CN110283902A - 一种肺动脉高压环状rna分子标志物、其制备方法和应用试剂盒 - Google Patents

一种肺动脉高压环状rna分子标志物、其制备方法和应用试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种肺动脉高压环状RNA分子标志物、其制备方法和应用。本发明涉及的肺动脉高压RNA分子标志物是环形RNA。本发明还给出了提取肺动脉高压环状RNA分子标志物的方法和鉴定肺动脉高压环状RNA分子标志物的方法。同时，本发明用鉴定肺动脉高压环状RNA分子标志物的方法来区分肺动脉平滑肌细胞的种类。通过控制细胞培养条件，获得了一种肺动脉平滑肌细胞，这种肺动脉平滑肌细胞中的环形RNA分子标物的含量显著高于健康人体的肺动脉平滑肌细胞中环形RNA分子标物的水平。这种新型的肺动脉平滑肌细胞的功能和作用也是不同的。

Description

一种肺动脉高压环状RNA分子标志物、其制备方法和应用试 剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学和生物化学领域；具体涉及一种肺动脉高压环状RNA分子标志物。除涉及肺动脉高压环状RNA分子标志物外，本发明还涉及这种肺动脉高压环状RNA分子标志物的制备方法；进一步地，本发明还涉及这种肺动脉高压环状RNA分子标志物的应用，即用这种肺动脉高压环状RNA分子标志物制造的试剂盒。
背景技术
肺动脉高压症是一种血流动力学状态和病理状态，其表现为肺动脉压力升高超过一定界值的生理现象。根据肺动脉高压症的血流动力学诊断标准，如果在海平面静息状态下，用右心导管检测肺动脉平均压≥25mmHg，那么医生将给出“患者具有肺动脉高压症”的诊断结论。
肺动脉高压症是一种常见病、多发病，并且致残率和病死率均非常高，对患者的生命健康具有危害，肺动脉高压症会导致右心衰竭。右心衰竭，是一种复杂的临床综合症，这种病症由多种因素引发。因此，在判定患者的病症引发原因时，需要综合考虑各方面的因素，这说明对右心衰竭的临床诊断过程是复杂的。但是，如果仅从人体生理结构与生理功能之间的关系来考察肺动脉高压症的发病原因，那么心血管系统的结构发生异常的变化引起的右心室充盈或射血功能受损是导致肺动脉高压症的发病原因。
心血管系统的结构发生异常的变化，是由于心血管系统内的组织或者细胞发生了异常变化。因此，如果从细胞层面来考察细胞内的成分变化、细胞器的结构变化和细胞内物质新陈代谢的生物化学反应过程变化，那么将能够清楚地揭示出心血管系统的结构发生异常的变化的生物化学反应机制。当谈到心血管系统的结构发生异常的变化的生物化学反应机制时，必然会进一步地引出细胞内生物分子的化学变化过程。这涉及细胞内生物分子的种类、结构和功能。
为了研究心血管系统内细胞的生物分子的种类、结构及其生物化学反应机制，必然涉及到揭示心血管系统内细胞的生物分子的种类、结构及其生物化学反应机制所采取的研究手段。因此，本发明给出了一种RNA分子标志物。利用这种RNA分子标志物来制备诊断试剂或者制疗药物，从而干预心血管系统内细胞的生物分子的种类、结构及其生物化学反应。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种肺动脉高压环状RNA分子标志物，所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的碱基序列为SEQ ID No.1。
所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的制备方法，包括：
第一步骤，在0℃用TRIzolLS试剂重新悬浮肺动脉平滑肌细胞10min，抑制所述肺动脉平滑肌细胞的核酸酶活性，并且裂解所述肺动脉平滑肌细胞；
第二步骤，在0℃用氯仿洗涤所述肺动脉平滑肌细胞的蛋白质，静止后所述RNA分子标志物溶解于体系上层水相中；
第三步骤，在4℃下离心，使所述肺动脉平滑肌细胞的蛋白质沉淀，并且移出所述RNA分子标志物的上层水相；
第四步骤，在0℃用异丙醇洗涤所述RNA分子标志物的水相，在4℃离心后获得所述RNA分子标志物的粗制品沉淀。
优选的，第五步骤，在0℃用无水乙醇洗涤所述RNA分子标志物的粗制品沉淀，在4℃下离心后获得所述RNA分子标志物的精制品。
所述RNA分子标志物的含量鉴定方法，包括：
第一步骤，在0℃配制逆转录反应体系，逆转录反应体系在37℃保温15min、85℃保温5sec、4℃保温∞的温度控制和时间控制的条件下完成逆转录反应过程，获得带有cDNA的逆转录反应体系；
