WO2023182324A1 - 化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推定する方法 - Google Patents

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WO2023182324A1
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compound
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component analysis
analysis
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正貴 田中
理智 坂口
彩希 中村
大志 伊波
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大塚製薬株式会社
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    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates to a method, device, and program for determining and/or estimating the mechanism of action of a compound in living organisms.
  • the present invention also relates to an antiepileptic drug screening method, device, and program.
  • Non-Patent Document 1 Calcium oscillation is used as a phenomenon that reflects neural activity (Non-Patent Document 1). Synchronized calcium oscillations have been observed in cultured cortical neurons (2 and 3), and calcium oscillations are driven by bursts of action potentials in neuronal cultures (4). Epilepsy is a type of neurological disorder, and it has been suggested that calcium oscillations may be a phenotypic screening method for characterizing some compounds, including antiepileptic drugs (Non-Patent Document 5). However, these are qualitative indicators and are difficult to analyze.
  • the present invention includes, for example, the subject matter described in the following sections.
  • Item 1 A method for determining and/or inferring the mechanism of action of a compound in living organisms, the method comprising: By analyzing the activity of nerve cells in the presence of a compound with a known mechanism of action and a compound with an unknown mechanism of action, and comparing the analysis results, the mechanism of action of a compound with an unknown mechanism of action in living organisms can be determined and/or Guess, how.
  • Item 2. The method according to item 1, wherein the analysis of the nerve cell activity is performed based on a calcium oscillation method.
  • Item 3. (a) Measuring fluorescence associated with calcium oscillations in nerve cells in the presence of a compound with a known mechanism of action and a compound with an unknown mechanism of action, 3.
  • the method according to item 2 comprising: (b) analyzing the fluorescence waveform measured in step (a); and (c) performing principal component analysis on the analysis result of step (b).
  • Item 4. The method according to item 3, further comprising the step of (d) determining and/or inferring the mechanism of action of a compound whose mechanism of action is unknown in living organisms based on the results of the principal component analysis in step (c).
  • Item 5. Items 1 to 4, wherein the compound with a known mechanism of action is an anti-epileptic drug, an anti-schizophrenic drug, an anti-mood disorder drug, an anti-addiction drug, or an anti-higher brain dysfunction drug (preferably an anti-epileptic drug) The method described in any one of the above.
  • a screening method for an anti-epileptic drug, an anti-schizophrenic drug, an anti-mood disorder drug, an anti-addiction drug or an anti-higher brain dysfunction drug comprising: In the presence of a compound and test substance known to have anti-epileptic effect, anti-schizophrenic effect, anti-mood disorder effect, anti-addiction effect or anti-higher brain dysfunction effect (preferably anti-epileptic effect)
  • a compound and test substance known to have anti-epileptic effect, anti-schizophrenic effect, anti-mood disorder effect, anti-addiction effect or anti-higher brain dysfunction effect preferably anti-epileptic effect
  • a method for selecting a candidate substance for an anti-mood disorder drug, an anti-addiction drug, or an anti-higher brain dysfunction drug preferably an anti-epileptic drug.
  • Section 8. (A) Measuring fluorescence associated with calcium oscillations in nerve cells, 8. The method according to item 7, comprising the steps of (B) analyzing the fluorescence waveform measured in step (A), and (C) performing principal component analysis on the analysis result of step (B).
  • test substance Based on the results of the principal component analysis in step (C), if the test substance has a similar mechanism of action as the above-mentioned compound, the test substance can be used as an antiepileptic drug, an antischizophrenia drug, or Item 9.
  • a method for determining and/or inferring the mechanism of action of a compound in living organisms comprising: (b) analyzing the fluorescence waveform associated with calcium oscillations in nerve cells, measured in the presence of a compound with a known mechanism of action and a compound with an unknown mechanism of action; (c) performing principal component analysis on the analysis results of step (b); and (d) determining and/or determining the action mechanism of a compound with an unknown action mechanism in living organisms based on the results of the principal component analysis of step (c).
  • a method comprising the step of estimating. Item 11.
  • a screening method for an anti-epileptic drug, an anti-schizophrenic drug, an anti-mood disorder drug, an anti-addiction drug or an anti-higher brain dysfunction drug comprising: (B) Compounds and test substances known to have anti-epileptic effects, anti-schizophrenic effects, anti-mood disorder effects, anti-addiction effects, or anti-higher brain dysfunction effects (preferably anti-epileptic effects) a step of analyzing fluorescence waveforms associated with calcium oscillations in nerve cells measured in the presence of (C) A step of principal component analysis of the analysis results of step (B), and (D) Based on the results of the principal component analysis of step (C), it is determined that the test substance has the same mechanism of action as the above-mentioned compound.
  • An apparatus for determining and/or inferring the mechanism of action of a compound in living organisms comprising: an analysis unit that analyzes fluorescence waveforms associated with calcium oscillations in nerve cells, measured in the presence of compounds with known mechanisms of action and compounds with unknown mechanisms of action; a principal component analysis section that performs principal component analysis on the analysis results of the analysis section; and a decision that determines and/or infers the mechanism of action of a compound whose action mechanism is unknown in living organisms based on the results of the principal component analysis of the principal component analysis section.
  • a device including an estimator. Item 13.
  • a screening device for anti-epileptic drugs, anti-schizophrenic drugs, anti-mood disorder drugs, anti-addiction drugs or anti-higher brain dysfunction drugs comprising: In the presence of a compound and test substance known to have anti-epileptic effect, anti-schizophrenic effect, anti-mood disorder effect, anti-addiction effect or anti-higher brain dysfunction effect (preferably anti-epileptic effect)
  • An analysis section that analyzes the measured fluorescence waveforms associated with calcium oscillations in nerve cells; a principal component analysis section that analyzes the analysis results of the analysis section as principal components, and based on the results of the principal component analysis of the principal component analysis section, if the test substance has a similar mechanism of action as the compound, a candidate substance selection unit that selects the test substance as a candidate substance for an antiepileptic drug, an antischizophrenia drug, an anti-mood disorder drug, an anti-addiction drug, or an anti-epileptic drugs
  • Section 14 A program for determining and/or inferring the mechanism of action of a compound in living organisms, the program comprising: (b) analyzing the fluorescence waveform associated with calcium oscillations in nerve cells, measured in the presence of a compound with a known mechanism of action and a compound with an unknown mechanism of action; (c) performing principal component analysis on the analysis results of step (b); and (d) determining and/or determining the action mechanism of a compound with an unknown action mechanism in living organisms based on the results of the principal component analysis of step (c).
  • a screening program for anti-epileptic drugs, anti-schizophrenia drugs, anti-mood disorder drugs, anti-addiction drugs or anti-higher brain dysfunction drugs comprising: (B) Compounds and test substances known to have anti-epileptic effects, anti-schizophrenic effects, anti-mood disorder effects, anti-addiction effects, or anti-higher brain dysfunction effects (preferably anti-epileptic effects) a step of analyzing fluorescence waveforms associated with calcium oscillations in nerve cells measured in the presence of (C) A step of principal component analysis of the analysis results of step (B), and (D) Based on the results of the principal component analysis of step (C), it is determined that the test substance has the same mechanism of action as the above-mentioned compound.
  • a computer-readable recording medium storing a program for determining and/or estimating the action mechanism of a compound in living organisms, the program comprising: (b) analyzing the fluorescence waveform associated with calcium oscillations in nerve cells, measured in the presence of a compound with a known mechanism of action and a compound with an unknown mechanism of action; (c) performing principal component analysis on the analysis results of step (b); and (d) determining and/or determining the action mechanism of a compound with an unknown action mechanism in living organisms based on the results of the principal component analysis of step (c).
  • a recording medium that allows a computer to perform the guessing process. Section 17.
  • a computer-readable recording medium recording an antiepileptic drug screening program, the program comprising: (B) Analyzing the fluorescence waveform associated with calcium oscillations in nerve cells, measured in the presence of a compound and test substance known to have antiepileptic effects; (C) A step of principal component analysis of the analysis results of step (B), and (D) Based on the results of the principal component analysis of step (C), it is determined that the test substance has the same mechanism of action as the above-mentioned compound.
  • a recording medium that causes a computer to execute the process of selecting a test substance as a candidate substance for an antiepileptic drug.
  • the mechanism of action of a compound in living organisms can be determined and/or estimated, and therefore compounds can be efficiently screened. Furthermore, according to the present invention, compounds that are candidates for antiepileptic drugs can be efficiently screened.
  • FIG. 1 is a flowchart showing the procedure of a method and a screening method for determining and/or estimating the mechanism of action of a compound in living organisms.
  • 2 is a block diagram of an apparatus and fluorometer for carrying out the method shown in FIG. 1;
  • FIG. This is a graph recording fluorescence associated with calcium oscillations.
  • FIG. 3 is a diagram showing definitions of typical calcium oscillations and waveform characteristics.
  • Mean Peak Height is the difference between the height of the peak top and the height of the peak rising point.
  • Mean Peak Height/Peak Width is the ratio of peak height to peak width. Peak width is the time from the point of peak rise to the time when the signal decreases to 10% of the height of the peak top.
  • Mean peak width 50% is the time from the top of the peak until the signal falls to half of the top of the peak.
