KR102002643B1 - 장기이식 후 거부반응 진단 방법 - Google Patents

장기이식 후 거부반응 진단 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102002643B1
KR102002643B1 KR1020170142714A KR20170142714A KR102002643B1 KR 102002643 B1 KR102002643 B1 KR 102002643B1 KR 1020170142714 A KR1020170142714 A KR 1020170142714A KR 20170142714 A KR20170142714 A KR 20170142714A KR 102002643 B1 KR102002643 B1 KR 102002643B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
rejection
hsa
mir
transplantation
present
Prior art date
Application number
KR1020170142714A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190048145A (ko
Inventor
오정미
손민지
김인화
한나영
김명규
허승연
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to KR1020170142714A priority Critical patent/KR102002643B1/ko
Publication of KR20190048145A publication Critical patent/KR20190048145A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102002643B1 publication Critical patent/KR102002643B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 장기이식 후 거부반응 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 장기이식 후 거부 반응 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자에서 수득한 시료에서 RNA 발현량 분석을 통해 hsa-miR-1299의 발현량을 측정하는 방법, hsa-miR-1299 miRNA 유전자를 유효성분으로 포함하는 장기이식 후 거부반응 진단용 조성물 및 hsa-miR-1299 miRNA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 장기이식 후 거부반응 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 장기이식 환자로부터 장기이식 후 거부반응을 조기에 진단할 수 있는 지표를 제공하여, 장기이식 환자에게서 장기이식 후 거부반응을 조직검사 없이 조기에 진단하여 빠른 치료를 시작하여 치료 효율을 높이는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

장기이식 후 거부반응 진단 방법{Method of diagnosing rejection after transplantation}
본 발명은 장기이식 후 거부반응 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 장기이식 후 거부 반응 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자에서 수득한 시료에서 RNA 발현량 분석을 통해 hsa-miR-1299의 발현량을 측정하는 방법, hsa-miR-1299 miRNA 유전자를 유효성분으로 포함하는 장기이식 후 거부반응 진단용 조성물 및 hsa-miR-1299 miRNA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 장기이식 후 거부반응 진단용 키트에 관한 것이다.
수술 기법 및 장기 보존 방식의 진보와 신규 면역억제제의 개발로 장기 이식 후 환자 생존율은 꾸준히 향상되어 왔다. 특히, 1980 년대에 칼시뉴린 (calcineurin) 억제제인 사이클로스포린 (cyclosporine)의 개발로 이식 후 생존율이 현저히 증가하였다. 장기이식 후 거부반응의 특징은, 임상적으로는 큰 변화를 보이지 않다가 어느 순간 이식거부가 관찰된다는 것이다. 즉, 이식 후 특별한 증상이 나타나지는 않으나 실제로는 손상이 서서히 진행된다. 따라서, 장기 이식 환자의 생존율 증가에도 불구하고, 장기이식 거부반응은 여전히 이식 수혜자의 생명을 위협하는 위험성을 가지고 있다.
신장이식은 말기신부전(end stage renal disease, ESRD) 환자에서 가장 이상적인 치료방법으로 환자의 삶의 질 개선에 중요한 역할을 하는데, 이렇게 이식 받은 장기가 기능을 상실하는 데에는 급성 및 만성면역반응이 주요 원인이 되고, 그 중에서도 급성거부반응은 이식 초기의 환자의 생존율과 이식 장기(graft)의 생존율을 좌우하는 요인이 될 뿐만 아니라 만성면역반응의 원인 인자로도 작용한다.
급성거부반응은 이식 성과 및 장기(graft) 생존율과 직접적으로 연관되므로, 정확하고 빠른 진단이 필수적이나 대부분 이식 후 혈청 크레아티닌(serum creatinine, SCr)의 지속적 상승 또는 소변량의 감소와 같은 임상적 증상이 발현되면 급성거부반응을 의심하여 신장 조직검사(renal biopsy)를 통한 조직학적 진단 또는 임상적 진단을 내린다. 조직학적 진단이 정확하나 검사 방법이 침습적이고 특히 면역억제제 치료 중인 환자에서 출혈이나 감염 위험이 높아 이를 대체할 수 있는 진단법 또는 진단을 위한 바이오마커 발굴이 필요하다(Viklicky O et al: Molecular markers of rejection and tolerance: lessons from clinical research. Nephrol Dial Transplant. 2013;28:2701-8).