其中，逆转录反应体系由2.0uL的5×PrimeScriptTM Buffer，0.5uL的Oligo dTPrimer(50uM)，0.5uL的PrimeScriptTM RT Enzyme Mix×1，0.5uL的Random 6mers(100μM)，500ng的Total RNA和Up to 10uL的RNase-free Water组成；
第二步骤，向2uL的带有cDNA的逆转录反应体系中加入SYBR-Green染料、2×SYBR(R)Premix Ex Taq酶、0.4uL的PCR Forward primer(10uM)、0.4uL的PCR Reverse primer(10uM)、7.2uL的ddH2O，经历95℃预变性1min、(95℃变性5sec→60℃退火30sec→72℃延伸45sec)×40个循环，并且收集荧光信号后获得循环数CT值；
其中，PCR Forward primer为5'-ACAACACCACTCACTTCGCA-3'，PCR Reverseprimer为5'-CAGGTGCTACCTTTCGAGCA-3'；
第三步骤，用2ΔΔCT法标准曲线定量分析所述RNA分子标志物的初始含量。
用所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的含量鉴定方法区别肺动脉平滑肌细胞的种类。当肺动脉平滑肌细胞中所述环形RNA分子标志物含量增加时，这种环形RNA分子标志物对micro-RNA具有吸附作用。特别地，在肺动脉平滑肌细胞中所述环形RNA分子标志物含量为0.5％至1.5％，micro-RNA的检验信号弱。当所述环形RNA分子标志物含量为1.4％时，micro-RNA的检验信号特别弱。这导致micro-RNA的功能不能在生物化学反应中表现出来。这意味着，当肺动脉平滑肌细胞中所述肺动脉高压环状RNA分子标志物含量超过一定临界值时，肺动脉平滑肌细胞的功能将发生变化。因此，能够用所述肺动脉高压环状RNA分子标志物鉴定方法区别肺动脉平滑肌细胞的功能种类，即该细胞是正常地发挥功能的，还是非正常地发挥功能的。
一种肺动脉平滑肌细胞，所述肺动脉平滑肌细胞包含所述肺动脉高压环状RNA分子标志物，所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的含量为0.5％至1.5％。
优选的，所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的含量为1.4％。
一种肺动脉平滑肌细胞的制备方法，所述肺动脉平滑肌细胞的制备方法包括将肺动脉平滑肌细胞进行体外扩增的步骤，所述体外扩增的步骤是在0.1％低氧环境中进行的。
一种降低micro-RNA在生化反应中参与量的方法，在所述生化反应中放入带有上述肺动脉平滑肌细胞。
优选的，所述降低micro-RNA在生化反应中参与量的方法，所述肺动脉平滑肌细胞中所述RNA分子标志物的含量较高。
具体实施方式
在这份发明专利申请中，通过具体实施方式进一步详细说明的技术方案并不构成对该发明内容的任何限制。任何人通过对发明权利要求范围所做出的限制性修改内容，仍然落入这份发明权利要求的保护范围内。
获取肺动脉平滑肌细胞。取5mL人体外周血样品，加入EDTA抗凝剂后，通过高速离心，分离上层血清。取少量血清在显微镜下观察，存在平滑肌细胞。取平滑肌细胞置于培养基上扩增。
取少量血清在培养基上扩增平滑肌细胞时，将样品分为2组，一组放置于0.1％的低氧环境中扩增培养，另一组放置于21％的高氧环境中培养。培养后的样品备用。
下面，将详细说明RNA分子标志物的制备方法。
第一步骤，在0℃用TRIzolLS试剂重新悬浮所述肺动脉平滑肌细胞10min，抑制所述肺动脉平滑肌细胞的核酸酶活性，并且裂解所述肺动脉平滑肌细胞。
1.具体操作过程如下：
首先，在EP管中按照3:1的体积比加入少量的TRIzol LS试剂和血清。然后，用涡旋振荡器混匀EP管内的TRIzol LS试剂和血清。最后，将EP管置于冰浴中静止10min，使EP管内的TRIzol LS试剂和血清至于0℃。此时，平滑肌细胞被裂解，细胞内蛋白质发生变性。
2.所用试剂
TRIzol LS试剂中含有异硫氰酸胍酚和β-巯基乙醇。异硫氰酸胍酚，不但可以溶解蛋白质，而且能够使蛋白质二级结构消失，是一类强力的蛋白质变性剂。在这种试剂的作用下，细胞结构发生降解，核蛋白与核酸迅速分离。β-巯基乙醇能够破坏RNase蛋白质中的二硫键。因此，它可以作用RNA降解酶的抑制剂。
第二步骤，在0℃用氯仿洗涤所述肺动脉平滑肌细胞的蛋白质，静止后所述RNA分子标志物溶解于体系上层水相中。
具体操作过程如下：