  • Method for determining and/or inferring the mechanism of action of a compound of the present invention in an organism By analyzing the activity of nerve cells in the presence of a compound with a known mechanism of action and a compound with an unknown mechanism of action, and comparing the analysis results, the mechanism of action of a compound with an unknown mechanism of action in living organisms can be determined and/or (hereinafter sometimes referred to as "determination/estimation method of the present invention").
  • Neurons that can be used in the present invention are not particularly limited as long as their activity can be analyzed to determine and/or infer the action mechanism of a compound whose action mechanism is unknown.
  • nerve cells extracted from the brain of a fetus nerve cells extracted from brain organoids, nerve cells produced by inducing differentiation from pluripotent stem cells, or nerve cells further cultured from these. , neuronal cell lines, and the like.
  • Specific examples of neurons include primary cultured neurons of the cerebral cortex.
  • Pluripotent stem cells include embryonic stem (ES) cells, embryonic stem (ntES) cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transfer, spermatogonial stem cells (GS cells), embryonic germ cells (EG cells), and induced polymorphisms. Examples include potent stem (iPS) cells, cultured fibroblasts, and pluripotent stem cells (Muse cells) derived from bone marrow stem cells.
  • the nerve cells in the present invention can be obtained from mammals such as humans, monkeys, rats, mice, rabbits, horses, cows, goats, sheep, dogs, and cats. Preferably, it is obtained from rats, more preferably from rat fetuses.
  • Primary culture of cerebral cortical neurons can be performed according to known methods (see, for example, Cell Rep. 2017 Jan 17;18(3):791-803). Specifically, the procedure is as follows. Furthermore, culture of neurons other than primary culture of cerebral cortical neurons can be performed according to known methods.
  • Rats can be used after several days of acclimatization.
  • the fetus is separated from the uterus of a healthy pregnant rat, and the whole brain is removed from the fetus.
  • the removed whole brain is immersed in an ice-cold medium.
  • the cerebral cortex is separated from the soaked whole brain.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the enzyme reaction solution used includes a papain/DNase I solution, and the reaction conditions include, for example, a reaction time of 30 to 40°C, preferably 36 to 38°C, for 5 to 60 minutes, preferably 20 to 30 minutes. I do.
  • Tissue pieces and cell aggregates are removed using a nylon mesh or the like, and the cells are collected.
  • the collected cells are centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes and redispersed in Neurobasal medium. Calculate the viable cell density of the redispersed cells using 0.5% trypan blue, suspend the required number of cells, and seed into a 96-well or 384-well culture plate. At this time, the cell density to be seeded is approximately 1 to 4 ⁇ 10 5 cells/cm 2 .
  • Compounds with a known mechanism of action and compounds with an unknown mechanism of action can be used without particular restrictions, such as low molecular weight compounds, high molecular weight compounds, biopolymers (peptides, proteins, nucleic acids, polysaccharides, etc.). ), and various compound libraries containing such compounds can also be used.
  • the types of compounds with known mechanisms of action used in the determination/estimation method of the present invention are, for example, 1 to 238, 1 to 118, 1 to 78, 1 to 58, 1 to 28, 1 to 18 There may be about 1 to 13 pieces.
  • Compounds with a known mechanism of action are not particularly limited as long as they have a mechanism that acts on the activity of nerve cells; for example, various known compounds that are known to have a mechanism that acts on the activity of nerve cells. (For example, drugs that have already been approved, compounds that are in the development stage, compounds whose development has been discontinued, compounds that have been reported in patents or literature to have a mechanism that acts on nerve cell activity, PerkinElmer, Selleck , compounds commercially available from MedChemExpress, etc.) can be used.
  • Specific examples of compounds with known mechanisms of action include antiepileptic drugs, antischizophrenia drugs (schizophrenia includes refractory (treatment-resistant, chronic) schizophrenia with cognitive impairment, and schizophrenia without cognitive impairment).
  • Anti-drug such as the above-mentioned antiepileptic drug means a prophylactic and/or therapeutic drug for the above-mentioned disease.
  • the determination/estimation method of the present invention is a method for determining and/or inferring the mechanism of action in living organisms, and examples of living organisms include humans, monkeys, rats, mice, rabbits, horses, cows, goats, and sheep. , a dog, a cat, etc., and preferably a human.
  • analysis is performed in the presence of compounds with known mechanisms of action and compounds with unknown mechanisms of action.
  • Such methods include, for example, a method of mixing cells with a solution containing these compounds (eg, Tyrode's buffer).
  • the concentration of the compound in the solution is not particularly limited as long as it is a concentration that allows analysis of nerve cell activity, and may be, for example, 0.001 to 5000 ⁇ M.
  • the upper or lower limit of the range is, for example, 0.001, 0.003, 0.005, 0.01, 0.03, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5, 1, 3, 5, 10, 30, 50, 100, 300, 500, 1000, 3000, 5000 ⁇ M It is.
  • concentration of the compound is within this range, changes caused by the compound can be better distinguished from changes caused by default, and calcium oscillations can be more clearly confirmed.
  • the same compound may be measured using two or more different concentrations.
  • different concentrations may be used for each type of compound.
  • the method for analyzing the activity of nerve cells is not particularly limited, and various known methods can be used.
  • Such neuronal activity can be captured, for example, by calcium oscillations.
  • calcium oscillations can be detected by measuring intracellular calcium using a calcium indicator.
  • calcium indicators include fluorescent calcium indicators whose fluorescence intensity changes before and after binding with calcium ions, and various known compounds as calcium indicators, such as Calbryte such as Cal-520, Fura-2 AM, It is possible to use commercially available calcium indicators such as Fluo-3 AM, Fluo-4 AM, BioTracker, and genetically encoded calcium indicators such as GCaMP.
  • a calcium indicator fluorescence is emitted due to calcium oscillations, so calcium oscillations can be visualized by fluorescence analysis. That is, calcium oscillations can be visualized by irradiating cells with light of a specific excitation wavelength and measuring the intensity of the specific emission wavelength over time.
  • Fluorescence can be measured using a plate reader.
  • a plate reader a microplate reader is preferred, and a microplate reader capable of simultaneous dispensing and simultaneous measurement of 96 wells/384 wells is more preferred.
  • FDSS/ ⁇ Cell manufactured by Hamamatsu Photonics Co., Ltd.
  • simultaneous dispensing and measurement of 96 wells/384 wells is possible.
  • the fluorescence measurement time can be, for example, about 1 to 20 minutes.
  • the upper or lower limit of the range may be, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 minutes. .
  • the mechanism of action of a compound whose mechanism of action is unknown in an organism is determined and/or inferred.
  • the method for determining and/or inferring the mechanism of action in living organisms is not particularly limited as long as it is possible to determine and/or infer the mechanism of action.
  • Specific embodiments of the determination/estimation method of the present invention include those including at least one of the following steps.
  • Step (a) is as already described above.
  • step (b) the waveform obtained by recording calcium oscillations over time using a fluorescence analysis method is analyzed. These waveforms may be analyzed visually or by using a computer. If you use a computer, you can extract waveform features by using Spotfire's Wave Finder (Data Visualization & Analytics Software-TIBCO Spotfire, http://spotfire.tibco.com/), or by using R or Python. It is possible to implement. Furthermore, it is also possible to perform multifaceted analysis by using applications that utilize AI (artificial intelligence), for example.
  • AI artificial intelligence
  • Analysis items include, for example, the number of waveform peaks (total number of peaks, number of peaks per unit time), time between peaks (average, standard deviation, maximum, minimum), peak height (average, standard deviation, coefficient of variation), peak Amplitude (average, standard deviation), peak brightness value/bottom brightness value ratio (average, standard deviation), bottom brightness value (average, standard deviation), rising slope (0 to 100%, 10 to 90%, 20 to 80% , 30-70%) (average, standard deviation), falling slope (0-100%, 10-90%, 20-80%, 30-70%) (average, standard deviation), peak width (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) (average, standard deviation), inter-peak width (average, standard deviation), total peak area (average, standard deviation), peak height/peak width (average, standard deviation), and peak width from the top of the peak to the peak's 50% height (average, standard deviation).
  • step (c) principal component analysis is performed on the fluorescence waveform of step (b) based on the analysis results.
  • Two or more types of data to be used for principal component analysis are selected from the analysis items, for example, 2 types, 3 types, 4 types, 5 types, 6 types, 7 types, 8 types, and 9 types.
  • Selected data can be subjected to principal component analysis using software such as R, JMP, SPSS, SAS, MATLAB(TM), etc.
  • a scatter diagram can be created using, for example, a first principal component and a second principal component.
  • the concentration of the compound used when performing principal component analysis may be only one concentration, or two or more concentrations may be used.
  • the concentration of compounds can be, for example, about 1 to 10 types.
  • the upper limit or lower limit of the range may be, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9 types.
  • step (d) based on the results of principal component analysis, the distribution of the principal component analysis of a compound with a known mechanism of action is compared, and the mechanism of action of a known compound with a matching distribution is compared with that of a compound with an unknown mechanism of action.
  • the mechanism can be determined and/or inferred.
  • the distribution of a compound with an unknown mechanism of action does not match any of the distributions of compounds with a known mechanism of action, it is assumed that the compound may have a new mechanism of action, and therefore it is considered that the compound has a new mechanism of action. can be determined and/or inferred.
