 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산과 실질적으로 동일하거나 (가령, 그것에 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열), 또는 엄격한 조건 하에, 서열 번호 31, 서열 번호 41, 서열 번호 32, 인간 이외의 종으로부터 유래된 대응물 핵산, 또는 이들 핵산 중에서 한 가지와 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 혼성화될 수 있는 서열일 수 있다.
일부 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 서열 번호 31, 서열 번호 41, 서열 번호 32, 인간 이외의 종으로부터 유래된 대응물 핵산, 또는 이들 핵산 중에서 한 가지와 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 내로 삽입 또는 상기 핵산으로부터 결실을 포함하는 미각 수용체 아단위-인코딩 핵산 서열 (가령, 감칠맛 수용체 아단위-인코딩 핵산 서열 또는 단맛 수용체 아단위-인코딩 핵산 서열)을 포함한다. 이러한 삽입 또는 결실은 10, 20, 30, 또는 40개 이하의 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 서열의 최대 1%, 5%, 10% 또는 20%를 구성할 수 있다. 일부 구체예에서, 삽입 또는 결실된 서열은 서열 번호 31, 서열 번호 41, 서열 번호 32, 인간 이외의 종으로부터 유래된 대응물 핵산, 또는 이들 핵산 중에서 한 가지와 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산과 실질적으로 동일하거나 (가령, 그것에 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열), 또는 엄격한 조건 하에, 서열 번호 31, 서열 번호 41, 서열 번호 32, 인간 이외의 종으로부터 유래된 대응물 핵산, 또는 이들 핵산 중에서 한 가지와 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 혼성화될 수 있는 서열일 수 있다.
앞서 기술된 바와 같이, 일정한 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 G 단백질, 예를 들면, 생쥐 Gα15 단백질 (서열 번호 36) 또는 인간 Gα15 단백질 (서열 번호 37)을 선택적으로 발현한다. 단맛 수용체의 T1R2 및 T1R3 아단위 또는 감칠맛 수용체의 T1R1 및 T1R3 아단위를 인코딩하는 핵산 서열에서처럼, G 단백질 (및 G 단백질의 아미노 서열)을 인코딩하는 핵산 서열은 단맛 수용체 아단위에 대하여 앞서 기술된 바와 같이 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 이러한 핵산 치환 또는 변형은 아미노산 변화, 예를 들면, 아미노산 치환을 유발한다. 가령, 서열 번호 34 (인간 T1R2), 서열 번호 35 (인간 T1R3), 서열 번호 42 (감칠맛 인간 T1R1 동종형 1 aa), 서열 번호 43 (감칠맛 인간 T1R1 동종형 2 aa), 서열 번호 44 (감칠맛 인간 T1R1 동종형 3 aa), 서열 번호 45 (감칠맛 인간 T1R1 동종형 4 aa), 또는 인간 이외의 종으로부터 유래된 대응물 아미노산의 아미노산 잔기, 또는 서열 번호 36 (생쥐 Gα15) 및 37 (인간 Gα15) 또는 임의의 종으로부터 G 단백질의 아미노산 잔기는 보존성 또는 비-보존성 치환에 의해 대체될 수 있다. 일부 구체예에서, 최초 및 변형된 아미노산 서열 사이에 서열 동일성은 상기 폴리펩티드 서열 또는 그것에 실질적으로 동일한 서열 (가령, 그것에 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열)로부터 대략 1%, 5%, 10% 또는 20% 다를 수 있다.
"보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 부모 아미노산 잔기에 유사한 화학적 특성 (가령, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 R 기를 보유하는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존성 치환에 의해 서로 달라지는 경우에, 서열 동일성 비율 또는 유사성 정도는 이러한 치환의 보존성을 보완하기 위하여 상향 조정될 수 있다. 이러한 조정을 달성하는 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있다 (참조: Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994)).
유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 보유하는 아미노산 그룹의 실례에는 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 그리고 이소류신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린과 트레오닌; 3) 아미드-포함 측쇄: 아스파라긴과 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 그리고 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 그리고 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파라긴산과 글루타민산; 그리고 7) 황-포함 측쇄: 시스테인과 메티오닌이 포함된다. 선호되는 보존성 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트, 그리고 아스파라긴-글루타민이다. 대안으로, 보존성 아미노산 치환은 Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992)에서 기술된 PAM250 대수-우도 행렬 (log-likelihood matrix)에서 양성 값을 갖는 임의의 변화이다. "중간 정도로 보존성" 치환은 PAM250 대수-우도 행렬에서 비-음성 값을 갖는 임의의 변화이다.
아단위 T1R2 및 T1R3에서 보존성 변형은 변형되지 않은 단맛 수용체의 것들과 유사한 (즉, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일한) 기능적 및 화학적 특징을 갖는 단맛 수용체를 생산할 것이다. 아단위 T1R1 및 T1R3에서 보존성 변형은 변형되지 않은 감칠맛 수용체의 것들과 유사한 (즉, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일한) 기능적 및 화학적 특징을 갖는 감칠맛 수용체를 생산할 것이다. 이는 G 단백질에서 보존성 변형에 동일하게 적용된다.
본 발명의 세포 또는 세포주를 생산하는데 이용되는 호스트 세포는 그들의 고유 상태에서, 하나 이상의 내생적 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위)를 발현하거나, 또는 임의의 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위)의 발현이 결핍한다. 이는 G 단백질에도 동일하게 적용된다. 호스트 세포는 일차 세포, 생식 세포, 또는 배아 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포일 수 있다. 호스트 세포는 또한, 영속화 세포일 수 있다. 일차 또는 영속화 호스트 세포는 진핵 생명체의 중배엽, 외배엽 또는 내배엽 층으로부터 유래될 수 있다. 호스트 세포는 내피, 외피, 중간엽, 신경, 신장, 간, 조혈, 또는 면역 세포일 수 있다. 가령, 호스트 세포는 혈액/면역 세포, 예를 들면, B 세포, T 세포 (세포독성 T 세포, 자연 킬러 T 세포, 조절 T 세포, T 보조 세포, gd T 세포, 자연 킬러 세포); 과립구 (호염기성 과립구, 호산구성 과립구, 호중구성 과립구/과다분획 호중구성), 단핵구/대식세포, 적혈구 세포 (망상적혈구), 비만 세포, 혈소판/거대핵세포, 수상돌기 세포; 내분비 세포, 예를 들면, 갑상선 (갑상선 상피 세포, 소포곁세포), 부갑상선 (부갑상선 주세포, 호산성 세포), 부신 (크롬친화세포); 신경계 세포, 예를 들면, 아교 세포 (성상세포, 소교세포), 거대세포 신경분비 세포, 성상 세포, 핵 사슬 세포, 뵈트허 세포, 뇌하수체, (생식선자극세포, 코르티코트로프성세포, 갑상선자극세포, 성장자극세포, 프로락틴분비세포), 호흡기 계통 세포, 예를 들면, 허파꽈리세포 (I형 허파꽈리세포, II형 허파꽈리세포), 클라라 세포, 배상 세포; 순환기 계통 세포 (심장근육세포, 혈관주위세포); 소화기 계통 세포 (위 (위 주세포, 벽세포), 배상 세포, 호산성과립세포, G 세포, D 세포, ECL 세포, I 세포, K 세포, 장내분비 세포, 창자크롬친화 세포, APUD 세포, 간 (간세포, 쿠퍼 세포), 췌장 (베타 세포, 알파 세포), 담낭); 연골/골/근육/피부 계통 세포, 예를 들면, 조골세포, 골세포, 파골세포, 치아 세포 (시멘트질모세포, 에나멜모세포); 연골 세포, 예를 들면, 연골모세포, 연골세포, 피부/유모 세포, 예를 들면, 모낭모세포, 켈틴 생성 세포; 멜라닌세포 근육 세포, 예를 들면, 근육세포, 지방세포, 섬유아세포; 비뇨기 계통 세포, 예를 들면, 발세포, 사구체곁세포, 사구체내 혈관사이세포/사구체밖 혈관사이세포, 신장 근위 요세관 솔 변연 세포, 치밀 반점 세포; 생식기 계통 세포, 예를 들면, 정자, 버팀 세포, 라이디히 세포, 난세포, 난소 여포 세포; 감각 세포, 예를 들면, 코르티 기관 세포, 후각 상피세포, 온도 민감성 감각 뉴런, 메르켈 세포, 후각 수용체 뉴런, 통증 민감성 뉴런, 광수용체 세포, 미뢰 세포, 전정 기관의 유모 세포, 경동맥 소체 세포일 수 있다. 호스트 세포는 진핵, 원핵, 포유동물, 조류, 닭, 파충류, 양서류, 개구리, 도마뱀, 뱀, 어류, 벌레, 오징어, 바닷가재, 성게, 시 슬러그, 멍게, 파리, 히드라, 절지동물, 딱정벌레, 닭, 칠성장어, 송사리, 제브라 핀치, 복어, 그리고 제브라피쉬일 수 있다. 포유동물 실례에는 인간, 비-인간 영장류, 소, 돼지, 고양이, 쥐, 유대류, 뮤린, 개, 양, 염소, 토끼, 기니 피그 및 햄스터가 포함된다. 호스트 세포는 또한, 비-포유동물, 예를 들면, 효모, 곤충, 진균류, 식물, 하등 진핵생물 및 원핵생물일 수 있다. 이런 호스트 세포는 표적과 상호작용하는 세포에 의해 제공되는 발현 산물의 부재에 대한 더욱 높은 가능성과 함께, 미각 수용체 조절제, 예를 들면, 감칠맛 수용체 조절제 또는 단맛 수용체 조절제를 조사하기 위한 더욱 분기성인 배경을 제공할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 호스트 세포는 포유동물 세포이다.
본 발명의 세포 또는 세포주를 생산하는데 이용될 수 있는 호스트 세포의 실례에는 인간 배아 신장-293T 세포, 확립된 뉴런 세포주, 크롬친화세포종, 신경아세포종 섬유아세포, 횡문근육종, 척수신경절 세포, NS0 세포, CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), L-세포, HEK-293 (ATCC CRL1573)과 PC12 (ATCC CRL-1721), HEK293T (ATCC CRL-11268), RBL (ATCC CRL-1378), SH-SY5Y (ATCC CRL-2266), MDCK (ATCC CCL-34), SJ-RH30 (ATCC CRL-2061), HepG2 (ATCC HB-8065), ND7/23 (ECACC 92090903), CHO (ECACC 85050302), Vero (ATCC CCL 81), Caco-2 (ATCC HTB 37), K562 (ATCC CCL 243), Jurkat (ATCC TIB-152), Per.C6 (Crucell, Leiden, The Netherlands), Huvec (ATCC 인간 일차 PCS 100-010, 생쥐 CRL 2514, CRL 2515, CRL 2516), HuH-7D12 (ECACC 01042712), 293 (ATCC CRL 10852), A549 (ATCC CCL 185), IMR-90 (ATCC CCL 186), MCF-7 (ATC HTB-22), U-2 OS (ATCC HTB-96), T84 (ATCC CCL 248), 또는 임의의 확립된 세포주 (극성 또는 비극성) 또는 American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Blvd. Manassas, Va. 20110-2209 USA) 또는 European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury Wiltshire SP4 0JG England)와 같은 기탁기관으로부터 입수가능한 임의의 세포주가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
한 구체예에서, 호스트 세포는 미각 수용체, 예를 들면, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체를 생산하는 유전자도입 동물의 산출을 위한 기초로서 이용되는 배아 줄기 세포이다. 적어도 하나의 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위), 또는 양쪽 미각 수용체 아단위 (가령, 양쪽 감칠맛 수용체 아단위 또는 양쪽 단맛 수용체 아단위), 그리고 바람직하게는, 기능적 미각 수용체 (가령, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체)를 안정적으로 발현하는 배아 줄기 세포가 생명체 내로 직접적으로 이식되거나, 또는 그들의 핵이 다른 수용자 세포 내로 이동되고 이들 세포가 이후, 이식되거나, 또는 이들이 유전자도입 동물을 산출하는데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 하나 이상의 아단위는 원하는 시간적 및/또는 조직 특이적 발현으로, 동물 내에서 발현될 수 있다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 선택된 호스트 세포와 함께 이용하기 적합한 임의의 벡터는 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) 또는 G 단백질을 인코딩하는 핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 다양한 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) 또는 G 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 동일한 유형 또는 상이한 유형일 수 있다. 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) 또는 G 단백질 인코딩 핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있는 벡터의 실례에는 플라스미드, 레트로바이러스와 렌티바이러스를 비롯한 바이러스, 코스미드, 인공 염색체가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 그리고 예로써, pFN11A (BIND) Flexi®, pGL4.31, pFC14A (HaloTag® 7) CMV Flexi®, pFC14K (HaloTag® 7) CMV Flexi®, pFN24A (HaloTag® 7) CMVd3 Flexi®, pFN24K (HaloTag® 7) CMVd3 Flexi®, HaloTag™ pHT2, pACT, pAdVAntage™, pALTER®-MAX, pBIND, pCAT®3-Basic, pCAT®3-Control, pCAT®3-Enhancer, pCAT®3-Promoter, pCI, pCMVTNT™, pG5luc, pSI, pTARGET™, pTNT™, pF12A RM Flexi®, pF12K RM Flexi®, pReg neo, pYES2/GS, pAd/CMV/V5-DEST Gateway® 벡터, pAd/PL-DEST™ Gateway® 벡터, Gateway® pDEST™27 벡터, Gateway® pEF-DEST51 벡터, Gateway® pcDNA™-DEST47 벡터, pCMV/Bsd 벡터, pEF6/His A, B, & c, pcDNA™6.2-DEST, pLenti6/TR, pLP-AcGFP1-C, pLPS-AcGFP1-N, pLP-IRESneo, pLP-TRE2, pLP-RevTRE, pLP-LNCX, pLP-CMV-HA, pLP-CMV-Myc, pLP-RetroQ, pLP-CMVneo, pCMVScript, pcDNA3.1 Hygro, pCDNA3.1neo, pcDNA3.1puro, PSV2neo, pIRESpuro, pSV2zeo가 포함된다. 일부 구체예에서, 이들 벡터는 발현 제어 서열, 예를 들면, 구조성 또는 조건부 프로모터를 포함하고, 바람직하게는 구조성 프로모터가 이용된다. 당업자는 이런 서열을 선택할 수 있을 것이다. 가령, 적절한 프로모터에는 CMV, TK, SV40 및 EF-1α가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일부 구체예에서, 이들 프로모터는 유도성, 온도 조절된, 조직 특이적, 억제성, 열-쇼크, 발달성, 세포 계통 특이적, 진핵, 원핵 또는 일시적 프로모터, 또는 이들 중에서 한 가지 이상의 변형되지 않은 또는 돌연변이된, 무작위화된, 뒤섞인 서열의 조합 또는 재조합이다. 다른 구체예에서, 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) 또는 이들 중에서 하나 이상 (그리고 선택적으로, G 단백질)은 유전자 활성화에 의해 또는 에피솜으로 발현된다.
일부 구체예에서, 벡터는 선별가능 마커 또는 약물 내성 유전자가 없다. 다른 구체예에서, 벡터는 선택적으로 선별가능 마커, 예를 들면, 약물 또는 항생제 내성을 공여하는 단백질, 또는 더욱 일반적으로, 세포에 대한 선별 압력을 발휘하는 임의의 산물을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 상이한 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) 또는 G 단백질을 인코딩하는 서열을 도입하기 위한 각 벡터는 동일한 또는 상이한 약물 내성 또는 다른 선별 압력 마커를 보유할 수 있다. 하나 이상의 약물 내성 또는 선별 압력 마커가 동일하면, 약물의 수준을 증가시킴으로써 동시 선별이 달성될 수 있다. 적절한 마커는 당업자에게 공지되어 있고, 그리고 여기에는 네오마이신/G418, 퓨로마이신, 하이그로마이신, 제오신, 메토트렉세이트 및 블라스티시딘 중에서 한 가지에 내성을 공여하는 폴리펩티드 산물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 비록 약물 선별 (또는 임의의 다른 적절한 선별 마커를 이용한 선별)이 본 발명의 세포와 세포주를 생산할 때 필수적인 단계가 아니긴 하지만, 이는 안정적으로 형질감염된 세포에 대한 형질감염된 세포 개체군을 농축하는데 이용될 수 있고, 단서로써 이들 형질감염된 구조체는 약물 내성을 공여하도록 설계된다. 양쪽 감칠맛 수용체 아단위, 그리고 선택적으로 G 단백질, 또는 양쪽 단맛 수용체 아단위, 그리고 선택적으로, G 단백질을 발현하는 세포의 차후 선별이 신호전달 프로브를 이용하여 달성되면, 형질감염 이후에 너무 이른 선별은 단지 일시적으로 형질감염되고 안정적으로 형질감염되지 않은 다소의 양성 세포를 유발할 수 있다. 하지만, 이러한 효과는 형질감염된 세포에서 일시적인 발현의 희석을 가능하게 하는 충분한 세포 계대배양을 허용함으로써 최소화될 수 있다.
일부 구체예에서, 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) 또는 선택적으로 G 단백질을 인코딩하는 핵산을 도입하는데 이용되는 벡터는 RNA 태그 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. "RNA 태그 서열"은 신호전달 프로브에 의해 검출되는 발현된 RNA 또는 RNA의 일부인 핵산 서열을 지칭한다. 신호전달 프로브는 다양한 RNA 서열을 검출할 수 있다. 이들 RNA 중에서 하나가 태그로서 이용될 수 있다. 신호전달 프로브는 태그의 RNA 서열에 상보적인 부분을 포함하도록 상기 프로브를 설계함으로써 상기 RNA 태그에 지향될 수 있다. 태그 서열은 공동-전사되고 신호전달 프로브 결합을 위한 표적 서열을 포함하는 벡터의 3' 비번역 영역일 수 있다. 목적되는 핵산으로부터 생산된 RNA는 태그 서열을 포함할 수 있고, 또는 이러한 태그 서열은 5'-비번역 영역 또는 3'-비번역 영역 내에 위치할 수 있다. 일부 구체예에서, 태그는 목적되는 핵산으로부터 생산된 RNA의 일부가 아니다. 태그 서열은 생산된 단백질에 태그표식을 원하는 지의 여부에 따라, 목적되는 핵산의 메시지의 단백질-코딩 부분과의 프레임 (frame) 내부에 또는 외부에 존재할 수 있다. 따라서 태그 서열은 신호전달 프로브에 의한 검출을 위하여 번역될 필요가 없다. 태그 서열은 동일하거나 상이한 복수 표적 서열을 포함할 수 있고, 여기서 하나의 신호전달 프로브가 각 표적 서열에 혼성화 (hybridization)된다. 태그 서열은 이차 구조를 갖는 RNA를 인코딩할 수 있다. 상기 구조는 3개의 팔 연접 구조일 수 있다. 본 발명에 이용될 수 있고, 그리고 신호전달 프로브가 준비될 수 있는 태그 서열의 실례에는 에피토프 태그, 예를 들면, HIS 태그, myc 태그, 적혈구응집소 (HA) 태그, 단백질 C, VSV-G, FLU, 황색 형광 단백질 (YFP), 녹색 형광 단백질, 다양한 공지된 자기 태그, FLAG, BCCP, 말토오스 결합 단백질 태그, Nus-태그, Softag-1, Softag-2, Strep-태그, S-태그, 티오레독신, GST, V5, TAP 또는 CBP의 RNA 전사체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 당업자는 RNA 태그 서열을 용이하게 준비하고 이용할 수 있다.
본 발명의 세포와 세포주를 만들기 위하여, 예로써 U.S. Patent 6,692,965 및 WO/2005/079462에서 기술된 방법이 이용될 수 있다. 이들 문헌은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 본 발명의 세포와 세포주를 만드는데 선호되는 이들 방법은 목적되는 핵산 서열을 발현하는 (즉, RNA를 생산하는) 임의의 원하는 숫자의 클론 (수십 개 내지 수백 개 내지 수천 개의 클론)이 선별될 수 있도록 수백만 개의 세포의 실시간 평가를 제공한다. 세포 분류 기술, 예를 들면, 유세포분석 세포 분류 (가령, FACS 머신 이용) 또는 자기 세포 분류 (가령, MACS 머신 이용)를 이용하여, 웰당 1개의 선별된 세포가 배양 용기 (가령, 96 웰 배양 평판) 내에 높은 통계학적 신뢰도 (statistical confidence)로 자동적으로 집어넣어진다. 상기 기술의 속도와 자동화는 다중유전자 세포주 (즉, 미각 수용체 (가령, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체)의 T1R2 및 T1R3 아단위, 그리고 선택적으로, G 단백질을 발현하는 것들)가 용이하게 분리될 수 있도록 한다.
이러한 기술을 이용하여, 세포 또는 세포주에서 발현된 각각의 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) (그리고 선택적으로, G 단백질)에 대한 RNA 서열이 분자 표지 또는 형광 프로브로 지칭되는 신호전달 프로브를 이용하여 검출될 수 있다. 일부 구체예에서, 분자 표지는 앞서 기술된 바와 같은 표적 서열을 인식한다. 다른 구체예에서, 분자 표지는 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) (또는 G 단백질) 그 자체 내에 서열을 인식한다. 신호전달 프로브는 각각, 태그의 RNA 서열 또는 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) (또는 G 단백질)에 상보적인 부분을 포함하도록 상기 프로브를 설계함으로써 상기 RNA 태그 또는 미각 수용체 아단위 서열 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 서열 또는 단맛 수용체 아단위 서열) (또는 G 단백질 서열)에 지향될 수 있다.
미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) (그리고 선택적으로, G 단백질을 인코딩하는 핵산)를 인코딩하는 핵산, 또는 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) (또는 G 단백질) 및 태그 서열을 인코딩하는 서열, 그리고 선택적으로 선별가능 마커를 인코딩하는 핵산은 공지된 방법을 이용하여 선별된 호스트 세포 내로 도입될 수 있다. 유전자 활성화 서열은 당분야에 공지된 전통적인 방법을 이용하여 유사한 방식으로 세포 내로 도입될 수 있다. 이들 방법에는 형질감염, 바이러스 전달, 단백질 또는 펩티드 매개된 삽입, 공동침전 방법, 지질 기초된 전달 시약 (lipofection), 사이토펙션 (cytofection), 리포폴리아민 전달, 덴드리머 (dendrimer) 전달 시약, 전기천공 또는 기계적 전달이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 형질감염 시약의 실례는 GENEPORTER, GENEPORTER2, LIPOFECTAMINE, LIPOFECTAMINE 2000, FUGENE 6, FUGENE HD, TFX-10, TFX-20, TFX-50, OLIGOFECTAMINE, TRANSFAST, TRANSFECTAM, GENESHUTTLE, TROJENE, GENESILENCER, X-TREMEGENE, PERFECTIN, CYTOFECTIN, SIPORT, UNIFECTOR, SIFECTOR, TRANSIT-LT1, TRANSIT-LT2, TRANSIT-EXPRESS, IFECT, RNAI SHUTTLE, METAFECTENE, LYOVEC, LIPOTAXI, GENEERASER, GENEJUICE, CYTOPURE, JETSI, JETPEI, MEGAFECTIN, POLYFECT, TRANSMESSANGER, RNAiFECT, SUPERFECT, EFFECTENE, TF-PEI-KIT, CLONFECTIN, 그리고 METAFECTINE이다. 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) 핵산 서열 (및 잠재적으로 G 단백질 인코딩 핵산)은 세포 내에서 게놈의 서로 다른 위치에 통합될 수 있다. 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) 및 G 단백질을 인코딩하는 도입된 핵산의 발현 수준은 통합 부위에 기초하여 달라질 수 있다.
미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) 코딩 서열 또는 미각 수용체 (가령, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체) 유전자 활성화 서열의 호스트 세포 내로 도입 (및 선택적으로, 이들 세포에서 G 단백질 인코딩 서열의 도입 또는 활성화) 및 선택적 차후 약물 선별 이후에, 분자 표지 (가령, 형광 프로브)가 이들 세포 내로 도입되고, 그리고 그들의 신호 및 원하는 핵산 서열의 발현 (RNA)에 양성인 세포를 분리하기 위하여 세포 분류가 이용된다. 당업자는 이러한 분류가 임의의 원하는 발현 수준에 대하여 게이팅 (gating)될 수 있음을 인지할 것이다. 원하는 경우에, 복수 라운드의 분류가 수행될 수 있다. 한 구체예에서, 유세포분석 세포 분류기는 FACS 머신이다. 레이저-가능된 분석과 가공을 이용한 음성 세포의 MACS (자기 세포 분류) 또는 레이저 박리 역시 이용될 수 있다. 이러한 방법에 따라서, 단맛 수용체 아단위 T1R2 및 T1R3 (및 선택적으로, G 단백질) 또는 감칠맛 수용체 아단위 T1R1 및 T1R3 (및 선택적으로, G 단백질)을 발현하는 세포가 검출되고 회수된다.
본 발명의 이러한 구체예에 유용한 신호전달 프로브는 당분야에 공지되어 있다. 이들은 일반적으로, 표적 서열에 상보적인 서열, 그리고 프로브가 표적 서열에 결합되지 않을 때 신호가 방출되지 않고 프로브가 표적 서열에 결합될 때 신호가 방출되도록 정렬된 신호 방출 시스템을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 무제한적 예시로써, 신호전달 프로브는 소광제 및 형광단이 결합되지 않은 프로브 내에서 서로 묶이도록 상기 프로브 내에 위치하는 형광단 및 소광제를 포함할 수 있다. 프로브와 표적 서열 사이에 결합 시에, 소광제 및 형광단은 분리되고 신호의 방출을 유발한다. 예로써, International publication WO/2005/079462에서는 본 발명의 세포와 세포주의 생산에 이용될 수 있는, 바람직하게는 이용되는 다수의 신호전달 프로브를 기술한다. 태그 서열이 이용되는 경우에, 각각의 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) (또는 선택적으로 G 단백질)에 대한 벡터는 동일한 또는 상이한 태그 서열을 포함할 수 있다. 태그 서열이 동일하거나 상이한 경우에, 신호전달 프로브는 각 아단위 (및 G 단백질)의 (RNA) 발현이 개별적으로 검출될 수 있도록 상이한 신호 방출체, 예를 들면, 상이한 착색된 형광단 등을 포함할 수 있다. 예시로써, 단맛 수용체 T1R2 mRNA 또는 감칠맛 수용체 T1R1 mRNA을 특이적으로 검출하는 신호전달 프로브는 적색 형광단을 포함할 수 있고, 단맛/감칠맛 수용체 T1R3 아단위 (RNA)를 검출하는 프로브는 녹색 형광단을 포함할 수 있고, 그리고 선택적으로, G 단백질 (RNA)을 검출하는 프로브는 황색 형광단을 포함할 수 있다. 당업자는 형질감염된 세포에서 신호전달 프로브로, 2개의 (또는 선택적으로 3개의) 발현된 RNA의 발현을 차별적으로 검출하는 다른 수단을 인지할 것이다.
신호전달 프로브를 인코딩하는 핵산은 형질감염, 공동침전 방법, 지질 기초된 전달 시약 (리포펙션), 사이토펙션, 리포폴리아민 전달, 덴드리머 전달 시약, 전기천공 또는 기계적 전달이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 당업자에게 공지된 다수의 수단을 이용하여 선별된 호스트 세포 내로 도입될 수 있다. 형질감염 시약의 실례는 GENEPORTER, GENEPORTER2, LIPOFECTAMINE, LIPOFECTAMINE 2000, FUGENE 6, FUGENE HD, TFX-10, TFX-20, TFX-50, OLIGOFECTAMINE, TRANSFAST, TRANSFECTAM, GENESHUTTLE, TROJENE, GENESILENCER, X-TREMEGENE, PERFECTIN, CYTOFECTIN, SIPORT, UNIFECTOR, SIFECTOR, TRANSIT-LT1, TRANSIT-LT2, TRANSIT-EXPRESS, IFECT, RNAI SHUTTLE, METAFECTENE, LYOVEC, LIPOTAXI, GENEERASER, GENEJUICE, CYTOPURE, JETSI, JETPEI, MEGAFECTIN, POLYFECT, TRANSMESSANGER, RNAiFECT, SUPERFECT, EFFECTENE, TF-PEI-KIT, CLONFECTIN, 그리고 METAFECTINE이다.
한 구체예에서, 신호전달 프로브는 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위)를 인코딩하는 RNA의 일부 또는 5' 또는 3' 비번역 영역의 일부 (또는 G 단백질을 인코딩하는 RNA의 유사한 일부)에 상보적이도록 설계된다. 비록 목적되는 메신저 RNA를 인식하도록 설계된 신호전달 프로브가 내생적으로 발현된 표적 서열을 검출할 수 있다고 하더라도, 형질감염된 또는 유전자 활성화된 세포에 의해 생산된 목적되는 서열의 비율에 비하여 이들 서열의 비율은 분류기가 이들 2가지 세포 유형을 구별할 수 있을 만큼의 비율이다.
특정한 구체예에서, 동일한 또는 상이한 코팅 엑손, 비-코딩 인트론 또는 비-코딩 비번역 서열 내에서 다른 서열에 지향되는 (가령, 상보적인) 신호전달 프로브 역시 설계되고 이용될 수 있다. 특정한 구체예에서, 단맛 수용체 (가령, T1R2 및 T1R3) 또는 감칠맛 수용체 (가령, T1R1 및 T1R3)의 신호전달 경로를 비롯한 신호전달 경로의 성분에 대한 신호전달 프로브 역시 이용될 수 있다.
미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) (그리고 선택적으로, G 단백질)의 발현 수준은 세포마다 또는 세포주마다 다를 수 있다. 세포 또는 세포주에서 발현 수준은 또한, 후성 사건 (epigenetic event), 예를 들면, DNA 메틸화, 유전자 침묵, 그리고 도입유전자 사본의 상실로 인하여, 시간의 흐름 동안 감소할 수 있다. 이들 변화는 다양한 인자, 예를 들면, 세포에 의해 흡수된 도입유전자의 사본 수, 도입유전자의 게놈 통합 부위, 그리고 게놈 통합 이후에 도입유전자의 완전성 (integrity)에 기인할 수 있다. 발현 수준을 평가하기 위하여 FACS 또는 기타 세포 분류 방법 (즉, MACS)이 이용될 수 있다. 예로써, 그들이 최초에 분리되었던 하나 이상의 RNA에 대하여 세포가 시간의 흐름 동안 양성으로 존속하는 지와 어느 정도 존속하는 지를 결정하기 위하여, 추가 라운드의 신호전달 프로브 도입이 이용될 수 있다.
특정한 구체예에서, 적어도 하나의 신호전달 프로브에 대하여 상이한 절대적인 또는 상대적인 형광 수준을 갖는 세포는 예로써 FACS에 의해, 전체 세포 개체군에 비하여 적절한 형광 수준을 갖는 세포의 부분집합을 게이팅 (gating)함으로써 분리될 수 있다. 가령, 특정 신호전달 프로브 (또는 신호전달 프로브의 조합)에 대하여 최대 형광 신호를 갖는 세포 중에서 상위 5%, 상위 10%, 상위 15%, 상위 20%, 상위 25%, 상위 30%, 상위 35%, 상위 40%, 상위 45%, 상위 50%, 상위 55%, 상위 60%, 또는 상위 65%가 예로써, FACS에 의해 게이팅되고 분리될 수 있다. 다른 구체예에서, 특정 신호전달 프로브 (또는 신호전달 프로브의 조합)에 대하여 최대 형광 신호를 갖는 세포 중에서 상위 2% 내지 3%, 상위 5% 내지 10%, 상위 5% 내지 15%, 상위 5% 내지 20%, 상위 5% 내지 30%, 상위 40% 내지 50%, 상위 10% 내지 30%, 상위 10% 내지 25%, 또는 상위 10% 내지 50%가 예로써, FACS에 의해 게이팅되고 분리될 수 있다.
T1R1 및 T1R3, 또는 T1R2 및 T1R3, (및 선택적으로, G 단백질)에 대한 RNA를 발현하는 세포가 일단 분리되면, 이들 세포는 이들 아단위 (그리고 선택적으로, G 단백질) (RNA 또는 단백질)를 안정적으로 발현하는, 더욱 바람직하게는 기능적 미각 수용체 (가령, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체) (그리고 선택적으로, G 단백질)를 발현하는 세포를 생산하고 확인하는데 충분한 시간 길이 동안 임의의 조건 하에 배지에서 배양될 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 부착성 세포는 세포 분류 전후에 현탁 및 단일 세포 분리에 순응될 수 있다. 한 구체예에서, 분리된 세포는 세포 개체군을 산출하기 위하여 개별적으로 성장되거나, 또는 합동될 수 있다. 개별 또는 복수 세포 또는 세포주 역시 개별적으로 성장되거나, 또는 합동될 수 있다. 세포 또는 세포주의 풀 (pool)이 이들 아단위, 더욱 바람직하게는 기능적 미각 수용체 (가령, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체)를 안정적으로 발현하면, 이는 이러한 특징을 갖는 세포 또는 세포주 또는 일단의 세포 또는 세포주가 확인될 때까지 더욱 분별될 수 있다. 이는 다수의 세포와 세포주를 각각 개별적으로 유지할 필요 없이, 이들 세포와 세포주를 유지하는 것을 더욱 용이하게 만든다. 따라서 세포 또는 세포주의 풀이 양성 세포에 대하여 농축될 수 있다. 농축된 풀은 원하는 특성 또는 활성에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%, 또는 100% 양성이다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 본 발명의 세포와 세포주를 생산하는 방법을 제시한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 하나 이상의 미각 수용체 아단위, 예를 들면, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위, 그리고 선택적으로 G 단백질을 인코딩하는 mRNA를 발현하는 복수의 세포를 제공하는 단계;
b) 이들 세포를 개별 배양 용기 내로 개별적으로 분산시켜 복수의 별개의 세포 배양액을 제공하는 단계;
c) 자동화 세포 배양 방법을 이용하여 일단의 원하는 배양 조건 하에 이들 세포를 배양하는 단계, 이들 조건은 별개의 세포 배양액 각각에 대하여 실질적으로 동일한 것으로 특징되고, 이러한 배양 기간 동안 별개의 세포 배양액 각각에서 세포의 숫자가 표준화되고, 그리고 이들 별개의 배양액은 동일한 일정에서 계대배양되고;
d) 미각 수용체, 예를 들면, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체의 적어도 하나의 원하는 특징에 대하여 별개의 세포 배양액을 적어도 2회 평가하는 단계; 그리고
e) 양쪽 분석에서 원하는 특징을 갖는 별개의 세포 배양액을 확인하는 단계.
상기 방법에 따라서, 이들 세포는 일단의 원하는 배양 조건 하에 배양된다. 이들 조건은 임의의 원하는 조건일 수 있다. 당업자는 일단의 배양 조건 내에 어떤 파라미터가 포함되는 지를 이해할 것이다. 가령, 배양 조건에는 배지 (기초 배지 (DMEM, MEM, RPMI, 혈청-없는, 혈청 포함, 완전하게 화학적으로 정의된, 동물-유래된 성분이 없는), 일가와 이가 이온 (나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘) 농도, 첨가되는 추가 성분 (아미노산, 항생제, 글루타민, 글루코오스 또는 기타 탄소 공급원, HEPES, 채널 차단제, 다른 표적의 조절제, 비타민, 미량 원소, 중금속, 보조-인자, 성장 인자, 항-아폽토시스 시약), HEPES를 포함하는 새로운 또는 조건 배지, pH, 일정한 영양소 (아미노산, 탄소 공급원)의 고갈 또는 제한, 분할/계대배양에 앞서 세포가 달성하도록 허용되는 포화도 수준, 세포의 영양층 (feeder layer), 또는 감마-조사된 세포, CO2, 3가지 가스 시스템 (산소, 질소, 이산화탄소), 습도, 온도, 정지 또는 교반기 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
세포 배양 조건은 편의적으로, 또는 세포의 원하는 특정 용도에 맞게 선택될 수 있다. 유리하게는, 본 발명에서는 원하는 특정 용도에 최적으로 적합한 세포와 세포주를 제시한다. 다시 말하면, 세포가 원하는 특정 용도를 위한 조건 하에 배양되는 본 발명의 구체예에서, 원하는 용도를 위한 조건 하에 원하는 특징을 갖는 세포가 선별된다.
예시로써, 부착성 세포가 요구되는 평판에서 분석에 세포가 이용되면, 상기 분석의 조건 하에 부착성을 나타내는 세포가 선별될 수 있다. 유사하게, 세포가 단백질 생산에 이용되면, 세포는 단백질 생산에 적합한 조건 하에 배양되고 이러한 용도를 위한 유익한 특성에 대하여 선별될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 별개의 세포 배양액의 성장 속도를 측정하는 추가 단계를 포함한다. 성장 속도는 당업자에게 공지되어 있는 다양한 기술 수단을 이용하여 결정될 수 있다. 이런 기술에는 ATP, 세포 포화도, 광 산란, 흡광도 (가령, DNA의 경우에 OD 260) 측정이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 바람직하게는, 성장 속도는 선택된 배양 조건을 벗어나는 배양 동안 소모되는 시간의 양을 최소화시키는 수단을 이용하여 결정된다.
일부 구체예에서, 세포 포화도가 측정되고, 그리고 성장 속도가 포화도 값으로부터 계산된다. 일부 구체예에서, 세포가 분산되고, 그리고 향상된 정확도를 위하여 세포 포화도를 측정하기에 앞서 덩어리가 제거된다. 세포를 단분산시키는 수단은 널리 공지되어 있고, 그리고 예로써, 측정되는 배양액에 분산제 (dispersing reagent)의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 분산제는 널리 공지되어 있고 용이하게 구입가능하며, 그리고 여기에는 효소 분산제, 예를 들면, 트립신, 그리고 EDTA-기초된 분산제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 성장 속도는 HAMILTON VECTOR와 같은 상업적으로 가용한 소프트웨어를 이용하여 포화도 데이터로부터 계산될 수 있다. 예로써, 자동화 현미경 평판 판독기를 이용한 자동화 포화도 측정이 특히 유용하다. 포화도를 측정하는 평판 판독기는 상업적으로 가용하고, 그리고 여기에는 CLONE SELECT IMAGER (Genetix)가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 전형적으로, 세포 포화도의 적어도 2회 측정이 성장 속도를 계산하기에 앞서 수행된다. 성장 속도를 결정하는데 이용되는 포화도 값의 숫자는 배양에 편의하거나 적합한 임의의 숫자일 수 있다. 가령, 포화도는 예로써, 1주, 2주, 3주 또는 임의의 기간 동안, 그리고 임의의 원하는 빈도로 수회 측정될 수 있다.
성장 속도가 알려져 있을 때, 본 발명의 방법에 따라서, 복수의 별개의 세포 배양액은 성장 속도의 유사성에 의해 여러 군으로 분류된다. 배양액을 성장 속도 빈 (growth rate bin)으로 집단화 (grouping)함으로써, 군 내에 배양액을 함께 조작할 수 있고, 따라서 배양액 간에 편차를 감소시키는 다른 수준의 표준화를 제공할 수 있다. 가령, 빈 (bin) 내에 배양액은 동일한 시점에서 계대배양되고, 동일한 시점에서 원하는 시약으로 처리될 수 있다. 게다가, 기능 분석 결과는 전형적으로, 분석 웰 내에서 세포 밀도에 좌우된다. 개별 클론의 진정한 비교는 이들을 동일한 밀도로 도말하고 평가할 때에만 달성된다. 특정한 성장 속도 코호트로의 집단화는 이들이 고처리량 형식으로 기능적으로 특성화될 수 있도록 하는 특정 밀도에서 클론의 도말을 가능하게 한다.
각 군에서 성장 속도의 범위는 임의의 편의한 범위일 수 있다. 세포가 동일한 시점에서 계대배양될 수 있도록 하고 세포 수의 빈번한 재표준화 (renormalization)를 예방하는 성장 속도의 범위를 선택하는 것이 특히 유리하다. 성장 속도 군은 엄격한 집단화를 위한 매우 좁은 범위, 예를 들면, 서로 간에 1시간 내에 평균 배가 시간을 포함할 수 있다. 하지만, 본 발명의 방법에 따라서, 상기 범위는 서로 간에 최대 2시간, 최대 3시간, 최대 4시간, 최대 5시간 또는 최대 10시간, 또는 더욱 넓은 범위일 수 있다. 재표준화의 요구는 빈 (bin)에서 성장 속도가 동일하지 않고, 따라서 일부 배양액에서 세포의 숫자가 다른 것보다 빠르게 증가할 때 발생한다. 빈 내에 모든 배양액에 대한 실질적으로 동일한 조건을 유지하기 위하여, 빈 전역에서 숫자를 재표준화하기 위하여 세포를 주기적으로 제거하는 것이 필요하다. 성장 속도가 더욱 상이하면, 재표준화가 더욱 빈번하게 요구된다.
단계 d)에서, 세포와 세포주는 게놈에 의해 인코딩된 세포 과정에서 변화; 게놈에 의해 조절된 세포 과정에서 변화; 염색체 활성의 패턴에서 변화; 염색체 침묵의 패턴에서 변화; 유전자 침묵의 패턴에서 변화; 유전자 활성화의 패턴 또는 효율에서 변화; 유전자 발현의 패턴 또는 효율에서 변화; RNA 발현의 패턴 또는 효율에서 변화; RNAi 발현의 패턴 또는 효율에서 변화; RNA 가공의 패턴 또는 효율에서 변화; RNA 수송의 패턴 또는 효율에서 변화; 단백질 번역의 패턴 또는 효율에서 변화; 단백질 접힘의 패턴 또는 효율에서 변화; 단백질 조립의 패턴 또는 효율에서 변화; 단백질 변형의 패턴 또는 효율에서 변화; 단백질 수송의 패턴 또는 효율에서 변화; 막 단백질의 세포 표면으로의 수송의 패턴 또는 효율에서 변화; 성장 속도에서 변화; 세포 크기에서 변화; 세포 형상에서 변화; 세포 형태에서 변화; % RNA 함량에서 변화; % 단백질 함량에서 변화; % 물 함량에서 변화; % 지질 함량에서 변화; 리보솜 함량에서 변화; 미토콘드리아 함량에서 변화; ER 질량에서 변화; 원형질 막 표면적에서 변화; 세포 체적에서 변화; 원형질 막의 지질 조성에서 변화; 핵 외피의 지질 조성에서 변화; 원형질 막의 단백질 조성에서 변화; 핵 외피의 단백질 조성에서 변화; 분비 소포의 숫자에서 변화; 리소솜의 숫자에서 변화; 액포의 숫자에서 변화; 단백질 생산, 단백질 분비, 단백질 접힘, 단백질 조립, 단백질 변형, 단백질의 효소 변형, 단백질 당화, 단백질 인산화, 단백질 탈인산화, 대사산물 생합성, 지질 생합성, DNA 합성, RNA 합성, 단백질 합성, 영양소 흡수, 세포 성장, 유사분열, 감수분열, 세포 분열, 탈분화, 줄기 세포로 변환, 다능성 세포로 변환, 전능성 세포로 변환, 임의의 장기 (즉, 간, 폐, 피부, 근육, 췌장, 뇌, 고환, 난소, 혈액, 면역계, 신경계, 골, 심혈관계, 중추신경계, 위장관, 위, 갑상선, 혀, 담낭, 신장, 코, 눈, 손발톱, 머리카락, 미뢰)의 줄기 세포 유형으로 변환, 임의의 분화된 세포 유형 (즉, 근육, 심장 근육, 뉴런, 피부, 췌장, 혈액, 면역, 적혈구 세포, 적혈구 세포, 킬러 T-세포, 장내분비 세포, 미각, 분비 세포, 신장, 상피 세포, 내피 세포, 또한 핵산 서열의 도입에 이용될 수 있는 것으로 이미 열거된 임의의 동물 또는 인간 세포 유형 포함)으로 변환, DNA 흡수, 소형 분자 흡수, 형광 프로브 흡수, RNA 흡수, 고형 표면에 부착, 혈청-없는 조건에 적응, 혈청-없는 현탁 조건에 적응, 규모 확대된 세포 배양에 적합, 대규모 세포 배양에 이용, 약물 발견에서 이용, 고처리량 스크리닝에서 이용, 기능적 세포 기초된 분석에서 이용, 칼슘 유동 분석에서 이용, G-단백질 리포터 분석에서 이용, 리포터 세포 기초된 분석에서 이용, ELISA 연구에서 이용, 시험관내 분석에서 이용, 생체내 적용에 이용, 이차 검사에 이용, 화합물 검사에서 이용, 결합 분석에서 이용, 패닝 (panning) 분석에서 이용, 항체 패닝 분석에서 이용, 영상 분석에서 이용, 현미경 영상 분석에서 이용, 멀티웰 평판에서 이용, 자동화 세포 배양에 적합, 축소된 자동화 세포 배양에 적합, 대규모 자동화 세포 배양에 적합, 멀티웰 평판 (6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 또는 더욱 높은 밀도)에서 세포 배양에 적합, 세포 칩에서 이용, 슬라이드에서 이용, 유리 슬라이드에서 이용, 슬라이드 또는 유리 슬라이드에서 마이크로어레이, 면역형광 연구, 단백질 정제에서 이용, 생물학적 생산에서 이용, 산업용 효소의 생산에서 이용, 연구용 시약의 생산에서 이용, 세포 요법에서 이용, 동물 또는 인간으로 이식에서 이용, 세포에 의해 분비된 인자의 분리에서 이용, cDNA 라이브러리의 준비, RNA의 정제, DNA의 정제, 병원균, 바이러스 또는 기타 병원체에 의한 감염, 병원균, 바이러스 또는 기타 병원체에 의한 감염에 내성, 내약성, 자동화 축소된 세포 배양 조건 하에 유지에 적합성, 단백질 결정학, 면역계의 자극, 항체 생산 또는 산출, 또는 항체의 검사를 비롯한 특성화를 위한 단백질의 생산에서 이용을 위한 세포의 능력 또는 잠재력에서 변화가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 생리학적 특성에 대하여 조사되고 선별될 수 있다. 당업자는 앞서 열거된 임의의 특성에 대한 적절한 검사법을 이의 없이 인지할 것이다. 특정한 구체예에서, 이들 물리적 특성 중에서 한 가지 이상은 미각 수용체 (가령, 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체)와 연관된 일관된 물리적 특성일 수 있고, 그리고 기능적 미각 수용체 (가령, 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체)의 발현을 모니터하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 세포와 세포주 및/또는 본 발명의 정합된 패널을 특성화하는데 이용될 수 있는 검사에는 아미노산 분석, DNA 염기서열분석, 단백질 염기서열분석, NMR, 단백질 수송에 대한 검사, 핵세포질 수송에 대한 검사, 단백질의 세포하 국부화에 대한 검사, 핵산의 세포하 국부화에 대한 검사, 현미경 분석, 초현미경 분석, 형광 검경, 전자 검경, 공초점 검경, 레이저 박리 기술, 세포수 계산 및 투석이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 당업자는 앞서 열거된 임의의 검사법을 어떻게 이용하는 지를 이해할 것이다.
상기 방법에 따라서, 세포는 이들 세포 또는 세포주가 성장 속도를 측정하는 단계에 앞서, 개별 배양액에서 분산되기만 하면, 임의의 세포 배양 형식으로 배양될 수 있다. 가령, 편의를 위하여, 세포는 원하는 조건 하에 배양을 위하여 초기에 합동되고, 이후 개별 세포가 웰 또는 용기마다 1개의 세포로 분리될 수 있다.
세포는 임의의 편의한 숫자의 웰을 보유하는 다중-웰 조직 배양 평판에서 배양될 수 있다. 이런 평판은 이의 없이 상업적으로 가용하고, 그리고 당업자에게 널리 공지되어 있다. 일부 경우에, 세포는 바람직하게는, 바이알 또는 임의의 다른 편의한 형식에서 배양될 수 있고, 이들 다양한 형식은 당업자에게 공지되어 있고 이의 없이 상업적으로 가용하다.
성장 속도를 측정하는 단계를 포함하는 구체예에서, 성장 속도를 측정하기에 앞서, 세포는 그들이 배양 조건에 순응할 만큼 충분한 시간 길이 동안 배양된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 이러한 시간 길이는 다수의 인자, 예를 들면, 세포 유형, 선택된 조건, 배양 형식에 따라 변할 것이고, 그리고 1일 내지 수일, 1주 또는 그 이상의 시간의 양일 수 있다.
바람직하게는, 복수의 별개의 세포 배양액에서 각 개별 배양액은 표준화된 유지 일정 (maintenance schedule)을 비롯한, 하기에 논의된 바와 같은 실질적으로 동일한 조건 하에 유지된다. 본 발명의 방법의 다른 유리한 특징은 많은 숫자의 개별 배양액이 동시에 유지될 수 있다는 점이고, 따라서 원하는 일단의 형질을 갖는 세포는 심지어 극히 드물게 존재하는 경우에도 확인될 수 있다. 이런 저런 이유로, 본 발명에 따라서, 복수의 별개의 세포 배양액은 각 웰에 대한 조건이 실질적으로 동일하도록 자동화 세포 배양 방법을 이용하여 배양된다. 자동화 세포 배양은 수동 세포 배양에 내재된 필연적인 가변성을 예방한다.
임의의 자동화 세포 배양 시스템이 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 다수의 자동화 세포 배양 시스템은 상업적으로 가용하고, 그리고 당업자에게 널리 공지되어 있다. 일부 구체예에서, 자동화 시스템은 로봇식 시스템이다. 바람직하게는, 상기 시스템은 독립적으로 이동 채널 (moving channel), 다중채널 헤드 (가령, 96-팁 헤드), 그리퍼 (gripper) 또는 신품-채집 팔 (cherry-picking arm), 그리고 이러한 절차 동안 무균을 유지시키는 HEPA 여과 장치를 포함한다. 피펫터 내에서 채널의 숫자는 배양의 형식에 적합해야 한다. 편의한 피펫터는 예로써, 96 또는 384 채널을 보유한다. 이런 시스템은 공지되어 있고 상업적으로 가용하다. 가령, MICROLAB STAR™ 기구 (Hamilton)가 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 자동화 시스템은 다양한 원하는 세포 배양 과제를 수행할 수 있어야 한다. 이런 과제는 당업자에게 공지되어 있다. 여기에는 배지 제거, 배지 대체, 시약 첨가, 세포 세척, 세척액 제거, 분산제 첨가, 배양 용기로부터 세포 이전, 배양 용기에 세포 첨가 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 발명의 세포 또는 세포주의 생산은 임의의 숫자의 별개의 세포 배양액을 포함할 수 있다. 하지만, 본 발명의 방법에 의해 제공된 이점은 세포의 숫자가 증가함에 따라 증가한다. 이러한 방법에 이용될 수 있는 세포 또는 별개의 세포 배양액의 숫자에 이론적 상한선은 없다. 본 발명에 따라서, 별개의 세포 배양액의 숫자는 2 이상일 수 있지만 더욱 유리하게는, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상, 예를 들면, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 48, 적어도 50, 적어도 75, 적어도 96, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 384, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 500,000 또는 그 이상의 별개의 세포 배양액이다.
본 발명의 세포와 세포주는 발현 및 발현 수준 (RNA 또는 단백질)의 맥락에서 전통적인 방법에 의해 생산된 세포와 세포주에 비하여 증진된 안정성을 갖는다. 이런 안정적인 발현에 의해 특징되는 세포와 세포주를 확인하기 위하여, 각 미각 수용체, 예를 들면, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체 아단위, (그리고 선택적으로, G 단백질)의 세포 또는 세포주의 발현이 시간 경과 동안 측정되고, 그리고 발현 수준이 비교된다. 안정적인 세포주는 이러한 시간 경과 내내 단맛 수용체 T1R2 및 T1R3 아단위, 또는 감칠맛 수용체 T1R1 및 T1R3 아단위, (그리고 선택적으로, G 단백질)를 지속적으로 발현할 것이다 (RNA 또는 단백질). 본 발명의 일부 측면에서, 이러한 시간 경과는 적어도 1주, 2주, 3주 등, 또는 적어도 1개월, 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개월, 또는 그 사이에 임의의 시간 기일일 수 있다.
분리된 세포와 세포주는 예로써, 발현되는 (RNA) 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위, (또는 G 단백질)의 절대적 양 및 상대적 양을 결정하기 위하여 예로써, qRT-PCR 및 단일 종점 RT-PCR에 의해 더욱 특성화될 수 있다. 바람직하게는, 이들 2가지 아단위의 확장 수준은 본 발명의 세포와 세포주에서 실질적으로 동일하다.
다른 구체예에서, 기능적 미각 수용체, 예를 들면, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체, (그리고 G 단백질)의 발현은 시간의 흐름 동안 평가된다. 이들 구체예에서, 안정적인 발현은 시간 경과 동안 기능 분석의 결과를 비교함으로써 측정된다. 기능 분석에 기초된 세포 및 세포주 안정성의 분석은 감칠맛 수용체의 T1R1 및 T1R3 아단위, 또는 단맛 수용체의 T1R2 및 T1R3 아단위, (그리고 선택적으로, G 단백질) (RNA 또는 단백질)을 안정적으로 발현할 뿐만 아니라 이들 아단위 (및 G 단백질)를 안정적으로 생산하고 적절하게 가공 (가령, 번역후 변형, 아단위 조립, 그리고 세포 내에서 국부화)하여 기능적 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체를 생산하는 세포와 세포주를 확인하는 이점을 제공한다.
본 발명의 세포와 세포주는 그들의 Z' 인자에 의해 입증되는 바와 같이, 높은 재현성 (reproducibility)을 갖는 분석법을 제공하는 추가의 유익한 특성을 갖는다 (참조: Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR, "A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays." J. Biomol. Screen. 1999;4(2):67-73, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). Z' 값은 세포 또는 세포주의 품질에 관계하는데, 그 이유는 이것이 세포 또는 세포주가 조절제에 일관되게 반응하는 정도를 반영하기 때문이다. Z'는 멀티웰 평판 전역에서 참고 화합물에 대한 기능적 반응의 신호-대-잡음 범위 (signal-to-noise range) 및 신호 가변성 (즉, 웰에서부터 웰까지)을 고려하는 통계학적 계산 결과이다. Z'는 양성 대조를 갖는 멀티웰 및 음성 대조를 갖는 멀티웰로부터 획득된 데이터를 이용하여 계산된다. 평균 값에서, 차이 인자에 3이 곱셈된 통합 표준 편차 (combined standard deviation)의 비율은 하기 방정식에 따라서, Z' 인자를 제공하기 위하여 1로부터 뺄셈된다:
Z' 인자 = 1 - ((3σ양성 대조 + 3σ음성 대조)/ (μ양성 대조 - μ음성 대조))
이론적 최대 Z' 인자는 1.0이고, 이는 가변성 없음 및 무제한의 동적 범위 (dynamic range)를 갖는 이상적인 분석법을 지시할 것이다. 본 명세서에서, "높은 Z'"는 적어도 0.6, 적어도 0.7, 적어도 0.75 또는 적어도 0.8, 또는 0.6과 1.0 사이에 임의의 소수의 Z'의 Z' 인자를 지칭한다. 복수 표적, 예를 들면, 미각 수용체, 예를 들면, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체의 경우에, 높은 Z'는 적어도 0.4 또는 그 이상의 Z'를 의미한다. 0에 가까운 스코어는 바람직하지 않은데, 그 이유는 이것이 양성 대조와 음성 대조 사이에 겹침이 존재한다는 것을 지시하기 때문이다. 업계에서, 단순한 세포-기초된 분석의 경우에, 0.3까지 Z' 스코어는 한계 스코어 (marginal score)인 것으로 간주되고, 0.3과 0.5 사이의 Z' 스코어는 조건에 맞는 것으로 간주되고, 그리고 0.5 초과의 Z' 스코어는 우수한 것으로 간주된다. 세포-없는 또는 생화학적 분석은 더욱 높은 Z' 스코어에 접근할 수 있지만, 세포-기초된 시스템에 대한 Z' 스코어는 세포-기초된 시스템이 복잡하기 때문에 더욱 낮아지는 경향이 있다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 단일 사슬 단백질을 발현하는 전통적인 세포를 이용한 세포-기초된 분석도 전형적으로, 0.5 내지 0.6보다 높은 Z'를 달성하지 못한다. 다중-아단위 단백질의 조작된 발현 (도입된 코딩 서열 또는 유전자 활성화로부터)을 갖는 세포는 당해 분야에서 보고된 바와 같이, 그들의 추가된 복잡성 (complexity)으로 인하여 더욱 낮아질 수 있을 것이다. 이런 세포는 분석에 이용하기에는 신뢰성이 없는데, 그 이유는 그 결과가 재현성이 없을 것이기 때문이다. 다른 한편, 본 발명의 세포와 세포주는 더욱 높은 Z' 값을 갖고, 그리고 분석에서 일관된 결과를 유리하게 산출한다. 실제로, 본 발명의 미각 수용체 (가령, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체) 발현 세포와 세포주는 고처리량 스크리닝 (HTS) 적합성 분석을 위한 기초를 제공하는데, 그 이유는 이들이 일반적으로, 전통적으로 생산된 세포보다 높은 Z' 값을 갖기 때문이다. 본 발명의 일부 측면에서, 이들 세포와 세포주는 적어도 0.3, 적어도 0.4, 적어도 0.5, 적어도 0.6, 적어도 0.7, 또는 적어도 0.8의 Z'를 산출한다. 심지어, 미각 수용체 (가령, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체)-발현 세포에 대한 적어도 0.3 - 0.4의 Z' 값이 유리한데, 그 이유는 미각 수용체 (가령, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체)가 다중유전자 표적 (multigene target)이기 때문이다. 본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 세포와 세포주는 이들 세포가 복수 계대배양, 예를 들면, 5 내지 20 사이에 임의의 정수를 비롯한 5 내지 20회 계대배양 동안 유지된 이후에도 적어도 0.7, 적어도 0.75 또는 적어도 0.8의 Z'를 산출한다. 본 발명의 일부 측면에서, 1, 2, 3, 4 또는 5주, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간 동안 유지된 세포와 세포주에서 적어도 0.7, 적어도 0.75 또는 적어도 0.8의 Z'가 관찰된다.
본 발명의 미각 수용체 (가령, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체) 발현 세포와 세포주의 다른 유익한 특성은 그들이 약물 또는 다른 선별 압력의 부재에서, 단맛 수용체의 T1R2 및 T1R3 아단위, 또는 감칠맛 수용체의 T1R1 및 T1R3 아단위, 그리고 선택적으로 G 단백질을 안정적으로 발현한다는 점이다. 따라서 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 임의의 선별 압력 없이 배양 동안 유지된다. 진전된 구체예에서, 세포와 세포주는 임의의 약물 또는 항생제 없이 유지된다. 본 명세서에서, 세포 유지는 단맛 수용체 아단위 또는 감칠맛 수용체 아단위 (그리고 선택적으로, G 단백질) 발현에 대하여 앞서 기술된 바와 같이 선별된 이후에, 세포를 배양하는 것을 지칭한다. 유지는 세포 내로 도입된 마커(들)가 혼성 개체군에서 안정적인 형질감염체의 농축을 가능하게 하는 세포 분류에 앞서, 선별 압력 (가령, 항생제) 하에 세포를 성장시키는 선택적 단계를 지칭하지 않는다.
본 발명의 세포와 세포주의 약물-없는 및 선별 압력-없는 세포 유지는 다수의 이점을 제공한다. 가령, 약물-내성 세포는 목적되는 공동-형질감염된 도입유전자를 적절한 수준으로 발현하지 못할 수도 있는데, 그 이유는 이러한 선별이 도입유전자와 함께 또는 도입유전자 없이, 약물 내성 유전자를 흡수하는 세포의 생존에 의존하기 때문이다. 게다가, 선별 약물 및 기타 선별 압력 인자는 종종, 돌연변이유발성이거나, 또는 세포의 생리를 달리 간섭하여 세포-기초된 분석에서 편중된 결과를 유발한다. 가령, 선별 약물은 아폽토시스에 대한 감수성을 감소시키고 (Robinson et al., Biochemistry, 36(37):11169-11178 (1997)), DNA 수복 및 약물 대사를 증가시키고 (Deffie et al., Cancer Res. 48(13):3595-3602 (1988)), 세포 pH를 증가시키고 (Thiebaut et al., J Histochem Cytochem. 38(5):685-690 (1990); Roepe et al., Biochemistry. 32(41):11042-11056 (1993); Simon et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 91(3):1128-1132 (1994)), 리소솜과 엔도솜 pH를 감소시키고 (Schindler et al., Biochemistry. 35(9):2811-2817 (1996); Altan et al., J Exp Med. 187(10):1583-1598 (1998)), 원형질 막 전위를 감소시키고 (Roepe et al., Biochemistry. 32(41):11042-11056 (1993)), 염화물 (Gill et al., Cell. 71(1):23-32 (1992)) 및 ATP (Abraham et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 90(1):312-316 (1993))에 대한 원형질 막 전도성을 증가시키고, 그리고 소포 수송 속도를 증가시킨다 (Altan et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 96(8):4432-4437 (1999)). 따라서 본 발명의 세포와 세포주는 선별 압력에 의해 유발된 인공물 (artifact)로부터 자유로운 스크리닝 분석을 가능하게 한다. 일부 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 원하는 특성을 갖는 세포와 세포주가 농축된 세포 개체군으로 시작되지 않을 때에도 분류에 의해 분리되도록, 세포 분류 이전에 또는 이후에 선별 압력 인자, 예를 들면, 항생제와 함께 배양되지 않는다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 본 발명의 세포와 세포주를 이용하는 방법을 제시한다. 본 발명의 세포와 세포주는 기능적 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위)가 요구되는 임의의 적용에서 이용될 수 있다. 이들 세포와 세포주는 예로써, 미각 수용체 조절제 (가령, 감칠맛 수용체 조절제 또는 단맛 수용체 조절제)를 스크리닝하고; 결정학 및 결합 연구를 위한 단백질을 생산하고; 그리고 화합물 선택성 (selectivity)과 용량 (dosing), 수용체/화합물 결합 동역학과 안정성, 그리고 세포 생리 기능 (가령, 전기생리학, 단백질 운송, 단백질 접힘, 그리고 단백질 조절)에 대한 수용체 발현의 효과를 조사하기 위하여, 시험관내 세포-기초된 분석 또는 생체내 분석 (여기서, 이들 세포는 동물 (가령, 비-인간 포유동물)에 이식된다)에 이용될 수 있다. 본 발명의 세포와 세포주는 또한, 특정한 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위)의 역할을 조사하기 위한 녹다운 (knock down) 연구에 이용될 수 있다.
아단위의 다양한 조합을 발현하는 세포와 세포주는 미각 수용체 조절제 (가령, 감칠맛 수용체 조절제 또는 단맛 수용체 조절제)를 확인하기 위하여 개별적으로 또는 함께 이용될 수 있다. 이들 세포와 세포주는 다양한 조절제에 대한 반응에 기초하여, 미각 수용체의 생체내 형태의 실체를 미각 수용체의 공지된 형태의 실체와 상관시킴으로써, 상이한 미각 수용체 병리에서 미각 수용체 (가령, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체)의 상이한 형태의 역할을 확인하는데 이용될 수 있다. 이는 이런 미각 수용체-관련된 병리의 고도로 표적화된 치료를 위한 질병- 또는 조직-특이적 미각 수용체 조절제 (가령, 감칠맛 수용체 조절제 또는 단맛 수용체 조절제)의 선별을 가능하게 한다.
미각 수용체 조절제 (가령, 감칠맛 수용체 조절제 또는 단맛 수용체 조절제)를 확인하기 위하여, 본 발명의 세포 또는 세포주는 상기 미각 수용체 (가령, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체)가 기능할 것으로 예상되는 조건 하에 검사 화합물에 노출되고, 이후 적절한 대조, 예를 들면, 검사 화합물에 노출되지 않은 세포와 비교하여 미각 수용체 활성 (가령, 감칠맛 수용체 활성 또는 단맛 수용체 활성)에서 통계학적으로 유의한 변화 (가령, p<0.05)가 검출된다. 공지된 작동약 또는 길항약 및/또는 미각 수용체 아단위 (가령, 감칠맛 수용체 아단위 또는 단맛 수용체 아단위) (그리고 선택적으로, G 단백질)의 상이한 조합을 발현하는 세포를 이용한 양성 및/또는 음성 대조 역시 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 검출되는 및/또는 측정되는 미각 수용체 활성 (가령, 감칠맛 수용체 활성 또는 단맛 수용체 활성)은 미각 수용체 활성화 (가령, 감칠맛 수용체 활성화 또는 단맛 수용체 활성화) 이후에 하류 신호전달 사건의 결과로서 소포체로부터 칼슘 방출이다. 당업자는 다양한 분석 파라미터, 예를 들면, 신호 대 잡음 비율이 최적화될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 하나 이상의 세포 또는 세포주는 복수의 검사 화합물, 예를 들면, 검사 화합물의 라이브러리에 노출된다. 검사 화합물의 이런 라이브러리는 미각 수용체 (가령, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체)의 하나 이상의 조절제를 확인하기 위하여 본 발명의 세포주를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 검사 화합물은 소형 분자, 폴리펩티드, 펩티드, 펩티드 모방체, 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 비롯한 화학적 모이어티일 수 있다. 항체의 경우에, 이들은 비-인간 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 항체는 항체 단편 (가령, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb 등), 단일 사슬 항체 (scFv), 단일 도메인 항체, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 전부 또는 항원-결합 부분을 비롯하여, 중쇄와 경쇄의 완전 보체 또는 임의의 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 완전한 항체일 수 있다.
일부 구체예에서, 검사 화합물에 노출에 앞서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 예로써, 포유동물 또는 다른 동물 효소, 식물 효소, 세균 효소, 단백질 수정 효소 및 지질 수정 효소를 비롯한 효소로 전처리 (pretreatment)에 의해 변형될 수 있다. 이런 효소에는 예로써, 키나아제, 프로테아제, 포스파타아제, 글리코시다아제, 산화환원효소, 트랜스퍼라아제, 하이드롤라아제, 리아제, 이성화효소, 리가아제 세균 프로테아제, 장으로부터 프로테아제, GI 관으로부터 프로테아제, 구강내 타액에서 프로테아제, 리졸 세포/세균으로부터 프로테아제 등이 포함될 수 있다. 대안으로, 이들 세포와 세포주는 먼저, 검사 화합물에 노출되고, 그 이후에 효소 처리가 수행되어 상기 처리에 의한 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체의 변형을 변경하는 화합물이 확인될 수 있다.
일부 구체예에서, 광범위한 화합물 수집물이 예로써, 96-웰, 384-웰, 1536-웰 또는 더욱 높은 밀도 형식을 이용한 세포-기초된, 기능적, 고처리량 스크린 (HTS)에서 미각 수용체 조정 활성 (가령, 감칠맛 수용체 조정 활성 또는 단맛 수용체 조정 활성)에 대하여 조사된다. 일부 구체예에서, 검사 화합물, 또는 검사 화합물의 라이브러리를 비롯한 복수의 검사 화합물은 본 발명의 하나 이상의 세포 또는 세포주를 이용하여 스크리닝될 수 있다.
인간 단맛 수용체를 발현하는 본 발명의 세포 또는 세포주의 경우에, 이들 세포 또는 세포주는 원치 않는 단맛 수용체 활성, 또는 원하는 단맛 수용체 활성의 감소 또는 결여로 특징되는 질환 또는 장애의 치료에서 이용을 위한 단맛 수용체 활성을 조정 (증가 또는 감소)하는 화합물을 확인하기 위하여 검사 화합물에 노출될 수 있다. 게다가, 본 발명의 방법에 따라서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 섭취가능 물질에 이용되는 단맛을 강화 또는 저해하는 화합물 또는 물질을 확인하는데 이용될 수 있다.
인간 감칠맛 수용체를 발현하는 본 발명의 세포 또는 세포주의 경우에, 이들 세포 또는 세포주는 원치 않는 감칠맛 수용체 활성, 또는 원하는 감칠맛 수용체 활성의 감소 또는 결여로 특징되는 질환 또는 장애의 치료에서 이용을 위한 감칠맛 수용체 활성을 조정 (증가 또는 감소)하는 화합물을 확인하기 위하여 검사 화합물에 노출될 수 있다. 게다가, 본 발명의 방법에 따라서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 섭취가능 물질에 이용되는 감칠맛을 강화 또는 저해하는 화합물 또는 물질을 확인하는데 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 단맛 수용체의 조절제에 증가된 민감도를 갖는다. 가령, 본 발명의 세포와 세포주는 모든 공지된 부류의 단맛 화합물, 예를 들면, 자연 감미료 (가령, 글루코오스, 프럭토오스 및 수크로오스); 고강도 감미료 (가령, 스테비아, 레바우디오시드 A, 나한과); 그리고 인공 감미료 (가령, 아스파테임, 사카린; 그리고 아세설팜k)에 반응한다 (도 23 및 24 참조). 본 발명의 세포와 세포주는 또한, 단맛 수용체에 대하여 생리학적 범위 EC50 또는 IC50 값으로 조절제에 반응하고 G 단백질을 활성화시킨다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 감칠맛 수용체의 조절제에 증가된 민감도를 갖는다. 가령, 본 발명의 세포와 세포주는 모든 공지된 부류의 감칠맛 화합물, 예를 들면, MSG 및 사이클라민산나트륨에 반응한다 (도 9-12 참조). 본 발명의 세포와 세포주는 또한, 감칠맛 수용체에 대하여 생리학적 범위 EC50 또는 IC50 값으로 조절제에 반응하고 G 단백질을 활성화시킨다.
본 명세서에서, EC50은 세포 또는 세포주에서 반-극대 (half-maximal) 활성화 반응을 유도하는데 필요한 화합물 또는 물질의 농도를 지칭한다. 본 명세서에서, IC50은 세포 또는 세포주에서 반-극대 (half-maximal) 저해 반응을 유도하는데 필요한 화합물 또는 물질의 농도를 지칭한다. EC50 및 IC50 값은 당분야에 널리 공지된 기술, 예를 들면, 화합물 또는 물질의 농도를 감칠맛 수용체-발현 세포주 또는 단맛 수용체-발현 세포주의 반응에 상관시키는 용량-반응 곡선 (dose-response curve)을 이용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 미각 수용체 (가령, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체) 발현 세포와 세포주의 더욱 유익한 특성은 이들 세포와 세포주를 이용한 최초 스크리닝에서 확인된 조절제가 이차 기능 분석, 예를 들면, 헹굼과 뱉기 (sip and spit), 미각 검사 및 감각 평가에서 기능적이라는 점이다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 최초 스크리닝 분석에서 확인된 화합물은 전형적으로, 그들의 유도체 또는 유사체가 이차 기능 분석에서 기능적이도록, 예로써 조합 화학, 의화학 또는 합성 화학에 의해 변형되어야 한다. 하지만, 본 발명의 미각 수용체 (가령, 감칠맛 수용체 또는 단맛 수용체) 발현 세포와 세포주의 높은 생리학적 적절성으로 인하여, 이들 세포와 세포주를 이용하여 확인된 다수의 화합물이 추가 변형 없이도 기능적이다.
일정한 측면에서, 세포 내에 존재하는 자연적으로 발생하는 정도의 유전적 다양성 (genetic diversity)을 이용하고, 그리고 원하는 특성 (가령, 기능적 미각 수용체, 예를 들면, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 또는 쓴맛 수용체의 안정적인 및/또는 높은 발현)을 공여하는 원하는 유전자 발현 프로필을 갖는 세포를 효과적으로 확인하고, 선별하고, 그리고 농축하는 방법이 본 발명에서 제시된다. 본 발명의 방법은 전통적인 방법보다 더욱 빠르고 더욱 효과적으로, 향상된 특성을 갖는 세포를 유전적으로 다양한 세포의 풀로부터 확인하고, 선별하고, 그리고 농축할 수 있다. 특정한 구체예에서, 이들 세포는 유전적으로 변형되지 않는다. 다른 특정한 구체예에서, 본 발명의 방법은 향상된 특성 (가령, 기능적 미각 수용체, 예를 들면, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 또는 쓴맛 수용체의 더욱 안정적인 및/또는 더욱 높은 발현)을 갖는 신규한 동질성 세포 개체군을 산출을 가능하게 한다.
일정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 한 가지 이상의 원하는 특성 (가령, 기능적 미각 수용체, 예를 들면, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 또는 쓴맛 수용체의 더욱 안정적인 및/또는 더욱 높은 발현)을 갖는 자연 발생 세포를 선별하는 단계를 포함한다. 특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 하나 이상의 미각 수용체 유전자 (가령, 단맛 수용체 유전자 또는 감칠맛 수용체 유전자)에서 자연 발생 변이체 또는 돌연변이를 갖는 세포를 선별하는 단계를 포함한다.
특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 유전자의 프로모터 영역에서 또는 유전자의 비-코딩 영역 (가령, 인트론, 5' 비번역 영역, 및/또는 3' 비번역 영역)에서 자연 발생 변이체 또는 돌연변이를 갖는 세포를 선별하는 단계를 포함한다. 유전자의 프로모터 영역에서 또는 유전자의 비-코딩 영역에서 변이체 또는 돌연변이는 유전자 산물의 더욱 높은 및/또는 더욱 안정적인 발현을 유발할 수 있다. 특정한 구체예에서, 유전자의 프로모터 영역 또는 유전자의 비-코딩 영역은 예로써, DNA의 메틸화 또는 아세틸화에 의해 변형된다. 특정한 구체예에서, 세포는 하나 이상의 목적되는 유전자에 대하여 염색질 재구성에 영향을 주는 후성 변형을 포함한다. 후성 변형의 무제한적 실례에는 아세틸화, 메틸화, 유비퀴틴화, 인산화 및 수모화 (sumoylation)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
일정한 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 전처리를 받은 세포를 선별하는 단계를 포함한다. 이런 전처리는 일광 또는 자외선 (UV) 광, 돌연변이원, 예를 들면, 에틸 메탄 설포네이트 (EMS), 그리고 화학적 작인에 노출일 수 있다. 특정한 구체예에서, 이런 전처리에는 바람직하지 않은 성장 조건, 예를 들면, 낮은 산소 또는 낮은 영양소 조건, 또는 독성 조건에 노출이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 방법은 하나 이상의 목적되는 유전자 (가령, 미각 수용체 아단위 유전자, 예를 들면, 단맛 수용체 아단위 유전자, 감칠맛 수용체 아단위 유전자, 또는 쓴맛 수용체 아단위 유전자)를 발현하는 분리된 세포 (가령, 진핵 세포)를 확인하고 및/또는 선별하는 것을 제공한다. 일정한 구체예에서, 목적되는 유전자는 유전적 변이성의 결과로서 다른 세포에서보다 높은 수준으로 발현된다. 특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 (a) 목적되는 RNA를 검출할 수 있는 (가령, 목적되는 RNA의 표적 서열에 혼성화될 수 있는) 하나 이상의 신호전달 프로브를 세포 (가령, 진핵 세포) 내로 도입하는 단계; 그리고 (b) 상기 세포 (가령, 진핵 세포)가 목적되는 RNA를 포함하는 지를 결정하는 단계를 포함한다. 이런 방법은 목적되는 RNA의 수준을 정량하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 원하는 RNA 발현 프로필을 갖는 세포를 확인하는 방법이 본 명세서에서 기술되고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 각각 목적되는 RNA를 검출할 수 있는 복수의 신호전달 프로브를 세포 (가령, 진핵 세포) 내로 도입하는 단계; 그리고 (b) 복수의 신호전달 프로브에 의해 검출된 RNA 수준을 정량하는 단계. 원하는 유전자 발현 프로필은 참고 개체군에 비교에 의해 결정될 수 있다.