대표적인 거부반응의 바이오마커로 관련 단백질과 사이토카인, 유전자의 IL-6-174G/C, TNF -A-308G/A, TGFBR2 rs2228048 C>T 등의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)과 구조적 변이(structural variation)에 대한 연구가 진행되어 왔으나, 유전적 변이로도 질병의 메커니즘을 모두 설명하지 못한다. 이후 후성유전적 요인을 고려하기 시작하였으며 그중 microRNA(miRNA)는 유전자의 3’-UTR에 결합하여 mRNA의 degradation을 통한 유전자의 발현을 조절하므로, 유전적 요인으로 설명되지 못하는 질환의 발생이나 진행을 설명할 수 있을 것으로 기대된다.
이에 따라 miRNA를 발굴하기 위한 분석 기술이 발달하고, 데이터베이스 구축 등을 통해 miRNA로 개체간 반응의 다양성을 예측하고자 하는 연구들이 시도되었다. 이제까지는 암과 연관된 miRNA에 대한 연구가 많이 이루어졌으며, 신장이식에서도 이식 예후 예측과 관련된 miRNA로 혈액과 소변에서 hsa-miRNA-210, hsa-miRNA-142 등이 발굴되었다(Anglicheau D, et al: MicroRNA expression profiles predictive of human renal allograft status. Proc Natl Acad Sci USA. 2009;106(13):5330-5, Wilflingseder J, et al: MicroRNAs in kidney transplantation. Nephrol Dial Transplant. 2015;30(6):910-7).
그러나 앞선 연구들에서 밝혀진 miRNA와 연구결과들이 일치된 결과를 보이지 못하여 임상 적용에 제한이 있으므로, 새로운 분석기술을 이용하여 장기이식 거부반응의 조기 진단의 가능성을 높일 수 있는 후성유전적 바이오마커의 발굴이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 장기이식 거부반응을 진단할 수 있는 유전적 바이오마커를 연구하던 중 장기이식 후 거부반응 환자에게서 hsa-mRNA-1299 발현량이 증가하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 장기이식 후 거부 반응 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자에서 수득한 시료에서 RNA 발현량 분석을 통해 hsa-miR-1299의 발현량을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 hsa-miR-1299 miRNA 유전자를 유효성분으로 포함하는 장기이식 후 거부반응 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 hsa-miR-1299 miRNA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 장기이식 후 거부반응 진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장기이식 후 거부 반응 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자에서 수득한 시료에서 RNA 발현량 분석을 통해 hsa-miR-1299의 발현량을 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 hsa-miR-1299 miRNA 유전자를 유효성분으로 포함하는 장기이식 후 거부반응 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 hsa-miR-1299 miRNA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 장기이식 후 거부반응 진단용 키트를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 장기이식 후 거부 반응 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자에서 수득한 시료에서 RNA 발현량 분석을 통해 hsa-miR-1299의 발현량을 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 ‘환자’는 장기이식한 환자를 의미하며, 이는 장기이식 후 거부 반응이 없는 환자와 장기 이식 후 거부반응을 나타내는 환자를 포함한다. 바람직하게는 신장이식한 환자일 수 있고, 신장 이식 후 거부반응이 없는 환자와 거부반응을 나타내는 환자일 수 있으며, 가장 바람직하게는 신장 이식 후 급성거부반응을 나타내는 환자일 수 있다.
본 발명의 상기 ‘시료’는 장기이식 환자에게서 수득하는 시료로 이에 제한되지는 않으나 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨일 수 있으며, 바람직하게는 혈액일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 신장이식을 받은 환자 35명을 대상으로 하여, 신장이식 후 일반적으로 계획되어 있는 조직검사를 실시하거나, 임상적으로 급성거부반응이 의심될 때 조직검사를 실시하여 급성거부 반응이 발생한 경우를 시험군으로 하고 급성거부 반응이 발생하지 않은 이식환자군을 대조군으로 분류한 다음, miRNA를 분석하기 위하여 말초 혈액을 수득하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 상기 hsa-miR-1299는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 RNA 발현량 분석은 시료에서 분리한 전체 RNA (total RNA)를 대상으로 하여 분석되는 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 상기‘total RNA’는 환자에서 수득한 시료에서 추출하는 RNA로, 이에 제한되는 것은 아니나 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨에서 추출할 수 있으며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청에서 추출할 수 있다. 가장 바람직하게는 말초 혈액 시료에서 추출할 수 있다.