  • determination/estimation method of the present invention includes an embodiment including the above steps (a) to (c), an embodiment including the above steps (a) to (d), and an embodiment including the above steps (b) to (d). Embodiments are also included.
  • a method for determining and/or inferring the mechanism of action of a compound in living organisms comprising: (a) Measuring fluorescence associated with calcium oscillations in nerve cells in the presence of a compound with a known mechanism of action and a compound with an unknown mechanism of action, (b) a step of analyzing the fluorescence waveform measured in step (a); and (c) a step of principal component analysis of the analysis result of step (b).
  • a method for determining and/or inferring the mechanism of action of a compound in living organisms comprising: (a) measuring fluorescence associated with calcium oscillations in nerve cells in the presence of a compound with a known mechanism of action and a compound with an unknown mechanism of action; (b) analyzing the fluorescence waveform measured in step (a); (c) performing principal component analysis on the analysis results of step (b); and (d) determining and/or determining the action mechanism of a compound with an unknown action mechanism in living organisms based on the results of the principal component analysis of step (c).
  • a method comprising the step of estimating.
  • a method for determining and/or inferring the mechanism of action of a compound in living organisms comprising: (b) analyzing the fluorescence waveform associated with calcium oscillations in nerve cells, measured in the presence of a compound with a known mechanism of action and a compound with an unknown mechanism of action; (c) performing principal component analysis on the analysis results of step (b); and (d) determining and/or determining the action mechanism of a compound with an unknown action mechanism in living organisms based on the results of the principal component analysis of step (c).
  • a method comprising the step of estimating.
  • the determination/estimation method of the present invention can determine and/or infer a mechanism as long as it affects the activity of nerve cells.
  • diseases that have mechanisms that affect the activity of nerve cells include epilepsy, schizophrenia, mood disorders, addiction, and higher brain dysfunction, and therapeutic, preventive, and diagnostic drugs for these diseases.
  • the mechanism of this can be determined and/or inferred.
  • the screening method for anti-epileptic drugs, anti-schizophrenic drugs, anti-mood disorder drugs, anti-addiction drugs, or anti-higher brain dysfunction drugs (preferably anti-epileptic drugs) of the present invention includes: In the presence of a compound and test substance known to have anti-epileptic effect, anti-schizophrenic effect, anti-mood disorder effect, anti-addiction effect or anti-higher brain dysfunction effect (preferably anti-epileptic effect) By analyzing the activity of nerve cells and comparing the analysis results, if the test substance has a similar mechanism of action as the compound, it is determined whether the test substance is an anti-epileptic drug, an anti-schizophrenia drug, or an anti-schizophrenic drug.
  • an anti-mood disorder drug an anti-addiction drug, or an anti-higher brain dysfunction drug (preferably an anti-epileptic drug) (hereinafter sometimes referred to as the "screening method of the present invention").
  • the screening method for anti-epileptic drugs, anti-schizophrenia drugs, anti-mood disorder drugs, anti-addiction drugs, or anti-higher brain dysfunction drugs (preferably anti-epileptic drugs) of the present invention includes the above-mentioned determination method of the present invention;
  • One of the embodiments of the estimation method "Having an anti-epileptic effect, an anti-schizophrenic effect, an anti-mood disorder effect, an anti-addiction effect, or an anti-higher brain dysfunction effect (preferably an anti-epileptic effect)" "A compound with a known mechanism of action" corresponds to a "compound with a known mechanism of action," and a "test substance” corresponds to a "compound with an unknown mechanism of action.”
  • test substance can be used without any particular restriction, and includes, for example, low-molecular compounds, high-molecular compounds, biopolymers (peptides, proteins, nucleic acids, polysaccharides, etc.); Various compound libraries can also be used.
  • Specific embodiments of the screening method of the present invention include those including at least one of the following steps.
  • A Compounds and test substances known to have anti-epileptic effect, anti-schizophrenic effect, anti-mood disorder effect, anti-addiction effect or anti-higher brain dysfunction effect (preferably anti-epileptic effect) measuring fluorescence associated with calcium oscillations in nerve cells in the presence of
  • B Analyzing the fluorescence waveform measured in step (A), (C) a step of principal component analysis of the analysis results of step (B);
  • D Based on the results of the principal component analysis in step (C), if the test substance has a similar mechanism of action as the above-mentioned compound, the test substance can be used as an antiepileptic drug, an antischizophrenia drug, or A step of selecting a candidate substance for a mood disorder drug, an anti-addiction drug, or an anti-higher brain dysfunction drug (preferably an anti-epileptic drug).
  • step (D) based on the results of principal component analysis, anti-epileptic effect, anti-schizophrenia effect, anti-mood disorder effect, anti-addiction effect or anti-higher brain dysfunction effect (preferably anti-epileptic effect) Compare the distribution with the distribution of principal component analysis of compounds known to have It can be selected as a candidate substance for a brain dysfunction drug (preferably an antiepileptic drug).
  • the distribution of candidate substances is the distribution of compounds known to have anti-epileptic effects, anti-schizophrenic effects, anti-mood disorder effects, anti-addiction effects, or anti-higher brain dysfunction effects (preferably anti-epileptic effects) If it does not match any of the above, it is determined that the test substance is not an anti-epileptic drug, anti-schizophrenia drug, anti-mood disorder drug, anti-addiction drug, or anti-higher brain dysfunction drug (preferably an anti-epileptic drug). and/or can be inferred.
  • the screening method of the present invention includes an embodiment including the above steps (A) to (C), an embodiment including the above steps (A) to (D), and an embodiment including the above steps (B) to (D). , also includes.
  • a screening method for an anti-epileptic drug, an anti-schizophrenic drug, an anti-mood disorder drug, an anti-addiction drug or an anti-higher brain dysfunction drug comprising: (A) Compounds and test substances known to have anti-epileptic effect, anti-schizophrenic effect, anti-mood disorder effect, anti-addiction effect or anti-higher brain dysfunction effect (preferably anti-epileptic effect) measuring fluorescence associated with calcium oscillations in nerve cells in the presence of (B) A method comprising the steps of analyzing the fluorescence waveform measured in step (A), and (C) performing principal component analysis on the analysis result of step (B).
  • a screening method for an anti-epileptic drug, an anti-schizophrenic drug, an anti-mood disorder drug, an anti-addiction drug or an anti-higher brain dysfunction drug comprising: (A) Compounds and test substances known to have anti-epileptic effect, anti-schizophrenic effect, anti-mood disorder effect, anti-addiction effect or anti-higher brain dysfunction effect (preferably anti-epileptic effect) measuring fluorescence associated with calcium oscillations in nerve cells in the presence of (B) Analyzing the fluorescence waveform measured in step (A), (C) A step of principal component analysis of the analysis results of step (B), and (D) Based on the results of the principal component analysis of step (C), it is determined that the test substance has the same mechanism of action as the above-mentioned compound.
  • a screening method for an anti-epileptic drug, an anti-schizophrenic drug, an anti-mood disorder drug, an anti-addiction drug or an anti-higher brain dysfunction drug comprising: (B) Compounds and test substances known to have anti-epileptic effects, anti-schizophrenic effects, anti-mood disorder effects, anti-addiction effects, or anti-higher brain dysfunction effects (preferably anti-epileptic effects) a step of analyzing fluorescence waveforms associated with calcium oscillations in nerve cells measured in the presence of (C) A step of principal component analysis of the analysis results of step (B), and (D) Based on the results of the principal component analysis of step (C), it is determined that the test substance has the same mechanism of action as the above-mentioned compound.
  • test substance as a candidate substance for an anti-epileptic drug, an anti-schizophrenia drug, an anti-mood disorder drug, an anti-addiction drug, or an anti-higher brain dysfunction drug (preferably an anti-epileptic drug).
  • an anti-epileptic drug including methods.
  • FIG. 1 is a flowchart showing the processing procedure of the determination/estimation method and screening method of the present invention
  • FIG. 2 is a block diagram of an apparatus 1 and a fluorometer 2 for carrying out steps S1 to S6 of the method. be.
  • the device 1 can be configured with a general-purpose computer, and has a hardware configuration including a processor such as a CPU and a GPU, a main storage device such as a DRAM or SRAM, and an auxiliary storage device such as an HDD or SSD. Furthermore, the device 1 may be configured with a plurality of computers.
  • the apparatus 1 includes an analysis section 11, a principal component analysis section 12, a determination/estimation section 13, and a candidate substance selection section 14 as functional blocks. Each of these parts can be realized in software by the processor of the device 1 reading the program of the present invention into the main storage and executing it.
  • the program may be downloaded to the device 1 via a communication network such as the Internet, or may be installed in the device 1 via a computer-readable non-transitory recording medium such as a CD-R on which the program is recorded. It's okay.
  • step S1 the fluorometer 2 measures fluorescence accompanying calcium oscillations in nerve cells in the presence of a compound with a known mechanism of action and a compound (test substance) with an unknown mechanism of action. .
  • the measured fluorescence waveform is transmitted to the device 1.
  • the mechanism of action is an antiepileptic action
  • the compound with a known mechanism of action is an antiepileptic drug.
  • the mechanism of action is an anti-schizophrenic effect, an anti-mood disorder effect, an anti-addiction effect, or an anti-higher brain dysfunction effect
  • the compound is an anti-schizophrenic drug, an anti-mood disorder drug. , an anti-addiction drug, or an anti-higher brain dysfunction drug.