특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 (a) 미각 수용체 (가령, 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체)의 RNA를 검출할 수 있는 하나 이상의 신호전달 프로브를 세포 (가령, 진핵 세포) 내로 도입하는 단계; 그리고 (b) 상기 세포 (가령, 진핵 세포)가 미각 수용체 (가령, 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체)의 RNA를 포함하는 지를 결정하는 단계를 포함한다. 이런 방법은 미각 수용체 (가령, 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체)의 RNA의 수준을 정량하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 원하는 RNA 발현 프로필을 갖는 세포를 확인하는 방법이 본 명세서에서 기술되고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 각각 복수의 목적되는 RNA를 검출할 수 있는 복수의 신호전달 프로브를 진핵 세포 (가령, 진핵 세포) 내로 도입하는 단계; 그리고 (b) 복수의 신호전달 프로브에 의해 검출된 RNA 수준을 정량하는 단계. 원하는 유전자 발현 프로필은 참고 개체군에 비교에 의해 결정될 수 있다. 특정한 구체예에서, 복수의 목적되는 RNA는 아래 RNA 중에서 임의의 조합을 포함할 수 있다: T1R1의 RNA, T1R2의 RNA, T1R3의 RNA, G 단백질의 RNA, 그리고 미각 수용체와 연관된 유전자의 RNA. 일정한 구체예에서, 복수의 목적되는 RNA는 T1R1의 RNA 및 T1R3의 RNA (그리고 선택적으로, G 단백질의 RNA)를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 목적되는 RNA는 T1R2의 RNA 및 T1R3의 RNA (그리고 선택적으로, G 단백질의 RNA)를 포함한다.
특정한 구체예에서, 이런 방법은 상기 세포의 정량된 RNA 수준을 각각, 참고 세포에서 RNA 수준과 비교하는 단계를 더욱 포함한다. 특정한 구체예에서, 복수의 신호전달 프로브는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 적어도 1000개의 신호전달 프로브를 포함한다. 일부 구체예에서, 목적되는 RNA는 번역된다. 다른 구체예에서, 목적되는 RNA는 번역되지 않는다. 특정한 구체예에서, 목적되는 RNA는 미각 수용체 아단위 유전자 (가령, 단맛 수용체 아단위 유전자, 감칠맛 수용체 아단위 유전자, 또는 쓴맛 수용체 아단위 유전자)에 의해 인코딩된다. 특정한 구체예에서, 분리된 세포 (가령, 진핵 세포)는 하나 이상의 목적되는 재조합 RNA를 발현한다.
특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 확인된 및/또는 선별된 진핵 세포는 유전적으로 조작되지 않는다 (가령, 하나 이상의 도입유전자를 재조합 방식으로 발현하지 않는다). 다른 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 확인된 및/또는 선별된 진핵 세포는 유전적으로 조작된다 (가령, 하나 이상의 도입유전자를 재조합 방식으로 발현한다). 특정한 구체예에서, 이런 세포는 체세포 또는 분화된 세포이다.
다른 구체예에서, 세포는 원하는 유전자 발현 프로필을 포함한다. 일정한 구체예에서, 원하는 유전자 발현 프로필은 유전자 조작에 의해, 또는 유전적 변이성을 증가시킴으로써 달성된다. 특정한 구체예에서, 원하는 유전자 발현 프로필은 참고 개체군의 것과의 비교에 기초하여 결정될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 평균 이종기원 세포 개체군에서보다 높은 수준으로 목적되는 RNA를 발현하는 세포를 확인하고 및/또는 선별한다. 일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 평균 이종기원 세포 개체군 (가령, 선별되지 않은 세포주 개체군, 예를 들면, 선별되지 않은 293T 세포주 개체군)에서보다 높은 수준으로 목적되는 RNA (가령, 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체의 RNA)를 발현하는 세포를 확인하고 및/또는 선별한다. 일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 평균 이종기원 세포 개체군 (가령, 선별되지 않은 세포주 개체군, 예를 들면, 선별되지 않은 293T 세포주 개체군)에서보다 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 높은 수준으로 목적되는 RNA (가령, 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체의 RNA)를 발현하는 세포를 확인하고 및/또는 선별한다. 일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 평균 이종기원 세포 개체군 (가령, 선별되지 않은 세포주 개체군, 예를 들면, 선별되지 않은 293T 세포주 개체군)에서보다 적어도 1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 높은 수준으로 목적되는 RNA (가령, 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체의 RNA)를 발현하는 세포를 확인하고 및/또는 선별한다.
특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 평균 이종기원 세포 개체군에서보다 낮은 수준으로 목적되는 RNA를 발현하는 세포를 확인하고 및/또는 선별한다. 예시적인 이종기원 세포 개체군은 상이한 기원의 혼성 세포 유형의 세포 개체군, 유전적으로 이종기원인 세포 유형의 세포 개체군, 또는 분리된 세포가 본 명세서에서 기술된 방법을 이용하여 획득되는 특정 세포주의 세포 개체군일 수 있다.
특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법을 이용하여 분리된 세포는 세포주로부터 세포 클론이다. 일정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법을 이용하여 분리된 세포는 일차 세포이다. 일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법을 이용하여 분리된 세포는 형질전환된 세포이다.
일정한 구체예에서, 세포는 인간 세포가 아니다. 특정한 구체예에서, 세포는 생쥐, 쥐, 원숭이, 개, 고양이, 돼지, 양, 염소, 말, 닭, 개구리, 벌레, 곤충 (가령, 파리), 어류, 조개, 또는 소로부터 유래된 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 포유동물 세포 또는 진핵 세포이다. 다른 구체예에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 일차 세포이다. 다른 구체예에서, 세포는 형질전환된 세포 또는 세포주의 세포 클론이다.
특정한 측면에서, 단맛 수용체 T1R2 아단위 및/또는 단맛 수용체 T1R3 아단위를 내생적으로 발현하는 세포를 분리하는 방법이 본 발명에서 제시되고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 세포 개체군을 제공하는 단계;
b) T1R2의 발현을 검출하는 신호전달 프로브 또는 분자 표지를 세포 내로 도입하고 및/또는 T1R3의 발현을 검출하는 분자 표지를 세포 내로 도입하는 단계; 그리고
c) 단맛 수용체 T1R2 아단위 및/또는 단맛 수용체 T1R3 아단위를 발현하는 세포를 분리하는 단계.
다른 특정한 측면에서, 단맛 수용체 T1R2 아단위 및 단맛 수용체 T1R3 아단위를 내생적으로 발현하는 세포를 분리하는 방법이 본 발명에서 제시되고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 세포 개체군을 제공하는 단계;
b) T1R2의 발현을 검출하는 분자 표지를 세포 내로 도입하고, 그리고 T1R3의 발현을 검출하는 분자 표지를 세포 내로 도입하는 단계; 그리고
c) 단맛 수용체 T1R2 아단위 및/또는 단맛 수용체 T1R3 아단위를 발현하는 세포를 분리하는 단계.
이런 방법의 특정한 구체예에서, 세포 개체군은 T1R2 또는 T1R3을 발현하는 것으로 알려져 있지 않다. 이런 방법의 다른 특정한 구체예에서, 분리된 세포에서 T1R2 또는 T1R3의 발현 수준은 상기 세포 개체군의 평균 세포에서보다 적어도 10배, 50배, 100배, 250배, 500배, 750배, 1000배, 2500배, 5000배, 7500배, 10000배, 50000배, 또는 적어도 100000배 높다. 미각 수용체 아단위, 예를 들면, T1R2 또는 T1R3의 발현 수준은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 이의 없이 결정될 수 있다.
특정한 측면에서, 감칠맛 수용체 T1R1 아단위 및/또는 감칠맛 수용체 T1R3 아단위를 내생적으로 발현하는 세포를 분리하는 방법이 본 발명에서 제시되고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 세포 개체군을 제공하는 단계;
b) T1R1의 발현을 검출하는 신호전달 프로브 또는 분자 표지를 세포 내로 도입하고 및/또는 T1R3의 발현을 검출하는 분자 표지를 세포 내로 도입하는 단계; 그리고
c) 감칠맛 수용체 T1R1 아단위 및/또는 감칠맛 수용체 T1R3 아단위를 발현하는 세포를 분리하는 단계.
다른 특정한 측면에서, 감칠맛 수용체 T1R1 아단위 및 감칠맛 수용체 T1R3 아단위를 내생적으로 발현하는 세포를 분리하는 방법이 본 발명에서 제시되고, 여기서 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 세포 개체군을 제공하는 단계;
b) T1R1의 발현을 검출하는 분자 표지를 세포 내로 도입하고, 그리고 T1R3의 발현을 검출하는 분자 표지를 세포 내로 도입하는 단계; 그리고
c) 감칠맛 수용체 T1R1 아단위 및/또는 감칠맛 수용체 T1R3 아단위를 발현하는 세포를 분리하는 단계.
이런 방법의 특정한 구체예에서, 세포 개체군은 T1R1 또는 T1R3을 발현하는 것으로 알려져 있지 않다. 이런 방법의 다른 특정한 구체예에서, 분리된 세포에서 T1R1 또는 T1R3의 발현 수준은 상기 세포 개체군의 평균 세포에서보다 적어도 10배, 50배, 100배, 250배, 500배, 750배, 1000배, 2500배, 5000배, 7500배, 10000배, 50000배, 또는 적어도 100000배 높다. 미각 수용체 아단위, 예를 들면, T1R1 또는 T1R3의 발현 수준은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 이의 없이 결정될 수 있다.
단백질 발현 수준을 결정하기 위한 방법의 무제한적 실례에는 면역블롯팅 (immunoblotting) (Western blotting), 유세포분석, 또는 ELISA가 포함된다. RNA 발현 수준을 결정하기 위한 방법의 무제한적 실례에는 노던 블롯팅 (Northern blotting), RT-PCR, 그리고 실시간 정량적 PCR이 포함된다. 이런 단백질 또는 RNA 발현 수준은 일반적으로, 세포 개체군에서 평균 발현 수준을 결정하기 위하여 세포 개체군에 대하여 결정될 수 있다.
이런 방법의 다른 특정한 구체예에서, 세포 개체군에서 유전적 변이성은 상기 분리 단계에 앞서, 증가되었다. 특정한 구체예에서, 이런 방법에 따라서 산출된 분리된 세포가 본 발명에서 제시된다.
쓴맛 수용체
본 출원은 하나 이상의 쓴맛 수용체를 발현하도록 조작된 신규한 세포와 세포주에 관계한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 신규한 세포 또는 세포주는 하나 이상의 기능적 쓴맛 수용체를 발현한다. 다른 측면에서, 본 발명에서는 이들 신규한 세포와 세포주를 만들고 이용하는 방법을 제시한다.
본 발명의 한 구체예에 따라서, 이들 신규한 세포와 세포주는 고유 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산으로 형질감염된다. 다른 구체예에서, 이들 신규한 세포와 세포주는 고유 쓴맛 수용체의 대립형질 변이체 (즉, 다형체), 또는 돌연변이 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산으로 형질감염된다. 본 발명의 신규한 세포주는 도입된 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현한다. 다른 구체예에서, 이들 신규한 세포와 세포주는 유전자 활성화에 의한 발현을 위하여 활성화된 쓴맛 수용체를 보유한다.
특정 구체예에서, 이들 신규한 세포와 세포주는 조작된 유전자 활성화, 다시 말하면, 내생적 유전자의 발현의 활성화의 결과로서 내생적 쓴맛 수용체를 발현하고, 여기서 이러한 활성화는 적절한 처리가 없으면 세포에서 자연적으로 발생하지 않는다. 조작된 유전자 활성화는 예로써, 내생적 쓴맛 수용체가 적절한 처리가 없으면 세포주에서 발현되지 않는 경우에, 내생적 쓴맛 수용체의 발현을 작동시킬 수 있다. 대안으로, 조작된 유전자 활성화는 예로써, 세포주에서 내생적 유전자의 발현 수준이 적절한 처리가 없으면 바람직하지 않게 낮은 경우에, 예를 들면, 상기 세포주에서 쓴맛 수용체의 기능 분석에 충분하지 않은 경우에, 내생적 쓴맛 수용체의 증가된 발현 수준을 유발할 수 있다. 대안으로, 조작된 유전자 활성화는 예로써, 세포주로부터 내생적 쓴맛 수용체를 분리하기 위하여 내생적 쓴맛 수용체를 과다-발현하는데 이용될 수 있다. 조작된 유전자 활성화는 당업자에게 공지된 다수의 수단에 의해 달성될 수 있다. 가령, 유전자 전사의 하나 이상의 전사 인자 또는 교차활성인자 (transactivator)는 예로써, 전사 인자 또는 교차활성인자를 발현하는 핵산을 구조성 또는 유도성 프로모터의 제어 하에 세포 내로 도입함으로써 과다-발현되거나, 또는 발현이 유도될 수 있다. 내생적 유전자가 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 것으로 알려지면, 발현은 세포를 유전자의 공지된 유도인자 (inducer)에 노출시킴으로써 유도될 수 있다. 이에 더하여, 게놈 내에서 증가된 사본 수에 기인한 유전자의 증가된 발현 수준을 획득하기 위하여, 내생적 유전자 그 자체를 인코딩하는 핵산이 세포 내로 도입될 수 있다. 더 나아가, 세포에 의해 발현되는 내생적 유전자의 발현의 일정한 공지된 저해제가 당분야에 공지된 기술, 예를 들면, RNAi를 이용하여 세포 내에서 녹다운 (knock down) 또는 심지어, 녹아웃 (knock out)되고, 따라서 상기 내생적 유전자의 발현이 증가할 수 있다.
쓴맛 수용체, 이의 돌연변이 형태, 또는 이의 자연-발생 대립형질 변이체를 포함하는 본 발명의 세포와 세포주는 특정 쓴맛 수용체 돌연변이 형태 또는 자연-발생 대립형질 변이체에 특이적인 조절제를 비롯한 쓴맛 수용체 기능의 조절제를 확인하는데 이용될 수 있다. 이들 세포와 세포주는 따라서, 쓴맛 수용체의 개별 고유 또는 돌연변이 형태 또는 자연-발생 대립형질 변이체의 특성, 활성 및 역할에 관한 정보를 획득하고, 그리고 특정 고유 또는 돌연변이 형태 또는 자연-발생 대립형질 변이체, 또는 고유 또는 돌연변이 형태 또는 자연-발생 대립형질 변이체의 부분집합에 대한 활성을 갖는 쓴맛 수용체 조절제를 확인하는데 이용될 수 있다. 이들 조절제는 질병 상태 또는 조직에서 변형된 쓴맛 수용체 형태를 차별적으로 표적화하는 치료제로서 유용하다. 생체내에서 쓴맛 수용체의 다형체는 예로써, 바람직하지 않은 활성 또는 질병 상태의 원인이 될 수 있기 때문에, 본 발명의 세포와 세포주는 또한, 돌연변이 형태 또는 자연-발생 대립형질 변이체의 반응의 변경이 요망되는 치료 용도를 위한 조절제를 스크리닝하는데 이용될 수 있다.
이들 세포와 세포주는 또한, 쓴맛 수용체의 고유 또는 돌연변이 형태 또는 자연-발생 대립형질 변이체의 부분집합에만 활성을 갖는 조절제를 확인하는데 유용하다.
본 발명에서는 또한, 안정적인 쓴맛 수용체 발현 세포와 세포주를 산출할 때 어려움을 확인하고 해결한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 태그표식된 쓴맛 수용체의 발현은 쓴맛 수용체 작동약의 부정확한 지정을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 특정한 태그, 신호 서열 및/또는 샤프롱이 쓴맛 수용체의 발현 및/또는 세포 표면으로의 수송에 필수적인 것으로 생각되었다 (Reichling, Meyerhof and Behrens, J. Neurochem. 106:1138-1148, 2008). 이는 딜레마를 초래하고, 그리고 태그표식된 수용체의 생리학적으로 무관한 조절제의 확인을 유발할 수 있다. 따라서 본 발명의 생리학적으로 적절한 세포주는 또한, 고아 쓴맛 수용체에 대한 리간드의 확인, 그리고 다양한 수용체-리간드 상호작용의 특이성의 분석을 용이하게 할 수 있다.
첫 번째 측면에서, 본 발명에서는 하나 이상의 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포와 세포주를 제공한다. 일부 구체예에서, 발현된 쓴맛 수용체는 작동약에 의한 활성화 시에 세포내 유리 칼슘을 증가시킨다. 일부 구체예에서, 강화제, 작동약 또는 활성제는 소형 분자, 화학적 모이어티, 폴리펩티드, 항체, 또는 식품 추출물일 수 있다. 다른 구체예에서, 발현된 쓴맛 수용체는 길항약에 의한 저해 시에 세포내 유리 칼슘을 감소시킨다. 일부 구체예에서, 저해제, 길항약 또는 차단제는 소형 분자, 화학적 모이어티, 폴리펩티드, 항체, 또는 식품 추출물일 수 있다. 강화제, 작동약, 활성제, 저해제, 길항약 또는 차단제는 모든 쓴맛 수용체 또는 쓴맛 수용체의 특정한 부분집합에서 기능할 수 있다. 진전된 구체예에서, 본 발명의 쓴맛 수용체 발현 세포와 세포주는 전통적인 방법에 의해 만들어진 세포와 세포주와 비교하여 증진된 특성을 갖는다. 가령, 쓴맛 수용체 발현 세포와 세포주는 발현의 증진된 안정성을 갖고 (예로써, 선별적 항생제 없이 배양 동안 유지될 때에도), 그리고 높은 Z' 값을 산출한다. 다른 측면에서, 본 발명에서는 쓴맛 수용체 발현 세포와 세포주를 만들고 이용하는 방법을 제시한다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200일 또는 그 이상 동안 일관된 발현 수준으로 쓴맛 수용체를 발현하고, 여기서 일관된 발현은 2 내지 4일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 이상; 5 내지 15일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10% 또는 12% 이상; 16 내지 20일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% 또는 20% 이상; 21 내지 30일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22% 또는 24% 이상; 30 내지 40일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 41 내지 45일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 45 내지 50일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 45 내지 50일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28%, 30% 또는 35% 이상; 50 내지 55일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 이상; 50 내지 55일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28%, 30% 또는 35% 이상; 55 내지 75일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이상; 75 내지 100일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 101 내지 125일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 126 내지 150일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 151 내지 175일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 176 내지 200일의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상; 200일 이상의 연속 세포 배양 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45% 이상 변하지 않는 발현 수준을 지칭한다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 세포 또는 세포주에 의해 발현된 쓴맛 수용체는 쥐, 생쥐, 토끼, 염소, 개, 소, 돼지 또는 영장류를 비롯한 임의의 포유동물로부터 유래될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 쓴맛 수용체는 인간 쓴맛 수용체이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 인간 TAS2R1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 51); 인간 TAS2R3을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 52); 인간 TAS2R4을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 53); 인간 TAS2R5를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 54); 인간 TAS2R7을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 55); 인간 TAS2R8을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 56); 인간 TAS2R9를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 57); 인간 TAS2R10을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 58); 인간 TAS2R13을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 59); 인간 TAS2R14를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 60); 인간 TAS2R16을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 61); 인간 TAS2R38을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 62); 인간 TAS2R39를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 63); 인간 TAS2R40을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 64); 인간 TAS2R41를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 65); 인간 TAS2R43을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 66); 인간 TAS2R44를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 67); 인간 TAS2R45를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 68); 인간 TAS2R46을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 69); 인간 TAS2R47을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 70); 인간 TAS2R48을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 71); 인간 TAS2R49를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 72); 인간 TAS2R50을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 73); 인간 TAS2R55를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 74); 인간 TAS2R60을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 75); 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 인간 TAS2R1 (서열 번호 77); 인간 TAS2R3 (서열 번호 78); 인간 TAS2R4 (서열 번호 79); 인간 TAS2R5 (서열 번호 80); 인간 TAS2R7 (서열 번호 81); 인간 TAS2R8 (서열 번호 82); 인간 TAS2R9 (서열 번호 83); 인간 TAS2R10 (서열 번호 84); 인간 TAS2R13 (서열 번호 85); 인간 TAS2R14 (서열 번호 86); 인간 TAS2R16 (서열 번호 87); 인간 TAS2R38 (서열 번호 88); 인간 TAS2R39 (서열 번호 89); 인간 TAS2R40 (서열 번호 90); 인간 TAS2R41 (서열 번호 91); 인간 TAS2R43 (서열 번호 92); 인간 TAS2R44 (서열 번호 93); 인간 TAS2R45 (서열 번호 94); 인간 TAS2R46 (서열 번호 95); 인간 TAS2R47 (서열 번호 96); 인간 TAS2R48 (서열 번호 97); 인간 TAS2R49 (서열 번호 98); 인간 TAS2R50 (서열 번호 99); 인간 TAS2R55 (서열 번호 100); 인간 TAS2R60 (서열 번호 101); 또는 이들의 임의의 조합에 대한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산은 게놈 DNA 또는 cDNA일 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 핵산은 야생형 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산 서열과 비교하여, 아미노산 치환을 유발하거나 유발하지 않는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 다른 구체예에서, 이들 핵산은 소정의 개체군에서 일정한 쓴맛 수용체를 인코딩하는 가장 빈번하게 발생하는 핵산 서열과 비교하여 하나 이상의 자연-발생 대립형질 변이체를 포함한다. 자연-발생 대립형질 변이체"는 자연-발생하는 동일한 쓴맛 수용체의 상이한 아미노산 서열, 예를 들면, 대립형질 변이 또는 다형성에 기인한 소정의 개체군에서 관찰되는 것들을 포함한다.
다형성은 인간 게놈에서 일반적인 현상이다. 쓴맛 수용체 유전자 내에 또는 주변에 발생하는 다형성은 예로써, 그들의 발현 수준을 상향 조절 또는 하향 조절함으로써, 또는 그들의 아미노산 서열을 변화시킴으로써 그들의 발현에 영향을 주거나, 또는 그들의 기능을 변화시킨다. 표 20에서는 인간 TAS2R 유전자에 관련된 단일 뉴클레오티드 다형체 ("SNP"), 각 참고 서열에서 이들 SNP의 위치, 그리고 이들 SNP에 관한 설명을 비롯하여, 독특한 다형체에 대한 참고 번호를 제시한다. 이들 참고 번호는 National Center for Biotechnology Information ("NCBI"; Bethesda, MD)의 단일 뉴클레오티드 다형체 데이터베이스 ("dbSNP")에서 검색가능하다.
코딩 서열 다양성을 유발하는 인간 쓴맛 수용체 유전자의 대립형질 변이는 연구되고 상세하게 보고되었다 (참조: Ueda et al., "Identification of coding single-nucleotide polymorphisms in human taste receptor gene involving bitter tasting", Biochem Biophys Res Commun 285:147-151, 2001; Wooding et al., "Natural selection and molecular evolution in PTC, a bitter-taste receptor gene," Am. J. Hum, Genet. 74:637-646, 2004; 그리고 Kim et al., "Worldwide haplotype diversity and coding sequence variation at human bitter taste receptor loci", Human Mutation 26:199-204, 2005). 표 21은 상이한 인간 쓴맛 수용체의 코딩 서열에서 자연 변형의 목록이다. 이들 인간 쓴맛 수용체, 그들의 코딩 서열의 서열 번호, 그리고 단백질 서열은 첫 3개의 칼럼에서 열거된다. 서열 번호에 의해 확인된 각 코딩 서열 내에서 뉴클레오티드 변화 및 그들의 위치는 각각, "뉴클레오티드 변화" 및 "뉴클레오티드 변화의 위치" 칼럼에서 지시된다. 서열 번호에 의해 확인된 각 쓴맛 수용체 내에 아미노산 변화는 1-문자 약어를 이용하여 "설명" 칼럼에서 지시된다. 각각의 상응하는 서열 번호에 관련하여 그들의 위치는 "아미노산 변화의 위치" 칼럼에서 지시된다. 이에 더하여, "설명" 칼럼은 NCBI의 dbSNP에서 검색가능한 이들 변형의 식별자를 포함한다. "특징 식별자"는 European Bioinformatics Institute (Cambridge, United Kingdom)에 의해 주도되는 UniProt Protein Knowledgebase에 의해 이들 변형 중에서 일부에 지정된 독특하고 안정적인 특징 식별자이다. 이들은 UniProt에서 검색가능하다. "NA"는 UniProt에 의해 지정된 특징 식별자가 아직 없음을 표시한다.
인간 미각에서 변화는 충분히 공지된 현상이다. 이론에 한정됨 없이, 쓴맛의 변화는 쓴맛 수용체의 다형성에 관련될 수 있다. 가령, 페닐티오카르바미드 (PTC)에 대한 수용체인 hTAS2R38에서 다형성은 프로필티오우라실 (propylthiouracil, PROP)을 검출하는 능력에 연관되었다 (Kim et al., "Positional cloning of the human quantiative trait locus underlying taste sensitivity to phenylthiocarbamide", Science 299:1221-1225, 2003; Wooding et al., 2004). hT2R43 유전자 대립유전자에서 일정한 다형체는 사람들을 자연 식물 화합물 앨로인 (aloin) 및 아리스토로킥산 (aristolochic acid)의 쓴맛에 매우 민감하게 만든다. 이러한 대립유전자를 보유하지 않는 사람들은 낮은 농도에서 이들 화합물의 맛을 느끼지 못한다. 동일한 hTAS2R43 유전자 대립유전자의 일정한 변형은 사람들을 사카린의 쓴맛에 더욱 민감하게 만든다. 이에 더하여, 밀접하게 관련된 유전자 (hTAS2R44) 대립유전자의 일정한 변형 역시 사람들을 사카린의 쓴맛에 더욱 민감하게 만든다. 게다가, 일부 사람들은 일정한 hTAS2R 유전자를 보유하지 않고, 이는 개체 간에 미각 변화의 원인이다. 쓴맛 유전자에서 다형체는 또한, 일정한 질환의 증가된 위험과 연관된다.
이종기원 자연-발생 쓴맛 수용체, 또는 이의 대립형질 변이체 또는 다형체를 안정적으로 발현하는 세포주, 또는 자연-발생이 아닌 하나 이상의 돌연변이 (가령, 무작위 돌연변이 또는 특정 부위 돌연변이)를 보유하는 이들의 돌연변이 형태는 모두 본 발명의 범위 내에 있다.
일부 구체예에서, 핵산은 상기에 제시된 핵산 서열의 단편이다. 단편이거나, 또는 이런 변형을 보유하는 쓴맛 수용체는 쓴맛 수용체의 적어도 한 가지의 생물학적 특성, 예를 들면, 세포내 유리 칼슘을 증가시키는 능력을 유지한다. 본 발명은 본 명세서에서 기술된 서열에 적어도 대략 85% 동일한 쓴맛 수용체-인코딩 뉴클레오티드 서열을 안정적으로 발현하는 세포와 세포주를 포함한다. 일부 구체예에서, 아단위-인코딩 서열 동일성은 본 명세서에서 기술된 아단위 서열과 비교하여 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이다. 본 발명은 또한, 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산이 엄격한 조건 하에, 상응하는 쓴맛 수용체를 인코딩하는 본 명세서에서 기술된 핵산에 혼성화되는 세포와 세포주를 포함한다.
일부 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 본 발명에서 제시된 서열과 비교하여, 적어도 1개 내지 10, 20, 30, 또는 40개 이하의 뉴클레오티드, 또는 상기 뉴클레오티드 서열 또는 그것에 실질적으로 동일한 서열 (가령, 그것에 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열, 또는 엄격한 조건 하에 이들 서열에 혼성화될 수 있는 서열)로부터 최대 1%, 5%, 10% 또는 20%의 치환을 포함하는 쓴맛 수용체-인코딩 핵산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 세포 또는 세포주는 본 발명에서 제시된 서열로부터, 10, 20, 30, 또는 40개 이하의 뉴클레오티드, 또는 상기 뉴클레오티드 서열 또는 그것에 실질적으로 동일한 서열 (가령, 그것에 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열, 또는 엄격한 조건 하에 이들 서열에 혼성화될 수 있는 서열)로부터 최대 1%, 5%, 10% 또는 20%의 삽입 또는 결실을 포함하는 쓴맛 수용체-인코딩 핵산 서열을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 이들 치환, 삽입 및 결실은 본 발명의 세포 또는 세포주에서 쓴맛 수용체를 인코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드에서 발생할 수 있다.
일부 구체예에서, 핵산 치환 또는 변형이 아미노산 변화, 예를 들면, 아미노산 치환을 유발하는 경우에, 고유 아미노산이 보존성 또는 비-보존성 치환에 의해 대체될 수 있다. 일부 구체예에서, 최초 폴리펩티드 서열과 변형된 폴리펩티드 서열 사이에 서열 동일성은 상기 폴리펩티드 서열, 또는 그것에 실질적으로 동일한 서열 (가령, 그것에 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열)로부터 대략 1%, 5%, 10% 또는 20% 다를 수 있다. 당업자는 보존성 아미노산 치환이 아미노산 측쇄가 구조 및/또는 화학적 특성에서 유사한 치환이고, 그리고 이러한 치환이 부모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다는 것을 이해할 것이다. 돌연변이를 포함하는 핵산을 포함하는 구체예에서, 이러한 돌연변이는 무작위 돌연변이 또는 특정 부위 돌연변이일 수 있다.
보존성 변형은 변형되지 않은 쓴맛 수용체의 것들과 유사한 기능적 및 화학적 특징을 갖는 쓴맛 수용체를 생산할 것이다. "보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 부모 아미노산 잔기에 유사한 화학적 특성 (가령, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 R 기를 보유하는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존성 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존성 치환에 의해 서로 달라지는 경우에, 서열 동일성 비율 또는 유사성 정도는 이러한 치환의 보존성을 보완하기 위하여 상향 조정될 수 있다. 이러한 조정을 달성하는 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있다 (참조: Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994)).
유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 보유하는 아미노산 그룹의 실례에는 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 그리고 이소류신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린과 트레오닌; 3) 아미드-포함 측쇄: 아스파라긴과 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 그리고 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 그리고 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파라긴산과 글루타민산; 그리고 7) 황-포함 측쇄: 시스테인과 메티오닌이 포함된다. 선호되는 보존성 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트, 그리고 아스파라긴-글루타민이다. 대안으로, 보존성 아미노산 치환은 Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992)에서 기술된 PAM250 대수-우도 행렬 (log-likelihood matrix)에서 양성 값을 갖는 임의의 변화이다. "중간 정도로 보존성" 치환은 PAM250 대수-우도 행렬에서 비-음성 값을 갖는 임의의 변화이다.
일부 구체예에서, 쓴맛 수용체-인코딩 핵산 서열은 태그 (tag)를 더욱 포함한다. 이런 태그는 예로써, HIS 태그, myc 태그, 적혈구응집소 (hemagglutinin, HA) 태그, 단백질 C, VSV-G, FLU, 황색 형광 단백질 (YFP), 녹색 형광 단백질, FLAG, BCCP, 말토오스 결합 단백질 태그, Nus-태그, Softag-1, Softag-2, Strep-태그, S-태그, 티오레독신 (thioredoxin), GST, V5, TAP 또는 CBP를 인코딩할 수 있다. 태그는 쓴맛 수용체 발현 수준, 세포내 국부화, 단백질-단백질 상호작용, 쓴맛 수용체의 조절, 또는 쓴맛 수용체의 기능을 결정하기 위한 마커로서 이용될 수 있다. 태그는 또한, 쓴맛 수용체를 정제하거나 분별하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 태그는 이러한 태그가 태그표식된 쓴맛 수용체로부터 절단가능하다. 이는 예로써, 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산 내에서 태그와 쓴맛 수용체 사이에 특정한 프로테아제 절단 부위를 도입하고, 그리고 상기 핵산에 의해 발현된 태그표식된 쓴맛 수용체를 특정한 프로테아제의 처리에 종속시킴으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 세포 또는 세포주를 생산하는데 이용되는 호스트 세포는 그들의 고유 상태에서 하나 이상의 내생적 쓴맛 수용체를 발현하거나, 또는 임의의 쓴맛 수용체의 발현이 없을 수 있다. 이러한 세포 또는 세포주가 "내생적" 쓴맛 수용체로 지칭되는 고유의 쓴맛 수용체 중에서 하나 이상을 발현하는 경우에, 이러한 이종기원 쓴맛 수용체는 세포 또는 세포주의 내생적 쓴맛 수용체(들) 중에서 하나와 동일할 수 있다. 가령, 세포 또는 세포주에 내생적인 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산은 도입된 핵산이 없을 때보다 높은 수준으로 쓴맛 수용체가 세포 또는 세포주에서 발현되도록 상기 세포 또는 세포주에서 쓴맛 수용체를 인코딩하는 유전자의 사본 수를 증가시키기 위하여, 세포 또는 세포주 내로 도입될 수 있다. 호스트 세포는 일차 세포, 생식 세포, 또는 배아 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포일 수 있다. 호스트 세포는 또한, 영속화 세포일 수 있다. 일차 또는 영속화 호스트 세포는 진핵 생명체의 중배엽, 외배엽 또는 내배엽 층으로부터 유래될 수 있다. 호스트 세포는 내피, 외피, 중간엽, 신경, 신장, 간, 조혈, 또는 면역 세포일 수 있다. 가령, 호스트 세포는 장내 장샘 또는 융모 세포, 클라라 세포, 결장 세포, 장내 세포, 배상 세포, 창자크롬친화 세포, 장내분비 세포일 수 있다. 호스트 세포는 진핵, 원핵, 포유동물, 인간, 영장류, 소, 돼지, 고양이, 설치류, 유대류, 뮤린 또는 기타 세포일 수 있다. 호스트 세포는 또한, 비-포유동물, 예를 들면, 효모, 곤충, 진균류, 식물, 하등 진핵생물 및 원핵생물일 수 있다. 이런 호스트 세포는 표적과 상호작용하는 세포에 의해 제공되는 발현 산물의 부재에 대한 더욱 높은 가능성과 함께, 쓴맛 수용체 조절제를 조사하기 위한 더욱 분기성인 배경을 제공할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 호스트 세포는 포유동물 세포이다. 본 발명의 세포 또는 세포주를 생산하는데 이용될 수 있는 호스트 세포의 실례에는 인간 배아 신장-293T 세포, 확립된 뉴런 세포주, 크롬친화세포종, 신경아세포종 섬유아세포, 횡문근육종, 척수신경절 세포, NS0 세포, CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), L-세포, HEK-293 (ATCC CRL1573)과 PC12 (ATCC CRL-1721), HEK293T (ATCC CRL-11268), RBL (ATCC CRL-1378), SH-SY5Y (ATCC CRL-2266), MDCK (ATCC CCL-34), SJ-RH30 (ATCC CRL-2061), HepG2 (ATCC HB-8065), ND7/23 (ECACC 92090903), CHO (ECACC 85050302), Vero (ATCC CCL 81), Caco-2 (ATCC HTB 37), K562 (ATCC CCL 243), Jurkat (ATCC TIB-152), Per.C6 (Crucell, Leiden, The Netherlands), Huvec (ATCC 인간 일차 PCS 100-010, 생쥐 CRL 2514, CRL 2515, CRL 2516), HuH-7D12 (ECACC 01042712), 293 (ATCC CRL 10852), A549 (ATCC CCL 185), IMR-90 (ATCC CCL 186), MCF-7 (ATC HTB-22), U-2 OS (ATCC HTB-96), T84 (ATCC CCL 248), 또는 임의의 확립된 세포주 (극성 또는 비극성) 또는 American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Blvd. Manassas, Va. 20110-2209 USA) 또는 European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury Wiltshire SP4 0JG England)와 같은 기탁기관으로부터 입수가능한 임의의 세포주가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
한 구체예에서, 호스트 세포는 유전자도입 동물의 산출을 위한 기초로서 이용되는 배아 줄기 세포이다. 일정한 구체예에서, 하나 이상의 쓴맛 수용체는 원하는 시간적 및/또는 조직 특이적 발현으로 발현될 수 있다. 적어도 하나의 쓴맛 수용체, 그리고 바람직하게는, 기능적 이종기원 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하는 배아 줄기 세포가 생명체 내로 직접적으로 이식되거나, 또는 그들의 핵이 다른 수용자 세포 내로 이동되고 이들 세포가 이후, 이식되거나, 또는 이들이 유전자도입 동물을 산출하는데 이용될 수 있다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 선택된 호스트 세포와 함께 이용하기 적합한 임의의 벡터는 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 쓴맛 수용체 인코딩 핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있는 벡터의 실례에는 플라스미드, 레트로바이러스와 렌티바이러스를 비롯한 바이러스, 코스미드, 인공 염색체가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 그리고 예로써, pCMVScript, pcDNA3.1 Hygro, pcDNA3.1neo, pcDNA3.1puro, pSV2neo, pIRES puro, pSV2 zeo, pFN11A (BIND) Flexi®, pGL4.31, pFC14A (HaloTag® 7) CMV Flexi®, pFC14K (HaloTag® 7) CMV Flexi®, pFN24A (HaloTag® 7) CMVd3 Flexi®, pFN24K (HaloTag® 7) CMVd3 Flexi®,HaloTag™ pHT2, pACT, pAdVAntage™, pALTER®-MAX, pBIND, pCAT®3-Basic, pCAT®3-Control, pCAT®3-Enhancer, pCAT®3-Promoter, pCI, pCMVTNT™, pG5luc, pSI, pTARGET™, pTNT™, pF12A RM Flexi®, pF12K RM Flexi®, pReg neo, pYES2/GS, pAd/CMV/V5-DEST Gateway® 벡터, pAd/PL-DEST™ Gateway® 벡터, Gateway® pDEST™27 벡터, Gateway® pEF-DEST51 벡터, Gateway® pcDNA™-DEST47 벡터, pCMV/Bsd 벡터, pEF6/His A, B, & c, pcDNA™6.2-DEST, pLenti6/TR, pLP-AcGFP1-C, pLPS-AcGFP1-N, pLP-IRESneo, pLP-TRE2, pLP-RevTRE, pLP-LNCX, pLP-CMV-HA, pLP-CMV-Myc, pLP-RetroQ, pLP-CMVneo가 포함된다. 일부 구체예에서, 이들 벡터는 발현 제어 서열, 예를 들면, 구조성 또는 조건부 프로모터를 포함한다. 당업자는 이런 서열을 선택할 수 있을 것이다. 가령, 적절한 프로모터에는 CMV, TK, SV40 및 EF-1α가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일부 구체예에서, 이들 프로모터는 유도성, 온도 조절된, 조직 특이적, 억제성, 열-쇼크, 발달성, 세포 계통 특이적, 또는 일시적 프로모터, 또는 이들 중에서 한 가지 이상의 변형되지 않은 또는 돌연변이된, 무작위화된, 뒤섞인 서열의 조합 또는 재조합이다. 다른 구체예에서, 쓴맛 수용체는 유전자 활성화에 의해 또는 쓴맛 수용체를 인코딩하는 유전자가 에피솜일 때 발현된다. 쓴맛 수용체, 또는 이들의 돌연변이 형태 또는 자연-발생 대립형질 변이체를 인코딩하는 RNA는 바람직하게는, 구조성으로 발현된다.
일부 구체예에서, 벡터는 선별가능 마커 또는 약물 내성 유전자가 없다. 다른 구체예에서, 벡터는 선택적으로, 선별가능 마커, 예를 들면, 약물 또는 항생제 내성을 공여하는 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 선별 압력은 원하는 서열 또는 형질을 갖는 세포를 선별하기 위하여 세포 배양액에 적용될 수 있고, 그리고 통상적으로, 목적되는 폴리펩티드의 발현을 상응하는 선별적 작인 또는 압력에 세포 내성을 제공하는 선별 마커의 발현과 결부함으로써 달성된다. 항생제 선별에는 제한 없이, 항생제 (가령, 퓨로마이신, 네오마이신, G418, 하이그로마이신, 블레오마이신 등)의 이용이 포함된다. 비-항생제 선별에는 제한 없이, 영양소 결핍의 이용, 선별적 온도에 노출, 그리고 돌연변이유발성 조건에 노출이 포함되고, 여기서 선별 마커는 예로써, 글루타민 합성효소, 디히드로엽산 환원효소 (dihydrofolate reductase, DHFR), 우아바인 (oabain), 티미딘 키나아제 (TK), 하이포크산틴 구아닌 포스포로리보실트랜스퍼라아제 (HGPRT)일 수 있다. 상이한 쓴맛 수용체를 인코딩하는 서열에 대한 각 벡터는 동일한 또는 상이한 약물 내성 또는 기타 선별가능 마커를 보유할 수 있다. 하나 이상의 약물 내성 마커가 동일하면, 약물의 수준을 증가시킴으로써 동시 선별이 달성될 수 있다. 적절한 마커는 당업자에게 공지되어 있고, 그리고 여기에는 네오마이신/G418, 퓨로마이신, 하이그로마이신, 제오신, 메토트렉세이트 및 블라스티시딘 중에서 임의의 한 가지에 대한 내성을 공여하는 유전자가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 비록 약물 선별 (또는 임의의 다른 적절한 선별 마커를 이용한 선별)이 필수적인 단계가 아니긴 하지만, 이는 안정적으로 형질감염된 세포에 대한 형질감염된 세포 개체군을 농축하는데 이용될 수 있고, 단서로써 이들 형질감염된 구조체는 약물 내성을 공여하도록 설계된다. 쓴맛 수용체를 발현하는 세포의 차후 선별이 신호전달 프로브를 이용하여 달성되면, 형질감염 이후에 너무 이른 선별은 단지 일시적으로 형질감염되고 안정적으로 형질감염되지 않은 다소의 양성 세포를 유발할 수 있다. 하지만, 이러한 효과는 형질감염된 세포에서 일시적인 발현의 희석을 가능하게 하는 충분한 세포 계대배양을 허용함으로써 최소화될 수 있다.
일부 구체예에서, 벡터는 RNA 태그 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. "태그 서열"은 신호전달 프로브에 의해 검출되는 발현된 RNA 또는 RNA의 일부인 핵산 서열을 지칭한다. 신호전달 프로브는 다양한 RNA 서열을 검출할 수 있다. 이들 중에서 임의의 RNA가 태그로서 이용될 수 있다. 신호전달 프로브는 태그 서열에 상보적인 부분을 포함하도록 상기 프로브를 설계함으로써 RNA 태그에 지향될 수 있다. 특정한 구체예에서, 신호전달 프로브는 RNA의 동일한 또는 상이한 코딩 엑손, 비-코딩 인트론 또는 비-코딩 비번역 서열 내에 서열에 지향된다 (가령, 상보적이다). 특정한 구체예에서, 신호전달 프로브는 쓴맛 수용체의 신호전달 경로를 비롯한 신호전달 경로의 성분의 RNA에 지향될 수 있다. 태그 서열은 공동-전사되고 신호전달 프로브 결합을 위한 표적 서열을 포함하는 플라스미드의 3' 비번역 영역일 수 있다. 목적되는 유전자를 인코딩하는 RNA는 태그 서열을 포함하거나, 또는 태그 서열은 5'-비번역 영역 또는 3'-비번역 영역 내에 위치할 수 있다. 일부 구체예에서, 태그는 목적되는 유전자를 인코딩하는 RNA와 함께 존재하지 않는다. 태그 서열은 생산된 단백질에 태그표식을 원하는 지의 여부에 따라, 유전자의 메시지의 단백질-코딩 부분과의 프레임 (frame) 내부에 또는 외부에 존재할 수 있다. 따라서 태그 서열은 신호전달 프로브에 의한 검출을 위하여 번역될 필요가 없다. 태그 서열은 동일하거나 상이한 복수 표적 서열을 포함할 수 있고, 여기서 하나의 신호전달 프로브가 각 표적 서열에 혼성화 (hybridization)된다. 태그 서열은 이차 구조를 갖는 RNA를 인코딩할 수 있다. 상기 구조는 3개의 팔 연접 구조일 수 있다. 본 발명에 이용될 수 있고, 그리고 신호전달 프로브가 준비될 수 있는 태그 서열의 실례에는 에피토프 태그의 RNA 전사체, 예를 들면, HIS 태그, myc 태그, 적혈구응집소 (HA) 태그, 단백질 C, VSV-G, FLU, 황색 형광 단백질 (YFP), 녹색 형광 단백질 (GFP), FLAG, BCCP, 말토오스 결합 단백질 태그, Nus-태그, Softag-1, Softag-2, Strep-태그, S-태그, 티오레독신, GST, V5, TAP 또는 CBP가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 당업자는 그 자신의 RNA 태그 서열을 산출할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명의 세포와 세포주는 G 단백질을 안정적으로 발현한다. G 단백질의 2가지 일족, 이종삼합체성 G 단백질 및 단일체성 G 단백질이 존재한다. 이종삼합체성 G 단백질은 G 단백질 결합된 수용체 ("GPCR")에 의해 활성화되고, 그리고 3가지 아단위: Gα, G β 및 Gγ를 포함한다. 본 명세서에서, 용어 G 단백질은 3가지 아단위를 모두 보유하는 이종삼합체성 G 단백질뿐만 아니라 이들 아단위 중에서 임의의 한 가지, 예를 들면, Gα, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 비활성 상태에서, Gα, G β 및 Gγ 는 삼합체 (trimer)를 형성한다. β 및 γ 아단위는 서로 가깝게 결합되고 베타-감마 복합체로 지칭된다. Gα는 GPCR에 리간드 결합후 Gβγ로부터 분리된다. Gβγ 복합체는 GDP-GTP 교환후 Gα 아단위로부터 방출된다. Gβγ 복합체는 다른 두 번째 메신저 또는 게이트 이온 채널을 활성화시킬 수 있다. G 알파의 4가지 일족에는 아데닐레이트 사이클라아제를 활성화시킴으로써 cAMP 합성을 증가시키는 Gs (자극); 아데닐레이트 사이클라아제를 저해하는 Gi (저해); 다양한 세포 이동 과정 (즉, 세포골격, 세포 연접)을 조절하는 G12/13 집단; 그리고 칼슘 신호전달 및 포스포리파아제 C를 자극하는 Gq가 포함된다. 이들 단일체성 G 단백질은 이종삼합체성 G 단백질의 α 아단위에 이종동형이다. 임의의 G 단백질은 트랜스듀신 (가령, GNAT1, GNAT2, 그리고 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 G(t)), 거스트듀신 (가령, GNAT3 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 및 α 트랜스듀신 3), 인간 GNA15 (구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 (G 단백질) α15 (Gq 부류; 동의어 GNA16) 및 생쥐 Gα15, 그리고 그들의 키메라 단백질, 예를 들면, Gα15-GNA15 (일명 Gα15-Gα16)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 본 발명의 세포 또는 세포주에서 발현될 수 있다. 바람직한 구체예에서, G 단백질은 생쥐 Gα15 (서열 번호 102)이다. 다른 바람직한 구체예에서, G 단백질은 인간 GNA15 (서열 번호 50)이거나, 또는 서열 번호 76을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된 인간 G 단백질이다. G 단백질은 또한, 임의의 포유동물 G 단백질, 예를 들면, 표 7에 열거된 임의의 포유동물 G 단백질일 수 있다. 세포에 의해 안정적으로 발현되는 G 단백질은 상기 세포에 내생적일 수 있다. 대안으로, G 단백질의 안정적인 발현은 G 단백질을 인코딩하는 핵산의 세포 내로의 안정적인 형질감염의 결과일 수 있다. 이종기원 G 단백질을 안정적으로 발현하는 세포, 예를 들면, HEK293/Gα15 세포는 당분야에 공지되어 있다 (Chandrashekar et al., "T2Rs function as bitter taste receptors", Cell 100:703-711, 2000; Bufe et al., "The human TAS2R16 receptor mediates bitter taste in response to β-glucopyranosides", Na Genet 32:397-401). 다른 구체예에서, G 단백질을 인코딩하는 핵산 및 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산은 호스트 세포 내로 연속적으로 형질감염될 수 있는데, G 단백질을 인코딩하는 핵산이 먼저 형질감염되거나, 또는 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산이 먼저 형질감염된다. 다른 구체예에서, G 단백질을 인코딩하는 핵산 및 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산은 동일한 또는 상이한 벡터 상에서 호스트 세포 내로 공동-형질감염될 수 있다. 따라서 G 단백질 및 쓴맛 수용체 둘 모두를 안정적으로 발현하는 세포의 선별은 유사하게, 연속적으로 또는 동시에 수행될 수 있다. G 단백질을 안정적으로 발현하는데 이용될 수 있는 세포 또는 세포주는 앞서 설명된 바와 같이, 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하는데 이용될 수 있는 것들과 동일하다. G 단백질을 형질감염시키기 위한 벡터는 선택적으로, 앞서 설명된 바와 같이 항생제 또는 비-항생제 선별을 위한 선별가능 마커를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
본 발명의 일정한 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 쓴맛 수용체(들)와 함께 다른 단백질을 공동-발현한다. 바람직한 구체예에서, 다른 단백질은 적어도 하나의 다른 미각 수용체, 예를 들면, 단맛 (TAS1R2/TAS1R3) 수용체 또는 감칠맛 (TAS1R1/TAS1R3) 수용체이다. 쓴맛 수용체와 함께 공동-발현되는 단백질은 호스트 세포에서 내생 또는 벡터로부터 이종기원이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 메커니즘에 의해 발현될 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 구체예에서, 한 가지 이상의 유형의 쓴맛 수용체가 세포 또는 세포주에서 안정적으로 발현될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명의 세포와 세포주는 전통적인 방법에 의해 생산된 세포와 세포주와 비교하여 증진된 안정성을 갖는다. 안정적인 발현을 확인하기 위하여, 쓴맛 수용체의 세포 또는 세포주의 발현이 시간 과정 동안 측정되고, 그리고 발현 수준이 비교된다. 안정적인 세포주는 이러한 시간 과정 내내 쓴맛 수용체를 지속적으로 발현할 것이다. 본 발명의 일부 측면에서, 이러한 시간 경과는 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주 등, 또는 적어도 1개월, 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개월, 또는 그 사이에 임의의 시간 기일일 수 있다. 분리된 세포와 세포주는 발현되는 쓴맛 수용체의 절대적 양 및 상대적 양을 결정하기 위하여 예로써, qRT-PCR 및 단일 종점 RT-PCR에 의해 더욱 특성화될 수 있다. 바람직하게는, 다중-아단위 단백질의 아단위의 확장 수준은 본 발명의 세포와 세포주에서 실질적으로 동일하다. 일부 구체예에서, 안정적인 발현은 시간 과정 동안 기능 분석의 결과를 비교함으로써 측정된다. 기능 분석에 기초된 안정성의 측정은 목적되는 유전자의 mRNA를 안정적으로 발현할 뿐만 아니라 적절하게 기능하는 목적되는 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 안정적으로 생산하고 적절하게 가공하는 (가령, 번역후 변형, 아단위 조립, 그리고 세포 내에 국부화) 클론을 확인하는 이점을 제공한다.
본 발명의 세포와 세포주는 그들의 Z' 인자에 의해 입증되는 바와 같이, 높은 재현성 (reproducibility)을 갖는 분석법을 제공하는 추가의 유익한 특성을 갖는다 (참조: Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR, "A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays." J. Biomol. Screen. 1999;4(2):67-73, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입됨). Z' 값은 세포 또는 세포주의 품질에 관계하는데, 그 이유는 이것이 세포 또는 세포주가 조절제에 일관되게 반응하는 정도를 반영하기 때문이다. Z'는 멀티웰 평판 전역에서 참고 화합물에 대한 기능적 반응의 신호-대-잡음 범위 (signal-to-noise range) 및 신호 가변성 (즉, 웰에서부터 웰까지)을 고려하는 통계학적 계산 결과이다. Z'는 양성 대조를 갖는 멀티웰 및 음성 대조를 갖는 멀티웰로부터 획득된 데이터를 이용하여 계산된다. 평균 값에서, 차이 인자에 3이 곱셈된 통합 표준 편차 (combined standard deviation)의 비율은 하기 방정식에 따라서, Z' 인자를 제공하기 위하여 1로부터 뺄셈된다:
Z' 인자 = 1 - ((3σ양성 대조 + 3σ음성 대조)/ (μ양성 대조 - μ음성 대조))
이론적 최대 Z' 인자는 1.0이고, 이는 가변성 없음 및 무제한의 동적 범위 (dynamic range)를 갖는 이상적인 분석법을 지시할 것이다. 더욱 낮은 스코어 (즉, 0에 가까운 스코어)는 바람직하지 않은데, 그 이유는 이것이 양성 대조와 음성 대조 사이에 겹침이 존재한다는 것을 지시하기 때문이다. 업계에서, 단순한 세포-기초된 분석의 경우에, 0.3까지 Z' 스코어는 한계 스코어 (marginal score)인 것으로 간주되고, 0.3과 0.5 사이의 Z' 스코어는 조건에 맞는 것으로 간주되고, 그리고 0.5 초과의 Z' 스코어는 우수한 것으로 간주된다. 세포-없는 또는 생화학적 분석은 더욱 높은 Z' 스코어에 접근할 수 있지만, 세포-기초된 시스템에 대한 Z' 스코어는 세포-기초된 시스템이 복잡하기 때문에 더욱 낮아지는 경향이 있다.
본 발명의 세포와 세포주는 분석에서 일관된 결과를 유리하게 산출하는 그들의 능력을 반영하는 Z' 값을 갖는다. 본 발명의 쓴맛 수용체 발현 세포와 세포주는 고처리량 스크리닝 (HTS) 적합성 분석을 위한 기초를 제공하는데, 그 이유는 이들이 일반적으로, 적어도 0.45의 Z' 값을 갖기 때문이다. 본 발명의 일부 측면에서, 이들 세포와 세포주는 적어도 0.3, 적어도 0.4, 적어도 0.5, 적어도 0.6, 적어도 0.7, 또는 적어도 0.8의 Z'를 산출한다. 본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 세포와 세포주는 이들 세포가 복수 계대배양, 예를 들면, 5 내지 20 사이에 임의의 정수를 비롯한 5 내지 20회 계대배양 동안 유지된 이후에, 적어도 0.3, 적어도 0.4, 적어도 0.5, 적어도 0.6, 적어도 0.7, 또는 적어도 0.8의 Z'를 산출한다. 본 발명의 일부 측면에서, 본 발명의 세포와 세포주는 1, 2, 3, 4 또는 5주, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간 동안 유지된 이후에, 적어도 0.4, 적어도 0.5, 적어도 0.6, 적어도 0.7, 또는 적어도 0.8의 Z'를 산출한다.
또한, 본 발명에 따라서, 자연 발생 쓴맛 수용체 또는 자연-발생 이의 대립형질 변이체의 형태를 발현하는 세포와 세포주, 그리고 쓴맛 수용체의 돌연변이 형태를 발현하는 세포와 세포주는 세포내 유리 칼슘 수준에 대하여 특성화될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 "생리학적으로 적절한" 활성을 갖는 쓴맛 수용체를 발현한다. 본 명세서에서, 생리학적 적절성 (physiological relevance)은 쓴맛 수용체를 발현하는 세포 또는 세포주의 특성을 지칭하고, 여기서 쓴맛 수용체는 동일한 유형의 자연 발생 쓴맛 수용체가 활성화될 때 그러한 것처럼 세포내 유리 칼슘에서 증가를 유발하고, 그리고 동일한 유형의 자연 발생 쓴맛 수용체가 동일한 화합물에 의해 조정될 때 반응하는 것과 동일한 방식으로 조절제에 반응한다. 쓴맛 수용체의 일부 돌연변이 형태 및 쓴맛 수용체의 일부 자연-발생 대립형질 변이체를 비롯한 본 발명의 쓴맛 수용체-발현 세포와 세포주는 바람직하게는, 적절한 분석, 예를 들면, 세포내 유리 칼슘을 측정하는 분석에서 고유 쓴맛 수용체를 정상적으로 발현하는 세포에 필적하는 기능을 나타낸다. 이런 분석은 당업자에게 공지되어 있다 (Nahorski, "Pharmacology of intracellular signaling pathways," Brit. J. Pharm. 147:S38-S45, 2000)). 이런 비교는 세포 또는 세포주의 생리학적 적절성을 결정하는데 이용된다. 숙련된 미각 검사자의 패널을 이용한 "헹굼과 뱉기" 미각 검사 역시 본 발명의 세포와 세포주에서 쓴맛 수용체 생리학적 적절성을 더욱 확인하는데 이용될 수 있다. 쓴맛 수용체의 고유 또는 돌연변이 형태 또는 이의 자연-발생 대립형질 변이체의 스크리닝을 통하여 확인된 조절제를 이용한 헹굼과 뱉기 미각 검사의 결과는 이들 상이한 형태의 생리학적 적절성을 확인하는데 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 쓴맛 수용체의 조절제에 증가된 민감도를 갖는다. 본 발명의 세포와 세포주는 쓴맛 수용체에 대하여 생리학적 범위 EC50 또는 IC50 값으로 조절제에 반응하고 세포내 유리 칼슘을 증가시킨다. 본 명세서에서, EC50은 세포 또는 세포주에서 반-극대 (half-maximal) 활성화 반응을 유도하는데 필요한 화합물 또는 물질의 농도를 지칭한다. 본 명세서에서, IC50은 세포 또는 세포주에서 반-극대 (half-maximal) 저해 반응을 유도하는데 필요한 화합물 또는 물질의 농도를 지칭한다. EC50 및 IC50 값은 당분야에 널리 공지된 기술, 예를 들면, 화합물 또는 물질의 농도를 쓴맛 수용체-발현 세포주의 반응에 상관시키는 용량-반응 곡선 (dose-response curve)을 이용하여 결정될 수 있다.
쓴맛 수용체의 생리학적으로 적절한 기능으로부터 발생하는, 본 발명의 쓴맛 수용체 발현 세포와 세포주의 더욱 유익한 특성은 최초 스크리닝에서 확인된 조절제가 이차 기능 분석, 예를 들면, 헹굼과 뱉기 또는 기타 미각 검사, 또는 미각 조정 화합물에 응하여 뇌 활성을 주사하는 기능적 자기 공명 영상 (MRI)에서 기능적이라는 점이다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 최초 스크리닝 분석에서 확인된 화합물은 전형적으로, 그들의 유도체 또는 유사체가 이차 기능 분석에서 기능적이도록, 예로써 조합 화학, 의화학 또는 합성 화학에 의해 변형되어야 한다. 하지만, 본 발명의 쓴맛 수용체 발현 세포와 세포주의 높은 생리학적 적절성으로 인하여, 이들 세포와 세포주를 이용하여 확인된 다수의 화합물이 변형 없이도 기능적이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주의 특성, 예를 들면, 안정성, 생리학적 적절성, 분석에서 재현성 (Z'), 또는 생리학적 EC50 또는 IC50 값은 특정 배양 조건 하에 달성가능하다. 일부 구체예에서, 이들 배양 조건은 표준화되고 예로써, 자동화에 의해 변형 없이 엄격하게 유지된다. 본 발명의 세포 또는 세포주가 성장되는 배양 조건에는 임의의 적절한 조건이 포함되고, 그리고 여기에는 당분야에 공지된 것들이 포함된다. 다양한 배양 조건이 임의의 쓴맛 수용체, 또는 이들의 돌연변이체 또는 대립형질 변이체에 대한 유익한 생물학적 특성을 산출할 수 있다.
다른 구체예에서, 원하는 특성, 예를 들면, 안정성, 생리학적 적절성, 분석에서 재현성 (Z'), 또는 생리학적 EC50 또는 IC50 값을 갖는 본 발명의 세포와 세포주는 1개월 이내에 획득될 수 있다. 이들 세포 또는 세포주는 2, 3, 4, 5, 또는 6일, 또는 1, 2, 3 또는 4주, 또는 그 사이에 임의의 시간 길이 이내에 획득될 수 있다.
본 발명의 한 측면에서는 클론 세포와 세포주의 수집물을 제공하고, 이들 각각은 하나 이상의 쓴맛 수용체의 상이한 돌연변이 형태 및 자연-발생 대립형질 변이체를 비롯하여, 동일한 쓴맛 수용체, 또는 상이한 쓴맛 수용체를 발현한다. 수집물은 예로써, 상이한 쓴맛 수용체의 조합, 또는 쓴맛 수용체의 돌연변이 형태, 쓴맛 수용체의 자연-발생 대립형질 변이체, 또는 이들의 임의의 조합을 발현하는 세포 또는 세포주를 포함할 수 있다. 수집물은 또한, 동일한 쓴맛 수용체 및 상이한 G 단백질, 또는 쓴맛 수용체의 이종다합체 또는 키메라 이합체 또는 다합체를 비롯한 임의의 가능한 이합체 또는 기타 다합체를 발현하는 세포 또는 세포주를 포함할 수 있다.
세포 또는 세포주의 수집물 또는 패널이 예로써, 약물 스크리닝을 위하여 생산될 때, 수집물 또는 패널 내에 세포 또는 세포주는 하나 이상의 선별적 생리학적 특성에 대하여 동일 (실질적으로 동일 포함)하도록 정합될 수 있다. 이러한 맥락에서 "동일한 생리학적 특성"은 세포 수집물 또는 패널이 약물 스크리닝 분석에서 신뢰성 있는 결과를 산출할 수 있도록, 선별된 생리학적 특성이 수집물 또는 패널 내에 구성원 간에 충분히 유사하다는 것을 의미한다; 가령, 약물 스크리닝 분석에서 해독 정보에서 편차는 예로써, 세포 내에서 내재된 편차에 기인하기 보다는 쓴맛 수용체의 상이한 고유 또는 돌연변이 형태, 또는 이의 대립형질 변이체를 발현하는 세포에 대한 검사 화합물의 상이한 생물학적 활성에 기인할 것이다. 가령, 이들 세포 또는 세포주는 세포 수집물 또는 패널의 구성원 간에 동일한 성장 속도, 다시 말하면, 1, 2, 3, 4, 또는 5 시간 이하 차이의 성장 속도를 갖도록 정합될 수 있다. 이는 예로써, 세포를 그들의 성장 속도에 의해 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 군으로 비닝 (binning)하고, 그리고 동일한 비닝된 군으로부터 세포를 이용하여 패널을 산출함으로써 달성될 수 있다. 세포 성장 속도를 결정하는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 패널 내에 세포 또는 세포주는 또한, 동일한 Z' 인자 (가령, 0.1 이상 변하지 않는 Z' 인자), 쓴맛 수용체 발현 수준 (가령, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 또는 30% 이상 변하지 않는 쓴맛 수용체 발현 수준), 조직 배양액 표면에 부착 등을 갖도록 정합될 수 있다. 정합된 세포와 세포주는 선별된 생리학적 특성을 유지하기 위하여, 예로써 자동화 병렬 처리에 의해 달성된 동일한 조건 하에 성장될 수 있다.
본 발명의 정합된 세포 패널은 예로써, 쓴맛 수용체에 대한 정의된 활성 (가령, 작동약 또는 길항약)을 갖는 조절제를 확인하고; 상이한 쓴맛 수용체, 또는 그들의 대립형질 변이체 또는 돌연변이 형태 전역에서 화합물 활성을 프로파일링 (profiling)하고; 쓴맛 수용체의 한 가지 유형, 또는 이의 대립형질 변이체 또는 돌연변이 형태에만 활성인 조제를 확인하고; 그리고 쓴맛 수용체의 부분집합에만 활성인 조절제를 확인하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 정합된 세포 패널은 고처리량 스크리닝을 가능하게 한다. 완결이 수개월이 소요되었던 스크리닝이 이제 수개월 이내에 달성될 수 있다.
본 발명의 세포와 세포주를 만들기 위하여, 예로써 U.S. Patent 6,692,965 및 WO/2005/079462에서 기술된 기술이 이용될 수 있다. 이들 문헌은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 이러한 기술은 선별되는 수백만 개의 세포, 예를 들면, 원하는 숫자의 (수백 개 내지 수천 개의 클론)의 실시간 평가를 제공한다. 세포 분류 기술, 예를 들면, 유세포분석 세포 분류 (가령, FACS 머신 이용) 또는 자기 세포 분류 (가령, MACS 머신 이용)를 이용하여, 웰당 1개의 세포가 배양 용기 (가령, 96 웰 배양 평판) 내에 높은 통계학적 신뢰도 (statistical confidence)로 자동적으로 집어넣어진다. 상기 기술의 속도와 자동화는 다중유전자 재조합 세포주가 용이하게 분리될 수 있도록 한다.
이러한 기술을 이용하여, 각각의 쓴맛 수용체에 대한 RNA 서열이 분자 표지 또는 형광 프로브로 지칭되는 신호전달 프로브를 이용하여 검출될 수 있다. 일부 구체예에서, 일부 구체예에서, 분자 표지는 앞서 기술된 바와 같은 표적 태그 서열을 인식한다. 다른 구체예에서, 분자 표지는 쓴맛 수용체 코딩 서열 그 자체 내에 서열을 인식한다. 신호전달 프로브는 각각, 태그의 RNA 서열 또는 쓴맛 수용체 코딩 서열에 상보적인 부분을 포함하도록 상기 프로브를 설계함으로써 상기 RNA 태그 또는 쓴맛 수용체 코딩 서열에 지향될 수 있다. 이들 동일한 기술은 이용되면, G 단백질에 대한 RNA 서열을 검출하는데 이용될 수 있다.
쓴맛 수용체를 인코딩하는 서열, G 단백질을 인코딩하는 서열, 태그 서열, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고, 그리고 선택적으로, 선별가능 마커를 인코딩하는 핵산을 더욱 포함하는 핵산은 널리 공지된 방법에 의해 선별된 호스트 세포 내로 도입될 수 있다. 이들 방법에는 형질감염, 바이러스 전달, 단백질 또는 펩티드 매개된 삽입, 공동침전 방법, 지질 기초된 전달 시약 (리포펙션), 사이토펙션, 리포폴리아민 전달, 덴드리머 전달 시약, 전기천공 또는 기계적 전달이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 형질감염 시약의 실례는 GENEPORTER, GENEPORTER2, LIPOFECTAMINE, LIPOFECTAMINE 2000, FUGENE 6, FUGENE HD, TFX-10, TFX-20, TFX-50, OLIGOFECTAMINE, TRANSFAST, TRANSFECTAM, GENESHUTTLE, TROJENE, GENESILENCER, X-TREMEGENE, PERFECTIN, CYTOFECTIN, SIPORT, UNIFECTOR, SIFECTOR, TRANSIT-LT1, TRANSIT-LT2, TRANSIT-EXPRESS, IFECT, RNAI SHUTTLE, METAFECTENE, LYOVEC, LIPOTAXI, GENEERASER, GENEJUICE, CYTOPURE, JETSI, JETPEI, MEGAFECTIN, POLYFECT, TRANSMESSANGER, RNAiFECT, SUPERFECT, EFFECTENE, TF-PEI-KIT, CLONFECTIN, 그리고 METAFECTINE이다.
쓴맛 수용체 코딩 서열, 그리고 선택적으로, G 단백질 코딩 서열의 호스트 세포 내로 도입 및 선택적 차후 약물 선별 이후에, 분자 표지 (가령, 형광 프로브)가 이들 세포 내로 도입되고, 그리고 그들의 신호에 양성인 세포를 분리하기 위하여 세포 분류가 이용된다. 분자 표지 역시 쓴맛 수용체, G 단백질, 또는 양쪽의 발현을 확인하는데 이용될 수 있다. 양쪽의 발현이 확인되면, 그들의 동정 (identification)이 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 원하는 경우에, 복수 라운드의 분류가 수행될 수 있다. 한 구체예에서, 유세포분석 세포 분류기는 FACS 머신이다. 레이저-가능된 분석과 가공을 이용한 음성 세포의 MACS (자기 세포 분류) 또는 레이저 박리 역시 이용될 수 있다. 이러한 방법에 따라서, 적어도 하나의 쓴맛 수용체를 발현하는 세포가 검출되고 회수된다. 쓴맛 수용체 (그리고, 선택적으로, G 단백질) 서열은 세포 내에 게놈의 상이한 위치에 통합될 수 있다. 쓴맛 수용체 (그리고, 도입되면, G 단백질)를 인코딩하는 도입된 유전자의 발현 수준은 통합 부위에 기초하여 변할 수 있다. 당업자는 분류가 임의의 원하는 발현 수준 (즉, 배경 초과 또는 배경 초과에서 특정 수준)에 대하여 게이팅 (gating)될 수 있음을 인지할 것이다. 게다가, 안정적인 세포주는 쓴맛 수용체 또는 G 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 도입된 유전자가 에피솜일 때 획득될 수 있다.
본 발명에 유용한 신호전달 프로브는 당분야에 공지되어 있고, 그리고 일반적으로, 표적 서열에 상보적인 서열, 그리고 프로브가 표적 서열에 결합되지 않을 때 신호가 방출되지 않고 프로브가 표적 서열에 결합될 때 신호가 방출되도록 정렬된 신호 방출 시스템을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 무제한적 예시로써, 신호전달 프로브는 소광제 및 형광단이 결합되지 않은 프로브 내에서 서로 묶이도록 상기 프로브 내에 위치하는 형광단 및 소광제를 포함할 수 있다. 프로브와 표적 서열 사이에 결합 시에, 소광제 및 형광단은 분리되고 신호의 방출을 유발한다. 예로써, International publication WO/2005/079462에서는 본 발명의 세포와 세포주의 생산에 이용될 수 있는 다수의 신호전달 프로브를 기술한다. 태그 서열이 이용되는 경우에, 복수의 쓴맛 수용체가 하나의 세포에서 발현되면 각각의 쓴맛 수용체에 대한 벡터, 또는 쓴맛 수용체 및 G 단백질에 대한 벡터는 동일한 또는 상이한 태그 서열을 포함할 수 있다. 태그 서열이 동일하거나 상이한 경우에, 신호전달 프로브는 각각의 상이한 쓴맛 수용체 및 선택적으로, G 단백질의 (RNA) 발현이 개별적으로 검출될 수 있도록 상이한 신호 방출체, 예를 들면, 상이한 착색된 형광단 등을 포함할 수 있다. 예시로써, 쓴맛 수용체 mRNA을 특이적으로 검출하는 신호전달 프로브는 적색 형광단을 포함할 수 있고, 그리고 도입된 G 단백질 (RNA)을 검출하는 프로브는 녹색 형광단을 포함할 수 있다. 또한, 예시로써, 쓴맛 수용체 mRNA를 특이적으로 검출하는 신호전달 프로브는 적색 형광단을 포함할 수 있고, 다른 쓴맛 수용체 mRNA를 특이적으로 검출하는 신호전달 프로브는 녹색 형광단을 포함할 수 있고, 그리고 세 번째 쓴맛 수용체 mRNA를 특이적으로 검출하는 신호전달 프로브는 황색 형광단을 포함할 수 있다. 당업자는 복수의 쓴맛 수용체로 형질감염된 세포에서 신호전달 프로브로, 복수의 쓴맛 수용체 또는 쓴맛 수용체와 G 단백질의 발현을 차별적으로 검출하는 다른 수단을 인지할 것이다.
신호전달 프로브를 인코딩하는 핵산은 형질감염, 공동침전 방법, 지질 기초된 전달 시약 (리포펙션), 사이토펙션, 리포폴리아민 전달, 덴드리머 전달 시약, 전기천공 또는 기계적 전달이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 당업자에게 공지된 다수의 수단을 이용하여 선별된 호스트 세포 내로 도입될 수 있다. 형질감염 시약의 실례는 GENEPORTER, GENEPORTER2, LIPOFECTAMINE, LIPOFECTAMINE 2000, FUGENE 6, FUGENE HD, TFX-10, TFX-20, TFX-50, OLIGOFECTAMINE, TRANSFAST, TRANSFECTAM, GENESHUTTLE, TROJENE, GENESILENCER, X-TREMEGENE, PERFECTIN, CYTOFECTIN, SIPORT, UNIFECTOR, SIFECTOR, TRANSIT-LT1, TRANSIT-LT2, TRANSIT-EXPRESS, IFECT, RNAI SHUTTLE, METAFECTENE, LYOVEC, LIPOTAXI, GENEERASER, GENEJUICE, CYTOPURE, JETSI, JETPEI, MEGAFECTIN, POLYFECT, TRANSMESSANGER, RNAiFECT, SUPERFECT, EFFECTENE, TF-PEI-KIT, CLONFECTIN, 그리고 METAFECTINE이다.
한 구체예에서, 신호전달 프로브는 쓴맛 수용체를 인코딩하는 RNA의 일부 또는 5' 또는 3' 비번역 영역의 일부에 상보적이도록 설계된다. 비록 목적되는 메신저 RNA를 인식하도록 설계된 신호전달 프로브가 가짜로 내생적으로 존재하는 표적 서열을 검출할 수 있다면, 형질감염된 세포에 의해 생산된 목적되는 서열의 비율에 비하여 이들 서열의 비율은 분류기가 이들 2가지 세포 유형을 구별할 수 있을 만큼의 비율이다. 따라서 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구조체는 형광 단백질을 인코딩하는 서열을 필요로 하지 않고 포함하지 않는다. 따라서 이종기원 형광 단백질은 본 발명의 세포에서 발현되지 않는다. 본 발명의 세포 또는 세포주는 이종기원 고유 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현한다. 이런 단백질 태그/샤프롱이 세포 표면에 쓴맛 수용체의 운송을 촉진하기 위하여 다수의 쓴맛 수용체의 발현에 이용되고 있긴 하지만, 본 발명의 세포와 세포주는 쓴맛 수용체가 없었던 세포 표면에서 신규한 쓴맛 수용체를 유익하게 기능적으로 발현한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 부착성 세포는 세포 분류 전후에 현탁 및 단일 세포 분리에 순응될 수 있다. 다른 구체예에서, 분리된 세포는 세포 개체군을 산출하기 위하여 개별적으로 성장되거나, 또는 합동될 수 있다. 개별 또는 복수 세포주 역시 개별적으로 성장되거나, 또는 합동될 수 있다. 세포주의 풀 (pool)이 원하는 활성을 산출하거나, 또는 원하는 특성을 가지면, 이는 이러한 효과를 갖는 세포주 또는 일단의 세포주가 확인될 때까지 더욱 분별될 수 있다. 세포 또는 세포주의 합동은 각각을 개별적으로 유지할 필요 없이, 다수의 세포주를 유지하는 것을 더욱 용이하게 만든다. 따라서 세포 또는 세포주의 풀이 양성 세포에 대하여 농축될 수 있다. 농축된 풀은 원하는 특성 또는 활성에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%, 또는 100% 양성이다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 본 발명의 세포와 세포주를 생산하는 방법을 제시한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 쓴맛 수용체를 인코딩하는 mRNA를 발현하는 복수의 세포를 제공하는 단계;
b) 이들 세포를 개별 배양 용기 내로 개별적으로 분산시켜 복수의 별개의 세포 배양액을 제공하는 단계;
c) 자동화 세포 배양 방법을 이용하여 일단의 원하는 배양 조건 하에 이들 세포를 배양하는 단계, 이들 조건은 별개의 세포 배양액 각각에 대하여 실질적으로 동일한 것으로 특징되고, 이러한 배양 기간 동안 별개의 세포 배양액 각각에서 세포의 숫자가 표준화되고, 그리고 이들 별개의 배양액은 동일한 일정에서 계대배양되고;
d) 쓴맛 수용체의 적어도 하나의 원하는 특징에 대하여 별개의 세포 배양액을 적어도 2회 평가하는 단계; 그리고
e) 양쪽 분석에서 원하는 특징을 갖는 별개의 세포 배양액을 확인하는 단계.