본 발명의 ‘서열번호 1로 표시되는 염기서열’은 22 nt(nucleotide) 길이의 hsa-miR-1299로 특정되는 부위이며, 5′-UUCUGGAAUUCUGUGUGAGGGA-3′의 서열정보를 가지고 있다. 구체적으로는 다음과 같은 과정을 통해 형성된다. 먼저 헤어핀 구조를 갖는 83 nt 길이의 primary miRNA(pri-mRNA)로 전사된다. 이러한 pri-mRNA는 수 개의 miRNA 전구체(precursor)를 포함하며, 효소의 작용에 의해 헤어핀 구조를 갖는 전구체 miRNA(pre-miRNA)가 처리된다. pre-miRNA는 핵 밖으로 이동하여 세포질에서 RNase 효소에 의해 해어핀 구조가 잘린다. 이 과정에서 효소는 헤어핀의 3’말단에 결합을 하여 3′과 5′암(arm)을 연결하는 루프를 자르고 불안정한 형태의 이중가닥 miRNA가 형성되어 hsa-miRNA-1299를 형성한다.
본 발명에서 장기이식 후 거부 반응 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 방법은 구체적으로, hsa-miR-1299 발현 수준을 거부 반응이 발생하지 않은 기준 시료와 비교하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 hsa-miR-1299 발현 수준이 기준 시료 대비 높을수록 장기이식 후 거부 반응이 나타나기 쉬운 것으로 판별하는 것을 특징으로 한다.
상기 기준 시료는 장기이식 후 거부 반응이 발생하지 않은 환자에서 수득한 시료에서 RNA의 발현량을 분석한 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 장기이식 후 거부 반응이 발생하지 않은 환자에서 수득한 시료에서 hsa-miR-1299의 발현량을 분석한 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 장기 이식 후 거부반응이 발생한 환자의 혈액에서 추출한 RNA를 small RNA-seq 분석을 실시하였다. 그 다음 시료로부터 추출된 총 RNA를 PAGE를 이용하여 크기에 따라 분리한 뒤, 분리된 total RNA 중 small RNA에 해당하는 17-25 nt 크기만을 선별하여 library를 준비하였고, 증폭된 RNA에 대하여 염기서열 분석을 시행하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 일실시예에서는 환자의 혈액에서 추출한 miRNA 발현량을 edgeR 프로그램의 TMM(trimmed mean of M-values) 방법으로 정규화(normalize)하여 비교한 결과, 거부반응이 발생한 환자와 발생하지 않은 환자의 miRNA 발현량에 유의한 차이가 있는 p-값이 0.05 미만인 miRNA를 선별하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 일실시예에서는 거부반응이 발생한 환자와 발생하지 않은 환자의 miRNA 발현량에 유의한 차이가 있는 miRNA 중 차이가 가장 큰 hsa-miR-1299를 선별하여 발현량을 비교한 결과, 거부반응이 발생한 환자에서 hsa-miR-1299의 발현량이 통계적으로 유의하게 증가하는 것을 확인하였다(실시예 3 및 도 1 참조).
본 발명의 상기 ‘장기이식(organ transplantation)’은 질병 또는 사고로 인해 기능이 소실된 장기를 대신하기 위하여, 신체 내의 장기를 다른 부위로 옮기거나 타인에게서 받은 장기를 대신 넣는 과정을 의미하는 것으로, 3가지로 분류할 수 있다. 자신의 장기를 자신에게 이식하는 경우는 자가이식(autotransplantation), 타인의 장기를 이식하는 경우는 동종이식(allogeneic transplantation), 뇌사자가 기증하는 장기를 이식하는 경우는 뇌사자 이식(deceased donor transplantation)이라고 한다. 본 발명의 장기이식은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 동종이식을 의미할 수 있다. 또한 장기이식을 받은 개체는 수혜자라고 하며, 장기를 제공한 개체는 제공자라고 한다. 장기이식을 할 수 있는 장기는 신장, 간장, 췌장, 췌도, 소장, 심장, 폐, 조혈모세포, 골, 인대, 피부, 혈관 등의 조직이 있다. 본 발명에서는, 이에 제한되지는 않으나 신장 이식, 간 이식, 심장 이식, 폐 이식, 조혈모세포 이식일 수 있으며, 가장 바람직하게는 신장 이식일 수 있다.