首先，在EP管中按照每0.75mL TRIzol LS加入0.2mL氯仿的比例加入氯仿。然后，用涡旋振荡器混匀EP管内的试剂10s。最后，将EP管置于冰浴中静止10min，使EP管内细胞蛋白质分布于底层、DNA分布于中层、RNA分布于上层水相中。
第三步骤，在4℃下离心，使所述肺动脉平滑肌细胞的蛋白质沉淀，并且移出所述RNA分子标志物的上层水相。
具体操作过程如下：
设置高速离心机的温度参数、转速参数、和离心时间参数为4℃、12000g、15min，启动离心机，使EP管内的变性蛋白质和DNA沉淀。用移液器将EP管中的水相层转移至新的EP管中，获得总RNA溶液。此时，获得细胞内的总RNA粗液。
第四步骤，在0℃用异丙醇洗涤所述RNA分子标志物的水相，4℃离心后获得所述RNA分子标志物的粗制品沉淀。
具体操作如下：
首先，在EP管中按照1:1的体积比向RNA粗液中加入异丙醇。然后，用涡旋振荡器混匀EP管内的试剂，使残留的有机物被抽提。接着，将EP管置于冰浴中静止10min。最后，设置高速离心机的温度参数、转速参数、和离心时间参数为4℃、12000g、15min，启动离心机，使RNA分子标志物的粗制品沉淀。终止离心后，取出EP管，轻轻弃去上清，则获得RNA分子标志物的粗制品。
第五步骤，在0℃用无水乙醇洗涤所述RNA分子标志物的粗制品沉淀，在4℃下离心后获得所述RNA分子标志物的精制品。
具体操作如下：
首先，在EP管中按照1:5的体积比向RNA粗制品中加入无水乙醇。然后，来回颠倒EP管，使无水乙醇充分接触RNA粗制品，使残留的异丙醇被抽提。最后，设置高速离心机的温度参数、转速参数、和离心时间参数为4℃、12000g、15min，启动离心机，使RNA分子标志物的精制品沉淀。终止离心后，取出EP管，轻轻弃去上清并且晾干，则获得RNA分子标志物的精制品。
取RNA分子标志物的精制品加入15uL DEPC水溶解。用紫外分光光度计测RNA浓度。读取RNA在OD260nm处的读数。根据公式RNA(mg/ml)＝40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000，计算RNA的浓度。RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。
下面，将详细说明RNA分子标志物的含量鉴定方法。以下操作均需要在冰浴下完成，应当保持体系处于0℃。
第一步骤，在0℃配制逆转录反应体系，逆转录反应体系在37℃保温15min、85℃保温5sec、4℃保温∞的温度控制和时间控制的条件下完成逆转录反应过程，获得带有cDNA的逆转录反应体系。
其中，逆转录反应体系由2.0uL的5×PrimeScriptTM Buffer，0.5uL的Oligo dTPrimer(50uM)，0.5uL的PrimeScriptTM RT Enzyme Mix×1，0.5uL的Random 6mers(100μM)，500ng的Total RNA和Up to 10uL的RNase-free Water组成。
具体操作：按照下表试剂和用量配制反应体系。
其中，Random 6mers作为环形RNA逆转录反应的引物。Oligo dT Primer在逆转录反应中结合poly A尾部分。
第二步骤，向2uL的带有cDNA的逆转录反应体系中加入SYBR-Green染料、2×SYBR(R)Premix Ex Taq酶、0.4uL的PCR Forward primer(10uM)、0.4uL的PCR Reverse primer(10uM)、7.2uL的ddH2O，经历95℃预变性1min、(95℃变性5sec→60℃退火30sec→72℃延伸45sec)×40个循环，并且收集荧光信号后获得循环数CT值；
按照上表试剂和用量配制反应体系。
其中，PCR Forward primer为5'-ACAACACCACTCACTTCGCA-3'，PCR Reverseprimer为5'-CAGGTGCTACCTTTCGAGCA-3'；
第三步骤，用2ΔΔCT法标准曲线定量分析所述RNA分子标志物的初始含量。
通过上述方法能够鉴别出不同种类的平滑肌细胞。平滑肌细胞在新陈代谢反应中的功能发生变化时，应当认识平滑肌细胞的种类发生了改变。
通过所述RNA分子标志物的含量鉴定方法区别肺动脉平滑肌细胞的种类，能够鉴定出不同种类的平滑肌细胞，从而预测平滑肌细胞在新陈代谢反应中的作用。