상기 방법에 따라서, 이들 세포는 일단의 원하는 배양 조건 하에 배양된다. 이들 조건은 임의의 원하는 조건일 수 있다. 당업자는 일단의 배양 조건 내에 어떤 파라미터가 포함되는 지를 이해할 것이다. 가령, 배양 조건에는 배지 (기초 배지 (DMEM, MEM, RPMI, 혈청-없는, 혈청 포함, 완전하게 화학적으로 정의된, 동물-유래된 성분이 없는), 일가와 이가 이온 (나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘) 농도, 첨가되는 추가 성분 (아미노산, 항생제, 글루타민, 글루코오스 또는 기타 탄소 공급원, HEPES, 채널 차단제, 다른 표적의 조절제, 비타민, 미량 원소, 중금속, 보조-인자, 성장 인자, 항-아폽토시스 시약), HEPES를 포함하는 새로운 또는 조건 배지, pH, 일정한 영양소 (아미노산, 탄소 공급원)의 고갈 또는 제한, 분할/계대배양에 앞서 세포가 달성하도록 허용되는 포화도 수준, 세포의 영양층 (feeder layer), 또는 감마-조사된 세포, CO2, 3가지 가스 시스템 (산소, 질소, 이산화탄소), 습도, 온도, 정지 또는 교반기 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
세포 배양 조건은 편의적으로, 또는 세포의 원하는 특정 용도에 맞게 선택될 수 있다. 유리하게는, 본 발명에서는 원하는 특정 용도에 최적으로 적합한 세포와 세포주를 제시한다. 다시 말하면, 세포가 원하는 특정 용도를 위한 조건 하에 배양되는 본 발명의 구체예에서, 원하는 용도를 위한 조건 하에 원하는 특징을 갖는 세포가 선별된다.
예시로써, 부착성 세포가 요구되는 평판에서 분석에 세포가 이용되면, 상기 분석의 조건 하에 부착성을 나타내는 세포가 선별될 수 있다. 유사하게, 세포가 단백질 생산에 이용되면, 세포는 단백질 생산에 적합한 조건 하에 배양되고 이러한 용도를 위한 유익한 특성에 대하여 선별될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 별개의 세포 배양액의 성장 속도를 측정하는 추가 단계를 포함한다. 성장 속도는 당업자에게 공지되어 있는 다양한 기술 수단을 이용하여 결정될 수 있다. 이런 기술에는 ATP, 세포 포화도, 광 산란, 흡광도 (가령, DNA의 경우에 OD 260) 측정이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 바람직하게는, 성장 속도는 선택된 배양 조건을 벗어나는 배양 동안 소모되는 시간의 양을 최소화시키는 수단을 이용하여 결정된다.
일부 구체예에서, 세포 포화도가 측정되고, 그리고 성장 속도가 포화도 값으로부터 계산된다. 일부 구체예에서, 세포가 분산되고, 그리고 향상된 정확도를 위하여 세포 포화도를 측정하기에 앞서 덩어리가 제거된다. 세포를 단분산시키는 수단은 널리 공지되어 있고, 그리고 예로써, 측정되는 배양액에 분산제 (dispersing reagent)의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 분산제는 널리 공지되어 있고 용이하게 구입가능하며, 그리고 여기에는 효소 분산제, 예를 들면, 트립신, 그리고 EDTA-기초된 분산제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 성장 속도는 HAMILTON VECTOR와 같은 상업적으로 가용한 소프트웨어를 이용하여 포화도 데이터로부터 계산될 수 있다. 예로써, 자동화 현미경 평판 판독기를 이용한 자동화 포화도 측정이 특히 유용하다. 포화도를 측정하는 평판 판독기는 상업적으로 가용하고, 그리고 여기에는 CLONE SELECT IMAGER (Genetix)가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 전형적으로, 세포 포화도의 적어도 2회 측정이 성장 속도를 계산하기에 앞서 수행된다. 성장 속도를 결정하는데 이용되는 포화도 값의 숫자는 배양에 편의하거나 적합한 임의의 숫자일 수 있다. 가령, 포화도는 예로써, 1주, 2주, 3주 또는 임의의 기간 동안, 그리고 임의의 원하는 빈도로 수회 측정될 수 있다.
성장 속도가 알려져 있을 때, 본 발명의 방법에 따라서, 복수의 별개의 세포 배양액은 성장 속도의 유사성에 의해 여러 군으로 분류된다. 배양액을 성장 속도 빈 (growth rate bin)으로 집단화 (grouping)함으로써, 군 내에 배양액을 함께 조작할 수 있고, 따라서 배양액 간에 편차를 감소시키는 다른 수준의 표준화를 제공할 수 있다. 가령, 빈 (bin) 내에 배양액은 동일한 시점에서 계대배양되고, 동일한 시점에서 원하는 시약으로 처리될 수 있다. 게다가, 기능 분석 결과는 전형적으로, 분석 웰 내에서 세포 밀도에 좌우된다. 개별 클론의 진정한 비교는 이들을 동일한 밀도로 도말하고 평가할 때에만 달성된다. 특정한 성장 속도 코호트로의 집단화는 이들이 고처리량 형식으로 기능적으로 특성화될 수 있도록 하는 특정 밀도에서 클론의 도말을 가능하게 한다.
각 군에서 성장 속도의 범위는 임의의 편의한 범위일 수 있다. 세포가 동일한 시점에서 계대배양될 수 있도록 하고 세포 수의 빈번한 재표준화 (renormalization)를 예방하는 성장 속도의 범위를 선택하는 것이 특히 유리하다. 성장 속도 군은 엄격한 집단화를 위한 매우 좁은 범위, 예를 들면, 서로 간에 1시간 내에 평균 배가 시간을 포함할 수 있다. 하지만, 본 발명의 방법에 따라서, 상기 범위는 서로 간에 최대 2시간, 최대 3시간, 최대 4시간, 최대 5시간 또는 최대 10시간, 또는 더욱 넓은 범위일 수 있다. 재표준화의 요구는 빈 (bin)에서 성장 속도가 동일하지 않고, 따라서 일부 배양액에서 세포의 숫자가 다른 것보다 빠르게 증가할 때 발생한다. 빈 내에 모든 배양액에 대한 실질적으로 동일한 조건을 유지하기 위하여, 빈 전역에서 숫자를 재표준화하기 위하여 세포를 주기적으로 제거하는 것이 필요하다. 성장 속도가 더욱 상이하면, 재표준화가 더욱 빈번하게 요구된다.
단계 d)에서, 세포와 세포주는 게놈에 의해 인코딩된 세포 과정에서 변화; 게놈에 의해 조절된 세포 과정에서 변화; 염색체 활성의 패턴에서 변화; 염색체 침묵의 패턴에서 변화; 유전자 침묵의 패턴에서 변화; 유전자 활성화의 패턴 또는 효율에서 변화; 유전자 발현의 패턴 또는 효율에서 변화; RNA 발현의 패턴 또는 효율에서 변화; RNAi 발현의 패턴 또는 효율에서 변화; RNA 가공의 패턴 또는 효율에서 변화; RNA 수송의 패턴 또는 효율에서 변화; 단백질 번역의 패턴 또는 효율에서 변화; 단백질 접힘의 패턴 또는 효율에서 변화; 단백질 조립의 패턴 또는 효율에서 변화; 단백질 변형의 패턴 또는 효율에서 변화; 단백질 수송의 패턴 또는 효율에서 변화; 막 단백질의 세포 표면으로의 수송의 패턴 또는 효율에서 변화; 성장 속도에서 변화; 세포 크기에서 변화; 세포 형상에서 변화; 세포 형태에서 변화; % RNA 함량에서 변화; % 단백질 함량에서 변화; % 물 함량에서 변화; % 지질 함량에서 변화; 리보솜 함량에서 변화; 미토콘드리아 함량에서 변화; ER 질량에서 변화; 원형질 막 표면적에서 변화; 세포 체적에서 변화; 원형질 막의 지질 조성에서 변화; 핵 외피의 지질 조성에서 변화; 원형질 막의 단백질 조성에서 변화; 핵 외피의 단백질 조성에서 변화; 분비 소포의 숫자에서 변화; 리소솜의 숫자에서 변화; 액포의 숫자에서 변화; 단백질 생산, 단백질 분비, 단백질 접힘, 단백질 조립, 단백질 변형, 단백질의 효소 변형, 단백질 당화, 단백질 인산화, 단백질 탈인산화, 대사산물 생합성, 지질 생합성, DNA 합성, RNA 합성, 단백질 합성, 영양소 흡수, 세포 성장, 유사분열, 감수분열, 세포 분열, 탈분화, 줄기 세포로 변환, 다능성 세포로 변환, 전능성 세포로 변환, 임의의 장기 (즉, 간, 폐, 피부, 근육, 췌장, 뇌, 고환, 난소, 혈액, 면역계, 신경계, 골, 심혈관계, 중추신경계, 위장관, 위, 갑상선, 혀, 담낭, 신장, 코, 눈, 손발톱, 머리카락, 미뢰)의 줄기 세포 유형으로 변환, 임의의 분화된 세포 유형 (즉, 근육, 심장 근육, 뉴런, 피부, 췌장, 혈액, 면역, 적혈구 세포, 적혈구 세포, 킬러 T-세포, 장내분비 세포, 미각, 분비 세포, 신장, 상피 세포, 내피 세포, 또한 핵산 서열의 도입에 이용될 수 있는 것으로 이미 열거된 임의의 동물 또는 인간 세포 유형 포함)으로 변환, DNA 흡수, 소형 분자 흡수, 형광 프로브 흡수, RNA 흡수, 고형 표면에 부착, 혈청-없는 조건에 적응, 혈청-없는 현탁 조건에 적응, 규모 확대된 세포 배양에 적합, 대규모 세포 배양에 이용, 약물 발견에서 이용, 고처리량 스크리닝에서 이용, 기능적 세포 기초된 분석에서 이용, 칼슘 유동 분석에서 이용, G-단백질 리포터 분석에서 이용, 리포터 세포 기초된 분석에서 이용, ELISA 연구에서 이용, 시험관내 분석에서 이용, 생체내 적용에 이용, 이차 검사에 이용, 화합물 검사에서 이용, 결합 분석에서 이용, 패닝 (panning) 분석에서 이용, 항체 패닝 분석에서 이용, 영상 분석에서 이용, 현미경 영상 분석에서 이용, 멀티웰 평판에서 이용, 자동화 세포 배양에 적합, 축소된 자동화 세포 배양에 적합, 대규모 자동화 세포 배양에 적합, 멀티웰 평판 (6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 또는 더욱 높은 밀도)에서 세포 배양에 적합, 세포 칩에서 이용, 슬라이드에서 이용, 유리 슬라이드에서 이용, 슬라이드 또는 유리 슬라이드에서 마이크로어레이, 면역형광 연구, 단백질 정제에서 이용, 생물학적 생산에서 이용, 산업용 효소의 생산에서 이용, 연구용 시약의 생산에서 이용, 세포 요법에서 이용, 동물 또는 인간으로 이식에서 이용, 세포에 의해 분비된 인자의 분리에서 이용, cDNA 라이브러리의 준비, RNA의 정제, DNA의 정제, 병원균, 바이러스 또는 기타 병원체에 의한 감염, 병원균, 바이러스 또는 기타 병원체에 의한 감염에 내성, 내약성, 자동화 축소된 세포 배양 조건 하에 유지에 적합성, 단백질 결정학, 면역계의 자극, 항체 생산 또는 산출, 또는 항체의 검사를 비롯한 특성화를 위한 단백질의 생산에서 이용을 위한 세포의 능력 또는 잠재력에서 변화가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 생리학적 특성에 대하여 조사되고 선별될 수 있다. 당업자는 앞서 열거된 임의의 특성에 대한 적절한 검사법을 이의 없이 인지할 것이다. 특정한 구체예에서, 이들 물리적 특성 중에서 한 가지 이상은 쓴맛 수용체와 연관된 일관된 물리적 특성일 수 있고, 그리고 기능적 쓴맛 수용체의 발현을 모니터하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 세포와 세포주 및/또는 본 발명의 정합된 패널을 특성화하는데 이용될 수 있는 검사에는 아미노산 분석, DNA 염기서열분석, 단백질 염기서열분석, NMR, 단백질 수송에 대한 검사, 핵세포질 수송에 대한 검사, 단백질의 세포하 국부화에 대한 검사, 핵산의 세포하 국부화에 대한 검사, 현미경 분석, 초현미경 분석, 형광 검경, 전자 검경, 공초점 검경, 레이저 박리 기술, 세포수 계산 및 투석이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 당업자는 앞서 열거된 임의의 검사법을 어떻게 이용하는 지를 이해할 것이다.
상기 방법에 따라서, 세포는 이들 세포 또는 세포주가 성장 속도를 측정하는 단계에 앞서, 개별 배양액에서 분산되기만 하면, 임의의 세포 배양 형식으로 배양될 수 있다. 가령, 편의를 위하여, 세포는 원하는 조건 하에 배양을 위하여 초기에 합동되고, 이후 개별 세포가 웰 또는 용기마다 1개의 세포로 분리될 수 있다.
세포는 임의의 편의한 숫자의 웰을 보유하는 다중-웰 조직 배양 평판에서 배양될 수 있다. 이런 평판은 이의 없이 상업적으로 가용하고, 그리고 당업자에게 널리 공지되어 있다. 일부 경우에, 세포는 바람직하게는, 바이알 또는 임의의 다른 편의한 형식에서 배양될 수 있고, 이들 다양한 형식은 당업자에게 공지되어 있고 이의 없이 상업적으로 가용하다.
성장 속도를 측정하는 단계를 포함하는 구체예에서, 성장 속도를 측정하기에 앞서, 세포는 그들이 배양 조건에 순응할 만큼 충분한 시간 길이 동안 배양된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 이러한 시간 길이는 다수의 인자, 예를 들면, 세포 유형, 선택된 조건, 배양 형식에 따라 변할 것이고, 그리고 1일 내지 수일, 1주 또는 그 이상의 시간의 양일 수 있다.
바람직하게는, 복수의 별개의 세포 배양액에서 각 개별 배양액은 표준화된 유지 일정 (maintenance schedule)을 비롯한, 하기에 논의된 바와 같은 실질적으로 동일한 조건 하에 유지된다. 본 발명의 방법의 다른 유리한 특징은 많은 숫자의 개별 배양액이 동시에 유지될 수 있다는 점이고, 따라서 원하는 일단의 형질을 갖는 세포는 심지어 극히 드물게 존재하는 경우에도 확인될 수 있다. 이런 저런 이유로, 본 발명에 따라서, 복수의 별개의 세포 배양액은 각 웰에 대한 조건이 실질적으로 동일하도록 자동화 세포 배양 방법을 이용하여 배양된다. 자동화 세포 배양은 수동 세포 배양에 내재된 필연적인 가변성을 예방한다.
임의의 자동화 세포 배양 시스템이 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 다수의 자동화 세포 배양 시스템은 상업적으로 가용하고, 그리고 당업자에게 널리 공지되어 있다. 일부 구체예에서, 자동화 시스템은 로봇식 시스템이다. 바람직하게는, 상기 시스템은 독립적으로 이동 채널 (moving channel), 다중채널 헤드 (가령, 96-팁 헤드), 그리퍼 (gripper) 또는 신품-채집 팔 (cherry-picking arm), 그리고 이러한 절차 동안 무균을 유지시키는 HEPA 여과 장치를 포함한다. 피펫터 내에서 채널의 숫자는 배양의 형식에 적합해야 한다. 편의한 피펫터는 예로써, 96 또는 384 채널을 보유한다. 이런 시스템은 공지되어 있고 상업적으로 가용하다. 가령, MICROLAB STAR™ 기구 (Hamilton)가 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 자동화 시스템은 다양한 원하는 세포 배양 과제를 수행할 수 있어야 한다. 이런 과제는 당업자에게 공지되어 있다. 여기에는 배지 제거, 배지 대체, 시약 첨가, 세포 세척, 세척액 제거, 분산제 첨가, 배양 용기로부터 세포 이전, 배양 용기에 세포 첨가 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 발명의 세포 또는 세포주의 생산은 임의의 숫자의 별개의 세포 배양액을 포함할 수 있다. 하지만, 본 발명의 방법에 의해 제공된 이점은 세포의 숫자가 증가함에 따라 증가한다. 이러한 방법에 이용될 수 있는 세포 또는 별개의 세포 배양액의 숫자에 이론적 상한선은 없다. 본 발명에 따라서, 별개의 세포 배양액의 숫자는 2 이상일 수 있지만 더욱 유리하게는, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상, 예를 들면, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 48, 적어도 50, 적어도 75, 적어도 96, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 384, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 500,000 또는 그 이상의 별개의 세포 배양액이다.
본 발명의 쓴맛 수용체 발현 세포와 세포주의 더욱 유익한 특성은 그들이 약물 선별 압력의 부재에서 하나 이상의 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현한다는 점이다. 따라서 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 임의의 선별 압력 없이 배양 동안 유지된다. 진전된 구체예에서, 세포와 세포주는 임의의 항생제 없이 유지된다. 본 명세서에서, 세포 유지는 쓴맛 수용체 발현에 대하여 앞서 기술된 바와 같이 선별된 이후에, 세포를 배양하는 것을 지칭한다. 유지는 세포 내로 도입된 약물 내성 마커(들)가 혼성 개체군에서 안정적인 형질감염체의 농축을 가능하게 하는 세포 분류에 앞서, 선별 압력 (가령, 항생제) 하에 세포를 성장시키는 선택적 단계를 지칭하지 않는다.
약물-없는 세포 유지는 다수의 이점을 제공한다. 가령, 약물-내성 세포는 목적되는 공동-형질감염된 도입유전자를 적절한 수준으로 발현하지 못할 수도 있는데, 그 이유는 이러한 선별이 도입유전자와 함께 또는 도입유전자 없이, 약물 내성 유전자를 흡수하는 세포의 생존에 의존하기 때문이다. 게다가, 선별 약물은 종종, 돌연변이유발성이거나, 또는 세포의 생리를 달리 간섭하여 세포-기초된 분석에서 편중된 결과를 유발한다. 가령, 선별 약물은 아폽토시스에 대한 감수성을 감소시키고 (Robinson et al., Biochemistry, 36(37):11169-11178 (1997)), DNA 수복 및 약물 대사를 증가시키고 (Deffie et al., Cancer Res. 48(13):3595-3602 (1988)), 세포 pH를 증가시키고 (Thiebaut et al., J Histochem Cytochem. 38(5):685-690 (1990); Roepe et al., Biochemistry. 32(41):11042-11056 (1993); Simon et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 91(3):1128-1132 (1994)), 리소솜과 엔도솜 pH를 감소시키고 (Schindler et al., Biochemistry. 35(9):2811-2817 (1996); Altan et al., J Exp Med. 187(10):1583-1598 (1998)), 원형질 막 전위를 감소시키고 (Roepe et al., Biochemistry. 32(41):11042-11056 (1993)), 염화물 (Gill et al., Cell. 71(1):23-32 (1992)) 및 ATP (Abraham et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 90(1):312-316 (1993))에 대한 원형질 막 전도성을 증가시키고, 그리고 소포 수송 속도를 증가시킨다 (Altan et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 96(8):4432-4437 (1999)). 따라서 본 발명의 세포와 세포주는 선별 압력에 의해 유발된 인공물 (artifact)로부터 자유로운 스크리닝 분석을 가능하게 한다. 일부 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세포와 세포주는 원하는 특성을 갖는 세포와 세포주가 농축된 세포 개체군으로 시작되지 않을 때에도 분류에 의해 분리되도록, 세포 분류 이전에 또는 이후에 선별 약물, 예를 들면, 항생제와 함께 배양되지 않는다.
쓴맛 수용체의 발현 수준은 세포마다 또는 세포주마다 다를 수 있다. 세포 또는 세포주에서 발현 수준은 또한, 후성 사건 (epigenetic event), 예를 들면, DNA 메틸화, 유전자 침묵, 그리고 도입유전자 사본의 상실로 인하여, 시간의 흐름 동안 감소할 수 있다. 이들 변화는 다양한 인자, 예를 들면, 세포에 의해 흡수된 도입유전자의 사본 수, 도입유전자의 게놈 통합 부위, 그리고 게놈 통합 이후에 도입유전자의 완전성 (integrity)에 기인할 수 있다. 발현 수준을 평가하기 위하여 FACS 또는 기타 세포 분류 방법 (즉, MACS)이 이용될 수 있다. 예로써, 그들이 최초에 분리되었던 하나 이상의 RNA에 대하여 세포가 시간의 흐름 동안 양성으로 존속하는 지와 어느 정도 존속하는 지를 결정하기 위하여, 추가 라운드의 신호전달 프로브 도입이 이용될 수 있다.
특정한 구체예에서, 적어도 하나의 신호전달 프로브에 대하여 상이한 절대적인 또는 상대적인 형광 수준을 갖는 세포는 예로써 FACS에 의해, 전체 세포 개체군에 비하여 적절한 형광 수준을 갖는 세포의 부분집합을 게이팅 (gating)함으로써 분리될 수 있다. 가령, 특정 신호전달 프로브 (또는 신호전달 프로브의 조합)에 대하여 최대 형광 신호를 갖는 세포 중에서 상위 5%, 상위 10%, 상위 15%, 상위 20%, 상위 25%, 상위 30%, 상위 35%, 상위 40%, 상위 45%, 상위 50%, 상위 55%, 상위 60%, 또는 상위 65%가 예로써, FACS에 의해 게이팅되고 분리될 수 있다. 다른 구체예에서, 특정 신호전달 프로브 (또는 신호전달 프로브의 조합)에 대하여 최대 형광 신호를 갖는 세포 중에서 상위 2% 내지 3%, 상위 5% 내지 10%, 상위 5% 내지 15%, 상위 5% 내지 20%, 상위 5% 내지 30%, 상위 40% 내지 50%, 상위 10% 내지 30%, 상위 10% 내지 25%, 또는 상위 10% 내지 50%가 예로써, FACS에 의해 게이팅되고 분리될 수 있다.
목적되는 RNA 전부를 더 이상 발현하지 못하는 세포로부터 원하는 RNA 전부를 발현하는 세포를 재-분리하는 것을 가능하게 하는 용이성은 약물 없이 또는 최소 농도의 약물의 존재에서 세포주를 유지하는 것을 가능하게 만든다. 신호전달 프로브는 또한, 예로써 그들이 최초에 분리되었던 하나 이상의 RNA에 대하여 세포가 여전히 양성으로 존속하는 지와 어느 정도 존속하는 지를 결정하기 위하여, 앞서 산출된 세포 또는 세포주에 재-적용될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 본 발명의 세포와 세포주를 이용하는 방법을 제시한다. 본 발명의 세포와 세포주는 기능적 쓴맛 수용체가 요구되는 임의의 적용에서 이용될 수 있다. 이들 세포와 세포주는 예로써, 쓴맛 수용체 조절제를 스크리닝하고; 물질의 쓴맛을 평가하고; 결정학 및 결합 연구를 위한 단백질을 생산하고; 그리고 화합물 선택성 (selectivity)과 용량 (dosing), 수용체/화합물 결합 동역학과 안정성, 그리고 세포 생리 기능 (가령, 전기생리학, 단백질 운송, 단백질 접힘, 그리고 단백질 조절)에 대한 수용체 발현의 효과를 조사하기 위하여, 시험관내 세포-기초된 분석 또는 생체내 분석 (여기서, 이들 세포는 동물 (가령, 비-인간 포유동물)에 이식된다)에 이용될 수 있다. 본 발명의 세포와 세포주는 또한, 특정한 쓴맛 수용체, 또는 쓴맛 수용체의 군의 역할을 조사하기 위한 녹다운 (knock down) 연구에 이용될 수 있다.
쓴맛 수용체의 다양한 조합을 발현하는 세포와 세포주는 특정 쓴맛 수용체, 또는 쓴맛 수용체의 돌연변이 형태 또는 자연-발생 대립형질 변이체에 특이적인 것들을 비롯한 쓴맛 수용체 조절제를 확인하고, 그리고 개별 형태의 활성에 관한 정보를 획득하기 위하여 개별적으로 또는 함께 이용될 수 있다.
조절제에는 쓴맛 수용체, 또는 이의 돌연변이 형태 또는 자연-발생 대립형질 변이체의 활성을 변화시키는 임의의 물질 또는 화합물이 포함된다. 조절제는 부분 작동약 또는 길항약, 선별적 작동약 또는 길항약 및 역작동약을 비롯한 쓴맛 수용체 작동약 (강화제 또는 활성제) 또는 길항약 (저해제 또는 차단제)일 수 있고, 또한 알로스테릭한 조절제일 수 있다. 물질 또는 화합물은 이의 조정 활성이 상이한 조건 또는 농도 하에, 또는 상이한 형태 (가령, 돌연변이 형태 및 자연-발생 대립형질 변이체)의 쓴맛 수용체에 대하여 변하면, 조절제이다. 다른 측면에서, 조절제는 다른 조절제의 능력을 변화시켜 쓴맛 수용체의 기능에 영향을 줄 수 있다. 가령, 길항약에 의해 저해되지 않는 형태의 쓴맛 수용체의 조절제는 상기 형태의 쓴맛 수용체가 상기 길항약에 의한 저해에 민감하도록 만든다.
본 발명의 세포와 세포주는 다양한 조절제에 대한 반응에 기초하여, 쓴맛 수용체의 생체내 형태의 실체를 쓴맛 수용체의 공지된 형태의 실체와 상관시킴으로써, 상이한 쓴맛 수용체 병리에서 상이한 형태의 쓴맛 수용체의 역할을 확인하는데 이용될 수 있다. 이는 쓴맛 수용체-관련된 병리 또는 다른 생리학적 장애의 고도로 표적화된 치료를 위한 질병- 또는 조직-특이적 쓴맛 수용체 조절제의 선별을 가능하게 한다. 가령, 많은 자연 발생 쓴맛 화합물이 독성이기 때문에, 쓴맛 수용체는 독성 식품 화합물의 섭취에 대한 경고 센서로서 기능할 수 있다. 위장 점막 내에서 발현된 쓴맛 수용체는 내강 (lumen) 내에서 영양소 및 유해 물질의 기능적 검출에 참여하고, 그리고 장이 이들을 흡수하거나, 또는 보호 반응을 시작하도록 준비시킬 지도 모른다. 이들은 또한, 장-뇌 신경 경로의 활성화를 통하여 식품 섭취의 제어에 참여할지도 모른다. 따라서 본 발명의 세포주와 방법을 이용하여 확인된 쓴맛 수용체 조절제는 다양한 배경에서 영양소 흡수를 조절하는, 예를 들면, 비만 개체의 장에서 식욕을 제어하고 및/또는 영양소 흡수를 감소시키고, 또는 배고픔 (hunger feeling)을 제어하고 및/또는 영양부족 개체에서 식품으로부터 영양소 및/또는 에너지의 흡수를 증가시키는데 이용될 수 있다. 쓴맛 수용체 조절제는 또한, 쓴맛 화합물을 확인하고, 그들의 결합 특성에 영향을 주는 쓴맛 수용체의 특정한 화학적 또는 구조적 모티프 또는 핵심 잔기를 더욱 특성화하고, 리간드 결합에 대하여 폭넓게, 중간 정도로 또는 선별적으로 조율되는 쓴맛 수용체를 확인하고, 결합 프로필에 기초하여 쓴맛 수용체의 군과 부분군을 정의하고, 고아 쓴맛 수용체를 탈고아 (deorphaning)시키고, 쓴맛 수용체에 대한 분자 모델링 또는 약물 설계를 위하여 이런 데이터를 이용하고, 그리고 다양한 쓴맛 수용체가 어떤 조직에서 활성적인 지를 결정하는데 유용할 수 있다.
쓴맛 수용체 조절제를 확인하기 위하여, 본 발명의 신규한 세포 또는 세포주는 쓴맛 수용체가 기능할 것으로 예상되는 조건 하에 검사 화합물에 노출되고, 이후 적절한 대조, 예를 들면, 검사 화합물에 노출되지 않은 세포와 비교하여 쓴맛 수용체 활성에서 통계학적으로 유의한 변화 (가령, p<0.05)가 검출될 수 있다. 공지된 작동약 또는 길항약 및/또는 상이한 쓴맛 수용체 또는 이의 돌연변이 형태 또는 자연-발생 대립형질 변이체를 발현하는 세포를 이용한 양성 및/또는 음성 대조 역시 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 검출되는 및/또는 측정되는 쓴맛 수용체 활성은 세포내 유리 칼슘 수준에서 변화이다. 당업자는 다양한 분석 파라미터, 예를 들면, 신호 대 잡음 비율이 최적화될 수 있음을 이해할 것이다.
다른 관련된 측면에서, 본 발명에서는 다른 GPCR의 리간드를 확인하는 방법을 제시한다. 이러한 방법에, 포유동물 또는 인간 GPCR 및 고아된 또는 탈고아된 GPCR이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 GPCR이 이용될 수 있다. 탈고아된 GPCR의 무제한적 실례는 오피오이드이다 (표 9에 열거됨). GPCR을 발현하는 세포 또는 세포주는 상기 수용체에 대한 발현 프로필을 산출하기 위하여 화합물 또는 추출물 라이브러리를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 유사한 프로필을 갖는 수용체는 함께 집단화되고, 그리고 수용체(들)에 결합하는 리간드(들)를 확인하기 위하여 화합물로 스크리닝될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 고아 쓴맛 수용체에 대한 리간드를 확인하는 방법을 제시한다, 다시 말하면, 본 발명에서는 쓴맛 수용체를 탈고아시키는 방법을 제시한다. 공지된 조절제 없이 쓴맛 수용체를 발현하는 세포 또는 세포주는 상기 수용체에 대한 발현 프로필을 산출하기 위하여 화합물 또는 추출물 라이브러리를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 선택적으로, 유사한 프로필을 갖는 수용체 (존재하면)는 함께 집단화되고, 그리고 수용체(들)에 결합하는 리간드(들)를 확인하기 위하여 공지된 쓴맛 화합물로 스크리닝된다. 일단 리간드가 확인되면, 그 결과는 미각 검사로 더욱 확인될 수 있다. 유익하게는, 본 발명의 세포와 세포주는 고유 (즉, 태그표식되지 않은) 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하고, 따라서 이러한 방법을 이용하여 확인된 리간드는 정확하고 적절하다. 관련된 구체예에서, 쓴맛 수용체를 탈고아시키는 방법은 임의의 고아 포유동물 GPCR 또는 임의의 고아 인간 GPCR, 예를 들면, 표 8에 열거된 것들을 비롯한 임의의 고아 GPCR을 탈고아시키는데 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포주의 수집물을 비롯한 하나 이상의 세포 또는 세포주는 복수의 검사 화합물, 예를 들면, 검사 화합물의 라이브러리에 노출된다. 검사 화합물의 라이브러리는 하나 이상의 조절제를 확인하기 위하여 본 발명의 세포주를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 검사 화합물은 소형 분자, 폴리펩티드, 펩티드, 펩티드 모방체, 항체 또는 이들의 항원-결합 부분을 비롯한 화학적 모이어티일 수 있다. 항체의 경우에, 이들은 비-인간 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 항체는 항체 단편 (가령, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb 등), 단일 사슬 항체 (scFv), 단일 도메인 항체, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 전부 또는 항원-결합 부분을 비롯하여, 중쇄와 경쇄의 완전 보체 또는 임의의 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 완전한 항체일 수 있다.
본 발명의 세포 또는 세포주는 또한, 특정한 변수를 갖는 수집물을 산출하는데 이용될 수 있다. 가령, 수집물에는 수용체-G 단백질 상호작용을 조사하기 위한 동일한 쓴맛 수용체 및 상이한 G 단백질을 모두 발현하는 세포 또는 세포주; 또는 이종다합체의 가능한 이합체화 또는 형성을 조사하기 위한 복수의 내생적 및/또는 이종기원 쓴맛 수용체를 발현하는 세포 또는 세포주가 포함될 수 있다. 본 발명의 세포 또는 세포주의 수집물은 또한, 바람직한 구체예에서, 25가지 쓴맛 수용체를 모두 포함한다. 이런 패널은 화합물에 대한 정확한 (on-target) 대(對) 부정확한 (off-target) 활성, 또는 순수한 쓴맛 대(對) 관련된 (즉, 떫은 또는 금속성) 맛에서 이들 수용체의 역할을 결정하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 세포와 세포주는 그들이 안정적으로 발현하는 쓴맛 수용체 이외에 GPCR 경로의 참가자를 확인하는데 이용될 수 있다. 가령, 상이한 G 단백질을 발현하는 핵산은 동일한 이종기원 쓴맛 수용체를 발현하고, 바람직하게는 내생적 쓴맛 수용체를 발현하지 않는 세포주의 수집물에서 각 세포주 내로 도입될 수 있다 (일시적으로 또는 안정적으로). G 단백질 및 이들 세포주에 의해 발현된 쓴맛 수용체 사이에 상호작용은 예로써, 이들 세포가 쓴맛 수용체의 공지된 작동약에 노출된 이후에, 세포내 유리 칼슘에서 변화를 검출함으로써 평가될 수 있다.
일부 구체예에서, 광범위한 화합물 수집물이 예로써, 96-웰, 384-웰, 1536-웰 또는 더욱 높은 평판 형식을 이용한 세포-기초된, 기능적, 고처리량 스크린 (HTS)에서 쓴맛 수용체 조정 활성에 대하여 조사된다. 일부 구체예에서, 검사 화합물, 또는 검사 화합물의 라이브러리를 비롯한 복수의 검사 화합물은 세포주의 수집물을 비롯하여 본 발명의 하나 이상의 세포 또는 세포주를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 각각 상이한 자연 발생 또는 돌연변이 쓴맛 수용체 분자를 발현하는 복수의 세포 또는 세포주가 이용되면, 복수의 쓴맛 수용체 또는 이의 돌연변이 형태 또는 자연-발생 대립형질 변이체에 효과적인 조절제, 또는 대안으로, 특정 쓴맛 수용체 또는 이의 돌연변이 형태 또는 자연-발생 대립형질 변이체에 특이적이고 다른 쓴맛 수용체 또는 쓴맛 수용체의 다른 형태를 조정하지 않는 조절제가 확인될 수 있다. 인간 쓴맛 수용체를 발현하는 본 발명의 세포 또는 세포주의 경우에, 이들 세포는 원치 않는 쓴맛 수용체 활성, 또는 원하는 쓴맛 수용체 활성의 감소 또는 부재로 특징되는 질환 또는 장애의 치료에 이용되는 쓴맛 수용체 활성을 조정 (증가 또는 감소)하는 화합물을 확인하기 위하여 검사 화합물에 노출될 수 있다.
일부 구체예에서, 검사 화합물에 노출에 앞서, 본 발명의 세포 또는 세포주는 예로써, 포유동물 또는 다른 동물 효소, 식물 효소, 세균 효소, 용해된 세포로부터 효소, 단백질 수정 효소, 지질 수정 효소, 그리고 구강, 위장관, 위 또는 타액에서 효소를 비롯한 효소로 전처리 (pretreatment)에 의해 변형될 수 있다. 이런 효소에는 예로써, 키나아제, 프로테아제, 포스파타아제, 글리코시다아제, 산화환원효소, 트랜스퍼라아제, 하이드롤라아제, 리아제, 이성화효소, 리가아제 등이 포함될 수 있다. 대안으로, 이들 세포와 세포주는 먼저, 검사 화합물에 노출되고, 그 이후에 효소 처리가 수행되어 상기 처리에 의한 쓴맛 수용체의 변형을 변경하는 화합물이 확인될 수 있다.
일정한 측면에서, 세포 내에 존재하는 자연적으로 발생하는 정도의 유전적 다양성 (genetic diversity)을 이용하고, 그리고 원하는 특성 (가령, 기능적 쓴맛 수용체의 안정적인 및/또는 높은 발현)을 공여하는 원하는 유전자 발현 프로필을 갖는 세포를 효과적으로 확인하고, 선별하고, 그리고 농축하는 방법이 본 발명에서 제시된다. 본 발명의 방법은 전통적인 방법보다 더욱 빠르고 더욱 효과적으로, 향상된 특성을 갖는 세포를 유전적으로 다양한 세포의 풀로부터 확인하고, 선별하고, 그리고 농축할 수 있다. 특정한 구체예에서, 이들 세포는 유전적으로 변형되지 않는다. 다른 특정한 구체예에서, 본 발명의 방법은 향상된 특성 (가령, 기능적 쓴맛 수용체의 더욱 안정적인 및/또는 더욱 높은 발현)을 갖는 신규한 동질성 세포 개체군을 산출을 가능하게 한다.
일정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 한 가지 이상의 원하는 특성 (가령, 기능적 쓴맛 수용체의 안정적인 및/또는 높은 발현)을 갖는 자연 발생 세포를 선별하는 단계를 포함한다. 특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 하나 이상의 쓴맛 수용체 아단위 유전자에서 자연 발생 변이체 또는 돌연변이를 갖는 세포를 선별하는 단계를 포함한다.
특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 쓴맛 수용체 유전자의 프로모터 영역에서 또는 쓴맛 수용체 유전자의 비-코딩 영역 (가령, 인트론, 5' 비번역 영역, 및/또는 3' 비번역 영역)에서 자연 발생 변이체 또는 돌연변이를 갖는 분리된 세포를 선별하는 단계를 포함한다. 쓴맛 수용체 유전자의 프로모터 영역에서 또는 쓴맛 수용체 유전자의 비-코딩 영역에서 변이체 또는 돌연변이는 유전자 산물의 더욱 높은 및/또는 더욱 안정적인 발현을 유발할 수 있다. 특정한 구체예에서, 쓴맛 수용체 유전자의 프로모터 영역 또는 쓴맛 수용체 유전자의 비-코딩 영역은 예로써, DNA의 메틸화 또는 아세틸화에 의해 변형된다. 특정한 구체예에서, 세포는 쓴맛 수용체 유전자에 대하여 염색질 재구성에 영향을 주는 후성 변형을 포함한다. 후성 변형의 무제한적 실례에는 아세틸화, 메틸화, 유비퀴틴화, 인산화 및 수모화 (sumoylation)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
일정한 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 전처리를 받은 세포를 선별하는 단계를 포함한다. 이런 전처리는 일광 또는 자외선 (UV) 광, 돌연변이원, 예를 들면, 에틸 메탄 설포네이트 (EMS), 그리고 화학적 작인에 노출일 수 있다. 특정한 구체예에서, 이런 전처리에는 바람직하지 않은 성장 조건, 예를 들면, 낮은 산소 또는 낮은 영양소 조건, 또는 독성 조건에 노출이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 방법은 하나 이상의 목적되는 유전자 (가령, 쓴맛 수용체 아단위 유전자)를 발현하는 세포 (가령, 진핵 세포)를 확인하고 및/또는 선별하는 것을 제공한다. 일정한 구체예에서, 목적되는 유전자는 유전적 변이성의 결과로서 다른 세포에서보다 높은 수준으로 발현된다.
특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 (a) 쓴맛 수용체의 RNA를 검출할 수 있는 하나 이상의 신호전달 프로브를 세포 (가령, 진핵 세포) 내로 도입하는 단계; 그리고 (b) 상기 세포 (가령, 진핵 세포)가 쓴맛 수용체의 RNA를 포함하는 지를 결정하는 단계를 포함한다. 이런 방법은 쓴맛 수용체의 RNA의 수준을 정량하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 원하는 RNA 발현 프로필을 갖는 세포를 확인하는 방법이 본 명세서에서 기술되고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 각각 복수의 목적되는 RNA를 검출할 수 있는 복수의 신호전달 프로브를 세포 (가령, 진핵 세포) 내로 도입하는 단계; 그리고 (b) 복수의 신호전달 프로브에 의해 검출된 RNA 수준을 정량하는 단계. 원하는 유전자 발현 프로필은 참고 개체군에 비교에 의해 결정될 수 있다. 특정한 구체예에서, 복수의 목적되는 RNA는 아래의 RNA의 임의의 조합을 포함할 수 있다: 서열 번호 50-102 중에서 임의의 한 가지에 의해 인코딩된 RNA.
특정한 구체예에서, 이런 방법은 상기 세포의 정량된 RNA 수준을 각각, 참고 세포에서 RNA 수준과 비교하는 단계를 더욱 포함한다. 특정한 구체예에서, 복수의 신호전달 프로브는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 적어도 1000개의 신호전달 프로브를 포함한다. 일부 구체예에서, 목적되는 RNA는 번역된다. 다른 구체예에서, 목적되는 RNA는 번역되지 않는다. 특정한 구체예에서, 목적되는 RNA는 쓴맛 수용체 아단위 유전자에 의해 인코딩된다. 특정한 구체예에서, 분리된 세포는 하나 이상의 목적되는 재조합 RNA를 발현한다.
특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 확인된 및/또는 선별된 분리된 세포는 유전적으로 조작되지 않는다 (가령, 하나 이상의 도입유전자를 재조합 방식으로 발현하지 않는다). 다른 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 확인된 및/또는 선별된 분리된 세포는 유전적으로 조작된다 (가령, 하나 이상의 도입유전자를 재조합 방식으로 발현한다). 특정한 구체예에서, 이런 세포는 체세포 또는 분화된 세포이다.
다른 구체예에서, 세포는 원하는 유전자 발현 프로필을 포함한다. 일정한 구체예에서, 원하는 유전자 발현 프로필은 유전자 조작에 의해, 또는 유전적 변이성을 증가시킴으로써 달성된다. 특정한 구체예에서, 원하는 유전자 발현 프로필은 참고 개체군의 것과의 비교에 기초하여 결정될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 평균 이종기원 세포 개체군 (가령, 선별되지 않은 세포주 개체군, 예를 들면, 선별되지 않은 293T 세포주 개체군)에서보다 높은 수준으로 목적되는 RNA (가령, 쓴맛 수용체의 RNA)를 발현하는 세포를 확인하고 및/또는 선별한다. 일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 평균 이종기원 세포 개체군 (가령, 선별되지 않은 세포주 개체군, 예를 들면, 선별되지 않은 293T 세포주 개체군)에서보다 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 높은 수준으로 목적되는 RNA (가령, 쓴맛 수용체의 RNA)를 발현하는 세포를 확인하고 및/또는 선별한다. 일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 평균 이종기원 세포 개체군 (가령, 선별되지 않은 세포주 개체군, 예를 들면, 선별되지 않은 293T 세포주 개체군)에서보다 적어도 1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 높은 수준으로 목적되는 RNA (가령, 쓴맛 수용체의 RNA)를 발현하는 세포를 확인하고 및/또는 선별한다.
특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 평균 이종기원 세포 개체군에서보다 낮은 수준으로 목적되는 RNA (가령, 쓴맛 수용체의 RNA)를 발현하는 세포를 확인하고 및/또는 선별한다. 예시적인 이종기원 세포 개체군은 상이한 기원의 혼성 세포 유형의 세포 개체군, 유전적으로 이종기원인 세포 유형의 세포 개체군, 또는 분리된 세포가 본 명세서에서 기술된 방법을 이용하여 획득되는 특정 세포주의 세포 개체군일 수 있다.
특정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법을 이용하여 분리된 세포는 세포주로부터 세포 클론이다. 일정한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법을 이용하여 분리된 세포는 일차 세포이다. 일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법을 이용하여 분리된 세포는 형질전환된 세포이다.
일정한 구체예에서, 세포는 인간 세포가 아니다. 특정한 구체예에서, 세포는 생쥐, 쥐, 원숭이, 개, 고양이, 돼지, 양, 염소, 말, 닭, 개구리, 벌레, 곤충 (가령, 파리), 어류, 조개, 또는 소로부터 유래된 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 포유동물 세포 또는 진핵 세포이다. 다른 구체예에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 일차 세포이다. 다른 구체예에서, 세포는 형질전환된 세포 또는 세포주의 세포 클론이다.
이론에 한정됨 없이, 쓴맛으로서 역할에서, 쓴맛 수용체는 아마도, 쓴맛으로서 잠재적으로 생리학적으로 활성 화합물의 폭넓은 다양성을 검출하도록 진화하였다. 이들 수용체 중에서 일부는 화학적 구조의 더욱 큰 다양성으로, 그들의 결합 또는 상호작용에서 다른 GPCR보다 더욱 폭넓게 조율될 수 있다. 이런 이유로, 구조적으로 다양한 화합물의 라이브러리로 쓴맛 GPCR의 검사는 쓴맛 수용체와 상호작용하거나 이들을 조정하는 화합물을 확인하는데 이용될 수 있다. 이렇게 확인된 화합물은 다른 GPCR의 활성 역시 조정할 것으로 예측된다.
더욱 특정한 구체예에서, 상이한 쓴맛 수용체, 예를 들면, 적어도 2, 5, 10, 50, 또는 적어도 100개의 상이한 쓴맛 수용체를 발현하는 세포주 패널은 이들 쓴맛 수용체에 가장 밀접하게 관련된 다른 GPCR에 적절한 화학 세계 (chemical space)를 확인하는데 이용될 수 있다. 반대로, 쓴맛 수용체와 상호작용하는 것으로 관찰되지 않은 화학 세계는 GPCR과의 더욱 낮은 상호작용 우도 (likelihood)를 갖는 화합물에 대하여 보강될 수 있다.
일정한 구체예에서, 이들 방법에 따른 GPCR 및 비-GPCR 화학 세계의 정의는 GPCR 또는 비-GPCR 표적이 이용되는 지에 따라서, HTS 동안 유망 적중 (likely hit)에 대한 화학적 라이브러리를 보강하는데 이용될 수 있다. 유사하게, 비-GPCR 표적에 대하여 개발 중인 화합물이 GPCR과의 원치 않는 상호작용의 기초가 될 수 있는 기능성 (functionality)이 배제되도록 최적화될 수 있는 경우에, 의화학 노력을 보도하기 위하여 동일한 정보가 이용될 수 있다.
본 발명의 방법과 함께 이용되는 임의의 분석법은 고처리량 형식으로 수행될 수 있다.
일정한 구체예에서, 단백질 복합체가 쓴맛 수용체이면, 이들 쓴맛 수용체의 활성은 칼슘 동원 검사를 이용하여 측정될 수 있다.
화합물 사이에 구조적 공통성의 확인
단백질 복합체를 조정하는 화합물 사이에 구조적 공통성을 확인하기 위한 시스템 및 방법이 제시된다. 일정한 구체예에서, 단백질 복합체는 세포 표면 수용체, 예를 들면, G 단백질-결합된 수용체이다. 특정 구체예에서, 단백질 복합체는 쓴맛 수용체일 수 있다. 이러한 단백질 복합체를 조정하는 화합물은 본 명세서에 기술된 임의의 시스템 및 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 이들 화합물은 예로써, 다수의 후보 화합물을 단백질 복합체를 발현하도록 조작된 세포와 개별적으로 접촉시키고, 그리고 상기 단백질 복합체의 활성에 대한 각 후보 화합물의 효과를 평가함으로써 확인될 수 있고, 여기서 이들 효과는 상기 단백질 복합체의 생물학적 활성에 대한 개별 후보 화합물의 효과의 다양한 정량적 치수를 이용함으로써 조사될 수 있다. 특정 구체예에서, 후보 화합물의 라이브러리는 단백질 복합체를 조정할 수 있는 화합물을 확인하기 위하여 상기 단백질 복합체에 대하여 스크리닝될 수 있다.
단백질 복합체에 대한 목적되는 화합물의 효과는 활성 프로필에 의해 표시될 수 있다. 이런 정량적 치수의 무제한적 실례에는 본 명세서에서 기술된 분석으로부터 유래된 것들이 포함된다. 각각의 목적되는 화합물은 이러한 화합물의 구조 및 기타 특성을 기술하는 분자 표현에 의해 표시될 수 있다. 특정 구체예에서, 목적되는 화합물의 분자 표현은 이러한 화합물의 구조적 특징을 수학적으로 기술하는 구조 서술자를 포함할 수 있다. 구조적 및 기타 유형의 서술자는 하기에 논의된다. 목적되는 화합물의 하나 이상의 서술자를 상기 화합물의 활성 프로필로부터 관찰되는 바와 같은 상기 화합물의 생물학적 활성과 수학적으로 상관시키기 위하여 구조-활성 상관관계 (SAR) 모형이 이용될 수 있다.
단백질 복합체를 조정하는 화합물 사이에 구조적 공통성을 확인하기 위한 시스템 및 방법이 제시되고, 이들 방법은 화합물의 분자 표현 및 이의 활성 프로필을 이용하여 목적되는 화합물의 하나 이상의 SAR 모형을 구축하는 단계, SAR 모형에 기초하여 개별 화합물의 활성 프로필과 상관하는 각 화합물의 한 가지 이상의 구조적 특징을 확인하는 단계, 그리고 각 화합물에 대하여 확인된 한 가지 이상의 구조적 특징 가운데서 이들 화합물에 공통적인 적어도 하나의 구조적 특징을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, SAR 모형은 개별 화합물의 분자 표현 및 개별 화합물의 활성 프로필을 이용하여 각각의 목적되는 화합물에 대하여 구축될 수 있다. 구조-활성 상관관계 (SAR) 모형은 하기에 논의된다.
이들 SAR 모형으로부터, 개별 화합물의 활성 프로필과 상관하는 각각의 목적되는 화합물의 한 가지 이상의 구조적 특징이 확인될 수 있다. 이들 특징 가운데서, 모든 목적되는 화합물에 공통적인 한 가지 이상의 구조적 특징 (구조적 공통성, structural commonality)이 확인될 수 있다. 일정한 구체예에서, 컴퓨터 모델링 기술은 목적되는 화합물의 3-차원 원자 구조를 시각화시키는데 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 목적되는 화합물의 구조적 공통성은 컴퓨터 모델링 기술을 이용하여 시각화될 수 있다. 분자의 3-차원 구조체는 선별된 분자의 x-선 결정학적 분석 또는 NMR 영상으로부터 데이터에 좌우될 수 있다. 목적되는 화합물의 분자 동역학, 및/또는 구조적 공통성의 모형을 산출하기 위하여 포스 필드 (force field) 데이터가 이용될 수 있다. 분자 모델링 프로그램의 실례는 CHARMm 및 QUANTA 프로그램 (Accelrys, Inc., San Diego, CA)이다.
화합물의 분자 표현
목적되는 화합물의 분자 표현은 화합물의 특징과 특성을 기술하는 다양한 서술자를 포함할 수 있다. 이들 서술자는 위상적, 구조적, 물리화학적 및/또는 공간적 유형의 서술자일 수 있다. 소정의 화합물은 하위 구조 성분 또는 모이어티, 화학적 기능적 기의 거리, 또는 상기 화합물의 공간적, 2D 또는 3D 위상적, 전기화학적, 전기-물리적, 및/또는 양자 기계적 특성을 비롯한 다양한 서술자에 의해 표시될 수 있다. 특정한 구체예에서, 목적되는 화합물은 구조 서술자에 의해 표시될 수 있다. 화합물의 구조 서술자의 실례에는 원자 유형, 분자량 (MW), 회전가능 결합 (Rotlbond)의 숫자, 수소 결합 공여자 (Hbond 공여자)의 숫자, 수소 결합 수용자 (Hbond 수용자)의 숫자, 화합물에서 키랄 중심 (R 또는 S)의 숫자, 3D 분자 모멘트 (molecular moment), 하위 구조 특성, 분자 특성, 그리고 양자 기계적 특성이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 위상적 서술자의 무제한적 실례에는 Balaban 지수 (Jx), 카파 형태 지수 (kappa shape indices), 유연성 (flexibility), 부분그래프 카운트 (subgraph count), 연결도 (connectivity), Wiener 지수, Zagreb 지수, 연결도 지수 (connectivity indices), Hosoya 지수, 그리고 E-sate 열쇠가 포함된다. 물리화학적 (또는 열역학적) 서술자의 무제한적 실례에는 분배 계수의 로그 (log) (AlogP), 분배 계수의 로그, 원자-유형 값 (AlogP98), 옥탄올/물 분배 계수 (LogP), 몰 굴절률 (molar refractivity, MR), 그리고 몰 굴절률 (molar refractivity, MolRef)이 포함된다. 공간적 서술자의 무제한적 실례에는 회전 반경 (radius of gyration) (RadOfGyration), Jurs 전하 부분 표면적 서술자 (charged partial surface area descriptor) (Jurs), 표면적 프로젝션 (surface area projection) (임시 지수체제 (shadow indices)), 분자 표면적 (Area), 밀도, 분자 부피 (Vm), 그리고 주축 관성 모멘트 (principal moments of inertia, PMI)가 포함된다. 전자적 서술자의 무제한적 실례에는 전하 (charge), 원자 편극성 (atomic polarizability)의 합 (Apol), 최대 점유 분자 궤도 에너지 (highest occupied molecular orbital energy, HOMO), 최저 비점유 분자 궤도 에너지 (lowest unoccupied molecular orbital energy, LUMO), 그리고 과다탈현지화능 (superdelocalizability, Sr)이 포함된다. 다양한 서술자에 관한 설명은 Scripps Research Institute (La Jolla CA)로부터 가용한, QSAR 서술자의 표제가 달린 웹사이트에서 찾아볼 수 있다. 설명은 또한, 예로써 Cerius2 소프트웨어 (Accelrys, Inc., San Diego, CA) 또는 Accelrys QSAR 소프트웨어 산물 (Accelrys, Inc., San Diego, CA)에 대한 웹사이트 지침서에서 찾아볼 수 있다.
목적되는 화합물의 다양한 서술자에 대한 값은 분자 구조를 결정하기 위한 계산 프로그램을 이용하여 도출될 수 있다. 가령, QSAR 분석에서 서술자 입력으로서 이용될 수 있는, 공지된 구조의 화합물에서 에너지 우호적인 결합 부위를 결정하기 위하여 GRID 프로그램 (Molecular Discovery Ltd., Middlesex, UK)이 이용될 수 있다. 또한, QSAR 분석을 수행하는 다양한 프로그램, 예를 들면, Accelrys QSAR 소프트웨어 산물 (Accelrys, Inc., San Diego, CA) 역시 목적되는 화합물의 서술자의 값을 도출하는데 이용될 수 있다. 다른 실례에서, 목적되는 화합물의 서술자로서 기능할 수 있는 정보는 화합물 구조의 데이터베이스, 예를 들면, Accelrys Chemicals Available for Purchase (CAP) 데이터베이스 (Accelrys Inc., San Diego, CA)로부터 획득될 수 있다.
구조 및 활성 상관관계 모형
SAR 모형은 목적되는 화합물의 서술자를 상기 화합물의 생물학적 활성과 수학적으로 상관시키는데 이용될 수 있다. 목적되는 화합물의 생물학적 활성은 상기 화합물의 활성 프로필에 의해 제공될 수 있다. SAR 모형은 다른 화합물을 분류하는데 이용될 수 있는 모형을 확립하기 위하여 서술자 및 알고리즘의 상이한 조합을 이용하여 구축될 수 있다. 가령, 서로 매우 유사한 일단의 훈련 화합물 (training compound)을 이용하여 구축된, 단백질 복합체를 조정하는 화합물의 부류의 구조적 특징을 예측하는 SAR은 상기 훈련 세트에 유사한 것으로 생각되는 다른 화합물을 분류하는데 이용될 수 있다.
SAR 알고리즘은 관련된 화학적 서술자 간에 수학적 상관관계 및 관찰된 생물학적 활성의 효능을 기술하는데 이용될 수 있다, 다시 말하면, 활성 Y는 서술자 X의 함수, [Y=f(X)]이다. 데이터 질문 (data interrogation)에 유용한 당분야의 임의의 알고리즘이 SAR 모형을 구축하는데 이용될 수 있다. 무제한적 실례로써, SAR 모형을 구축하는데 이용될 수 있는 프로그램에는 보통 다중 회귀 (ordinary multiple regression, OMR), 단계별 회귀 (SWR), 모든 가능한 부분집합 회귀 (PSR), 그리고 부분 최소 제곱 (partial least square, PLS) 회귀, 그리고 유전 알고리즘 (GA)을 수행할 수 있는 프로그램이 포함된다. 특정 구체예에서, 화합물에 대한 SAR 모형은 선형 방정식의 형태를 취할 수 있다:
A0+(A1M1)+(A2M2)+(A3M3)+. . . (AnMn)
여기서 파라미터 M1 내지 Mn은 상기 화합물의 분자 표현에서 상이한 서술자이고, A0은 상수이고, 그리고 계수 A1 내지 An은 파라미터 M1 내지 Mn에서 편차 및 예로써, 활성 프로필에 의해 제공되는 상기 화합물의 생물학적 활성을 피팅 (fitting)함으로써 계산된다. 이러한 SAR 모형은 당분야에서 임의의 회귀 기술을 이용하여 피팅될 수 있다. 가령, 보통 다중 회귀는 종속 변수 (dependent variable) (가령, 활성 프로필인 것으로 간주됨)에 독립 변수 (independent variable) (가령, 서술자인 것으로 간주됨)의 최소 제곱법 (least squares fit)을 계산하는데 이용될 수 있다. 예로써, 정량적 구조-활성 상관관계 분석 (quantitative structure-activity relationship, QSAR)을 수행함으로써 SAR 모형을 제공하는데 이용될 수 있는 소프트웨어의 실례에는 Accelrys QSAR 소프트웨어 (Accelrys Inc., San Diego, CA), 그리고 Quasar 5, 6D-QSAR 소프트웨어 산물 (Biographics Laboratory 3R, Basel, Switzerland)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다른 SAR 모형은 Selassie, C.D., "History of Quantitative Structure-Activity Relationships," Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 6th Edition, vol. 1: Drug Discovery에서 논의되고, 이는 본 발명에 참조로서 편입된다.
목적되는 화합물에 대하여 구축될 수 있는 SAR 모형의 실례에는 수용체-의존성 유리 에너지 포스 필드 QSAR (FEFF-QSAR), 수용체-독립성 3-차원 QSAR (3D-QSAR), 그리고 수용체-의존성 또는 수용체-독립성 4-차원 QSAR (4D-QSAR)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
수용체-독립성 3D-QSAR. 화합물에 의해 나타나는 특정 특성의 크기를 상기 화합물의 하나 이상의 구조적 특징 및/또는 물리적 특성에 관련시키는 도구를 제공하는데 이용될 수 있는 접근법은 수용체-독립성 3D-QSAR 분석이다. 수용체 결합 구조 (geometry)는 수용체-독립성 3D-QSAR 분석의 실행 동안 알려져 있지 않을 수 있다. 수용체-독립성 QSAR은 화학적 화합물이 공통의 작용 기전을 공유한다는 가정에 기초하여, 의존성 (즉, 생물학적 활성) 특성이 일단의 분자내 서술자로부터 유래되는 일련의 화학적 유사체에 적용될 수 있다. 회귀 분석은 화합물의 서술자를 수용체-독립성 3D-QSAR 분석을 위한 활성 프로필의 상이한 치수에 피팅시키는데 이용될 수 있다.
수용체-의존성 3D-QSAR. 다른 접근법은 유리 에너지 포스 필드 QSAR (FEFF-QSAR)로 지칭되는 수용체-의존성 3D-QSAR을 이용하는 것일 수 있다. 수용체-의존성 3D-QSAR 분석의 경우에, 수용체 결합 구조가 알려져 있다. 유리 에너지 포스 필드 리간드-수용체 결합 에너지 조건은 QSAR 스코어링 함수의 독립 변수로서 계산되고 이용될 수 있다 (참조: Tokarski and Hopfinger (1997), J. Chem. Inf. Computer Sci. 37:792-811을 참조하고, 이는 본 발명에 참조로서 편입된다).
수용체-의존성 또는 수용체-독립성 4D-QSAR. 4D-QSAR 모형은 일단의 훈련 화합물에서 분자 상태 앙상블 평균화 (molecular state ensemble averaging)를 수행함으로써, 배좌적 자유도 (conformational freedom) 및 정렬 자유도 (alignment freedom)를 3D-QSAR 분석과 통합할 수 있다 (네 번째 특징). 4D-QSAR 분석에서, 화합물의 활성에서 차이는 상호작용 약리작용단 요소 (interaction pharmacophore element, IPE)에 대하여 분자 모양 (molecular shape)의 Boltzmann 평균 공간적 분포 (average spatial distribution)에서 차이에 관련될 수 있는 것으로 생각된다. 단일 "활성" 배좌가 일단의 훈련 화합물에서 각 화합물에 대하여 가정될 수 있다. 4D-QSAR 분석은 수용체 독립성 3D-QSAR 및 FEFF-QSAR 모형을 비롯한 추가의 분자 설계 애플리케이션과 함께 이용될 수 있다. 이들 4D-QSAR 모형은 Duca and Hopfinger (2001), J Chem Inf Comput Sci 41(5): 1367-87에서 기술되고, 이는 본 발명에 참조로서 편입된다.
장치, 컴퓨터 및 컴퓨터
프로그램 산물 수행
본 발명은 컴퓨터-판독가능 저장 매체에 장착된 컴퓨터 프로그램 메커니즘을 포함하는 컴퓨터 프로그램 산물로서 수행될 수 있다. 게다가, 본 발명의 방법은 하나 이상의 컴퓨터 또는 다른 형태의 장치에서 수행될 수 있다. 장치의 실례에는 컴퓨터, 그리고 측정 장치 (가령, 분석 판독기 또는 스캐너)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 더 나아가, 본 발명의 방법은 하나 이상의 컴퓨터 프로그램 산물에서 수행될 수 있다. 본 발명의 일부 구체예는 본 명세서에서 개시된 임의의 또는 모든 방법을 암호화하는 컴퓨터 프로그램 산물을 제시한다. 이런 방법은 CD-ROM, DVD, 자기 디스크 저장 산물, 또는 임의의 다른 컴퓨터-판독가능 데이터 또는 프로그램 저장 산물에서 저장될 수 있다. 이런 컴퓨터 판독가능 저장 매체는 실체적인 물체 (반송파에 대립됨)인 것으로 의도된다. 이런 방법은 또한, 영구 저장소, 예를 들면, ROM, 하나 이상의 프로그램가능 칩, 또는 하나 이상의 주문형 집적회로 (application specific integrated circuit, ASIC)에 장착될 수 있다. 이런 영구 저장소는 서버, 802.11 액세스 포인트, 802.11 무선 브리지/스테이션, 중계기, 라우터, 휴대전화, 또는 기타 전자 장치 내에 위치될 수 있다. 컴퓨터 프로그램 산물에서 암호화된 이들 방법은 또한, 인터넷 또는 다른 경로를 통하여, 디지털로 또는 반송파 (명백하게, 반송파의 이런 이용은 저장이 아닌 배포를 위한 것이다)에서 컴퓨터 데이터 신호 (여기에 소프트웨어 모듈이 장착된다)의 전송에 의해 전자적으로 배포될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서는 컴퓨터 프로그램 산물을 제시한다. 이들 프로그램 모듈은 CD-ROM, DVD, 자기 디스크 저장 산물, 또는 임의의 다른 컴퓨터-판독가능 데이터 또는 프로그램 저장 산물에서 저장될 수 있다. 이들 프로그램 모듈은 또한, 영구 저장소, 예를 들면, ROM, 하나 이상의 프로그램가능 칩, 또는 하나 이상의 주문형 집적회로 (application specific integrated circuit, ASIC)에 장착될 수 있다. 이런 영구 저장소는 서버, 802.11 액세스 포인트, 802.11 무선 브리지/스테이션, 중계기, 라우터, 휴대전화, 또는 기타 전자 장치 내에 위치될 수 있다. 컴퓨터 프로그램 산물에서 이들 소프트웨어 모듈은 또한, 인터넷 또는 다른 경로를 통하여, 디지털로 또는 반송파에서 컴퓨터 데이터 신호 (여기에 소프트웨어 모듈이 장착된다)의 전송에 의해 전자적으로 배포될 수 있다.
특정 구체예에서, 이러한 컴퓨터 프로그램은 청구된 방법의 결과를 사용자, 사용자 인터페이스 장치, 컴퓨터 판독가능 저장 매체, 모니터, 로컬 컴퓨터, 또는 네트워크의 일부인 컴퓨터에 출력한다. 이런 컴퓨터 판독가능 저장 매체는 실체적인 물체 (반송파에 대립됨)인 것으로 의도된다.
본 발명의 이들 및 기타 구체예는 아래의 무제한적 실례에서 더욱 예증될 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1-3은 각각, 본 발명에 따라서 이용될 수 있는 컴퓨터 프로그램 모듈의 도해이다.
도 4는 여러 화합물에 대한 용량 반응 곡선을 각각 보여주는 4개의 패널을 포함하고, 이들 화합물 각각은 NaV α, β1과 β2 아단위를 발현하는 4가지 상이한 NaV 1.7 세포주에 대하여 시험되었다.
도 5는 Bin으로 분류된, 상이한 화합물의 상이한 용량에 대한 NaV α, β1과 β2 아단위를 발현하는 상이한 NaV 1.7 세포주의 반응을 보여주는 표이다.
도 6은 감칠맛 수용체-발현 (RNA) 세포-기초된 분석 이후에 획득된 데이터의 막대 그래프 표현이고, 여기서 감칠맛 수용체-발현 세포는 12.5 mM 프럭토오스 (단맛 작동약) 또는 25 mM MSG (감칠맛 작동약)로 처리되고 다양한 조건에서 성장되며, 그리고 이들 조건 중에서 3가지 (1, 2와 "최종")에서 시험된 동일한 세포의 분취량으로부터 분석 결과가 본 도면에서 도시된다.
도 7은 감칠맛 수용체 T1R1과 T1R3 아단위, 그리고 Gα15 단백질을 발현하는 본 발명의 세포주의 정량적 유전자 발현 분석의 그래프 표현이다. 전체 RNA는 T1R1, T1R3, 그리고 Gα15에 대한 유전자-특이적 프라이머와 프로브를 이용한 유전자 발현의 TaqMan 분석을 위하여 세포주로부터 추출되었다. 대조 세포에 비하여 상대적인 발현 수준이 제공된다.
도 8에서는 9개월 배양후 세포주에서 감칠맛 수용체 발현의 안정성을 분석하는 대표적인 겔을 도시한다. 감칠맛 수용체-발현 세포주의 1개월과 9개월 배양액에서 T1R1, T1R3 및 Gα15 유전자 발현을 평가하기 위하여 단일 종점 RT-PCR이 이용되었다. 역전사효소의 존재 또는 부재 ("+RT" 또는 "-RT")에서, 그리고 대조 세포 ("대조") 또는 물 단독 ("없음") 시료를 이용한 반응 역시 수행되고, 그리고 양성 대조로서, 플라스미드 인코딩된 네오마이신 내성 유전자 ("neo")의 발현이 이용되었다. 화살표는 양성 결과가 예상되었던 반응을 지시한다. 다수의 반응으로 인하여, 상이한 겔로부터 데이터는 디지털 방식으로 병렬되었다. T1R3에 대한 데이터는 이들 반응이 독립된 PCR 조건을 필요로 했기 때문에 별개의 패널에 도시된다.
도 9는 감칠맛 수용체-발현 세포-기초된 분석을 수행한 이후에 산출된 일련의 대표적인 반응 궤적 (response trace)이다. 감칠맛 수용체-발현 세포-기초된 분석는 대조로서 완충액 단독 (상자로 표시된 웰) 및 나머지 웰에서 33mM에서 감칠맛 수용체 작동약 MSG를 이용하여 수행되었다. 상기 세포주는 > 0.8의 Z' 값을 산출한다.
도 10은 감칠맛 수용체-발현 세포-기초된 분석에서 감칠맛 수용체 작동약 MSG를 이용한 용량 반응 곡선 실험 이후에 획득된 데이터를 표현하는 선 그래프이다. 감칠맛 수용체-발현 세포주와 대조 세포의 반응은 작동약 농도의 함수로서 플롯팅 (plotting)되었다.
도 11은 다양한 농도의 MSG (1mM-100mM, 오른쪽에서 왼쪽으로) 및 강화제 IMP (0mM-30mM, 아래쪽에서 위쪽으로)의 존재에서 감칠맛 수용체-발현 세포-기초된 분석을 수행한 이후에 산출된 일련의 대표적인 반응 궤적이다.
도 12는 다양한 농도의 사이클라민산나트륨 (sodium cyclamate)의 존재에서 감칠맛 수용체-발현 세포-기초된 분석을 수행한 이후에 산출된 일련의 대표적인 반응 궤적이다.
도 13은 일정한 농도 범위의 쓴맛 추출물 (x-축)의 존재에서 고유 (원)와 태그표식된 (사각형) 인간 쓴맛 수용체의 독특한 기능적 활성 (y-축에서 "분석 반응")을 보여주는 그래프이다.
도 14는 인간 쓴맛 수용체를 발현하는 세포주가 기능적 수용체 반응에 대하여 최대 89% 양성 비율을 나타낸다는 증명하는 표이다. 각 셀은 96-웰 평판에서 웰을 표시한다. 검은색 상자는 세포 없음/너무 적은 세포를 표시한다. 흰색 상자는 세포가 존재하지만 상기 웰의 배경 신호를 초과하는 작동약 신호가 없음을 표시한다. 회색 상자는 세포가 존재하고 상기 웰의 배경 신호를 초과하는 작동약 신호가 있음을 표시한다.
도 15는 (1) 본 발명의 방법에 따라서 분리된 쓴맛 수용체-발현 세포주 (위쪽 패널) 및 (2) 약물-선별된 세포 (아래쪽 패널)에서 쓴맛 작동약에 대한 쓴맛 수용체 반응의 실시간 영상법의 일련의 형광 현미경 사진이다.
도 16은 25가지의 인간 쓴맛 수용체-Gα15 세포주에서 이소프로테레놀에 대한 상대적인 반응의 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 17은 일시적인 형질감염 분석에서 확인된 바와 같은 폭넓게 조율된, 중간 정도로 조율된, 그리고 선별적 쓴맛 수용체를 보여주는 표이다.
도 18은 기능적 세포-기초된 분석에서 측정되고 25개의 상이한 인간 쓴맛 수용체의 기초 활성을 초과하는 활성 비율로서 표시되는, 이들 수용체에서 상이한 화합물의 활성을 보여주는 표이다.
도 19는 고유 세포주 (위쪽 줄) 및 태그표식된 세포주 (아래쪽 줄)를 이용한 상이한 쓴맛 수용체 지정을 보여주는 표이다.
도 20은 검사 화합물로서 12.5mM 프럭토오스 (단맛 작동약) 또는 25mM MSG (감칠맛 작동약)를 이용한 단맛 수용체-발현 (RNA) 세포-기초된 분석의 막대 그래프 표현이다. 배양액은 다양한 조건에서 성장되고, 그리고 이들 조건 중에서 3가지 (1, 2와 "최종")에서 시험된 동일한 세포의 분취량으로부터 분석 결과가 본 도면에서 도시된다. 분석 반응은 대조 세포 값에 표준화된다.
도 21은 단맛 수용체 인간 T1R2와 T1R3 아단위 (각각, 서열 번호 31과 32) 및 생쥐 Gα15 단백질 (서열 번호 33)을 발현하는 본 발명의 세포주의 정량적 유전자 발현 분석의 그래프 표현이다. 전체 RNA는 상기 세포주로부터 추출되고, 그리고 인간 T1R2와 T1R3, 그리고 생쥐 Gα15에 대한 유전자-특이적 프라이머와 프로브를 이용하여 유전자 발현에 대하여 TaqMan에 의해 분석되었다. 대조 세포에 비하여 상대적인 발현 수준이 제공된다.
도 22에서는 9개월 배양후 본 발명의 세포주에서 단맛 수용체 발현의 안정성을 분석하는 대표적인 겔을 도시한다. 단맛 수용체-발현 세포주의 1개월과 9개월 배양액에서 인간 T1R2, 인간 T1R3 및 생쥐 Gα15 유전자 발현을 평가하기 위하여 단일 종점 RT-PCR이 이용되었다. 역전사효소의 존재 또는 부재 ("+RT" 또는 "-RT")에서, 그리고 대조 세포 ("대조") 또는 물 단독 ("없음") 시료를 이용한 반응 역시 수행되고, 그리고 양성 대조로서, 플라스미드 인코딩된 네오마이신 내성 유전자 ("neo")의 발현이 이용되었다. 화살표는 양성 결과가 예상되었던 레인을 지시한다. 다수의 반응으로 인하여, 상이한 겔로부터 데이터는 디지털 방식으로 병렬되었다. 인간 T1R3에 대한 데이터는 이들 반응이 독립된 PCR 조건을 필요로 했기 때문에 별개의 패널에 도시된다.
도 23은 엇갈리는 웰에서 75mM에서 단맛 수용체의 공지된 작동약, 프럭토오스, 그리고 다른 웰에서 대조로서 이용된 완충액 단독의 단맛 수용체-발현 세포-기초된 분석 (본 발명의 세포를 이용)를 수행한 이후에 산출된 일련의 대표적인 반응 궤적이다. 상기 세포주는 ≥ 0.8의 Z' 값을 산출한다.
도 24 (A-C)는 단맛 수용체-발현 세포-기초된 분석 (본 발명의 세포를 이용)에서 단맛 수용체 작동약을 이용한 다양한 용량 반응 실험에서 획득된 데이터를 표시하는 일련의 선 그래프이다. (A) 천연 칼로리 감미료에 대한 단맛 수용체-발현 세포주의 반응은 작동약 농도의 함수로서 플롯팅 (plotting)되었다. (B) 단맛 수용체-발현 세포-기초된 분석에서 일반적인 인공 감미료의 용량 반응 곡선. (C) 단맛 수용체-발현 세포-기초된 분석에서 천연 고농도 감미료의 용량 반응 곡선.
도 25는 본 발명의 세포를 이용한 단맛 수용체-발현 세포-기초된 분석을 수행한 이후에 산출된 일련의 대표적인 반응 궤적이다. 대부분의 작동약에서 관찰되는 전형적인 종-모양 GPCR 반응에 대조적으로, 스테비아 (stevia) 작동약은 칼슘 유동 FDSS 분석에서 연장된 반응을 보였다.
도 26 (A-B)에서는 T1R2의 게놈 좌위를 도시한다. 도 26A에서는 염색체 1 내에 T1R2 좌위의 위치를 도시한다. 도 26B에서는 T1R2 유전자에 대한 한 가지 가능 인트론-엑손 코딩 구조를 도시한다. 이러한 정보는 the University of California (Santa Cruz.)의 게놈 브라우저로부터 획득되었다. T1R2에 상응하는 엑손과 인트론은 5'에서 3' 방향으로 수치로 지시된다. 엑손 번호는 검은색으로 지시되고, 그리고 인트론 번호는 회색으로 지시된다. 척도 및 염색체 위치가 지시된다. 이러한 정보는 the University of California (Santa Cruz.)의 게놈 브라우저로부터 획득되었다.
도 27 (A-B)에서는 T1R3의 게놈 좌위를 도시한다. 도 27A에서는 염색체 1 내에 T1R3 좌위의 위치를 도시한다. 이러한 정보는 the University of California (Santa Cruz.)의 게놈 브라우저로부터 획득되었다. 도 27B에서는 T1R3 유전자에 대한 한 가지 가능 인트론-엑손 코딩 구조를 도시한다. T1R3에 상응하는 엑손과 인트론은 5'에서 3' 방향으로 수치로 지시된다. 엑손 번호는 검은색으로 지시되고, 그리고 인트론 번호는 회색으로 지시된다. 척도 및 염색체 위치가 지시된다. 이러한 정보는 the University of California (Santa Cruz.)의 게놈 브라우저로부터 획득되었다.
도 28 (A-B)에서는 배경과 비교하여 프럭토오스 (15mM의 최종 농도로)의 첨가에 대한 본 발명의 세포의 기능적 세포-기초된 반응의 대표적인 궤적을 도시한다. 개별 분리된 세포로부터 배양된 세포(검은색 궤적)는 대조 세포 (회색 궤적)에 대하여 시험되었다. 이들 세포는 검사와 대조 세포 시료 둘 모두로부터 대조 반응, 또는 배경을 뺄셈함으로써 증명되는 바와 같이, 프럭토오스에 대한 더욱 높은 반응을 보였다. 이러한 세포-기초된 분석은 형광 칼슘 신호전달 염료를 이용하여 칼슘 유동을 보고하도록 설계되었다. 형광 분석 반응은 Y-축을 따라 플롯팅되고, 그리고 시간은 X-축을 따라 표시된다. 화살표는 프럭토오스가 첨가된 시점을 지시한다. 도 28A에서는 대조와 비교하여 개별 HuTu 세포로부터 배양된 세포로부터 궤적을 도시한다. 도 28B에서는 대조와 비교하여 개별 H716 세포로부터 배양된 세포로부터 궤적을 도시한다. 도 28C에서는 대조와 비교하여 개별 293T 세포로부터 배양된 세포로부터 궤적을 도시한다.
도 29 (A-B)에서는 배경과 비교하여 헬리오날 (Helional) 및 부르지오날 (Bourgeonal)에 대한, 인간 후각 수용체를 발현하는 세포의 기능적 세포-기초된 반응의 대표적인 궤적을 도시한다. 도 29A에서는 대조로서 DMSO 운반제 배경 신호와 비교하여 헬리오날 (Helional) (4.5 mM의 최종 농도로)에 대한, 인간 후각 수용체 OR3A1을 발현하는 본 명세서에서 기술된 세포주의 기능적 세포-기초된 반응의 대표적인 궤적을 도시한다. 검사 궤적 (검은색) 및 대조 궤적 (회색)이 도시된다. 이들 세포는 배경에 비하여 헬리오날 (Helional)에 대한 반응을 나타냈다. 이러한 세포-기초된 분석은 형광 칼슘 신호전달 염료를 이용하여 칼슘 유동을 보고하도록 설계되었다. 형광 분석 반응은 Y-축을 따라 플롯팅되고, 그리고 시간은 X-축을 따라 표시된다. 화살표는 헬리오날 (Helional) 또는 DMSO가 첨가된 시점을 지시한다.
도 29B에서는 대조로서 DMSO 운반제 배경 신호와 비교하여 부르지오날 (Bourgeonal) (0.3 mM의 최종 농도로)에 대한, 인간 후각 수용체 OR1D2를 발현하는 본 명세서에서 기술된 세포주의 기능적 세포-기초된 반응의 대표적인 궤적을 도시한다. 검사 궤적 (검은색) 및 대조 궤적 (회색)이 도시된다. 이들 세포는 배경에 비하여 부르지오날 (Bourgeonal)에 대한 반응을 나타냈다. 이러한 세포-기초된 분석은 형광 칼슘 신호전달 염료를 이용하여 칼슘 유동을 보고하도록 설계되었다. 형광 분석 반응은 Y-축을 따라 플롯팅되고, 그리고 시간은 X-축을 따라 표시된다. 화살표는 부르지오날 (Bourgeonal) 또는 DMSO가 첨가된 시점을 지시한다.
실시예 1. 안정적인 GABA A -발현 세포주의 산출
발현 벡터의 산출
간결한 클로닝을 가능하게 하는 플라스미드 발현 벡터는 pCMV-SCRIPT (Stratagene)에 기초하여 산출되고, 그리고 CMV와 SV40 진핵 프로모터; SV40과 HSV-TK 폴리아데닐화 서열; 복수 클로닝 부위; Kozak 서열; 그리고 네오마이신/카나마이신 내성 카세트를 비롯하여, 목적되는 유전자의 전사와 번역을 위한 다양한 필수 성분을 포함하였다.
단계 1: 형질감염
293T와 CHO 세포 둘 모두 형질감염되었다. 본 실시예에서는 CHO 세포에 집중하는데, 여기서 이들 CHO 세포는 아래의 조합: α1β3γ2s (α1), α2β3γ2s (α2), α3β3γ2s (α3) 및 α5β3γ2s (α5)에서, 3가지 별개의 플라스미드, 인간 GABA 알파 아단위를 인코딩하는 플라스미드 (서열 번호 1-4), 인간 GABA 베타 3 아단위를 인코딩하는 플라스미드 (서열 번호:5) 및 인간 GABA 감마 2 아단위를 인코딩하는 다른 플라스미드 (서열 번호 6)로 공동형질감염되었다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 선택된 호스트 세포와 함께 이용하기 적합한 임의의 시약이 적절한 최적화로, 핵산, 예를 들면, 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, 또는 표지된 올리고뉴클레오티드를 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있는 시약의 실례에는 Lipofectamine, LIPOFECTAMINE 2000, Oligofectamine, TFX 시약, Fugene 6, DOTAP/DOPE, Metafectine, 또는 Fecturin이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
비록 약물 선별이 본 발명의 방법에서 선택 사항이긴 하지만, 플라스미드 마다 하나의 약물 내성 마커가 포함되었다. 이들 서열은 CMV 프로모터의 제어 하에 있었다. 신호전달 프로브에 의한 검출을 위한 태그를 인코딩하는 비번역 서열 역시 약물 내성 마커를 인코딩하는 서열과 함께 존재하였다. 이용된 표적 서열은 GABA 표적 서열 1 (서열 번호 7), GABA 표적 서열 2 (서열 번호 8) 및 GABA 표적 서열 3 (서열 번호 9)이었다. 이들 실례에서, GABA 알파 아단위 유전자-포함 벡터는 GABA 표적 서열 1을 포함하고, GABA 베타 아단위 유전자-포함 벡터는 GABA 표적 서열 2를 포함하고, 그리고 GABA 감마 아단위 유전자-포함 벡터는 GABA 표적 서열 3을 포함하였다.
단계 2: 선별 단계
형질감염된 세포는 HAMF12-FBS에서 2일 동안, 그 이후에 항생제-포함 HAMF12-FBS에서 14일까지 성장되었다. 이러한 항생제 포함 기간 동안, 항생제가 아래와 같이 배지에 첨가되었다: 퓨로마이신 (3.5 ㎍/㎖), 하이그로마이신 (150 ㎍/㎖), 그리고 G418/네오마이신 (300 ㎍/㎖).
단계 3: 세포 계대배양
항생제 선별 이후, 그리고 형광 프로브의 도입에 앞서, 세포는 선택된 기간 동안 안정적이지 않은 발현이 진정될 수 있는 시간을 허용하기 위하여 항생제 선별의 부재에서 6 내지 18회 계대배양되었다.
단계 4: 형광 프로브에 세포의 노출
세포는 수확되고 GABA 신호전달 프로브 (서열 번호 10-12)로 형질감염되었다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 선택된 호스트 세포와 함께 이용하기 적합한 임의의 시약이 적절한 최적화로, 핵산, 예를 들면, 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, 또는 표지된 올리고뉴클레오티드를 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있는 시약의 실례에는 Lipofectamine, LIPOFECTAMINE 2000, Oligofectamine, TFX 시약, Fugene 6, DOTAP/DOPE, Metafectine, 또는 Fecturin이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
GABA 신호전달 프로브 1은 GABA 표적 서열 1에 결합하고, GABA 신호전달 프로브 2는 GABA 표적 서열 2에 결합하고, 그리고 GABA 신호전달 프로브 3은 GABA 표적 서열 3에 결합한다. 이들 세포는 이후, 분석을 위하여 수집되고 형광 활성화된 세포 분류기 (Beckman Coulter, Miami, FL) (하기)를 이용하여 분류되었다.
신호전달 프로브에 의해 검출된 표적 서열
GABA 표적 1
5'-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3' (서열 번호 7) (알파 아단위)
GABA 표적 2
5'-GAAGTTAACCCTGTCgttctgcgac-3' (서열 번호 8) (베타 아단위)
GABA 표적 3
5'-GTTCTATAGGGTCTGCTTGTCGCTC-3' (서열 번호 9) (감마 아단위)
신호전달 프로브
100 μM 스톡 (stock)으로 제공됨
GABA 신호전달 프로브 1 - (GABA 표적 1)에 결합
5' - Cy5 GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ3 소광기 -3' (서열 번호 10)
GABA 신호전달 프로브 2 - (GABA 표적 2)에 결합
5'- Cy5.5 GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGC BHQ3 소광기 -3' (서열 번호 11)
Cy5와 유사한 스펙트럼 특성을 갖는 Quasar Dye (BioSearch)를 이용한 유사한 프로브가 일정한 실험에 이용되었다. 또한, 일부 경우에 DNA 프로브 대신에 5-MedC와 2-아미노 dA 혼합기 프로브가 이용될 수 있다는 점에 주의한다. BHQ3이 프로브 1 또는 프로브 2에서 BHQ2 또는 금 입자로 치환될 수 있다는 점에 주의한다.
GABA 신호전달 프로브 3 - (GABA 표적 3)에 결합
5'- Fam GCGAGAGCGACAAGCAGACCCTATAGAACCTCGC BHQ1 소광기 -3'' (서열 번호 12)
BHQ1이 프로브 3에서 BHQ2 또는 Dabcyl로 치환될 수 있다는 점에 주의한다.
단계 5: 양성 세포의 분리
이들 세포는 해리되고, 그리고 분석 및 형광 활성화된 세포 분류기 (Beckman Coulter, Miami, FL)를 이용한 분류를 위하여 수집되었다. 배경을 초과하여 형광을 발하는 세포를 게이팅 (gating)하고, 그리고 게이트 내에 속하는 개별 세포를 바코드 부착된 96-웰 평판으로 분리하기 위하여 표준 분석 방법이 이용되었다. 게이팅 체계 (gating hierarchy)는 아래와 같았다: 게이팅 체계: 일치 게이트 (coincidence gate) > 싱글렛 게이트 (singlets gate) > 라이브 게이트 (live gate) > 분류 게이트 (Sort gate). 이러한 게이팅 전략으로, 삼중 양성 세포의 상위 0.04-0.4%는 바코드 부착된 96-웰 평판으로 분류되는 것으로 표기되었다.
단계 6: 단계 1-5 및/또는 3-5의 추가 사이클
단계 1 내지 5 및/또는 3-5는 더욱 많은 수의 세포를 획득하기 위하여 반복되었다. 단계 1-5의 2번의 독립된 라운드가 완결되었고, 그리고 이들 사이클 각각에 대하여, 단계 3-5의 적어도 3번의 내부 사이클이 각각의 독립된 라운드를 위하여 실시되었다.
단계 7: 세포 개체군에 대한 성장 속도의 평가
이들 평판은 Hamilton Microlabstar 자동화 액체 조작기 (automated liquid handler)로 이동되었다. 세포는 100 단위/㎖ 페니실린 + 0.1 ㎎/㎖ 스트렙토마이신으로 보충된, 2-3일 조건 성장 배지 : 새로운 성장 배지 (성장 배지는 Ham의 F12/10% FBS이다)의 1:1 혼합물에서 5-7일 동안 배양되고, 이후 덩어리를 최소화시키기 위하여 0.25% 트립신으로 트립신처리에 의해 분산되고 새로운 96-웰 평판으로 이동되었다. 클론이 분산된 이후, 평판은 웰 (Genetix)의 포화도를 결정하기 위하여 이미지화되었다. 각 평판은 평판 전역에서 신뢰성 있는 영상 획득을 위하여 집중되었다. 70% 이상의 보고된 포화도는 신뢰되지 않았다. 포화도 측정은 9일 (분산후 1일과 10일 사이에)에 걸쳐 3회 실시되고 성장 속도를 계산하는데 이용되었다.
단계 8: 성장 속도 평가치에 따른 세포 개체군 비닝
세포는 단계 7에서 분산 단계 이후 10-11일 사이에 성장 속도에 따라 비닝 (binning) (독립적으로 분류되고 코호트 (cohort)로서 도말됨) 되었다. 빈 (bin)은 독립적으로 수집되고 하류 취급을 위한 개별 96 웰 평판에 도말되고, 그리고 특정 빈 마다 하나 이상의 표적 평판이 존재할 수 있었다. 빈 (bin)은 성장 속도의 전개를 고려하고 높은 비율의 세포 개체군 총수를 포괄하는 범위를 일괄함으로써 계산되었다. 분류 반복 (sort iteration) (단계 5 참조)에 따라서, 5 내지 6개의 성장 빈 (growth bin)이 1-4일의 간격으로 이용되었다. 이런 이유로, 각 빈은 반복에 따라서, 12 내지 14.4 시간의 성장 속도 또는 개체군 배가시간 차이에 상응하였다.
단계 9: 병렬 처리를 진척시키고 엄격한 QC를 제공하는 복제 평판법 (replica plating)
이들 평판은 항생제 없는 Ham의 F12 배지/10%FBS에서 표준화되고 고정된 조건 (가습된 37℃, 5% CO2/95% 공기) 하에 배양되었다. 이들 세포 평판은 표적 평판의 4개 세트 (이러한 세트는 모든 성장 빈과 함께, 모든 평판으로 구성된다 - 이들 단계는 최초 세트의 4개 복제물이 존재하도록 담보한다)를 생산하기 위하여 분할되었다. 최대 2개의 표적 평판 세트는 저온 보존 (cryopreservation)되고 (하기 참조), 그리고 나머지 세트는 스케일에 따라 분류되고 계대배양 및 기능 분석 실험을 위하여 더욱 복제 도말되었다. 각각의 독립적으로 운반된 평판 세트에 대하여 별개의 독립된 조직 배양 시약, 배양기, 인력 및 이산화탄소 공급원이 이용되었다. 모든 조직 배양 시약의 적절한 생산과 품질을 담보하기 위한 품질 관리 단계가 실시되었다: 이용을 위하여 준비된 배지의 각 병에 첨가된 각 성분은 두 번째 지정된 사람이 실수가 없도록 모니터링하는 동안, 지정된 후드에서 지정된 사람에 의해 상기 후드 내에서 단지 그 시약만을 이용하여 첨가되었다. 액체 취급 조건은 벽을 통한 교차 오염이 제거되도록 설정되었다. 모든 단계를 위해 새로운 팁이 이용되거나, 또는 엄격한 팁 세척 프로토콜이 이용되었다. 정확한 부피 전달, 효과적인 세포 조작, 세척 사이클, 피펫팅 속도와 위치, 세포 분산을 위한 피펫팅 사이클의 횟수, 그리고 평판에 대한 팁의 상대적 위치에 대한 액체 취급 조건이 설정되었다.
단계 10 - 세포 개체군의 조기 계대배양 스톡의 동결
2개 이상의 평판 세트가 -70℃ 내지 -80℃에서 동결되었다. 각 세트의 평판은 먼저 70 내지 100%의 포화도 (confluency)가 달성되도록 허용되었다. 배지가 흡인되고 90% FBS 및 10% DMSO가 첨가되었다. 이들 평판은 파라필름으로 밀봉되고, 1 내지 5 cm 발포체로 개별적으로 둘러싸이고, 이후 -80℃ 냉동장치 내로 넣어졌다.
단계 11 - VSF를 생산하기 위한 초기 형질전환 단계를 위한 방법 및 조건
남아있는 평판 세트는 단계 9 (상기)에서 기술된 바와 같이 유지되었다. 모든 세포 분할 (splitting)은 배지 제거, 세포 세척, 트립신 첨가와 배양, 소광 및 세포 분산 단계를 비롯한 자동화 액체 취급 단계를 이용하여 실시되었다.
단계 12 - 성장 속도의 나머지 편차를 보정하기 위한 표준화 방법
모든 세포 개체군에 대한 세포 및 배양 조건의 일관성 및 표준화가 제어되었다. 성장 속도에서 약간의 차이로 인한 평판 전역에서 차이는 평판 전역에서 세포 수의 주기적 표준화에 의해 제어될 수 있다.
단계 13 - 세포 개체군의 특성화
세포는 이들 조건 하에서 그들의 시험관내 진화가 일어나도록 하기 위하여 6 내지 8주의 세포 배양 동안 유지되었다. 이 기간 동안, 크기, 형태, 취성, 트립신처리에 대한 반응 또는 해리, 해리후 둥글기/평균 원형도, 생존율(%), 미세포화도 (microconfluency) 경향, 또는 세포 유지의 다른 측면, 예를 들면, 배양 평판 표면에 부착성이 관찰되었다.
단계 14 - VSF 조건 하에서 세포 개체군의 잠재적 기능성 평가
세포 개체군은 기능적 기준을 이용하여 조사되었다. 막 전위 분석 키트(Molecular Devices/MDS)는 제조업체의 지시에 따라 이용되었다. 세포는 96 웰 또는 384 웰 평판에서 여러 다른 밀도로 조사되고, 그리고 반응이 분석되었다. 도말후 다양한 시점, 예를 들면, 도말후 12-48 시간이 이용되었다. 또한, 분석 반응 차이에 대하여 다른 도말 밀도가 조사되었다.
단계 15
3 내지 9주 범위의 지정된 기간 동안 가장 일관된 반응을 보이는 세포를 확인하기 위하여, 낮은 및 더욱 높은 계대배양 횟수에서 실시된 실험으로부터 기능적 반응이 비교되었다. 형태, 미세포화도 경향, 그리고 도말후 배양 매트릭스에 부착하는 시간을 비롯하여, 시간의 흐름 동안 변하는 세포의 다른 특징들도 주목된다.
단계 16
기능적 및 다른 기준을 충족하는 세포 개체군은 생존가능하고, 안정하며 기능적인 세포주를 생산하기에 가장 적합한 것을 결정하기 위해서 추가로 평가되었다. 선별된 세포 개체군은 거대 조직 배양 용기에서 증식되고, 그리고 앞서 기술된 특성화 단계가 이들 조건하에서 지속되거나 반복되었다. 이 시점에서, 일관되고 신뢰성 있는 계대배양을 위해서 추가의 표준화 단계가 도입되었다. 이들에는 상이한 도말 세포 밀도, 계대배양 시간, 배양 접시 크기/형태 및 코팅, 유체공학 최적화, 세포 해리 최적화 (유형, 이용된 부피 및 시간), 그리고 세척 단계가 포함되었다. 분석 Z' 스코어는 4주의 배양 기간 동안 매 수일마다 조사될 때 안정하였다.
또한, 각 계대배양에서 세포의 생존율이 측정되었다. 수동 개입이 증가되고, 그리고 세포는 면밀히 관찰되고 모니터링되었다. 이러한 정보는 원하는 성질을 유지하는 최종 세포주를 확인 및 선별하는데 도움이 되었다. 일관된 성장, 적절한 부착성 및 기능적 반응을 나타내는 최종 세포주 및 백업 세포주가 선별되었다.
단계 17 - 세포 은행의 확립
최종 세포주 및 백업 세포주에 상응하는 낮은 계대배양 동결 평판 (상기 참조)은 37℃에서 해동되고, Ham의 F12/10% FBS로 2회 세척되고, 가습된 37℃/5% CO2 조건에서 배양되었다. 이들 세포는 이후, 2-3주 동안 증식되었다. 각각 천만 개의 세포를 포함하는 25개의 바이알로 이루어진 각각의 최종 및 백업 세포주에 대한 세포 은행이 확립되었다.
단계 18
세포 은행으로부터 하나 이상의 바이알이 해동되고 배양 동안 증식되었다. 생산된 세포는 이들 세포가 그들이 처음 선별되었던 특성과 동일한 특성을 충족하는지를 확인하기 위하여 조사되었다.
실시예 2: GABA 리간드에 대한 GABAA 세포주 반응의 검증
내생적 GABAA 리간드인 GABAA (α1β3γ2s (α1), α2β3γ2s (α2), α3β3γ2s (α3) 및 α5β3γ2s (α5)의 아단위 조합) GABA를 발현하는 CHO 세포주의 반응이 평가되었다. GABA와 세포주의 상호작용은 하기 프로토콜을 이용하여, GABA에 응하는 GABAA의 막 전위를 측정하여 평가되었다.
세포는 분석전 24시간 시점에, 384 웰 평판에서 성장 배지 (Ham F-12 배지 + FBS 및 글루타민)에서 웰당 10-25,000개 세포로 도말되었다. 배지 제거 이후에, 적하 완충액 (137mM NaCl, 5mM KCl, 1.25mM CaCl, 25mM HEPES, 10mM 글루코오스)에 희석된 막 전위 염료가 첨가되었다. 1시간 동안 배양한 이후에, 고처리량 형광 평판 판독기 (Hamamastu FDSS)에 평판 적하되었다. GABA 리간드는 MP 분석 완충액(137mM NaCl, 5mM KGluconate, 1.25mM CaCl, 25mM HEPES, 10mM 글루코오스)에서 원하는 농도로 희석되고(필요에 따라, GABA의 일련의 희석물이 산출되었고, 이용된 농도는 다음과 같다: 3nM, 10nM, 30nM, 100nM, 300nM, 1μM, 3μM, 10μM), 각 웰에 첨가되었다. 이들 평판은 90초간 판독되었다.
표 6 (하기)에서는 생산된 각 세포주가 GABA 리간드에 반응한다는 것을 입증한다. 이들 결과는 내생적 리간드에 예측한 바와 같이 반응하는 생산된 GABAA 세포주가 고처리량 스크리닝 분석에 이용하기에 생리적으로 적절하다는 것을 지시한다. 또한, 복제 웰은 웰별로 정확한 EC50 값을 생성하였는데, 이는 GABAA 세포주의 높은 재현성을 지시하였다. 막 전위 분석을 이용하여 산출된 Z' 값은 α1β3γ2s 0.58, α2β3γ2s 0.67, α3β3γ2s 0.69 및 α5β3γ2s 0.62이었다.
실시예 3: 공지된 GABA A 조절제를 이용한 GABA A 세포주의 추가 검증
GABAA 세포주 및 막 전위 분석은 30μM, 10μM, 3μM, 1μM, 300nM, 100nM 및 30nM에서 비쿠쿨린 (공지의 길항약)의 분석 완충액에서 일련의 희석물을 이용하여 실시예 2에 기술된 방법으로 검증되었다.
비쿠쿨린은 GABA의 EC50 농도의 존재 하에 모두 4종의 GABAA 세포주와 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 GABAA의 이러한 공지된 조절제에 예측한 바와 같이 반응하는 생산된 GABAA 세포주가 고처리량 스크리닝 분석에 이용하기에 생리적으로 그리고 약리학적으로 적절하다는 것을 지시한다.
실시예 4: 막 전위 분석을 이용한 고유 GABA A 기능을 위한 GABA A 를 발현하는 세포주의 특성화
LOPAC 1280 (약리학적으로 활성 화합물의 라이브러리)으로부터 입수한 1280 화합물과 GABAA (α1β3γ2s (α1), α2β3γ2s (α2), α3β3γ2s (α3) 및 α5β3γ2s (α5)의 아단위 조합)를 발현하는 CHO 세포주의 상호작용이 평가되었다(Sigma-RBI Prod. No. LO1280). LOPAC 1280 라이브러리는 충분히 입증된 약리학적 활성을 가지는 고순도의 소형 유기 리간드를 포함한다. 검사 화합물과 세포주의 상호작용은 하기 프로토콜을 이용하여, 검사 화합물에 응하는 GABAA의 막 전위를 측정하여 평가되었다.
세포는 분석전 24시간 시점에, 384 웰 평판에서 성장 배지 (Ham F-12 배지 + FBS 및 글루타민)에서 웰당 10-25,000개 세포로 도말되었다. 배지 제거 이후에, 적하 완충액 (137mM NaCl, 5mM KCl, 1.25mM CaCl, 25mM HEPES, 10mM 글루코오스)에 희석된 막 전위 염료가 첨가되었다. 1시간 동안 배양한 이후에, 고처리량 형광 평판 판독기 (Hamamastu FDSS)에 평판 적하되었다. 검사 화합물은 MP 분석 완충액(137mM NaCl, 5mM KGluconate, 1.25mM CaCl, 25mM HEPES, 10mM 글루코오스)에서 원하는 농도로 희석되고(필요에 따라, 각 검사 화합물의 일련의 희석물이 산출되었고, 이용된 농도는 다음과 같다: 3nM, 10nM, 30nM, 100nM, 300nM, 1μM, 3μM, 10μM), 각 웰에 첨가되었다. 이들 평판은 90초간 판독되었다.
결과
생산된 GABAA 세포주에 대한 각 화합물의 활성이 측정되고, 그리고 GABA (내생적 리간드)와 유사하거나 또는 보다 큰 활성을 나타내는 화합물은 양성 히트로서 기록되었다. 스크리닝된 1280개의 화합물 중에서, 34개는 GABA보다 더 우수하진 않지만 동등하게 하나 이상의 세포주 (즉, α1, α2, α3 및 α5)를 활성화시켰다. 생산된 GABAA 세포주와 이들 화합물 중에서 17개의 상호작용은 하기 용량 반응 연구에서 확인되었다. GABA의 존재를 요구하는 조절제, 부분 작동약 및 낮은 효능 화합물은 리스트에 포함되지 않았다.
이러한 스크리닝 분석에서, LOPAC 라이브러리에서 각각의 GABAA 작동약이 확인되었다: GABA (내생적 리간드), 프로포폴, 이소구바신 염산염, 뮤시몰 하이드로브로마이드, 피페리딘-4-설폰산, 3-알파,21-디하이드록시-5-알파-프레그난-20-온(뉴로스테로이드), 5-알파-프레그난-3알파-올-11,20-디온(뉴로스테로이드), 5-알파-프레그난-3알파-올-20-온(뉴로스테로이드) 및 트라카졸레이트. 그 결과는 생산된 GABAA 세포주가 생리적으로 적절한 방식으로 반응한다(가령, 이들 세포주가 내생적 수용체의 길항약에 반응한다)는 것을 지시한다. 이들 8개의 작동약에 대한 EC50 값이 측정되었고 표 6 (하기)에 포함된다.
이러한 스크리닝 분석에서, 또한 GABA 작동약으로서 기술되진 않지만 GABAA와 관련된 다른 활성을 가지는 것으로 알려진, LOPAC 라이브러리에서 4개의 화합물이 확인되었다: 에타졸레이트 (포스포디에스터라제 저해제), 안드로스테론 (스테로이드 호르몬), 클로르메자논 (근이완제), 그리고 이베르멕틴(염소 채널에 영향을 주는 것으로 알려진 항기생충제). 이들 4개의 화합물에 대한 EC50 값이 측정되었고 표 6 (하기)에 요약된다.
이러한 스크리닝 분석에서, 지금까지 GABAA와 상호작용하는 것으로 알려지지 않았던 LOPAC 라이브러리에서 4개의 화합물이 추가로 확인되었다. 이들 신규 화합물은 아래와 같다: 디피리미돌 (아데노신 데아미나제 저해제), 니클로사미드 (항기생충제), 타이르포신 A9 (PDGFR 저해제), 그리고 I-오메-타이르포신 AG 538 (IGF PTK 저해제). 이들 4개의 화합물에 대한 EC50 값이 측정되었고 표 6 (하기)에 요약된다.
이들 스크리닝 분석의 결과는 표 6에 요약된다.
Figure pct00010
Figure pct00011

실시예 5: 전기생리학 분석을 이용한 고유 GABA A 기능에 대한 GABA A - CHO 세포의 특성화
하기 전압-클램프 프로토콜이 이용되었다: 막 전위가 -60 mV의 유지 전위 (holding potential)로 클램핑 (clamping)되었다. 전류는 완충액으로 중간 세척하면서 증가하는 농도의 GABA (0.10-100 μM)의 2초간 적용에 의해 유발되었다.
100 μM GABA에 응하는 α2, α3 및 α5 GABAA 세포주, 그리고 증가하는 농도의 GABA (로그 증분에서 0.10-100 μM)에 응하는 α1 GABAA 세포주에 대한 전체 세포 수용체 전류 트레이스는 앞서 기술된 고처리량 스크리닝 분석 이외에, 전통적인 전기생리학 분석에서 GABAA 세포주가 이용될 수 있음을 확증한다. 실시예 2의 막 전위 분석과 함께, 이들 전기생리학적 분석 결과는 생산된 GABAA 세포주가 생리적 및 약리학적으로 적절하다는 것을 확증한다. 전기생리학은 GABAA 수용체의 조절제를 검출하는 신뢰성 있는 방법으로서 받아들여진다. 본 발명자들의 데이터는 본 발명의 세포주가 막 전위 분석을 이용하여 유사하게 신뢰성 있는 결과를 산출할 수 있다는 것을 지시한다. 종래 기술의 세포주는 전기생리학보다 비용이 저렴하고 신속한 이러한 막 전위 분석을 효과적으로 이용할 수 있을 만큼 충분히 신뢰성이 있거나 민감하지 않다. 따라서 본 발명의 세포주는 전기생리학을 이용하여 획득가능한 것보다 훨씬 큰 규모의 스크리닝을 가능하게 한다 (막 전위 분석을 이용하면 1일 10,000 분석이 가능한 반면, 전기생리학을 이용하면 1일 100 미만의 분석이 가능하다).
실시예 6: 할로겐화합물-민감성 meYFP를 이용한 고유 GABA A 기능에 대한 세포내 판독 분석의 특성화
본 발명의 GABAA (α1β3γ2s (A1), α2β3γ2s (A2), α3β3γ2s (A3) 및 α5β3γ2s (A5) 아단위의 조합) 발현 CHO 세포의 검사 화합물에 대한 반응은 세포내 판독 분석에 대한 하기 프로토콜을 이용하여 평가되었다.
세포는 분석전 24시간 시점에, 384 웰 평판에서 성장 배지 (Ham F-12 배지 + FBS 및 글루타민)에서 웰당 10-25,000개 세포로 도말되었다. 배지 제거 이후에, 적하 완충액 (135mM NaCl, 5mM KCl, 2mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10mM HEPES, 10mM 글루코오스)이 첨가되고 1시간 동안 배양되었다. 분석 평판은 이후, FDSS (Hamamatsu Corporation) 상에 적하되었다. 검사 화합물 (가령, GABA 리간드)은 분석 완충액 (150mM NaI, 5mM KCl, 1.25mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 25mM HEPES, 10mM 글루코오스)에서 원하는 농도로 희석되고(필요에 따라, 각 검사 화합물의 일련의 희석물이 산출되었고, 이용된 유효 농도는 다음과 같다: 3nM, 10nM, 30nM, 100nM, 300nM, 1μM, 3μM, 10μM), 각 웰에 첨가되었다. 이들 평판은 90초간 판독되었다.
증가하는 농도의 GABA 리간드에 반하여, GABAA-meYFP-CHO 세포는 meYFP 신호의 소광 증가를 나타낸다. 이러한 소광은 GABA 활성화에 대한 용량 반응 곡선을 계산하는데 이용될 수 있다. 세포내 판독 분석에 의해 산출된 GABA 용량 반응 곡선은 실시예 3에 기술된 막 전위 블루 분석에 의해 산출된 곡선과 유사하다. 이들 데이터는 본 발명의 세포가 GABAA의 조절자를 결정하기 위한 세포내 판독 분석에 이용될 수 있음을 입증한다.
실시예 7: 안정한 GC-C-발현 세포주의 산출
293T 세포는 표준 기술을 이용하여, 인간 GC-C 유전자 (서열 번호 15)를 인코딩하는 플라스미드로 형질감염되었다. 핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있는 시약의 실례에는 LIPOFECTAMINE™, LIPOFECTAMINE™ 2000, OLIGOFECTAMINE™, TFX™ 시약, FUGENE 6, DOTAP/DOPE, 메타펙틴 또는 FECTURIN™이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
비록 약물 선별이 본 발명의 방법에서 선택 사항이긴 하지만, 인간 GC-C 유전자를 인코딩하는 플라스미드에 하나의 약물 내성 마커가 포함되었다. 이러한 GC-C 서열은 CMV 프로모터의 제어 하에 있었다. 신호전달 프로브에 의한 검출을 위해 태그를 인코딩하는 비번역 서열 역시 약물 내성 마커를 인코딩하는 서열과 함께 존재하였다. 이용된 표적 서열은 GC-C 표적 서열 1 (서열 번호 13)이었다. 본 실시예에서, GC-C 유전자 포함 벡터는 GC-C 표적 서열 1을 포함하였다.
형질감염된 세포는 신호전달 프로브의 첨가에 앞서, DMEM-FBS에서 2일 동안, 그 이후에 500 ㎍/㎖ 하이그로마이신-함유 DMEM-FBS에서 10일 동안, 이후 DMEM-FBS에서 나머지 시간 동안, DMEM/10% FBS에서 총 4-5주 (독립적인 분리에 따라서) 동안 성장되었다.
항생제에서 농축 이후에, 세포는 선택된 기간 동안 안정적이지 않은 발현이 진정될 수 있는 시간을 허용하기 위하여 항생제 선별의 부재에서 8 내지 10회 계대배양되었다.
세포는 수확되고 표준 기술을 이용하여 GC-C 신호전달 프로브 1 (서열 번호 14)로 형질감염되었다. 핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있는 시약의 실례에는 LIPOFECTAMINE™, LIPOFECTAMINE™ 2000, OLIGOFECTAMINE™, TFX™ 시약, FUGENE 6, DOTAP/DOPE, 메타펙틴 또는 FECTURIN™이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이후, 이들 세포는 해리되고, 분석을 위해 수집되고, 그리고 형광 활성화된 세포 분류기 (Beckman Coulter, Miami, FL)를 이용하여 분류되었다.
GC-C 신호전달 프로브 1에 의해 검출되는 GC-C 표적 서열 1
5'-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3' (서열 번호 13)
GC-C 신호전달 프로브 1
(100 μM 스톡으로서 제공됨)
5' - Cy5 GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ2 -3' (서열 번호 14)
이에 더하여, Cy5와 유사한 스펙트럼 특성을 갖는 Quasar® Dye (BioSearch)를 이용한 유사한 프로브가 일정한 실험에 이용되었다. 일부 실험에서, DNA 프로브가 아닌 5-MedC와 2-아미노 dA 혼합기 프로브가 이용되었다.
이들 세포는 해리되고, 그리고 분석 및 형광 활성화된 세포 분류기 (Beckman Coulter, Miami, FL)를 이용한 분류를 위하여 수집되었다. 배경을 초과하여 형광을 발하는 세포를 게이팅 (gating)하고, 그리고 게이트 내에 속하는 개별 세포를 바코드 부착된 96-웰 평판으로 분리하기 위하여 표준 분석 방법이 이용되었다. 아래의 게이팅 체계 (gating hierarchy)가 이용되었다: 플롯 FAM 대(對) Cy5: 0.3%의 생존 세포에서 일치 게이트 (coincidence gate) → 싱글렛 게이트 (singlets gate) → 라이브 게이트 (live gate) → 분류 게이트 (Sort gate).
이들 단계는 더욱 많은 수의 세포를 획득하기 위하여 반복되었다. 이들 모든 단계의 2번의 라운드가 수행되었다. 이에 더하여, 세포 계대배양, 신호전달 프로브에 노출 및 형광 활성화된 세포 분류기에 의한 양성 세포의 분리 순서의 단계가 독립된 형질감염 라운드 중에서 하나에서 총 2회 수행되었다.
이들 평판은 MICROLAB STAR™ (Hamilton)로 이동되었다. 세포는 100 단위/㎖ 페니실린 및 0.1 ㎎/㎖ 스트렙토마이신으로 보충된, 새로운 완전 성장 배지와 2일 조건 성장 배지의 100 ㎕의 1:1 혼합물에서 9일 동안 배양되고, 이후 덩어리를 최소화시키기 위하여 2회 트립신처리에 의해 분산되고 새로운 96-웰 평판으로 이동되었다. 평판은 웰 (Genetix)의 포화도를 결정하기 위하여 이미지화되었다. 각 평판은 평판 전역에서 신뢰성 있는 영상 획득을 위하여 집중되었다. 70% 이상의 보고된 포화도는 신뢰되지 않았다. 포화도 측정은 3 연속일에서 실시되고 성장 속도를 계산하는데 이용되었다.
세포는 분산 단계 이후 3일 동안, 성장 속도에 따라 비닝 (binning) (독립적으로 분류되고 코호트 (cohort)로서 도말됨) 되었다. 각각 4개의 성장 빈 (growth bin)이 개별 96 웰 평판 내로 분리되었다; 일부 성장 빈은 하나 이상의 96-웰 평판을 발생시켰다. 빈 (bin)은 성장 속도의 전개를 고려하고 높은 비율의 세포 개체군 총수를 포괄하는 범위를 일괄함으로써 계산되었다. 빈은 성장 속도에서 12-시간 차이가 획득되도록 계산되었다.
세포는 배가 시간이 1일 이하 내지 2주 이상일 수 있다. 동시에 성장 속도에 따라서 합리적으로 비닝될 수 있는 가장 다양한 클론을 처리하기 위하여, 빈 (bin)당 배가 시간이 0.25 내지 0.7일인 3-9개의 빈을 이용하는 것이 바람직하다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 빈의 치밀성 및 빈의 수는 특정 상황에 맞게 조정될 수 있고, 그리고 빈의 치밀성 및 수는 세포가 그들의 세포 주기에 대해 동기화되면 추가로 조정될 수 있다.
이들 평판은 항생제 없는 표준화되고 고정된 조건 (DMEM/FBS, 37℃, 5% CO2) 하에 배양되었다. 세포 평판은 5개 세트의 96 웰 평판 (동결을 위한 3개의 세트, 분석을 위한 1개의 세트 및 계대배양을 위한 1개의 세트)을 생산하기 위하여 분할되었다. 각각의 평판 세트에 대한 작업흐름에서 하류에, 별개의 독립된 조직 배양 시약, 배양기, 인력 및 이산화탄소 공급원이 이용되었다. 모든 조직 배양 시약의 적절한 생산과 품질을 담보하기 위한 품질 관리 단계가 실시되었다: 이용을 위하여 준비된 배지의 각 병에 첨가된 각 성분은 두 번째 지정된 사람이 실수가 없도록 모니터링하는 동안, 지정된 후드에서 지정된 사람에 의해 상기 후드 내에서 단지 그 시약만을 이용하여 첨가되었다. 액체 취급 조건은 벽을 통한 교차 오염이 제거되도록 설정되었다. 모든 단계를 위해 새로운 팁이 이용되거나, 또는 엄격한 팁 세척 프로토콜이 이용되었다. 정확한 부피 전달, 효과적인 세포 조작, 세척 사이클, 피펫팅 속도와 위치, 세포 분산을 위한 피펫팅 사이클의 횟수, 그리고 평판에 대한 팁의 상대적 위치에 대한 액체 취급 조건이 설정되었다.
하나의 평판 세트가 -70℃ 내지 -80℃에서 동결되었다. 상기 세트의 평판은 먼저 70 내지 100%의 포화도 (confluency)가 달성되도록 허용되었다. 배지가 흡인되고 90% FBS 및 10% DMSO가 첨가되었다. 이들 평판은 파라필름으로 개별적으로 밀봉되고, 1 내지 5 cm 발포체로 둘러싸이고, 이후 냉동장치 내로 넣어졌다.
남아있는 2개의 평판 세트는 앞서 기술된 바와 같이 표준화되고 고정된 조건 하에 유지되었다. 모든 세포 분할 (splitting)은 배지 제거, 세포 세척, 트립신 첨가와 배양, 소광 및 세포 분산 단계를 비롯한 자동화 액체 취급 단계를 이용하여 실시되었다.
모든 세포 개체군에 대한 세포 및 배양 조건의 일관성 및 표준화가 제어되었다. 성장 속도에서 약간의 차이로 인한 평판 전역에서 차이는 평판 전역에서 세포 수의 표준화에 의해 제어되고, 그리고 재배열 (rearry)후 3회 계대배양 시점에 발생하였다.
이들 세포는 이들 조건 하에서 그들의 시험관내 진화가 일어나도록 하기 위하여 3 내지 6주 동안 유지되었다. 이 기간 동안, 크기, 형태, 미세포화도 경향, 취성, 트립신처리에 대한 반응, 트립신처리후 평균 원형도, 또는 세포 유지의 다른 측면, 예를 들면, 배양 평판 표면에 부착성 및 유체 첨가후 분출 (blow-off)에 내성이 관찰되었다.
세포 개체군은 기능적 기준을 이용하여 조사되었다. Direct Cyclic GMP 효소 면역분석 키트 (카탈로그 900-014; AssayDesigns, Inc.)는 제조업체의 지시에 따라 이용되었다:
(http://www.assaydesigns.com/objects/catalog//product/extras/900-014.pdf). 세포는 96 또는 384 웰 평판에서 4가지 다른 밀도로 조사되고, 그리고 반응이 분석되었다. 본 발명의 GC-C 발현 세포주에 대해 하기 조건이 이용되었다:
- 클론 스크리닝: 분석 48시간 전에 합류성 96 웰 평판의 1:2 및 1:3 분할, 30분 구아닐린 처리.
- 용량-반응 연구: 웰당 20,000, 40,000, 60,000, 80,000, 120,000 및 160,000의 밀도, 30분 구아닐린 처리(실시예 8 참조).
- Z' 연구: 웰당 160,000 및 200,000의 밀도가 이용됨, 30분 구아닐린 처리(실시예 9 참조).
낮은 및 더욱 높은 계대배양 횟수에서 실시된 실험으로부터 기능적 반응은 4 내지 10주 범위의 지정된 기간 동안 가장 일관된 반응을 보이는 세포를 확인하기 위하여 비교되었다. 시간의 흐름 동안 변하는 세포의 다른 특성 역시 주목되었다.
기능적 및 다른 기준을 충족하는 세포 개체군은 생존가능하고, 안정하며 기능적인 세포주를 생산하기에 가장 적합한 것을 결정하기 위해서 추가로 평가되었다. 선별된 세포 개체군은 거대 조직 배양 용기에서 증식되고, 그리고 앞서 기술된 특성화 단계가 이들 조건하에서 지속되거나 반복되었다. 이 시점에서, 추가의 표준화 단계, 예를 들면, 상이한 세포 밀도; 도말 시간, 세포 계대배양 길이; 세포 배양 접시 형태 및 코팅; 유체공학 최적화, 예를 들면, 속도 및 전단력; 계대배양 시간; 그리고 세척 단계가 일관되고 신뢰성 있는 계대배양을 위해 도입되었다. 또한, 각 계대배양에서 세포의 생존율이 측정되었다. 수동 개입이 증가되고, 그리고 세포는 면밀히 관찰되고 모니터링되었다. 이러한 정보는 원하는 성질을 유지하는 최종 세포주를 확인 및 선별하는데 도움이 되었다. 이들 조건 하에, 그리고 이러한 과정에 따라서 생산될 때 적절한 부착성/점착성, 성장 비율, 그리고 고른 도말 (미세포화도 결여)을 나타내는 최종 세포주 및 백업 세포주 (총 20개 클론)가 선별되었다.
DMEM/10%FBS/HEPES/L-Glu에서 24 웰, 6 웰 및 10 cm 접시를 통해 재배열된 96 웰 평판으로부터 비-동결된 개체군을 증식함으로써, 선별된 20개 클론 각각에 대한 3개 바이알의 초기 동결 스톡이 산출되었다. 최종 세포주 및 백업 세포주에 상응하는 낮은 계대배양 동결 스톡은 37℃에서 해동되고, FBS 함유 DMEM으로 2회 세척하고, 동일한 방식으로 배양되었다. 이후, 이들 세포는 2 내지 4주 동안 증식되었다. 2개의 최종 클론이 선별되었다.
초기 동결된 하나의 클론으로부터 하나의 바이알이 해동되고 배양 동안 증식되었다. 생산된 세포는 이들 세포가 그들이 처음 선별되었던 특성과 동일한 특성을 충족하는지를 확인하기 위하여 조사되었다. 20 내지 100개 이상의 바이알로 이루어진 각 세포주에 대한 세포 은행이 확립될 수 있다.
또한, 이들 세포주가 생존가능하고, 안정하며, 기능성인 지를 확인하기 위해서 하기 단계가 실시될 수 있다: 세포 은행으로부터 하나 이상의 바이알은 해동되고 배양 동안 증식되었다; 생산된 세포는 이들 세포가 그들이 처음 선별되었던 특성과 동일한 특성을 충족하는지를 확인하기 위하여 조사되었다.
실시예 8: 고유 GC-C 기능에 대한 세포주의 특성화
cGMP의 검출을 위한 경쟁적 ELISA를 이용하여, 생산된 GC-C 발현 세포주에서 고유 GC-C 기능이 특성화되었다. 10% 태아 소 혈청, 글루타민 및 HEPES로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM)에서 표준 세포 배양 조건 하에서 GC-C 발현 세포가 유지되고 T175cm 플라스크에서 성장되었다. ELISA를 위하여, 이들 세포는 코팅된 96 웰 평판 (폴리-D-리신)으로 도말되었다.
세포 처리 및 세포 용해 프로토콜
세포는 무혈청 배지로 2회 세척되고 30분 동안 1 Mm IBMX와 함께 배양되었다. 이후, 원하는 활성제 (즉, 구아닐린, 0.001-40 μM)가 세포에 첨가되고 30 내지 40분 동안 배양되었다. 상청액은 제거되고, 그리고 이들 세포는 TBS 완충액으로 세척되었다. 이들 세포는 0.1 N HCl로 용해되었다. 그 이후에, 0.1N HCl로 세포용해 및 -20℃/실온의 냉동/해동 사이클이 수행되었다. 냉동된 세포용해물 (시료는 10,000rpm으로 에펜도르프 튜브 내에서 회전됨)은 원심분리되어 세포 파편으로 펠릿화되었다. 그 다음, 투명한 상청액 세포용해물은 ELISA 평판으로 이동되었다.
ELISA 프로토콜
달리 지시되지 않으면, 하기 모든 단계는 실온에서 실시되었다. ELISA 평판은 코팅 완충액 (Na-탄산염/중탄산염 완충액, 0.1M 최종, pH 9.6)에서 항-IgG 항체로 4℃에서 하룻밤동안 코팅되었다. 이후, 평판은 세척액 (TBS-트윈 20, 0.05%)으로 세척되고, 그 이후에 차단 시약이 첨가되었다. 37℃에서 차단 시약과 함께 1시간 동안 배양한 이후, 평판이 세척 완충액으로 세척되었다. 그 다음, 토끼 항-cGMP 다중클론 항체 (Chemicon)가 첨가되고, 그 이후에 1시간 동안 배양되고, 세척 완충액으로 차후 세척되었다. 이후, 세포 용해물이 첨가되고, cGMP-비오틴 접합체 (1 내지 10 nM의 8-비오틴-AET-cGMP (Biolog))의 차후 첨가에 앞서 1시간 동안 배양되었다. 평판은 2시간 동안 배양되고, 이후 세척 완충액으로 세척되었다. 그 다음, 스트렙타비딘-알칼리 포스페이트가 첨가되고, 1시간 동안 배양되고, 이후 세척 완충액으로 세척되었다. 평판은 PNPP 기질 (Sigma)과 함께, 1시간 이상 (바람직하게는 2 내지 5 시간) 동안 배양되었다. 이후, 흡광도는 SAFIRE 2™ 평판 판독기(Tecan)에서 405 nm에서 판독되었다.
ELISA에서 세포 용해물이 이용되지 않는 경우에, 최대 흡광도가 관찰되었다 (대조). 100 nM 구아닐린 (Clone)으로 처리된 생산된 GC-C 발현 세포주로부터 세포 용해물을 이용하면, 흡광도 감소 (증가된 cGMP 수준에 상응)가 관찰되었다.
100 nM 구아닐린으로 처리된 생산된 GC-C 발현 세포주에서 cGMP 수준은 Direct Cyclic GMP 효소 면역분석 키트 (카탈로그 900-014; AssayDesigns, Inc.)를 이용하여, GC-C를 발현하지 않는 부모 세포주 대조 시료 (제시되지 않음)과 비교되었다. GC-C 발현 세포주는 구아닐린으로 처리된 및 처리되지 않은 부모 세포보다 흡광도에서 더욱 큰 감소 (증가된 cGMP 수준에 상응)를 보였다.
구아닐린 용량-반응 실험을 위해서, 96 웰 평판에서 20,000, 40,000, 60,000, 80,000, 120,000 및 160,000 세포/웰의 밀도로 도말된, 생산된 GC-C-발현 세포주의 세포는 30분 동안 증가하는 농도의 구아닐린으로 공격접종되었다. cGMP 수준 변화 (Direct Cyclic GMP 효소 면역분석 키트 (카탈로그 900-014; AssayDesigns, Inc.)를 이용하여 측정됨)의 함수로서 세포 반응 (즉, 흡광도)은 SAFIRE2™ 평판 판독기 (Tecan)를 이용하여 검출되었다. 이후, 데이터는 구아닐린 농도의 함수로서 플롯팅 (plotting)되고 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어를 이용한 비선형 회귀 분석을 이용하여 분석되었으며, 그 결과로써 1.1 nM의 EC50 값이 산출되었다. 생산된 GC-C 발현 세포주는 다른 세포주 (3.5 pmol/㎖)에서 이전에 보고된 것 (Forte et al., Endocr. 140(4):1800-1806 (1999))과 비교하여 낮은 농도의 구아닐린으로 처리될 때, 더욱 높은 수준의 cGMP (6 pmol/㎖)를 나타내고, 이는 상기 클론의 효능을 지시한다.
실시예 9: GC-C-발현 세포주 Z' 값의 산출
생산된 GC-C 발현 세포주에 대한 Z'는 직접 경쟁적 ELISA 분석을 이용하여 계산되었다. ELISA는 Direct Cyclic GMP 효소 면역분석 키트 (카탈로그 900-014; AssayDesigns, Inc.)를 이용하여 실시되었다. 구체적으로, Z' 분석을 위하여, 96 웰 분석 평판에서 24개의 양성 대조군 웰 (160,000 또는 200,000 세포/웰의 밀도로 도말됨)은 30분 동안 DMEM 배지에서 40 μM 구아닐린과 IBMX의 GC-C 활성화 칵테일로 공격접종되었다. 96 웰 분석 평판의 부피 및 표면적을 고려하면, 이러한 양의 구아닐린은 Forte et al. (1999) Endocr. 140(4), 1800-1806에서 이용된 10 μM에 필적하는 농도를 발생시켰다. DMEM/IMBX에서 클론 세포를 포함하는 동수의 웰은 운반제 단독 (활성제의 부재에서)으로 공격접종되었다. 2가지 조건에서 흡광도 (cGMP 수준에 상응)는 SAFIRE2™ 평판 판독기 (Tecan)를 이용하여 모니터링되었다. 2가지 조건에서 평균 및 표준 편차가 계산되고, 그리고 Zhang et al., J Biomol Screen, 4(2):67-73 (1999)의 방법을 이용하여 Z'가 산정되었다. 생산된 GC-C 발현 세포주의 Z' 값은 0.72인 것으로 측정되었다.
실시예 10: 단락 전류 측정
배양 삽입체 (Snapwell, Corning Life Sciences) 상에 GC-C 발현 세포 (일차 또는 영속화 상피 세포, 예를 들면, 폐, 장, 유방, 자궁 또는 신장)를 도말한 이후 7 내지 14일에, Using 챔버 실험이 실시되었다. 배양 삽입체 상의 세포는 세정되고, Using 타입 장치 (EasyMount Chamber System, Physiologic Instruments)에 적재되고, 그리고 37℃에서 유지되고 120 NaCl, 25 NaHCO3, 3.3 KH2PO4, 0.8 K2HPO4, 1.2 CaCl2, 1.2 MgCl2 및 10 글루코오스 (mM 단위)를 함유하는 연속적으로 가스공급된 링거액 (O2에서 5% CO2, pH 7.4)로 적셔진다. 이들 헤미챔버는 다채널 전압 및 전류 클램프 (VCC-C8, Physiologic Instruments)에 연결된다. 전극 [한천 가교된(1M KCl에서 4%) Ag-AgCl]이 이용되고, 그리고 삽입체는 0 mV로 전압 클램핑 (clamping)되었다. 실험 기간 동안 매 10초마다 경상피 전류, 전압 및 저항이 측정된다. 저항이 <200 mOhm인 막은 폐기된다. 이러한 2차 분석으로, 적절한 세포 유형 (즉, 치밀 접합부를 형성하는 세포)에서 도입된 GC-C가 CFTR 활성을 변화시키고 경상피 전류를 조정한다는 것을 확인할 수 있다.
실시예 11: 안정한 CFTR-발현 세포주의 산출
발현 구조체 산출
스트림라인 클로닝이 가능한 플라스미드 발현 벡터는 pCMV-SCRIPT (Stratagene)에 기초하여 산출되고, 그리고 CMV 및 SV40 진핵 프로모터; SV40 및 HSV-TK 폴리아데닐화 서열; 복수 클로닝 부위; Kozak 서열; 그리고 약물 내성 카세트 (즉, 퓨로마이신)를 비롯하여, 목적 유전자의 전사 및 번역을 위해 필요한 다양한 성분을 포함하였다. 암피실린 또는 네오마이신 내성 카세트 역시 퓨로마이신 대신에 이용될 수 있다. 이후, 표적 서열 2 (SEQ ID NO: 138)를 포함하는 태그 서열이 플라스미드의 복수 클로닝 부위 (multiple cloning site) 내로 삽입되었다. 그 다음, 인간 CFTR을 인코딩하는 cDNA 카세트가 Asc1과 Pac1 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여, 태그 서열의 상류에 복수 클로닝 부위 내로 서브클로닝 (subcloning)되었다.
세포주 산출
단계 1: 형질감염
CHO 세포는 표준 기술을 이용하여 인간 CFTR (서열 번호 16)을 인코딩하는 플라스미드로 형질감염되었다. (핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있는 시약의 실례에는 LIPOFECTAMINE™, LIPOFECTAMINE™ 2000, OLIGOFECTAMINE™, TFX™ 시약, FUGENE 6, DOTAP/DOPE, 메타펙틴 또는 FECTURIN™이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.)
비록 약물 선별이 본 발명의 세포 또는 세포주를 생산하는데 선택 사항이긴 하지만, 플라스미드 내에 하나의 약물 내성 마커 (즉, 퓨로마이신)가 포함되었다. 상기 CFTR 서열은 CMV 프로모터의 제어 하에 있었다. 신호전달 프로브에 의한 검출을 위해 표적 서열을 인코딩하는 비번역 서열 역시 약물 내성 마커를 인코딩하는 서열과 함께 존재되었다. 이용된 표적 서열은 표적 서열 2 (서열 번호 138)이고, 그리고 본 실시예에서 CFTR 유전자-포함 벡터는 표적 서열 2 (서열 번호 138)를 포함하였다.
단계 2: 선별
형질감염된 세포는 항생제 없는 Ham의 F12-FBS 배지 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)에서 2일 동안 성장되고, 그 이후에 12.5 ㎍/㎖ 퓨로마이신-함유 Ham의 F12-FBS 배지에서 10일 동안 성장되었다. 이후, 이들 세포는 신호전달 프로브의 첨가에 앞서, 잔여 시간 동안 항생제 없는 Ham의 F12-FBS 배지로 이동되었다.
단계 3: 세포 계대배양
항생제에서 농축 이후에, 세포는 선택된 기간 동안 안정적이지 않은 발현이 진정될 수 있는 시간을 허용하기 위하여 항생제 선별의 부재에서 5 내지 14회 계대배양되었다.
단계 4: 형광 프로브에 세포 노출
세포는 수확되고 표준 기술을 이용하여 신호전달 프로브 2 (서열 번호 139)로 형질감염되었다. (핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있는 시약의 실례에는 LIPOFECTAMINE™, LIPOFECTAMINE™ 2000, OLIGOFECTAMINE™, TFX™ 시약, FUGENE 6, DOTAP/DOPE, 메타펙틴 또는 FECTURIN™이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다). CFTR 신호전달 프로브 2 (서열 번호 139)는 표적 서열 2 (서열 번호 138)에 결합하였다. 이후, 이들 세포는 분석을 위해 수집되고 형광 활성화된 세포 분류기를 이용하여 분류되었다.
신호전달 프로브에 의해 검출되는 표적 서열
CFTR 표적 서열 1
5'- GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC -3' (서열 번호 17)
CFTR 표적 서열 2
5'- GAAGTTAACCCTGTCGTTCTGCGAC -3' (서열 번호 138)
신호전달 프로브
CFTR 신호전달 프로브 1 (100 μM 스톡으로서 제공됨)
5' - Cy5 GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ2 -3' (서열 번호 18)
CFTR 신호전달 프로브 2 (100 μM 스톡으로서 제공됨)
5' - CY5.5 GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGC BHQ2 -3' (서열 번호 139)
신호전달 프로브 2에서 BHQ2는 BHQ3 또는 금 입자로 치환될 수 있다. 표적 서열 2 및 신호전달 프로브 2는 각각, 표적 서열 1 (서열 번호 17) 및 신호전달 프로브 1 (서열 번호 18)에 의해 대체될 수 있다. 신호전달 프로브 1에서 BHQ2는 BHQ3 또는 금 입자로 치환될 수 있다.
이에 더하여, Cy5와 유사한 스펙트럼 특성을 갖는 Quasar® Dye (BioSearch)를 이용한 유사한 프로브가 표적 서열 1 (서열 번호 17)에 대한 실험에 이용된다. 일부 실험에서, DNA 프로브가 아닌 5-MedC와 2-아미노 dA 혼합기 프로브가 이용되었다. 비-표적화 FAM 표지된 프로브 역시 적하 대조 (loading control)로서 이용된다.
단계 5: 양성 세포의 분리
이들 세포는 해리되고, 그리고 분석 및 형광 활성화된 세포 분류기 (Beckman Coulter, Miami, FL)를 이용한 분류를 위하여 수집되었다. 배경을 초과하여 형광을 발하는 세포를 게이팅 (gating)하고, 그리고 게이트 내에 속하는 개별 세포를 바코드 부착된 96-웰 평판으로 분리하기 위하여 표준 분석 방법이 이용되었다. 아래의 게이팅 체계 (gating hierarchy)가 이용되었다: 현장에서 표준 절차에 따라서 플롯 FAM 대(對) Cy5.5:0.1-0.4%의 세포에서 일치 게이트 (coincidence gate) → 싱글렛 게이트 (singlets gate) → 라이브 게이트 (live gate) → 분류 게이트 (Sort gate).
단계 6: 단계 1-5 및/또는 3-5의 추가 사이클
단계 1 내지 5 및/또는 3-5는 더욱 많은 수의 세포를 획득하기 위하여 반복되었다. 단계 1-5의 2번의 라운드가 실시되고, 그리고 이들 라운드 각각에 대하여, 단계 3-5의 2번의 내부 사이클이 실시되었다.
단계 7: 세포 개체군에 대한 성장 속도 추정
이들 평판은 MICROLAB STAR™ (Hamilton)로 이동되었다. 세포는 100 단위/㎖ 페니실린 및 0.1 ㎎/㎖ 스트렙토마이신으로 보충된, 새로운 완전 성장 배지와 2-3일 조건 성장 배지의 100 ㎕의 1:1 혼합물에서 9일 동안 배양되었다. 이후, 이들 세포는 덩어리를 최소화시키기 위하여 1회 또는 2회 트립신처리에 의해 분산되고 새로운 96-웰 평판으로 이동되었다. 평판은 웰 (Genetix)의 포화도를 결정하기 위하여 이미지화되었다. 각 평판은 평판 전역에서 신뢰성 있는 영상 획득을 위하여 집중되었다. 70% 이상의 보고된 포화도는 신뢰되지 않았다. 포화도 측정은 분산후 1일과 10일 사이에 연속일에서 실시되고 성장 속도를 계산하는데 이용되었다.
단계 8: 성장 속도 평가치에 따른 세포 개체군의 비닝
세포는 단계 7에서 분산 단계 이후 2주 이내에, 성장 속도에 따라 비닝 (binning) (독립적으로 분류되고 코호트 (cohort)로서 도말됨) 되었다. 각각 3개의 성장 빈 (growth bin)이 개별 96 웰 평판 내로 분리되었다; 일부 성장 빈은 하나 이상의 96-웰 평판을 발생시켰다. 빈 (bin)은 성장 속도의 전개를 고려하고 높은 비율의 세포 개체군 총수를 포괄하는 범위를 일괄함으로써 계산되었다. 빈은 성장 속도에서 12-16 시간 차이가 획득되도록 계산되었다.
세포는 배가 시간이 1일 이하 내지 2주 이상일 수 있다. 동시에 성장 속도에 따라서 합리적으로 비닝될 수 있는 가장 다양한 클론을 처리하기 위하여, 빈 (bin)당 배가 시간이 0.25 내지 0.7일인 3-9개의 빈을 이용하는 것이 바람직하다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 빈의 치밀성 및 빈의 수는 특정 상황에 맞게 조정될 수 있고, 그리고 빈의 치밀성 및 수는 세포가 그들의 세포 주기에 대해 동기화되면 추가로 조정될 수 있다.
단계 9: 병렬 처리를 진척시키고 엄격한 품질 관리를 제공하는 복제 평판법 (replica plating)
이들 평판은 항생제 없는 표준화되고 고정된 조건 (즉, Ham의 F12-FBS 배지, 37℃/5% CO2) 하에 배양되었다. 세포 평판은 4개 세트의 96 웰 평판 (동결을 위한 3개의 세트, 분석 및 계대배양을 위한 1개의 세트)을 생산하기 위하여 분할되었다. 각각의 평판 세트에 대하여, 별개의 독립된 조직 배양 시약, 배양기, 인력 및 이산화탄소 공급원이 이용되었다. 모든 조직 배양 시약의 적절한 생산과 품질을 담보하기 위한 품질 관리 단계가 실시되었다: 이용을 위하여 준비된 배지의 각 병에 첨가된 각 성분은 두 번째 지정된 사람이 실수가 없도록 모니터링하는 동안, 지정된 후드에서 지정된 사람에 의해 상기 후드 내에서 단지 그 시약만을 이용하여 첨가되었다. 액체 취급 조건은 벽을 통한 교차 오염이 제거되도록 설정되었다. 모든 단계를 위해 새로운 팁이 이용되거나, 또는 엄격한 팁 세척 프로토콜이 이용되었다. 정확한 부피 전달, 효과적인 세포 조작, 세척 사이클, 피펫팅 속도와 위치, 세포 분산을 위한 피펫팅 사이클의 횟수, 그리고 평판에 대한 팁의 상대적 위치에 대한 액체 취급 조건이 설정되었다.
단계 10: 세포 개체군의 조기 계대배양 스톡의 동결
3개의 평판 세트가 -70℃ 내지 -80℃에서 동결되었다. 상기 세트의 평판은 먼저 70 내지 100%의 포화도 (confluency)가 달성되도록 허용되었다. 배지가 흡인되고 90% FBS 및 10% DMSO가 첨가되었다. 이들 평판은 파라필름으로 개별적으로 밀봉되고, 1 내지 5 cm 발포체로 개별적으로 둘러싸이고, 이후 -80℃ 냉동장치 내로 넣어졌다.
단계 11: 생존가능하고, 안정하며, 기능적인 (VSF) 세포주를 생산하기 위한 초기 형질전환 단계의 방법 및 조건
남아있는 평판 세트는 단계 9에서 기술된 바와 같이 유지되었다. 모든 세포 분할 (splitting)은 배지 제거, 세포 세척, 트립신 첨가와 배양, 소광 및 세포 분산 단계를 비롯한 자동화 액체 취급 단계를 이용하여 실시되었다.
단계 12 - 성장 속도의 나머지 편차를 보정하기 위한 표준화 방법
모든 세포 개체군에 대한 세포 및 배양 조건의 일관성 및 표준화가 제어되었다. 성장 속도에서 약간의 차이로 인한 평판 전역에서 차이는 평판 전역에서 세포 수의 표준화에 의해 제어되고, 그리고 재배열 (rearry)후 매 8회 계대배양 시점에서 발생하였다. 범위를 벗어나는 세포 개체군은 검출되고 제거되었다.
단계 13: 세포 개체군의 특성화
세포는 배양 동안 재배열후 6 내지 10주 동안 유지되었다. 이 기간 동안, 강한 세포를 확인하기 위한 일과적인 내부 품질 관리의 일부로서, 크기, 형태, 미세포화도 경향, 취성, 트립신처리에 대한 반응, 트립신처리후 평균 원형도, 또는 세포 유지의 다른 측면, 예를 들면, 배양 평판 표면에 부착성 및 유체 첨가후 분출 (blow-off)에 내성이 관찰되었다. 이런 벤치마크 세포는 이후, 기능적 평가가 실시되었다.
단계 14: VSF 조건 하에서 세포 개체군의 잠재적 기능성의 평가
세포 개체군은 기능적 기준을 이용하여 조사되었다. 막 전위 염료 키트(Molecular Devices, MDS)는 제조업체의 지시에 따라서 이용되었다.
세포는 384 웰 평판에서 변하는 밀도 (즉, 12.5 x 103 내지 20 x 103개 세포/웰)에서 조사되고, 그리고 반응이 분석되었다. 세포 도말과 분석 판독 사이의 시간이 조사되었다. 염료 농도 역시 조사되었다. 잠재적 기능성 평가의 일부로서 용량 반응 곡선 및 Z' 스코어가 모두 계산되었다.
또한, 생존가능하고, 안정하며, 기능성인 최종 및 백업 세포주를 선별하기 위하여, 하기 단계 (즉, 단계 15 내지 18)가 실시될 수 있다.
단계 15
지정된 기간 (가령, 3 내지 9주) 동안 가장 일관된 반응을 보이는 세포를 확인하기 위하여, 낮은 및 더욱 높은 계대배양 횟수에서 실시된 실험으로부터 기능적 반응이 비교된다. 시간의 흐름 동안 변하는 세포의 다른 특징들도 주목된다.
단계 16
기능적 및 다른 기준을 충족하는 세포 개체군은 생존가능하고, 안정하며 기능적인 세포주를 생산하기에 가장 적합한 것을 결정하기 위해서 추가로 평가된다. 선별된 세포 개체군은 거대 조직 배양 용기에서 증식되고, 그리고 앞서 기술된 특성화 단계가 이들 조건하에서 지속되거나 반복된다. 이 시점에서, 일관되고 신뢰성 있는 계대배양을 위해서 추가의 표준화 단계, 예를 들면, 상이한 세포 밀도; 도말 시간, 세포 계대배양 길이; 세포 배양 접시 형태 및 코팅; 유체공학 최적화, 예를 들면, 속도 및 전단력; 계대배양 시간; 그리고 세척 단계가 도입된다.
또한, 각 계대배양에서 세포의 생존율이 측정된다. 수동 개입이 증가되고, 그리고 세포는 면밀히 관찰되고 모니터링된다. 이러한 정보는 원하는 성질을 유지하는 최종 세포주를 확인 및 선별하는데 도움이 된다. 일관된 성장, 적절한 부착성 및 기능적 반응을 나타내는 최종 세포주 및 백업 세포주가 선별되었다. 이들 조건 하에, 그리고 이러한 과정에 따라서 생산될 때 적절한 부착성/점착성, 성장 비율, 그리고 고른 도말 (미세포화도 결여)을 나타내는 최종 세포주 및 백업 세포주가 선별된다.
단계 17 - 세포 은행의 확립
최종 세포주 및 백업 세포주에 상응하는 낮은 계대배양 동결 스톡은 37℃에서 해동되고, Ham의 F12-FBS로 2회 세척되고, 이후 Ham의 F12-FBS에서 배양된다. 이들 세포는 이후, 2 내지 4주 동안 증식된다. 각각의 최종 및 백업 세포주에 대한 클론의 세포 은행이 확립되며, 각 클론 세포에 대한 25개의 바이알이 동결보존된다.
단계 18
세포 은행으로부터 하나 이상의 바이알이 해동되고 배양 동안 증식된다. 생산된 세포는 이들 세포가 그들이 처음 선별되었던 특성과 동일한 특성을 충족하는지를 확인하기 위하여 조사된다.
실시예 12: 고유 CFTR 기능에 대한 안정한 세포주의 특성화
본 발명자들은 고처리량의 적합한 형광 막 전위 분석을 이용하여, 생산된 안정한 CFTR-발현 세포주에서 고유 CFTR 기능을 특성화하였다.
CFTR을 안정적으로 발현하는 CHO 세포주는 10% 태아 소 혈청 및 글루타민으로 보충된 Ham의 F12 배지에서 표준 세포 배양 조건 하에 유지되었다. 분석 전날, 세포는 스톡 평판으로부터 수확되고 검고 깨끗한 바닥 384 웰 분석 평판으로 도말되었다. 이들 분석 평판은 37℃ 세포 배양 배양기에서 5% CO2 하에 22 내지 24시간 동안 유지되었다. 이후, 분석 평판으로부터 배지가 제거되고, 그리고 적하 완충액 (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.25 mM CaCl2, 25 mM HEPES, 10 mM 글루코오스)에 희석된 블루 막 전위 염료 (Molecular Devices Inc.)가 첨가되고 37℃에서 1시간 동안 배양되었다. 그 다음, 이들 분석 평판은 형광 평판 판독기 (Hamamatsu FDSS)에 적하되고, 그리고 화합물 완충액(137 mM 글루콘산나트륨, 5 mM 글루콘산칼륨, 1.25 mM CaCl2, 25 mM HEPES, 10 mM 글루코오스)에 용해된 포스콜린 및 IBMX의 칵테일이 첨가되었다.
형광 막 전위 분석으로부터 대표적인 데이터는 안정한 CFTR-발현 CHO 세포주 (세포주 1, M11, J5, E15, 그리고 O15)에서 기능성 CFTR에 기인하는 이온 플럭스 (ion flux)가 분석 반응에 의해 제시되는 바와 같이, CFTR 결여 대조 세포에서보다 모두 높다는 것을 증명하였다.
또한, 안정한 CFTR-발현 CHO 세포주 (세포주 1, M11, J5, E15, 그리고 O15)에서 기능성 CFTR에 기인하는 이온 플럭스가 일시적으로 CFTR-형질감염된 CHO 세포에서보다 모두 높았다. 일시적으로 CFTR-형질감염된 세포는 10 cm 조직 배양 접시당 5-16 백만 개로 CHO 세포를 도말하고, 형질감염에 앞서 18 내지 20시간 동안 배양함으로써 산출되었다. 지질 형질감염 시약과 CFTR을 인코딩하는 플라스미드로 구성되는 형질감염 복합체가 각 접시에 직접 첨가되었다. 이후, 이들 세포는 37℃에서 6 내지 12시간 동안 CO2 배양기에서 배양되었다. 배양 이후, 이들 세포는 들어 올려지고, 검고 깨끗한 바닥 384 웰 분석 평판으로 도말되고, 그리고 앞서 기술된 형광 막 전위 분석을 이용하여 기능에 대하여 분석되었다.
포스콜린 용량-반응 실험을 위해서, 384 웰 평판에서 15,000개 세포/웰의 밀도로 도말된 생산된 안정한 CFTR-발현 세포주의 세포는 CFTR 작동약으로 알려져 있는 증가하는 농도의 포스콜린으로 공격접종되었다. 세포 형광에서 변화의 함수로서의 세포 반응은 형광 평판 판독기 (Hamamatsu FDSS)에 의해 시간의 흐름 동안 모니터링되었다. 이후, 데이터는 포스콜린 농도의 함수로서 플롯팅되고, 그리고 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어를 이용한 비선형 회귀 분석을 이용하여 분석되고, 그 결과로써 256 nM의 EC50 값이 산출되었다. 생산된 CFTR-발현 세포주는 다른 세포주에서 이전에 보고된 포스콜린의 EC50 범위 (250 내지 500 nM) (Galietta et al., Am J Physiol Cell Physiol. 281(5): C1734-1742 (2001)) 내에서 포스콜린의 EC50 값을 나타내고, 이는 상기 클론의 효능을 지시한다.
실시예 13: CFTR 세포-기초된 분석에 대한 Z' 값의 측정
생산된 안정한 CFTR-발현 세포주에 대한 Z' 값은 고처리량의 적합한 형광 막 전위 분석을 이용하여 계산되었다. 형광 막 전위 분석 프로토콜은 실질적으로 실시예 12의 프로토콜에 따라 실시되었다. 구체적으로, Z' 분석을 위하여, 384 웰 분석 평판에서 24개의 양성 대조 웰 (15,000개 세포/웰의 밀도로 도말됨)은 포스콜린 및 IBMX의 CFTR 활성화 칵테일로 공격접종되었다. 동수의 웰은 운반제 단독 및 DMSO 함유 운반제(활성제의 부재에서)로 공격접종되었다. 2가지 조건에서 세포 반응은 형광 평판 판독기 (Hamamatsu FDSS)를 이용하여 모니터링되었다. 2가지 조건에서 평균 및 표준 편차가 계산되고, 그리고 Zhang et al., J Biomol Screen, 4(2):67-73 (1999)에 개시된 방법을 이용하여 Z'가 산정되었다. 생산된 안정한 GTFR 발현 세포주의 Z' 값은 0.82 이상인 것으로 측정되었다.
실시예 14: CFTR 조절제의 고처리량 스크리닝 및 확인
CFTR 조절제를 스크리닝하고 확인하기 위하여 고처리량의 적합한 형광 막 전위 분석이 이용된다. 분석 전날, 세포는 스톡 평판으로부터 항생제 없는 성장 배지로 수확되고 검고 깨끗한 바닥 384 웰 분석 평판으로 도말된다. 이들 분석 평판은 37℃ 세포 배양 배양기에서 5% CO2 하에 19 내지 24시간 동안 유지된다. 이후, 분석 평판으로부터 배지가 제거되고, 적하 완충액 (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.25 mM CaCl2, 25 mM HEPES, 10 mM 글루코오스)에서 희석된 블루 막 전위 염료 (Molecular Devices Inc.)가 첨가되고, 그리고 37℃에서 1시간 동안 세포가 배양된다. 검사 화합물은 디메틸설폭시드에 용해되고, 분석 완충액 (137 mM 글루콘산나트륨, 5 mM 글루콘산칼륨, 1.25 mM CaCl2, 25 mM HEPES, 10 mM 글루코오스)에서 희석되고, 이후 384 웰 폴리프로필렌 미량역가 평판으로 적하된다. 이들 세포 및 화합물 평판은 형광 평판 판독기 (Hamamatsu FDSS)로 적하되고 검사 화합물 활성을 확인하기 위하여 3분 동안 작동된다. 상기 기구는 이후, 300 nM 내지 1 μM 농도의 포스콜린 용액을 이들 세포에 첨가하여, 앞서 첨가된 화합물의 조절제 또는 차단제 활성이 관찰될 수 있도록 한다. 화합물의 활성은 이들 세포에 검사 화합물의 첨가 이후에 및/또는 차후 작동약 첨가 이후에 생성된 형광 변화를 측정함으로써 결정한다.
실시예 15: 단락 전류 측정을 이용한 고유 CFTR 기능에 대한 안정한 CFTR-발현 세포주의 특성화
배양 삽입체 (Snapwell, Corning Life Sciences) 상에 CFTR-발현 세포 (일차 또는 영속화 상피 세포, 예를 들면, 폐와 장)를 도말한 이후 7 내지 14일에, Using 챔버 실험이 실시된다. 배양 삽입체 상의 세포는 세정되고, Using 타입 장치 (EasyMount Chamber System, Physiologic Instruments)에 적재되고, 그리고 37℃에서 유지되고 120 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 3.3 mM KH2PO4, 0.8 mM K2HPO4, 1.2 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2 및 10 mM 글루코오스를 함유하는 연속적으로 가스공급된 링거액 (O2에서 5% CO2, pH 7.4)로 적셔진다. 이들 헤미챔버는 다채널 전압 및 전류 클램프 (VCC-C8, Physiologic Instruments)에 연결된다. 전극 [한천 가교된(1M KCl에서 4%) Ag-AgCl]이 이용되고, 그리고 삽입체는 0 mV로 전압 클램핑 (clamping)된다. 실험 기간 동안 매 10초마다 경상피 전류, 전압 및 저항이 측정된다. 저항이 <200 mΩ인 막은 폐기된다.