본 발명에서 ‘장기이식 후 거부반응’은 제공자와 수혜자의 유전적 배경이 다른 경우, 이식한 장기가 수혜자에 의해 이물질로 인식됨으로서 수혜자의 면역계가 그 장기를 거절하여 배제하려고 하는 면역반응을 의미한다. 상기 면역반응은 (1) 이식 직후에 일어나는 강한 거부반응인 초급성 거부반응 (hyper-acute rejection reaction), (2) 이식 후 수개월 이내에 보이는 급성 거부반응 (acute rejection reaction), (3) 이식 후 수개월 이후에 보이는 만성 거부반응 (chronic rejection reaction)으로 나누어진다. 또한, T 세포로 대표되는 면역담당 세포에 의한 세포성 면역과 항체에 의한 액성 면역이 복잡하게 관련된 형태로 일어나지만, 주로 세포성 면역이다. 이러한 이식거부반응은 장기이식 후 생존율 및 환자의 이환 및 사망률과 연결된다. 바람직하게는 장기이식 후의 급성 거부반응인 것일 수 있다.
본 발명은 hsa-miR-1299 miRNA 유전자를 유효성분으로 포함하는 장기이식 후 거부반응 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 ‘진단’은 질병 발생의 예측 및 질병 발생위험도를 결정하거나 도출시키는데 사용되는 모든 유형의 분석을 포함한다. 즉, 장기이식 후 거부반응의 발생 위험도의 증가를 나타낸다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서 hsa-miR-1299 miRNA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 장기이식 후 거부반응 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 ‘진단용 키트’는 서열번호 1로 표시되는 miRNA 유전자인 hsa-miR-1299를 증폭할 수 있는 프라이머 뿐만 아니라, 중합 반응에 필요한 시약, 예를 들면, dNTP, 각종의 중합효소 및 발색제 등을 포함할 수 있다.
상기 ‘증폭할 수 있는 프라이머’란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명은 장기이식 후 거부반응 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 장기이식 환자로부터 장기이식 후 거부반응을 조기에 진단할 수 있는 지표를 제공하여, 장기이식 환자에게서 장기이식 후 거부반응을 조직검사 없이 조기에 진단하여 빠른 치료를 시작하여 치료 효율을 높이는 데에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 장기이식 급성거부반응이 발생한 환자 그룹인 시험군(BC-AR)과 급성거부 반응이 발생하지 않은 환자 그룹인 대조군(N)에서의 hsa-miR-1299의 발현량 차이를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
피검자의 정보와 혈액검체 수집 및 mRNA 추출
본 발명의 대상자는 서울대병원 외과에서 모집하였고, 본 발명은 해당 기관에서 신장 이식을 받는 환자를 대상으로 진행하였다. 상기 모든 과정은 서울대병원의 생명윤리심의위원회에 의해 승인되었으며, 모든 환자의 정보는 서면동의 후 수집하였다.
신장이식을 받은 환자 35명을 대상으로 하여, 환자의 인적 정보, 신장이식정보, 조직검사정보, 임상검사정보를 수집하였다. 신장이식 후 일반적으로 계획되어 있는 조직검사를 실시하거나, 임상적으로 급성거부반응이 의심될 때 조직검사를 실시하였다. gun-biopsy 도구를 이용하여 채취한 조직에 대해 병리학적 진단 정보를 바탕으로, Banff 진단분류에 따른 경계선 변화(borderline change) 또는 T세포 매개 급성거부반응이 발생한 경우를 시험군으로 하였으며, 급성거부 반응이 발생하지 않은 이식환자군을 대조군으로 분류하였다. 두 그룹간의 성별, 나이, 이식 공여자 분포의 차이는 유의하지 않았다. 이는 하기 표 1에 나타나 있다.