  • Step (a) and step (A) described in the claims correspond to step S1.
  • step S2 the analysis unit 11 of the device 1 analyzes the fluorescence waveform measured in step S1.
  • Step (b) and step (B) described in the claims correspond to step S2.
  • step S3 the principal component analysis unit 12 of the apparatus 1 performs principal component analysis on the analysis result of step S3.
  • Steps (c) and (C) described in the claims correspond to step S3.
  • step S4 the determination/estimation unit 13 of the apparatus 1 determines and/or infers the mechanism of action of a compound (test substance) with an unknown action mechanism in living organisms based on the result of the principal component analysis in step S3.
  • Step (d) described in the claims corresponds to step S4.
  • step S5 if the test substance has the same action mechanism (antiepileptic effect) as a known compound (YES in step S5), the process moves to step S6, and the candidate substance selection unit 14 of the device 1 selects the Select a test substance as a candidate substance for an antiepileptic drug.
  • Step (D) described in the claims corresponds to steps S4 to S6.
  • the cerebral cortex was collected in ice-cold HBSS and dissociated in PBS containing 0.25% papain/Dnase I for 30 minutes in an incubator. Add 10 mL of Neurobasal medium and pipette 10 times. The supernatant was collected, filtered using a cell strainer (#352350, Falcon Biosystems, Inc.), and centrifuged (1,000 rpm, 5 minutes).
  • the pellet was suspended in Ovomucoid protease inhibitor/HBSS, centrifuged (800 rpm, 5 min), and treated with B27 supplement (#17504044, Gibco), GlutaMAX (#35050061, Gibco), penicillin-streptomycin solution (#P4333, Sigma- Aldrich) containing Neurobasal medium (#21103-049, Gibco).
  • Dissociated cells were seeded in 60 wells (excluding peripheral wells of a 96-well plate (#3842, Corning)) at a density of 75,000 cells/well. Cell cultures were maintained in a 5% CO2 incubator at 37°C, and half of the medium was changed twice a week. In all experiments, cultures were used DIV14.
  • Fluorescence intensity data was extracted from FDSS/ ⁇ Cell software. Data analysis and visualization used Spotfire's Wave Finder (Data Visualization & Analytics Software-TIBCO Spotfire, http://spotfire.tibco.com/). Six items were quantified from the fluorescence intensity data: average detected peak height, coefficient of variation of detected peak height, average peak height/peak width, 50% peak width, total area under the curve, and total number of detected peaks.
  • PCA Principal component analysis
  • Rat primary cortical neurons were cultured in 96-well plates, and calcium oscillations were observed using a fluorescent calcium indicator dissolved in Tyrode's buffer at day 14 in vitro.
  • the results are shown in Figure 3.
  • Tyrode's buffer with low magnesium concentration (0.1 mM) was used to mimic neuronal activity in epilepsy.
  • FDSS/ ⁇ Cell we succeeded in simultaneously observing synchronized calcium oscillations in 60 wells ( Figure 3). More than 40 peaks were observed in each well in 5 minutes. Therefore, we decided to measure calcium oscillations under these conditions in the next pharmacological experiment.
  • the characteristics are the average detected peak height (Mean Peak Height), coefficient of variation of detected peak height (CV of Peak Height), average peak height/peak width (Mean Peak Height /Peak Width), and average 50% peak for each well.
  • Width (Mean peak width 50%: peak width from the time of peak top to the time when the signal falls to half of the peak top), total area under the average curve (AUC), and total number of peaks detected (Peak Number).
  • Test compounds included diazepam (10 ⁇ M) and clonazepam, positive allosteric modulators (PAMs) of GABAergic inhibitory activity, and carbamazepine (10 ⁇ M), an inhibitor of excitatory input through voltage-gated sodium channels.
  • carbamazepine (30 ⁇ M) lamotrigine (10 ⁇ M) and lacosamide (100 ⁇ M), levetiracetam (100 ⁇ M), brivaracetam (100 ⁇ M), perampanel (100 ⁇ M), which is widely used as an antiepileptic drug. perampanel) (100 ⁇ M) (Table 1).
  • PCA principal component analysis
  • Diazepam and clonazepam which have the same mechanism, moved in the same direction as their concentrations increased, whereas carbamazepine and perampanel, which have different mechanisms, were separated by trajectories rather than at a single concentration.
  • the mechanism of action of a compound whose mechanism of action is unknown can be easily determined or inferred, and therefore the mechanism of action of a compound whose mechanism of action is unknown can be quickly determined or inferred.

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Abstract

開示されているのは、化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する方法であって、作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物の存在下で神経細胞の活動を解析し、当該解析結果を比較することにより、作用メカニズムが未知の化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する、方法、並びに抗てんかん薬のスクリーニング方法であって、抗てんかん作用を有することが既知の化合物及び被検物質の存在下で神経細胞の活動を解析し、当該解析結果を比較することにより、被検物質が前記化合物と同様の作用メカニズムを有している場合に、被検物質を抗てんかん薬の候補物質として選択する、方法である。

Description

化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推定する方法
　本発明は、化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推定する方法、装置及びプログラムに関する。また、本発明は、抗てんかん薬のスクリーニング方法、装置及びプログラムに関する。
　神経活動を反映する現象として、カルシウム振動（calcium oscillation）が使用されている（非特許文献１）。同期したカルシウム振動は培養皮質ニューロンで観察され（非特許文献２及び３）、カルシウム振動はニューロン培養における活動電位のバーストによって駆動される（非特許文献４）。てんかんは神経障害の一種であり、カルシウム振動は、抗てんかん薬を含むいくつかの化合物を特徴づけるための表現型スクリーニング法である可能性が示唆されている（非特許文献５）。しかし、これらは定性的な指標であり、解析が困難である。
D. Smetters, et. al., Methods A Companion to Methods Enzymol., 18(2), 215-221, 1999 T. Tanaka, et. al., Jpn. J. Pharmacol., 70(1), 89-93, 1996 H. P. C. Robinson, et. al., J. Neurophysiol., 70(4), 1606-1616, 1993 M. Shen, et. al., J. Neurosci., 16(14), 4322-4334, 1996 N. Pacico et. al., PLoS One, 9(1), 2014
　本発明は、化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推定する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、抗てんかん薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、カルシウム振動で得られる各種データを主成分分析の手法を用いて解析することにより、公知化合物のメカニズムによって、その特徴が異なることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、例えば、以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