실시예 16: 전기생리학 분석을 이용한 고유 CFTR 기능에 대한 안정한 CFTR-발현 세포주의 특성화
수동식 및 자동식 전기생리학 분석 모두 개발되었고 양쪽 모두 이러한 시스템을 분석하는데 적용될 수 있지만, 하기에는 수동식 패치 클램프 실험을 위한 프로토콜이 기술된다.
세포는 낮은 밀도로 접종되고 도말후 2 내지 4일 시점에 이용된다. 보로실리케이트 유리 피펫은 파이어-폴리싱 (fire-polishing)되고 2-4 매가Ω의 팁 저항 (tip resistance)이 획득된다. 전류는 샘플링 (sampling)되고 로우 패스 (low pass) 필터링된다. 세포외 (베스) 용액은 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM 글루코오스, 10 mM 만니톨, 그리고 10 mM TES, pH 7.4를 함유한다. 피펫 용액은 120 mM CsCl, 1 mM MgCl2, 10 mM TEA-Cl, 0.5 mM EGTA, 1 mM Mg-ATP, 그리고 10 mM HEPES (pH 7.3)를 함유한다. 막 전도도는 막 전위를 -80 mV와 -100 mV 사이에 교류함으로써 모니터링된다. 전류-전압 관계는 20 mV 단계에서 -100 mV과 +100 mV 사이에 전압 펄스를 적용함으로써 산출된다.
실시예 17: 안정한 NaV 1.7 헤테로삼합체-발현 세포주의 산출
발현 구조체 산출
스트림라인 클로닝이 가능한 플라스미드 발현 벡터는 pCMV-SCRIPT (Stratagene)에 기초하여 산출되고, 그리고 CMV 및 SV40 진핵 프로모터; SV40 및 HSV-TK 폴리아데닐화 서열; 복수 클로닝 부위; Kozak 서열; 그리고 네오마이신/카나마이신 내성 카세트 (또는 암피실린, 하이그로마이신, 퓨로마이신, 제오신 내성 카세트)를 비롯하여, 목적 유전자의 전사 및 번역을 위해 필요한 다양한 성분을 포함하였다.
세포주 산출
단계 1: 형질감염
293T 세포는 표준 기술을 이용하여 3개의 개별 플라스미드로 공동-형질감염되었는데, 하나는 인간 NaV 1.7α 아단위 (서열 번호 19)를 인코딩하고, 하나는 인간 NaV 1.7 β1 아단위 (서열 번호 20)를 인코딩하고, 그리고 하나는 인간 NaV 1.7 β2 아단위 (서열 번호 NAV-3)를 인코딩하였다. (핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있는 시약의 실례에는 LIPOFECTAMINE™, LIPOFECTAMINE™ 2000, OLIGOFECTAMINE™, TFX™ 시약, FUGENE 6, DOTAP/DOPE, 메타펙틴 또는 FECTURIN™]이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.)
비록 본 발명의 세포 또는 세포주를 생성하기 위한 약물 선별이 선택 사항이긴 하지만, 플라스미드 마다 하나의 약물 내성 마커가 포함되었다. 이들 서열은 CMV 프로모터의 제어 하에 있었다. 신호전달 프로브에 의한 검출을 위한 NaV 표적 서열을 인코딩하는 비번역 서열 역시 약물 내성 마커를 인코딩하는 서열과 함께 존재하였다. 이용된 NaV 표적 서열은 NaV 표적 서열 1 (서열 번호 22), NaV 표적 서열 2 (서열 번호 23) 및 NaV 표적 서열 3 (서열 번호 24)이었다. 본 실시예에서, NaV 1.7α 아단위 유전자-포함 벡터는 NaV 표적 서열 1 (서열 번호 22)을 포함하고; NaV 1.7 β1 아단위 유전자-포함 벡터는 NaV 표적 서열 2 (서열 번호 23)를 포함하며; 그리고 NaV 1.7 β2 아단위 유전자-포함 벡터는 NaV 표적 서열 3 (서열 번호 24)을 포함하였다.
단계 2: 선별
형질감염된 세포는 DMEM-FBS 배지에서 2일간 성장되고, 그 이후에 항생제 함유 DMEM-FBS 배지에서 10일간 성장되었다. 항생제 함유 기간 동안, 다음과 같은 항생제가 배지에 첨가되었다: 퓨로마이신 (0.1 ㎍/㎖), 하이그로마이신 (100 ㎍/㎖) 및 제오신 (200 ㎍/㎖)
단계 3: 세포 계대배양
항생제에서 농축 이후에, 세포는 선택된 기간 동안 안정적이지 않은 발현이 진정될 수 있는 시간을 허용하기 위하여 항생제 선별의 부재에서 6 내지 18회 계대배양되었다.
단계 4: 형광 프로브에 세포 노출
세포는 수확되고 표준 기술을 이용하여 신호전달 프로브 (서열 번호 25, 26, 27)로 형질감염되었다. (핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있는 시약의 실례에는 LIPOFECTAMINE™, LIPOFECTAMINE™ 2000, OLIGOFECTAMINE™, TFX™ 시약, FUGENE 6, DOTAP/DOPE, 메타펙틴 또는 FECTURIN™이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.)
NaV 신호전달 프로브 1 (서열 번호 25)은 NaV 표적 서열 1 (서열 번호 22)에 결합하고; NaV 신호전달 프로브 2 (서열 번호 26)는 NaV 표적 서열 2 (서열 번호 23)에 결합하며; 그리고 NaV 신호전달 프로브 3 (서열 번호 27)은 NaV 표적 서열 3 (서열 번호 24)에 결합하였다. 이후, 이들 세포는 해리되고, 분석을 위해 수집되고, 그리고 형광 활성화된 세포 분류기 (Beckman Coulter, Miami, FL)를 이용하여 분류되었다.
신호전달 프로브에 의해 검출되는 표적 서열
NaV 1.7 아단위 도입유전자에 대하여 하기 표적 서열이 이용되었다.
NaV 표적 서열 1
5'-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3' (서열 번호 22) (NaV 1.7 α 아단위)
NaV 표적 서열 2
5'-GAAGTTAACCCTGTCgttctgcgac-3' (서열 번호 23) (NaV 1.7 β1 아단위)
NaV 표적 서열 3
5'-GTTCTATAGGGTCTGCTTGTCGCTC-3' (서열 번호 24) (NaV 1.7 β2 아단위)
신호전달 프로브
100 μM 스톡으로 제공됨.
NaV 신호전달 프로브 1 - 이 프로브는 표적 서열 1에 결합한다.
5' - Cy5 GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ3 소광기 -3' (서열 번호 25)
NaV 신호전달 프로브 2 - 이 프로브는 표적 서열 2에 결합한다.
5'- Cy5.5 CGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGC BHQ3 소광기 -3' (서열 번호 26)
NaV 신호전달 프로브 3 - 이 프로브는 표적 서열 3에 결합한다.
5'- Fam CGAGAGCGACAAGCAGACCCTATAGAACCTCGC BHQ1 소광기 -3' (서열 번호 27)
NaV 신호전달 프로브 1과 2에서 BHQ3은 BHQ2 또는 금 입자에 의해 대체될 수 있다. NaV 신호전달 프로브 3에서 BHQ1은 BHQ2, 금 입자, 또는 DABCYL에 의해 대체될 수 있다.
이에 더하여, Cy5와 유사한 스펙트럼 특성을 갖는 Quasar® Dye (BioSearch)를 이용한 유사한 프로브가 일정한 실험에 이용되었다. 일부 실험에서, DNA 프로브가 아닌 5-MedC와 2-아미노 dA 혼합기 프로브가 이용되었다.
단계 5: 양성 세포의 분리
배경을 초과하여 형광을 발하는 세포를 게이팅 (gating)하고, 그리고 규정된 게이트 내에 속하는 세포를 96-웰 평판으로 직접적으로 분리하기 위하여 표준 분석 방법이 이용되었다. 웰마다 단일 세포가 배치되도록 유세포분석 세포 분류 (flow cytometric cell sorting)가 실시되었다. 선별후, 이들 세포는 약물이 없는 배지에서 증식되었다. 아래의 게이팅 체계 (gating hierarchy)가 이용되었다: 플롯 FAM 대(對) Cy5: 0.1 - 1.0%의 생존 세포에서 일치 게이트 (coincidence gate) → 싱글렛 게이트 (singlets gate) → 라이브 게이트 (live gate) → 분류 게이트 (Sort gate).
단계 6: 단계 1-5 및/또는 3-5의 추가 사이클
단계 1 내지 5 및/또는 3-5는 더욱 많은 수의 세포를 획득하기 위하여 반복되었다. 단계 1-5의 적어도 4번의 독립된 라운드가 완결되었고, 그리고 이들 사이클 각각에 대하여, 단계 3-5의 적어도 2번의 내부 사이클이 각각의 독립된 라운드를 위하여 실시되었다.
단계 7: 세포 개체군에 대한 성장 속도의 평가
이들 평판은 Microlabstar 자동화 액체 조작기 (Hamilton Robotics)로 이동되었다. 세포는 100 단위/㎖ 페니실린 + 0.1 ㎎/㎖ 스트렙토마이신으로 보충된, 새로운 완전 성장 배지 (DMEM/10% FBS) 및 2-3일 조건 성장 배지의 1:1 혼합물에서 5-7일 동안 배양되었다. 이후, 이들 세포는 덩어리를 최소화시키기 위하여 트립신처리에 의해 분산되고 새로운 96-웰 평판으로 이동되었다. 클론이 분산된 이후, 평판은 웰 (Genetix)의 포화도를 결정하기 위하여 이미지화되었다. 각 평판은 평판 전역에서 신뢰성 있는 영상 획득을 위하여 집중되었다. 70% 이상의 보고된 포화도는 신뢰되지 않았다. 포화도 측정은 9일 (즉, 분산후 1일과 10일 사이에)에 걸쳐 3회 실시되고 성장 속도를 계산하는데 이용되었다.
단계 8: 성장 속도 평가치에 따른 세포 개체군 비닝
세포는 단계 7에서 분산 단계 이후 10-11일 사이에 성장 속도에 따라 비닝 (binning) (독립적으로 분류되고 코호트 (cohort)로서 도말됨) 되었다. 빈 (bin)은 독립적으로 수집되고 하류 취급을 위한 개별 96 웰 평판에 도말되었다; 일부 성장 빈은 하나 이상의 96 웰 평판을 발생시켰다. 빈 (bin)은 성장 속도의 전개를 고려하고 높은 비율의 세포 개체군 총수를 포괄하는 범위를 일괄함으로써 계산되었다. 단계 5에서 기술된 분류 반복 (sort iteration)에 따라서, 5 내지 9개의 성장 빈 (growth bin)이 1-4일의 간격으로 이용되었다. 이런 이유로, 각 빈은 반복에 따라서, 8 내지 14.4 시간의 성장 속도 또는 개체군 배가시간 차이에 상응하였다.
세포는 배가 시간이 1일 이하 내지 2주 이상일 수 있다. 동시에 성장 속도에 따라서 합리적으로 비닝될 수 있는 가장 다양한 클론을 처리하기 위하여, 빈 (bin)당 배가 시간이 0.25 내지 0.7일인 3-9개의 빈을 이용하는 것이 바람직하다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 빈의 치밀성 및 빈의 수는 특정 상황에 맞게 조정될 수 있고, 그리고 빈의 치밀성 및 수는 세포가 그들의 세포 주기에 대해 동기화되면 추가로 조정될 수 있다.
단계 9: 병렬 처리를 진척시키고 엄격한 품질 관리를 제공하는 복제 평판법 (replica plating)
이들 평판은 항생제 없는 DMEM-10%FBS 배지에서 표준화되고 고정된 조건 (가습된 37℃, 5% CO2) 하에 배양되었다. 이들 세포 평판은 표적 평판의 4개 세트를 생산하기 위하여 분할되었다. 이들 4개의 평판 세트는 최초 세트의 4개 복제물이 존재하도록 담보하기 위하여 모든 성장 빈과 함께, 모든 평판을 포함한다. 최대 3개의 표적 평판 세트는 저온 보존 (cryopreservation)되고 (단계 10에서 기술됨), 그리고 나머지 세트는 스케일에 따라 분류되고 계대배양 및 기능 분석 실험을 위하여 더욱 복제 도말되었다. 하류 복제 평판에 대하여 별개의 독립된 조직 배양 시약, 배양기, 인력 및 이산화탄소 공급원이 이용되었다. 모든 조직 배양 시약의 적절한 생산과 품질을 담보하기 위한 품질 관리 단계가 실시되었다: 이용을 위하여 준비된 배지의 각 병에 첨가된 각 성분은 두 번째 지정된 사람이 실수가 없도록 모니터링하는 동안, 지정된 후드에서 지정된 사람에 의해 상기 후드 내에서 단지 그 시약만을 이용하여 첨가되었다. 액체 취급 조건은 벽을 통한 교차 오염이 제거되도록 설정되었다. 모든 단계를 위해 새로운 팁이 이용되거나, 또는 엄격한 팁 세척 프로토콜이 이용되었다. 정확한 부피 전달, 효과적인 세포 조작, 세척 사이클, 피펫팅 속도와 위치, 세포 분산을 위한 피펫팅 사이클의 횟수, 그리고 평판에 대한 팁의 상대적 위치에 대한 액체 취급 조건이 설정되었다.
단계 10 - 세포 개체군의 조기 계대배양 스톡의 동결
3개의 평판 세트가 -70℃ 내지 -80℃에서 동결되었다. 각 세트의 평판은 먼저 70 내지 100%의 포화도 (confluency)가 달성되도록 허용되었다. 배지가 흡인되고 90% FBS 및 5%-10% DMSO가 첨가되었다. 이들 평판은 파라필름으로 밀봉되고, 1 내지 5 cm 발포체로 개별적으로 둘러싸이고, 이후 -80℃ 냉동장치 내로 넣어졌다.
단계 11 - 생존가능하고, 안정하며, 기능적인 (VSF) 세포주를 생산하기 위한 초기 형질전환 단계의 방법 및 조건
남아있는 평판 세트는 단계 9에서 기술된 바와 같이 유지되었다. 모든 세포 분할 (splitting)은 배지 제거, 세포 세척, 트립신 첨가와 배양, 소광 및 세포 분산 단계를 비롯한 자동화 액체 취급 단계를 이용하여 실시되었다. 일부 분석 도말 단계의 경우에, 세포는 트립신 보다는 세포 해리 완충액(가령, CDB, Invitrogen 또는 CellStripper, CellGro)을 이용하여 해리되었다.
단계 12 - 성장 속도의 나머지 편차를 보정하기 위한 표준화 방법
모든 세포 개체군에 대한 세포 및 배양 조건의 일관성 및 표준화가 제어되었다. 성장 속도에서 약간의 차이로 인한 평판 전역에서 차이는 매 2 내지 8회 계대배양 시점에서 평판 전역에서 세포 수의 주기적 표준화에 의해 제어되었다. 범위를 벗어나는 세포 개체군은 검출되고 제거되었다.
단계 13 - 세포 개체군의 특성화
세포는 이들 조건 하에서 그들의 시험관내 진화가 일어나도록 하기 위하여 3 내지 8주 동안 유지되었다. 이 기간 동안, 크기, 형태, 취성, 트립신처리에 대한 반응 또는 해리, 해리후 둥글기/평균 원형도, 생존율(%), 미세포화도 (microconfluency) 경향, 또는 세포 유지의 다른 측면, 예를 들면, 배양 평판 표면에 부착성이 관찰되었다.
단계 14 - VSF 조건 하에서 세포 개체군의 잠재적 기능성 평가
세포 개체군은 기능적 기준을 이용하여 조사되었다. 막 전위 분석 키트(Molecular Devices/MDS)는 제조업체의 지시에 따라 이용되었다. 세포는 96 웰 또는 384 웰 평판에서 여러 다른 밀도로 조사되고, 그리고 반응이 분석되었다. 도말후 다양한 시점, 예를 들면, 도말후 12-48 시간이 이용되었다. 또한, 분석 반응 차이에 대하여 다른 도말 밀도가 조사되었다.
단계 15
3 내지 9주 범위의 지정된 기간 동안 가장 일관된 반응을 보이는 세포를 확인하기 위하여, 낮은 및 더욱 높은 계대배양 횟수에서 실시된 실험으로부터 기능적 반응이 비교되었다. 시간의 흐름 동안 변하는 세포의 다른 특징들도 주목된다.
단계 16
기능적 및 다른 기준을 충족하는 세포 개체군은 생존가능하고, 안정하며 기능적인 세포주를 생산하기에 가장 적합한 것을 결정하기 위해서 추가로 평가되었다. 선별된 세포 개체군은 거대 조직 배양 용기에서 증식되고, 그리고 앞서 기술된 특성화 단계가 이들 조건하에서 지속되거나 반복되었다. 이 시점에서, 일관되고 신뢰성 있는 계대배양을 위해서 추가의 표준화 단계, 예를 들면, 상이한 도말 세포 밀도, 계대배양 시간, 배양 접시 크기/형태 및 코팅, 유체공학 최적화, 세포 해리 최적화 (유형, 이용된 부피 및 시간), 그리고 세척 단계가 도입되었다. 온도 차이 역시 표준화에 이용되었다 (즉, 30℃ 대(對) 37℃)
또한, 각 계대배양에서 세포의 생존율이 측정되었다. 수동 개입이 증가되고, 그리고 세포는 면밀히 관찰되고 모니터링되었다. 이러한 정보는 원하는 성질을 유지하는 최종 세포주를 확인 및 선별하는데 도움이 되었다. 일관된 성장, 적절한 부착성 및 기능적 반응을 나타내는 최종 세포주 및 백업 세포주가 선별되었다.
단계 17 - 세포 은행의 확립
최종 세포주 및 백업 세포주에 상응하는 앞서 기술된 낮은 계대배양 동결 평판은 37℃에서 해동되고, DMEM-10% FBS로 2회 세척되고, 가습된 37℃/5% CO2 조건에서 배양되었다. 이들 세포는 이후, 2-3주 동안 증식되었다. 15-20개의 바이알로 이루어진 각각의 최종 및 백업 세포주에 대한 세포 은행이 확립되었다.
단계 18
이들 세포주가 생존가능하고, 안정하며, 기능성인 지를 확인하기 위해서 하기 단계가 실시될 수 있다. 세포 은행으로부터 하나 이상의 바이알은 해동되고 배양 동안 증식된다. 생산된 세포는 이들 세포가 그들이 처음 선별되었던 특성과 동일한 특성을 충족하는지를 확인하기 위하여 조사된다.
실시예 18: 안정한 NaV 1.7-발현 세포주에서 이종기원 NaV 1.7 아단위의 상대적 발현 특성화
생산된 안정한 NaV 1.7-발현 세포주에서 이종기원 인간 NaV 1.7 α, β1 및 β2 아단위의 상대적 발현을 결정하기 위하여 정량적 RT-PCR (qRT-PCR)이 이용되었다. 전체 RNA는 RNA 추출 키트 (RNeasy Mini Kit, Qiagen)를 이용하여 1-3x106개 포유동물 세포로부터 정제되었다. 엄격한 DNase 처리 프로토콜 (TURBO DNA-없는 키트, Ambion)에 따라 DNase 처리가 수행되었다. 제1 가닥 cDNA 합성은 1 ㎍ DNA-없는 전체 RNA 및 250 ng 랜덤 프라이머 (Invitrogen)와 함께, 20 ㎕ 반응 부피에서 역전사효소 키트 (SuperScript III, Invitrogen)를 이용하여 수행되었다. 역전사효소가 없는 시료 및 RNA가 없는 시료은 이러한 반응의 음성 대조로서 이용되었다. 합성은 다음의 조건에서 유전자 증폭기 (Mastercycler, Eppendorf)에서 수행되었다: 25℃에서 5분, 50℃에서 60분; 반응 종결은 70℃에서 15분간 수행되었다.
유전자 발현 분석을 위하여, qRT-PCR용 프라이머 및 프로브 (MGB TaqMan probes, Applied Biosystems)는 표적 서열 (서열 번호 22, 23, 24)에 특이적으로 어닐링되도록 설계되었다. 시료 표준화를 위하여, 대조 (글리세르알데히드 3-포스페이트 디히드로게나제, GAPDH) 프리-디벨로프드 (Pre-Developed) 분석 시약 (TaqMaN, Applied Biosystems)이 이용되었다. 음성 대조 및 양성 대조 (플라스미드 DNA)를 비롯한 반응물은 50 ㎕ 반응 부피에서 40 ng의 cDNA를 이용하여 삼중으로 셋업되었다. 발현되는 3개의 NaV 1.7 아단위 각각의 상대적인 양이 측정되었다. 3개의 아단위 모두 생산된 안정한 NaV 1.7-발현 세포주에서 성공적으로 발현되었다.
실시예 19: 전기생리학적 분석을 이용한 고유 NaV 기능에 대한 안정한 NaV 1.7-발현 세포주의 특성화
NaV 1.7 α, β1 및 β2 아단위를 발현하는 생산된 안정한 HEK293T 세포주로부터 나트륨 흐름을 기록하기 위하여 자동화된 패치-클램프 (patch-clamp) 시스템이 이용되었다. 아래에 예시된 프로토콜 역시 QPatch, Sophion 또는 Patchliner, Nanion 시스템에 이용될 수 있다. 세포외 링거액은 140 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 2.6 mM MgCl2, 11 mM 글루코오tm 및 5 mM HEPES (실온에서 pH 7.4)을 함유하였다. 세포내 링거액은 120 mM CsF, 20 mM Cs-EGTA, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 그리고 10 mM HEPES (pH 7.2)를 함유하였다. 실험은 실온에서 수행되었다.
NaV 1.7 α, β1 및 β2 아단위를 안정적으로 발현하는 세포는 실시예 17에 기술된 표준 배양 프로토콜 하에 성장되었다. 세포는 수확되고 패치 능력 또는 품질의 유의미한 변화 없이 최대 4시간 동안 연속 교반하면서 현탁 상태로 유지되었다. 표준 패치 평판을 이용하여 전기생리학적 실험 (전체-세포)이 수행되었다. 패치-클램프 홀 (칩에서 마이크로-엣칭됨)은 직경이 대략 1 ㎛이고 저항이 ∼2 MΩ이다. 막 전위는 -100 mV의 유지 전위로 클램핑되었다.
HEK293T 세포에서 안정적으로 발현되는 전압-게이팅된 인간 NaV 1.7 나트륨 채널의 전류-전압 관계 및 불활성화 특징이 규명되었다. 나트륨 전류는 -100 mV의 유지 전위로, -80 mV 내지 +50 mV의 20 ms 탈분극 펄스에 응하여 측정되었다. 피크 나트륨 채널 전류에 대한 결과의 전류-전압(I-V) 관계가 규명되었다. 활성화 역치는 -35 mV (활성화 중간점, Va = -24.9 mV +/- 3.7 mV)이고, 그리고 최대 전류 진폭은 -10 mV에서 획득되었다. 나트륨 채널에 대한 불활성화 그래프가 작성되었다. 막 전위는 -100 mV의 유지 전위에 유지되고, 이후 1000 ms 동안 -110 mV 내지 +10 mV 범위의 조건 전위 (conditioning potential)로 바뀌고, 최종적으로 전류는 한 단계후 0 mV로 측정되었다. 결과의 전류 진폭은 나트륨 채널의 일부가 불활성화 상태임을 지시한다. -85 mV 보다 더 마이너스인 전위에서, 채널은 주로 닫힌 상태인데 반해 -50 mV 보다 높은 전위에서, 이들은 주로 불활성화 상태이었다. 곡선은 볼츠만 피트 (Boltzmann fit)를 나타내며, 이로부터 항정-상태 불활성화에 대한 V1/2는 -74 mV인 것으로 추정되었다. 생산된 안정한 NaV 1.7-발현 세포주에 대한 전류-전압 프로필은 앞서 보고된 전류-전압 프로필과 일치한다 (Va= -28.0 mV ± 1.1 mV; V1 /2 = -71.3 mV ± 0.8 mV) (Sheets et al., J Physiol. 581(Pt 3):1019-1031. (2007)).
실시예 20: 막 전위 분석법을 이용한 고유 NaV 기능에 대한 안정한 NaV 1.7-발현 세포주의 특성화
NaV 1.7 α, β1 및 β2 아단위를 발현하는 생산된 안정한 세포는 10% 소 태아 혈청, 글루타민 및 HEPES가 보충된 둘베코 변형 이글 배지에서 표준 세포 배양 조건 하에 유지되었다. 분석 전날, 이들 세포는 세포 해리 완충액, 예를 들면, CDB (GIBCO) 또는 세포 스트립퍼 (Mediatech)를 이용하여 스톡 평판으로부터 수확되고, 그리고 성장 배지에서 384 웰 평판에 웰당 10,000 - 25,000개 세포로 도말되었다. 이들 분석 평판은 5% CO2 하에 37℃ 세포 배양 배양기에서 22 내지 24시간 동안 유지되었다. 이후, 분석 평판으로부터 배지가 제거되고, 그리고 적하 완충액 (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.25 mM CaCl2, 25 mM HEPES, 10 mM 포도당)에서 희석된 블루 형광 막 전위 염료 (Molecular Devices Inc.)가 첨가되었다. 이들 세포는 1시간 동안 37℃에서 블루 막 전위 염료와 함께 배양되었다. 그 다음, 분석 평판은 고처리량 형광 평판 판독기 (Hamamastu FDSS)에 적하되었다. 형광 평판 판독기는 초당 1회 촬영된 세포 평판의 영상에서 세포 형광을 측정하고 그 데이터를 상대적 형광 단위 (relative florescence unit)로서 표시한다.
완충액 및 채널 활성제 (즉, 베라트리딘 및 스콜피온 독(SV))의 첨가에 대한 안정한 NaV 1.7-발현 세포 및 대조 세포 (즉, HEK293T 모세포)의 분석 반응이 측정되었다. 제1 첨가 단계 (즉, 첨가 1)에서, 완충액만 첨가되고 검사 화합물은 첨가되지 않았다. 원하는 경우에, 검사 화합물이 이 단계에서 첨가될 수 있다. 제2 첨가 단계에서, 나트륨 채널 활성제인 베라트리딘 및 스콜피온 독은 분석 완충액에서 원하는 농도 (즉, 25 μM 베라트리딘, 그리고 5∼25 ㎍/㎖ 스콜피온 독)로 희석되고, 384 웰 폴리프로필렌 미량역가 평판에 첨가되었다. 결합되면, 베라트리딘 및 스콜피온 독 단백질은 활성화 및 불활성화 동역학의 변화를 비롯한 메커니즘의 조합을 통해 전압-게이팅된 나트륨 채널의 활성을 조정한다. 안정한 NaV 1.7-발현 세포에서 나트륨 채널의 결과적인 활성화는 세포 막 전위를 변화시키고, 그리고 형광 신호가 증가한다. 앞서 기술된 기능성 분석은 또한, NaV 1.7 이온 채널에서 검사 화합물의 상대적인 효능을 특성화하는데 이용될 수 있다.
실시예 21: 베타 아단위에 의한 NaV 1.7 알파 아단위의 조절 특성화
베타 아단위에 의한 알파 아단위 유전자 발현의 조절
HEK293T 세포의 풀 (pool)은 독립적인 플라스미드 DNA 또는 α 및 대조 플라스미드의 몰 비율 (가령, α:β1:β2 = 1:1:1)을 조작함으로써, 다양한 비율의 α 및 β 아단위를 발현시키도록 조작되었다. 약물 선별 후, 6개의 상이한 세포 풀에서의 아단위 발현은 실시예 18에 기술된 바와 같이 qRT-PCR로 평가되었다. 비교 qRT-PCR은 α 아단위 및 대조 플라스미드만으로 형질감염된 경우와 비교하여 3개의 인간 NaV 1.7 아단위 (즉, α, β1 및 β2) 모두로 공동 형질감염될 때, 약물 선별된 세포 검출에서 α 아단위 발현이 증가된다는 것을 지시하였다. β 아단위 전사체의 존재는 α 아단위 유전자 발현에 영향을 주고, 이는 생리적으로 관련된 기능성 분석을 위하여 3개의 NaV 1.7 아단위 모두를 공동 발현시키는 것의 중요성을 증명한다.
베타 아단위에 의한 약리학적 특성의 조절
3개의 NaV 1.7 아단위 (즉, α, β1 및 β2) 모두를 안정적으로 공동-발현하는 세포 및 NaV 1.7 α 아단위만을 안정적으로 발현하는 대조 세포의 검사 화합물에 대한 반응을 측정하기 위하여 막 전이 세포-기반 분석법이 이용되었다. 2종의 화합물 (즉, C18 및 K21)이 실질적으로 실시예 20의 프로토콜에 따라서 수행된 막전이 분석에서 조사되었다. 구체적으로, 본 실시예에서, 검사 화합물은 제1 첨가 단계에서 첨가되었다.
C18 및 K21은 클론 44 (NaV 1.7 α, β1 및 β2 아단위 발현)의 발현을 강화시키고 클론 C60 (NaV 1.7 α 아단위만을 발현)의 반응을 차단하였다. 2종의 검사 화합물의 분석 반응은 이들 2가지 클론 각각에 대한 완충액 단독의 반응으로 표준화되었다.
실시예 22: NaV 1.7의 상이한 아단위 조합의 특성화
3개의 NaV 1.7 아단위 (즉, α, β1 및 β2) 모두를 안정적으로 공동-발현하는 상이한 세포주의 검사 화합물에 대한 반응을 측정하기 위하여 막 전이 세포-기반 분석법이 이용되었다. NaV 1.7 알파, 베타1 및 베타2 아단위의 발현에 대하여 양성인 세포로부터 산출된 4가지 세포주에서 조사된 일단의 화합물에 대한 용량-반응 분석 (dose-response analysis, DRC)은 상이한 기능적 프로필을 산출하였다 (도 4). 복수 세포주가 도 4에 도시된 4가지 프로필 각각에 유사한 프로필을 포함하는 것으로 밝혀졌다.
3개의 NaV 1.7 아단위 (즉, α, β1 및 β2) 모두를 공동-발현하는 ~90 NaV 1.7 세포주는 세포 기초된 분석법에서 그들의 기능적 약리학적 프로필에 기초하여 분류되었고, 여기서 각 클론 세포주는 동일한 화합물을 이용하여 조사되었다 (도 5). 도 5에서 각 군집 (빈 1-5)은 유사한 활성을 갖는 클론의 부분집합을 나타낸다. 활성은 도 5에서 각 클론 세포주에 대하여 도시된 바와 같이, 최대 신호 저해의 비율로서 계산되었다. 도 5에서 음수는 강화 작용 (potentiation)의 비율을 나타낸다.
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쓴맛 수용체 세포주를 만드는데 선호되는 G 단백질에는 생쥐 Gα15와 인간 GNA15가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
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표 22에 제시된 수용체의 인간 후각 수용체 동족체 역시 본 발명의 방법과 조성물에 이용될 수 있다.
실시예 23. 안정적인 감칠맛 수용체-발현 세포주의 산출
형질감염
HEK293T (ATCC CRL-11268)는 3개의 별개의 플라스미드로 공동-형질감염되었는데, 하나는 T1R1 (서열 번호 41)을 인코딩하고, 하나는 T1R3 (서열 번호 32)을 인코딩하고, 그리고 나머지 하나는 신호전달 분자 (생쥐 Gα15, 서열 번호 33)를 인코딩하였다. 비록 본 발명의 방법에서 약물 선별이 선택 사항이긴 하지만, 플라스미드 마다 하나의 약물 내성 마커가 포함되었다. 이들 서열은 CMV 프로모터의 제어 하에 있었다. 신호전달 프로브에 의한 검출을 위한 태그를 인코딩하는 비번역 서열 역시 약물 내성 마커를 인코딩하는 서열과 함께 존재하였다. 이용된 표적 서열은 표적 서열 1 (서열 번호 28), 표적 서열 2 (서열 번호 29) 및 표적 서열 3 (서열 번호 30)이었다. 이들 실례에서, T1R1 유전자 벡터는 표적 서열 3을 포함하고, T1R3 유전자 벡터는 표적 서열 1을 포함하고, 그리고 Gα15 유전자 벡터는 표적 서열 2를 포함하였다. 이들 세포는 약물을 포함하는 배지에서 10-14일 동안 전통적으로 선별되었다.
형광 프로브에 세포의 노출
선별된 세포는 수확되고 신호전달 프로브 (서열 번호 38-40)로 형질감염되었다. 신호전달 프로브 1은 태그 서열 1 (서열 번호:126)에 결합하고, 신호전달 프로브 2는 태그 서열 2 (서열 번호:127)에 결합하고, 그리고 신호전달 프로브 3은 태그 서열 3 (서열 번호:128)에 결합한다. 이후, 이들 세포는 해리되고, 분석을 위하여 수집되고, 형광 활성화된 세포 분류기 (Beckman Coulter, Miami, FL)를 이용하여 분류되었다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 선택된 호스트 세포와 함께 이용하기 적합한 임의의 시약이 적절한 최적화로, 핵산, 예를 들면, 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, 또는 표지된 올리고뉴클레오티드를 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있는 시약의 실례에는 Lipofectamine, LIPOFECTAMINE 2000, Oligofectamine, TFX 시약, Fugene 6, DOTAP/DOPE, Metafectine, 또는 Fecturin이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
신호전달 프로브 1
5' - Cy5 GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ3 소광기 -3' (SEQ ID NO: 38)
신호전달 프로브 2
5'- Cy5.5 GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGC BHQ3 소광기 -3' (SEQ ID NO: 39)
신호전달 프로브 3
5'- Fam GCGAGAGCGACAAGCAGACCCTATAGAACCTCGC BHQ1 소광기 -3' (SEQ ID NO: 40)
표적 서열이 굵게 표시된 태그 서열 1 (감칠맛)
AGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGAGGCAGGTGGACAGGAAGGTTCTAATGTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGACATCTGGGCCCGGAAAGCCTTTTTCTCTGTGATCCGGTACAGTCCTTCTGC (서열 번호:126)
표적 서열이 굵게 표시된 태그 서열 2 (감칠맛)
AGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTCGAGGCAGGTGGACAGCTTGGTTCTAATGAAGTTAACCCTGTCGTTCTGCGACATCTGGGCCCGGAAAGCGTTTAACTGATGGATGGAACAGTCCTTCTGC (서열 번호:127)
표적 서열이 굵게 표시된 태그 서열 3 (감칠맛)
AAGGGCGAATTCGGATCCGCGGCCGCCTTAAGCTCGAGGCAGGTGGACAGGAAGGTTCTAATGTTCTATAGGGTCTGCTTGTCGCTCATCTGGGCCCGGAGATG (서열 번호:128)
다른 표적 서열 및 신호전달 프로브가 이용될 수 있다 (가령, 2005년 9월 1일 공개된 International Patent Application Publication No. WO2005/079462 (Application No. PCT/US05/005080)에서 기술된 바와 같이). 가령, BHQ3은 프로브 1 또는 프로브 2에서 BHQ1 또는 금 입자로 치환될 수 있다. BHQ1이 프로브 3에서 BHQ2 또는 Dabcyl로 치환될 수 있다는 점에 주의한다. Cy5와 유사한 스펙트럼 특성을 갖는 Quasar Dye (BioSearch)를 이용한 유사한 프로브가 일정한 실험에 이용되었다. 또한, 일부 경우에 DNA 프로브 대신에 5-MedC와 2-아미노 dA 혼합기 프로브가 이용될 수 있다는 점에 주의한다.
양성 세포의 분리
배경을 초과하여 형광을 발하는 세포를 게이팅 (gating)하고, 그리고 규정된 게이트 내에 속하는 세포를 96-웰 평판으로 직접적으로 분리하기 위하여 표준 분석 방법이 이용되었다. 웰마다 단일 세포가 배치되도록 세포 분류가 실시되었다. 선별후, 이들 세포는 약물이 없는 배지에서 증식되었다.
기능적 형질전환
감칠맛 수용체 세포 (상기와 같이 선별되고 증식됨)는 예로써, 낮은-글루코오스 DMEM 배지를 비롯한 다양한 성장 조건에서, 또는 10% 혈청을 포함하거나 혈청이 없는 글루코오스-없는 Leibovitz L-15 배지에서 동일한 세포와 상이한 세포의 분취량 둘 모두를 이용하여 유지되었다. 일부 세포는 다양한 농도의 다른 당, 예를 들면, 갈락토오스를 포함하는 배지에서 유지되었다. 이후, 복합 조건 하에 유지된 감칠맛 수용체 세포주의 세포는 감칠맛 리간드에 적절하게 반응하고 다른 자극 (즉, 당)에 반응하지 않는 능력에 대하여 특성화되었다.
이론에 한정됨 없이, 다양한 배지 조건에서 성장은 예로써, 유전자 발현 수준에서 변화, 게놈 조직 및 세포 표면에서 수용체의 기능적 발현으로 인하여, 세포를 기능적으로 형질전환시킬 수 있다. 평가되고 세포의 기능 분석 반응에 영향을 주는 것으로 밝혀진 다양한 배지에서 파라미터에는 혈청 농도 (즉, 낮은 혈청 농도 및 혈청 상실), 당 상실 및 분석 평판 코팅 (가령, 폴리 D 리신 및 라미닌)이 포함된다. 이들 결과는 감칠맛 수용체 세포주의 세포의 특징이 이들 세포가 상이한 배지 조건에서 유지될 때 달라질 수 있음을 증명하였다. 이들 결과는 또한, 형광 프로브에 의해 선별된 상이한 세포가 상이한 특징을 가질 수 있음을 증명한다. 형광 프로브에 의해 선별되는 세포의 특성화의 한 가지 실례는 도 6에 도시된다. 도 6에서 확인되는 바와 같이, 상이한 조건 (1, 2 및 최종)에서 성장된 동일한 세포의 분취량은 감칠맛 (MSG) 및 단맛 (프럭토오스) 리간드에 매우 상이하게 반응하였다. 조건 1에서 성장된 세포는 혈청 상실된, 낮은 글루코오스 배지에 도말되었다. 조건 2에서 성장된 세포는 10% 혈청을 포함하는 낮은 글루코오스 배지에서 하룻밤동안 도말되고, 이후 분석에 앞서 혈청-상실된 배지로 전환되었다. 조건 1 또는 2에서 성장된 세포는 코팅된 평판 (Corning #3665)에 도말되었다. "최종" 조건은 코팅된 평판 (Corning #3300) 상에서, 그리고 혈청 상실된 낮은 글루코오스 배지에서 고밀도 성장을 포함한다. 조건 1에서 성장된 세포는 감칠맛 작동약보다 단맛 작동약에 더욱 강하게 반응한다. 조건 2에서 성장된 세포는 양쪽 리간드에 동등하게 반응한다. 대조적으로, "최종" 성장 조건에서 성장된 세포는 MSG에 강하게 반응하지만 프럭토오스에 반응하지 않는다. 따라서 이들 세포는 생리학적으로 및 약리학적으로 관련된 감칠맛 수용체를 생산하였다.
실시예 24: 고유 감칠맛 수용체 기능에 대한 세포주의 특성화
1. 유전자 발현의 확인과 정량
qRT-PCR을 이용하여, 상기 세포 ("최종")에서 발현되는 각각의 감칠맛 수용체 아단위의 상대적인 양 (RNA)이 측정되었다. qRT-PCR을 이용하여, 발현되는 각각의 감칠맛 수용체 아단위의 상대적인 양이 측정되었다. 전체 RNA는 상업적으로 가용한 RNA 정제 키트 (RNeasy Mini Kit,Qiagen)를 이용하여 1-3x106개 포유동물 세포로부터 정제되었다. RNA 추출물은 이후, 엄격한 DNase 처리 프로토콜 (TURBO DNA-없는 키트; Ambion)을 이용하여 처리되었다. 제1 가닥 cDNA 합성은 1 ㎍ DNA-없는 전체 RNA 및 250 ng 랜덤 프라이머 (Invitrogen)와 함께, 20 ㎕ 반응 부피에서 역전사효소 키트 (SuperScript III, Invitrogen)를 이용하여 수행되었다. 이러한 반응의 음성 대조에는 cDNA 합성 단계 동안 역전사효소 또는 RNA가 존재하지 않는 시료가 포함되었다. cDNA 및 PCR 산물 합성은 다음의 조건에서 유전자 증폭기 (Mastercycler, Eppendorf)에서 수행되었다: 25℃에서 5분, 50℃에서 60분; 반응 종결은 70℃에서 15분간 수행되었다.
유전자 발현 (RNA) 분석을 위하여, T1R1, T1R3 및 생쥐 Gα15 cDNA (MGB TaqMan 프로브, Applied Biosystems)에 대한 프로브가 이용되었다. 시료 표준화 대조, GAPDH의 경우에, Pre-Developed TaqMaN 분석 시약 (Applied Biosystems)이 이용되었다. 음성 대조 및 양성 대조 (플라스미드 DNA)를 비롯한 반응물은 50 ㎕ 반응 부피에서 40 ng의 cDNA를 이용하여 삼중으로 셋업되었다. 발현되는 각각의 감칠맛 수용체 아단위의 상대적인 양 (RNA)이 측정되었다. 도 7의 그래프에서는 그 결과를 도시하고 3개의 핵산 모두 감칠맛 수용체 세포주에서 발현된다는 (RNA) 것을 지시한다. T1R1, T1R3 및 Gα15의 발현 수준은 대조 세포에서 관찰되는 수준보다 각각, 대략 10,000x, 100x, 그리고 100,000x 높았다.
앞서 기술된 프로토콜에 따라서 산출된 감칠맛 수용체 세포주 ("최종")의 1개월과 9개월 배양액에서 T1R1, T1R3 및 Gα15 유전자 발현 (RNA)을 평가하기 위하여 표준 단일 종점 RT-PCR 절차가 이용되었다. 세포는 24-웰 평판 형태에서 80% 포화도로 성장되고, 수확되고, 그리고 상업적으로 가용한 RNA 준비 키트 (RNAqueous kit, Ambion)를 이용하여 RNA가 분리되었다. 5pg 내지 5 ㎍ 범위의 정제된 전체 RNA가 올리고 (dT) 12,18 프라이머와 함께, 상업적 제1 가닥 cDNA 합성 키트 (Superscript III kit, Invitrogen)의 프로토콜에 따라서, 역전사를 수행하는데 이용되었다. 제1 가닥 합성 이후에, 생쥐 Gα15 핵산뿐만 아니라 감칠맛 수용체 핵산의 아단위 (T1R1, T1R3)에 특이적인 올리고 세트가 PCR 반응 혼합물 (HotStart Taq)에서 독립적으로 조립되었다. 45회 사이클 PCR 이후에, 앰플리콘 시료는 아가로즈 겔 전기영동에 의해 더욱 분석되었다.
이들 단일-종점 RT-PCR 실험으로부터 결과는 도 8에 예시된다. 도 8에서는 이들 RT-PCR 실험에 이용된 아가로즈 겔의 대표적인 사진을 도시한다. 모든 감칠맛 수용체 인코딩 핵산의 강한 발현 (RNA)이 1개월과 9개월 배양액 둘 모두에서 검출되었는데, 이는 "최종" 조건 하에 성장된 본 발명의 세포주에 대한 안정성의 이례적인 수준을 증명하였다.
2. 조절제에 대한 세포-기초된 분석
본 발명의 세포는 분석에 앞서 24시간 시점에, 96 웰 평판에서 성장 배지 (낮은 글루코오스 DMEM 또는 L15 배지, 상기 배지는 혈청 및 표준 성장 첨가제로 보충됨)에서 웰마다 접종된다 (75-125K). 배양 이후에, 성장 배지가 제거되고, 그리고 이들 세포는 성장 혈청-없는 배지에 배치된다. 세포는 2-3시간 동안 배양된다. 이후, 배지가 제거되고, 그리고 이들 세포는 감칠맛 분석 완충액 (130mM NaCl, 1.1mM KH2PO4, 1.3mM CaCl, 20mM HEPES 및 3mM NaHPO4*7H20)에 희석된 칼슘-민감성 형광 염료 (칼슘-3, Molecular Devices Corp.)가 적하된다. 세포는 상기 배지에서 1시간 동안 배양된다. 평판은 고처리량 형광 평판 판독기 (Hamamatsu FDSS) 상에 적하된다. 검사 화합물은 감칠맛 분석 완충액에서 원하는 농도로 희석되고 각 웰에 첨가된다. 칼슘 유동은 90초 동안 검출된다. 앞서 기술된 바와 같이 완충액에서 희석된 활성제 (즉, MSG)가 10 μM 내지 100 mM 범위의 최종 농도로 각 웰에 첨가되고, 그리고 상대적인 형광에서 변화가 추가로 90초 동안 기록된다.
3. 감칠맛 세포-기초된 분석에서 Z'와 EC 50 값의 측정
이들 감칠맛 수용체-발현 세포주에서 감칠맛 수용체 반응의 유효성을 조사하기 위하여, 확립된 감칠맛 수용체 작동약 모노나트륨 글루타메이트 (MSG)가 앞서 기술된 분석에서 검사 화합물로서 이용된다. MSG (Sigma, G5889)는 33mM의 농도로 검사 웰에 첨가되고, 그리고 대조 웰은 완충액 단독이 제공된다. 이들 최종 분석 조건에서, 형광 평판 판독기 (FLIPR3 작동 시스템, Molecular Devices)에 의해 측정되는 칼슘 유동 치수가 보고된다. 한 가지 수회 반복된 분석에서, 이들 세포주는 0.8의 Z' 값을 갖는다. 도 9 (한 가지 예시적인 분석)를 참조한다. 이러한 Z' 값은 산출된 감칠맛 수용체-발현 세포가 세포-기초된 분석에서 MSG를 인식하고, 그리고 이들 분석이 이들 세포를 이용하여 신뢰성 있게 및 강건하게 실시될 수 있다는 것을 지시한다.
본 발명의 감칠맛 수용체-발현 세포주에서 감칠맛 수용체 반응의 민감도를 조사하기 위하여, 증가하는 용량의 MSG를 세포에 첨가하고 앞서 기술된 바와 같이 반응을 측정함으로써 용량 반응 실험이 실시된다. 한 가지 분석 (도 10)에서, 이러한 세포주에서 MSG에 대한 EC50 값이 22mM인 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 본 발명의 세포주에서 생산된 감칠맛 수용체가 본 발명의 감칠맛 수용체-발현 세포주에서 공지된 감칠맛 수용체 리간드에 강한 민감도를 나타낸다는 것을 지시한다.
실시예 25. 공지된 강화제 IMP 및 사이클라민산나트륨에 의한 MSG에 대한 감칠맛 세포주 반응의 강화 작용
앞서 언급된 바와 같이, MSG는 감칠맛 수용체의 공지된 리간드이다. 또한, 뉴클레오티드 이노신 모노포스페이트 (IMP, Sigma)가 MSG와 함께 제공될 때, 감칠맛 수용체 신호전달의 강화제로서 기능할 수 있는 것으로 증명되었다. 앞서 기술된 분석 프로토콜을 이용하여, 증가하는 MSG 및 증가하는 IMP 농도의 매트릭스가 세포주에 적용되고, 그리고 반응이 산출된다. 도 11에서는 한 가지 이와 같은 분석에서, IMP 농도가 증가함에 따라서, 더욱 강한 반응이 조사된 MSG의 각 농도에서 검출된다는 것을 보여준다.
MSG와 유사하게, 인공 감미료인 사이클라민산나트륨은 단맛 및 감칠맛 수용체 둘 모두에 공통된 아단위와 상호작용하기 때문에, 감칠맛 수용체의 활성제로서 기능할 수 있다. 앞서 기술된 분석 프로토콜을 이용하여, 증가하는 사이클라메이트 (cyclamate) (Sigma) 농도의 매트릭스가 적용되고, 그리고 반응이 산출된다. 도 12에서는 한 가지 분석에서, 사이클라메이트 농도가 증가함에 따라서, 더욱 현저한 반응이 검출된다는 것을 보여준다. 이는 MSG의 존재 없이 사이클라메이트를 검출하지 못하는, 선행 기술에서 기술된 여러 다른 세포와 대조적이다.
실시예 26. 안정적인 쓴맛 수용체-발현 세포주의 산출
단계 1 - 형질감염
293T 세포는 2개의 별개의 플라스미드로 공동-형질감염되는데, 하나는 인간 TAS2R 쓴맛 수용체 (서열 번호 77-101 중의 한 가지)를 인코딩하고, 그리고 다른 하나는 생쥐 Gα15 신호전달 단백질 (서열 번호 102)을 인코딩한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 선택된 호스트 세포와 함께 이용하기 적합한 임의의 시약이 적절한 최적화로, 핵산, 예를 들면, 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, 또는 표지된 올리고뉴클레오티드를 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있는 시약의 실례에는 Lipofectamine, LIPOFECTAMINE 2000, Oligofectamine, TFX 시약, Fugene 6, DOTAP/DOPE, Metafectine, 또는 Fecturin이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 비록 약물 선별이 본 발명의 방법에서 선택 사항이긴 하지만, 플라스미드 마다 하나의 포유동물 약물 내성 마커가 포함되었다. 플라스미드는 쓴맛 수용체 유전자 또는 Gα15 유전자의 발현을 위하여 CMV 프로모터를 이용하였다. 신호전달 프로브에 의한 검출을 위한 태그를 인코딩하는 비번역 서열 역시 약물 내성 마커를 인코딩하는 서열과 함께 각 벡터 내에 존재하고, 따라서 상기 태그는 상기 벡터가 발현하는 단백질, 다시 말하면, 쓴맛 수용체 또는 Gα15와 함께 전사되었다. 이용된 표적 서열은 표적 서열 1 (서열 번호 46), 그리고 표적 서열 2 (서열 번호 47)이었다. 이들 실례에서, TAS2R 유전자-포함 벡터는 표적 서열 1을 포함하고, 그리고 Gα15 유전자-포함 벡터는 표적 서열 2를 포함하였다.
단계 2 - 선별 단계
형질감염된 세포는 소 태아 혈청 (FBS)을 포함하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 2일 동안 성장되고, 그 이후에 항생제-포함 DMEM-FBS에서 2주 동안 성장되었다. 이러한 항생제 포함 기간 동안, 항생제가 아래와 같이 배지에 첨가되었다: 퓨로마이신 (0.15 ㎍/㎖) 및 하이그로마이신 (100 ㎍/㎖).
단계 3 - 세포 계대배양
항생제에서 농축 이후에, 그리고 형광 신호전달 프로브의 도입에 앞서, 세포는 선택된 기간 동안 안정적이지 않은 발현이 진정될 수 있는 시간을 허용하기 위하여 항생제 선별의 부재에서 8회 (p5-p13) 이상 계대배양되었다.
단계 4 - 형광 신호전달 프로브에 세포의 노출
세포는 수확되고 신호전달 프로브 (서열 번호 48과 49)로 형질감염되었다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 선택된 호스트 세포와 함께 이용하기 적합한 임의의 시약이 적절한 최적화로, 핵산, 예를 들면, 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, 또는 표지된 올리고뉴클레오티드를 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있는 시약의 실례에는 Lipofectamine, LIPOFECTAMINE 2000, Oligofectamine, TFX 시약, Fugene 6, DOTAP/DOPE, Metafectine, 또는 Fecturin이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
신호전달 프로브에 의해 검출되는 표적 서열
표적 1
5'-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3' (서열 번호 46)
표적 2
5'-GAAGTTAACCCTGTCgttctgcgac-3' (서열 번호 47)
Cy5와 유사한 스펙트럼 특성을 갖는 Quasar Dye (BioSearch)를 이용한 유사한 프로브가 일정한 실험에 이용되었다. 또한, 일부 경우에 DNA 프로브 대신에 5-MedC와 2-아미노 dA 혼합기 프로브가 이용될 수 있다는 점에 주의한다. 뒤섞인 비-표적화 fam 프로브는 전달 대조로서 이용되었다 (제시되지 않음).
신호전달 프로브
이들 신호전달 프로브는 100μM 스톡으로서 제공되었다.
신호전달 프로브 1 - 표적 1에 결합한다
5' - Cy5 GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ3 소광기 -3' (서열 번호 48)
신호전달 프로브 2 - 표적 2에 결합한다
5'- Cy5.5 GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGC BHQ3 소광기 -3' (서열 번호 49)
BHQ3이 프로브 1 또는 프로브 2에서 BHQ1 또는 금 입자로 치환될 수 있다는 점에 주의한다.
BHQ3은 프로브 1 또는 프로브 2에서 BHQ2 또는 금 입자로 치환될 수 있다.
단계 5 - 양성 세포의 분리
이들 세포는 해리되고, 분석 및 형광 활성화된 세포 분류기 (Beckman Coulter, Miami, FL)를 이용한 분류를 위하여 수집되었다. 배경을 초과하여 형광을 발하는 세포를 게이팅 (gating)하고, 그리고 게이트 내에 속하는 개별 세포를 바코드 부착된 96-웰 평판으로 분리하기 위하여 표준 분석 방법이 이용되었다. 게이팅 체계 (gating hierarchy)는 아래와 같았다: 일치 게이트 (coincidence gate) > 싱글렛 게이트 (singlets gate) > 라이브 게이트 (live gate) > 분류 게이트 (Sort gate). 이러한 게이팅 전략으로, 이중 양성 세포의 상위 0.1-1.3%는 바코드 부착된 96-웰 평판으로 분류되는 것으로 표기되었다.
단계 6 - 단계 1-5 및/또는 3-5의 추가 사이클
실험은 매우 엄격하게 시한된 상세 계획으로 수행되었다. 이러한 프로토콜의 일부로서, 중복 분류 (redundant sort)를 완결하고 추가 클론을 획득하기 위하여 단계 3-5의 2회 완전 사이클이 실시되었다.
단계 7 - 세포 개체군에 대한 성장 속도의 평가
이들 평판은 Hamilton Microlabstar 자동화 액체 조작기 (automated liquid handler)로 이동되었다. 세포는 100 단위/㎖ 페니실린 + 0.1 ㎎/㎖ 스트렙토마이신으로 보충된, 2-3일 조건 성장 배지 : 새로운 성장 배지 (DMEM/10% FBS)의 1:1 혼합물에서 최대 20일 동안 배양되었다. 평판은 분류후 7일과 20일 사이에, 웰 (Genetix)의 포화도를 결정하기 위하여 이미지화되었다. 각 평판은 평판 전역에서 신뢰성 있는 영상 획득을 위하여 집중되었다. 70% 이상의 보고된 포화도는 신뢰되지 않았다. 포화도 측정은 상기 특정된 기간 동안 3회 실시되고 성장 속도를 계산하는데 이용되었다.
단계 8: 성장 속도 평가치에 따른 세포 개체군 비닝
세포는 분류후 대략 20일 시점에 성장 속도에 따라 비닝 (binning) (독립적으로 분류되고 코호트 (cohort)로서 도말됨) 되었다. 빈 (bin)은 독립적으로 수집되고 하류 취급을 위한 개별 96 웰 평판에 도말되고, 그리고 특정 빈 마다 하나 이상의 표적 평판이 존재할 수 있었다. 빈 (bin)은 성장 속도의 전개를 고려하고 높은 비율, 적어도 대략 90% (평가치로서)의 세포 개체군 총수를 포괄하는 범위를 일괄함으로써 계산되었다. 5개의 성장 빈이 이용되었는데, 상이한 쓴맛 수용체 세포주 전역에서 이들 빈의 평균 간격이 1.2-3.5일이었다. 이런 이유로, 각각의 빈은 대략 11시간의 성장 속도 또는 개체군 배가시간 차이에 상응하였다.
세포는 배가 시간이 1일 이하 내지 2주 이상일 수 있다 - 동시에 성장 속도에 따라서 합리적으로 비닝될 수 있는 가장 다양한 클론을 처리하기 위하여, 빈 (bin)당 배가 시간이 0.25 내지 0.7일인 3-9개의 빈을 이용하는 것이 바람직하다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 빈의 치밀성 및 빈의 수는 특정 상황에 맞게 조정될 수 있고, 그리고 빈의 치밀성 및 수는 세포가 그들의 세포 주기에 대해 동기화되면 추가로 조정될 수 있다.
단계 9: 병렬 처리를 진척시키고 엄격한 품질 관리를 제공하는 복제 평판법 (replica plating)
이들 평판은 항생제 없는 DMEM 배지/10% FBS에서 표준화되고 고정된 조건 (가습된 37℃, 5% CO2/95% 공기) 하에 배양되었다. 이들 세포 평판은 표적 평판의 4개 세트 (이러한 세트는 모든 성장 빈과 함께, 모든 평판으로 구성된다 - 이들 단계는 최초 세트의 4개 복제물이 존재하도록 담보한다)를 생산하기 위하여 분할되었다. 최대 3개의 표적 평판 세트는 저온 보존 (cryopreservation)되고 (하기 참조), 그리고 나머지 세트는 스케일에 따라 분류되고 계대배양 및 기능 분석 실험을 위하여 더욱 복제 도말되었다. 각각의 평판 세트에 대하여 별개의 독립된 조직 배양 시약, 배양기, 인력 및 이산화탄소 공급원이 이용되었다. 모든 조직 배양 시약의 적절한 생산과 품질을 담보하기 위한 품질 관리 단계가 실시되었다: 이용을 위하여 준비된 배지의 각 병에 첨가된 각 성분은 두 번째 지정된 사람이 실수가 없도록 모니터링하는 동안, 지정된 후드에서 지정된 사람에 의해 상기 후드 내에서 단지 그 시약만을 이용하여 첨가되었다. 액체 취급 조건은 벽을 통한 교차 오염이 제거되도록 설정되었다. 모든 단계를 위해 새로운 팁이 이용되거나, 또는 엄격한 팁 세척 프로토콜이 이용되었다. 정확한 부피 전달, 효과적인 세포 조작, 세척 사이클, 피펫팅 속도와 위치, 세포 분산을 위한 피펫팅 사이클의 횟수, 그리고 평판에 대한 팁의 상대적 위치에 대한 액체 취급 조건이 설정되었다.
단계 10 - 세포 개체군의 조기 계대배양 스톡의 동결
3개의 평판 세트가 -70℃ 내지 -80℃에서 동결되었다. 각 세트의 평판은 먼저 70 내지 100%의 포화도 (confluency)가 달성되도록 허용되었다. 배지가 흡인되고 90% FBS 및 10% DMSO가 첨가되었다. 이들 평판은 파라필름으로 밀봉되고, 1 내지 5 cm 발포체로 개별적으로 둘러싸이고, 이후 -80℃ 냉동장치 내로 넣어졌다.
단계 11 - 안정적인 세포주를 생산하기 위한 초기 형질전환 단계를 위한 방법 및 조건
남아있는 평판 세트는 단계 9에서 앞서 기술된 바와 같이 유지되었다. 모든 세포 분할 (splitting)은 배지 제거, 세포 세척, 트립신 첨가와 배양, 소광 및 세포 분산 단계를 비롯한 액체 취급 단계를 이용하여 실시되었다.
단계 12 - 재배열된 평판에서 세포의 기능성 조사
수용체 세포 패널의 스케일로 인하여, 표준화가 이용되지 않았다 - 그 대신에, 성장 재배열된 평판이 최우선적으로 기능성에 대하여 즉시 조사되었다 (재배열후 3 내지 5회 계대배양), 그리고 25개 쓴맛 수용체 각각에 대한 반응자의 부분집합 개체군이 확인되었다.
단계 13 - 세포 개체군의 특성화
클론은 분류후 3.5 내지 6주 시점에 스크리닝 (screening)되고, 그리고 상위 클론은 기능적으로 재조사되고 분류후 5 내지 6주 시점에 확인되었다. 세포는 이들 조건 하에서 그들의 시험관내 진화가 일어나도록 하기 위하여 최대 6주 동안 유지되었다. 이 기간 동안, 크기, 형태, 취성, 트립신처리에 대한 반응 또는 해리, 해리후 둥글기/평균 원형도, 생존율(%), 미세포화도 (microconfluency) 경향, 또는 세포 유지의 다른 측면, 예를 들면, 배양 평판 표면에 부착성이 관찰되었다.
단계 14 - 세포 개체군의 잠재적 기능성 평가
세포 개체군은 기능적 기준을 이용하여 조사되었다. 칼슘 동원 염료 키트 (칼슘 3, Molecular Devices/MDS)는 제조업체의 지시에 따라 이용되었다. 세포는 96 웰 또는 384 웰 평판에서 여러 다른 밀도로 조사되고, 그리고 반응이 분석되었다. 도말후 다양한 시점, 예를 들면, 도말후 12-48 시간이 이용되었다. 또한, 분석 반응 차이에 대하여 다른 도말 밀도가 조사되었다.
분류후 6 내지 11주 범위의 지정된 기간 동안 가장 일관된 반응을 보이는 세포를 확인하기 위하여, 낮은 및 더욱 높은 계대배양 횟수에서 실시된 실험으로부터 기능적 반응이 비교되었다. 시간의 흐름 동안 변하는 세포의 다른 특징, 예를 들면, 해리후 세포가 재부착하는데 걸리는 시간 역시 주목되었다.
단계 16 - 세포의 추가적인 평가
기능적 및 다른 기준을 충족하는 세포 개체군은 생존가능하고, 안정하며 기능적인 세포주를 생산하기에 가장 적합한 것을 결정하기 위해서 추가로 평가되었다. 선별된 세포 개체군은 거대 조직 배양 용기에서 증식되고, 그리고 앞서 기술된 특성화 단계가 이들 조건하에서 지속되거나 반복되었다. 이 시점에서, 일관되고 신뢰성 있는 계대배양을 위해서 추가의 표준화 단계가 도입되었다. 이들에는 상이한 도말 세포 밀도, 평판 코팅, 계대배양 시간, 배양 접시 크기/형태 및 코팅, 유체공학 최적화, 세포 해리 최적화 (가령, 세포 해리 완충액 (Invitrogen) 대(對) 트립신의 존재에서 해리), 이용된 해리 시약의 부피, 그리고 해리 시간), 그리고 세척 단계가 포함되었다. 글루타민 농도는 배양 배지에 대한 용량 범위에 있었다. 또한, 각 계대배양에서 세포의 생존율이 측정되었다. 수동 개입이 증가되고, 그리고 세포는 면밀히 관찰되고 모니터링되었다. 이러한 정보는 원하는 성질을 유지하는 최종 세포주를 확인 및 선별하는데 도움이 되었다. 일관된 성장, 일관되고 (즉, 변하지 않는 형태) 적절한 부착성, 그리고 기능적 반응을 나타내는 최종 세포주 및 백업 세포주가 선별되었다.
단계 17 - 세포 은행의 확립
최종 세포주 및 백업 세포주에 상응하는 낮은 계대배양 동결 평판 (상기 참조)은 37℃에서 해동되고, DMEM/10% FBS로 2회 세척되고, 가습된 37℃/5% CO2 조건에서 배양되었다. 이들 세포는 이후, 2-3주 동안 증식되었다. 25-50개의 바이알로 이루어진 각각의 최종 및 백업 세포주에 대한 세포 은행이 확립되었다. 세포는 추가의 최적화 실험에서 유래하는, 50% DMEM/10% FBS, 40% FBS, 그리고 10% DMSO에서 저온보존되었다.
단계 18 - 세포 은행의 조사
해동되고, 증식되고, 재-동결된 세포주의 동결 스톡을 비롯한 세포 은행으로부터 하나 이상의 바이알이 해동되고 배양 동안 증식되었다. 생성된 세포는 이들 세포가 그들이 처음 선별되었던 특성과 동일한 특성을 충족하는지를 확인하기 위하여 조사되었다.
실시예 27. 고유 쓴맛 수용체 기능에 대한 세포주 특성화
쓴맛 수용체-발현 HEK293 세포의 리간드-유도된 반응성을 확인하고 측정하기 위하여, 수용체 활성화가 세포내 칼슘 수준에서 수용체-유발된 변경을 측정함으로써 모니터링되었다. 세포는 검고 깨끗한 바닥 평판에서 표준 성장 배지에서 하룻밤동안 성장되거나, 또는 분석 완충액 (10 mM HEPES, 130 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 5 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 10 mM 글루코오스, pH 7.4)에서 현탁액으로서 검고 깨끗한 바닥 평판에 첨가되었다. 이들 세포는 완충액에서 세척-없음 칼슘-민감성 형광 염료 칼슘-3 (Molecular Devices Corp.)과 함께, 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 세포 평판 및 검사 화합물 (0.01 μM - 100 mM)은 고처리량 형광 평판 판독기 (Hamamatsu FDSS)에 배치되고, 이는 상기 장치에 의해 검사 화합물이 이들 세포에 첨가되기 이전에, 첨가되는 동안, 그리고 첨가된 이후에 평판 형광의 영상을 수집하였다. 영상의 소프트웨어 (Hamamatsu FDSS) 분석에서, 세포 평판에서 각 웰에 대한 상대적인 형광에서 변화가 보고되었다.
다양한 화합물과 추출물 (이들 중에서 상당수가 쓴맛을 나타내는 것으로 보고됨)이 활성을 측정하고 탈고아 (deorphaning)를 유도하기 위하여, 대조 세포뿐만 아니라 25종의 쓴맛 수용체 세포주 전체에서 분석되었다.
실시예 28: 일시적으로 형질감염된 고유 및 태그표식된 수용체 사이에 기능적 차이
고유 및 태그표식된 수용체의 일시적인 형질감염, 그 이후에 분석은 고유 및 태그표식된 수용체 사이에 기능적 차이의 분석을 가능하게 하였다. 실례로써, 기능 분석은 생쥐 Gα15 단백질 및 고유 T2R16 쓴맛 수용체 또는 생쥐 로돕신 유전자로부터 N-말단 태그를 보유하는 동일한 수용체의 일시적인 형질감염후 48시간 시점에, 인간 배아 신장 (HEK) 293T 세포에서 수행되었다. 이들 세포는 완충액 (10 mM HEPES, 130 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 5 mM KCL, 1.2 mM MgCl2, 10 mM 글루코오스, pH 7.4)에서 세척-없음 칼슘-민감성 형광 염료 칼슘-3 (Molecular Devices Corp.)과 함께, 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 쓴맛 수용체 활성에 대한 분석 반응은 Hamamatsu FDSS 형광 평판 판독기에서 측정되고, 이는 상기 장치에 의해 일정한 농도 범위 (0.01 μM - 100 μM)의 쓴맛 추출물이 첨가되기 이전에, 첨가되는 동안, 그리고 첨가된 이후에 평판 형광의 영상을 수집하였다. FDDS 소프트웨어는 영상을 분석하고 세포 평판에서 각 웰에 대한 상대적인 형광에서 변화를 보고하였다.
그 결과는 도 13에 플롯팅되었다. 도 13에서 확인되는 바와 같이, 쓴맛 추출물은 로돕신 태그-포함 수용체보다 고유 쓴맛 수용체를 더욱 크게 선별적으로 활성화시켰다. 이러한 결과는 고유 및 태그표식된 인간 쓴맛 수용체가 상이한 기능적 활성을 보인다는 것을 지시하고, 그리고 적절한 수용체 지정과 탈고아 (deorphaning)를 위한 발현되는 고유 단백질 및 생리학적으로 적절한 세포 기초된 분석의 중요성을 강조하였다.
실시예 29: 쓴맛 수용체의 기능적 클론의 산출의 높은 성공률
성공률 (분리된 전체 클론에서 기능적으로 활성 수용체를 발현하는 클론의 수)은 안정적인 세포주를 산출하는 효율을 결정하는데 중요한 파라미터이다. 실시예 26에서 기술된 방법을 이용하여 분리된 클론의 기능 분석이 수행되고, 그리고 분리된 클론 중에서 80% 이상이 기능적으로 활성인 것으로 밝혀졌다.
실례로써, 특정한 인간 쓴맛 수용체 T2R41의 발현을 위하여 분리된 개별 클론 세포주는 96-웰 평판의 개별 웰에서 배양되고, 그리고 각 웰에서 생존 세포의 존재는 초기 칼슘-민감성 염료 적하 측정에 의해 확인되었다. 염료 적하가 없거나 낮은 웰은 공백 (blank)으로 간주되고 도 14에서 검은색으로 표시되었다. 세포는 이후, 쓴맛 추출물의 첨가에 대한 기능적 쓴맛 수용체 반응에 대하여 조사되고, 수용체-매개된 칼슘 동원에 의해 판독되고, 그리고 염료 형광에서 변화에 의해 모니터링되었다. 세포를 포함하지만 최초 형광보다 신호에서 2-배 이하의 증가를 보이는 웰은 음성으로 간주되었고 도 14에서 흰색으로 표시되고, 반면 2-배 이상 증가된 신호를 갖는 웰은 회색으로 표시된다. 이러한 평판에서, 상기 쓴맛 수용체 유전자의 발현을 위하여 분리된 64개의 클론 중에서, 57개의 클론 (89%)이 유의미한 기능적 쓴맛 수용체 반응을 보였다.
실시예 30: 쓴맛 수용체 반응의 기능적 실시간 영상법
동질성 (homogeneity)은 안정적인 세포주를 산출하는데 중요한 다른 파라미터이다. 약물 선별만으로 발견된 것들과 비교하여, 실시예 26에서 기술된 방법을 이용하여 분리된 세포의 동질성을 결정하기 위하여 쓴맛 수용체 반응의 기능적 실시간 영상법이 이용되었다. 쓴맛 수용체 및 G 단백질을 발현하는 세포는 분석에 앞서 24시간 시점에, 96-웰 폴리-D-리신 코팅된 검고 깨끗한 평판 (Becton Dickinson)에 도말되었다. 세포는 분석 완충액 (130 NaCl, 2mM CaCl, 1.2mM MgCl, 5mM KCl, 10mM 글루코오스, 10mM HEPES, pH 7.4)에 희석된 칼슘-민감성 형광 염료가 적하되었다. 세포는 1시간 동안 배양되고, 이후 쓴맛 수용체의 공지된 활성제가 적절한 농도로 이용되었다. 세포의 칼슘 유동 반응은 적절한 필터가 달린 AxioVert 200 EPI-형광 현미경 (Zeiss)을 이용하여 3분 동안 기록되었다. 데이터는 MetaMorph6.3r7 소프트웨어 (Molecular Devices)를 이용하여 분석되었다.
동질성 쓴맛 수용체 반응은 쓴맛 수용체 활성화에 기인하는 세포내 유리 칼슘에서 증가에 의해 지시되는 바와 같이, 분리된 클론 세포주에서 검출되었다 (도 15, 위쪽 사진). 약물 선별된 세포의 유사하게 처리된 배양액에서, 분석 반응에서 상당한 이질성 (heterogeneity)이 동일한 활성제의 적용 이후에 관찰되었다 (도 15, 아래쪽 사진). 이러한 결과는 본 발명의 쓴맛 수용체-발현 세포주를 산출하는 방법 (즉, 실시예 26)이 유전적으로 및 기능적으로 일관되는 세포 개체군을 선별할 수 있다는 것을 증명하였다.
실시예 31: 쓴맛 수용체-발현 세포주에서 기능적 반응의 균일성
쓴맛 수용체가 G 단백질 결합된 수용체 (GPCR)이기 때문에, 다양한 화합물의 존재에서 상이한 쓴맛 수용체 사이에 쓴맛 반응의 의미 있는 비교를 달성하기 위하여, G 단백질 결합 수용체가 상이한 세포주에서 균일하게 기능하는 지를 결정하는 것이 중요하다. G 단백질 결합 작동약의 농도 범위 전역에서 상이한 세포주의 상대적인 반응은 균일해야 한다. 이를 확증하기 위하여, 세포 내에서 내생적으로 발현된 β-아드레날린성 수용체의 작동약인 가변 농도의 이소프로테레놀을 이용한 용량 반응 곡선 실험에서, 상이한 인간 쓴맛 수용체 및 생쥐 Gα15 단백질을 발현하는 25개 세포주 모두의 Gα15-매개된 수용체 반응에서 균일성이 조사되었다. 이러한 내생적 수용체는 자극될 때, 발현된 Gα15에 결합하고 세포내 유리 칼슘에서 변화를 유발할 수 있다. 반응 백분은 이소프로테레놀 농도의 함수로서 플롯팅되고, 그리고 그 결과는 EC50 값 (반-극대 수용체 활성화의 농도)을 계산하기 위하여 곡선-피팅 (curve-fitting)되었다 (도 16 참조). 25개의 구별된 클론 쓴맛 세포주 모두를 비교하면, EC50 값은 공개된 문헌에서 보고된 값과 거의 일치하는 4.9 ± 0.41 nM인 것으로 밝혀졌고, 그리고 세포주 간에 현저하게 적은 편차를 보였다.
실시예 32: 기능적으로 반응성인 폭넓게 조율된, 중간 정도로 조율된, 그리고 선별적인 수용체의 확인
본 발명의 방법 (즉, 실시예 26)을 이용하여 산출된 고유 인간 쓴맛 수용체 유전자를 안정적으로 발현하는 세포주는 화학적으로 다양한 화합물의 수집물에 의해 그들의 활성화를 검출하는 기능적 세포-기초된 수용체 연구에서 조사되었다. 상응하는 인간 쓴맛 수용체의 용량-의존성 활성화를 유도하는 물질 1-12는 도 17에서, 그들이 활성화시키는 것으로 밝혀진 수용체와 나란히 열거된다. 이는 폭넓게 조율된 수용체, 덜 폭넓게 조율된 수용체, 그리고 좁게 조율된 수용체의 확인을 가능하게 하였다.
실시예 33: 화합물의 라이브러리에 의해 활성화된 수용체의 확인
25개의 인간 쓴맛 수용체 세포주 각각에 대한 화합물의 라이브러리의 활성이 조사되었다. 데이터는 이들 화합물의 첨가 시에 수용체 활성에 대한 기능적 세포-기초된 분석에서 산출되고, 그리고 수용체의 기초 활성 (즉, 완충액 단독의 첨가 시에 수용체 활성)을 초과하는 활성 비율로서 표시되었다. 이후, 각 수용체에서 각 화합물의 활성이 암호화되어 각 수용체에서 낮은 (기초 활성보다 <100%; 흰색), 중간 (기초 활성보다 101-500%; 밝은 회색), 높은 (기초 활성보다 501-1000%; 어두운 회색), 또는 매우 높은 (기초 활성보다 >1001%, 검은색) 활성을 갖는 화합물이 강조되었다 (도 18). 결과의 패턴은 쓴맛 수용체 전역에서 선별적으로 또는 폭넓게 활성인 화합물 (행), 그리고 화학적으로 다양한 화합물 세트에 폭넓은 또는 선별적 반응을 보이는 수용체 (열)의 그래프적 표현을 제공한다.