거부반응 발생 및 비발생 환자군의 특성
개요 시험군
(n = 22) 		대조군
(n = 13) 		P -value
성별, 남성† 13 (59.1%) 6 (46.2%) 0.458
연령 (yr)‡ 43.5 (21-65) 48 (22-60) 0.853
기증자 유형†
Living donor
Deceased donor
13 (59.1%)
9 (40.9%)
10 (76.9%)
3 (23.1%)		 0.283
† n (%), ‡ median (range)
miRNA를 분석하기 위한 혈액 검체는 35명의 신장이식 환자에서 조직검사 할 때, 환자의 말초 혈액으로부터 PAX gene Blood RNA tube(Qiagen)에 채혈하여 70℃에 보관하였다.
<실시예 2>
miRNA의 small RNA 염기서열 분석
상기 실시예 1의 PAX gene Blood RNA tube로부터 total RNA를 추출하였고, 이 중 5 μg의 total RNA를 PAGE(denaturing polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 크기에 따라 분리하였다. 그 다음 분리된 total RNA 중 small RNA에 해당하는 크기인 17 내지 25 nt의 밴드를 선별하였다. NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3(Illumina)를 사용하여 라이브러리(library)를 준비하였으며, RNA 3‘ 위치에 결합하는 어댑터(3’ adaptor)의 서열은 ‘TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG’이다. 어댑터를 결합한 RNA 서열은 역전사하였으며, PCR 방법으로 증폭시켰다. 그 다음 증폭된 RNA는 유동 세포 부착(flow cell attachment)과 브릿지 증폭(bridge amplification), 시퀀싱 프라이머의 어닐링(annealing) 과정을 거친 후, 테라젠이텍스에 의뢰하여 염기서열 분석을 실시하였다.
<실시예 3>
miRNA 바이오마커 선별
상기 실시예 1에서 수집된 환자의 시료 중 22명의 시험군과 13명의 대조군에 대하여 혈액에서의 miRNA 발현량을 분석하였다.
먼저 당업계에서 통상적으로 사용되는 HTseq(high-throught seqeuncing) 방법으로 miRNA read count를 생성하였고, count 데이터는 edgeR 프로그램(Bioconductor)의 TMM(trimmed mean of M-values) 방법으로 정규화(normalize) 하였다. 그 다음 시험군과 대조군 간의 각 miRNA 발현량의 차이를 분석하였다.
그 결과 시험군과 대조군간에 유의한 차이가 있으며, log2 스케일(scale)의 fold change 차이가 1.5보다 큰 경우를 바이오마커 후보 miRNA로 발굴하였다. 이 중 차이가 가장 큰 hsa-miR-1299를 유의미한 바이오마커로 선별하였다. 선별한 hsa-miR-1299에 관한 정보는 하기 표 2에 기재하였다.
이식거부반응 관련 miRNA 정보
miRNA ID miRNA Accession Number Sequence 서열번호
hsa-miR-1299 MIMAT0005887 UUCUGGAAUUCUGUGUGAGGGA 1
또한 도 1에 나타난 바와 같이, hsa-miR-1299의 발현량의 정규화된 값(normalized value)은 시험군(BC-AR)에서 대조군(N)에 비해 평균 5.27배 증가하는 것으로 나타났다.
이를 통해, hsa-miR-1299가 급성 장기이식 거부반응의 바이오마커로서 사용하기 용이하며, hsa-miR-1299를 이용하여 급성 장기이식 거부반응을 진단할 수 있음을 확인할 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이 본 발명의 방법은 장기이식 환자로부터 장기이식 후 거부반응을 조기에 진단할 수 있는 지표를 제공하여, 장기이식 환자에게서 장기이식 후 거부반응을 조직검사 없이 조기에 진단하여 빠른 치료를 시작하여 치료 효율을 높이는 데에 유용하게 이용될 수 있다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Method of diagnosing rejection after transplantation <130> NP17-0060 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-mir-1299 <400> 1 uucuggaauu cugugugagg ga 22

Claims (10)

  1. 신장 이식 후 거부 반응 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자에서 수득한 시료에서 RNA 발현량 분석을 통해 hsa-miR-1299의 발현량을 측정하는 단계;
    상기 hsa-miR-1299 발현 수준을 거부 반응이 발생하지 않은 기준 시료와 비교하는 단계;
    상기 hsa-miR-1299 발현 수준이 기준 시료 대비 높을수록 신장 이식 후 거부 반응이 나타나기 쉬운 것으로 판별하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 hsa-miR-1299는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 RNA 발현량 분석은 시료에서 분리한 전체 RNA (total RNA)를 대상으로 하여 분석되는 것임을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 신장 이식 후 거부 반응은 신장 이식 후의 급성 거부반응인 것을 특징을 하는 방법.