　化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する方法であって、
作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物の存在下で神経細胞の活動を解析し、当該解析結果を比較することにより、作用メカニズムが未知の化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する、方法。
項２．
　前記神経細胞の活動の解析が、カルシウム振動法に基づいて実施される、項１に記載の方法。
項３．
（ａ）作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物の存在下で神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光を測定する工程、
（ｂ）工程（ａ）で測定した蛍光波形を解析する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）の解析結果を主成分分析する工程
を含む、項２に記載の方法。
項４．
（ｄ）工程（ｃ）の主成分分析の結果に基づき、作用メカニズムが未知の化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する工程
を更に含む、項３に記載の方法。
項５．
　前記作用メカニズムが既知の化合物が抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）である、項１～４のいずれか一項に記載の方法。
項６．
　抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）のスクリーニング方法であって、
抗てんかん作用、抗統合失調症作用、抗気分障害作用、抗依存症作用又は抗高次脳機能障害作用（好ましくは、抗てんかん作用）を有することが既知の化合物及び被検物質の存在下で神経細胞の活動を解析し、当該解析結果を比較することにより、被検物質が前記化合物と同様の作用メカニズムを有している場合に、被検物質を抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）の候補物質として選択する、方法。
項７．
　前記神経細胞の活動の解析が、カルシウム振動法に基づいて実施される、項６に記載の方法。
項８．
（Ａ）神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光を測定する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で測定した蛍光波形を解析する工程、及び
（Ｃ）工程（Ｂ）の解析結果を主成分分析する工程
を含む、項７に記載の方法。
項９．
（Ｄ）工程（Ｃ）の主成分分析の結果に基づき、被検物質が前記化合物と同様の作用メカニズムを有している場合に、被検物質を抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）の候補物質として選択する工程
を更に含む、項８に記載の方法。
項１０．
　化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する方法であって、
（ｂ）作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物の存在下で測定した、神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光波形を解析する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の解析結果を主成分分析する工程、及び
（ｄ）工程（ｃ）の主成分分析の結果に基づき、作用メカニズムが未知の化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する工程
を含む、方法。
項１１．
　抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）のスクリーニング方法であって、
（Ｂ）抗てんかん作用、抗統合失調症作用、抗気分障害作用、抗依存症作用又は抗高次脳機能障害作用（好ましくは、抗てんかん作用）を有することが既知の化合物及び被検物質の存在下で測定した、神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光波形を解析する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）の解析結果を主成分分析する工程、及び
（Ｄ）工程（Ｃ）の主成分分析の結果に基づき、被検物質が前記化合物と同様の作用メカニズムを有している場合に、被検物質を抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）の候補物質として選択する工程
を含む、方法。
項１２．
　化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する装置であって、
　作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物の存在下で測定した、神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光波形を解析する解析部、
　前記解析部の解析結果を主成分分析する主成分分析部、及び
　前記主成分分析部の主成分分析の結果に基づき、作用メカニズムが未知の化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する決定／推測部
を含む、装置。
項１３．
　抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）のスクリーニング装置であって、
　抗てんかん作用、抗統合失調症作用、抗気分障害作用、抗依存症作用又は抗高次脳機能障害作用（好ましくは、抗てんかん作用）を有することが既知の化合物及び被検物質の存在下で測定した、神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光波形を解析する解析部、
　前記解析部の解析結果を主成分分析する主成分分析部、及び
　前記主成分分析部の主成分分析の結果に基づき、被検物質が前記化合物と同様の作用メカニズムを有している場合に、被検物質を抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）の候補物質として選択する候補物質選択部
を含む、装置。
項１４．
　化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測するプログラムであって、
（ｂ）作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物の存在下で測定した、神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光波形を解析する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の解析結果を主成分分析する工程、及び
（ｄ）工程（ｃ）の主成分分析の結果に基づき、作用メカニズムが未知の化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する工程
をコンピュータに実行させる、プログラム。
項１５．
　抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）のスクリーニングプログラムであって、
（Ｂ）抗てんかん作用、抗統合失調症作用、抗気分障害作用、抗依存症作用又は抗高次脳機能障害作用（好ましくは、抗てんかん作用）を有することが既知の化合物及び被検物質の存在下で測定した、神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光波形を解析する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）の解析結果を主成分分析する工程、及び
（Ｄ）工程（Ｃ）の主成分分析の結果に基づき、被検物質が前記化合物と同様の作用メカニズムを有している場合に、被検物質を抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）の候補物質として選択する工程
をコンピュータに実行させる、スクリーニングプログラム。
項１６．
　化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測するプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、前記プログラムは、
（ｂ）作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物の存在下で測定した、神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光波形を解析する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の解析結果を主成分分析する工程、及び
（ｄ）工程（ｃ）の主成分分析の結果に基づき、作用メカニズムが未知の化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する工程
をコンピュータに実行させる、記録媒体。
項１７．
　抗てんかん薬のスクリーニングプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、前記プログラムは、
（Ｂ）抗てんかん作用を有することが既知の化合物及び被検物質の存在下で測定した、神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光波形を解析する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）の解析結果を主成分分析する工程、及び
（Ｄ）工程（Ｃ）の主成分分析の結果に基づき、被検物質が前記化合物と同様の作用メカニズムを有している場合に、被検物質を抗てんかん薬の候補物質として選択する工程
をコンピュータに実行させる、記録媒体。
　本発明により、化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推定することができるので、効率的に化合物のスクリーニングを行うことができる。また、本発明により、抗てんかん薬の候補となる化合物のスクリーニングを効率的に行うことができる。
化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推定する方法及びスクリーニング方法の処理手順を示すフローチャートである。 図１に示す方法を実行するための装置及び蛍光測定器のブロック図である。 カルシウム振動に伴う蛍光を記録したグラフである。 代表的なカルシウム振動と波形の特徴の定義を示す図である。平均検出ピーク高（Mean Peak Height）はピークトップの高さとピーク上昇点の高さとの差である。平均ピーク高/ピーク幅（Mean Peak Height /Peak Width）はピーク幅に対するピーク高の比率である。ピーク幅はピーク上昇点からピークトップの高さの10%までシグナルが減少する時間までの時間である。50%ピーク幅（Mean peak width 50%）はピークトップからシグナルがピークトップの半分まで落ちるまでの時間である。AUCは台形公式によって計算した。 蛍光波形（１濃度）を解析した結果を示すグラフである。特徴は1つの抗てんかん薬あたり6ウェルから計算した。データは平均±SEMである（n=6ウェル）。*P<0.05（1ウェルあたりn=40-123ピーク、one-way ANOVA with Dunnett post hoc test） 主成分分析（１濃度）の結果を示す散布図である。 蛍光波形（３濃度）を解析した結果を示すグラフである。特徴は1つの抗てんかん薬あたり6ウェルから計算した。データは平均±SEMである（n=3-6ウェル）。*P<0.05（1ウェルあたりn=43-113ピーク、one-way ANOVA with Dunnett post hoc test） 主成分分析（３濃度）の結果を示す散布図である。各マーカーは薄い色が低濃度を示し、濃い色が高濃度を示す。同じ抗てんかん薬のプロットが濃度の順に線で結ばれている。
　以下、本発明に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。
　作用メカニズムを決定及び／又は推測する方法
　本発明の化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する方法は、
作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物の存在下で神経細胞の活動を解析し、当該解析結果を比較することにより、作用メカニズムが未知の化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する（以下、「本発明の決定／推測方法」と称することもある）。
　本明細書中で用いる語句及び用語について、以下に詳述する。
　本発明で使用することができる神経細胞としては、活動を解析し、作用メカニズムが未知の化合物の作用メカニズムを決定及び／又は推測することができる神経細胞であれば特に限定されず、例えば、生体の脳から抽出した神経細胞、胎児（胎仔）の脳から抽出した神経細胞、脳オルガノイドから抽出した神経細胞、多能性幹細胞から分化誘導して製造した神経細胞、又はこれらをさらに培養した神経細胞、神経細胞の細胞株などを挙げることができる。神経細胞の具体例としては、大脳皮質初代培養神経細胞が挙げられる。多能性幹細胞としては、胚性幹（ES）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞、精子幹細胞（GS細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、人工多能性幹（iPS）細胞、培養線維芽細胞及び骨髄幹細胞由来の多能性幹細胞（Muse細胞）などが挙げられる。