실시예 34: 작동약-유도된 쓴맛 수용체 활성의 길항약으로서 유사한 기능적 활성을 갖는 화합물 유사체의 확인
유사한 기능적 활성을 갖는 화합물 유사체를 확인하는 쓴맛 수용체-발현 세포-기초된 분석법의 능력을 조사하기 위하여, 공지된 쓴맛 차단 화합물의 21개 구조 유사체가 쓴맛 수용체의 작동약-유도된 수용체 활성을 저해하는 능력에 대하여 조사된다. 작동약에 의해 유도된 쓴맛 수용체의 활성을 저해하는 구조 유사체가 비교된다. 따라서 쓴맛 수용체-발현 세포주는 강력한 쓴맛 수용체 길항약의 발견을 보조할 수 있다.
실시예 35: 고유 세포주 및 태그표식된 세포주를 이용한 상이한 수용체 지정
실시예 28에 기술된 일시적인 형질감염 이후에 기능 분석은 고유 및 태그표식된 인간 쓴맛 수용체가 상이한 기능적 활성을 갖는다는 것을 증명하였다. 이는 또한, 태그표식된 쓴맛 수용체를 발현하는 세포주와 비교하여 고유 쓴맛 수용체를 발현하는 세포주를 이용하여 확증되었다. 간단히 말하면, 사카린에 대한 쓴맛 수용체 지정은 고유 쓴맛 수용체를 발현하는 안정적인 세포주로 칼슘 동원을 측정하는 기능적 세포-기초된 수용체 분석을 이용하여 달성되었다. 사카린에 대한 쓴맛 수용체 지정은 또한, GTP 가수분해에 대한 막 분획물-기초된 세포 유리 분석에서, N-말단 생쥐 로돕신 태그 서열을 보유하는 곤충-생산된 재조합 수용체 단백질을 이용하여 Pronin et al., "Identification of Ligands for Two Human Bitter T2R Receptors," Chem. Senses, 29:583-593 (2004)에서 기술된 바와 같이 달성되었다. 이들 상이한 지정은 도 19에 도시된다. 동일한 쓴맛 화합물에 대한 쓴맛 수용체 지정 사이에 불일치는 생리학적으로 적절한 기능적 지정을 위한 고유 쓴맛 수용체에 대한 필수적인 요구를 명백하게 확인시켰다.
실시예 36. 안정적인 단맛 수용체-발현 세포주의 산출
형질감염
HEK293T (ATCC CRL-11268)는 3개의 별개의 플라스미드로 공동-형질감염되었는데, 하나는 T1R2 (서열 번호 31)를 인코딩하고, 하나는 T1R3 (서열 번호 32)을 인코딩하고, 그리고 나머지 하나는 신호전달 분자 (생쥐 Gα15, 서열 번호 33)를 인코딩하였다. 비록 본 발명의 방법에서 약물 선별이 선택 사항이긴 하지만, 플라스미드 마다 하나의 약물 내성 마커가 포함되었다. 이들 서열은 CMV 프로모터의 제어 하에 있었다. 신호전달 프로브에 의한 검출을 위한 태그를 인코딩하는 비번역 서열 역시 약물 내성 마커를 인코딩하는 서열과 함께 존재하였다. 이용된 표적 서열은 표적 서열 1 (서열 번호 28; 서열 번호 123의 태그 서열을 이용), 표적 서열 2 (서열 번호 29; 서열 번호 124의 태그 서열을 이용) 및 표적 서열 3 (서열 번호 30; 서열 번호 125의 태그 서열을 이용)이었다. 이들 실례에서, T1R2 유전자 벡터는 표적 서열 3을 포함하고, T1R3 유전자 벡터는 표적 서열 1을 포함하고, 그리고 Gα15 유전자 벡터는 표적 서열 2를 포함하였다. 이들 세포는 약물을 포함하는 배지에서 10-14일 동안 전통적으로 선별되었다.
형광 프로브에 세포의 노출
선별된 세포는 수확되고 신호전달 프로브 (서열 번호 38-40)로 형질감염되었다. 신호전달 프로브 1은 표적 서열 1에 결합하고, 신호전달 프로브 2는 표적 서열 2에 결합하고, 그리고 신호전달 프로브 3은 표적 서열 3에 결합한다. 이후, 이들 세포는 해리되고, 분석을 위하여 수집되고, 형광 활성화된 세포 분류기 (Beckman Coulter, Miami, FL)를 이용하여 분류되었다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 선택된 호스트 세포와 함께 이용하기 적합한 임의의 시약이 적절한 최적화로, 핵산, 예를 들면, 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, 또는 표지된 올리고뉴클레오티드를 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있는 시약의 실례에는 Lipofectamine, LIPOFECTAMINE 2000, Oligofectamine, TFX 시약, Fugene 6, DOTAP/DOPE, Metafectine, 또는 Fecturin이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
신호전달 프로브 1
5' - Cy5 GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ3 소광기 -3' (SEQ ID NO: 38)
신호전달 프로브 2
5'- Cy5.5 GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGC BHQ3 소광기 -3' (SEQ ID NO: 39)
신호전달 프로브 3
5'- Fam GCGAGAGCGACAAGCAGACCCTATAGAACCTCGC BHQ1 소광기 -3' (SEQ ID NO: 40)
표적 서열이 굵게 표시된 태그 서열 1 (단맛)
AGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGAGGCAGGTGGACAGGAAGGTTCTAATGTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGACATCTGGGCCCGGAAAGCCTTTTTCTCTGTGATCCGGTACAGTCCTTCTGC(서열 번호 123)
표적 서열이 굵게 표시된 태그 서열 2 (단맛)
AGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTCGAGGCAGGTGGACAGCTTGGTTCTAATGAAGTTAACCCTGTCGTTCTGCGACATCTGGGCCCGGAAAGCGTTTAACTGATGGATGGAACAGTCCTTCTGC(서열 번호 124)
표적 서열이 굵게 표시된 태그 서열 3 (단맛)
AAGGGCGAATTCGGATCCGCGGCCGCCTTAAGCTCGAGGCAGGTGGACAGGAAGGTTCTAATGTTCTATAGGGTCTGCTTGTCGCTCATCTGGGCCCGGAGATG(서열 번호 125)
다른 표적 서열 및 신호전달 프로브가 이용될 수 있다 (가령, 2005년 9월 1일 공개된 International Patent Application Publication No. WO2005/079462 (Application No. PCT/US05/005080)에서 기술된 바와 같이). 가령, BHQ3은 프로브 1 또는 프로브 2에서 BHQ1 또는 금 입자로 치환될 수 있다. BHQ1이 프로브 3에서 BHQ2 또는 Dabcyl로 치환될 수 있다는 점에 주의한다. Cy5와 유사한 스펙트럼 특성을 갖는 Quasar Dye (BioSearch)를 이용한 유사한 프로브가 일정한 실험에 이용되었다. 또한, 일부 경우에 DNA 프로브 대신에 5-MedC와 2-아미노 dA 혼합기 프로브가 이용될 수 있다는 점에 주의한다.
양성 세포의 분리
배경을 초과하여 형광을 발하는 세포를 게이팅 (gating)하고, 그리고 규정된 게이트 내에 속하는 세포를 96-웰 평판으로 직접적으로 분리하기 위하여 표준 분석 방법이 이용되었다. 웰마다 단일 세포가 배치되도록 세포 분류가 실시되었다. 선별후, 이들 세포는 약물이 없는 배지에서 증식되었다.
기능적 형질전환
단맛 수용체 세포 (상기와 같이 선별되고 증식됨)는 예로써, 낮은-글루코오스 DMEM 배지를 비롯한 다양한 성장 조건에서, 또는 10% 혈청을 포함하거나 혈청이 없는 글루코오스-없는 Leibovitz L-15 배지에서 동일한 세포와 상이한 세포의 분취량 둘 모두를 이용하여 유지되었다. 일부 세포는 다양한 농도의 다른 당, 예를 들면, 갈락토오스를 포함하는 배지에서 유지되었다. 이후, 복합 조건 하에 유지된 단맛 수용체 세포주의 세포는 단맛 리간드에 적절하게 반응하고 다른 자극 (MSG)에 반응하지 않는 능력에 대하여 특성화되었다.
이론에 한정됨 없이, 다양한 배지 조건에서 성장은 예로써, 유전자 발현 수준에서 변화, 게놈 조직 및 세포 표면에서 수용체의 기능적 발현으로 인하여, 세포를 기능적으로 형질전환시킬 수 있다. 평가되고 세포의 기능 분석 반응에 영향을 주는 것으로 밝혀진 다양한 배지에서 파라미터에는 혈청 농도 (즉, 낮은 혈청 농도 및 혈청 상실), 당 상실 및 분석 평판 코팅 (가령, 폴리 D 리신 및 라미닌)이 포함된다. 이들 결과는 단맛 수용체 세포주의 세포의 특징이 이들 세포가 상이한 배지 조건에서 유지될 때 달라질 수 있음을 증명하였다. 이들 결과는 또한, 형광 프로브에 의해 선별된 상이한 세포가 동일한 성장 조건 하에 상이한 특징을 가질 수 있음을 증명한다. 형광 프로브에 의해 선별되는 세포의 특성화의 한 가지 실례는 도 20에 도시된다. 도 20에서 확인되는 바와 같이, 상이한 조건 (1, 2 및 최종)에서 성장된 동일한 세포의 분취량은 감칠맛 (MSG) 및 단맛 (프럭토오스) 리간드에 매우 상이하게 반응하였다. 조건 1에서 성장된 세포는 혈청 상실된, 낮은 글루코오스 배지에 도말되었다. 조건 2에서 성장된 세포는 10% 혈청을 포함하는 낮은 글루코오스 배지에서 하룻밤동안 도말되고, 이후 분석에 앞서 혈청-상실된 배지로 전환되었다. 조건 1 또는 2에서 성장된 세포는 코팅된 평판 (Corning #3665)에 도말되었다. "최종" 조건은 코팅된 평판 (Corning #3300) 상에서, 그리고 혈청 상실된 낮은 글루코오스 배지에서 고밀도 성장을 포함한다. 조건 1 및 조건 2에서 성장된 세포는 단맛 작동약보다 감칠맛 작동약에 더욱 강하게 반응한다. 대조적으로, "최종" 성장 조건에서 성장된 세포는 프럭토오스에 강하게 반응하지만 MSG에 반응하지 않는다. 따라서 이들 세포는 생리학적으로 및 약리학적으로 관련된 단맛 수용체를 생산하였다.
실시예 37: 고유 단맛 수용체 기능에 대한 세포주의 특성화
1. 유전자 발현의 확인과 정량
qRT-PCR을 이용하여, 상기 세포 ("최종")에서 발현되는 각각의 단맛 수용체 아단위의 상대적인 양 (RNA)이 측정되었다. 전체 RNA는 상업적으로 가용한 RNA 정제 키트 (RNeasy Mini Kit,Qiagen)를 이용하여 1-3x106개 포유동물 세포로부터 정제되었다. RNA 추출물은 이후, 엄격한 DNase 처리 프로토콜 (TURBO DNA-없는 키트; Ambion)을 이용하여 처리되었다. 제1 가닥 cDNA 합성은 1 ㎍ DNA-없는 전체 RNA 및 250 ng 랜덤 프라이머 (Invitrogen)와 함께, 20 ㎕ 반응 부피에서 역전사효소 키트 (SuperScript III, Invitrogen)를 이용하여 수행되었다. 이러한 반응의 음성 대조에는 cDNA 합성 단계 동안 역전사효소 또는 RNA가 존재하지 않는 시료가 포함되었다. cDNA 및 PCR 산물 합성은 다음의 조건에서 유전자 증폭기 (Mastercycler, Eppendorf)에서 수행되었다: 25℃에서 5분, 50℃에서 60분; 반응 종결은 70℃에서 15분간 수행되었다.
유전자 발현 (RNA) 분석을 위하여, T1R2, T1R3 및 생쥐 Gα15 cDNA (MGB TaqMan 프로브, Applied Biosystems)에 대한 프로브가 이용되었다. 시료 표준화 대조, GAPDH의 경우에, Pre-Developed TaqMaN 분석 시약 (Applied Biosystems)이 이용되었다. 음성 대조 및 양성 대조 (플라스미드 DNA)를 비롯한 반응물은 50 ㎕ 반응 부피에서 40 ng의 cDNA를 이용하여 삼중으로 셋업되었다. 발현되는 각각의 단맛 수용체 아단위의 상대적인 양 (RNA)이 측정되었다. 도 21의 그래프에서는 그 결과를 도시하고 3개의 핵산 모두 단맛 수용체 세포에서 발현된다는 (RNA) 것을 지시한다. T1R2, T1R3 및 Gα15의 발현 수준은 대조 세포에서 관찰되는 수준보다 각각, 대략 100,000x, 10x, 그리고 100,000x 높았다.
앞서 기술된 프로토콜에 따라서 산출된 단맛 수용체 세포 ("최종")의 1개월과 9개월 배양액에서 T1R2, T1R3 및 Gα15 유전자 발현 (RNA)을 평가하기 위하여 표준 단일 종점 RT-PCR 절차가 이용되었다. 세포는 24-웰 평판 형태에서 80% 포화도로 성장되고, 수확되고, 그리고 상업적으로 가용한 RNA 준비 키트 (RNAqueous kit, Ambion)를 이용하여 RNA가 분리되었다. 5pg 내지 5 ㎍ 범위의 정제된 전체 RNA가 올리고 (dT) 12,18 프라이머와 함께, 상업적 제1 가닥 cDNA 합성 키트 (Superscript III kit, Invitrogen)의 프로토콜에 따라서, 역전사를 수행하는데 이용되었다. 제1 가닥 합성 이후에, 생쥐 Gα15 핵산뿐만 아니라 단맛 수용체 핵산의 아단위 (T1R2, T1R3)에 특이적인 올리고 세트가 PCR 반응 혼합물 (HotStart Taq)에서 독립적으로 조립되었다. 45회 사이클 PCR 이후에, 앰플리콘 시료는 아가로즈 겔 전기영동에 의해 더욱 분석되었다.
이들 단일-종점 RT-PCR 실험으로부터 결과는 도 22에 예시된다. 도 22에서는 이들 RT-PCR 실험에 이용된 아가로즈 겔의 대표적인 사진을 도시한다. 모든 단맛 수용체 인코딩 핵산의 강한 발현 (RNA)이 1개월과 9개월 배양액 둘 모두에서 검출되었는데, 이는 "최종" 조건 하에 성장된 본 발명의 세포주에 대한 안정성의 이례적인 수준을 증명하였다.
2. 조절제에 대한 세포-기초된 분석
본 발명의 세포는 분석에 앞서 48시간 시점에, 10 cm 접시에서 높은 밀도에서 성장 배지 (낮은 글루코오스 DMEM 또는 L15 배지, 상기 배지는 혈청 및 표준 성장 첨가제로 보충됨)에 접종된다. 세포는 배양 매트릭스 (culture matrix)로부터 해리되고 분석에 앞서 24시간 시점에, 96 웰 평판에 접종된다. 이후, 배지 제거, 그 이후에 단맛 분석 완충액 (130mM NaCl, 1.1mM KH2PO4, 1.3mM CaCl, 20mM HEPES 및 3mM NaHPO4*7H20)에 희석된 칼슘-민감성 형광 염료 (칼슘-3, Molecular Devices Corp.)의 첨가가 수행된다. 세포는 상기 배지에서 1시간 동안 배양된다. 평판은 이후, 고처리량 평판 판독기 (Hamamatsu FDSS) 상에 적하된다. 검사 화합물 (즉, 프럭토오스 (Sigma), 수크로오스 (Sigma), 글루코오스 (Sigma), 아세설팜 K (Fluka), Na-사카린 (Sigma), Na-사이클라메이트 (Aldrich), 스테비아 (Steviva Brands Inc.), 나한과 (Slim Sweet, Trimedica), 그리고 소르비톨 (Sigma))은 단맛 분석 완충액에 희석되고 각 웰에 첨가된다. 칼슘 유동은 90초 동안 검출된다. 앞서 기술된 바와 같이 완충액에서 희석된 활성제가 10 μM 내지 100 mM 범위의 최종 농도로 각 웰에 첨가되고, 그리고 상대적인 형광에서 변화가 추가로 90초 동안 기록된다.
3. 단맛 세포-기초된 분석에서 Z'와 EC 50 값의 측정
이들 단맛 수용체-발현 세포에서 단맛 수용체 반응의 유효성을 조사하기 위하여, 확립된 단맛 수용체 작동약 프럭토오스가 앞서 기술된 분석에서 검사 화합물로서 이용된다. 프럭토오스는 75mM의 농도로 검사 웰 (홀수 칼럼)에 첨가되고, 그리고 대조 웰 (짝수 칼럼)은 완충액 단독이 제공된다. 이들 최종 분석 조건에서, 형광 평판 판독기 (FLIPR3 작동 시스템, Molecular Devices)에 의해 측정되는 칼슘 유동 치수가 보고된다. 한 가지 수회 반복된 분석에서, 이들 세포는 0.8의 Z' 값을 갖는다. 도 23 (한 가지 예시적인 분석)을 참조한다. 이러한 Z' 값은 산출된 단맛 수용체-발현 세포가 세포-기초된 분석에서 프럭토오스를 인식하고, 그리고 이들 분석이 이들 세포를 이용하여 신뢰성 있게 및 강건하게 실시될 수 있다는 것을 지시한다.
본 발명의 단맛 수용체-발현 세포주에서 단맛 수용체 반응의 민감도를 조사하기 위하여, 증가하는 용량의 다양한 단맛 수용체 작동약을 세포에 첨가하고 앞서 기술된 바와 같이 반응을 측정함으로써 일련의 용량 반응 실험이 실시되었다. 한 가지 분석 (도 24)에서, 이들 조사된 화합물에 대한 EC50 값은 아래와 같은 것으로 밝혀졌다: 사카린의 경우에 1.5 mM 이하, 수크로오스의 경우에 3.5 mM 이하, 프럭토오스의 경우에 4.3 mM 이하, 그리고 글루코오스의 경우에 34.1 mM 이하. 이들 결과는 본 발명의 세포주에서 생산된 단맛 수용체가 본 발명의 단맛 수용체-발현 세포주에서 다수의 확립된 단맛 수용체 리간드에 강한 민감도를 나타낸다는 것을 지시한다.
이러한 분석에서, 단맛 수용체-발현 세포가 상이한 감미료에 노출될 때, 칼슘 유동 반응 곡선이 서로 다른 것으로 밝혀졌다. 도 25에서 예증된 바와 같이, 상이한 리간드에 대한 이들 세포의 반응의 길이와 강도가 변화하였다. 가령, 스테비아는 조사된 많은 다른 감미료보다 더욱 길고 강한 반응을 보였다. 이들 결과는 본 발명의 세포와 세포주가 스테비아와 같은 일정한 고강도 감미료에서 관찰되는 단맛의 원치 않는 지속인 단맛 지체 (sweet lingering)에 대한 분석에 유용하다는 것을 암시한다.
실시예 38. 적어도 하나의 단맛 수용체 아단위를 내생적으로 발현하는 안정적인 세포주의 산출과 분리
신호전달 프로브의 설계
T1R2 또는 T1R3 게놈 좌위에 상응하는 서열에 지향되는 신호전달 프로브가 설계되었다. 이들 신호전달 프로브는 표 23에 기술된 바와 같이 코딩 엑손, 비-코딩 인트론 또는 비-코딩 비번역 서열에 지향되었다.
신호전달 프로브 S21, S22, S23, R2-3U1 및 R2-I1은 5' 말단에서 Cy5.5 형광 라벨 및 3'말단에서 BHQ2 소광제를 포함한다. 신호전달 프로브 S31, S32, S33, R3-3U1 및 R3-I31은 5' 말단에서 6-FAM 형광단을 포함하고 3' 말단에서 BHQ1을 포함한다. 신호전달 프로브는 또한, 다른 형광단 또는 소광제를 포함할 수 있다. 신호전달 프로브는 합성되고, 그들의 개별 라벨에 접합되고, 그리고 Genelink (Hawthorne, NY)에서 정제되었다.
Figure pct00110
Figure pct00111
도 26과 27에서는 T1R2와 T1R3 게놈 좌위 및 인트론-엑손 코딩 구조의 그래프적 표현을 도시한다. 다른 표적 서열 및 신호전달 프로브가 이용될 수 있다 (가령, 2005년 9월 1일 공개된 International Patent Application Publication No. WO2005/079462 (Application No. PCT/US05/005080)에서 기술된 바와 같이). 가령, BHQ1이 프로브 3에서 BHQ2 또는 Dabcyl로 치환될 수 있다. 또한, 일부 경우에 DNA 프로브 대신에 5-MedC와 2-아미노 dA 혼합기 프로브가 이용될 수 있다는 점에 주의한다.
형광 프로브에 세포의 노출
HEK 293T (ATCC CRL-11268), HuTu (ATCC HTB-40) 또는 H716 (ATCC CCL-251) 세포는 별개의 실험에서 아래의 신호전달 프로브 조합 중의 하나로 형질감염되었다: a) S21과 S31, b) S21과 S32, c) S21과 S33, d) S22와 S31, e) S22와 S32, f) S22와 S33, g) S23과 S31, h) S23과 S32, i) S23과 S33, j) R2-3U1과 R3-3U1, k) R2-3U1과 R3-I31, l) R2-I1과 R3-3U1, 그리고 m) R2-I1과 R3-I31. HEK 293T 세포는 10% 소 태아 혈청 (FBS) (Sigma #SAC1203C), 2mM L-글루타민 (Sigma G7513) 및 10mM HEPES (Sigma H0887)를 포함하는 둘베코 변형 이글 배지 (Sigma #D5796)에 유지되고, HuTu 세포는 10% FBS (Sigma #2442), 2mM L-글루타민 (Sigma #G7513) 및 1mM 나트륨 피루베이트 (Sigma #S8636)를 포함하는 이글 최소 필수 배지 (Eagle's Minimal Essential Media) (Sigma #D5650)에 유지되고, 그리고 H716 세포는 10% FBS (Sigma #F2442)를 포함하는 Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco #11875-093)에 유지되었다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 선택된 호스트 세포와 함께 이용하기 적합한 임의의 시약이 적절한 최적화로, 핵산, 예를 들면, 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, 또는 표지된 올리고뉴클레오티드를 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있는 시약의 실례에는 Lipofectamine, LIPOFECTAMINE 2000, Oligofectamine, TFX 시약, Fugene 6, DOTAP/DOPE, Metafectine, 또는 Fecturin이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
상이한 실험에서, HEK 293T 세포, HuTu 세포 및 H716 세포는 하기에 기술된 바와 같이 형광 프로브의 도입에 앞서, 무작위 돌연변이유발 또는 유전자-활성화를 유도하기 위하여 돌연변이유발성 처리 (가령, UV 광)와 함께 또는 이러한 처리 없이 처리되었다. 세포는 혈청 없는 배지에서 1.25 x 106개 세포/㎖로 재현탁되고, 그리고 주로 254 nm 파장을 방출하는 살균 전구 (germicidal bulb) (Sylvania)로부터 1 Joule/m2/s를 전달하기 위하여 UV 방사에 15분 동안 노출되었다. 다른 돌연변이유발성 처리 (가령, 돌연변이원, 예를 들면, 에틸 메탄 설포네이트 (ethyl methane sulfonate, EMS)에 노출에 의한 화학적 돌연변이유발) 역시 이용될 수 있다. 세포는 최종 농도 (가령, 200 ㎍/㎖)의 에틸 메탄설포네이트 (EMS; Sigma)와 함께 배양될 수 있고, 그리고 EMS가 결핍되는 배지로 이동에 앞서 배양될 수 있다.
이들 세포는 이후, 신호전달 프로브에 노출되고, 해리되고, 그리고 형광 활성화된 세포 분류기 (Beckman Coulter, Miami, FL)를 이용한 실험을 위하여 수집되었다.
양성 세포의 분리
유세포분석 분야에서 표준 관례에 따른 당업자에게 익숙한 표준 분석 방법이 양성 형광발광 세포를 게이팅하거나 선별하는데 이용되었다. 형광 활성화된 세포 분류는 규정된 게이트에 속하는, 또는 원하는 형광을 갖는 양성 형광발광 세포를 96-웰 평판 내로 직접적으로 분리하는데 이용되었다. 세포 분류 파라미터는 웰당 단지 하나의 세포만 분리되도록 설정되었다. 적어도 하나의 신호전달 프로브에 대한 상이한 절대적 또는 상대적 형광 수준과 연관된 형질감염된 세포는 전체 개체군에 비하여 최대 신호 강도를 갖는 상위 1%의 세포를 게이팅함으로써 분리되었다.
별개의 실험에서, 적어도 하나의 신호전달 프로브에 대한 상이한 절대적 또는 상대적 형광 수준과 연관된 형질감염된 세포는 전체 개체군에 비하여 최대 신호 강도를 갖는 상위 0.1%의 세포를 게이팅함으로써 분리되었다.
개별 세포는 분리되고 하기에 기술된 바와 같이 배지에 유지되었다. 각 세포 유형에 대하여, 동등한 비율의 개별 조건 및 새로운 배지가 이용을 위하여 결합되었다. 조건 배지는 2일 동안 개별 새로운 배지에서 각 세포 유형을 배양하고, 수확하고, 이후 상기 배지를 여과함으로써 제조되었다. 개별적으로 분리된 HEK 293T 세포는 분리되고, 그리고 10% FBS (Sigma #SAC1203C), 2mM L-글루타민 (Sigma G7513), 10mM HEPES (Sigma H0887) 및 1 내지 50 희석도의 페니실린/스트렙토마이신 용액 (최종 농도 100 단위 페니실린/100 ㎍ 스트렙토마이신/㎖) (Sigma # P4458)을 포함하는 둘베코 변형 이글 배지 (Sigma #D5796)에 유지되었다. 개별적으로 분리된 HuTu 세포는 분리되고, 그리고 10% FBS (Sigma #2442), 2mM L-글루타민 (Sigma #G7513), 1mM 나트륨 피루베이트 (Sigma #S8636) 및 1 내지 50 희석도의 페니실린/스트렙토마이신 용액 (최종 농도 100 단위 페니실린/100 ㎍ 스트렙토마이신/㎖) (Sigma # P4458)을 포함하는 이글 최소 필수 배지 (Sigma #D5650)에 유지되었다. 개별적으로 분리된 H716 세포는 분리되고, 그리고 10% FBS (Sigma #F2442) 및 1 내지 50 희석도의 페니실린/스트렙토마이신 용액 (최종 농도 100 단위 페니실린/100 ㎍ 스트렙토마이신/㎖) (Sigma # P4458)을 포함하는 Roswell Park Memorial Institute 1640 배지 (Gibco #11875-093)에서 유지되었다.
분리되고 96 웰 조직 배양 평판에 유지된 세포를 계대배양하기 위하여 로봇식 세포 배양 방법이 이용되었다. 특히, 다양한 자동화 세포 배양 과제 (가령, 배지 제거, 배지 대체, 시약 첨가, 세포 세척, 세척액 제거, 분산제 첨가, 배양 용기로부터 세포 이전, 배양 용기에 세포 첨가 등)를 수행하기 위하여 MICROLAB STAR™ 장치가 이용되었다. 수동 방법을 비롯한 다른 세포 배양 방법 역시 이용될 수 있다. 세포는 이후, 10 cm 조직 배양 접시 내로 증식되고, 그리고 표준 수동 조직 배양 기술 (가령, 배지 제거, 세포 세척, 배지 첨가)을 이용하여 배양되었다.
분리된 세포는 개별적으로 분리된 세포로부터 유래된 세포 개체군을 산출하기 위하여 배양 동안 증식되었다. 개별적으로 분리된 세포는 하기에 기술된 바와 같이, 그들을 개별 배지에서 배양함으로써 증식되었다. HEK 293T 세포는 10% FBS (Sigma #SAC1203C), 2mM L-글루타민 (Sigma G7513) 및 10mM HEPES (Sigma H0887)를 포함하는 둘베코 변형 이글 배지 (Sigma #D5796)에서 유지를 위하여 이동되고, HuTu 세포는 10% FBS (Sigma #2442), 2mM L-글루타민 (Sigma #G7513) 및 1mM 나트륨 피루베이트 (Sigma #S8636)를 포함하는 이글 최소 필수 배지 (Sigma #D5650)에서 유지를 위하여 이동되었다. H716 세포는 10% FBS (Sigma #F2442)를 포함하는 Roswell Park Memorial Institute 1640 배지 (Gibco #11875-093)에서 유지를 위하여 이동되었다.
기능적 검사
단일 분리된 세포의 증식에 기인하는 각각의 세포 개체군은 이후, 기능적 세포-기초된 분석을 이용하여, 단맛 리간드에 반응하는 그들의 능력에 대하여 특성화되었다. 15mM 프럭토오스가 이들 실험에 이용되었다. 세포 유형에 따라서, 하기에 기술된 바와 같은 상이한 조건이 이용되었다.
분석에 앞서 48시간 시점에, 세포는 10 cm 접시에서 12 내지 20 백만 개 세포의 높은 밀도로, 10% 혈청 (Sigma #SAC1203C), 4mM L-글루타민 (Sigma G7513), 10mM HEPES (Sigma H0887), 그리고 1 내지 50 희석도의 페니실린/스트렙토마이신 용액 (최종 농도 100 단위 페니실린/100 ㎍ 스트렙토마이신/㎖) (Sigma # P4458)로 보충된 성장 배지 (L15 배지 (Sigma #L5520)에 접종되었다. 세포는 배양 매트릭스 (culture matrix)로부터 해리되고, 그리고 분석에 앞서 24시간 시점에, 384 웰 평판에서 웰당 35,000개 세포로 접종되었다. 배지는 18 내지 24시간후 제거되었다. 이후, 단맛 분석 완충액 (130mM NaCl, 1.1mM KH2PO4, 1.3mM CaCl, 20mM HEPES 및 3mM NaHPO4*7H20)에서 희석된 칼슘-민감성 형광 염료 (Fluo-4, Invitrogen)가 각 웰에 첨가되었다. 세포는 상기 배지에서 1시간 동안 배양되었다. 그 다음, 평판은 고처리량 평판 판독기 (Hamamatsu FDSS)에 적하되었다. DMSO를 포함하는 단맛 분석 완충액이 0.2% DMSO의 최종 농도를 위하여 각 웰에 첨가되었다. 칼슘 유동 또는 분석 반응은 15mM 프럭토오스의 최종 농도를 위한, 프럭토오스 포함 단맛 분석 완충액의 각 웰에 첨가 이전에, 첨가 동안 및 첨가 이후에 검출되었다. 상기 분석은 선택적으로, 칼슘-민감성 형광 염료의 소광제로 수행될 수 있다. 이런 소광제는 당분야에 널리 공지되어 있고, 그리고 여기에는 예로써, 디피크릴아민 (DPA), Acid Violet 17 (AV17), Diazine Black (DB), HLB30818, 트립판 블루, Bromophenol Blue, HLB30701, HLB30702, HLB30703, Nitrazine Yellow, Nitro Red, DABCYL (Molecular Probes), QSY (Molecular Probes), 금속 이온 소광제 (가령, Co2+, Ni2+, Cu2+), 그리고 요오드 이온이 포함된다.
대안으로, 세포는 배양 매트릭스로부터 해리되고, 그리고 분석에 앞서 24 또는 48시간 동안, 384 웰 평판에서 10% FBS (Sigma #2442), 2mM L-글루타민 (Sigma #G7513) 및 1mM 나트륨 피루베이트 (Sigma #S8636)를 포함하는 이글 최소 필수 배지 (Sigma #D5650) 또는 상기 배지와 L-15 배지 (Sigma, L5520)의 동등 분율의 혼합물에서 웰당 2,500 내지 20,000개의 세포 밀도로 접종되었다. 18 내지 52시간후, 배지가 제거되었다. 이후, 단맛 분석 완충액 (130mM NaCl, 1.1mM KH2PO4, 1.3mM CaCl, 20mM HEPES 및 3mM NaHPO4*7H20)에서 희석된 칼슘-민감성 형광 염료 (Fluo-4, Invitrogen)가 각 웰에 첨가되었다. 세포는 상기 배지에서 1시간 동안 배양되었다. 그 다음, 평판은 고처리량 평판 판독기 (Hamamatsu FDSS)에 적하되었다. DMSO를 포함하는 단맛 분석 완충액이 0.2% DMSO의 최종 농도를 위하여 각 웰에 첨가되었다. 칼슘 유동 또는 분석 반응은 15mM 프럭토오스의 최종 농도를 위한, 프럭토오스 포함 단맛 분석 완충액의 각 웰에 첨가 이전에, 첨가 동안 및 첨가 이후에 검출되었다.
대안으로, 세포는 펠릿으로 만들어지고, 그리고 단맛 분석 완충액 (130mM NaCl, 1.1mM KH2PO4, 1.3mM CaCl, 20mM HEPES 및 3mM NaHPO4*7H20)에 희석된 칼슘-민감성 형광 염료 (Fluo-4, Invitrogen)에서 재현탁되었다. 세포는 384 웰 평판에 도말되고 상기 배지에서 1시간 동안 배양되었다. 그 다음, 평판은 고처리량 평판 판독기 (Hamamatsu FDSS)에 적하되었다. DMSO를 포함하는 단맛 분석 완충액이 0.2% DMSO의 최종 농도를 위하여 각 웰에 첨가되었다. 칼슘 유동 또는 분석 반응은 15mM 프럭토오스의 최종 농도를 위한, 프럭토오스 포함 단맛 분석 완충액의 각 웰에 첨가 이전에, 첨가 동안 및 첨가 이후에 검출되었다.
고강도 천연 및 인공 감미료, 그리고 천연 및 인공 감미료를 비롯한 다른 단맛 리간드, 예를 들면, 수크로오스 (Sigma), 글루코오스 (Sigma), 아세설팜 K (Fluka), Na-사카린 (Sigma), Na-사이클라메이트 (Aldrich), 스테비아 (스테비아 Brands Inc.), 나한과 (Slim Sweet, Trimedica), 그리고 소르비톨 (Sigma) 역시 이용될 수 있다. 이에 더하여, 공지된 또는 내재된 맛이 없는 화합물뿐만 아니라 쓴맛, 감칠맛, 기름진 맛, 시원한 맛, 뜨거운 맛 및 쓴맛 리간드 또는 미각촉진제를 비롯한 다른 미각 리간드가 단맛 반응의 선택성 (selectivity)과 특이성 (specificity)을 결정하는데 이용될 수 있다. 이에 더하여, 임의의 미각촉진제 또는 리간드가 증진제 또는 차단제, 예를 들면, 단맛 증진제 레바우디오시드-C RP44 (RedPoint Bio) 및 수크랄로스 증진제 S2383 (Senomyx), 그리고 수크로오스 증진제 S5742 (Senomyx)를 비롯한 추가적인 화합물의 존재에서 조사될 수 있다.
이에 더하여, 다른 배지 및 배양 단계가 이용될 수 있고, 그리고 기타 평판 형태, 예를 들면, 96 웰 평판 및 1536 웰 평판이 이용될 수 있다. 개별적으로 분리된 세포로부터 배양되고 자연적으로 및/또는 유전자-활성화에 의해 단맛 수용체의 적어도 하나의 아단위를 발현하는 것으로 밝혀진 다수의 세포 개체군은 기능적 형광 칼슘 유동 리포터 분석에서 이들 세포의 반응 또는 활성화 동역학을 모니터링함으로써 프럭토오스에 대한 반응을 갖는 것으로 확인되었다 (도 28 참조). 도 28A에서는 프럭토오스에 반응하는 HuTu 세포를 도시한다. 도 28B에서는 프럭토오스에 반응하는 H716 세포를 도시한다. 도 28C에서는 프럭토오스에 반응하는 293T 세포를 도시한다.
고처리량 스크리닝
단맛 작동약 및/또는 조절제는 상기 방법에 따라서 도말된 세포에 대한 화합물의 효과를 조사하는 고처리량 스크리닝 (HTS)을 이용함으로써 확인될 수 있다. 단맛 분석 완충액이 자연 또는 합성 화합물 라이브러리, 또는 추출물 또는 추출 분획물 중에서 한 가지 이상의 성분 또는 화합물과 함께, 또는 이들 없이 각 웰에 첨가된다. 5% 이하의 DMSO (가령, 0.2%)의 최종 농도를 위한 화합물 또는 추출물 용해화를 보조하기 위하여, DMSO 또는 다른 유기 용매, 예를 들면, 에탄올 역시 포함된다. 칼슘 유동은 일정한 시간 (가령, 90초) 동안 검출된다. 이후, 단맛 분석 완충액에 희석된 프럭토오스, 또는 다른 단맛 리간드가 최종 활성화 농도 (가령, 15mM)를 위하여 각 웰에 첨가된다. 상대적 형광에서 변화는 추가의 시간 (가령, 90초) 동안 기록된다. 다수의 대조 화합물 역시 조사될 것이다.
이러한 검사는 화합물 라이브러리 중에서 일부 또는 전부가 스크리닝될 때까지 반복된다. 획득된 데이터는 활성 화합물을 확인하기 위하여 분석된다. 차단제, 강화제, 증진제 또는 알로스테릭한 조절제를 비롯한 작동약과 조절제는 이런 저런 분석 프로토콜을 이용하여 확인된다. 상이한 단맛 리간드를 이용한 화합물의 검사는 단맛 수용체의 반응을 단맛 리간드 중에서 단지 하나, 전부 또는 일부, 예를 들면, 선별적 또는 범-활성적 화합물로 조정하는 화합물을 확인하는데 이용된다. 이는 동일한 화합물 또는 화합물 라이브러리의 독립된 고처리량 스크리닝에 의해, 하지만 각 스크린에서 하나 이상의 상이한 단맛 리간드를 이용하여 수행된다.
반응 곡선의 시간적 동역학 (가령, 감쇠 또는 크기 또는 반응의 정도)을 조사함으로써, 다른 정성적 및 정량적 효과를 갖는 조절 화합물이 확인된다.
미각 검사
단맛 세포 기초된 분석을 이용하여 확인된 화합물은 당해 분야에서 표준 관례에 따른 당업자에게 익숙한 인간 감각 검사에서 조사된다. 화합물은 그들의 내재성 미각 특징 (가령, 단맛, 쓴맛, 감칠맛, 짠맛, 신맛, 시원한맛 또는 매운맛 및 오프-테이스트 (off-taste)), 그리고 인지될 수 있는 다른 성질 또는 특성, 예를 들면, 입맛 (mouthfeel), 마비 (numbing), 통증 (pain), 자극 (irritation) 및 따끔거림 (tingle)에 대하여 조사된다. 검사는 액체, 반-고체, 고체, 분말, 정제, 겔, 검 (gum), 스프레이, 용해가능 스트립, 식품 또는 음료 산물 제제 (formulation)를 비롯한 하나 이상의 상이한 형태 또는 기반에서 수행된다. 화합물을 포함하거나 포함하지 않는 시료는 상기 화합물의 감각 특성을 검출하기 위하여 평가된다. 상이한 용량의 화합물이 조사될 수 있다. 일정한 실험에서, 화합물은 풍미를 갖는 다른 화합물 또는 성분을 부가적으로 포함하는 시료에서 조사되고, 그리고 이런 풍미의 지각의 변화, 변경, 증진, 강화 또는 저해가 평가된다. 상기 화합물은 알코올, 예를 들면, 에탄올, DMSO 또는 기타 용매를 비롯하여, 이를 용해화시키도록 설계된 작용제의 존재에서 제공될 수 있다. 이들 시료는 실온에서 가열되거나, 냉각되거나, 또는 조사될 수 있다. 화합물은 또한, 단맛 또는 다른 미각을 증진 또는 차단하는 능력에 대하여 조사된다. 감각 검사는 임의의 향기-관련된 효과를 확인하기 위하여, 코-클립 (nose-clip)과 함께, 또는 코-클립 없이 실시된다. 미각 검사는 인간 노출을 제한하기 위하여 낮은 농도의 화합물이 이용되는 "헹굼과 뱉기 (sip and spit)" 양식을 이용하여 실시된다. 화합물은 하나 이상의 단맛 리간드와 감미료의 지각에 대한 그들의 효과를 결정하기 위하여 시식된다. 이들 화합물에 노출되거나, 또는 이들 화합물을 평가하는 인간 또는 동물 개체는 생체내 활성의 패턴을 화합물과 상관시키는 기능적 뇌 영상법 (functional brain imaging) 또는 기타 영상 검사 (가령, 자기 공명 영상)를 이용하여 조사될 수 있다.
실시예 39. 안정적인 후각 수용체-발현 세포주의 산출
단계 1 - 형질감염
293T 세포는 2개의 별개의 플라스미드로 공동-형질감염되는데, 하나는 인간 후각 수용체 (서열 번호 134-135 중의 한 가지)를 인코딩하고, 그리고 다른 하나는 인간 Gα15 신호전달 단백질 (서열 번호 133)을 인코딩한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 선택된 호스트 세포와 함께 이용하기 적합한 임의의 시약이 적절한 최적화로, 핵산, 예를 들면, 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, 또는 표지된 올리고뉴클레오티드를 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있는 시약의 실례에는 Lipofectamine, LIPOFECTAMINE 2000, Oligofectamine, TFX 시약, Fugene 6, DOTAP/DOPE, Metafectine, 또는 Fecturin이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 비록 약물 선별이 본 발명의 방법에서 선택 사항이긴 하지만, 플라스미드 마다 하나의 포유동물 약물 내성 마커가 포함되었다. 이용된 이들 플라스미드는 후각 수용체 유전자 또는 Gα15 유전자의 발현을 위하여 CMV 프로모터를 포함한다. 신호전달 프로브에 의한 검출을 위한 표적 서열을 포함하는 태그를 인코딩하는 비번역 서열 역시 각 플라스미드 내에 존재하고, 따라서 상기 태그는 후각 수용체 또는 Gα15 전사체와 공동-전사되고 융합되었다. 태그는 신호전달 프로브에 혼성화될 수 있는 표적 서열을 포함한다. 이용된 표적 서열은 표적 서열 1 (서열 번호 129) 및 표적 서열 2 (서열 번호 130)이고, 그리고 이용된 태그 서열은 태그 서열 1 (서열 번호 136) 및 태그 서열 2 (서열 번호 137)이었다. 이들 실례에서, 후각 유전자-인코딩 플라스미드는 표적 서열 1을 포함하고, 그리고 Gα15 유전자-인코딩 플라스미드는 표적 서열 2를 포함한다.
단계 2 - 선별 단계
형질감염된 세포는 소 태아 혈청 (FBS)을 포함하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 1-4일 동안 성장되고, 그 이후에 항생제-포함 DMEM-FBS에서 2주 동안 성장되었다. 이러한 항생제 포함 기간 동안, 아래와 같은 항생제가 배지에 첨가되었다: 퓨로마이신 (0.3 ㎍/㎖) 및 하이그로마이신 (110 ㎍/㎖), 퓨로마이신 (0.15 ㎍/㎖) 및 하이그로마이신 (75 ㎍/㎖), 그리고 퓨로마이신 (0.05 ㎍/㎖) 및 하이그로마이신 (18 ㎍/㎖).
단계 3 - 세포 계대배양
항생제 선별에 의한 농축 이후에, 그리고 형광 신호전달 프로브의 도입에 앞서, 세포는 안정적이지 않은 발현이 진정될 수 있는 시간을 허용하기 위하여 항생제 선별의 부재에서 3 내지 15회 (p3-p15) 이상 계대배양되었다.
단계 4 - 형광 신호전달 프로브에 세포의 노출
세포는 수확되고 신호전달 프로브 (서열 번호 131과 132)로 형질감염되었다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 선택된 호스트 세포와 함께 이용하기 적합한 임의의 시약이 적절한 최적화로, 핵산, 예를 들면, 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, 또는 표지된 올리고뉴클레오티드를 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있는 시약의 실례에는 Lipofectamine, LIPOFECTAMINE 2000, Oligofectamine, TFX 시약, Fugene 6, DOTAP/DOPE, Metafectine, 또는 Fecturin이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
신호전달 프로브에 의해 검출되는 표적 서열
표적 서열 1
5'-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3' (서열 번호 129)
표적 서열이 굵게 표시된 태그 서열 1 (후각)
5'-AGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGAG GCAGGTGGACAGGAAGGTTCTAATGTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGACATCTGGGCCCGGAAAGCCTTTTTCTCTGTGATCCGGTACAGTCCTTCTGC-3' (서열 번호 136)
표적 서열 2
5'-GAAGTTAACCCTGTCgttctgcgac-3' (서열 번호 130)
표적 서열이 굵게 표시된 태그 서열 2 (후각)
5'-AGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGTAC CAAGCTTCGAGGCAGGTGGACAGCTTGGTTCTAATGAAGTTAACCCTGTCGTTCTGCGACATCTGGGCCCGGAAAGCGTTTAACTGATGGATGGAACAGTCCTTCTGC-3' (서열 번호 137)
신호전달 프로브
이들 신호전달 프로브는 100 μM 스톡으로 제공되었다.
신호전달 프로브 1 - 표적 1에 결합한다
5' - Quasar670 GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ2 소광기 -3' (서열 번호 131)
신호전달 프로브 2 - 표적 2에 결합한다
5'- Cy5.5 GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGC BHQ2 소광기 -3' (서열 번호 132)
또한, 일부 경우에 DNA 프로브 대신에 5-MedC와 2-아미노 dA 혼합기 프로브가 이용되었다는 점에 주의한다.
일부 실험에서, 뒤섞인 비-표적화 6-Fam 프로브가 전달 대조로서 이용되었다 (제시되지 않음).
단계 5 - 양성 세포의 분리
이들 세포는 해리되고, 그리고 분석 및 형광 활성화된 세포 분류기 (Beckman Coulter, Miami, FL)를 이용한 분류를 위하여 수집되었다. 배경을 초과하여 형광을 발하는 세포를 게이팅 (gating)하고, 그리고 게이트 내에 속하는 개별 세포를 바코드 부착된 96-웰 평판으로 분리하기 위하여 표준 분석 방법이 이용되었다. 게이팅 체계 (gating hierarchy)는 아래와 같았다: 일치 게이트 (coincidence gate) > 싱글렛 게이트 (singlets gate) > 라이브 게이트 (live gate) > 분류 게이트 (Sort gate). 이러한 게이팅 전략으로, 이중 양성 세포의 상위 0.1-2%는 바코드 부착된 96-웰 평판으로 분류되는 것으로 표기되었다.
단계 6 - 단계 2-5 및/또는 3-5의 추가 사이클
실험은 매우 엄격하게 시한된 상세 계획으로 수행되었다. 이러한 프로토콜의 일부로서, 중복 분류 (redundant sort)를 완결하고 추가 클론을 획득하기 위하여 단계 2-5 또는 3-5의 2회 완전 사이클이 실시되었다.
단계 7 - 세포 개체군에 대한 성장 속도의 평가
이들 평판은 Hamilton Microlabstar 자동화 액체 조작기 (automated liquid handler)로 이동되었다. 세포는 100 단위/㎖ 페니실린 + 0.1 ㎎/㎖ 스트렙토마이신으로 보충된, 2-3일 조건 성장 배지 : 새로운 성장 배지 (DMEM/10% FBS)의 1:1 혼합물에서 최대 20일 동안 배양되었다. 평판은 분류후 7일과 30일 사이에, 웰 (Genetix)의 포화도를 결정하기 위하여 이미지화되었다. 각 평판은 평판 전역에서 신뢰성 있는 영상 획득을 위하여 집중되었다. 70% 이상의 보고된 포화도는 신뢰되지 않았다. 포화도 측정은 상기 특정된 기간 동안 3회 실시되고 성장 속도를 계산하는데 이용되었다.
단계 8: 성장 속도 평가치에 따른 세포 개체군 비닝
세포는 분류후 대략 20 내지 30일 시점에 성장 속도에 따라 비닝 (binning) (독립적으로 분류되고 코호트 (cohort)로서 도말됨) 되었다. 빈 (bin)은 독립적으로 수집되고 하류 취급을 위한 개별 96 웰 평판에 도말되고, 그리고 특정 빈 마다 하나 이상의 표적 평판이 존재할 수 있었다. 빈 (bin)은 성장 속도의 전개를 고려하고 높은 비율, 적어도 대략 30 내지 90% (평가치로서)의 세포 개체군 총수를 포괄하는 범위를 일괄함으로써 계산되었다. 9개의 성장 빈이 이용되었는데, 상이한 후각 수용체 세포주 전역에서 이들 빈의 평균 간격이 대략 15-40시간이었다. 이런 이유로, 각각의 빈은 대략 1 내지 5시간의 성장 속도 또는 개체군 배가시간 차이에 상응하였다.
세포는 배가 시간이 1일 이하 내지 2주 이상일 수 있다 - 동시에 성장 속도에 따라서 합리적으로 비닝될 수 있는 가장 다양한 클론을 처리하기 위하여, 빈 (bin)당 배가 시간이 0.25 내지 0.7일인 3-9개의 빈을 이용하는 것이 바람직하다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 빈의 치밀성 및 빈의 수는 특정 상황에 맞게 조정될 수 있고, 그리고 빈의 치밀성 및 수는 세포가 그들의 세포 주기에 대해 동기화되면 추가로 조정될 수 있다. 이러한 실례에서, 15 내지 40시간의 배가 시간을 갖는 세포주가 이들 빈의 치밀성을 증가시키기 위한 비닝에서 선별되었다.
단계 9: 병렬 처리를 진척시키고 엄격한 품질 관리를 제공하는 복제 평판법 (replica plating)
이들 평판은 항생제 (100 단위/㎖ 페니실린 + 0.1㎎/㎖ 스트렙토마이신)를 포함하는 DMEM 배지/10% FBS에서 표준화되고 고정된 조건 (가습된 37℃, 5% CO2/95% 공기) 하에 배양되었다. 이들 세포 평판은 표적 평판의 4개 세트 (이러한 세트는 모든 성장 빈과 함께, 모든 평판으로 구성된다 - 이들 단계는 최초 세트의 4개 복제물이 존재하도록 담보한다)를 생산하기 위하여 분할되었다. 최대 3개의 표적 평판 세트는 저온 보존 (cryopreservation)되고 (하기 참조), 그리고 나머지 세트는 스케일에 따라 분류되고 계대배양 및 기능 분석 실험을 위하여 더욱 복제 도말되었다. 각각의 평판 세트에 대하여 별개의 독립된 조직 배양 시약, 배양기, 인력 및 이산화탄소 공급원이 이용되었다. 모든 조직 배양 시약의 적절한 생산과 품질을 담보하기 위한 품질 관리 단계가 실시되었다: 이용을 위하여 준비된 배지의 각 병에 첨가된 각 성분은 두 번째 지정된 사람이 실수가 없도록 모니터링하는 동안, 지정된 후드에서 지정된 사람에 의해 상기 후드 내에서 단지 그 시약만을 이용하여 첨가되었다. 액체 취급 조건은 벽을 통한 교차 오염이 제거되도록 설정되었다. 모든 단계를 위해 새로운 팁이 이용되거나, 또는 엄격한 팁 세척 프로토콜이 이용되었다. 정확한 부피 전달, 효과적인 세포 조작, 세척 사이클, 피펫팅 속도와 위치, 세포 분산을 위한 피펫팅 사이클의 횟수, 그리고 평판에 대한 팁의 상대적 위치에 대한 액체 취급 조건이 설정되었다.
단계 10 - 세포 개체군의 조기 계대배양 스톡의 동결
2개의 평판 세트가 -70℃ 내지 -80℃에서 동결되었다. 각 세트의 평판은 먼저 70 내지 100%의 세포 포화도 (confluency)가 달성되도록 허용되었다. 배지가 흡인되고, 그리고 배양 배지 또는 90% FBS 및 10% DMSO가 첨가되었다. 이들 평판은 파라필름으로 밀봉되고, 1 내지 5 cm 발포체로 개별적으로 둘러싸이고, 이후 -80℃ 냉동장치 내로 넣어졌다.
단계 11 - 안정적인 세포주를 생산하기 위한 초기 형질전환 단계를 위한 방법 및 조건
남아있는 2개의 평판 세트는 단계 9에서 앞서 기술된 바와 같이 유지되었다. 모든 세포 분할 (splitting)은 배지 제거, 세포 세척, 트립신 첨가와 배양, 소광 및 세포 분산 단계를 비롯한 액체 취급 단계를 이용하여 실시되었다.
단계 12 - 재배열된 평판에서 세포의 기능성 조사
모든 세포 개체군에 대한 세포 및 배양 조건의 일관성 및 표준화가 제어되었다. 성장 속도에서 약간의 차이로 인한 평판 전역에서 차이는 평판 전역에서 세포 수의 표준화에 의해 제어되고, 그리고 재배열 (rearry)후 매 2 내지 8회 계대배양 시점에서 발생하였다. 범위를 벗어나는 세포 개체군은 검출되고 제거되었다.
단계 13 - 세포 개체군의 특성화
클론은 분류후 3.5 내지 6주 시점에 스크리닝 (screening)되고, 그리고 상위 클론은 기능적으로 재조사되고 분류후 5 내지 6주 시점에 확인되었다. 세포는 이들 조건 하에서 그들의 시험관내 진화가 일어나도록 하기 위하여 최대 6주 동안 유지되었다. 이 기간 동안, 크기, 형태, 취성, 트립신처리에 대한 반응 또는 해리, 해리후 둥글기/평균 원형도, 생존율(%), 미세포화도 (microconfluency) 경향, 또는 세포 유지의 다른 측면, 예를 들면, 배양 평판 표면에 부착성이 관찰되었다.
단계 14 - 세포 개체군의 잠재적 기능성 평가
세포 개체군은 기능적 기준을 이용하여 조사되었다. 칼슘 동원 염료 Fluo-4 (Invitrogen)는 제조업체의 지시에 따라 이용되었다. h-OR을 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포주는 10% 소 태아 혈청과 글루타민으로 보충된 DMEM 배지에서 표준 세포 배양 조건 하에 유지되었다. 분석 전날, 세포는 스톡 평판으로부터 수확되고 검고 깨끗한 바닥 384 웰 분석 평판으로 도말되었다. 이들 분석 평판은 37℃ 세포 배양 배양기에서 5% CO2 하에 22 내지 48시간 동안 유지되었다. 이후, 분석 평판으로부터 배지가 제거되고, 그리고 완충액 (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM 글루코오스, pH 7.0)에서 희석된 칼슘 동원 염료 (Fluo-4, Invitrogen, Carlsbad, CA)가 첨가되고 소광제로서 Trypan Ultra Blue (ABD Bioquest, CA)와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양되고, 그리고 상기 완충액 (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM 글루코오스, pH 7.0)에서 희석되었다. 상기 확인된 소광제는 당분야에서 널리 공지된 소광제, 예를 들면, 디피크릴아민 (DPA), Acid Violet 17 (AV17), Diazine Black (DB), HLB30818, Bromophenol Blue, HLB30701, HLB30702, HLB30703, Nitrazine Yellow, Nitro Red, DABCYL (Molecular Probes), QSY (Molecular Probes), 금속 이온 소광제 (가령, Co2+, Ni2+, Cu2+), 그리고 요오드 이온 (Iodide ion)으로 대체될 수 있다. 이들 분석 평판은 이후, 형광 평판 판독기 (Hamamatsu FDSS)에 적하되고, 그리고 상기 완충액 (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM 글루코오스, pH 7.0)에서 희석된 작동약 (OR3A1의 경우에 4.5 mM 헬리오날 (Helional) 및 OR1D2의 경우에 0.3 mM 부르지오날 (Bourgeonal) - 도 29A, 29B)이 첨가되었다. 세포는 384 웰 평판에서 여러 다른 밀도로 조사되고, 그리고 반응이 분석되었다. 도말후 다양한 시점, 예를 들면, 도말후 12-48 시간이 이용되었다. 또한, 분석 반응 차이에 대하여 다른 도말 밀도가 조사되었다.
도 29A에서는 대조로서 DMSO 운반제 배경 신호와 비교하여 헬리오날 (Helional) (4.5 mM의 최종 농도로)에 대한, 인간 후각 수용체 OR3A1을 발현하는 세포의 기능적 세포-기초된 반응의 대표적인 궤적을 도시한다. 검사와 대조 궤적은 덮어씌워진다. 형광 칼슘 신호전달 염료를 이용하여 칼슘 유동을 보고하도록 설계된 세포-기초된 분석의 도 29A에 제공된 결과는 이들 세포가 배경을 초과하여 헬리오날 (Helional)에 대한 반응을 나타낸다는 것을 증명한다.
도 29B에서는 대조로서 DMSO 운반제 배경 신호와 비교하여 부르지오날 (Bourgeonal) (0.3 mM의 최종 농도로)에 대한, 인간 후각 수용체 OR1D2를 발현하는 세포의 기능적 세포-기초된 반응의 대표적인 궤적을 도시한다. 검사와 대조 궤적은 덮어씌워진다. 형광 칼슘 신호전달 염료를 이용하여 칼슘 유동을 보고하도록 설계된 세포-기초된 분석의 도 29B에 제공된 결과는 이들 세포가 배경을 초과하여 부르지오날 (Bourgeonal)에 대한 반응을 나타낸다는 것을 증명한다.
분류후 6 내지 40주 범위의 지정된 기간 동안 가장 일관된 반응을 보이는 세포를 확인하기 위하여, 낮은 및 더욱 높은 계대배양 횟수에서 실시된 실험으로부터 기능적 반응이 비교된다. 시간의 흐름 동안 변하는 세포의 다른 특징, 예를 들면, 해리후 세포가 재부착하는데 걸리는 시간 역시 주목된다.
단계 16 - 세포의 추가적인 평가
기능적 및 다른 기준을 충족하는 세포 개체군은 생존가능하고, 안정하며 기능적인 세포주를 생산하기에 가장 적합한 것을 결정하기 위해서 추가로 평가된다. 선별된 세포 개체군은 거대 조직 배양 용기에서 증식되고, 그리고 앞서 기술된 특성화 단계가 이들 조건하에서 지속되거나 반복된다. 이 시점에서, 일관되고 신뢰성 있는 계대배양을 위해서 추가의 표준화 단계가 도입된다. 이들에는 상이한 도말 세포 밀도, 평판 코팅, 계대배양 시간, 배양 접시 크기/형태 및 코팅, 유체공학 최적화, 세포 해리 최적화 (가령, 세포 해리 완충액 (Invitrogen) 대(對) 트립신의 존재에서 해리), 이용된 해리 시약의 부피, 그리고 해리 시간), 그리고 세척 단계가 포함된다. 글루타민 농도는 배양 배지에 대한 용량 범위에 있다. 또한, 각 계대배양에서 세포의 생존율이 측정된다. 수동 개입이 증가되고, 그리고 세포는 면밀히 관찰되고 모니터링된다. 이러한 정보는 원하는 성질을 유지하는 최종 세포주를 확인 및 선별하는데 도움이 된다. 일관된 성장, 일관되고 (즉, 변하지 않는 형태) 적절한 부착성, 그리고 기능적 반응을 나타내는 최종 세포주 및 백업 세포주가 선별된다.
단계 17 - 세포 은행의 확립
최종 세포주 및 백업 세포주에 상응하는 낮은 계대배양 동결 평판 (상기 참조)은 37℃에서 해동되고, DMEM/10% FBS로 2회 세척되고, 가습된 37℃/5% CO2 조건에서 배양된다. 이들 세포는 이후, 2-3주 동안 증식된다. 25-50개의 바이알로 이루어진 각각의 최종 및 백업 세포주에 대한 세포 은행이 확립된다. 세포는 추가의 최적화 실험에서 유래하는, 50% DMEM/10% FBS, 40% FBS, 그리고 10% DMSO에서 저온보존된다.
단계 18 - 세포 은행의 조사
해동되고, 증식되고, 재-동결된 세포주의 동결 스톡을 비롯한 세포 은행으로부터 하나 이상의 바이알이 해동되고 배양 동안 증식된다. 생성된 세포는 이들 세포가 그들이 처음 선별되었던 특성과 동일한 특성을 충족하는지를 확인하기 위하여 조사된다.
실시예 40. 고유 후각 수용체 기능에 대한 세포주 특성화
후각 수용체-발현 HEK293 세포의 리간드-유도된 반응성을 확인하고 측정하기 위하여, 수용체 활성화가 세포내 칼슘 수준에서 수용체-유발된 변경을 측정함으로써 모니터링된다. 세포는 검고 깨끗한 바닥 평판에서 표준 성장 배지에서 하룻밤동안 성장되거나, 또는 분석 완충액 (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM 글루코오스, pH 7.0)에서 현탁액으로서 검고 깨끗한 바닥 평판에 첨가된다. 이들 세포는 Trypan Ultra Blue (ABD Bioquest, CA)를 소광제로서 포함하는 완충액에서 세척-없음 칼슘-민감성 형광 염료 Fluo-4 (Invitrogen)와 함께, 실온에서 1시간 동안 배양되고, 상기 완충액 (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM 글루코오스, pH 7.0)에서 희석된다. 상기 확인된 소광제는 당분야에서 널리 공지된 소광제, 예를 들면, 디피크릴아민 (DPA), Acid Violet 17 (AV17), Diazine Black (DB), HLB30818, Bromophenol Blue, HLB30701, HLB30702, HLB30703, Nitrazine Yellow, Nitro Red, DABCYL (Molecular Probes), QSY (Molecular Probes), 금속 이온 소광제 (가령, Co2+, Ni2+, Cu2+), 그리고 요오드 이온 (Iodide ion)으로 대체될 수 있다. 세포 평판 및 검사 화합물 (0.01 μM - 100 mM)은 고처리량 형광 평판 판독기 (Hamamatsu FDSS)에 배치되고, 이는 상기 장치에 의해 검사 화합물이 이들 세포에 첨가되기 이전에, 첨가되는 동안, 그리고 첨가된 이후에 평판 형광의 영상을 수집한다. 영상의 소프트웨어 (Hamamatsu FDSS) 분석에서, 세포 평판에서 각 웰에 대한 상대적인 형광에서 변화가 보고된다.
다양한 화합물과 추출물 (이들 중에서 상당수가 취기제로서 보고됨)이 활성을 측정하고 탈고아 (deorphaning)를 유도하기 위하여, 대조 세포뿐만 아니라 후각 수용체 세포주 전체에서 분석된다.
실시예 41: 후각 수용체-발현 세포주에서 기능적 반응의 균일성
후각 수용체가 G 단백질 결합된 수용체 (GPCR)이기 때문에, 다양한 화합물의 존재에서 상이한 후각 수용체 사이에 반응의 의미 있는 비교를 달성하기 위하여, G 단백질 결합 수용체가 상이한 세포주에서 균일하게 기능하는 지를 결정하는 것이 중요하다. G 단백질 결합 작동약의 농도 범위 전역에서 상이한 세포주의 상대적인 반응은 균일해야 한다. 이를 확증하기 위하여, 세포 내에서 내생적으로 발현된 β-아드레날린성 수용체의 작동약인 가변 농도의 이소프로테레놀을 이용한 용량 반응 곡선 실험에서, 상이한 후각 수용체 및 생쥐 Gα15 단백질을 발현하는 모든 세포주의 Gα15-매개된 수용체 반응에서 균일성이 조사된다. 이러한 내생적 수용체는 자극될 때, 발현된 Gα15에 결합하고 세포내 유리 칼슘에서 변화를 유발할 수 있다. 반응 백분은 이소프로테레놀 농도의 함수로서 플롯팅되고, 그리고 그 결과는 EC50 값 (반-극대 수용체 활성화의 농도)을 계산하기 위하여 곡선-적합 (curve-fit)된다.
실시예 42: 기능적으로 반응성인 폭넓게 조율된, 중간 정도로 조율된, 그리고 선별적인 수용체의 확인
본 발명의 방법 (즉, 실시예 39)을 이용하여 산출된 고유 인간 후각 수용체 유전자를 안정적으로 발현하는 세포주는 화학적으로 다양한 화합물의 수집물에 의해 그들의 활성화를 검출하는 기능적 세포-기초된 수용체 연구에서 조사된다. 이는 폭넓게 조율된 수용체, 덜 폭넓게 조율된 수용체, 그리고 좁게 조율된 수용체의 확인을 가능하게 한다.
실시예 43: 화합물의 라이브러리에 의해 활성화된 수용체의 확인
후각 수용체 세포주 각각에 대한 화합물의 라이브러리의 활성이 조사된다. 데이터는 이들 화합물의 첨가 시에 수용체 활성에 대한 기능적 세포-기초된 분석에서 산출되고, 그리고 수용체의 기초 활성 (즉, 완충액 단독의 첨가 시에 수용체 활성)을 초과하는 활성 비율로서 표시된다. 이후, 각 수용체에서 각 화합물의 활성이 암호화되어 각 수용체에서 낮은 (가령, 기초 활성보다 <100%; 흰색), 중간 (가령, 기초 활성보다 101-500%; 밝은 회색), 높은 (가령, 기초 활성보다 501-1000%; 어두운 회색), 또는 매우 높은 (가령, 기초 활성보다 >1001%, 검은색) 활성을 갖는 화합물이 강조된다. 결과의 패턴은 후각 수용체 전역에서 선별적으로 또는 폭넓게 활성인 화합물, 그리고 화학적으로 다양한 화합물 세트에 폭넓은 또는 선별적 반응을 보이는 수용체의 그래프적 표현을 제공하는데 이용된다. 상기 데이터의 분석은 목적되는 검사 화합물로 특정 후각 수용체 또는 후각 수용체 활성의 패턴을 지정하거나 확인하고, 그리고 차단제와 강화제를 비롯한 조절제를 확인하는데 이용된다. 이러한 데이터의 분석은 또한, 후각 수용체 활성의 패턴을 조사된 상응하는 취기제의 생리학적 효과와 상관시키는데 이용될 수 있다.
실시예 44: 작동약-유도된 후각 수용체 활성의 길항약으로서 유사한 기능적 활성을 갖는 화합물 유사체의 확인
유사한 기능적 활성을 갖는 화합물 유사체를 확인하는 후각 수용체-발현 세포-기초된 분석법의 능력을 조사하기 위하여, 공지된 조절제 또는 조절 화합물의 구조 유사체가 후각 수용체의 작동약-유도된 수용체 활성을 저해하는 능력에 대하여 조사된다. 작동약에 의해 유도된 후각 수용체의 활성을 저해하는 구조 유사체가 비교된다. 따라서 후각 수용체-발현 세포주는 강력한 후각 수용체 길항약의 발견을 보조할 수 있다. 상이한 활성 (가령, 강화, 항진, 차단 등)을 갖는 조절제는 또한, 이들 분석과 검사를 수행하고 당업자에게 공지된 바와 같이 분석 결과 분석을 실시함으로써 확인된다.
앞서 기술된 본 발명의 구체예는 단지 예시인 것으로 의도되고, 그리고 당업자는 단지 일과적인 실험을 이용하여, 본 명세서에서 기술된 특정 절차에 다수의 등가물을 인지하거나, 또는 확인할 수 있다. 이와 같은 등가물 모두 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주되고 아래의 청구범위에 의해 포함된다. 부가적으로, 당업자는 작업 순서가 설명과 청구의 목적으로 특정한 순서로 기술되긴 하지만, 본 발명에서 이런 특정한 순서를 뛰어넘어 다양한 변화가 계획된다는 것을 인지할 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 본 발명에 순전히 참조로서 편입되고, 그리고 각 개별 간행물, 또는 특허 또는 특허 출원 역시 동일한 정도로, 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시된다.
SEQUENCE LISTING <110> Shekdar, Kambiz Sawchuk, Dennis J. Shah, Purvi Manoj <120> NOVEL CELL LINES AND METHODS <130> 0022980025WO1 <140> <141> <150> 61/149,321 <151> 2009-02-02 <150> 61/149,318 <151> 2009-02-02 <150> 61/149,324 <151> 2009-02-02 <150> 61/149,311 <151> 2009-02-02 <150> 61/230,536 <151> 2009-07-31 <150> 61/235,181 <151> 2009-08-19 <160> 139 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1371 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human GABA-A receptor alpha 1 subunit cDNA <400> 1 atgaggaaaa gtccaggtct gtctgactgt ctttgggcct ggatcctcct tctgagcaca 60 ctgactggaa gaagctatgg acagccgtca ttacaagatg aacttaaaga caataccact 120 gtcttcacca ggattttgga cagactccta gatggttatg acaatcgcct gagaccagga 180 ttgggagagc gtgtaaccga agtgaagact gatatcttcg tcaccagttt cggacccgtt 240 tcagaccatg atatggaata tacaatagat gtatttttcc gtcaaagctg gaaggatgaa 300 aggttaaaat ttaaaggacc tatgacagtc ctccggttaa ataacctaat ggcaagtaaa 360 atctggactc cggacacatt tttccacaat ggaaagaagt cagtggccca caacatgacc 420 atgcccaaca aactcctgcg gatcacagag gatggcacct tgctgtacac 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ttgtggagcc ggaactatat 2460 gaggaagtta caatctactt cagtgacatt gtaggtttca ctactatctg caaatacagc 2520 acccccatgg aagtggtgga catgcttaat gacatctata agagttttga ccacattgtt 2580 gatcatcatg atgtctacaa ggtggaaacc atcggtgatg cgtacatggt ggctagtggt 2640 ttgcctaaga gaaatggcaa tcggcatgca atagacattg ccaagatggc cttggaaatc 2700 ctcagcttca tggggacctt tgagctggag catcttcctg gcctcccaat atggattcgc 2760 attggagttc actctggtcc ctgtgctgct ggagttgtgg gaatcaagat gcctcgttat 2820 tgtctatttg gagatacggt caacacagcc tctaggatgg aatccactgg cctccctttg 2880 agaattcacg tgagtggctc caccatagcc atcctgaaga gaactgagtg ccagttcctt 2940 tatgaagtga gaggagaaac atacttaaag ggaagaggaa atgagactac ctactggctg 3000 actgggatga aggaccagaa attcaacctg ccaacccctc ctactgtgga gaatcaacag 3060 cgtttgcaag cagaattttc agacatgatt gccaactctt tacagaaaag acaggcagca 3120 gggataagaa gccaaaaacc cagacgggta gccagctata aaaaaggcac tctggaatac 3180 ttgcagctga ataccacaga caaggagagc acctattttt aa 3222 <210> 16 <211> 4443 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <223> human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) <400> 16 atgcagaggt cgcctctgga aaaggccagc gttgtctcca aacttttttt cagctggacc 60 agaccaattt tgaggaaagg atacagacag cgcctggaat tgtcagacat ataccaaatc 120 ccttctgttg attctgctga caatctatct gaaaaattgg aaagagaatg ggatagagag 180 ctggcttcaa agaaaaatcc taaactcatt aatgcccttc ggcgatgttt tttctggaga 240 tttatgttct atggaatctt tttatattta ggggaagtca ccaaagcagt acagcctctc 300 ttactgggaa gaatcatagc ttcctatgac ccggataaca aggaggaacg ctctatcgcg 360 atttatctag gcataggctt atgccttctc tttattgtga ggacactgct cctacaccca 420 gccatttttg gccttcatca cattggaatg cagatgagaa tagctatgtt tagtttgatt 480 tataagaaga ctttaaagct gtcaagccgt gttctagata aaataagtat tggacaactt 540 gttagtctcc tttccaacaa cctgaacaaa tttgatgaag gacttgcatt ggcacatttc 600 gtgtggatcg ctcctttgca agtggcactc ctcatggggc taatctggga gttgttacag 660 gcgtctgcct tctgtggact tggtttcctg atagtccttg ccctttttca ggctgggcta 720 gggagaatga tgatgaagta cagagatcag agagctggga agatcagtga aagacttgtg 780 attacctcag aaatgattga 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actgagtgga ggtcaacgag caagaatttc tttagcaaga 1680 gcagtataca aagatgctga tttgtattta ttagactctc cttttggata cctagatgtt 1740 ttaacagaaa aagaaatatt tgaaagctgt gtctgtaaac tgatggctaa caaaactagg 1800 attttggtca cttctaaaat ggaacattta aagaaagctg acaaaatatt aattttgcat 1860 gaaggtagca gctattttta tgggacattt tcagaactcc aaaatctaca gccagacttt 1920 agctcaaaac tcatgggatg tgattctttc gaccaattta gtgcagaaag aagaaattca 1980 atcctaactg agaccttaca ccgtttctca ttagaaggag atgctcctgt ctcctggaca 2040 gaaacaaaaa aacaatcttt taaacagact ggagagtttg gggaaaaaag gaagaattct 2100 attctcaatc caatcaactc tatacgaaaa ttttccattg tgcaaaagac tcccttacaa 2160 atgaatggca tcgaagagga ttctgatgag cctttagaga gaaggctgtc cttagtacca 2220 gattctgagc agggagaggc gatactgcct cgcatcagcg tgatcagcac tggccccacg 2280 cttcaggcac gaaggaggca gtctgtcctg aacctgatga cacactcagt taaccaaggt 2340 cagaacattc accgaaagac aacagcatcc acacgaaaag tgtcactggc ccctcaggca 2400 aacttgactg aactggatat atattcaaga aggttatctc aagaaactgg cttggaaata 2460 agtgaagaaa ttaacgaaga agacttaaag gagtgctttt ttgatgatat ggagagcata 2520 ccagcagtga ctacatggaa cacatacctt cgatatatta ctgtccacaa gagcttaatt 2580 tttgtgctaa tttggtgctt agtaattttt ctggcagagg tggctgcttc tttggttgtg 2640 ctgtggctcc ttggaaacac tcctcttcaa gacaaaggga atagtactca tagtagaaat 2700 aacagctatg cagtgattat caccagcacc agttcgtatt atgtgtttta catttacgtg 2760 ggagtagccg acactttgct tgctatggga ttcttcagag gtctaccact ggtgcatact 2820 ctaatcacag tgtcgaaaat tttacaccac aaaatgttac attctgttct tcaagcacct 2880 atgtcaaccc tcaacacgtt gaaagcaggt gggattctta atagattctc caaagatata 2940 gcaattttgg atgaccttct gcctcttacc atatttgact tcatccagtt gttattaatt 3000 gtgattggag ctatagcagt tgtcgcagtt ttacaaccct acatctttgt tgcaacagtg 3060 ccagtgatag tggcttttat tatgttgaga gcatatttcc tccaaacctc acagcaactc 3120 aaacaactgg aatctgaagg caggagtcca attttcactc atcttgttac aagcttaaaa 3180 ggactatgga cacttcgtgc cttcggacgg cagccttact ttgaaactct gttccacaaa 3240 gctctgaatt tacatactgc caactggttc ttgtacctgt caacactgcg ctggttccaa 3300 atgagaatag aaatgatttt tgtcatcttc ttcattgctg ttaccttcat ttccatttta 3360 acaacaggag aaggagaagg aagagttggt attatcctga ctttagccat gaatatcatg 3420 agtacattgc agtgggctgt aaactccagc atagatgtgg atagcttgat gcgatctgtg 3480 agccgagtct ttaagttcat tgacatgcca acagaaggta aacctaccaa gtcaaccaaa 3540 ccatacaaga atggccaact ctcgaaagtt atgattattg agaattcaca cgtgaagaaa 3600 gatgacatct ggccctcagg gggccaaatg actgtcaaag atctcacagc aaaatacaca 3660 gaaggtggaa atgccatatt agagaacatt tccttctcaa taagtcctgg ccagagggtg 3720 ggcctcttgg gaagaactgg atcagggaag agtactttgt tatcagcttt tttgagacta 3780 ctgaacactg aaggagaaat ccagatcgat ggtgtgtctt gggattcaat aactttgcaa 3840 cagtggagga aagcctttgg agtgatacca cagaaagtat ttattttttc tggaacattt 3900 agaaaaaact tggatcccta tgaacagtgg agtgatcaag aaatatggaa agttgcagat 3960 gaggttgggc tcagatctgt gatagaacag tttcctggga agcttgactt tgtccttgtg 4020 gatgggggct gtgtcctaag ccatggccac aagcagttga tgtgcttggc tagatctgtt 4080 ctcagtaagg cgaagatctt gctgcttgat gaacccagtg ctcatttgga tccagtaaca 4140 taccaaataa ttagaagaac 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tttcatagta ttgaacaaag ggaaaacaat cttccgtttc 300 aatgccacac ctgctttata tatgctttct cctttcagtc ctctaagaag aatatctatt 360 aagattttag tacactcctt attcagcatg ctcatcatgt gcactattct gacaaactgc 420 atatttatga ccatgaataa cccgccggac tggaccaaaa atgtcgagta cacttttact 480 ggaatatata cttttgaatc acttgtaaaa atccttgcaa gaggcttctg tgtaggagaa 540 ttcacttttc ttcgtgaccc gtggaactgg ctggattttg tcgtcattgt ttttgcgtat 600 ttaacagaat ttgtaaacct aggcaatgtt tcagctcttc gaactttcag agtattgaga 660 gctttgaaaa ctatttctgt aatcccaggc ctgaagacaa ttgtaggggc tttgatccag 720 tcagtgaaga agctttctga tgtcatgatc ctgactgtgt tctgtctgag tgtgtttgca 780 ctaattggac tacagctgtt catgggaaac ctgaagcata aatgttttcg aaattcactt 840 gaaaataatg aaacattaga aagcataatg aataccctag agagtgaaga agactttaga 900 aaatattttt attacttgga aggatccaaa gatgctctcc tttgtggttt cagcacagat 960 tcaggtcagt gtccagaggg gtacacctgt gtgaaaattg gcagaaaccc tgattatggc 1020 tacacgagct ttgacacttt cagctgggcc ttcttagcct tgtttaggct aatgacccaa 1080 gattactggg aaaaccttta ccaacagacg 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gctatgtgcc ttattgttta catgatggtc 2820 atggtcattg gaaacctggt ggtcctaaac ctatttctgg ccttattatt gagctcattt 2880 agttcagaca atcttacagc aattgaagaa gaccctgatg caaacaacct ccagattgca 2940 gtgactagaa ttaaaaaggg aataaattat gtgaaacaaa ccttacgtga atttattcta 3000 aaagcatttt ccaaaaagcc aaagatttcc agggagataa gacaagcaga agatctgaat 3060 actaagaagg aaaactatat ttctaaccat acacttgctg aaatgagcaa aggtcacaat 3120 ttcctcaagg aaaaagataa aatcagtggt tttggaagca gcgtggacaa acacttgatg 3180 gaagacagtg atggtcaatc atttattcac aatcccagcc tcacagtgac agtgccaatt 3240 gcacctgggg aatccgattt ggaaaatatg aatgctgagg aacttagcag tgattcggat 3300 agtgaataca gcaaagtgag attaaaccgg tcaagctcct cagagtgcag cacagttgat 3360 aaccctttgc ctggagaagg agaagaagca gaggctgaac ctatgaattc cgatgagcca 3420 gaggcctgtt tcacagatgg ttgtgtacgg aggttctcat gctgccaagt taacatagag 3480 tcagggaaag gaaaaatctg gtggaacatc aggaaaacct gctacaagat tgttgaacac 3540 agttggtttg aaagcttcat tgtcctcatg atcctgctca gcagtggtgc cctggctttt 3600 gaagatattt atattgaaag gaaaaagacc attaagatta tcctggagta tgcagacaag 3660 atcttcactt acatcttcat tctggaaatg cttctaaaat ggatagcata tggttataaa 3720 acatatttca ccaatgcctg gtgttggctg gatttcctaa ttgttgatgt ttctttggtt 3780 actttagtgg caaacactct tggctactca gatcttggcc ccattaaatc ccttcggaca 3840 ctgagagctt taagacctct aagagcctta tctagatttg aaggaatgag ggtcgttgtg 3900 aatgcactca taggagcaat tccttccatc atgaatgtgc tacttgtgtg tcttatattc 3960 tggctgatat tcagcatcat gggagtaaat ttgtttgctg gcaagttcta tgagtgtatt 4020 aacaccacag atgggtcacg gtttcctgca agtcaagttc caaatcgttc cgaatgtttt 4080 gcccttatga atgttagtca aaatgtgcga tggaaaaacc tgaaagtgaa ctttgataat 4140 gtcggacttg gttacctatc tctgcttcaa gttgcaactt ttaagggatg gacgattatt 4200 atgtatgcag cagtggattc tgttaatgta gacaagcagc ccaaatatga atatagcctc 4260 tacatgtata tttattttgt cgtctttatc atctttgggt cattcttcac tttgaacttg 4320 ttcattggtg tcatcataga taatttcaac caacagaaaa agaagcttgg aggtcaagac 4380 atctttatga cagaagaaca gaagaaatac tataatgcaa tgaaaaagct ggggtccaag 4440 aagccacaaa agccaattcc tcgaccaggg aacaaaatcc aaggatgtat atttgaccta 4500 gtgacaaatc aagcctttga tattagtatc atggttctta tctgtctcaa catggtaacc 4560 atgatggtag aaaaggaggg tcaaagtcaa catatgactg aagttttata ttggataaat 4620 gtggttttta taatcctttt cactggagaa tgtgtgctaa aactgatctc cctcagacac 4680 tactacttca ctgtaggatg gaatattttt gattttgtgg ttgtgattat ctccattgta 4740 ggtatgtttc tagctgattt gattgaaacg tattttgtgt cccctaccct gttccgagtg 4800 atccgtcttg ccaggattgg ccgaatccta cgtctagtca aaggagcaaa ggggatccgc 4860 acgctgctct ttgctttgat gatgtccctt cctgcgttgt ttaacatcgg cctcctgctc 4920 ttcctggtca tgttcatcta cgccatcttt ggaatgtcca actttgccta tgttaaaaag 4980 gaagatggaa ttaatgacat gttcaatttt gagacctttg gcaacagtat gatttgcctg 5040 ttccaaatta caacctctgc tggctgggat ggattgctag cacctattct taacagtaag 5100 ccacccgact gtgacccaaa aaaagttcat cctggaagtt cagttgaagg agactgtggt 5160 aacccatctg ttggaatatt ctactttgtt agttatatca tcatatcctt cctggttgtg 5220 gtgaacatgt acattgcagt catactggag aattttagtg ttgccactga agaaagtact 5280 gaacctctga gtgaggatga ctttgagatg ttctatgagg tttgggagaa gtttgatccc 5340 gatgcgaccc agtttataga gttctctaaa ctctctgatt ttgcagctgc cctggatcct 5400 cctcttctca tagcaaaacc caacaaagtc cagctcattg ccatggatct gcccatggtt 5460 agtggtgacc ggatccattg tcttgacatc ttatttgctt ttacaaagcg tgttttgggt 5520 gagagtgggg agatggattc tcttcgttca cagatggaag aaaggttcat gtctgcaaat 5580 ccttccaaag tgtcctatga acccatcaca accacactaa aacggaaaca agaggatgtg 5640 tctgctactg tcattcagcg tgcttataga cgttaccgct taaggcaaaa tgtcaaaaat 5700 atatcaagta tatacataaa agatggagac agagatgatg atttactcaa taaaaaagat 5760 atggcttttg ataatgttaa tgagaactca agtccagaaa aaacagatgc cacttcatcc 5820 accacctctc caccttcata tgatagtgta acaaagccag acaaagagaa atatgaacaa 5880 gacagaacag aaaaggaaga caaagggaaa gacagcaagg aaagcaaaaa atag 5934 <210> 20 <211> 657 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> human SCN1B <400> 20 atggggaggc tgctggcctt agtggtcggc gcggcactgg tgtcctcagc ctgcgggggc 60 tgcgtggagg tggactcgga gaccgaggcc gtgtatggga tgaccttcaa aattctttgc 120 atctcctgca agcgccgcag cgagaccaac 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cctcagcacc 1740 ctggccatcc tggtgatatt ctggaggcac ttccagacac ccatagttcg ctcggctggg 1800 ggccccatgt gcttcctgat gctgacactg ctgctggtgg catacatggt ggtcccggtg 1860 tacgtggggc cgcccaaggt ctccacctgc ctctgccgcc aggccctctt tcccctctgc 1920 ttcacaatct gcatctcctg tatcgccgtg cgttctttcc agatcgtctg cgccttcaag 1980 atggccagcc gcttcccacg cgcctacagc tactgggtcc gctaccaggg gccctacgtc 2040 tctatggcat ttatcacggt actcaaaatg gtcattgtgg taattggcat gctggccacg 2100 ggcctcagtc ccaccacccg tactgacccc gatgacccca agatcacaat tgtctcctgt 2160 aaccccaact accgcaacag cctgctgttc aacaccagcc tggacctgct gctctcagtg 2220 gtgggtttca gcttcgccta catgggcaaa gagctgccca ccaactacaa cgaggccaag 2280 ttcatcaccc tcagcatgac cttctatttc acctcatccg tctccctctg caccttcatg 2340 tctgcctaca gcggggtgct ggtcaccatt gtggacctct tggtcactgt gctcaacctc 2400 ctggccatca gcctgggcta cttcggcccc aagtgctaca tgatcctctt ctacccggag 2460 cgcaacacgc ccgcctactt caacagcatg atccagggct acaccatgag gagggactag 2520 <210> 32 <211> 2559 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 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Lys Ser Thr Ser Val 260 265 270 Ile Leu Phe Leu Asn Lys Thr Asp Ile Leu Glu Glu Lys Ile Pro Thr 275 280 285 Ser His Leu Ala Thr Tyr Phe Pro Ser Phe Gln Gly Pro Lys Gln Asp 290 295 300 Ala Glu Ala Ala Lys Arg Phe Ile Leu Asp Met Tyr Thr Arg Met Tyr 305 310 315 320 Thr Gly Cys Val Asp Gly Pro Glu Gly Ser Lys Lys Gly Ala Arg Ser 325 330 335 Arg Arg Leu Phe Ser His Tyr Thr Cys Ala Thr Asp Thr Gln Asn Ile 340 345 350 Arg Lys Val Phe Lys Asp Val Arg Asp Ser Val Leu Ala Arg Tyr Leu 355 360 365 Asp Glu Ile Asn Leu Leu 370 <210> 51 <211> 900 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> human TAS2R1(F1) coding sequence <400> 51 atgctagagt ctcacctcat tatctatttt cttcttgcag tgatacaatt tcttcttggg 60 attttcacaa atggcatcat tgtggtggtg aatggcattg acttgatcaa gcacagaaaa 120 atggctccgc tggatctcct tctttcttgt ctggcagttt ctagaatttt tctgcagttg 180 ttcatcttct acgttaatgt gattgttatc ttcttcatag aattcatcat gtgttctgcg 240 aattgtgcaa ttctcttatt tataaatgaa ttggaacttt ggcttgccac atggctcggc 300 gttttctatt gtgccaaggt tgccagcgtc cgtcacccac tcttcatctg gttgaagatg 360 aggatatcca agctggtccc atggatgatc ctggggtctc tgctatatgt atctatgatt 420 tgtgttttcc atagcaaata tgcagggttt atggtcccat acttcctaag gaaatttttc 480 tcccaaaatg ccacaattca aaaagaagat acactggcta tacagatttt ctcttttgtt 540 gctgagttct cagtgccatt gcttatcttc ctttttgctg ttttgctctt gattttctct 600 ctggggaggc acacccggca aatgagaaac acagtggccg gcagcagggt tcctggcagg 660 ggtgcaccca tcagcgcgtt gctgtctatc ctgtccttcc tgatcctcta cttctcccac 720 tgcatgataa aagtttttct ctcttctcta aagtttcaca tcagaaggtt catctttctg 780 ttcttcatcc ttgtgattgg tgtataccct tctggacact ctctcatctt aattttagga 840 aatcctaaat tgaaacaaaa tgcaaaaaag ttcctcctcc acagtaagtg ctgtcagtga 900 <210> 52 <211> 951 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> human TAS2R3 (F5) coding sequence <400> 52 atgatgggac tcaccgaggg ggtgttcctg attctgtctg gcactcagtt cacactggga 60 attctggtca attgtttcat tgagttggtc aatggtagca gctggttcaa gaccaagaga 120 atgtctttgt ctgacttcat catcaccacc ctggcactct tgaggatcat tctgctgtgt 180 attatcttga ctgatagttt tttaatagaa ttctctccca acacacatga ttcagggata 240 ataatgcaaa ttattgatgt ttcctggaca tttacaaacc atctgagcat ttggcttgcc 300 acctgtcttg gtgtcctcta ctgcctgaaa atcgccagtt tctctcaccc cacattcctc 360 tggctcaagt ggagagtttc tagggtgatg gtatggatgc tgttgggtgc actgctctta 420 tcctgtggta gtaccgcatc tctgatcaat gagtttaagc tctattctgt ctttagggga 480 attgaggcca ccaggaatgt gactgaacac ttcagaaaga agaggagtga gtattatctg 540 atccatgttc ttgggactct gtggtacctg cctcccttaa ttgtgtccct ggcctcctac 600 tctttgctca tcttctccct ggggaggcac acacggcaga tgctgcaaaa tgggacaagc 660 tccagagatc caaccactga ggcccacaag agggccatca gaatcatcct ttccttcttc 720 tttctcttct tactttactt tcttgctttc ttaattgcat catttggtaa tttcctacca 780 aaaaccaaga tggctaagat gattggtgaa gtaatgacaa tgttttatcc tgctggccac 840 tcatttattc tcattctggg gaacagtaag ctgaagcaga catttgtagt gatgctccgg 900 tgtgagtctg gtcatctgaa gcctggatcc aagggaccca ttttctctta g 951 <210> 53 <211> 900 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> human TAS2R4 (F25) coding sequence <400> 53 atgcttcggt tattctattt ctctgctatt attgcctcag ttattttaaa ttttgtagga 60 atcattatga atctgtttat tacagtggtc aattgcaaaa cttgggtcaa aagccataga 120 atctcctctt ctgataggat tctgttcagc ctgggcatca ccaggtttct tatgctggga 180 ctatttctgg tgaacaccat ctacttcgtc tcttcaaata cggaaaggtc agtctacctg 240 tctgcttttt ttgtgttgtg tttcatgttt ttggactcga gcagtgtctg gtttgtgacc 300 ttgctcaata tcttgtactg tgtgaagatt actaacttcc aacactcagt gtttctcctg 360 ctgaagcgga atatctcccc aaagatcccc aggctgctgc tggcctgtgt gctgatttct 420 gctttcacca cttgcctgta catcacgctt agccaggcat caccttttcc tgaacttgtg 480 actacgagaa ataacacatc atttaatatc agtgagggca tcttgtcttt agtggtttct 540 ttggtcttga gctcatctct ccagttcatc attaatgtga cttctgcttc cttgctaata 600 cactccttga ggagacatat acagaagatg cagaaaaatg ccactggttt ctggaatccc 660 cagacggaag ctcatgtagg tgctatgaag ctgatggtct atttcctcat cctctacatt 720 ccatattcag ttgctaccct ggtccagtat ctcccctttt atgcagggat ggatatgggg 780 accaaatcca tttgtctgat ttttgccacc ctttactctc caggacattc tgttctcatt 840 attatcacac atcctaaact gaaaacaaca gcaaagaaga ttctttgttt caaaaaatag 900 <210> 54 <211> 900 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> human TAS2R5 (F11) coding sequence <400> 54 atgctgagcg ctggcctagg actgctgatg ctggtggcag tggttgaatt tctcatcggt 60 ttaattggaa atggaagcct ggtggtctgg agttttagag aatggatcag aaaattcaac 120 tggtcctcat ataacctcat tatcctgggc ctggctggct gccgatttct cctgcagtgg 180 ctgatcattt tggacttaag cttgtttcca cttttccaga gcagccgttg gcttcgctat 240 cttagtatct tctgggtcct ggtaagccag gccagcttat ggtttgccac cttcctcagt 300 gtcttctatt gcaagaagat cacgaccttc gatcgcccgg cctacttgtg gctgaagcag 360 agggcctata acctgagtct ctggtgcctt ctgggctact ttataatcaa tttgttactt 420 acagtccaaa ttggcttaac attctatcat cctccccaag gaaacagcag cattcggtat 480 ccctttgaaa gctggcagta cctgtatgca tttcagctca attcaggaag ttatttgcct 540 ttagtggtgt ttcttgtttc ctctgggatg ctgattgtct ctttgtatac acaccacaag 600 aagatgaagg tccattcagc tggtaggagg gatgtccggg ccaaggctca catcactgcg 660 ctgaagtcct tgggctgctt cctcttactt cacctggttt atatcatggc cagccccttc 720 tccatcacct ccaagactta tcctcctgat ctcaccagtg tcttcatctg ggagacactc 780 atggcagcct atccttctct tcattctctc atattgatca tggggattcc tagggtgaag 840 cagacttgtc agaagatcct gtggaagaca gtgtgtgctc ggagatgctg gggcccatga 900 <210> 55 <211> 957 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> human TAS2R7 (F4) coding sequence <400> 55 atggcagata aagtgcagac tactttattg ttcttagcag ttggagagtt ttcagtgggg 60 atcttaggga atgcattcat tggattggta aactgcatgg attgggtcaa gaagaggaaa 120 attgcctcca ttgatttaat cctcacaagt ctggccatat ccagaatttg tctattgtgc 180 gtaatactat tagattgttt tatattggtg ctatatccag atgtctatgc cactggtaaa 240 gaaatgagaa tcattgactt cttctggaca ctaaccaatc atttaagtat ctggtttgca 300 acctgcctca gcatttacta tttcttcaag ataggtaatt tctttcaccc acttttcctc 360 tggatgaagt ggagaattga cagggtgatt tcctggattc tactggggtg cgtggttctc 420 tctgtgttta ttagccttcc agccactgag aatttgaacg ctgatttcag gttttgtgtg 480 aaggcaaaga ggaaaacaaa cttaacttgg agttgcagag taaataaaac tcaacatgct 540 tctaccaagt tatttctcaa cctggcaacg ctgctcccct tttgtgtgtg cctaatgtcc 600 tttttcctct tgatcctctc cctgcggaga catatcaggc gaatgcagct cagtgccaca 660 gggtgcagag accccagcac agaagcccat gtgagagccc tgaaagctgt catttccttc 720 cttctcctct ttattgccta ctatttgtcc tttctcattg ccacctccag ctactttatg 780 ccagagacgg aattagctgt gatttttggt gagtccatag ctctaatcta cccctcaagt 840 cattcattta tcctaatact ggggaacaat aaattaagac atgcatctct aaaggtgatt 900 tggaaagtaa tgtctattct aaaaggaaga aaattccaac aacataaaca aatctga 957 <210> 56 <211> 930 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> human TAS2R8 (F2) coding sequence <400> 56 atgttcagtc ctgcagataa catctttata atcctaataa ctggagaatt catactagga 60 atattgggga atggatacat tgcactagtc aactggattg actggattaa gaagaaaaag 120 atttccacag ttgactacat ccttaccaat ttagttatcg ccagaatttg tttgatcagt 180 gtaatggttg taaatggcat tgtaatagta ctgaacccag atgtttatac aaaaaataaa 240 caacagatag tcatttttac cttctggaca tttgccaact acttaaatat gtggattacc 300 acctgcctta atgtcttcta ttttctgaag atagccagtt cctctcatcc actttttctc 360 tggctgaagt ggaaaattga tatggtggtg cactggatcc tgctgggatg ctttgccatt 420 tccttgttgg tcagccttat agcagcaata gtactgagtt gtgattatag gtttcatgca 480 attgccaaac ataaaagaaa cattactgaa atgttccatg tgagtaaaat accatacttt 540 gaacccttga ctctctttaa cctgtttgca attgtcccat ttattgtgtc actgatatca 600 tttttccttt tagtaagatc tttatggaga cataccaagc aaataaaact ctatgctacc 660 ggcagtagag accccagcac agaagttcat gtgagagcca ttaaaactat gacttcattt 720 atcttctttt ttttcctata ctatatttct tctattttga tgacctttag ctatcttatg 780 acaaaataca agttagctgt ggagtttgga gagattgcag caattctcta ccccttgggt 840 cactcactta ttttaattgt tttaaataat aaactgaggc agacatttgt cagaatgctg 900 acatgtagaa aaattgcctg catgatatga 930 <210> 57 <211> 939 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> human TAS2R9 (F24) coding sequence <400> 57 atgccaagtg caatagaggc aatatatatt attttaattg ctggtgaatt gaccataggg 60 atttggggaa atggattcat tgtactagtt aactgcattg actggctcaa aagaagagat 120 atttccttga ttgacatcat cctgatcagc ttggccatct ccagaatctg tctgctgtgt 180 gtaatatcat tagatggctt ctttatgctg ctctttccag gtacatatgg 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agtgtttggg 60 gttttgggga atggatttat tggacttgta aactgcattg actgtgccaa gaataagtta 120 tctacgattg gctttattct caccggctta gctatttcaa gaatttttct gatatggata 180 ataattacag atggatttat acagatattc tctccaaata tatatgcctc cggtaaccta 240 attgaatata ttagttactt ttgggtaatt ggtaatcaat caagtatgtg gtttgccacc 300 agcctcagca tcttctattt cctgaagata gcaaattttt ccaactacat atttctctgg 360 ttgaagagca gaacaaatat ggttcttccc ttcatgatag tattcttact tatttcatcg 420 ttacttaatt ttgcatacat tgcgaagatt cttaatgatt ataaaatgaa gaatgacaca 480 gtctgggatc tcaacatgta taaaagtgaa tactttatta aacagatttt gctaaatctg 540 ggagtcattt tcttctttac actatcccta attacatgta tttttttaat catttccctt 600 tggagacaca acaggcagat gcaatcaaat gtgacaggat tgagagactc caacacagaa 660 gctcatgtga aggcaatgaa agttttgata tctttcatca tcctctttat cttgtatttt 720 ataggcatgg ccatagaaat atcatgtttt actgtgcgag aaaacaaact gctgcttatg 780 tttggaatga caaccacagc catctatccc tggggtcact catttatctt aattctagga 840 aacagcaagc taaagcaagc ctctttgagg gtactgcagc aattgaagtg ctgtgagaaa 900 aggaaaaatc tcagagtcac atag 924 <210> 59 <211> 912 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> human TAS2R13 (F3) coding sequence <400> 59 atggaaagtg ccctgccgag tatcttcact cttgtaataa ttgcagaatt cataattggg 60 aatttgagca atggatttat agtactgatc aactgcattg actgggtcag taaaagagag 120 ctgtcctcag tcgataaact cctcattatc ttggcaatct ccagaattgg gctgatctgg 180 gaaatattag taagttggtt tttagctctg cattatctag ccatatttgt gtctggaaca 240 ggattaagaa ttatgatttt tagctggata gtttctaatc acttcaatct ctggcttgct 300 acaatcttca gcatctttta tttgctcaaa atagcgagtt tctctagccc tgcttttctc 360 tatttgaagt ggagagtaaa caaagtgatt ctgatgatac tgctaggaac cttggtcttc 420 ttatttttaa atctgataca aataaacatg catataaaag actggctgga ccgatatgaa 480 agaaacacaa cttggaattt cagtatgagt gactttgaaa cattttcagt gtcggtcaaa 540 ttcactatga ctatgttcag tctaacacca tttactgtgg ccttcatctc ttttctcctg 600 ttaattttct ccctgcagaa acatctccag aaaatgcaac tcaattacaa aggacacaga 660 gaccccagga ccaaggtcca tacaaatgcc ttgaaaattg tgatctcatt ccttttattc 720 tatgctagtt tctttctatg tgttctcata tcatggattt ctgagctgta tcagaacaca 780 gtgatctaca tgctttgtga gacgattgga gtcttctctc cttcaagcca ctcctttctt 840 ctgattctag gaaacgctaa gttaagacag gcctttcttt tggtggcagc taaggtatgg 900 gctaaacgat ga 912 <210> 60 <211> 954 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> human TAS2R14 (F15) coding sequence <400> 60 atgggtggtg tcataaagag catatttaca ttcgttttaa ttgtggaatt tataattgga 60 aatttaggaa atagtttcat agcactggtg aactgtattg actgggtcaa gggaagaaag 120 atctcttcgg ttgatcggat cctcactgct ttggcaatct ctcgaattag cctggtttgg 180 ttaatattcg gaagctggtg tgtgtctgtg tttttcccag ctttatttgc cactgaaaaa 240 atgttcagaa tgcttactaa tatctggaca gtgatcaatc attttagtgt ctggttagct 300 acaggcctcg gtacttttta ttttctcaag atagccaatt tttctaactc tatttttctc 360 tacctaaagt ggagggttaa aaaggtggtt ttggtgctgc ttcttgtgac ttcggtcttc 420 ttgtttttaa atattgcact gataaacatc catataaatg ccagtatcaa tggatacaga 480 agaaacaaga cttgcagttc tgattcaagt aactttacac gattttccag tcttattgta 540 ttaaccagca ctgtgttcat tttcataccc tttactttgt ccctggcaat gtttcttctc 600 ctcatcttct ccatgtggaa acatcgcaag aagatgcagc acactgtcaa aatatccgga 660 gacgccagca ccaaagccca cagaggagtt aaaagtgtga tcactttctt cctactctat 720 gccattttct ctctgtcttt tttcatatca gtttggacct ctgaaaggtt ggaggaaaat 780 ctaattattc tttcccaggt gatgggaatg gcttatcctt catgtcactc atgtgttctg 840 attcttggaa acaagaagct gagacaggcc tctctgtcag tgctactgtg gctgaggtac 900 atgttcaaag atggggagcc ctcaggtcac aaagaattta gagaatcatc ttga 954 <210> 61 <211> 876 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> human TAS2R16 (F14) coding sequence <400> 61 atgataccca tccaactcac tgtcttcttc atgatcatct atgtgcttga gtccttgaca 60 attattgtgc agagcagcct aattgttgca gtgctgggca gagaatggct gcaagtcaga 120 aggctgatgc ctgtggacat gattctcatc agcctgggca tctctcgctt ctgtctacag 180 tgggcatcaa tgctgaacaa tttttgctcc tattttaatt tgaattatgt actttgcaac 240 ttaacaatca cctgggaatt ttttaatatc cttacattct ggttaaacag cttgcttacc 300 gtgttctact gcatcaaggt ctcttctttc acccatcaca tctttctctg gctgaggtgg 360 agaattttga ggttgtttcc ctggatatta ctgggttctc tgatgattac ttgtgtaaca 420 atcatccctt cagctattgg gaattacatt caaattcagt tactcaccat ggagcatcta 480 ccaagaaaca gcactgtaac tgacaaactt gaaaattttc atcagtatca gttccaggct 540 catacagttg cattggttat tcctttcatc ctgttcctgg cctccaccat ctttctcatg 600 gcatcactga ccaagcagat acaacatcat agcactggtc actgcaatcc aagcatgaaa 660 gcgcgcttca ctgccctgag gtcccttgcc gtcttattta ttgtgtttac ctcttacttt 720 ctaaccatac tcatcaccat tataggtact ctatttgata agagatgttg gttatgggtc 780 tgggaagctt ttgtctatgc tttcatctta atgcattcca cttcactgat gctgagcagc 840 cctacgttga aaaggattct aaagggaaag tgctag 876 <210> 62 <211> 1002 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> human TAS2R38 (F7) coding sequence <400> 62 atgttgactc taactcgcat ccgcactgtg tcctatgaag tcaggagtac atttctgttc 60 atttcagtcc tggagtttgc agtggggttt ctgaccaatg ccttcgtttt cttggtgaat 120 ttttgggatg tagtgaagag gcaggcactg agcaacagtg attgtgtgct gctgtgtctc 180 agcatcagcc ggcttttcct gcatggactg ctgttcctga gtgctatcca gcttacccac 240 ttccagaagt tgagtgaacc actgaaccac agctaccaag ccatcatcat 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aatgactaaa 60 ctctgcgatc ctgcagaaag tgaattgtcg ccatttctca tcaccttaat tttagcagtt 120 ttacttgctg aatacctcat tggtatcatt gcaaatggtt tcatcatggc tatacatgca 180 gctgaatggg ttcaaaataa ggcagtttcc acaagtggca ggatcctggt tttcctgagt 240 gtatccagaa tagctctcca aagcctcatg atgttagaaa ttaccatcag ctcaacctcc 300 ctaagttttt attctgaaga cgctgtatat tatgcattca aaataagttt tatattctta 360 aatttttgta gcctgtggtt tgctgcctgg ctcagtttct tctactttgt gaagattgcc 420 aatttctcct accccctttt cctcaaactg aggtggagaa ttactggatt gataccctgg 480 cttctgtggc tgtccgtgtt tatttccttc agtcacagca tgttctgcat caacatctgc 540 actgtgtatt gtaacaattc tttccctatc cactcctcca actccactaa gaaaacatac 600 ttgtctgaga tcaatgtggt cggtctggct tttttcttta acctggggat tgtgactcct 660 ctgatcatgt tcatcctgac agccaccctg ctgatcctct ctctcaagag acacacccta 720 cacatgggaa gcaatgccac agggtccaac gaccccagca tggaggctca catgggggcc 780 atcaaagcta tcagctactt tctcattctc tacattttca atgcagttgc tctgtttatc 840 tacctgtcca acatgtttga catcaacagt ctgtggaata atttgtgcca gatcatcatg 900 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Leu Gly Asn 275 280 285 Ser Lys Leu Arg Gln Thr Ala Val Arg Leu Leu Trp His Leu Arg Asn 290 295 300 Tyr Thr Lys Thr Pro Asn Ala Leu Pro Leu 305 310 <210> 101 <211> 318 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human TAS2R60 (F20) <400> 101 Met Asn Gly Asp His Met Val Leu Gly Ser Ser Val Thr Asp Lys Lys 1 5 10 15 Ala Ile Ile Leu Val Thr Ile Leu Leu Leu Leu Arg Leu Val Ala Ile 20 25 30 Ala Gly Asn Gly Phe Ile Thr Ala Ala Leu Gly Val Glu Trp Val Leu 35 40 45 Arg Arg Met Leu Leu Pro Cys Asp Lys Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala 50 55 60 Ser Arg Phe Cys Leu Gln Ser Val Val Met Gly Lys Thr Ile Tyr Val 65 70 75 80 Phe Leu His Pro Met Ala Phe Pro Tyr Asn Pro Val Leu Gln Phe Leu 85 90 95 Ala Phe Gln Trp Asp Phe Leu Asn Ala Ala Thr Leu Trp Ser Ser Thr 100 105 110 Trp Leu Ser Val Phe Tyr Cys Val Lys Ile Ala Thr Phe Thr His Pro 115 120 125 Val Phe Phe Trp Leu Lys His Lys Leu Ser Gly Trp Leu Pro Trp Met 130 135 140 Leu Phe Ser Ser Val Gly Leu Ser Ser Phe Thr Thr Ile Leu Phe Phe 145 150 155 160 Ile Gly Asn His Arg Met Tyr Gln Asn Tyr Leu Arg Asn His Leu Gln 165 170 175 Pro Trp Asn Val Thr Gly Asp Ser Ile Arg Ser Tyr Cys Glu Lys Phe 180 185 190 Tyr Leu Phe Pro Leu Lys Met Ile Thr Trp Thr Met Pro Thr Ala Val 195 200 205 Phe Phe Ile Cys Met Ile Leu Leu Ile Thr Ser Leu Gly Arg His Arg 210 215 220 Lys Lys Ala Leu Leu Thr Thr Ser Gly Phe Arg Glu Pro Ser Val Gln 225 230 235 240 Ala His Ile Lys Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ser Phe Ala Met Leu Phe 245 250 255 Ile Ser Tyr Phe Leu Ser Leu Val Phe Ser Ala Ala Gly Ile Phe Pro 260 265 270 Pro Leu Asp Phe Lys Phe Trp Val Trp Glu Ser Val Ile Tyr Leu Cys 275 280 285 Ala Ala Val His Pro Ile Ile Leu Leu Phe Ser Asn Cys Arg Leu Arg 290 295 300 Ala Val Leu Lys Ser Arg Arg Ser Ser Arg Cys Gly Thr Pro 305 310 315 <210> 102 <211> 236 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Mouse GNA15 (G-alpha15) <400> 102 Met Ala Arg Ser Thr Trp Gly Cys Cys Trp Cys Thr Lys Thr Ala Ala 1 5 10 15 Arg Asp Asn Arg Lys Lys Arg Lys Gly Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys 20 25 30 Met Arg His Gly Val Gly Tyr Ser Asp Arg Arg Ala Arg Tyr Asn Val 35 40 45 Ser Met Ala Met Asp Ala Met Asp Arg Ser Arg Asp Ser Lys His Ala 50 55 60 Ser Val Met Thr Asp Tyr Lys Val Ser Thr Lys Tyr Ala Val Ala Met 65 70 75 80 Tyr Trp Arg Asp Ala Gly Arg Ala Cys Tyr Arg Arg Arg His Asp Ser 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Ser His Arg Ser Asp Ser Tyr Thr Ala Asp Val Arg 100 105 110 Ser Arg Met Thr Thr Gly Asn Tyr Cys Ser Val Lys Lys Thr Lys Arg 115 120 125 Val Asp Val Gly Gly Arg Ser Arg Arg Lys Trp His Cys Asn Val Ala 130 135 140 Tyr Ala Ser Ser Tyr Asp Cys Asn Asp Asn Arg Met Ser Ala Ser Thr 145 150 155 160 Trp Lys Ser Thr Ser Val Asn Lys Thr Asp Asp Lys His Thr Ser His 165 170 175 Ala Thr Tyr Ser Gly Arg Arg Asp Ala Ala Ala Lys Ser Asp Met Tyr 180 185 190 Ala Arg Val Tyr Ala Ser Cys Ala Asp Gly Gly Arg Lys Gly Ser Arg 195 200 205 Ala Arg Arg Ala His Thr Cys Ala Thr Asp Thr Ser Val Arg Ser Val 210 215 220 Lys Asp Val Arg Asp Ser Val Ala Arg Tyr Asp Asn 225 230 235 <210> 103 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signaling probe S21 <400> 103 gcgaggagac ggatgaggtg aaatagaagc tcgc 34 <210> 104 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signaling probe S22 <400> 104 gcgagattgt gaagcagagg ggaaagaggc tcgc 34 <210> 105 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signaling probe S23 <400> 105 gcgagacctt cacttcatac tccttgcacc tcgc 34 <210> 106 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signaling probe R2-3U1 <400> 106 gcgagccttg tctcccgcaa taccttcacc tcgc 34 <210> 107 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signaling probe R2-I1 <400> 107 gcgagctttc tccttgtctc ccgcaatacc tcgc 34 <210> 108 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signaling probe S31 <400> 108 gcgaggtttc ccctgatttc ctgtgttccg tcgc 34 <210> 109 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signaling probe S32 <400> 109 gcgagcaccc acagcttcag gtcgtactcc tcgc 34 <210> 110 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signaling probe S33 <400> 110 gcgaggacca ctcatcctgg ccacaaaagc tcgc 34 <210> 111 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signaling probe R3-3U1 <400> 111 gccagcctga tttgggcttc cagccatctc tcgc 34 <210> 112 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signaling probe R3-I31 <400> 112 gcgaggcaga ggacagcaca cccccatctc tcgc 34 <210> 113 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence (T1R2 exon 6) of Signaling probe S21 <400> 113 cttctatttc acctcatccg tctc 24 <210> 114 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence (T1R2 exon 6) of Signaling probe S22 <400> 114 cctctttccc ctctgcttca caat 24 <210> 115 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence (T1R2 exon 1) of Signaling probe S23 <400> 115 gtgcaaggag tatgaagtga aggt 24 <210> 116 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence (T1R2 3 prime untranslated region) of Signaling probe R2-3U1 <400> 116 gtgaaggtat tgcgggagac aagg 24 <210> 117 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence (T1R2 intron 1) of Signaling probe R2-I1 <400> 117 gtattgcggg agacaaggag aaag 24 <210> 118 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence (T1R3 exon 6) of Signaling probe S31 <400> 118 ggaacacagg aaatcagggg aaac 24 <210> 119 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence (T1R3 exon 4) of Signaling probe S32 <400> 119 gagtacgacc tgaagctgtg ggtg 24 <210> 120 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence (T1R3 exon 6) of Signaling probe S33 <400> 120 cttttgtggc caggatgagt ggtc 24 <210> 121 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence (T1R3 3 prime untranslated region) of Signaling probe R3-3U1 <400> 121 agatggctgg aagcccaaat cagg 24 <210> 122 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence (T1R3 intron 3) of Signaling probe R3-I31 <400> 122 agatgggggt gtgctgtcct ctgc 24 <210> 123 <211> 151 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tag sequence 1 (sweet) <400> 123 agggcgaatt ccagcacact ggcggccgtt actagtggat ccgagctcgg aggcaggtgg 60 acaggaaggt tctaatgttc ttaaggcaca ggaactggga catctgggcc cggaaagcct 120 ttttctctgt gatccggtac agtccttctg c 151 <210> 124 <211> 161 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tag sequence 2 (sweet) <400> 124 agggcgaatt ccagcacact ggcggccgtt actagtggat ccgagctcgg taccaagctt 60 cgaggcaggt ggacagcttg gttctaatga agttaaccct gtcgttctgc gacatctggg 120 cccggaaagc gtttaactga tggatggaac agtccttctg c 161 <210> 125 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tag sequence 3 (sweet) <400> 125 aagggcgaat tcggatccgc ggccgcctta agctcgaggc aggtggacag gaaggttcta 60 atgttctata gggtctgctt gtcgctcatc tgggcccgga gatg 104 <210> 126 <211> 151 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tag sequence 1 (umami) <400> 126 agggcgaatt ccagcacact ggcggccgtt actagtggat ccgagctcgg aggcaggtgg 60 acaggaaggt tctaatgttc ttaaggcaca ggaactggga catctgggcc cggaaagcct 120 ttttctctgt gatccggtac agtccttctg c 151 <210> 127 <211> 161 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tag sequence 2 (umami) <400> 127 agggcgaatt ccagcacact ggcggccgtt actagtggat ccgagctcgg taccaagctt 60 cgaggcaggt ggacagcttg gttctaatga agttaaccct gtcgttctgc gacatctggg 120 cccggaaagc gtttaactga tggatggaac agtccttctg c 161 <210> 128 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tag sequence 3 (umami) <400> 128 aagggcgaat tcggatccgc ggccgcctta agctcgaggc aggtggacag gaaggttcta 60 atgttctata gggtctgctt gtcgctcatc tgggcccgga gatg 104 <210> 129 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target Sequence 1 (odorant) <400> 129 gttcttaagg cacaggaact gggac 25 <210> 130 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target Sequence 2 (odorant) <400> 130 gaagttaacc ctgtcgttct gcgac 25 <210> 131 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signaling Probe 1 (odorant) <400> 131 gccagtccca gttcctgtgc cttaagaacc tcgc 34 <210> 132 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signaling Probe 2 (odorant) <400> 132 gcgagtcgca gaacgacagg gttaacttcc tcgc 34 <210> 133 <211> 374 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human G-alpha15 signaling protein <400> 133 Met Ala Arg Ser Leu Thr Trp Arg Cys Cys Pro Trp Cys Leu Thr Glu 1 5 10 15 Asp Glu Lys Ala Ala Ala Arg Val Asp Gln Glu Ile Asn Arg Ile Leu 20 25 30 Leu Glu Gln Lys Lys Gln Asp Arg Gly Glu Leu Lys Leu Leu Leu Leu 35 40 45 Gly Pro Gly Glu Ser Gly Lys Ser Thr Phe Ile Lys Gln Met Arg Ile 50 55 60 Ile His Gly Ala Gly Tyr Ser Glu Glu Glu Arg Lys Gly Phe Arg Pro 65 70 75 80 Leu Val Tyr Gln Asn Ile Phe Val Ser Met Arg Ala Met Ile Glu Ala 85 90 95 Met Glu Arg Leu Gln Ile Pro Phe Ser Arg Pro Glu Ser Lys His His 100 105 110 Ala Ser Leu Val Met Ser Gln Asp Pro Tyr Lys Val Thr Thr Phe Glu 115 120 125 Lys Arg Tyr Ala Ala Ala Met Gln Trp Leu Trp Arg Asp Ala Gly Ile 130 135 140 Arg Ala Cys Tyr Glu Arg Arg Arg Glu Phe His Leu Leu Asp Ser Ala 145 150 155 160 Val Tyr Tyr Leu Ser His Leu Glu Arg Ile Thr Glu Glu Gly Tyr Val 165 170 175 Pro Thr Ala Gln Asp Val Leu Arg Ser Arg Met Pro Thr Thr Gly Ile 180 185 190 Asn Glu Tyr Cys Phe Ser Val Gln Lys Thr Asn Leu Arg Ile Val Asp 195 200 205 Val Gly Gly Gln Lys Ser Glu Arg Lys Lys Trp Ile His Cys Phe Glu 210 215 220 Asn Val Ile Ala Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Glu Tyr Asp Gln 225 230 235 240 Cys Leu Glu Glu Asn Asn Gln Glu Asn Arg Met Lys Glu Ser Leu Ala 245 250 255 Leu Phe Gly Thr Ile Leu Glu Leu Pro Trp Phe Lys Ser Thr Ser Val 260 265 270 Ile Leu Phe Leu Asn Lys Thr Asp Ile Leu Glu Glu Lys Ile Pro Thr 275 280 285 Ser His Leu Ala Thr Tyr Phe Pro Ser Phe Gln Gly Pro Lys Gln Asp 290 295 300 Ala Glu Ala Ala Lys Arg Phe Ile Leu Asp Met Tyr Thr Arg Met Tyr 305 310 315 320 Thr Gly Cys Val Asp Gly Pro Glu Gly Ser Lys Lys Gly Ala Arg Ser 325 330 335 Arg Arg Leu Phe Ser His Tyr Thr Cys Ala Thr Asp Thr Gln Asn Ile 340 345 350 Arg Lys Val Phe Lys Asp Val Arg Asp Ser Val Leu Ala Arg Tyr Leu 355 360 365 Asp Glu Ile Asn Leu Leu 370 <210> 134 <211> 948 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> human odorant receptor (OR3A1) <400> 134 atgcagccag aatctggggc caatggaaca gtcattgctg agttcatcct gctgggcttg 60 ctggaggcgc cagggctgca gccagttgtc tttgtgctct tcctctttgc ctacctggtc 120 acggtcaggg gcaacctcag catcctggca gctgtcttgg tggagcccaa actccacacc 180 cccatgtact tcttcctggg gaacctatca gtgctggatg ttgggtgcat cagcgtcact 240 gttccatcaa tgttgagtcg tctcctgtcc cgcaagcgtg cagttccctg tggggcctgc 300 cttacccagc tcttcttctt ccatctgttc gttggagtgg actgcttcct gctgaccgcc 360 atggcctatg accaattcct ggccatctgc cggcccctca cctacagcac ccgcatgagt 420 cagacagtcc agaggatgtt ggtggctgcg tcctgggctt gtgctttcac caacgcactg 480 acccacactg tggccatgtc cacgctcaac ttctgtggcc ccaatgtgat caatcacttc 540 tactgtgacc tcccacagct cttccagctc tcctgctcca gcacccaact caatgagctg 600 ctgctttttg ctgtgggttt tataatggca ggtaccccca tggctctcat tgtcatctcc 660 tatatccacg tggcagctgc agtcctgcga attcgctctg tagagggcag gaagaaagcc 720 ttctccacat gtggctccca cctcactgtg gttgccatat tctatggttc aggtatcttt 780 aactatatgc gactgggttc aaccaagctt tcagacaagg ataaagctgt tggaattttc 840 aacactgtca tcaatcccat gctgaaccca atcatctaca gcttcagaaa ccctgatgtg 900 cagagtgcca tctggaggat gctcacaggg aggcggtcac tggcttga 948 <210> 135 <211> 637 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> human odorant receptor (OR1D2) <400> 135 atggatggag gcaaccagag tgaaggttca gagttccttc tcctggggat gtcagagagt 60 cctgagcagc agcagatcct gttttggatg ttcctgtcca tgtacctggt cacggtggtg 120 ggaaatgtgc tcatcatcct ggccatcagc tctgattccc gcctgcacac ccccgtgtac 180 ttcttcctgg ccaacctctc cttcactgac ctcttctttg tcaccaacac aatccccaag 240 atgctggtga acctccagtc ccataacaaa gccatctcct atgcagggtg tctgacacag 300 ctctacttcc tggtctcctt ggtggccctg gacaacctca tcctggctgt gatggcatat 360 gaccgctatg tggccatctg ctgccccctc cactacacca cagccatgag ccctaagctc 420 tgtatcttac tcctttcctt gtgttgggtc ctatccgtcc tctatggcct catacacacc 480 ctcctcatga ccagagtgac cttctgtggg tcacgaaaaa tccactacat cttctgtgag 540 atgtatgtat tgctgaggat ggcatgttcc aacattcaga ttaatcacac agtgctgatt 600 gccacaggct gcttcatctt cctcattccc tttggat 637 <210> 136 <211> 151 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tag Sequence 1 (odorant) <400> 136 agggcgaatt ccagcacact ggcggccgtt actagtggat ccgagctcgg aggcaggtgg 60 acaggaaggt tctaatgttc ttaaggcaca ggaactggga catctgggcc cggaaagcct 120 ttttctctgt gatccggtac agtccttctg c 151 <210> 137 <211> 161 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tag Sequence 2 (G-alpha 15) <400> 137 agggcgaatt ccagcacact ggcggccgtt actagtggat ccgagctcgg taccaagctt 60 cgaggcaggt ggacagcttg gttctaatga agttaaccct gtcgttctgc gacatctggg 120 cccggaaagc gtttaactga tggatggaac agtccttctg c 161 <210> 138 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFTR Target Sequence 2 <400> 138 gaagttaacc ctgtcgttct gcgac 25 <210> 139 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFTR Signaling probe 2 <400> 139 gcgagtcgca gaacgacagg gttaacttcc tcgc 34

Claims (311)

  1. 단맛 수용체 T1R2 아단위 및/또는 단맛 수용체 T1R3 아단위를 내생적으로 발현하는 세포를 분리하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a. 세포 개체군을 제공하는 단계;
    b. T1R2의 발현을 검출하는 분자 표지를 세포 내로 도입하고 및/또는 T1R3의 발현을 검출하는 분자 표지를 세포 내로 도입하는 단계; 그리고
    c. 단맛 수용체 T1R2 아단위 및/또는 단맛 수용체 T1R3 아단위를 발현하는 세포를 분리하는 단계.
  2. 단맛 수용체 T1R2 아단위 및 단맛 수용체 T1R3 아단위를 내생적으로 발현하는 세포를 분리하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a. 세포 개체군을 제공하는 단계;
    b. T1R2의 발현을 검출하는 분자 표지를 세포 내로 도입하고, 그리고 T1R3의 발현을 검출하는 분자 표지를 세포 내로 도입하는 단계; 그리고
    c. 단맛 수용체 T1R2 아단위 및 단맛 수용체 T1R3 아단위를 발현하는 세포를 분리하는 단계.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 세포 개체군은 T1R2 또는 T1R3을 발현하는 것으로 공지되어 있지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 1 또는 2에 있어서, 분리된 세포에서 T1R2 또는 T1R3의 발현 수준은 세포 개체군의 평균 세포에서보다 적어도 10x, 50x, 100x, 250x, 500x, 750x, 1000x, 2500x, 5000x, 7500x, 10000x, 50000x, 또는 적어도 100000x 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 1 또는 2에 있어서, 세포 개체군에서 유전적 변이성은 분리 단계에 앞서 증가된 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 1 내지 5중 어느 한 항의 방법에 따라 산출된 분리된 세포.
  7. 단맛 수용체 T1R2 아단위 및/또는 단맛 수용체 T1R3 아단위를 내생적으로 발현하는 분리된 세포에 있어서, 분리된 세포는 세포 개체군으로부터 유래되고, 그리고 여기서 상기 분리된 세포에서 단맛 수용체 T1R2 아단위 및/또는 단맛 수용체 T1R3 아단위의 발현은 세포 개체군의 평균 세포에서보다 적어도 10x, 50x, 100x, 250x, 500x, 750x, 1000x, 2500x, 5000x, 7500x, 10000x, 50000x, 또는 적어도 100000x 높은 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  8. 청구항 7에 있어서, 세포 개체군은 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 확립된 뉴런 세포주, 크롬친화세포종, 신경아세포종 섬유아세포, 횡문근육종, 척수신경절 세포, NS0 세포, CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), L-세포, HEK-293 (ATCC CRL1573)과 PC12 (ATCC CRL-1721), HEK293T (ATCC CRL-11268), RBL (ATCC CRL-1378), SH-SY5Y (ATCC CRL-2266), MDCK (ATCC CCL-34), SJ-RH30 (ATCC CRL-2061), HepG2 (ATCC HB-8065), ND7/23 (ECACC 92090903), CHO (ECACC 85050302), Vero (ATCC CCL 81), Caco-2 (ATCC HTB 37), K562 (ATCC CCL 243), Jurkat (ATCC TIB-152), Per.C6 (Crucell, Leiden, The Netherlands), Huvec (ATCC 인간 일차 PCS 100-010, 생쥐 CRL 2514, CRL 2515, CRL 2516), HuH-7D12 (ECACC 01042712), 293 (ATCC CRL 10852), A549 (ATCC CCL 185), IMR-90 (ATCC CCL 186), MCF-7 (ATC HTB-22), U-2 OS (ATCC HTB-96), T84 (ATCC CCL 248), 일차 세포, 또는 영속화 세포의 개체군인 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  9. 청구항 7에 따른 세포의 배양액.
  10. 단맛 수용체 T1R2 아단위 및 단맛 수용체 T1R3 아단위를 포함하는 단맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포 또는 세포주에 있어서,
    적어도 하나의 아단위의 발현은 호스트 세포 내로 아단위를 인코딩하는 핵산의 도입, 또는 호스트 세포 내에 이미 존재하는 아단위를 인코딩하는 핵산의 유전자 활성화에 기인하고, 상기 세포 또는 세포주는 호스트 세포로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  11. 단맛 수용체 T1R2 아단위, 단맛 수용체 T1R3 아단위 및 G 단백질을 포함하는 단맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포 또는 세포주에 있어서,
    적어도 하나의 아단위 및 G 단백질의 발현은 호스트 세포 내로 아단위 또는 G 단백질을 인코딩하는 핵산의 도입, 또는 호스트 세포 내에 이미 존재하는 아단위 또는 G 단백질을 인코딩하는 핵산의 유전자 활성화에 기인하고, 상기 세포 또는 세포주는 호스트 세포로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  12. 청구항 10 또는 11에 있어서, 적어도 하나의 단맛 수용체 아단위는 호스트 세포 내로 도입되는 아단위를 인코딩하는 핵산으로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  13. 청구항 10 또는 11에 있어서, 적어도 하나의 단맛 수용체 아단위는 유전자 활성화에 의해, 호스트 세포 내에 존재하는 핵산으로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  14. 청구항 10 또는 11에 있어서, 호스트 세포는
    a) 진핵 세포이고;
    b) 포유동물 세포이고;
    c) 단맛 수용체 또는 감칠맛 수용체의 적어도 하나의 아단위 또는 G 단백질을 내생적으로 발현하지 않고; 또는
    d) a), b)와 c)의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  15. 청구항 10 또는 11에 있어서, 호스트 세포는 HEK-293 세포인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  16. 청구항 10 또는 11에 있어서, 단맛 수용체는
    a) 포유동물 유래이고;
    b) 인간 유래이고;
    c) 상이한 종으로부터 아단위를 포함하고;
    d) 키메라인 하나 이상의 아단위를 포함하고; 또는
    e) (a) - (d)의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  17. 청구항 10 또는 11에 있어서, 단맛 수용체는 기능적인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  18. 청구항 10 또는 11에 있어서, 분석에서 적어도 0.3의 Z' 값을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  19. 청구항 17에 있어서, 분석에서 적어도 0.7의 Z' 값을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  20. 청구항 10 또는 11에 있어서, 선별 압력의 부재에서 배양 배지에서 단맛 수용체를 안정적으로 발현하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  21. 청구항 10 또는 11에 있어서, 단맛 T1R2 수용체 아단위는
    a) 서열 번호 34의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 포함하는 단맛 수용체 아단위;
    b) 서열 번호 34의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열에 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단맛 수용체 아단위;
    c) 엄격한 조건 하에 서열 번호 31에 혼성화되는 핵산, 또는 서열 번호 34의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 단맛 수용체 아단위; 그리고
    d) 서열 번호 31에 적어도 85% 동일한 핵산, 또는 서열 번호 34의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 단맛 수용체 아단위로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  22. 청구항 10 또는 11에 있어서, 단맛 수용체 아단위 T1R2는
    a) 서열 번호 31을 포함하는 핵산:
    b) 서열 번호 34의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산;
    c) 엄격한 조건 하에 a) 또는 b)의 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 그리고
    d) 서열 번호 31에 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 또는 서열 번호 34의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산으로 구성된 군에서 선택되는 핵산에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  23. 청구항 10 또는 11에 있어서, 단맛 수용체 아단위 T1R3은
    a) 서열 번호 35의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 포함하는 단맛 수용체 아단위;
    b) 서열 번호 35의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열에 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단맛 수용체 아단위;
    c) 엄격한 조건 하에 서열 번호 32에 혼성화되는 핵산, 또는 서열 번호 35의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 단맛 수용체 아단위; 그리고
    d) 서열 번호 32에 적어도 85% 동일한 핵산, 또는 서열 번호 35의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 단맛 수용체 아단위로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  24. 청구항 10 또는 11에 있어서, 단맛 수용체 T1R3 아단위는
    a) 서열 번호 32를 포함하는 핵산;
    b) 서열 번호 35의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산;
    c) 엄격한 조건 하에 a) 또는 b)의 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 그리고
    d) 서열 번호 32에 적어도 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 또는 서열 번호 35의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산으로 구성된 군에서 선택되는 핵산에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  25. 청구항 11에 있어서, G 단백질은
    a) 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 포함하는 G 단백질;
    b) 서열 번호 36 또는 37 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열에 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 G 단백질;
    c) 엄격한 조건 하에 서열 번호 33에 혼성화되는 핵산, 또는 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 G 단백질; 그리고
    d) 서열 번호 33에 적어도 85% 동일한 핵산 서열, 또는 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 G 단백질로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  26. 청구항 11에 있어서, G 단백질은
    a) 서열 번호 33을 포함하는 핵산;
    b) 서열 번호 36 또는 37의 폴리펩티드 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산;
    c) 엄격한 조건 하에 a) 또는 b)의 핵산 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 그리고
    d) 서열 번호 33에 적어도 95% 서열 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 또는 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로 구성된 군에서 선택되는 핵산에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  27. 청구항 10 또는 11의 세포 또는 세포주를 생산하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 단맛 수용체 T1R2 아단위를 인코딩하는 핵산을 포함하는 첫 번째 벡터, 단맛 수용체 T1R3 아단위를 인코딩하는 핵산을 포함하는 두 번째 벡터, 그리고 선택적으로, G 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세 번째 벡터를 호스트 세포 내로 도입하는 단계;
    b) 단맛 수용체 T1R2 아단위의 발현을 검출하는 첫 번째 분자 표지, 단맛 수용체 T1R3 아단위의 발현을 검출하는 두 번째 분자 표지, 그리고 선택적으로, G 단백질의 발현을 검출하는 세 번째 분자 표지를 단계 a)에서 생산된 호스트 세포 내로 도입하는 단계; 그리고
    c) T1R2 아단위, T1R3 아단위, 그리고 선택적으로, G 단백질을 발현하는 세포를 분리하는 단계.
  28. 청구항 27에 있어서, 단계 c)에서 분리된 세포로부터 세포주를 산출하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 청구항 27에 있어서, 호스트 세포는
    a) 진핵 세포이고;
    b) 포유동물 세포이고;
    c) 단맛 수용체의 적어도 하나의 아단위 또는 G 단백질을 내생적으로 발현하지 않고; 또는
    d) a), b)와 c)의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 청구항 27에 있어서, 아래의 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 1 내지 4주, 1 내지 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간에서 선택되는 일정한 기간 동안 세포를 배양하는 단계;
    b) 이들 기간 동안 주기적으로 단맛 수용체 또는 이의 아단위의 발현을 평가하는 단계, 상기 발현은 RNA 또는 단백질 수준에서 평가되고; 그리고
    c) 1 내지 4주, 1 내지 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간에서 선택되는 일정한 기간 동안 단맛 수용체 또는 이의 아단위의 실질적으로 안정적인 발현으로 특징되는 세포 또는 세포주를 선별하는 단계.
  31. 청구항 27에 있어서, 아래의 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 1 내지 4주, 1 내지 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간에서 선택되는 일정한 기간 동안 세포를 배양하는 단계;
    b) 이들 기간 동안 주기적으로 단맛 수용체 또는 이의 아단위의 발현 수준을 측정하는 단계, 상기 발현은 RNA 또는 단백질 수준에서 평가되고; 그리고
    c) 1 내지 4주, 1 내지 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간에서 선택되는 일정한 기간 동안 단맛 수용체 또는 이의 아단위의 발현의 실질적으로 동일한 수준으로 특징되는 세포 또는 세포주를 선별하는 단계.
  32. 청구항 31에 있어서, 단맛 수용체의 단백질 발현 수준의 측정은 기능 분석을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 청구항 27에 있어서, T1R2 아단위는 청구항 12a) 내지 d)의 아단위로 구성된 군에서 선택되고, T1R3 아단위는 청구항 14a) 내지 d)의 아단위로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 G 단백질은 청구항 16a) 내지 d)의 단백질로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 청구항 27에 있어서, T1R2 아단위는 청구항 13a) 내지 d)의 핵산에 의해 인코딩된 아단위로 구성되는 군에서 선택되는 핵산에 의해 인코딩되고, T1R3 아단위는 청구항 15a) 내지 d)의 핵산에 의해 인코딩된 아단위로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 G 단백질은 청구항 17a) 내지 d)의 핵산에 의해 인코딩된 단백질로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 청구항 27에 있어서, 분리 단계는 형광 활성화된 세포 분류기를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 단맛 수용체 기능의 조절제를 확인하는 방법에 있어서, 청구항 6, 10 또는 11중 어느 한 항의 적어도 하나의 세포 또는 세포주를 적어도 하나의 검사 화합물에 노출시키는 단계, 그리고 단맛 수용체 기능에서 변화를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 청구항 35에 있어서, 조절제는 단맛 수용체 저해제, 단맛 수용체 길항약, 단맛 수용체 차단제, 단맛 수용체 활성제, 단맛 수용체 작동약 또는 단맛 수용체 강화제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 청구항 35에 있어서, 단맛 수용체는 인간 단맛 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 청구항 35에 있어서, 검사 화합물은 소형 분자, 화학적 모이어티, 폴리펩티드, 또는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 청구항 35에 있어서, 검사 화합물은 화합물의 라이브러리인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 청구항 40에 있어서, 라이브러리는 소형 분자 라이브러리, 조합 라이브러리, 펩티드 라이브러리 또는 항체 라이브러리인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 청구항 35에 있어서, 조절제는 단맛 수용체의 효소에 의해 변형된 형태에 대하여 선별적인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 청구항 35의 방법에 의해 확인된 조절제.
  44. 청구항 6, 10 또는 11중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 세포주는 1 내지 4주, 1 내지 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간에서 선택되는 기간 동안 단맛 수용체의 실질적으로 안정적인 발현으로 특징되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  45. 청구항 6, 10 또는 11중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 세포주는 1 내지 4주, 1 내지 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간에서 선택되는 기간 동안 단맛 수용체의 발현의 실질적으로 동일한 수준으로 특징되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  46. 청구항 45에 있어서, 발현 수준은 기능 분석을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  47. 청구항 6, 10 또는 11중 어느 한 항에 있어서, 청구항 27 내지 35중 어느 한 항의 방법에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  48. 청구항 10 또는 11의 세포 또는 세포주를 생산하는 방법에 있어서, 상기 세포는 시간의 흐름 동안 일정한 적어도 하나의 원하는 특성을 갖고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 단맛 수용체의 아단위 및 선택적으로, G 단백질을 인코딩하는 mRNA를 발현하는 복수의 세포를 제공하는 단계;
    b) 이들 세포를 개별 배양 용기 내로 개별적으로 분산시켜 복수의 별개의 세포 배양액을 제공하는 단계;
    c) 자동화 세포 배양 방법을 이용하여 일단의 원하는 배양 조건 하에 이들 세포를 배양하는 단계, 이들 조건은 별개의 세포 배양액 각각에 대하여 실질적으로 동일한 것으로 특징되고, 이러한 배양 기간 동안 각각의 별개의 세포 배양액에서 웰당 세포의 숫자가 표준화되고, 그리고 이들 별개의 배양액은 동일한 일정에서 계대배양되고;
    d) 단맛 수용체 또는 상기 수용체를 생산하는 세포의 적어도 하나의 원하는 특징에 대하여 별개의 세포 배양액을 적어도 2회 평가하는 단계; 그리고
    e) 양쪽 분석에서 원하는 특징을 갖는 별개의 세포 배양액을 확인하는 단계.
  49. 단맛 수용체를 생산하고 시간의 흐름 동안 일정한 적어도 하나의 원하는 특성을 갖는 세포 또는 세포주에 있어서, 청구항 48의 방법에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  50. 감칠맛 수용체 T1R1 아단위 및 감칠맛 수용체 T1R3 아단위를 포함하는 감칠맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포 또는 세포주에 있어서,
    적어도 하나의 아단위의 발현은 호스트 세포 내로 아단위를 인코딩하는 핵산의 도입, 또는 호스트 세포 내에 이미 존재하는 아단위를 인코딩하는 핵산의 유전자 활성화에 기인하고, 상기 세포 또는 세포주는 호스트 세포로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  51. 감칠맛 수용체 T1R1 아단위, 감칠맛 수용체 T1R3 아단위 및 G 단백질을 포함하는 감칠맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포 또는 세포주에 있어서,
    적어도 하나의 아단위 및 G 단백질의 발현은 호스트 세포 내로 아단위 또는 G 단백질을 인코딩하는 핵산의 도입, 또는 호스트 세포 내에 이미 존재하는 아단위 또는 G 단백질을 인코딩하는 핵산의 유전자 활성화에 기인하고, 상기 세포 또는 세포주는 호스트 세포로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  52. 청구항 50 또는 51에 있어서, 적어도 하나의 감칠맛 수용체 아단위는 호스트 세포 내로 도입되는 아단위를 인코딩하는 핵산으로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  53. 청구항 50 또는 51에 있어서, 적어도 하나의 감칠맛 수용체 아단위는 유전자 활성화에 의해, 호스트 세포 내에 존재하는 핵산으로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  54. 청구항 50 또는 51에 있어서, 호스트 세포는
    a) 진핵 세포이고;
    b) 포유동물 세포이고;
    c) 감칠맛 수용체의 적어도 하나의 아단위 또는 G 단백질을 내생적으로 발현하지 않고; 또는
    d) a), b)와 c)의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  55. 청구항 50 또는 51에 있어서, 호스트 세포는 HEK-293 세포인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  56. 청구항 50 또는 51에 있어서, 감칠맛 수용체는
    a) 포유동물 유래이고;
    b) 인간 유래이고;
    c) 상이한 종으로부터 아단위를 포함하고;
    d) 키메라인 하나 이상의 아단위를 포함하고; 또는
    e) (a) - (d)의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  57. 청구항 50 또는 51에 있어서, 감칠맛 수용체는 기능적인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  58. 청구항 50 또는 51에 있어서, 분석에서 적어도 0.3의 Z' 값을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  59. 청구항 58에 있어서, 분석에서 적어도 0.7의 Z' 값을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  60. 청구항 50 또는 51에 있어서, 선별 압력의 부재에서 배양 배지에서 감칠맛 수용체를 안정적으로 발현하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  61. 청구항 50 또는 51에 있어서, 감칠맛 T1R1 수용체 아단위는
    a) 서열 번호 42-45 및 다른 종의 대응물 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 감칠맛 수용체 아단위;
    b) 서열 번호 42-45 및 다른 종의 대응물 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 감칠맛 수용체 아단위;
    c) 엄격한 조건 하에 서열 번호 41에 혼성화되는 핵산, 또는 서열 번호 42-45 및 다른 종의 대응물 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 감칠맛 수용체 아단위; 그리고
    d) 서열 번호 41에 적어도 85% 동일한 핵산, 또는 서열 번호 42-45 및 다른 종의 대응물 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 감칠맛 수용체 아단위로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  62. 청구항 50 또는 51에 있어서, 감칠맛 수용체 아단위 T1R1은
    a) 서열 번호 41을 포함하는 핵산:
    b) 서열 번호 42-45 및 다른 종의 대응물 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산;
    c) 엄격한 조건 하에 a) 또는 b)의 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 그리고
    d) 서열 번호 41에 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 또는 서열 번호 42-45 및 다른 종의 대응물 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산으로 구성된 군에서 선택되는 핵산에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  63. 청구항 50 또는 51에 있어서, 감칠맛 수용체 아단위 T1R3은
    a) 서열 번호 35의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 포함하는 감칠맛 수용체 아단위;
    b) 서열 번호 35의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열에 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 감칠맛 수용체 아단위;
    c) 엄격한 조건 하에 서열 번호 32에 혼성화되는 핵산, 또는 서열 번호 35의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 감칠맛 수용체 아단위; 그리고
    d) 서열 번호 32에 적어도 85% 동일한 핵산, 또는 서열 번호 35의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 감칠맛 수용체 아단위로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  64. 청구항 50 또는 51에 있어서, 감칠맛 수용체 T1R3 아단위는
    a) 서열 번호 32를 포함하는 핵산;
    b) 서열 번호 35의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산;
    c) 엄격한 조건 하에 a) 또는 b)의 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 그리고
    d) 서열 번호 32에 적어도 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 또는 서열 번호 35의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산으로 구성된 군에서 선택되는 핵산에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  65. 청구항 51에 있어서, G 단백질은
    a) 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 서열 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 포함하는 G 단백질;
    b) 서열 번호 36 또는 37 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열에 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 G 단백질;
    c) 엄격한 조건 하에 서열 번호 33에 혼성화되는 핵산, 또는 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 G 단백질; 그리고
    d) 서열 번호 33에 적어도 85% 동일한 핵산 서열, 또는 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 G 단백질로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  66. 청구항 51에 있어서, G 단백질은
    a) 서열 번호 33 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 포함하는 핵산;
    b) 서열 번호 36 또는 37의 폴리펩티드 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산;
    c) 엄격한 조건 하에 a) 또는 b)의 핵산 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 그리고
    d) 서열 번호 33에 적어도 95% 서열 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 또는 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 또는 다른 종의 대응물 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로 구성된 군에서 선택되는 핵산에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  67. 청구항 50 또는 51의 세포 또는 세포주를 생산하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 감칠맛 수용체 T1R1 아단위를 인코딩하는 핵산을 포함하는 첫 번째 벡터, 감칠맛 수용체 T1R3 아단위를 인코딩하는 핵산을 포함하는 두 번째 벡터, 그리고 선택적으로, G 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세 번째 벡터를 호스트 세포 내로 도입하는 단계;
    b) 감칠맛 수용체 T1R1 아단위의 발현을 검출하는 첫 번째 분자 표지, 감칠맛 수용체 T1R3 아단위의 발현을 검출하는 두 번째 분자 표지, 그리고 선택적으로, G 단백질의 발현을 검출하는 세 번째 분자 표지를 단계 a)에서 생산된 호스트 세포 내로 도입하는 단계; 그리고
    c) T1R1 아단위, T1R3 아단위, 그리고 선택적으로, G 단백질을 발현하는 세포를 분리하는 단계.
  68. 청구항 [0207]에 있어서, 단계 c)에서 분리된 세포로부터 세포주를 산출하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 청구항 [0207]에 있어서, 호스트 세포는
    a) 진핵 세포이고;
    b) 포유동물 세포이고;
    c) 감칠맛 수용체의 적어도 하나의 아단위 또는 G 단백질을 내생적으로 발현하지 않고; 또는
    d) a), b)와 c)의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 청구항 [0207]에 있어서, 아래의 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 1 내지 4주, 1 내지 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간에서 선택되는 일정한 기간 동안 세포를 배양하는 단계;
    b) 이들 기간 동안 주기적으로 감칠맛 수용체 또는 이의 아단위의 발현을 평가하는 단계, 상기 발현은 RNA 또는 단백질 수준에서 평가되고; 그리고
    c) 1 내지 4주, 1 내지 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간에서 선택되는 일정한 기간 동안 감칠맛 수용체 또는 이의 아단위의 실질적으로 안정적인 발현으로 특징되는 세포 또는 세포주를 선별하는 단계.
  71. 청구항 [0207]에 있어서, 아래의 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 1 내지 4주, 1 내지 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간에서 선택되는 일정한 기간 동안 세포를 배양하는 단계;
    b) 이들 기간 동안 주기적으로 감칠맛 수용체 또는 이의 아단위의 발현 수준을 측정하는 단계, 상기 발현은 RNA 또는 단백질 수준에서 평가되고; 그리고
    c) 1 내지 4주, 1 내지 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간에서 선택되는 일정한 기간 동안 감칠맛 수용체 또는 이의 아단위의 발현의 실질적으로 동일한 수준으로 특징되는 세포 또는 세포주를 선별하는 단계.
  72. 청구항 71에 있어서, 감칠맛 수용체의 단백질 발현 수준의 측정은 기능 분석을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 청구항 [0207]에 있어서, T1R1 아단위는 청구항 12a) 내지 d)의 아단위로 구성된 군에서 선택되고, T1R3 아단위는 청구항 14a) 내지 d)의 아단위로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 G 단백질은 청구항 16a) 내지 d)의 단백질로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 청구항 [0207]에 있어서, T1R1 아단위는 청구항 13a) 내지 d)의 핵산에 의해 인코딩된 아단위로 구성되는 군에서 선택되는 핵산에 의해 인코딩되고, T1R3 아단위는 청구항 15a) 내지 d)의 핵산에 의해 인코딩된 아단위로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 G 단백질은 청구항 17a) 내지 d)의 핵산에 의해 인코딩된 단백질로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 청구항 [0207]에 있어서, 분리 단계는 형광 활성화된 세포 분류기를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 감칠맛 수용체 기능의 조절제를 확인하는 방법에 있어서, 청구항 50 또는 51의 적어도 하나의 세포 또는 세포주를 적어도 하나의 검사 화합물에 노출시키는 단계, 그리고 감칠맛 수용체 기능에서 변화를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 청구항 [0213]에 있어서, 조절제는 감칠맛 수용체 저해제, 감칠맛 수용체 길항약, 감칠맛 수용체 차단제, 감칠맛 수용체 활성제, 감칠맛 수용체 작동약 또는 감칠맛 수용체 강화제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 청구항 [0213]에 있어서, 감칠맛 수용체는 인간 감칠맛 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 청구항 [0213]에 있어서, 검사 화합물은 소형 분자, 화학적 모이어티, 폴리펩티드, 또는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 청구항 [0213]에 있어서, 검사 화합물은 화합물의 라이브러리인 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 청구항 80에 있어서, 라이브러리는 소형 분자 라이브러리, 조합 라이브러리, 펩티드 라이브러리 또는 항체 라이브러리인 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 청구항 [0213]에 있어서, 조절제는 감칠맛 수용체의 효소에 의해 변형된 형태에 대하여 선별적인 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 청구항 [0213]의 방법에 의해 확인된 조절제.
  84. 청구항 50 또는 51에 있어서, 세포 또는 세포주는 1 내지 4주, 1 내지 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간에서 선택되는 기간 동안 감칠맛 수용체의 실질적으로 안정적인 발현으로 특징되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  85. 청구항 50 또는 51에 있어서, 세포 또는 세포주는 1 내지 4주, 1 내지 9개월, 또는 그 사이에 임의의 기간에서 선택되는 기간 동안 감칠맛 수용체의 발현의 실질적으로 동일한 수준으로 특징되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  86. 청구항 85에 있어서, 발현 수준은 기능 분석을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  87. 청구항 50 또는 51에 있어서, 청구항 18 내지 26중 어느 한 항의 방법에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  88. 청구항 50 또는 51의 세포 또는 세포주를 생산하는 방법에 있어서, 상기 세포는 시간의 흐름 동안 일정한 적어도 하나의 원하는 특성을 갖고, 상기 방법은 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 감칠맛 수용체의 아단위 및 선택적으로, G 단백질을 인코딩하는 mRNA를 발현하는 복수의 세포를 제공하는 단계;
    b) 이들 세포를 개별 배양 용기 내로 개별적으로 분산시켜 복수의 별개의 세포 배양액을 제공하는 단계;
    c) 자동화 세포 배양 방법을 이용하여 일단의 원하는 배양 조건 하에 이들 세포를 배양하는 단계, 이들 조건은 별개의 세포 배양액 각각에 대하여 실질적으로 동일한 것으로 특징되고, 이러한 배양 기간 동안 각각의 별개의 세포 배양액에서 웰당 세포의 숫자가 표준화되고, 그리고 이들 별개의 배양액은 동일한 일정에서 계대배양되고;
    d) 감칠맛 수용체 또는 상기 수용체를 생산하는 세포의 적어도 하나의 원하는 특징에 대하여 별개의 세포 배양액을 적어도 2회 평가하는 단계; 그리고
    e) 양쪽 분석에서 원하는 특징을 갖는 별개의 세포 배양액을 확인하는 단계.
  89. 감칠맛 수용체를 생산하고 시간의 흐름 동안 일정한 적어도 하나의 원하는 특성을 갖는 세포 또는 세포주에 있어서, 청구항 88의 방법에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  90. 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하도록 조작된 세포 또는 세포주.
  91. 청구항 90에 있어서, 쓴맛 수용체는 세포 또는 세포주 내로 도입된 핵산으로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  92. 청구항 90에 있어서, 쓴맛 수용체는 조작된 유전자 활성화에 의해 내생적 핵산으로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  93. 청구항 90에 있어서, 적어도 하나의 다른 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  94. 청구항 93에 있어서, 적어도 하나의 다른 쓴맛 수용체가 내생적으로 발현되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  95. 청구항 93에 있어서, 적어도 하나의 다른 쓴맛 수용체가 세포 또는 세포주 내로 도입된 핵산으로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  96. 청구항 95에 있어서, 쓴맛 수용체 및 적어도 하나의 다른 쓴맛 수용체는 세포 또는 세포주 내로 도입된 별개의 핵산으로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  97. 청구항 95에 있어서, 쓴맛 수용체 및 적어도 하나의 다른 쓴맛 수용체는 둘 모두, 세포 또는 세포주 내로 도입된 단일 핵산으로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  98. 청구항 90에 있어서, 세포 또는 세포주는
    a. 내생적 G 단백질;
    b. 이종기원 G 단백질 또는
    c. 둘 모두를 안정적으로 발현하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  99. 청구항 98에 있어서, G 단백질은 3개의 상이한 아단위를 포함하는 이종다합체성 G 단백질이고, 그리고 여기서 적어도 2개의 상이한 아단위가 세포 또는 세포주 내로 도입된 상이한 핵산으로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  100. 청구항 98에 있어서, G 단백질은 3개의 상이한 아단위를 포함하는 이종다합체성 G 단백질이고, 그리고 여기서 이들 3개의 상이한 아단위 모두 세포 또는 세포주 내로 도입된 동일한 핵산으로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  101. 청구항 90에 있어서, 세포 또는 세포주 내에 세포는
    a) 진핵 세포;
    b) 포유동물 세포;
    c) 내생적 쓴맛 수용체를 발현하지 않는 세포; 또는
    d) a), b)와 c)의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  102. 청구항 90에 있어서, 세포 또는 세포주 내에 세포는 인간 배아 신장 293T 세포인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  103. 청구항 90에 있어서, 쓴맛 수용체는
    a) 포유동물 유래이고;
    b) 인간 유래이고;
    c) 아미노 말단 또는 카르복실 말단에서 폴리펩티드 태그를 보유하지 않고; 또는
    d) (a), (b)와 (c)의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  104. 청구항 90에 있어서, 세포 또는 세포주는 세포-기초된 분석, 형광 세포-기초된 분석, 고처리량 스크리닝 분석, 리포터 세포-기초된 분석, G 단백질 매개된 세포-기초된 분석, 그리고 칼슘 유동 세포-기초된 분석으로 구성된 군에서 선택되는 분석에서 적어도 0.45의 Z' 값을 산출하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  105. 청구항 90에 있어서, 세포 또는 세포주는 세포-기초된 분석, 형광 세포-기초된 분석, 고처리량 스크리닝 분석, 리포터 세포-기초된 분석, G 단백질 매개된 세포-기초된 분석, 그리고 칼슘 유동 세포-기초된 분석으로 구성된 군에서 선택되는 분석에서 적어도 0.5의 Z' 값을 산출하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  106. 청구항 90에 있어서, 세포 또는 세포주는 세포-기초된 분석, 형광 세포-기초된 분석, 고처리량 스크리닝 분석, 리포터 세포-기초된 분석, G 단백질 매개된 세포-기초된 분석, 그리고 칼슘 유동 세포-기초된 분석으로 구성된 군에서 선택되는 분석에서 적어도 0.6의 Z' 값을 산출하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  107. 청구항 90에 있어서, 세포 또는 세포주는 적어도 2주, 적어도 4주, 적어도 6주, 적어도 3개월, 적어도 6개월 및 적어도 9개월로 구성된 군에서 선택되는 기간 동안 항생제가 없는 배양 배지에서 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  108. 청구항 90에 있어서, 쓴맛 수용체는
    a) 서열 번호 77-101 중에서 한 가지;
    b) 서열 번호 77-101 중에서 한 가지의 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열;
    c) 엄격한 조건 하에 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 역-보체 서열을 포함하는 핵산에 혼성화되는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열; 그리고
    d) 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 대립형질 변이체인 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  109. 청구항 90에 있어서, 쓴맛 수용체는
    a) 서열 번호 51-75 중에서 한 가지;
    b) 서열 번호 51-75 중에서 한 가지에 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열;
    c) 엄격한 조건 하에 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 역-보체 서열을 포함하는 핵산에 혼성화되는 핵산의 서열; 그리고
    d) 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 대립형질 변이체인 핵산의 서열로 구성된 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  110. 청구항 90에 있어서, 쓴맛 수용체는 기능적 쓴맛 수용체인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  111. 청구항 90에 있어서, 이소프로테레놀과 접촉될 때, 세포내 유리 칼슘 (free calcium)의 농도가 변하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  112. 청구항 111에 있어서, 이소프로테레놀은 세포 또는 세포주로 수행된 용량 반응 곡선에서 대략 1 nM 내지 대략 20 nM의 EC50 값을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  113. 청구항 90에 있어서, 1 이상의 신호 대 잡음 비율을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포주.
  114. 청구항 90의 세포 또는 세포주의 수집물 (collection)에 있어서, 2개 이상의 세포 또는 세포주를 포함하고, 각각의 세포 또는 세포주는 상이한 쓴맛 수용체 또는 이의 대립형질 변이체를 안정적으로 발현하는 것을 특징으로 하는 수집물.
  115. 청구항 114에 있어서, 공지된 리간드를 갖는 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하도록 조작된 세포 또는 세포주를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 수집물.
  116. 청구항 1114에 있어서, 대립형질 변이체는 단일-뉴클레오티드 다형체 (SNP)인 것을 특징으로 하는 수집물.
  117. 청구항 114에 있어서, 각각의 세포 또는 세포주는 이소프로테레놀과 접촉될 때 세포내 유리 칼슘의 농도가 변하는 것을 특징으로 하는 수집물.
  118. 청구항 117에 있어서, 이소프로테레놀은 각각의 세포 또는 세포주로 수행된 용량 반응 곡선에서 1 nM 내지 20 nM의 EC50 값을 갖는 것을 특징으로 하는 수집물.
  119. 청구항 114에 있어서, 세포 또는 세포주는 병렬 처리를 가능하게 하는 동일한 생리학적 특성을 공유하도록 정합되는 것을 특징으로 하는 수집물.
  120. 청구항 119에 있어서, 생리학적 특성은 성장 속도인 것을 특징으로 하는 수집물.
  121. 청구항 119에 있어서, 생리학적 특성은 조직 배양액 표면에 부착인 것을 특징으로 하는 수집물.
  122. 청구항 119에 있어서, 생리학적 특성은 Z' 인자인 것을 특징으로 하는 수집물.
  123. 청구항 119에 있어서, 생리학적 특성은 쓴맛 수용체의 발현 수준인 것을 특징으로 하는 수집물.
  124. 청구항 90에 있어서, 수집물은 2개 이상의 세포 또는 세포주를 포함하고, 각각의 세포 또는 세포주는 동일한 쓴맛 수용체 또는 이의 대립형질 변이체를 안정적으로 발현하는 것을 특징으로 하는 수집물.
  125. 청구항 124에 있어서, 공지된 리간드를 갖는 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하도록 조작된 세포 또는 세포주를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 수집물.
  126. 청구항 124에 있어서, 대립형질 변이체는 단일-뉴클레오티드 다형체 (SNP)인 것을 특징으로 하는 수집물.
  127. 청구항 124에 있어서, 각각의 세포 또는 세포주는 이소프로테레놀과 접촉될 때 세포내 유리 칼슘의 농도가 변하는 것을 특징으로 하는 수집물.
  128. 청구항 127에 있어서, 이소프로테레놀은 각각의 세포 또는 세포주로 수행된 용량 반응 곡선에서 1 nM 내지 20 nM의 EC50 값을 갖는 것을 특징으로 하는 수집물.
  129. 청구항 124에 있어서, 세포 또는 세포주는 병렬 처리를 가능하게 하는 동일한 생리학적 특성을 공유하도록 정합되는 것을 특징으로 하는 수집물.
  130. 청구항 129에 있어서, 생리학적 특성은 성장 속도인 것을 특징으로 하는 수집물.
  131. 청구항 129에 있어서, 생리학적 특성은 조직 배양액 표면에 부착인 것을 특징으로 하는 수집물.
  132. 청구항 129에 있어서, 생리학적 특성은 Z' 인자인 것을 특징으로 하는 수집물.
  133. 청구항 129에 있어서, 생리학적 특성은 쓴맛 수용체의 발현 수준인 것을 특징으로 하는 수집물.
  134. 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포를 생산하는 방법에 있어서,
    a) 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산을 복수의 세포 내로 도입하는 단계;
    b) 쓴맛 수용체의 발현을 검출하는 분자 표지를 단계 (a)에서 제공된 복수의 세포 내로 도입하는 단계; 그리고
    c) 쓴맛 수용체를 발현하는 세포를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  135. 청구항 134에 있어서, 단계 (c)에서 분리된 세포로부터 세포주를 산출하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  136. 청구항 135에 있어서, 산출된 세포주는 적어도 2주, 적어도 4주, 적어도 6주, 적어도 3개월, 적어도 6개월 및 적어도 9개월로 구성된 군에서 선택되는 기간 동안 항생제가 없는 배양 배지에서 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  137. 청구항 134에 있어서, 세포는
    a) 진핵 세포;
    b) 포유동물 세포;
    c) 내생적 쓴맛 수용체를 발현하지 않는 세포; 또는
    d) a), b)와 c)의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  138. 청구항 134에 있어서, 세포는 인간 배아 신장 293T 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  139. 청구항 134에 있어서, 쓴맛 수용체는
    a) 포유동물 유래이고;
    b) 인간 유래이고;
    c) 아미노 말단 또는 카르복실 말단에서 폴리펩티드 태그를 보유하지 않고; 또는
    d) (a), (b)와 (c)의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  140. 청구항 134에 있어서, 쓴맛 수용체는
    a) 서열 번호 77-101 중에서 한 가지;
    b) 서열 번호 77-101 중에서 한 가지의 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열;
    c) 엄격한 조건 하에 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 역-보체 서열을 포함하는 핵산에 혼성화되는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열; 그리고
    d) 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 대립형질 변이체인 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  141. 청구항 134에 있어서, 쓴맛 수용체는
    a) 서열 번호 51-75 중에서 한 가지;
    b) 서열 번호 51-75 중에서 한 가지에 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열;
    c) 엄격한 조건 하에 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 역-보체 서열을 포함하는 핵산에 혼성화되는 핵산의 서열; 그리고
    d) 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 대립형질 변이체인 핵산의 서열로 구성된 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  142. 청구항 134에 있어서, 쓴맛 수용체는 기능적 쓴맛 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
  143. 청구항 134에 있어서, 단계 (c)에서 분리된 세포는 이소프로테레놀과 접촉될 때, 세포내 유리 칼슘 (free calcium)의 농도가 변하는 것을 특징으로 하는 방법.
  144. 청구항 143에 있어서, 이소프로테레놀은 세포로 수행된 용량 반응 곡선에서 1 nM 내지 20 nM의 EC50 값을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  145. 청구항 134에 있어서, 분리 단계는 형광 활성화된 세포 분류기를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  146. 청구항 134에 있어서, 세포는 내생적 G 단백질, 이종기원 G 단백질, 또는 둘 모두를 안정적으로 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  147. 청구항 134에 있어서,
    a) 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산을 도입하기 이전에;
    b) 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산을 도입한 이후에; 또는
    c) 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산을 도입하는 것과 동시에, G 단백질을 인코딩하는 핵산을 세포 내로 도입하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  148. 청구항 134에 있어서, 쓴맛 수용체를 인코딩하는 핵산 및 G 단백질을 인코딩하는 핵산은 단일 벡터 상에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  149. 청구항 58에 있어서,
    a) 쓴맛 수용체의 발현을 검출하는 분자 표지를 도입하기 이전에;
    b) 쓴맛 수용체의 발현을 검출하는 분자 표지를 도입한 이후에; 또는
    c) 쓴맛 수용체의 발현을 검출하는 분자 표지를 도입하는 것과 동시에, G 단백질의 발현을 검출하는 분자 표지를 세포 내로 도입하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  150. 청구항 149에 있어서, 쓴맛 수용체의 발현을 검출하는 분자 표지 및 G 단백질의 발현을 검출하는 분자 표지는 상이한 분자 표지인 것을 특징으로 하는 방법.
  151. 청구항 58에 있어서,
    a) 쓴맛 수용체를 발현하는 세포를 분리하기 이전에;
    b) 쓴맛 수용체를 발현하는 세포를 분리한 이후에; 또는
    c) 쓴맛 수용체를 발현하는 세포를 분리하는 것과 동시에, G 단백질을 발현하는 세포를 분리하고, 따라서 쓴맛 수용체와 G 단백질을 모두 발현하는 세포를 분리하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  152. 쓴맛 수용체 기능의 조절제를 확인하는 방법에 있어서,
    a) 쓴맛 수용체를 안정적으로 발현하는 세포 또는 세포주를 검사 화합물에 노출시키는 단계; 그리고
    b) 쓴맛 수용체의 기능에서 변화를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  153. 청구항 152에 있어서, 검출 단계는 세포내 유리 칼슘을 측정하는 분석법을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  154. 청구항 153에 있어서, 세포내 유리 칼슘은 하나 이상의 칼슘-민감성 형광 염료, 형광 현미경, 그리고 선택적으로, 형광 평판 판독기를 이용하여 측정되고, 여기서 적어도 하나의 형광 염료가 유리 칼슘에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  155. 청구항 153에 있어서, 세포내 유리 칼슘은 하나 이상의 칼슘-민감성 형광 염료를 이용한 실시간 영상법 (real-time imaging)으로 모니터링되고, 여기서 적어도 하나의 형광 염료가 유리 칼슘에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  156. 청구항 152에 있어서, 세포 또는 세포주 내에 세포는
    a) 진핵 세포;
    b) 포유동물 세포;
    c) 내생적 쓴맛 수용체를 발현하지 않는 세포; 또는
    d) a), b)와 c)의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  157. 청구항 152에 있어서, 세포 또는 세포주 내에 세포는 인간 배아 신장 293T 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  158. 청구항 152에 있어서, 쓴맛 수용체는
    a) 포유동물 유래이고;
    b) 인간 유래이고;
    c) 아미노 말단 또는 카르복실 말단에서 폴리펩티드 태그를 보유하지 않고; 또는
    d) (a), (b)와 (c)의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  159. 청구항 152에 있어서, 쓴맛 수용체는
    a) 서열 번호 77-101 중에서 한 가지;
    b) 서열 번호 77-101 중에서 한 가지의 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열;
    c) 엄격한 조건 하에 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 역-보체 서열을 포함하는 핵산에 혼성화되는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열; 그리고
    d) 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 대립형질 변이체인 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  160. 청구항 152에 있어서, 쓴맛 수용체는
    a) 서열 번호 51-75 중에서 한 가지;
    b) 서열 번호 51-75 중에서 한 가지에 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열;
    c) 엄격한 조건 하에 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 역-보체 서열을 포함하는 핵산에 혼성화되는 핵산의 서열; 그리고
    d) 서열 번호 51-75 중에서 한 가지의 대립형질 변이체인 핵산의 서열로 구성된 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  161. 청구항 152에 있어서, 세포 또는 세포주는 이소프로테레놀과 접촉될 때, 세포내 유리 칼슘 (free calcium)의 농도가 변하는 것을 특징으로 하는 방법.
  162. 청구항 161에 있어서, 이소프로테레놀은 세포 또는 세포주로 수행된 용량 반응 곡선에서 1 nM 내지 20 nM의 EC50 값을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  163. 청구항 152에 있어서, 검사 화합물은 쓴맛 수용체 저해제인 것을 특징으로 하는 방법.
  164. 청구항 163에 있어서, 세포 또는 세포주를 검사 화합물에 노출시키는 단계 이전에 또는 이러한 단계와 동시에, 상기 세포 또는 세포주를 쓴맛 수용체의 공지된 작동약에 노출시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  165. 청구항 152에 있어서, 검사 화합물은 쓴맛 수용체 작동약인 것을 특징으로 하는 방법.
  166. 청구항 165에 있어서, 세포 또는 세포주를 검사 화합물에 노출시키는 단계 이전에 또는 이러한 단계와 동시에, 상기 세포 또는 세포주를 쓴맛 수용체의 공지된 저해제에 노출시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  167. 청구항 152에 있어서, 검사 화합물은 소형 분자, 화학적 모이어티, 폴리펩티드, 항체, 또는 식품 추출물인 것을 특징으로 하는 방법.
  168. 쓴맛 수용체 기능의 조절제를 확인하는 방법에 있어서,
    a) 세포주의 수집물을 상이한 검사 화합물의 라이브러리에 노출시키는 단계, 여기서 세포주의 수집물은 2개 이상의 세포주를 포함하고, 각 세포주는 동일한 쓴맛 수용체 또는 이의 대립형질 변이체를 안정적으로 발현하고, 그리고 여기서 각 세포주는 라이브러리 내에 하나 이상의 검사 화합물에 노출되고; 그리고
    b) 각 세포주에 의해 안정적으로 발현되는 쓴맛 수용체 또는 이의 대립형질 변이체의 기능에서 변화를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  169. 청구항 168에 있어서, 검출 단계는 세포내 유리 칼슘을 측정하거나 모니터링하는 분석법을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  170. 청구항 169에 있어서, 세포내 유리 칼슘은 하나 이상의 칼슘-민감성 형광 염료, 형광 현미경, 그리고 선택적으로 형광 평판 판독기를 이용하여 측정되고, 여기서 적어도 하나의 형광 염료가 유리 칼슘에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  171. 청구항 169에 있어서, 세포내 유리 칼슘은 하나 이상의 칼슘-민감성 형광 염료를 이용한 실시간 영상법에 의해 모니터링되고, 여기서 적어도 하나의 형광 염료가 유리 칼슘에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  172. 청구항 168에 있어서, 라이브러리는 소형 분자 라이브러리, 조합 라이브러리, 펩티드 라이브러리, 또는 항체 라이브러리인 것을 특징으로 하는 방법.
  173. 청구항 168에 있어서, 검사 화합물은 소형 분자, 화학적 모이어티, 폴리펩티드, 항체, 그리고 식품 추출물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  174. 청구항 168에 있어서, 단계 (a) 이전에 또는 단계 (a)와 동시에, 세포주의 수집물을 공지된 쓴맛 수용체 작동약 또는 저해제에 노출시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  175. 쓴맛 수용체 기능의 조절제를 확인하는 방법에 있어서,
    a) 세포주의 수집물을 검사 화합물에 노출시키는 단계, 여기서 세포주의 수집물은 2개 이상의 세포주를 포함하고, 각 세포주는 상이한 쓴맛 수용체 또는 이의 대립형질 변이체를 안정적으로 발현하고; 그리고
    b) 각 세포주에 의해 안정적으로 발현되는 쓴맛 수용체의 기능에서 변화를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  176. 청구항 175에 있어서, 검출 단계는 세포내 유리 칼슘을 측정하거나 모니터링하는 분석법을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  177. 청구항 176에 있어서, 세포내 유리 칼슘은 하나 이상의 칼슘-민감성 형광 염료, 형광 현미경, 그리고 선택적으로 형광 평판 판독기를 이용하여 측정되고, 여기서 적어도 하나의 형광 염료가 유리 칼슘에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  178. 청구항 176에 있어서, 세포내 유리 칼슘은 하나 이상의 칼슘-민감성 형광 염료를 이용한 실시간 영상법에 의해 모니터링되고, 여기서 적어도 하나의 형광 염료가 유리 칼슘에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  179. 청구항 175에 있어서, 검사 화합물은 소형 분자, 화학적 모이어티, 폴리펩티드, 항체, 그리고 식품 추출물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  180. 청구항 175에 있어서, 단계 (a) 이전에 또는 단계 (a)와 동시에, 세포주의 수집물을 공지된 쓴맛 수용체 작동약 또는 저해제에 노출시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  181. 쓴맛 수용체를 시간의 흐름 동안 일정한 수준에서 안정적으로 발현하도록 조작된 세포에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 방법에 의해 만들어지는 것을 특징으로 하는 조작된 세포:
    a) 쓴맛 수용체를 인코딩하는 mRNA를 발현하는 복수의 세포를 제공하는 단계;
    b) 이들 세포를 개별 배양 용기 내로 개별적으로 분산시켜 복수의 별개의 세포 배양액을 제공하는 단계;
    c) 자동화 세포 배양 방법을 이용하여 일단의 원하는 배양 조건 하에 이들 세포를 배양하는 단계, 이들 조건은 별개의 세포 배양액 각각에 대하여 실질적으로 동일한 것으로 특징되고, 이러한 배양 기간 동안 별개의 세포 배양액에 대해 세포의 숫자가 표준화되고, 그리고 여기서 이들 별개의 배양액은 동일한 일정에서 계대배양되고;
    d) 쓴맛 수용체의 발현을 측정하기 위하여 별개의 세포 배양액을 적어도 2회 평가하는 단계; 그리고
    e) 양쪽 분석에서 쓴맛 수용체를 일정한 수준에서 발현하는 별개의 세포 배양액을 확인하여 상기 세포를 획득하는 단계.
  182. 클론 세포주의 조합 정합된 패널에 있어서, 이들 클론 세포주는 동일한 유형이고, 그리고 여기서 패널 내에 적어도 2개의 세포주는 목적되는 다중-아단위 단백질의 아단위의 상이한 조합을 발현하고; 그리고 여기서 상기 패널의 클론 세포주는 그들이 동일한 세포 배양 조건 하에 동시에 성장되도록 정합되는 것을 특징으로 하는 클론 세포주의 조합 정합된 패널.
  183. 청구항 [0079]에 있어서, 세포주 세포는 일차 세포 및 영속화 세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 클론 세포주의 조합 정합된 패널.
  184. 청구항 [0079]에 있어서, 클론 세포주 세포는 진핵이고 진균류 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 효모 세포, 조류 (algae), 갑각류 세포, 절지동물 세포, 조류 (avian) 세포, 파충류 세포, 양서류 세포, 식물 세포, 인간, 비-인간 영장류, 소, 돼지, 고양이, 쥐, 유대류, 뮤린, 개, 양, 염소, 토끼, 기니 피그 및 햄스터로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 클론 세포주의 조합 정합된 패널.
  185. 청구항 [0079]에 있어서, 세포주 내에 세포는 목적되는 단백질을 발현하도록 조작되는 것을 특징으로 하는 클론 세포주의 조합 정합된 패널.
  186. 청구항 [0079]에 있어서, 세포주 내에 세포는 단백질 또는, 다합체성 단백질의 경우에, 상기 단백질의 아단위를 인코딩하는 도입된 핵산으로부터 목적되는 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 클론 세포주의 조합 정합된 패널.
  187. 청구항 [0079]에 있어서, 세포는 내생적 핵산으로부터 목적되는 단백질을 발현하고, 그리고 여기서 상기 세포는 내생적 단백질의 전사를 활성화시키도록 또는, 다합체성 단백질의 경우에, 상기 단백질의 아단위의 전사를 활성화시키도록 조작되는 것을 특징으로 하는 클론 세포주의 조합 정합된 패널.
  188. 청구항 [0079]에 있어서, 패널은 적어도 4개, 적어도 6개, 또는 적어도 20개의 클론 세포주를 포함하는 것을 특징으로 하는 클론 세포주의 조합 정합된 패널.
  189. 청구항 [0079]에 있어서, 다중-아단위 단백질은 이온 채널, G 단백질 결합된 수용체 (GPCR), 티로신 수용체 키나아제, 사이토카인 수용체, 핵 스테로이드 호르몬 수용체, 항체, 생물학적 수용체 및 면역학적 수용체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 클론 세포주의 조합 정합된 패널.
  190. 적어도 하나의 목적되는 RNA를 발현하는 세포에 있어서, 상기 목적되는 RNA는 도입된 핵산에 의해 인코딩되고, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 RNA를 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 세포는 선별 압력의 부재에서 배양되고, 그리고 여기서 상기 RNA의 발현은 3개월 동안 30% 이상 변하지 않는 것을 특징으로 하는 세포.
  191. 청구항 190에 있어서, RNA의 발현은 6개월 동안 30% 이상 변하지 않는 것을 특징으로 하는 세포.
  192. 적어도 하나의 목적되는 단백질을 발현하는 세포에 있어서, 상기 목적되는 단백질은 도입된 핵산에 의해 인코딩되고, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 세포는 선별 압력의 부재에서 배양되고, 그리고 여기서 상기 단백질의 발현은 3개월 동안 30% 이상 변하지 않는 것을 특징으로 하는 세포.
  193. 청구항 192에 있어서, 단백질의 발현은 6개월 동안 30% 이상 변하지 않는 것을 특징으로 하는 세포.
  194. 적어도 하나의 목적되는 단백질을 발현하는 세포에 있어서, 목적되는 단백질은 공지된 리간드를 갖지 않거나, 또는 상기 목적되는 단백질의 기능적 발현을 검출하는 공지된 분석법이 존재하지 않고; 그리고 여기서 상기 목적되는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 세포.
  195. 적어도 하나의 목적되는 단백질을 인코딩하는 도입된 핵산으로부터 상기 적어도 하나의 목적되는 단백질을 발현하는 세포에 있어서, 적어도 하나의 목적되는 단백질은 상기 세포의 생리학적 특성을 변화시키고, 그리고 여기서 상기 세포의 생리학적 특성은 일정한 세포 배양 조건 하에 3개월 동안 25% 이상 변하지 않는 것을 특징으로 하는 세포.
  196. 목적되는 단백질을 발현하는 세포에 있어서, 상기 세포는 목적되는 단백질을 인코딩하는 내생적 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작되고, 여기서 목적되는 단백질은 상기 세포의 생리학적 특성을 변화시키고, 그리고 여기서 상기 세포의 생리학적 특성은 일정한 세포 배양 조건 하에 3개월 동안 25% 이상 변하지 않는 것을 특징으로 하는 세포.
  197. 목적되는 RNA를 발현하는 세포에 있어서, 목적되는 RNA는 도입된 핵산에 의해 인코딩되고, 여기서 적어도 하나의 목적되는 RNA는 상기 세포의 생리학적 특성을 변화시키고, 그리고 여기서 상기 세포의 생리학적 특성은 일정한 세포 배양 조건 하에 3개월 동안 25% 이상 변하지 않는 것을 특징으로 하는 세포.
  198. 적어도 하나의 목적되는 단백질을 인코딩하는 도입된 핵산으로부터 적어도 하나의 목적되는 단백질을 발현하는 세포에 있어서, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 그리고 여기서 상기 세포는 일일 세포당 적어도 500, 2,500, 5,000, 또는 100,000 피코그람 (picogram)의 단백질을 일관되게 및 재현가능하게 발현하는 것을 특징으로 하는 세포.
  199. 목적되는 단백질을 발현하는 세포에 있어서, 상기 세포는 목적되는 단백질을 인코딩하는 내생적 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작되고, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 그리고 여기서 상기 세포는 일일 세포당 적어도 500, 2,500, 5,000, 또는 100,000 피코그람의 단백질을 일관되게 및 재현가능하게 발현하는 것을 특징으로 하는 세포.
  200. 청구항 [0100] 내지 [0104] 중 어느 한 항에 있어서, 1주 이하, 2주 이하, 3주 이하, 4주 이하, 1개월 이하, 2개월 이하, 3개월 이하, 4개월 이하, 5개월 이하, 6개월 이하, 7개월 이하, 8개월 이하 또는 9개월 이하에서 선택되는 기간 동안 생산되는 것을 특징으로 하는 세포.
  201. 적어도 하나의 목적되는 단백질을 인코딩하는 도입된 핵산으로부터 적어도 하나의 목적되는 단백질을 발현하는 세포에 있어서, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 세포는 7개월 이하, 8개월 이하 또는 9개월 이하에서 선택되는 기간 동안 생산되고, 그리고 여기서 상기 세포는 적어도 0.5, 1.0, 5.0 또는 10 g/L의 단백질을 일관되게 및 재현가능하게 발현하는 것을 특징으로 하는 세포.
  202. 목적되는 단백질을 발현하는 세포에 있어서, 상기 세포는 목적되는 단백질을 인코딩하는 내생적 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작되고, 상기 세포는 생물학적으로 활성이거나, 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로, 목적되는 단백질을 생산하는 것으로 특징되고, 여기서 상기 세포는 7개월 이하, 8개월 이하 또는 9개월 이하에서 선택되는 기간 동안 생산되고, 그리고 여기서 상기 세포는 적어도 0.5, 1.0, 5.0 또는 10 g/L의 단백질을 일관되게 및 재현가능하게 발현하는 것을 특징으로 하는 세포.
  203. 청구항 168 또는 169에 있어서, 3개월 이하, 4개월 이하 또는 6개월 이하에서 선택되는 기간 동안 생산되는 것을 특징으로 하는 세포.
  204. 청구항 [0100] 내지 203중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 단일체성 단백질인 것을 특징으로 하는 세포.
  205. 청구항 [0100] 내지 203중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 다합체성 단백질인 것을 특징으로 하는 세포.
  206. 청구항 [0100] 내지 203중 어느 한 항에 있어서, 목적되는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나, 또는 세포는 선별 압력의 부재에서 배양되거나, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 세포.
  207. 청구항 205에 있어서, 목적되는 다합체성 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  208. 청구항 205에 있어서, 목적되는 다합체성 단백질은 이온 채널, G 단백질 결합된 수용체 (GPCR), 티로신 수용체 키나아제, 사이토카인 수용체, 핵 스테로이드 호르몬 수용체, 항체, 생물학적 수용체 및 면역학적 수용체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
  209. 청구항 208에 있어서, 목적되는 다합체성 단백질은 이온 채널이고, 그리고 세포 생리학적 특성은 막 전위, UPR, 세포 생존능, 향상된 단백질 생산에 대한 능력, 수율, 접힘, 조립, 분비, 세포 막 내로 통합, 번역후 변형, 당화, 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
  210. 청구항 [0100] 내지 209중 어느 한 항의 세포로부터 생산된 세포주.
  211. 목적되는 단백질의 조절제를 확인하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 청구항 [0100] 내지 210중 어느 한 항에 따른 세포를 검사 화합물과 접촉시키는 단계; 그리고
    b) 검사 화합물에 의해 접촉되지 않은 세포 내에서 단백질의 활성과 비교하여, 검사 화합물과 접촉된 세포 내에서 목적되는 단백질의 활성에서 변화를 검출하는 단계;
    여기서 부재에서와 비교하여 존재에서 활성의 차이를 발생시키는 화합물은 목적되는 단백질의 조절제이다.
  212. 청구항 [0100] 내지 209중 어느 한 항에 따른 적어도 2개의 세포 또는 청구항 210에 따른 적어도 2개의 클론 세포주를 포함하는 세포 또는 클론 세포주의 정합된 패널에 있어서, 적어도 2개의 세포 또는 적어도 2개의 클론 세포주는 그들이 동일한 세포 배양 조건 하에 동시에 성장되도록 정합되는 것을 특징으로 하는 정합된 패널.
  213. 청구항 [0111]에 있어서, 정합된 패널은 청구항 [0100] 내지 209중 어느 한 항에 따른 적어도 10개의 세포 또는 청구항 210에 따른 적어도 10개의 클론 세포주를 포함하고, 그리고 적어도 10개의 세포 또는 적어도 10개의 클론 세포주는 그들이 동일한 세포 배양 조건 하에 동시에 성장되도록 정합되는 것을 특징으로 하는 정합된 패널.
  214. 청구항 213에 있어서, 패널은 청구항 [0100] 내지 209중 어느 한 항에 따른 적어도 100개의 세포 또는 청구항 210에 따른 적어도 100개의 클론 세포주를 포함하고, 그리고 적어도 100개의 세포 또는 적어도 100개의 클론 세포주는 동일한 세포 배양 조건 하에 동시에 성장되는 것을 특징으로 하는 정합된 패널.
  215. 클론 세포주의 정합된 패널에 있어서, 이들 클론 세포주는 동일한 유형이고 첫 번째와 두 번째 목적되는 단백질을 포함하고; 여기서 첫 번째 목적되는 단백질은 각 클론 세포주에서 동일하고; 여기서 두 번째 목적되는 단백질은 기능적 생물학적 경로의 성분이고; 그리고 여기서:
    a) 상기 패널은 적어도 5개의 세포주를 포함하고;
    b) 상기 패널은 6개월 이하 동안 생산되고;
    c) 첫 번째와 두 번째 목적되는 단백질은 단백질 태그를 갖지 않고;
    d) 이들 클론 세포주는 선별 압력의 부재에서 배양되고; 또는
    e) a)-d)의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 클론 세포주의 정합된 패널.
  216. 청구항 [0113]에 있어서, 첫 번째 목적되는 단백질은 항체이고, 그리고 기능적 생물학적 경로는 당화 경로인 것을 특징으로 하는 클론 세포주의 정합된 패널.
  217. 생체내 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관 (correlate)을 산출하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 이러한 생리학적 특성을 갖는 화합물 또는 복수의 화합물을 첫 번째 목적되는 단백질을 발현하는 첫 번째 세포와 접촉시키는 단계;
    b) 기능 분석에서 첫 번째 단백질에 대한 상기 화합물 또는 복수의 화합물의 효과를 평가하는 단계;
    c) 상기 화합물 또는 복수의 화합물을 두 번째 목적되는 단백질을 발현하는 두 번째 세포와 접촉시키는 단계;
    d) 기능 분석에서 두 번째 단백질에 대한 상기 화합물 또는 복수의 화합물의 효과를 평가하는 단계;
    여기서 첫 번째와 두 번째 단백질은 독립적으로 i) 단백질 태그를 포함하지 않고, ii) 이들 세포가 기능 분석에서 적어도 0.4의 Z' 인자를 갖도록 기능 분석에 이용하기 적합한 형태로 일관되게 및 재현가능하게 생산되고, iii) 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 발현되고, iv) 상기 세포의 생리학적 특성을 변화시키고, 그리고 여기서 상기 세포의 생리학적 특성은 일정한 세포 배양 조건 하에 3개월 동안 25% 이상 변하지 않고; v) 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 안정적으로 발현되고, 그리고 여기서 상기 단백질의 발현은 3개월 동안 30% 이상 변하지 않고, vi) 다른 단백질을 더욱 발현하는 세포에서 발현되고, 그리고 상기 세포는 선별 압력의 부재에서 배양되고, 또는 vii) 이들의 임의의 조합이고; 그리고
    여기서 단계 a) 내지 d)에서 획득된 프로필은 생체내 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 제시한다.
  218. 청구항 [0115]에 있어서, 첫 번째와 두 번째 목적되는 단백질은 독립적으로 단일체성 단백질 또는 다합체성 단백질에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  219. 청구항 218에 있어서, 다합체성 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  220. 청구항 219에 있어서, 다합체성 단백질은 이종다합체성 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  221. 청구항 [0115] 내지 219중 어느 한 항에 있어서,
    a) 첫 번째 세포 및 두 번째 세포는 적어도 하나의 다른 세포를 더욱 포함하는 세포의 패널 내에 세포이고;
    b) 세포의 패널 내에 각 세포는 상이한 단백질을 발현하도록 조작되고, 그리고 화합물 또는 복수의 화합물에 의해 접촉되고;
    c) 세포의 패널 내에 각 세포에서 발현된 각 단백질에 대한 상기 화합물 또는 복수의 화합물의 효과는 기능 분석에서 평가되고; 그리고
    d) 각 세포에서 상기 화합물 또는 복수의 화합물의 활성 프로필은 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 산출하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  222. 청구항 221에 있어서, 각 단백질은 독립적으로 단일체성 단백질 또는 다합체성 단백질에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  223. 청구항 222에 있어서, 다합체성 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  224. 청구항 223에 있어서, 다합체성 단백질은 이종다합체성 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  225. 검사 화합물의 생리학적 특성을 예측하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 청구항 [0115] 내지 220중 어느 한 항에 따른 첫 번째 목적되는 단백질을 발현하는 첫 번째 세포와 접촉시키는 단계;
    b) 기능 분석에서 첫 번째 단백질에 대한 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 효과를 평가하는 단계;
    c) 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 [0115] 내지 220중 어느 한 항에 따른 두 번째 목적되는 단백질을 발현하는 두 번째 세포와 접촉시키는 단계;
    d) 기능 분석에서 두 번째 단백질에 대한 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 효과를 평가하는 단계;
    e) 단계 a) 내지 d)에서 획득된 화합물의 활성 프로필을 청구항 [0115]의 방법에 의해 산출된 바와 같은 시험관내 상관과 비교하는 단계,
    여기서 첫 번째와 두 번째 단백질은 독립적으로 i) 단백질 태그를 포함하지 않고, ii) 이들 세포가 기능 분석에서 적어도 0.4의 Z' 인자를 갖도록 기능 분석에 이용하기 적합한 형태로 일관되게 및 재현가능하게 생산되고, iii) 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 발현되고, iv) 상기 세포의 생리학적 특성을 변화시키고, 그리고 여기서 상기 세포의 생리학적 특성은 일정한 세포 배양 조건 하에 3개월 동안 25% 이상 변하지 않고; v) 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 안정적으로 발현되고, 그리고 여기서 상기 단백질의 발현은 3개월 동안 30% 이상 변하지 않고, vi) 다른 단백질을 더욱 발현하는 세포에서 발현되고, 그리고 상기 세포는 선별 압력의 부재에서 배양되고, 또는 vii) 이들의 임의의 조합이고; 그리고
    여기서 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물은 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 활성 프로필 및 시험관내 상관의 활성 프로필이 적어도 90% 동일하면, 시험관내 상관의 생리학적 특성을 갖는 것으로 예측된다.
  226. 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 생리학적 특성을 확증하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 청구항 [0115]에 따른 첫 번째 목적되는 단백질을 발현하는 첫 번째 세포와 접촉시키는 단계;
    b) 기능 분석에서 첫 번째 단백질에 대한 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 효과를 평가하는 단계;
    c) 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 청구항 [0115]에 따른 두 번째 목적되는 단백질을 발현하는 두 번째 세포와 접촉시키는 단계;
    d) 기능 분석에서 두 번째 단백질에 대한 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 효과를 평가하는 단계;
    e) 단계 a) 내지 d)에서 획득된 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 활성 프로필을 청구항 [0115]에 따른 방법에 의해 산출된 바와 같은 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관과 비교하는 단계,
    여기서 첫 번째와 두 번째 단백질은 독립적으로 i) 단백질 태그를 포함하지 않고, ii) 이들 세포가 기능 분석에서 적어도 0.4의 Z' 인자를 갖도록 기능 분석에 이용하기 적합한 형태로 일관되게 및 재현가능하게 생산되고, iii) 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 발현되고, iv) 상기 세포의 생리학적 특성을 변화시키고, 그리고 여기서 상기 세포의 생리학적 특성은 일정한 세포 배양 조건 하에 3개월 동안 25% 이상 변하지 않고; v) 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 안정적으로 발현되고, 그리고 여기서 상기 단백질의 발현은 3개월 동안 30% 이상 변하지 않고, vi) 다른 단백질을 더욱 발현하는 세포에서 발현되고, 그리고 상기 세포는 선별 압력의 부재에서 배양되고, 또는 vii) 이들의 임의의 조합이고; 그리고
    여기서 상기 화합물은 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 활성 프로필 및 시험관내 상관의 활성 프로필이 적어도 90% 동일하면, 생리학적 특성을 갖는 것으로 확증된다.
  227. 청구항 [0119] 내지 [0121]중 어느 한 항에 있어서, 첫 번째와 두 번째 단백질은 독립적으로 단일체성 단백질 또는 다합체성 단백질에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  228. 청구항 227에 있어서, 다합체성 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  229. 청구항 228에 있어서, 다합체성 단백질은 이종다합체성 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  230. 청구항 [0119] 내지 229중 어느 한 항에 있어서,
    a) 첫 번째 세포 및 두 번째 세포는 적어도 하나의 다른 세포를 더욱 포함하는 세포의 패널 내에 세포이고;
    b) 세포의 패널 내에 각 세포는 상이한 단백질을 발현하도록 조작되고, 그리고 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물에 의해 접촉되고;
    c) 세포의 패널 내에 각 세포에서 발현된 각 목적되는 단백질에 대한 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 효과는 기능 분석에서 평가되고; 그리고
    d) 각 세포에서 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 활성 프로필은 시험관내 상관의 프로필과 비교하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  231. 청구항 230에 있어서, 각 단백질은 독립적으로 단일체성 단백질 또는 다합체성 단백질에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  232. 청구항 231에 있어서, 다합체성 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  233. 청구항 232에 있어서, 다합체성 단백질은 이종다합체성 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  234. 청구항 [0115], 221, [0119], [0121] 또는 230중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 첫 번째 목적되는 다합체성 단백질 및 두 번째 목적되는 다합체성 단백질은 이절성 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  235. 청구항 [0115], 221, [0119], [0121] 또는 230중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 첫 번째 목적되는 단백질 및 두 번째 목적되는 단백질은 이합체성 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  236. 청구항 [0115], 221, [0119], [0121] 또는 230중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 첫 번째 목적되는 단백질 및 두 번째 목적되는 단백질은 삼합체성 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  237. 청구항 [0115], 221, [0119], [0121] 또는 230중 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 목적되는 단백질 및 두 번째 목적되는 단백질은 다합체성 단백질의 상이한 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  238. 청구항 237에 있어서, 다합체성 단백질은 GABA A 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
  239. 청구항 [0115], 221, [0119], [0121] 또는 230중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 첫 번째 또는 두 번째 목적되는 단백질은 기능적 생물학적 경로의 일부인 것을 특징으로 하는 방법.
  240. 청구항 239에 있어서, 기능적 생물학적 경로는 당화, 단백질 합성, UPR, ER, 리보솜, 미토콘드리아 활성, RNA 합성, 번역후 변형, 세포 신호전달, 세포 성장 및 세포 사멸로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  241. 청구항 [0115], 221, [0119], [0121] 또는 230중 어느 한 항에 있어서, 생리학적 특성은 치료 효과인 것을 특징으로 하는 방법.
  242. 청구항 [0115], 221, [0119], [0121] 또는 230중 어느 한 항에 있어서, 생리학적 특성은 역효과인 것을 특징으로 하는 방법.
  243. 청구항 [0115], 221, [0119], [0121] 또는 230중 어느 한 항에 있어서, 생리학적 특성에 대한 화합물 또는 복수의 화합물의 효과는 고처리량 스크리닝에 의해 평가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  244. 청구항 [0115], 221, [0119], [0121] 또는 230중 어느 한 항에 있어서, 단계 e)는 컴퓨터 시스템에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  245. 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 생리학적 특성을 결정하는 컴퓨터-수행된 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 첫 번째 활성 프로필을 수용하는 단계, 여기서 상기 첫 번째 활성 프로필은 청구항 [0115] 또는 221의 방법에 의해 산출되고, 그리고 여기서 상기 첫 번째 활성 프로필은 상기 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 제공하고;
    b) 상기 첫 번째 활성 프로필을 데이터베이스에 저장된 복수의 대표 활성 프로필에 비교하여 상기 첫 번째 활성 프로필 및 상기 복수의 대표 활성 프로필 내에 각각의 대표 활성 프로필 사이에 유사성 척도를 결정하는 단계, 여기서 각각의 대표 활성 프로필은 개별 공지된 화합물 또는 복수의 공지된 화합물의 공지된 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 제공하고;
    c) 단계 (b)에서 결정된 유사성 척도에 기초하여, 상기 첫 번째 활성 프로필에 가장 유사한 하나 이상의 대표 활성 프로필을 결정하는 단계; 그리고
    d) 단계 (c)에서 상기 첫 번째 활성 프로필과 가장 유사한 것으로 결정된 하나 이상의 대표 활성 프로필과 연관된 공지된 생리학적 특성을 상기 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 생리학적 특성으로서 확인하는 단계;
    여기서 단계 (a), (b), (c), 그리고 (d)는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
  246. 청구항 [0127]에 있어서, 하나 이상의 대표 활성 프로필은 유사성 척도가 미리 결정된 역치 (predetermined threshold)를 초과하면, 첫 번째 활성 프로필에 가장 유사한 것을 특징으로 하는 방법.
  247. 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 특정 생리학적 특성과 연관되는 것으로 특징짓기 위한 컴퓨터-수행된 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 첫 번째 활성 프로필을 수용하는 단계, 여기서 상기 첫 번째 활성 프로필은 청구항 [0115] 또는 221의 방법에 의해 산출되고, 그리고 여기서 상기 첫 번째 활성 프로필은 상기 검사 화합물 또는 복수의 화합물의 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 제공하고;
    b) 복수의 활성 프로필을 군집시키는 단계, 이러한 복수는 상기 첫 번째 활성 프로필 및 복수의 대표 활성 프로필을 포함하고, 여기서 각각의 대표 활성 프로필은 개별 공지된 화합물 또는 복수의 공지된 화합물의 공지된 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 제공하고;
    c) 첫 번째 활성 프로필과 함께 군집하는 상기 복수의 대표 활성 프로필에서 하나 이상의 대표 활성 프로필을 확인하는 단계; 그리고
    d) 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을, 단계 (c)에서 상기 첫 번째 활성 프로필과 함께 군집되는 것으로 확인된 하나 이상의 대표 활성 프로필에 상응하는 개별 공지된 화합물 또는 복수의 공지된 화합물의 상기 공지된 생리학적 특성과 연관되는 것으로 특징짓는 단계;
    여기서 단계 (a), (b), (c), 그리고 (d)는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
  248. 식별자를 이용하여 생리학적 특성에 대하여 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 분류하는 컴퓨터-수행된 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 데이터베이스에 저장된 복수의 대표 활성 프로필을 이용하여 약리학적 특성에 대하여 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 분류하기 위하여 식별자를 훈련시키는 단계, 여기서 각각의 대표 활성 프로필은 개별 공지된 화합물 또는 복수의 공지된 화합물의 공지된 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 제공하고; 그리고
    b) 상기 식별자를 이용하여, 청구항 [0115] 또는 221의 방법에 의해 산출된 첫 번째 활성 프로필을 처리하여 생리학적 특성에 대하여 상기 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 분류하는 단계;
    여기서 단계 (a)와 (b)는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
  249. 식별자를 이용하여 생리학적 특성에 대하여 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 분류하는 컴퓨터-수행된 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 데이터베이스에 저장된 복수의 대표 활성 프로필을 이용하여 약리학적 특성에 대하여 화합물 또는 복수의 화합물을 분류하기 위하여 식별자를 훈련시키는 단계, 여기서 각각의 대표 활성 프로필은 개별 화합물의 공지된 생체내 약리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 제공하고; 그리고
    b) 상기 식별자를 이용하여, 청구항 [0115] 또는 221의 방법에 의해 산출된 첫 번째 활성 프로필을 처리하여 생리학적 특성에 대하여 상기 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물을 분류하는 단계, 여기서 상기 식별자는 아래의 단계를 포함하는 방법에 따라 훈련되고,
    여기서 단계 (a)와 (b)는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
  250. 세포 내에서 목적되는 다합체성 단백질의 활성 아단위 조합을 특징짓기 위한 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 목적되는 다합체성 단백질의 첫 번째 아단위를 발현하는 첫 번째 세포를 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물과 접촉시키는 단계;
    b) 목적되는 다합체성 단백질의 두 번째 아단위를 발현하는 두 번째 세포를 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물과 접촉시키는 단계;
    c) 목적되는 다합체성 단백질의 첫 번째 아단위 및 두 번째 아단위를 발현하는 세 번째 세포를 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물과 접촉시키는 단계;
    d) 기능 분석에서, 목적되는 다합체성 단백질이 첫 번째 세포, 두 번째 세포, 그리고 세 번째 세포에서 발현될 때, 상기 다합체성 단백질에 대한 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 효과를 평가하는 단계;
    e) 첫 번째 및/또는 두 번째 아단위가 생물학적으로 활성 다합체성 단백질의 일부인 지를 추론하는 단계,
    여기서 단계 a) 내지 d)에서 획득된 프로필은 생체내 생리학적 특성에 대한 시험관내 상관을 제공하고,
    그리고 여기서 상기 다합체성 단백질의 첫 번째와 두 번째 아단위는 독립적으로 단백질 태그를 포함하지 않거나, 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 발현되거나, 또는 이들의 임의의 조합이다.
  251. 청구항 [0132]에 있어서, 목적되는 다합체성 단백질은 이종이합체인 것을 특징으로 하는 방법.
  252. 청구항 [0132]에 있어서, 목적되는 다합체성 단백질은 이종삼합체인 것을 특징으로 하는 방법.
  253. 세포 내에서 목적되는 다합체성 단백질의 활성 아단위 조합을 특징짓기 위한 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 목적되는 다합체성 단백질의 첫 번째 아단위를 발현하는 첫 번째 세포를 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물과 접촉시키는 단계;
    b) 목적되는 다합체성 단백질의 두 번째 아단위를 발현하는 두 번째 세포를 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물과 접촉시키는 단계;
    c) 목적되는 다합체성 단백질의 세 번째 아단위를 발현하는 세 번째 세포를 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물과 접촉시키는 단계;
    d) 목적되는 다합체성 단백질의 첫 번째 아단위, 두 번째 아단위, 그리고 세 번째 아단위를 발현하는 네 번째 세포를 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물과 접촉시키는 단계;
    e) 기능 분석에서, 목적되는 다합체성 단백질이 첫 번째 세포, 두 번째 세포, 세 번째 세포, 그리고 네 번째 세포에서 발현될 때, 상기 다합체성 단백질에 대한 검사 화합물 또는 복수의 검사 화합물의 효과를 평가하는 단계;
    f) 첫 번째, 두 번째 및/또는 세 번째 아단위가 생물학적으로 활성 다합체성 단백질의 일부인 지를 추론하는 단계;
    여기서 상기 다합체성 단백질의 첫 번째, 두 번째와 세 번째 아단위는 독립적으로 단백질 태그를 포함하지 않거나, 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 발현되거나, 또는 이들의 임의의 조합이다.
  254. 청구항 [0134]에 있어서, 다합체성 단백질은 이종삼합체인 것을 특징으로 하는 방법.
  255. 청구항 [0132]에 있어서, 다합체성 단백질은 GABA A 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
  256. 세포의 패널에 있어서, 상기 패널은 첫 번째 세포 및 두 번째 세포를 포함하고, 여기서 첫 번째 세포 및 두 번째 세포는 목적되는 다합체성 단백질의 동일한 아단위를 발현하도록 조작되고, 여기서 첫 번째 세포에서 목적되는 다합체성 단백질의 생리학적 프로필은 두 번째 세포에서 다합체성 단백질의 생리학적 프로필과 상이하고, 그리고 여기서 첫 번째 세포 및 두 번째 세포는 동일한 호스트 세포주로부터 기원하고;
    여기서 목적되는 다합체성 단백질의 아단위는 단백질 태그를 포함하지 않거나, 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 발현되거나, 또는 이들의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 세포의 패널.
  257. 클론 세포주 패널에 있어서, 각 세포주는 목적되는 다합체성 단백질의 동일한 아단위를 발현하도록 조작되고, 그리고 여기서 각 세포주에서 다합체성 단백질의 생리학적 프로필은 패널의 다른 세포주에서 목적되는 다합체성 단백질의 생리학적 프로필과 상이하고, 그리고 여기서 세포주 패널 내에 이들 세포주는 동일한 호스트 세포주로부터 기원하고;
    여기서 목적되는 다합체성 단백질의 아단위는 단백질 태그를 포함하지 않거나, 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 발현되거나, 또는 이들의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 클론 세포주 패널.
  258. 청구항 [0137]에 있어서, 2개의 세포주를 포함하는 것을 특징으로 하는 클론 세포주 패널.
  259. 청구항 [0137]에 있어서, 5개의 세포주를 포함하는 것을 특징으로 하는 클론 세포주 패널.
  260. 청구항 [0137]에 있어서, 10개의 세포주를 포함하는 것을 특징으로 하는 클론 세포주 패널.
  261. 청구항 [0137]에 있어서, 목적되는 다합체성 단백질은 NaV인 것을 특징으로 하는 클론 세포주 패널.
  262. 기능적 생물학적 경로의 모든 성분 단백질을 발현하도록 조작된 세포.
  263. 청구항 [0140]에 있어서, 경로는 적어도 5개의 단백질 성분을 보유하는 것을 특징으로 하는 세포.
  264. 청구항 [0140]에 있어서, 세포는 선별 압력의 부재에서 배양되는 것을 특징으로 하는 세포.
  265. 청구항 [0140]에 있어서, 생물학적 경로의 성분 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 세포.
  266. 복수의 클론 세포주를 포함하는 클론 세포주 패널에 있어서, 복수의 클론 세포주의 각 클론 세포주는 상이한 후각 수용체를 발현하도록 조작되고; 여기서 후각 수용체는 단백질 태그를 포함하지 않고, 또는 후각 수용체는 이들 세포가 기능 분석에서 적어도 0.4의 Z' 인자를 갖도록 기능 분석에 이용하기 적합한 형태로 일관되게 및 재현가능하게 생산되고, 또는 클론 세포주는 선별 압력의 부재에서 배양되고, 또는 이들의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 클론 세포주 패널.
  267. 청구항 [0142]에 있어서, 복수의 클론 세포주는 적어도 10개의 세포주를 포함하는 것을 특징으로 하는 클론 세포주 패널.
  268. 청구항 [0142]에 있어서, 상이한 후각 수용체는 인간 후각 수용체 또는 곤충 후각 수용체인 것을 특징으로 하는 클론 세포주 패널.
  269. 청구항 [0142]에 있어서, 상이한 인간 후각 수용체는 OR10A1, OR10A3, OR10A4, OR10A5, OR10A6, OR10A7, OR10C1, OR10C2, OR10D4, OR10G2, OR10G3, OR10G4, OR10G7, OR10G8, OR10G9, OR10H1, OR10H2, OR10H3, OR10H4, OR10H5, OR10J1, OR10J3, OR10J5, OR10J6, OR10K1, OR10K2, OR10Q1, OR10R2, OR10S1, OR10T2, OR10V1, OR10Z1, OR11A1, OR11G2, OR11H1, OR11H4, OR11H6, OR11H7P, OR11L1, OR12D3, OR13A1, OR13C2, OR13C3, OR13C4, OR13C5, OR13C7, OR13C8, OR13C9, OR13D1, OR13E2, OR13F1, OR13G1, OR13H1, OR13J1, OR14A16, OR14A2, OR14C36, OR14J1, OR1A1, OR1A2, OR1A2, OR1B1, OR1C1, OR1D2, OR1D4, OR1D5, OR1E1, OR1E2, OR1E2, OR1E5, OR1E5, OR1E6, OR1E7, OR1F1, OR1F10, OR1F11, OR1F12, OR1F2, OR1G1, OR1I1, OR1J1, OR1J2, OR1J2, OR1J4, OR1J5, OR1K1, OR1L1, OR1L3, OR1L4, OR1L6, OR1L8, OR1M1, OR1M1, OR1N1, OR1N2, OR1N3, OR1Q1, OR1S1, OR1S2, OR2A1, OR2A10, OR2A19, OR2A20, OR2A21, OR2A4, OR2A42, OR2A5, OR2A6, OR2A7, OR2AE1, OR2AJ1, OR2AK2, OR2B1, OR2B2, OR2B3, OR2B6, OR2B9, OR2C1, OR2D1, OR2D2, OR2D3, OR2F1, OR2F2, OR2F3, OR2G2, OR2G3, OR2H1, OR2H2, OR2H3, OR2J2, OR2J3, OR2K1, OR2K2, OR2L1, OR2L2, OR2L3, OR2L5, OR2L8, OR2M1, OR2M2, OR2M4, OR2S2, OR2T1, OR2T3, OR2T4, OR2T5, OR2T6, OR2T7, OR2T8, OR2V1, OR2V2, OR2V3, OR2W1, OR2W3, OR2Y1, OR2Z1, OR3A1, OR3A2, OR3A3, OR3A4, OR4A15, OR4A16, OR4A4, OR4A5, OR4B1, OR4C12, OR4C13, OR4C15, OR4C16, OR4C3, OR4C6, OR4D1, OR4D2, OR4D5, OR4D6, OR4D9, OR4E2, OR4F10, OR4F15, OR4F16, OR4F16, OR4F17, OR4F18, OR4F19, OR4F3, OR4F6, OR4K1, OR4K13, OR4K14, OR4K15, OR4K17, OR4K2, OR4K3, OR4K5, OR4L1, OR4M1, OR4M2, OR4N2, OR4N4, OR4N5, OR4P4, OR4Q3, OR4S1, OR4X1, OR4X2, OR51A2, OR51A4, OR51A7, OR51B2, OR51B4, OR51D1, OR51E1, OR51E2, OR51F2, OR51G1, OR51G2, OR51H1, OR51I1, OR51I2, OR51L1, OR51M1, OR51Q1, OR51S1, OR51T1, OR52A1, OR52A2, OR52B2, OR52B4, OR52B4, OR52B4, OR52B6, OR52D1, OR52E2, OR52E4, OR52E5, OR52E6, OR52E8, OR52H1, OR52I1, OR52I2, OR52J3, OR52K1, OR52K2, OR52L1, OR52L2, OR52N1, OR52N2, OR52N4, OR52N5, OR52P1, OR52R1, OR56A4, OR56A6, OR56B2, OR56B4, OR5A1, OR5A2, OR5AC2, OR5AK2, OR5AK3, OR5AN1, OR5AP2, OR5AR1, OR5AS1, OR5AU1, OR5AU1, OR5B13, OR5B16, OR5B17, OR5B2, OR5B3, OR5C1, OR5D13, OR5D14, OR5D16, OR5D18, OR5F1, OR5G3, OR5H1, OR5H2, OR5H6, OR5I1, OR5K1, OR5K2, OR5L1, OR5L2, OR5M1, OR5M10, OR5M11, OR5M11, OR5M3, OR5M3, OR5M8, OR5M9, OR5P2, OR5P3, OR5T2, OR5T3, OR5V1, OR6A1, OR6B1, OR6B2, OR6C1, OR6C2, OR6C3, OR6F1, OR6J2, OR6K3, OR6K6, OR6M1, OR6N1, OR6N2, OR6P1, OR6Q1, OR6S1, OR6T1, OR6V1, OR6X1, OR6Y1, OR7A10, OR7A17, OR7A2, OR7A5, OR7C1, OR7C2, OR7D2, OR7D2, OR7D4P, OR7E102, OR7E120, OR7G1, OR7G2, OR7G3, OR8A1, OR8B12, OR8B2, OR8B3, OR8B4, OR8B8, OR8D1, OR8D2, OR8D4, OR8G1, OR8G2, OR8H1, OR8H2, OR8H3, OR8I2, OR8J1, OR8J3, OR8K1, OR8K3, OR8K5, OR9A2, OR9A4, OR9G1, OR9G4, OR9G5, OR9I1, OR9K2, 그리고 OR9Q1로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 클론 세포주 패널.
  270. 청구항 [0142]에 있어서, 상이한 곤충 후각 수용체는 IOR100, IOR101, IOR102, IOR103, IOR104, IOR105, IOR106, IOR107, IOR108, IOR109, IOR110, IOR111, IOR112, IOR113, IOR114, IOR115, IOR116, IOR117, IOR118, IOR119, IOR120, IOR121, IOR122, IOR123, IOR124, IOR125, IOR126, IOR127, IOR49, IOR50, IOR51, IOR52, IOR53, IOR54, IOR55, IOR56, IOR57, IOR58, IOR59, IOR60, IOR61, IOR62, IOR63, IOR64, IOR65, IOR66, IOR67, IOR68, IOR69, IOR70, IOR71, IOR72, IOR73, IOR74, IOR75, IOR76, IOR77, IOR78, IOR79, IOR80, IOR81, IOR82, IOR83, IOR84, IOR85, IOR86, IOR87, IOR88, IOR89, IOR90, IOR91, IOR92, IOR93, IOR94, IOR95, IOR96, IOR97, IOR98, IOR99, ORL7077, ORL7078, ORL7079, ORL7080, ORL7081, ORL7082, ORL7083, ORL7084, ORL7085, ORL7086, ORL7087, ORL7088, ORL7089, ORL7090, ORL7091, ORL7092, ORL7093, ORL7094, ORL7095, ORL7096, ORL7097, ORL7098, ORL7099, ORL7100, ORL7101, ORL7102, ORL7103, ORL7104, ORL7105, ORL7106, ORL7107, ORL7108, ORL7109, ORL7110, ORL7111, ORL7112, ORL7113, ORL7114, ORL7115, ORL7116, ORL7117, ORL7118, ORL7119, ORL7120, ORL7121, ORL7122, ORL7123, ORL7124, ORL7125, TPR2307, TPR2308, TPR2309, TPR2310, TPR2312, TPR2314, TPR2315, TPR2316, TPR2317, TPR2318, TPR2319, TPR2320, TPR2321, TPR2321, TPR698, TPR699, TPR700, TPR701, TPR702, TPR703, TPR704, TPR705, TPR706, TPR707, TPR708, TPR709, TPR710, TPR711, TPR712, TPR713, TPR714, TPR715, TPR716, TPR717, TPR718, TPR719, TPR720, TPR721, TPR722, TPR723, TPR724, TPR725, TPR725, TPR726, TPR727, TPR728, TPR729, TPR730, TPR731, TPR732, TPR733, TPR734, TPR735, TPR736, TPR737, TPR738, TPR739, TPR740, TPR741, TPR742, TPR743, TPR744, TPR745, TPR746, TPR747, TPR748, TPR749, TPR750, TPR751, TPR752, TPR753, TPR754, TPR755, TPR756, TPR757, TPR758, TPR759, TPR760, TPR761, TPR762, TPR763, TPR764, TPR765, TPR766, TPR767, TPR768, TPR769, TPR770, TPR771, 그리고 TPR772로 구성된 군에서 선택되는 모기 후각 수용체인 것을 특징으로 하는 클론 세포주 패널.
  271. 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 산출하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 청구항 [0142]의 패널을 검사 화합물 또는 조성물과 접촉시키는 단계; 그리고
    b) 패널 내에 적어도 2개의 상이한 후각 수용체의 기능 분석에서 활성에 대한 검사 화합물 또는 조성물의 효과를 측정하는 단계,
    여기서 단계 (b)에서 측정된 활성은 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 제공한다.
  272. 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물의 향기를 모의하는 두 번째 검사 화합물을 확인하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 청구항 [0142]의 패널을 두 번째 검사 화합물과 접촉시키는 단계;
    b) 패널 내에 적어도 2개의 후각 수용체의 기능 분석에서 활성에 대한 두 번째 검사 화합물의 효과를 조사하는 단계;
    c) 단계 (b)에서 획득된 두 번째 검사 화합물의 후각 활성 프로필을 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필과 비교하는 단계; 여기서 두 번째 검사 화합물은 두 번째 검사 화합물의 후각 활성 프로필이 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필에 유사하면 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물의 향기를 모의한다.
  273. 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 변경하는 두 번째 검사 화합물을 확인하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 청구항 [0146]의 방법에 따라서, 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물의 존재에서 두 번째 검사 화합물의 후각 활성 프로필을 산출하는 단계;
    b) 단계 (a)에서 획득된 후각 활성 프로필을 두 번째 검사 화합물의 부재에서 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필과 비교하는 단계; 여기서 두 번째 검사 화합물은 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물 단독의 후각 활성 프로필이 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물의 존재에서 두 번째 검사 화합물의 후각 활성 프로필과 상이하면 첫 번째 검사 화합물 또는 조성물의 후각 활성 프로필을 변경한다.
  274. 검사 화합물과 연관된 향기를 확인하는 컴퓨터-수행된 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 검사 화합물의 첫 번째 후각 활성 프로필을 수용하는 단계, 여기서 상기 첫 번째 후각 활성 프로필은 청구항 [0146]의 방법에 의해 산출되고;
    b) 상기 첫 번째 후각 활성 프로필을 데이터베이스에 저장된 복수의 대표 후각 활성 프로필에 비교하여 상기 첫 번째 후각 활성 프로필 및 상기 복수의 대표 후각 활성 프로필 내에 각각의 대표 후각 활성 프로필 사이에 유사성 척도를 결정하는 단계, 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 공지된 향기를 갖는 개별 공지된 화합물에 상응하고, 그리고 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 청구항 [0146]의 방법에 의해 산출되고;
    c) 단계 (b)에서 결정된 유사성 척도에 기초하여, 상기 첫 번째 후각 활성 프로필에 가장 유사한 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필을 결정하는 단계; 그리고
    d) 단계 (c)에서 상기 첫 번째 후각 활성 프로필에 가장 유사한 것으로 결정된 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필과 연관된 향기를 상기 공지된 화합물과 연관된 향기로서 확인하는 단계;
    여기서 단계 (a), (b), (c), 그리고 (d)는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
  275. 청구항 [0149]에 있어서, 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필은 유사성 척도가 미리 결정된 역치를 초과하면, 첫 번째 후각 활성 프로필에 가장 유사한 것을 특징으로 하는 방법.
  276. 화합물을 특정 향기와 연관되는 것으로 특징짓기 위한 컴퓨터-수행된 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 상기 화합물의 첫 번째 후각 활성 프로필을 수용하는 단계, 여기서 상기 첫 번째 후각 활성 프로필은 청구항 [0146]의 방법에 의해 산출되고;
    b) 복수의 후각 활성 프로필을 군집시키는 단계, 이러한 복수는 상기 첫 번째 후각 활성 프로필 및 복수의 대표 후각 활성 프로필을 포함하고, 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 공지된 향기를 갖는 개별 공지된 화합물에 상응하고, 그리고 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 청구항 [0146]의 방법에 의해 산출되고;
    c) 첫 번째 후각 활성 프로필과 함께 군집하는 상기 복수의 대표 후각 활성 프로필 내에 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필을 확인하는 단계; 그리고
    d) 상기 화합물을, 단계 (c)에서 상기 첫 번째 후각 활성 프로필과 함께 군집되는 것으로 확인된 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필에 상응하는 개별 화합물과 연관된 상기 공지된 향기와 연관되는 것으로 특징짓는 단계;
    여기서 단계 (a), (b), (c), 그리고 (d)는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
  277. 식별자를 이용하여 향기에 대하여 검사 화합물을 분류하는 컴퓨터-수행된 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 데이터베이스에 저장된 복수의 대표 후각 활성 프로필을 이용하여 향기에 대하여 검사 화합물을 분류하기 위하여 식별자를 훈련시키는 단계, 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 공지된 향기를 갖는 개별 공지된 화합물에 상응하고, 그리고 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 청구항 [0146]의 방법에 의해 산출되고; 그리고
    b) 상기 식별자를 이용하여, 청구항 [0146]의 방법에 의해 산출된 상기 화합물의 첫 번째 후각 활성 프로필을 처리하여 공지된 향기에 대하여 상기 화합물을 분류하는 단계;
    여기서 단계 (a)와 (b)는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
  278. 식별자를 이용하여 향기에 대하여 검사 화합물을 분류하는 컴퓨터-수행된 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 상기 식별자를 이용하여, 청구항 [0146]의 방법에 의해 산출된 상기 화합물의 첫 번째 후각 활성 프로필을 처리하여 공지된 향기에 대하여 상기 검사 화합물을 분류하는 단계, 여기서 상기 식별자는 아래의 단계를 포함하는 방법에 따라 훈련되고:
    b) 데이터베이스에 저장된 복수의 대표 후각 활성 프로필을 이용하여 향기에 대하여 검사 화합물을 분류하기 위하여 상기 식별자를 훈련시키는 단계, 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 공지된 향기를 갖는 개별 공지된 화합물에 상응하고, 그리고 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 청구항 [0146]의 방법에 의해 산출되고;
    여기서 이러한 처리는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
  279. 하나 이상의 검사 화합물을 향기와 연관시키기 위한 컴퓨터-수행된 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 첫 번째 검사 화합물의 첫 번째 후각 활성 프로필을 수용하는 단계, 여기서 상기 첫 번째 후각 활성 프로필은 청구항 [0146]의 방법에 의해 산출되고, 그리고 여기서 상기 첫 번째 검사 화합물은 공지된 향기를 갖고;
    b) 상기 첫 번째 후각 활성 프로필을 데이터베이스에 저장된 복수의 대표 후각 활성 프로필에 비교하여 상기 첫 번째 후각 활성 프로필 및 상기 복수의 대표 후각 활성 프로필 내에 각각의 대표 후각 활성 프로필 사이에 유사성 척도를 결정하는 단계, 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 개별 공지된 화합물에 상응하고, 그리고 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 청구항 [0146]의 방법에 의해 산출되고;
    c) 단계 (b)에서 결정된 유사성 척도에 기초하여, 상기 첫 번째 후각 활성 프로필에 가장 유사한 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필을 결정하는 단계; 그리고
    d) 단계 (c)에서 상기 첫 번째 후각 활성 프로필에 가장 유사한 것으로 결정된 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필에 상응하는 개별 검사 화합물을 상기 공지된 향기와 연관되는 것으로 특징짓는 단계;
    여기서 단계 (a), (b), (c), 그리고 (d)는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
  280. 청구항 [0161]에 있어서, 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필은 유사성 척도가 미리 결정된 역치를 초과하면 첫 번째 후각 활성 프로필에 가장 유사한 것을 특징으로 하는 방법.
  281. 하나 이상의 검사 화합물을 특정 향기와 연관되는 것으로 특징짓기 위한 컴퓨터-수행된 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 첫 번째 검사 화합물의 첫 번째 후각 활성 프로필을 수용하는 단계, 여기서 상기 첫 번째 후각 활성 프로필은 청구항 [0146]의 방법에 의해 산출되고, 그리고 여기서 상기 첫 번째 검사 화합물은 공지된 향기를 갖고;
    b) 복수의 후각 활성 프로필을 군집시키는 단계, 이러한 복수는 상기 첫 번째 후각 활성 프로필 및 복수의 대표 후각 활성 프로필을 포함하고, 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 개별 공지된 화합물에 상응하고, 그리고 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 청구항 [0146]의 방법에 의해 산출되고;
    c) 첫 번째 후각 활성 프로필과 함께 군집하는 상기 복수의 대표 후각 활성 프로필 내에 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필을 확인하는 단계; 그리고
    d) 단계 (c)에서 상기 첫 번째 후각 활성 프로필과 함께 군집되는 것으로 확인된 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필에 상응하는 개별 화합물을 상기 공지된 향기와 연관되는 것으로 특징짓는 단계;
    여기서 단계 (a), (b), (c), 그리고 (d)는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
  282. 식별자를 이용하여 향기에 대하여 하나 이상의 검사 화합물을 분류하는 컴퓨터-수행된 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 상기 식별자를 이용하여, 청구항 [0146]의 방법에 의해 산출된 첫 번째 후각 활성 프로필을 처리하여 데이터베이스에 저장된 복수의 대표 후각 활성 프로필의 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필을 상기 공지된 향기에 대하여 분류하는 단계, 여기서 상기 첫 번째 후각 활성 프로필은 공지된 향기를 갖는 첫 번째 검사 화합물에 상응하고, 그리고 여기서 상기 식별자는 아래의 단계를 포함하는 방법에 따라 훈련되고:
    b) 향기에 대하여 상기 하나 이상의 대표 후각 활성 프로필을 분류하기 위하여 상기 복수의 대표 후각 활성 프로필을 이용하여 상기 식별자를 훈련시키는 단계, 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 개별 공지된 화합물에 상응하고, 그리고 여기서 각각의 대표 후각 활성 프로필은 청구항 [0146]의 방법에 의해 산출되고;
    여기서 이러한 처리는 적절하게 프로그램된 컴퓨터에서 수행된다.
  283. 목적되는 생체내 단백질 또는 복수의 단백질에 대한 시험관내 상관인 단백질 또는 복수의 단백질에 있어서, 시험관내 상관은 생체내에서 발현된 상응하는 목적되는 단백질 또는 복수의 단백질의 기능 또는 활성의 전조가 되고; 여기서 시험관내 상관은 시험관내에서 비-생리학적 조건 하에 발현된 생물학적으로 활성 단백질 또는 복수의 단백질이고; 여기서 시험관내 상관은 목적되는 생체내 단백질 또는 복수의 단백질에 상응하는 적어도 하나의 기능적 또는 약리학적 또는 생리학적 프로필을 포함하고; 그리고 여기서 상기 시험관내 상관을 이용하여 고처리량 스크리닝에서 확인된 화합물 중에서 적어도 10%는 생체내 치료 효과를 가질 수 있는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 복수의 단백질.
  284. 청구항 [0175]에 있어서, 시험관내 상관은 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 복수의 단백질.
  285. 청구항 [0175]에 있어서, 시험관내 상관의 적어도 하나의 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 복수의 단백질.
  286. 청구항 [0175]에 있어서, 시험관내 상관은 이종다합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 복수의 단백질.
  287. 청구항 [0175]에 있어서, 시험관내 상관의 적어도 하나의 단백질은 이종다합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 복수의 단백질.
  288. 청구항 [0175] 내지 287중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 상관의 단백질 또는 복수의 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 복수의 단백질.
  289. 청구항 [0175] 내지 288중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 상관은 선별 압력의 부재에서 배양된 세포에서 안정적으로 발현되는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 복수의 단백질.
  290. 청구항 [0175] 내지 289중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 상관은 세포독성을 유발하지 않으면서 세포주에서 발현되는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 복수의 단백질.
  291. 청구항 [0175] 내지 290중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 상관은 단백질 또는 복수의 단백질을 내생적으로 발현하지 않는 세포에서 발현되는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 복수의 단백질.
  292. 청구항 [0175] 내지 291중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 복수의 단백질을 발현하는 세포.
  293. 청구항 292의 세포로부터 생산된 세포주.
  294. 목적되는 생체내 단백질의 조절제를 확인하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 청구항 292에 따른 세포를 검사 화합물과 접촉시키는 단계; 그리고
    b) 검사 화합물에 의해 접촉되지 않은 세포에서 시험관내 상관의 단백질 또는 복수의 단백질의 활성과 비교하여 검사 화합물과 접촉된 세포에서 시험관내 상관의 단백질 또는 복수의 단백질의 활성에서 변화를 검출하는 단계;
    여기서 부재에서와 비교하여 존재에서 활성의 차이를 발생시키는 화합물은 목적되는 생체내 단백질의 조절제이다.
  295. 청구항 294의 방법에 의해 확인된 조절제.
  296. 청구항 190, 192, [0097], [0100] 내지 [0104], 201 내지 202, [0140] 및 292중 어느 한 항에 있어서, 분화된 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  297. 청구항 190, 192, [0097], [0100] 내지 [0104], 201 내지 202, [0140] 및 292중 어느 한 항에 있어서, 역분화된 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  298. 청구항 297에 있어서, 역분화된 세포는 다분화성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 암 줄기 세포, 장기-특이적 줄기 세포 및 조직-특이적 줄기 세포로 구성된 군에서 선택되는 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  299. 줄기 세포를 산출하는 방법에 있어서, 상기 방법은 분화된 세포를 줄기 세포로 역분화시키는 단계를 포함하고, 여기서 분화된 세포는 청구항 296에 따른 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  300. 재분화된 세포를 산출하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 청구항 296에 따른 세포를 역분화시켜 줄기 세포를 생산하는 단계; 그리고
    b) 상기 줄기 세포를 재분화시켜 재분화된 세포를 생산하는 단계.
  301. 청구항 299 또는 300에 있어서, 줄기 세포는 다분화성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 암 줄기 세포, 장기-특이적 줄기 세포 및 조직-특이적 줄기 세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  302. 청구항 300에 있어서, 재분화된 세포는 청구항 296에 따른 세포와 상이한 유형인 것을 특징으로 하는 방법.
  303. 비-인간 생명체를 산출하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 청구항 296에 따른 세포를 역분화시켜 줄기 세포를 생산하는 단계, 여기서 줄기 세포는 배아 줄기 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포이고; 그리고
    b) 상기 줄기 세포를 재분화시켜 비-인간 생명체를 생산하는 단계.
  304. 청구항 303에 있어서, 생명체는 포유동물인 것을 특징으로 하는 방법.
  305. 청구항 304에 있어서, 포유동물은 생쥐인 것을 특징으로 하는 방법.
  306. 청구항 300의 방법에 의해 생산된 재분화된 세포.
  307. 청구항 303의 방법에 의해 생산된 비-인간 생명체.
  308. 청구항 307에 있어서, 포유동물인 것을 특징으로 하는 비-인간 생명체.
  309. 청구항 308에 있어서, 포유동물은 생쥐인 것을 특징으로 하는 비-인간 생명체.
  310. 청구항 218 또는 227에 있어서, 첫 번째와 두 번째 목적되는 단백질은 독립적으로 ENaC, NaV, GABAA, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 쓴맛 수용체, CFTR 및 GCC로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  311. 청구항 231에 있어서, 각 단백질은 독립적으로 ENaC, NaV, GABAA, 단맛 수용체, 감칠맛 수용체, 쓴맛 수용체, CFTR 및 GCC로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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