例如，当肺动脉平滑肌细胞中所述环形RNA分子标志物含量增加时，这种环形RNA分子标志物对micro-RNA具有吸附作用。这导致micro-RNA的功能不能在生物化学反应中表现出来。这意味着，当肺动脉平滑肌细胞中所述环形RNA分子标志物含量超过一定临界值时，肺动脉平滑肌细胞的功能将发生变化。因此，应当认为平滑肌细胞的种类发生了改变。这样，需要采用某种鉴定方法来区分平滑肌细胞。本发明提供的所述RNA分子标志物的含量鉴定方法能够用区别肺动脉平滑肌细胞的种类。
在掌握了区别平滑肌细胞的种类的鉴定方法后，能够对体外人工培养的平滑肌细胞进行分类培养或者制备具有新功能的体外培养细胞。
一种肺动脉平滑肌细胞，所述肺动脉平滑肌细胞包含所述RNA分子标志物，所述RNA分子标志物的含量为0.5％至1.5％。
优选的，所述RNA分子标志物的含量为1.4％。
一种肺动脉平滑肌细胞的制备方法，所述肺动脉平滑肌细胞的制备方法包括将肺动脉平滑肌细胞进行体外扩增的步骤，所述体外扩增的步骤是在0.1％低氧环境中进行的。
由于这种细胞能够分泌出比较多的环形RNA分子。因此，可以用于调控带有micro-RNA参与的反应平衡点。因此，可以应用带有0.5％至1.5％含量RNA分子标志物的平滑肌细胞调控micro-RNA参与生化反应。
因此，提出一种降低micro-RNA在生化反应中参与量的方法，在所述生化反应中放入带有上述肺动脉平滑肌细胞。
优选的，所述降低micro-RNA在生化反应中参与量的方法，所述肺动脉平滑肌细胞中所述RNA分子标志物的含量较高。其中，含量较高，是指RNA分子标志物的含量在0.5％至1.5％范围内，取趋向于1.5％方向的较大值。
最后，本发明权利要求书和说明书中的第一、第二等序数词仅表示对步骤先后顺序进行标识，除此用途之外，不表达实质性的内容，在确定权利要求的保护范围内应当不予以考虑。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东医院
<120> 肺动脉高压症诊断试剂及其制备方法
<130> 2019
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2881
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
cuucgcagaa ucaagaacgg cuaugugcgu uuaaagaucc guaucagcaa gaccuuggga 60
uaggugagag uagaaucucu caugaaaaug ggacaauauu augcucgaaa gguagcaccu 120
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cuccgccucc cggguucaag cgauucuccu gccucagccu gccaaguagc ugggacuaca 1620
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cccaugaaau gucuuuggua uccuuuacca uuuuucuguu ucuuaaaaau auguuuccug 2580
uugauuugca aaacuguuuc auagcuuaca cguacucuca cauuuauuga aauuacugcu 2640
uaguuuguug uuuuucucuu aguuuucuuu aucauauugu cuccuuuuuu guauucauau 2700
ugauuuauag gauguugguc ucacauugga gauccccaag agugucacua ugaagaaugu 2760
guaguaacua ccacuccucc cucaauucag aauggaacau accguuucug cuguuguagc 2820
acagauuuau guaaugucaa cuuuacugag aauuuuccac cuccugacac aacaccacuc 2880
a 2881

Claims (10)

1.一种肺动脉高压环状RNA分子标志物，其特征在于，所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的碱基序列为SEQ ID No.1。
2.一种权利要求1所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的制备方法，其特征在于，所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的制备方法包括：
第一步骤，在0℃用TRIzolLS试剂重新悬浮肺动脉平滑肌细胞10min，抑制所述肺动脉平滑肌细胞的核酸酶活性，并且裂解所述肺动脉平滑肌细胞；
第二步骤，在0℃用氯仿洗涤所述肺动脉平滑肌细胞的蛋白质，静止后所述肺动脉高压环状RNA分子标志物被溶解于体系上层水相中；
第三步骤，在4℃下离心，使所述肺动脉平滑肌细胞的蛋白质沉淀，并且移出所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的上层水相；
和第四步骤，在0℃用异丙醇洗涤所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的水相，在4℃离心后获得所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的粗制品沉淀。
3.根据权利要求2所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的制备方法，其特征在于，所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的制备方法还包括：
第五步骤，在0℃用无水乙醇洗涤所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的粗制品沉淀，在4℃下离心后获得所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的精制品。
4.一种权利要求1所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的含量鉴定方法，其特征在于，所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的含量鉴定方法包括：
第一步骤，在0℃配制逆转录反应体系，逆转录反应体系在37℃保温15min、85℃保温5sec、4℃保温∞的温度控制和时间控制的条件下完成逆转录反应过程，获得带有cDNA的逆转录反应体系；
其中，逆转录反应体系由2.0uL的5×PrimeScriptTM Buffer，0.5uL的Oligo dTPrimer(50uM)，0.5uL的PrimeScriptTM RT Enzyme Mix×1，0.5uL的Random 6 mers(100μM)，500ng的所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的精制品和Up to 10uL的RNase-freeWater组成；
第二步骤，向2uL的带有cDNA的逆转录反应体系中加入SYBR-Green染料、2×SYBR(R)Premix Ex Taq酶、0.4uL的PCR Forward primer(10uM)、0.4uL的PCR Reverse primer(10uM)、7.2uL的ddH2O，经历95℃预变性1min、(95℃变性5sec→60℃退火30sec→72℃延伸45sec)×40个循环，并且收集荧光信号后获得循环数CT值；
其中，PCR Forward primer为5'-ACAACACCACTCACTTCGCA-3'，PCR Reverse primer为5'-CAGGTGCTACCTTTCGAGCA-3'；
第三步骤，用2ΔΔCT法标准曲线定量分析所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的初始含量。
5.用权利要求4所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的含量鉴定方法区别肺动脉平滑肌细胞的种类。
6.一种肺动脉平滑肌细胞，其特征在于，所述肺动脉平滑肌细胞包含肺动脉高压环状RNA分子标志物，所述RNA分子标志物的含量为0.5％至1.5％。
7.根据权利要求5所述肺动脉平滑肌细胞，其特征在于，所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的含量为1.4％。
8.一种肺动脉平滑肌细胞的制备方法，其特征在于，所述肺动脉平滑肌细胞的制备方法包括将肺动脉平滑肌细胞进行体外扩增的步骤，所述体外扩增的步骤是在0.1％低氧环境中进行的。
9.一种降低micro-RNA在生化反应中参与量的方法，其特征在于，在所述生化反应中放入带有权利要求6所述肺动脉平滑肌细胞。
10.根据权利要求9所述降低micro-RNA在生化反应中参与量的方法，其特征在于，所述肺动脉平滑肌细胞中所述肺动脉高压环状RNA分子标志物的含量为1.4％。
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