　本発明における神経細胞（例えば、大脳皮質初代培養神経細胞など）は、例えば、ヒト、サル、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコなどの哺乳動物から得られるものであり、好ましくは、ラット、より好ましくは、ラット胎仔から得られるものである。
　大脳皮質神経細胞の初代培養は、公知の方法に準じて行うことができる（例えば、Cell Rep. 2017 Jan 17;18(3):791-803参照）。具体的には、以下の手順で実施する。また、大脳皮質神経細胞の初代培養以外の神経細胞の培養についても、公知の方法に準じて行うことができる。
　ラットは、数日間の馴化飼育を行ってから使用することができる。健康状態の良好な妊娠ラットの子宮から胎仔を切り離し、胎仔から全脳を摘出する。摘出した全脳は、氷冷した培地に浸漬する。浸漬した全脳から大脳皮質を分取する。その後、リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄し、酵素反応により細胞を分散する。使用する酵素反応溶液としては、パパイン/DNase I溶液が挙げられ、反応条件としては、例えば30～40℃、好ましくは36～38℃で、例えば5～60分間、好ましくは20～30分間の反応を行う。次にNeurobasal mediumなどを添加し、ピペットで分散する。これをナイロンメッシュなどで組織片及び細胞凝集塊を除去し、細胞を回収する。回収した細胞は、1000rpmで5分間遠心分離を行いNeurobasal mediumなどで再分散させる。再分散させた細胞の生細胞密度を0.5%トリパンブルーなどを用いて算出し、必要な細胞数を懸濁して96ウェル又は384ウェルの培養プレートに播種する。この際、播種する細胞密度は、およそ1～4×105個/cm2が挙げられる。播種後は、5%二酸化炭素、36～38℃の条件で培養する。そして、週に2～3回程度培地の半量交換を行う。
　作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物における化合物としては、特に制限なく使用することができ、例えば、低分子化合物、高分子化合物、生体高分子(ペプチド、タンパク質、核酸、多糖類等)などが挙げられ、このような化合物を含む種々の化合物ライブラリーも使用できる。本発明の決定／推測方法に使用する作用メカニズムが既知の化合物の種類は、例えば、１～238個、1～118個、1～78個、１～58個、1～28個、1～18個、1～13個程度でありうる。
　作用メカニズムが既知の化合物としては、神経細胞の活動に作用するメカニズムを有する化合物であれば特に制限されず、例えば、神経細胞の活動に作用するメカニズムを有することが知られている各種公知の化合物（例えば、既に承認されている医薬品、開発段階にある化合物、開発等が中止された化合物、神経細胞の活動に作用するメカニズムを有することが特許、文献等で報告されている化合物、PerkinElmer、Selleck、MedChemExpressなどにより市販されている化合物）などを使用することができる。作用メカニズムが既知の化合物の具体例としては、抗てんかん薬、抗統合失調症薬（統合失調症としては、認知障害を伴う難治性（治療抵抗性、慢性）統合失調症、認知障害を伴わない難治性（治療抵抗性、慢性）統合失調症等を含む）、抗気分障害薬、抗依存症薬（依存症としては、アルコール依存症、薬物依存症等を含む）、抗高次脳機能障害薬などが挙げられる。上記抗てんかん薬などの「抗～薬」とは、上記疾患の予防薬及び／又は治療薬を意味する。
　本発明の決定／推測方法は、生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する方法であり、ここでの生物としては、例えば、ヒト、サル、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコなどの哺乳動物であり、好ましくは、ヒトである。
　神経細胞の活動を解析する際には、作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物の存在下で解析を行う。このような方法としては、例えば、細胞とこれらの化合物を含む溶液（例えば、Tyrode'sバッファー）とを混合する方法が挙げられる。
　溶液中の化合物の濃度は、神経細胞の活動を解析できる濃度であれば、特に限定されず、例えば、0.001～5000μMであり得る。当該範囲の上限又は下限は、例えば0.001, 0.003, 0.005, 0.01, 0.03, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5, 1, 3, 5, 10, 30, 50, 100, 300, 500, 1000, 3000, 5000μMである。化合物の濃度がこの範囲であると、化合物による変化をデフォルトによる変化とより区別することができるようになり、且つカルシウム振動をより確認することができるようになる。また、同じ化合物について、2以上の複数の種類の濃度を使用して測定してもよい。さらに、化合物の種類毎に異なる濃度を使用してもよい。
　神経細胞の活動を解析する方法は、特に限定されず、各種公知の方法を使用することができる。そのような神経細胞の活動は、例えば、カルシウム振動によって捕捉することができる。
　さらに、カルシウム振動は、カルシウム指示薬を使用して細胞内のカルシウムを測定することで検出することが可能である。このようなカルシウム指示薬としては、カルシウムイオンとの結合前後に蛍光強度が変化する蛍光カルシウム指示薬などが挙げられ、カルシウム指示薬として各種公知の化合物、例えば、Cal-520などのCalbryte、Fura-2 AM、Fluo-3 AM、Fulo-4 AM、BioTrackerなどの市販のカルシウム指示薬、GCaMPなどのGenetic encoded calcium indicatorを使用することが可能である。カルシウム指示薬を使用することでカルシウム振動により蛍光を発するので、蛍光分析法によりカルシウム振動を可視化することができる。すなわち、特定の励起波長の光を細胞に照射して、特定の発光波長の強度を経時的に測定することによりカルシウム振動を可視化することができる。
　蛍光の測定は、プレートリーダーを用いて測定することができる。プレートリーダーとしては、マイクロプレートリーダーが好ましく、96ウェル／384ウェルの同時分注、同時測定が可能なマイクロプレートリーダーがさらに好ましい。例えば、FDSS/μCell（浜松ホトニクス株式会社製）を用いると、96ウェル／384ウェルの同時分注、同時測定が可能である。
　蛍光の測定時間は、例えば、1～20分間程度であり得る。当該範囲の上限又は下限は、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19分であってもよい。
　このように神経細胞の活動を解析することで得られた解析結果を比較することによって、作用メカニズムが未知の化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する。生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する方法としては、作用メカニズムを決定及び／又は推測することが可能である限り特に限定されない。本発明の決定／推測方法の具体的な実施態様としては、以下の少なくとも１つの工程を含むものが挙げられる。
（ａ）作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物の存在下で神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光を測定する工程、
（ｂ）工程（ａ）で測定した蛍光波形を解析する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の解析結果を主成分分析する工程、
（ｄ）工程（ｃ）の主成分分析の結果に基づき、作用メカニズムが未知の化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する工程。
　工程（ａ）は上で既に説明されているものである。工程（ｂ）では、カルシウム振動を蛍光分析法で経時的に記録することで得られた波形を解析する。これらの波形の解析は目視で行ってもよいし、コンピュータを用いてもよい。コンピュータを使用する場合は、SpotfireのWave Finder（Data Visualization＆Analytics Software-TIBCO Spotfire、http：//spotfire.tibco.com/）を使用することにより波形の特徴を抽出することができるし、R又はPythonでも実施可能である。また、例えば、AI（人工知能）等を活用したアプリケーションを用いることにより、多面的に解析することも可能である。
　解析項目としては、例えば、波形ピーク数（総ピーク数、単位時間当たりのピーク数）、ピーク間時間（平均、標準偏差、最大、最小）、ピーク高（平均、標準偏差、変動係数）、ピーク振幅（平均、標準偏差）、ピーク輝度値/ボトム輝度値レシオ（平均、標準偏差）、ボトム輝度値（平均、標準偏差）、立ち上がりスロープ(0～100%、10～90%、20～80%、30～70%)（平均、標準偏差）、立ち下がりスロープ(0～100%、10～90%、20～80%、30～70%)（平均、標準偏差）、ピーク幅（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）（平均、標準偏差）、ピーク間幅（平均、標準偏差）、ピーク総面積（平均、標準偏差）、ピーク高/ピーク幅（平均、標準偏差）、ピークの頂点からピークが50%の高さになるまでのピーク幅（平均、標準偏差）を挙げることができる。
　工程（ｃ）では工程（ｂ）の蛍光波形を解析結果に基づき主成分分析を行う。主成分分析に用いるデータは解析項目から2種類以上、例えば、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類を選択する。選択したデータは、R、JMP、SPSS、SAS、MATLAB（商標）などのソフトウェアを使用して主成分分析を行うことができる。散布図は、例えば、第一主成分、第二主成分を用いて作成することができる。
　主成分分析を行う際に使用する化合物の濃度は、1濃度のみでもよいし、2種類以上の濃度を使用することもできる。化合物の濃度は、例えば、1～10種類程度であり得る。当該範囲の上限又は下限は、例えば2、3、4、5、6、7、8、9種類であってもよい。2種類以上の濃度を使用する場合は、2種類以上の異なる濃度を用いて、各濃度で主成分分析を行うことにより、濃度による変化具合から、単一の濃度では区別ができなかった化合物を区別することも可能となり得る。
　工程（ｄ）では、主成分分析の結果に基づいて、作用メカニズムが既知の化合物の主成分分析の分布と比較し、分布が合致した既知の化合物の作用メカニズムを、作用メカニズムが未知の化合物のメカニズムと決定及び／又は推測することができる。作用メカニズムが未知の化合物の分布が、作用メカニズムが既知の化合物の分布のいずれとも合致しないときは、新たな作用メカニズムを有する可能性が推察されるため、新たな作用メカニズムを有する化合物であると決定及び／又は推測することができる。
　なお、本発明の決定／推測方法は、上記工程（ａ）～（ｃ）を含む実施形態、上記工程（ａ）～（ｄ）を含む実施形態、上記工程（ｂ）～（ｄ）を含む実施形態、も包含する。
　上記工程（ａ）～（ｃ）を含む実施形態は以下のように記載することができる。
化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する方法であって、
（ａ）作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物の存在下で神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光を測定する工程、
（ｂ）工程（ａ）で測定した蛍光波形を解析する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）の解析結果を主成分分析する工程
を含む、方法。
　上記工程（ａ）～（ｄ）を含む実施形態は以下のように記載することができる。
化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する方法であって
（ａ）作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物の存在下で神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光を測定する工程、
（ｂ）工程（ａ）で測定した蛍光波形を解析する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の解析結果を主成分分析する工程、及び
（ｄ）工程（ｃ）の主成分分析の結果に基づき、作用メカニズムが未知の化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する工程
を含む、方法。
　上記工程（ｂ）～（ｄ）を含む実施形態は以下のように記載することができる。
化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する方法であって、
（ｂ）作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物の存在下で測定した、神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光波形を解析する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の解析結果を主成分分析する工程、及び
（ｄ）工程（ｃ）の主成分分析の結果に基づき、作用メカニズムが未知の化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する工程
を含む、方法。
　本発明の決定／推測方法は、神経細胞の活動に作用するメカニズムであれば、メカニズムを決定及び／又は推測することができる。神経細胞の活動に作用するメカニズムを有する疾患としては、例えば、てんかん、統合失調症、気分障害、依存症、高次脳機能障害などを挙げることができ、これらの治療薬、予防薬、診断薬のメカニズムを決定及び／又は推測することができる。
　スクリーニング方法
　本発明の抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）のスクリーニング方法は、
抗てんかん作用、抗統合失調症作用、抗気分障害作用、抗依存症作用又は抗高次脳機能障害作用（好ましくは、抗てんかん作用）を有することが既知の化合物及び被検物質の存在下で神経細胞の活動を解析し、当該解析結果を比較することにより、被検物質が前記化合物と同様の作用メカニズムを有している場合に、被検物質を抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）の候補物質として選択する（以下、「本発明のスクリーニング方法」と称することもある）。
　本発明の抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）のスクリーニング方法は、前述する本発明の決定／推測方法の実施形態の1つであり、「抗てんかん作用、抗統合失調症作用、抗気分障害作用、抗依存症作用又は抗高次脳機能障害作用（好ましくは、抗てんかん作用）を有することが既知の化合物」が「作用メカニズムが既知の化合物」に、「被検物質」が「作用メカニズムが未知の化合物」に対応する。本発明の抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）のスクリーニング方法は、特に明示しない限り、本発明の決定／推測方法と基本的には同様に実施することができる。
　被検物質としては、特に制限なく使用することができ、例えば、低分子化合物、高分子化合物、生体高分子(ペプチド、タンパク質、核酸、多糖類等)などが挙げられ、このような化合物を含む種々の化合物ライブラリーも使用できる。
　本発明のスクリーニング方法の具体的な実施態様としては、以下の少なくとも１つの工程を含むものが挙げられる。
（Ａ）抗てんかん作用、抗統合失調症作用、抗気分障害作用、抗依存症作用又は抗高次脳機能障害作用（好ましくは、抗てんかん作用）を有することが既知の化合物及び被検物質の存在下で神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光を測定する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で測定した蛍光波形を解析する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）の解析結果を主成分分析する工程、
（Ｄ）工程（Ｃ）の主成分分析の結果に基づき、被検物質が前記化合物と同様の作用メカニズムを有している場合に、被検物質を抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）の候補物質として選択する工程。
　工程（Ｄ）では、主成分分析の結果に基づいて、抗てんかん作用、抗統合失調症作用、抗気分障害作用、抗依存症作用又は抗高次脳機能障害作用（好ましくは、抗てんかん作用）を有することが既知の化合物の主成分分析の分布と比較し、分布が合致した場合、被検物質を抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）の候補物質として選択することができる。候補物質の分布が、抗てんかん作用、抗統合失調症作用、抗気分障害作用、抗依存症作用又は抗高次脳機能障害作用（好ましくは、抗てんかん作用）を有することが既知の化合物の分布のいずれとも合致しないときは、被検物質を抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）でないと決定及び／又は推測することができる。
　なお、本発明のスクリーニング方法は、上記工程（Ａ）～（Ｃ）を含む実施形態、上記工程（Ａ）～（Ｄ）を含む実施形態、上記工程（Ｂ）～（Ｄ）を含む実施形態、も包含する。
　上記工程（Ａ）～（Ｃ）を含む実施形態は以下のように記載することができる。
抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）のスクリーニング方法であって、
（Ａ）抗てんかん作用、抗統合失調症作用、抗気分障害作用、抗依存症作用又は抗高次脳機能障害作用（好ましくは、抗てんかん作用）を有することが既知の化合物及び被検物質の存在下で神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光を測定する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で測定した蛍光波形を解析する工程、及び
（Ｃ）工程（Ｂ）の解析結果を主成分分析する工程
を含む、方法。
　上記工程（Ａ）～（Ｄ）を含む実施形態は以下のように記載することができる。
抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）のスクリーニング方法であって、
（Ａ）抗てんかん作用、抗統合失調症作用、抗気分障害作用、抗依存症作用又は抗高次脳機能障害作用（好ましくは、抗てんかん作用）を有することが既知の化合物及び被検物質の存在下で神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光を測定する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で測定した蛍光波形を解析する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）の解析結果を主成分分析する工程、及び
（Ｄ）工程（Ｃ）の主成分分析の結果に基づき、被検物質が前記化合物と同様の作用メカニズムを有している場合に、被検物質を抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）の候補物質として選択する工程
を含む、方法。
　上記工程（Ｂ）～（Ｄ）を含む実施形態は以下のように記載することができる。
抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）のスクリーニング方法であって、
（Ｂ）抗てんかん作用、抗統合失調症作用、抗気分障害作用、抗依存症作用又は抗高次脳機能障害作用（好ましくは、抗てんかん作用）を有することが既知の化合物及び被検物質の存在下で測定した、神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光波形を解析する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）の解析結果を主成分分析する工程、及び
（Ｄ）工程（Ｃ）の主成分分析の結果に基づき、被検物質が前記化合物と同様の作用メカニズムを有している場合に、被検物質を抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬（好ましくは、抗てんかん薬）の候補物質として選択する工程。
を含む、方法。
　決定／推測及びスクリーニングの処理手順
　続いて、本発明の決定／推測方法及びスクリーニング方法の処理手順の一例について説明する。図１は、本発明の決定／推測方法及びスクリーニング方法の処理手順を示すフローチャートであり、図２は、該方法の工程Ｓ１～Ｓ６を実行するための装置１及び蛍光測定器２のブロック図である。
　装置１は、汎用のコンピュータで構成することができ、ハードウェア構成として、CPU、GPUなどのプロセッサ、DRAM、SRAMなどの主記憶装置、及びHDD、SSDなどの補助記憶装置を備えている。また、装置１は、複数のコンピュータで構成してもよい。
　装置１は、機能ブロックとして、解析部１１と、主成分分析部１２と、決定／推測部１３と、候補物質選択部１４と、を含む。これらの各部は、装置１のプロセッサが、本発明のプログラムを主記憶装置に読み出して実行することにより、ソフトウェア的に実現することができる。当該プログラムは、インターネット等の通信ネットワークを介して装置１にダウンロードしてもよいし、当該プログラムを記録したCD-R等のコンピュータ読み取り可能な非一時的な記録媒体を介して装置１にインストールしてもよい。
　図１に示すフローチャートでは、工程Ｓ１において、蛍光測定器２が、作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物（被検物質）の存在下で神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光を測定する。測定された蛍光波形は、装置１に送信される。本実施形態では、前記作用メカニズムが抗てんかん作用であり、前記作用メカニズムが既知の化合物が抗てんかん薬である。他の実施形態としては、前記作用メカニズムが抗統合失調症作用、抗気分障害作用、抗依存症作用又は抗高次脳機能障害作用であり、前記化合物が抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬であることが挙げられる。特許請求の範囲に記載の工程（ａ）及び工程（Ａ）は、工程Ｓ１に対応する。
　工程Ｓ２において、装置１の解析部１１が、工程Ｓ１で測定した蛍光波形を解析する。特許請求の範囲に記載の工程（ｂ）及び工程（Ｂ）は、工程Ｓ２に対応する。
　工程Ｓ３において、装置１の主成分分析部１２が、工程Ｓ３の解析結果を主成分分析する。特許請求の範囲に記載の工程（ｃ）及び工程（Ｃ）は、工程Ｓ３に対応する。
　工程Ｓ４において、装置１の決定／推測部１３が、工程Ｓ３の主成分分析の結果に基づき、作用メカニズムが未知の化合物（被検物質）の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する。特許請求の範囲に記載の工程（ｄ）は、工程Ｓ４に対応する。
　その結果、被検物質が既知の化合物と同様の作用メカニズム（抗てんかん作用）を有している場合（工程Ｓ５においてＹＥＳ）、工程Ｓ６に移行し、装置１の候補物質選択部１４が、被検物質を抗てんかん薬の候補物質として選択する。特許請求の範囲に記載の工程（Ｄ）は、工程Ｓ４～Ｓ６に対応する。
　本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
　なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本発明は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。
　また、上述した本発明の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本発明に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本発明には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
　本発明は、更に以下の実施例によって詳しく説明されるが、これらは本発明を限定するものではなく、また本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。
　神経細胞の調製
　妊娠18日目のラット（Crl：CD（SD））の胚をPapain Dissociation System（Worthington Biochemical Corp）を使用して解離し皮質ニューロンを調製した。
　具体的には、大脳皮質を氷冷HBSSに収集し、インキュベーター内で0.25%パパイン/Dnase I含有PBS中で30分間解離させた。Neurobasal培地を10 mL加え、10回ピペッティングした。上清を回収し、セルストレーナー（＃352350、株式会社ファルコンバイオシステムズ）を使用してろ過し、遠心分離（1,000 rpm、5分）した。ペレットをOvomucoidプロテアーゼ阻害剤/HBSSに懸濁し、遠心分離（800 rpm、5分）し、B27サプリメント（＃17504044、Gibco）、GlutaMAX（＃35050061、Gibco）、ペニシリン-ストレプトマイシン溶液（＃P4333、Sigma-Aldrich）を含むNeurobasal培地（＃21103-049、Gibco）で再懸濁した。
　解離した細胞を60ウェル（96ウェルプレート（＃3842、Corning）の周辺ウェルを除く）に75,000細胞/ウェルの密度で播種した。細胞培養は37℃の5% CO2インキュベーター内で維持し、培地の半分は週に2回交換した。すべての実験において、培養物はDIV14を使用した。
　カルシウムイメージングの準備
　Cal-520（＃21130、AAT-Bioquest）のバイアルを、0.01% Pluronic（商標） F-127（＃P3000MP、Invitrogen）を含むTyrode'sバッファー（0.1 mM Mg2+）に2μMになるように再懸濁した。培養物をタイロードバッファーで3回洗浄し、1ウェルあたり80μlのCal-520で37℃ 1時間インキュベートした。培養プレートをアッセイ場所に設置し、測定前に10分以上安定化させた。
　カルシウムイメージングの測定
　FDSS/μCell（浜松ホトニクス株式会社）を使用して、カルシウムシグナルを蛍光強度データとして記録した。インキュベーション後、FDSS/μCellの96ディスペンサーヘッドを使用して表１に示した試験化合物をタイロードバッファーに溶解させた溶液及び溶媒対照を20μL分注した。分注から5分以上後にカルシウムシグナルを以下の測定条件で5分間測定した。
・測定条件：
　　露光時間36.5 ms
　　励起波長480 nm
　　発光波長540 nm
　　温度37℃
　蛍光強度データの数値化
　蛍光強度データは、FDSS/μCellソフトウェアから抽出した。データ分析と可視化は、SpotfireのWave Finder（Data Visualization＆Analytics Software-TIBCO Spotfire、http：//spotfire.tibco.com/）を用いた。蛍光強度データから平均検出ピーク高、検出ピーク高の変動係数、平均ピーク高/ピーク幅、50%ピーク幅、曲線下総面積、総検出ピーク数の6項目を数値化した。
　主成分分析（PCA）
　PCA分析用にRによって作成されたカスタムコードを使用して処理した。PCA分析の特徴は、特徴の相関と各波形の目視検査に基づいて選択した。各ウェルの統計分析を実行し、GraphPad Prism 7を使用して視覚化した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　結果
　96ウェルプレートでラット初代皮質神経細胞を培養し、インビトロで14日目にTyrode'sバッファーに溶解した蛍光カルシウムインジケーターを使用してカルシウム振動を観察した。結果を図３に示す。てんかんにおける神経細胞の活動を模倣するために、低マグネシウム濃度(0.1 mM)のTyrode'sバッファーを使用した。FDSS/μCellを使用し同時に60ウェルの同期したカルシウム振動を観察することに成功した（図３）。各ウェルにおいて5分間で40以上のピークが観察された。それ故、次の薬理学的実験においてもこれらの条件でカルシウム振動を測定することに決めた。
　カルシウム振動の形状を評価するために、Wave Finder softwareを使用して波形の6つの特徴を抽出した（図４参照）。当該特徴は、各ウェルについて、平均検出ピーク高（Mean Peak Height）、検出ピーク高の変動係数（CV of Peak Height）、平均ピーク高/ピーク幅（Mean Peak Height /Peak Width）、平均50%ピーク幅（Mean peak width 50%：ピークトップの時間からシグナルがピークトップの半分まで落ちる時間までのピーク幅）、平均曲線下総面積（AUC）、総検出ピーク数（Peak Number）。試験化合物としては、GABA作動性阻害活性のポジティブアロステリックモジュレーター（PAM）であるジアゼパム（diazepam）（10μM）及びクロナゼパム（clonazepam）、電位依存性ナトリウムチャネルを介した興奮性入力の阻害剤であるカルバマゼピン（carbamazepine）（30μM）、ラモトリギン（lamotrigine）（10μM）及びラコサミド（lacosamide）（100μM）、抗てんかん薬として広く使用されているレベチラセタム（levetiracetam）（100μM）、ブリバラセタム（brivaracetam）（100μM）、ペランパネル（perampanel）（100μM）を使用した（表１）。各化合物は、FDSS/μCellのオートディスペンサーによってプレートの6ウェルに分注、5分間インキュベートし、5分間カルシウム振動のシグナルを記録した。結果を図５に示す。DMSO（0.1%）が分注されたウェルと比べて、試験化合物が分注されたウェルのカルシウム振動の特徴について変化しているものがあった。
　次に、主成分分析（PCA）を使用して化合物によるカルシウム振動の特徴を比較した。結果を図６に示す。2つの成分（PC1、PC2）の固有値は1以上であった。2つの成分は、変動性の83.8%を説明した。
　次に、PCAプロットにおいてDMSOのプロットから離れた位置にある化合物の濃度依存性を確認した。レベチラセタムとブリバラセタムはカルシウム振動の特徴にほとんど影響を与えなかったので、この実験から除外した。6つの化合物を3種類の濃度で、1条件当たり3つのウェルに分注した。前述するように全ての検出されたピークから特徴を抽出した。結果を図７に示す。また、主成分分析の結果を図８に示す。濃度が増加するほど、プロットはDMSOのプロットから分離されており、化合物は様々な軌道に沿って移動した。同じメカニズムであるジアゼパムとクロナゼパムは濃度が増加しても同じ方向に移動したのに対して、異なるメカニズムであるカルバマゼピンとペランパネルは単一の濃度とは異なり軌道によって分離していた。
　本発明によれば、作用メカニズムが未知の化合物の作用メカニズムを容易に決定又は推測できるため、作用メカニズムが未知の化合物の作用メカニズムの決定又は推測が迅速に行うことができる。
１　　装置
１１　解析部
１２　主成分分析部
１３　決定／推測部
１４　候補物質選択部
２　　蛍光測定器

Claims (17)

  1. 　化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する方法であって、
    作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物の存在下で神経細胞の活動を解析し、当該解析結果を比較することにより、作用メカニズムが未知の化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する、方法。
  2. 　前記神経細胞の活動の解析が、カルシウム振動法に基づいて実施される、請求項１に記載の方法。
  3. （ａ）作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物の存在下で神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光を測定する工程、
    （ｂ）工程（ａ）で測定した蛍光波形を解析する工程、及び
    （ｃ）工程（ｂ）の解析結果を主成分分析する工程
    を含む、請求項２に記載の方法。
  4. （ｄ）工程（ｃ）の主成分分析の結果に基づき、作用メカニズムが未知の化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する工程
    を更に含む、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記作用メカニズムが既知の化合物が抗てんかん薬、抗統合失調症薬、抗気分障害薬、抗依存症薬又は抗高次脳機能障害薬である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　抗てんかん薬のスクリーニング方法であって、
    抗てんかん作用を有することが既知の化合物及び被検物質の存在下で神経細胞の活動を解析し、当該解析結果を比較することにより、被検物質が前記化合物と同様の作用メカニズムを有している場合に、被検物質を抗てんかん薬の候補物質として選択する、方法。
  7. 　前記神経細胞の活動の解析が、カルシウム振動法に基づいて実施される、請求項６に記載の方法。
  8. （Ａ）抗てんかん作用を有することが既知の化合物及び被検物質の存在下で神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光を測定する工程、
    （Ｂ）工程（Ａ）で測定した蛍光波形を解析する工程、及び
    （Ｃ）工程（Ｂ）の解析結果を主成分分析する工程
    を含む、請求項７に記載の方法。
  9. （Ｄ）工程（Ｃ）の主成分分析の結果に基づき、被検物質が前記化合物と同様の作用メカニズムを有している場合に、被検物質を抗てんかん薬の候補物質として選択する工程
    を更に含む、請求項８に記載の方法。
  10. 　化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する方法であって、
    （ｂ）作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物の存在下で測定した、神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光波形を解析する工程、
    （ｃ）工程（ｂ）の解析結果を主成分分析する工程、及び
    （ｄ）工程（ｃ）の主成分分析の結果に基づき、作用メカニズムが未知の化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する工程
    を含む、方法。
  11. 　抗てんかん薬のスクリーニング方法であって、
    （Ｂ）抗てんかん作用を有することが既知の化合物及び被検物質の存在下で測定した、神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光波形を解析する工程、
    （Ｃ）工程（Ｂ）の解析結果を主成分分析する工程、及び
    （Ｄ）工程（Ｃ）の主成分分析の結果に基づき、被検物質が前記化合物と同様の作用メカニズムを有している場合に、被検物質を抗てんかん薬の候補物質として選択する工程
    を含む、方法。
  12. 　化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する装置であって、
    　作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物の存在下で測定した、神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光波形を解析する解析部、
    　前記解析部の解析結果を主成分分析する主成分分析部、及び
    　前記主成分分析部の主成分分析の結果に基づき、作用メカニズムが未知の化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する決定／推測部
    を含む、装置。
  13. 　抗てんかん薬のスクリーニング装置であって、
    　抗てんかん作用を有することが既知の化合物及び被検物質の存在下で測定した、神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光波形を解析する解析部、
    　前記解析部の解析結果を主成分分析する主成分分析部、及び
    　前記主成分分析部の主成分分析の結果に基づき、被検物質が前記化合物と同様の作用メカニズムを有している場合に、被検物質を抗てんかん薬の候補物質として選択する候補物質選択部
    を含む、装置。
  14. 　化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測するプログラムであって、（ｂ）作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物の存在下で測定した、神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光波形を解析する工程、
    （ｃ）工程（ｂ）の解析結果を主成分分析する工程、及び
    （ｄ）工程（ｃ）の主成分分析の結果に基づき、作用メカニズムが未知の化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する工程
    をコンピュータに実行させる、プログラム。
  15. 　抗てんかん薬のスクリーニングプログラムであって、
    （Ｂ）抗てんかん作用を有することが既知の化合物及び被検物質の存在下で測定した、神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光波形を解析する工程、
    （Ｃ）工程（Ｂ）の解析結果を主成分分析する工程、及び
    （Ｄ）工程（Ｃ）の主成分分析の結果に基づき、被検物質が前記化合物と同様の作用メカニズムを有している場合に、被検物質を抗てんかん薬の候補物質として選択する工程
    をコンピュータに実行させる、スクリーニングプログラム。
  16. 　化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測するプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、前記プログラムは、
    （ｂ）作用メカニズムが既知の化合物及び作用メカニズムが未知の化合物の存在下で測定した、神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光波形を解析する工程、
    （ｃ）工程（ｂ）の解析結果を主成分分析する工程、及び
    （ｄ）工程（ｃ）の主成分分析の結果に基づき、作用メカニズムが未知の化合物の生物における作用メカニズムを決定及び／又は推測する工程
    をコンピュータに実行させる、記録媒体。
  17. 　抗てんかん薬のスクリーニングプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、前記プログラムは、
    （Ｂ）抗てんかん作用を有することが既知の化合物及び被検物質の存在下で測定した、神経細胞のカルシウム振動に伴う蛍光波形を解析する工程、
    （Ｃ）工程（Ｂ）の解析結果を主成分分析する工程、及び
    （Ｄ）工程（Ｃ）の主成分分析の結果に基づき、被検物質が前記化合物と同様の作用メカニズムを有している場合に、被検物質を抗てんかん薬の候補物質として選択する工程
    をコンピュータに実行させる、記録媒体。
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JP2012516687A (ja) * 2009-02-02 2012-07-26 クロモセル コーポレーション 新規の細胞株および方法
JP2020052865A (ja) * 2018-09-28 2020-04-02 学校法人東北工業大学 対象化合物の特性の予測を行うための方法、コンピュータシステム、プログラム

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