  9. hsa-miR-1299 miRNA 유전자를 유효성분으로 포함하는 신장 이식 후 거부반응 진단용 조성물.
  10. hsa-miR-1299 miRNA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 신장 이식 후 거부반응 진단용 키트.
KR1020170142714A 2017-10-30 2017-10-30 장기이식 후 거부반응 진단 방법 KR102002643B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170142714A KR102002643B1 (ko) 2017-10-30 2017-10-30 장기이식 후 거부반응 진단 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170142714A KR102002643B1 (ko) 2017-10-30 2017-10-30 장기이식 후 거부반응 진단 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190048145A KR20190048145A (ko) 2019-05-09
KR102002643B1 true KR102002643B1 (ko) 2019-07-22

Family

ID=66546532

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170142714A KR102002643B1 (ko) 2017-10-30 2017-10-30 장기이식 후 거부반응 진단 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102002643B1 (ko)

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PLoSOne, 11(3):e0151246(2016)*
PNAS, 106(13):5330-5335(2009)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190048145A (ko) 2019-05-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230203573A1 (en) Methods for detection of donor-derived cell-free dna
ES2726650T3 (es) Métodos de monitorización de terapias inmunosupresoras en un receptor de trasplante
JP4404553B2 (ja) 単離された母体血液の胎児細胞に対する出生前診断の方法
Sherwood et al. Characteristics, properties, and potential applications of circulating cell-free dna in clinical diagnostics: a focus on transplantation
US11479819B2 (en) Non-invasive method for monitoring transplanted organ status in organ-transplant recipients
US11104954B2 (en) Plasma derived cell-free mitochondrial deoxyribonucleic acid
US20190112645A1 (en) Method for measuring mutational load
KR102178922B1 (ko) 당뇨병성 신증 진단을 위한 마이크로RNA let-7 또는 마이크로RNA-150 바이오마커 및 이의 용도
JP2024507536A (ja) 複数の臓器の移植レシピエントにおけるドナー由来無細胞ｄｎａの検出方法
US20140378334A1 (en) Method for quantifying renal markers by assaying urine
JPWO2004083856A1 (ja) 大腸癌マーカー検出方法
KR102002643B1 (ko) 장기이식 후 거부반응 진단 방법
US20100248251A1 (en) Tissue Rejection
KR102505618B1 (ko) 신장이식 후 항체 매개성 거부반응의 진단을 위한 소변 엑소좀 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도
KR102505617B1 (ko) 신장이식 후 T 세포 매개성 거부반응의 진단을 위한 소변 엑소좀 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도
KR20130098669A (ko) 위암의 림프절 전이 진단 마커로서의 혈청 ｍｉＲＮＡ
RU2431149C2 (ru) Способ оценки почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом на основе данных о полиморфизме генов интерлейкинов
CN110283902A (zh) 一种肺动脉高压环状rna分子标志物、其制备方法和应用试剂盒
CN110699450A (zh) miRNA生物标志物在肝脏疾病诊断和预后判断中的应用
KR101596359B1 (ko) SORT1 유전자 프로모터의 CpG 메틸화 변화를 이용한 모야모야병 진단용 조성물 및 이의 이용
KR102545543B1 (ko) BK 바이러스 신병증의 진단을 위한 소변 엑소좀 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도
KR102546810B1 (ko) 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 조성물
KR20180040461A (ko) Bnip2 유전자 부위의 염기서열 다형성을 이용한 장기이식 후 거부반응 예측 방법
US20220056508A1 (en) Method for amplifying a genomic sample
KR101772448B1 (ko) 성격 특성 판단용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant