JP4583180B2

JP4583180B2 - Ｒｎａバイオアッセイ

Info

Publication number: JP4583180B2
Application number: JP2004563482A
Authority: JP
Inventors: ブリーズ，ドミニク・ジュールズ; ロイ，ジェームズ・ケネス
Original assignee: ザハムナーリサーチインスティテューツ
Priority date: 2002-12-31
Filing date: 2003-12-19
Publication date: 2010-11-17
Anticipated expiration: 2023-12-19
Also published as: ATE406461T1; EP1590478A4; WO2004059276A2; AU2003288621A1; EP1590478A2; JP2006512074A; EP1590478B1; US20090004655A1; WO2004059276A3; DE60323267D1; US7968291B2; AU2003288621A8; US20040197805A1; ES2311745T3

Description

発明の分野
本発明は、細胞内におけるメッセンジャーＲＮＡ放出の増加させる、薬剤の能力を決定することにより、薬剤の細胞障害可能性を評価する方法に関する。

発明の背景
医薬分野において、医薬剤の毒物学的潜在性を最小限にするための、大変な努力がなされた。毒物剤に暴露することに関連したリスクの中には、体の細胞の損傷または死を引き起こす可能性があり、それは重要な器官に障害を引き起こす結果となりうる。

ＭａｎｄｅｌとＭｅｔａｉｓ（１９４８）は、ヒト血漿における細胞外核酸の発見を報告した。
Ｌｏ，Ｋ．Ｗ．ら（１９９９）とＫｏｐｒｅｓｋｉ，Ｍ．ら（１９９９）は、両方とも癌患者の血漿における腫瘍由来ＲＮＡの検出を報告した。

Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｑ．ら（２０００）は、乳癌患者の血清における検出マーカーとして、テロメラーゼＲＮＡの使用を提案した。
Ｐｏｏｎ，Ｌ．Ｌ．ら（２０００）は、母親の血漿内で胎児のＲＮＡの存在を報告した。

米国特許番号６，３２９，１７９号は、癌または悪性前の状態の検出、モニタリング、評価のための、血液の血漿画分または血清画分中に循環していることが見出された、腫瘍由来のまたは関連した細胞外ＲＮＡの発見の使用を開示する。

米国特許番号６，１５６，５０４号は、血漿画分または血清画分中の新生物の突然変異した核酸の検出を通じて、新生物に関連した突然変異を保持するヒトまたは動物における、良性の、悪生前の、または悪性の新生物の、存在、進行または臨床状態の検出、同定、またはモニタリングを開示する。

米国特許番号６，０２０，１２４号は、生物学的体液における突然変異した遺伝子および癌遺伝子の可溶性ＤＮＡの検出を開示する。
ＲＮＡは不安定と考えられているので、研究者らは、ヒト血漿中のＲＮＡを分解から保護する可能性のある機構を検討した。Ｈａｓｓｅｌｍａｎｎ，Ｄ．Ｏ．ら（２００１）は、ｉｎｖｉｔｒｏモデルにおけるメラノーマ細胞により放出されるアポトーシス小体内のｍＲＮＡが、ヒト血清中でインキュベートされたとき、分解から保護されることを報告した。

Ｎｇ，Ｅ．Ｋ．Ｏ．ら（２００２）は、血漿ｍＲＮＡの実質的部分が粒子に結合したものであることを報告した。
Ｔｓｕｉ，Ｎ．Ｂ．Ｙ．ら（２００２）は、血液、血清および血漿中の内生的ＲＮＡおよび添加されたＲＮＡの安定性を検討した。

薬剤が組織障害及び細胞障害を引き起こすか否かを決定するために利用できる慣用の方法は、細胞障害のマーカー測定する生物化学的方法を含む。例えば、酵素ＡＬＴ，ＡＳＴおよび５’ＮＴは、肝臓細胞の障害の指標として使用することができる（Ｄｕｎｃａｎ，Ｊ．Ｒ．ら（１９９４））。肝臓細胞で普通に見られるこれらの酵素は、肝臓細胞が障害を受けたとき放出され、そして次いで血液中に検出されうる。しかしながら、早期検出のためのそのような指標の使用の可能性は、酵素放出の速度および検出の感度を含む多くの因子に依存する。このように、これまでの方法は、感度が悪くそして非特異的であった。それ故に、そこには毒性に対するさらなる早期な生物学的指標またはバイオマーカーを明らかにする、高まりつつある興味が存在する。

発明の概要
本発明の１つの側面は、薬剤を評価する方法であって、１つまたはそれより多くの細胞を薬剤で処理し、そして細胞により放出されたＲＮＡ量への薬剤の効果を測定することを含んでなる、前記方法を提供する。本側面の１つの態様において、本発明の方法は、薬剤を細胞損傷を起こしうる薬剤として特徴づけることをさらに含む、ここにおいて細胞によるＲＮＡ放出量が増加する場合に、損傷は増加したＲＮＡ放出により特徴づけられる。本発明の本側面の他の態様において、細胞は１つまたはそれより多くの哺乳類由来細胞、好ましくはヒト由来細胞、を含んでなる。

本発明の他の側面は、薬剤の細胞保護的特徴を評価する方法であって：１つまたはそれより多くの細胞を細胞損傷を引き起こす第一薬剤で処理し、ここで損傷は損傷を受けた細胞からの増加したＲＮＡ放出により特徴づけられ；細胞を第二薬剤で処理し；そして第一薬剤により引き起こされた細胞によるＲＮＡ放出の量を削減する第二薬剤の効果を測定することを含んでなる、前記方法を提供する。本発明の本側面の１つの態様において、該方法は、細胞によるＲＮＡ放出量が増加することを条件に、細胞損傷は増加したＲＮＡ放出により特徴づけられ、第二薬剤を細胞損傷を起こしうる薬剤による細胞損傷から細胞を保護しうる薬剤としてみなすことをさらに含んでなる。本発明の本側面の他の態様において、細胞は、１つまたはそれより多くの哺乳類由来細胞、好ましくはヒト由来細胞を含んでなる。

本発明のさらなる側面は、対象に対する薬剤の効果を評価する方法であって、薬剤で対象を処理し；そして１つまたはそれより多くのＲＮＡマーカーの血液中への増加した放出における処理の効果を測定することを含んでなる、前記方法を提供する。

本発明の方法の１つの態様において、ＲＮＡ放出への効果の測定は、薬剤の１つまたはそれより多くのＲＮＡマーカーの量への効果を測定することを含んでなる。
本発明の他の態様において、ＲＮＡ放出のレベルの測定はＲＴ−ＰＣＲを含んでなる。

本発明の方法のさらなる態様において、ＲＮＡマーカーは、アルブミン、心臓アクチン（ｃａｒｄｉａｃａｃｔｉｎ）、トロポニンＴ（ｔｒｏｐｏｎｉｎＴ）、ＳＭ２２、平滑筋アクチン（ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎ）、腎臓アンドロゲン特異的タンパク質、タム−ホースフォールタンパク質（Ｔａｍｍ−Ｈｏｒｓｆａｌｌｐｒｏｔｅｉｎ）およびアクアポリン−２（ａｑｕａｐｏｒｉｎ−２）、より選択される。

１つまたはそれより多くの細胞を薬剤で処理することを含んでなる本発明の方法のさらに他の態様において、細胞は哺乳類の肝臓、心臓、平滑筋または腎臓由来である。

定義
本明細書で使用される用語は、当該技術分野でのそれらの通常の意味を有する。しかしながら、本発明をさらに明確にし、そして便宜のために、実施例および係属中の請求の範囲を含む明細書で採用されたある用語および句の意味は、以下で提供される。

“薬剤”は、効果を作り出す化学的手段、生物学的手段、または物理学的手段を意味する。薬剤は、１つまたは２以上の化学的もしくは生物化学的物質、生物学的病原体または物理学的摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）の組み合わせであってよい。

“アルブミン”は、肝臓内で発現するタンパク質、またはその対応するｍＲＮＡが肝臓内で発現するタンパク質を意味し、それはアクセッション番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ）ＢＣ０３４０２６のヌクレオチド配列に７０％またはそれ以上のヌクレオチド同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ、そして以下で提供するアクセッション番号を有するアルブミンヌクレオチド配列を含む。

“アクアポリン−２”は、腎臓内で発現するタンパク質を意味し、またはその対応するｍＲＮＡが腎臓内で発現するタンパク質を意味し、それはアクセッション番号ＨＳ２ＡＱＰ２のヌクレオチド配列に７０％またはそれ以上のヌクレオチド同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ、そして以下で提供するアクセッション番号を有するアクアポリン−２ヌクレオチド配列を含む。

“心臓アクチン”は、心臓内で発現するタンパク質を意味し、またはその対応するｍＲＮＡが心臓内で発現するタンパク質を意味し、それはアクセッション番号ＨＵＭＡＣＴＣＡ２のヌクレオチド配列に７０％またはそれ以上のヌクレオチド同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ、そして以下で提供するアクセッション番号を有する心臓アクチンヌクレオチド配列を含む。

“腎臓アンドロゲン特異的タンパク質”は、腎臓内で発現するタンパク質を意味し、またはその対応するｍＲＮＡが腎臓内で発現するタンパク質を意味し、それはアクセッション番号ＲＮＵ２５８０８のヌクレオチド配列に７０％またはそれ以上のヌクレオチド同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる。

“ヌクレオチド同一性”は、他のヌクレオチド配列、例えばヒトのメガリン（ｍｅｇａｌｌｉｎ）のヌクレオチド配列に対して計算されたヌクレオチド配列の配列アラインメントを意味する。特に、その用語は、標準ＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムを使用した少なくとも２つのヌクレオチド配列間の残基適合のパーセントを言う。このアルゴリズムは、配列間のアラインメントを最適化し、それによってより意味深い比較を達成するために、標準化された方法および再生可能な方法に比較して配列の中にギャップを挿入してもよい。ヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、好ましくはＭＥＧＡＬＩＧＮ^ＴＭ配列アラインメントプログラムの第５版の中に取り込まれる、ＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムのデフォルトパラメーターを使用して決定される。このプログラムは、一連の分子生物解析プログラムＬＡＳＥＲＧＥＮＥ^ＴＭ（ＤＮＡＳＴＥＲ、ウィスコンシン州マジソン）の一部である。ＣＬＵＳＴＡＬＷは、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ１９９４）に記載される。

“ヌクレオチド配列”および“ポリヌクレオチド”は、一本鎖型または二本鎖型のいずれにせよ、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。用語“相補的ヌクレオチド配列”は、グアニジンヌクレオチド（Ｇ）とシチジンヌクレオチド（Ｃ）との、およびアデノシンヌクレオチド（Ａ）とチミジンヌクレオチド（Ｔ）の対合による、他のヌクレオチド配列へアニールする（ａｎｎｅａｌ）（結合する）ヌクレオチド配列を意味し、ただし、ＲＮＡでは、ウリジンヌクレオチド（Ｕ）とＡとが結合できるように、ＴがＵで置換されている。

“病的な状態”は生物学的異常性を意味し、そして器官、組織型または細胞型の異常な状態を含む。その用語は、原因にかかわらずに異常性を含み、そして例えば生理学的異常、遺伝学的異常もしくは病原体、身体的的損傷、または生体異物薬剤に起因する毒性から生じる、疾患を含みうる。

“放出”は、能動的な方式または受動的な方式のいずれにせよ、逃避する（ｅｓｃａｐｅ）、分泌する（ｅｘｃｒｅｔｅ）または排出する（ｅｘｐｅｌ）ことを可能にする意味である。

“ＲＮＡマーカー”は、細胞のＤＮＡ遺伝情報から転写された特異的配列を有するＲＮＡポリヌクレオチド、またはその断片を意味する。用語ＲＮＡマーカーは、対応するＤＮＡ配列からコピーされた後に、例えば５’キャッピング、ＲＮＡスプライシングおよび３’ポリアデニル化によって、細胞により加工された、ｍＲＮＡポリヌクレオチド、またはその断片を含む。“ＲＮＡマーカー”が、器官、組織型または細胞型の名前に先行されたとき（例えば、“肝臓ＲＮＡマーカー”）、その用語は、その器官、組織型または細胞型において転写されたＲＮＡマーカーを意味する。本発明の目的のために、その用語のそのような使用は、指定された器官、組織型または細胞型においてのみ転写されるＲＮＡマーカーをいう。しかしながら、その用語は、本発明の文脈の中で興味のある特定の器官、組織型または細胞型を同定するために使用しうるＲＮＡマーカーも含む。例えば、血中における肝臓ＲＮＡマーカーを測定することにより、肝臓の病的な状態を特徴づけることを伴うこの方法において、例えば、第二の器官または組織において、いずれの発現も、第二の器官または組織の病変の結果として血液中に検出されない限り、特定のＲＮＡマーカーは、肝臓において排他的に発現するものである必要はない。

“ＳＭ２２”は、平滑筋において発現するタンパク質、またはその対応するｍＲＮＡが平滑筋で発現するタンパク質を意味し、それはアクセッション番号Ｄ１７４０９のヌクレオチド配列と７０％またはそれより多くのヌクレオチド同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ、そしてそのヌクレオチド配列は、以下で提供されるものにリストアップされるアクセッション番号を有するＳＭ２２ヌクレオチド配列を含む。

“トロポニンＴ”は、心臓において発現するタンパク質、またはその対応するｍＲＮＡが心臓内で発現するタンパク質を意味し、それはアクセッション番号ＨＳＣＴＮＴＡＩ１のヌクレオチド配列と７０％またはそれより多くのヌクレオチド同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ、そしてそのヌクレオチド配列は、以下で提供されるアクセッション番号を有するトロポニンＴヌクレオチド配列を含む。

“タム−ホースフォールタンパク質（Ｔａｍｍ−Ｈｏｒｓｆａｌｌｐｒｏｔｅｉｎ）”は腎臓において発現するタンパク質、またはその対応するｍＲＮＡが腎臓内で発現するタンパク質を意味し、それはアクセッション番号ＨＵＭＵＭＯＤのヌクレオチド配列と７０％またはそれより多くのヌクレオチド同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ、以下で提供されるものにリストアップされるアクセッション番号を有するタム−ホースフォールタンパク質ヌクレオチド配列を含む。

略語
本明細書で使用される略語は、当該技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。しかしながら、本発明をさらに明確にし、便宜のために、特定の略語の意味を以下に提供する：“℃”は摂氏温度を意味する；“５’ＮＴ”は５−ヌクレオチダーゼを意味する；“μｌ”はマイクロリットルを意味する；“ＡＬＴ”はアラニンアミノ転移酵素を意味する；“ＡＳＴ”はアスパラギン酸転移酵素を意味する；“ＡＴＣＣ”は、ヴァージニア州マナッサスに所在するＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ウェブサイトｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）を意味する；“ｃＤＮＡ”は相補的ＤＮＡを意味する；“ｄＬ”はデシリットルを意味する、“ＤＮＡ”はデオキシリボ核酸を意味する；“ＥＤＴＡ”はエチレンジアミン四酢酸を意味する；“ＥＧＴＡ”はエチレングリコール−ビス（ｂ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸を意味する；“ＦＢＳ”はウシ胎児血清を意味する；“ｇ”はグラムを意味する；“Ｈ_２Ｏ_２”は過酸化水素を意味する；“ＬＤＨ”は乳酸デヒドロゲナーゼを意味する；“ｋｇ”はキログラムを意味する；“ＮａＯＨ”は水酸化ナトリウムを意味する；“ＭＥＭ”は変法イーグル培地を意味する；“ｍＲＮＡ”はメッセンジャーＲＮＡを意味する；“ｍｇ”はミリグラムを意味する；“ｍＬ”はミリリットルを意味する；“ｎｇ”はナノグラムを意味する；“ＰＣＲ”はポリメラーゼ連鎖反応を意味する；“ＰＢＳ”はリン酸緩衝液を意味する；“ＲＮＡ”はリボ核酸を意味する；“ＲＰＭ”は分当たりの回転を意味する；そして“ＲＴ−ＰＣＲ”は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。

発明の詳細な説明
正常な細胞の代謝回転（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）の間、哺乳類細胞は血漿中に検出可能なＲＮＡを放出する。本発明は、細胞によるＲＮＡの放出が化学薬剤に起因する細胞損傷により激化し、そしてこの効果が細胞損傷の有用な指標であるとの発見に一部基づく。本発明の一側面は、遺伝子転写の組織型特異的性質および細胞型特異的性質（即ち、ある遺伝子は転写されることができ、そして他の遺伝子は転写されることができない）、並びに特定遺伝子の転写の組織型特異的および細胞型特異的スプライシング配置（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を利用する。特別の組織型または細胞型に特有であるＲＮＡは、特定の器官型、組織型または細胞型の、生物学的、生理学的または毒性学的損傷のバイオマーカーとして使用可能である。

本発明は、細胞損傷または細胞死の指標としての、細胞によるＲＮＡの放出に基づき、インビボおよびインビトロ両方における、潜在性毒性薬剤の試験、療法薬剤の同定、および療法薬剤の有効性の試験を提供する。当業者に公知のＲＮＡ検出技術、または本開示に基づいて明白であろうものは、本発明の実施に有用である。

一態様は、薬剤の細胞障害潜在性の評価のためのインビトロ方法を提供する。これらの方法によれば、細胞培養物または組織培養物は、１つまたはそれより多くの潜在性毒性試験薬剤に暴露される。次いで、ＲＮＡの放出は、細胞を取り囲む液体培地中に検出される。試験薬剤の毒性は、細胞によるＲＮＡの放出の増加する能力により評価される。

もう１つの態様は、療法薬剤を同定するインビトロ方法を提供する。例えば、アポトーシス（即ち、プログラムされた細胞死）を受けるように誘導された細胞培養物または組織培養物を、試験薬剤で処理することができる。生存細胞の放出ＲＮＡのレベルをやがて減少させたならば、これは試験薬剤がアポトーシスの進行を阻害する指標であるだろう。

本発明は、薬剤の毒性を評価し、そしてどの器官または組織が薬剤により負の影響を受けたかを決定するためのインビボ方法も提供する。そのような方法によれば、対象の血液は、特別の組織型または細胞型に特異的なＲＮＡのレベルを決定するために試験される。薬剤の毒性は、試験対象の血液中で測定されるように、細胞のＲＮＡの放出を引き起こす能力に基づいて評価される。そのような方法は、例えば、試験動物を使用した試験薬剤の毒性の評価のためのインビボアッセイとして有用であろう。本方法は、その後の薬剤治療の毒性の可能性の早期の警告として、非侵襲性のモニター患者に臨床的に使用してもよい。

本発明は、組織または器官の障害を検出するための非侵襲性診断方法を、さらに提供する。そのような方法は、疾患および他の病的な状態の同定または診断への臨床設定において有用である。本方法は、疾患の進行を探知するためにも有用であろう。そのような方法によれば、対象の血液は、組織型特異的ＲＮＡの存在を試験される。時間に伴う特異的組織のＲＮＡのレベルの増加は、その中での疾患の悪化の指標となる。同様に、ＲＮＡレベルの減少は、疾患の緩和を示唆する。

加えて、本発明は、対象における療法薬剤または方法の有効性を評価するための非侵襲性診断方法を提供する。そのような方法によれば、標的組織型の以前に損傷した細胞により放出された、正常ＲＮＡレベルへの回帰は、療法薬剤が標的組織に対してその望ましい効果を有することを示すであろう。

本発明のインビトロ方法により、いずれの生動物細胞または細胞株を、薬剤の毒性評価に使用してもよいことを、本開示に基づいて当業者により認められるであろう。例えば、そのような細胞は、哺乳類、鳥類、は虫類、両生類、魚類（ｐｉｓｃｉｎｉａｎ）または昆虫由来であってよい。本発明の方法において使用される細胞は、好ましくは、毒性が評価されている生物の細胞に緊密な類似性を有するであろうことは、当業者にとって明白であろう。例えば、もしも薬剤がヒトにおいて毒性の可能性を評価されるならば、哺乳類由来細胞を使用して薬剤を試験することが好ましく、より好ましくは、ヒト由来細胞である。さらに、特別な組織型または器官由来の細胞は、その組織型または器官の毒性の可能性を評価する時に好ましいであろうということは、当業者にとって明白であろう。例えば、もし薬剤が肝臓における毒性の可能性を評価されているならば、肝臓由来細胞を使用して薬剤を試験することが好ましい。

インビトロ方法で使用される細胞は、多くの動物の器官および／または組織のいずれか由来であってよい。例えば、哺乳類細胞に関して、そのような細胞は、内皮、胸腺、脾臓、骨髄、リンパ球、肝臓、腎臓、心臓、精巣、卵巣、心筋および骨格筋由来であってよい。

無傷の（ｉｎｔａｃｔ）生きている肝細胞は、例えば、Ｍａｉｎｅｓら（１９９８）に記載されたものを含む、当該技術分野で公知の方法により、実験動物の肝臓組織または寄付されたヒト肝臓から調製してよい。肝細胞は、２工程のコラゲナーゼ消化により調製することができる。第一工程において、組織の間室カルシウムを激減させ、そして上皮の細胞−細胞接着を弱めるために、ＥＧＴＡを含む緩衝液で、組織を潅流する（ｐｅｒｆｕｓｅ）。第二工程において、第二潅流緩衝液がコラゲナーゼを含んで使用され、それは細胞間コラーゲンを消化し、やがて細胞−細胞接触の完全な消化に至る。

哺乳類細胞株を利用する好ましい態様において、細胞は、試験薬剤で処理する前に細胞の培養を発生することにより、調製する。当業者により周知なように、培養状態は、使用する細胞型に依存して変化するであろう。例えば、細胞株を使用したとき、細胞が５０−１００％の密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）の密度に至るまで、細胞を日常的に増殖することができる。密集度は、お互いに接触している細胞の数を視覚的に見積もることにより測定する。例えば、もしも細胞が、それらの間に空間がない密度に至ったならば、それは１００％の密集度であると考えられる。

本明細書の記載に基づいて当業者に明白であるように、望ましい密度は、細胞の型、並びに試験薬剤の変化する濃度で使用しそして処理した増殖条件を含む、多くの要素に依存するであろう。本開示に基づいて当業者が認めるように、いずれか所与の試験薬剤に関して、濃度の範囲は使用した細胞型および試験薬剤に依存して変化するであろうが、ゼロと細胞死をもたらす濃度の間にすべきである。暴露の期間は、一般的におよそ５分からおよそ４８時間の間の範囲であろうが、好ましくはおよそ２時間からおよそ３２時間である。本明細書の記載に基づいて当業者に明白であるように、暴露の最適な期間は、使用した細胞型、並びに試験薬剤の物理学的および化学的特性を含む多くの因子に依存するであろう。

哺乳類細胞を培養するさらなる方法および技術は、当業者に周知である。細胞培養の準備および操作の一般的方法は、Ｂｏｎｆａｃｉｎｏら（１９９８）に記載される。Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（１９９３）も参照されたい。

本発明のインビトロ方法の実施において、細胞によるＲＮＡ放出は、本明細書の記載に基づいて、当業者に公知の方法により検出できる。一般的に、ＲＮＡの検出は、以下に記載するような抽出、増幅および検出を含む多工程処理を含む。

本発明のインビボ方法は、例えば哺乳類、鳥類、は虫類、両生類または魚類対象を含むいずれの脊椎動物対象で利用してよい。例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、マウス、ラットまたは霊長類を含み、好ましくは、哺乳類対象が使用される。

本発明のインビボ方法の実施において、血液は、収集チューブ、好ましくは抗凝血剤ありのまたは無しのシリコン処理したガラスの中に、当業者に公知の標準的方法により対象から取り出される。血漿の調製のために、血液は、好ましくはＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウム、ヘパリン、または類似の抗凝血剤と保存される。好ましくは、血液は、ＥＤＴＡを含むチューブの中に収集され、そして分画されずに４℃で保存される。あるいは、血清の調製のための抗凝血剤無しの非処理の血餅は、４℃で保存し、そして６時間以内に処理すべきである。使用した方法に関わらず、ＲＮＡの分解またはさらなる放出、それによる結果の正確性に影響があることを避けるために、できるだけ早く、好ましくは６時間以内に、血液はＲＮＡ内容の解析のために最もよく処理される。

長期間の保存のために、血漿または血清は、好ましくは全血液および次いだ冷凍物から分画される。これは、冷凍細胞および融解細胞の溶解から放出される無関係な細胞内ＲＮＡの可能性、またはＰＣＲ増幅の使用に関して、ＲＮＡの定量化の感度を減少するかもしれないポルフィリンおよびヘマチンのようなＰＣＲの阻害剤の放出を減少させる。血漿または血清は、遠心分離により、好ましくはおよそ３００から８００回の重力でおよそ５から１０分間の穏やかな遠心分離を使用することにより全血液から分画してもよく、または他の標準的方法により分画してもよい。ヘパリンはＲＴ−ＰＣＲに干渉しうるので、ヘパリン添加血液の使用は、当業者に公知の方法によりヘパリナーゼの非活性化を必要とするかもしれない。

一般的に、本発明のインビトロ方法およびインビボ方法の実施のためのＲＮＡの検出は、多工程処理を伴う：（１）ＲＮＡの抽出；（２）ＲＮＡのそのｃＤＮＡの逆転写を含んでよい増幅；および（３）検出。いずれか特別な理論または機構に傾倒することを意図しないが、細胞外ＲＮＡは、タンパク質−ＲＮＡ、リポタンパク質−ＲＮＡ複合体、脂質−ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡ複合体として細胞外に存在し、そしてそのような複合体はＲＮＡレベルの増幅および検出を干渉するかもしれないと考えられる。それ故に、この理論によれば、ＲＮＡをその結びついた複合体から解離するために、増幅および検出の前に、抽出工程を使用することが好ましい。

当業者に公知の多くの核酸抽出方法のいずれかを、本発明の実施において使用してよい。公表された方法の多くは、細胞内ＲＮＡの抽出を意図するが、それらは文字通り記載されるように、または本開示に基づいて当業者に明らかであろう修正とともに使用してよい。例えば、Ｂｏｏｍら（１９９０）またはＣｈｅｕｎｇら（１９９４）が記載する方法におけるように、細胞外ＲＮＡは、シリカ粒子、ガラスビーズ、または珪藻を使用して抽出してよい。

本発明のインビトロ方法での細胞増殖培地からのＲＮＡを抽出するための典型的な方法において、当該技術分野において周知の方法（例えば、遠心分離またはろ過による）により細胞から分離された培地は、例えば、米国特許番号５，２３４，８０９号に記載されるグアニジニウム（イソ）チオシアネートの、カオトロピック物質のようなＲＮＡ安定化剤と処理する。次いで、ＲＮＡは、シリカ粒子のような固体結合材に結合する。次いで、ＲＮＡ−固体相は、ろ過により液層から分離可能である。次いで、ＲＮＡが溶出しうる１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）からなる緩衝液を使用して、シリカ粒子から溶出可能である。

血液からの典型的な抽出方法において、およそ１００から２５０ｍｌの細胞無しの血漿または血清を、以下で記載するように調製した４０マイクロリットルの水性シリカ懸濁液、および以下で記載するように調製した９００マイクロリットルの溶解緩衝液と混合し、そして室温で１０分間混合する。次いで、混合物を、１２，０００×ｇで１分間遠心分離し、そして上清を除く。次いで、結果生じたシリカ−ＲＮＡペレットをおよそ４５０マイクロリットルの、以下で記載するように調製した洗浄緩衝液で２回、その後に１ｍｌの７０％（体積／体積）エタノールで洗浄する。最後に、ペレットを１ｍｌのアセトンで洗浄し、そしておよそ５６℃でおよそ１０分間乾燥する。次いで、およそ２０から５０マイクロリットルのジエチルプロカーボネート処理水中で、５６℃で１０分間懸濁し、その後におよそ３分間のおよそ１２，０００回の重力の遠心分離により、ＲＮＡをシリカペレットから溶出する。あるいは、Ｂｏｏｍら（１９９１）に記載される方法によって、プロテイナーゼＫのようなプロテイナーゼありでまたは無しで、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）およびＲＮａｓｅ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎ（登録商標）、プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）からなる緩衝液を使用して、ＲＮＡを溶出してよい。結果生じた上清を含むＲＮＡを、増幅および検出のために再生する。

増幅および検出の前に、微量ＤＮＡの除去によりＲＮＡをさらに精製することが望ましい。さらなる精製は、Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎ，Ａ．（１９９４）に記載される方法によって、ＤＮａｓｅを使用して達成してもよい。

以上に記載した水性シリカ懸濁液は、６０グラムの二酸化ケイ素（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏｒｐ．，ミズーリ州セントルイス）を、５００ｍｌの脱塩滅菌二重蒸留水中で懸濁することにより調製可能である。次いで、上清をおよそ２４時間室温で安定させる。上清を除き、そして粒子を等量の５００ミリリットルを加えた脱塩滅菌二重蒸留水中で懸濁する。一度懸濁液が安定したら、およそ４４０ミリリットルの上清を除き、そして懸濁液のｐＨを塩酸を使用しておよそｐＨ２に調節する。

以上に記載の溶解緩衝液を、１２０グラムのグアニジンチオシアン酸塩を、１００ｍｌの０．１ＭＴｒｉｓ塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ６．４）、およびＮａＯＨでｐＨ８．０に調整した２２ミリリットルの０．２ＭＥＤＴＡ、および２．６グラムのＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏｒｐ．）の中に溶解することによって調製する。

以上に記載の洗浄緩衝液を、１２０グラムのグアニジンチオシアン酸塩を、１００ミリリットルの０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．４）に溶解することによって調製する。

血液からのＲＮＡ抽出の好ましい方法において、ＰＡＸｇｅｎｅ^ＴＭＢｌｏｏｄＲＮＡキット（カタログナンバー７６２１３２，ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．，カリフォルニア州ヴァレンシア）を、シリカ−ゲル−膜システムを使用してＲＮＡを抽出するために使用する。この方法において、血液試料を核酸をペレットにするために遠心分離し、そしてペレットを洗浄し、そしてプロテイナーゼＫで処理する。エタノールを加え、そして試料をＲＮＡ選択的に結合するシリカ−ゲル膜を含むスピンカラムに適用する。不純物を取り除くための遠心分離の後に、ＲＮＡを最適化した緩衝液で溶出する。本発明のインビトロ方法に由来する上清からのＲＮＡ抽出の好ましい方法において、ＲＮｅａｓｙ^ＴＭキット（カタログナンバー７４１２４，ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．，カリフォルニア州ヴァレンシア）を、以上に記載したＰＡＸｇｅｎｅ^ＴＭＢｌｏｏｄＲＮＡキットに類似したシリカ−ゲル−膜システムを使用してＲＮＡを抽出するために使用する。

代替の方法をＲＮＡ抽出のために使用することができ、それは限定はされないが、例えば、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（１９７９）に記載されるような塩化セシウム勾配を介した遠心分離、および例えばＦｏｕｒｎｉｅら（１９８６）に一般的に記載されるような、ゼラチンを用いた血漿または血清からの細胞外ＲＮＡの共沈降を含む。ＲＮＡ抽出の他の方法は、本開示に基づいて、当業者には明白であろう。

以上に記載のように抽出されたＲＮＡは、核酸増幅アッセイを使用して増幅することができる。少数のＲＮＡ分子の検出を可能にすることができるいずれの核酸増幅アッセイを、本発明の実施において使用することができる。適用可能なアッセイは、限定はされないが、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（例えば、Ａｂｒａｖａｙａ，Ｋ．ら（１９９５）を参照されたい）、分岐ＤＮＡシグナル増幅（例えば、Ｊｒｄｅａ，Ｍ．Ｓ．ら（１９９３）を参照されたい）、増幅に基づく定温核酸配列（ＮＡＳＢＡ）（例えば、Ｋｉｅｖｉｔｓ，Ｔ．ら（１９９１）を参照されたい）、およびその他自立した配列複製アッセイを含む。

本発明のためのＲＮＡの増幅のための好ましい態様は、ＲＴ−ＰＣＲの使用を介する。ＲＴ−ＰＣＲを使用したＲＮＡの増幅の方法は、当業者に周知であり、そして文献中に十分に記載される（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４）およびＩｎｎｉｓら（１９９０）を参照されたい）。

例えば、ＲＴ−ＰＣＲによる、増幅および増幅産物の検出のためのプローブへ使用されるプライマーの選択は、本発明の方法を介して評価される細胞の型に依存するであろう。本発明のインビトロ方法のための、そのような評価は、１つまたはそれより多くの細胞型を含んでなる細胞培養の使用を含む。インビボ方法のために、評価は、対象の体の中の多くの異なる細胞型を含んでもよい。

したがって、プローブおよびプライマーのセットは、そのような細胞の１つまたはそれより多くの転写された遺伝子を標的とすべきであり、その転写物はそれらの細胞を同定するために使用することができる。好ましくは、そのようなプローブおよびプライマーは、特別な細胞型に独特のＲＮＡを標的とするであろう。そのような遺伝子が比較的高いレベルで転写されることも好ましく、そして細胞の状況または細胞が影響される状態に関わらないことも続けて好ましい。

いずれかの適した転写された遺伝子は、そのようなプローブおよびプライマーを構築するために使用することができる。例えば、肝臓を標的とするために、アルブミン遺伝子を使用することができる。代表的なアルブミン遺伝子配列は、以下の遺伝子アクセッション番号を含む：Ｖ０１２２２およびＪ００６９８（ラット）；ＢＣ０３４０２６（ヒト）；ＡＢＢＯＳ（ウシ）；ＣＡＢ６４８６７（イヌ）；ＡＢＣＨＳ（ニワトリ）；Ｘ７８５９８およびＳ５９５１７（コブラ）；Ｐ４９０６４およびＸ８４８４２（ネコ）；ＡＢＸＬ６８、ＡＢＸＬ７２、Ｐ２１８４７およびＡＡＤ０９３５８（カエル）；ＪＣ５８３８（アレチネズミ）；Ｘ７４０４５（ヤツメウネギ）；Ｑ２８５２２（マカクザル）；Ｐ０７７２４（マウス）；Ｍ３６７８７（ブタ）；Ｐ４９０６５（ウサギ）；Ｍ９０４６３（アカゲザル）；ＡＡＬ５６６４６（サンショウウオ）；ＡＢＯＮＳ１およびＡＢＯＮＳ２（サケ）；およびＸ１７０５５（ヒツジ）。

心臓を標的とするために、トロポニンＴ遺伝子を使用することができる。代表的なトロポニンＴ遺伝子配列は、以下の遺伝子アクセッション番号を含む：ＲＡＴＣＴＴＧ（ラット）；ＨＳＣＴＮＴＡＩ１（ヒト）；ＡＢ０８５６００（ウシ）；Ｕ８４０３７（ブラウントラウト）；ＡＹ００５１４０（イヌ）；Ｋ０２２６３（ニワトリ）；ＡＦ０２０９４６（マウス）；およびＬ４０１７８（ウサギ）。

心臓を標的とするために使用できる代替の遺伝子は、心臓アクチンである。代表的な心臓アクチン遺伝子配列は、以下の遺伝子アクセッション番号を含む：ＲＲＡＬＰＨＡＡＣ（ラット）；およびＨＵＭＡＣＴＣＡ２（ヒト）。

平滑筋を標的とするために、ＳＭ２２遺伝子を使用することができる。代表的なＳＭ２２遺伝子配列は、以下の遺伝子アクセッション番号を含む：ＲＡＴＡＲＳＭ２２Ｃ（ラット）；Ｄ１７４０９（ヒト）；Ｍ８３１０５（ニワトリ）；Ｚ６８６１８（マウス）；およびＡＦ０５３６２９（ブタ）。

平滑筋を標的とするために使用できる代替の遺伝子は、平滑筋アクチンである。代表的な平滑筋アクチンは、以下の遺伝子アクセッション番号を含む：ＲＡＴＡＣＴＡＳＭ（ラット）；およびＢＣ０１７５５４（ヒト）。

腎臓を標的とするために、タム−ホースフォールタンパク質遺伝子を使用することができる。代表的なタム−ホースフォールタンパク質遺伝子配列は、以下の遺伝子アクセッション番号を含む：ＲＡＴＵＲＯＭＯＤ（ラット）；およびＨＵＭＵＭＯＤ（ヒト）。

腎臓を標的とするために使用できる代替の遺伝子は、アクアポリン−２である。代表的なアクアポリン−２遺伝子配列は、以下の遺伝子アクセッション番号を含む：ＡＱＰ２＿ＲＡＴ（ラット）；ＨＳ２ＡＱＰ２（ヒト）；ＡＦ０２８００５（ウシ）；ＡＹ０５５４６８（マウス）；およびＡＦ０５０１５２（ヒツジ）。

腎臓を標的とするために使用できるさらに他の代替の遺伝子は、腎臓アンドロゲン特異的タンパク質である。代表的な腎臓アンドロゲン特異的タンパク質遺伝子配列は、アクセッション番号ＲＮＵ２５８０８（ラット）である。

上述の遺伝子は、説明的な目的のみのためである。これらのリストは、所与の組織または細胞の型に対するすべての標的遺伝子を含むことを意図していない。他の適した遺伝子標的は、本開示に基づき当業者に明白であろう。

プローブおよびプライマーを調製するおよび使用する方法は、当該技術分野で周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４）、およびＩｎｎｉｓら（１９９０）に記載される。ＰＣＲプライマー対は、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ（ヴァージョン０．５，１９９１，ＷｈｉｔｅｈｅａｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）のような目的を意図するコンピュータープログラムを使用することにより、公知の配列に由来することができる。

プライマーとしての使用のためのオリゴヌクレオチドは、そのような目的のために当該技術分野で公知のソフトウェアを使用して選択される。例えば、ＯＬＩＧＯ（登録商標）ヴァージョン６ソフトウェア（ＭｏｌｕｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＩｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．，コロラド州カスケード、ｗｗｗ．ｏｌｉｇｏ．ｎｅｔ）は、それぞれ１００ヌクレオチドまでのＰＣＲプライマー対の選択のために、並びに３２キロ塩基までのインプットポリヌクレオチド配列から、オリゴヌクレオチドおよび５０００塩基までのより大きなポリヌクレオチドの解析のために有用である。同様のプライマー選択プログラムは、拡大された性能のために、さらなる特徴を取り込んだ。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｘａｓ，ＳｏｕｔｈＷｅｓｔＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒのＧｅｎｏｍｅＣｅｎｔｅｒ，テキサス州ダラス、ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｇｅｎｏｍｅ．ｏｕ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｐｒｏｇｒａｍｓ／ｐｒｉｍｏｕ＿ｓｒｃ．ｔａｒから一般に利用できる）は、メガベース（ｍａｇａｂａｓｅ）配列から特異的なプライマーを選ぶことができ、そしてしたがって、ゲノム規模の範囲でのプライマーの設計に有用である。Ｐｒｉｍｅｒ３、ヴァージョン０．９、プライマー選択プログラム（ＷｈｉｔｅｈｅａｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴＣｅｎｔｅｒｆｏｒＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ、マサチューセッツ州ケンブリッジ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｏｔｈｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｈｔｍｌから一般に利用できる、）は、“ミスプライミングライブラリー（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇｌｉｂｒａｒｙ）”を、使用者が入力することができ、それは、使用者が指定したプライマー結合部位を避けるための配列である。特に、Ｐｒｉｍｅｒ３は、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。（後の２つのプライマー選択プログラムのためのソースコードは、それら個別のソースから入手してもよく、そして使用者の特定の必要性に合うために修正してもよい）。ＰｒｉｍｅＧｅｎプログラム（ＵＫＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＭａｐｐｉｎｇＰｒｏｊｅｃｔＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｒｅ，英国ケンブリッジ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ／Ｏｐｉｎｉｏｎ／ｐｒｉｍｅｒｇｅｎ．ｈｔｍｌから一般に利用できる、）は、多配列アラインメントに基づきプライマーを設計し、それにより並列された（ａｌｉｇｎｅｄ）核酸配列の最も保存された、または最も少なく保存された領域のいずれかにハイブリダイズするプライマーの選択を可能にする。それ故に、このプログラムは、独特の並びに保存されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片の両方の同定に有用である。他のオリゴヌクレオチド選択方法は、本開示に基づいて、当業者に明白であろう。

上述のように抽出されおよび／または増幅されたＲＮＡは、検出方法を使用して検出することができる。ＲＮＡ検出の方法は、当業者により周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４）およびＩｎｎｉｓら（１９９０）に記載される。

好ましい検出システムは、ＰＣＲサイクルの間に、統合されたサーマルサイクラー、光源を含む蛍光、および検出器を使用する、ＲＮＡのリアルタイムの検出を使用する。そのような検出を実行するための典型的な機器は、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州フォスターシティー）である。

ＲＮＡの検出のためのまた別の方法は、本開示に基づいて、当業者に明白であろう。そのような方法は、例えば、ゲル電気泳動とその後に続くサザンブロット解析（例えば、Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．Ｄ．（１９８９）を参照されたい）、ＥＬＩＳＡ検出方法（例えば、Ｌａｎｄｇｒａｆ，Ａら（１９９１）、Ｃｏｕｔｌｅｅ，Ｆ．ら（１９８９）およびＢｏｂｏ，Ｌ．ら（１９９０）を参照されたい）および電気化学蛍光検出（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を使用した方法（例えば、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｆ．（１９９１）およびＤｉＣｅｓａｒｅ，Ｊ．ら（１９９３）を参照されたい）を含みうる。電気泳動検出方法は、２またはそれより多くのＲＮＡ集団のバンドの比較を含んでよい。１つのＲＮＡ集団から１つのゲルのオートラジオグラフ上で存在し、そしてもう一つの上には存在しないバンドは、１つの集団中にあり、そして他方にはない、特別なＲＮＡの存在に対応し、そしてしたがって異なって発現しうる遺伝子を示唆する（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｇ．（１９９０）、Ｗｅｌｓｈ，Ｊ．ら（１９９０）、Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｓ．Ｒ．（１９９２）、Ｎａｄｅａｕ，Ｊ．Ｈ．（１９９２）、Ｌｉａｎｇ，Ｐ．ら（１９９２）、Ｗｅｌｓｈ，Ｊ．ら（１９９２）およびＬｉａｎｇ，Ｐ．ら（１９９３）を参照されたい）。

最後に、本発明ための検出方法は、アレイまたはマイクロアレイの使用を含んでよい。アレイおよびマイクロアレイは、紙、ナイロンまたは他の種類の膜、フィルター、チップ、ガラススライド、またはいずれか他の適した固体支持体のような担体上の、一組の異なって合成されたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。好ましい態様において、アレイおよびマイクロアレイは、米国特許番号５，８３７，８３２、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ９５／１１９９５、Ｌｏｃｋｈａｒｔら（１９９６）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．ら（１９９６）に記載される方法に従って調製し、そして使用してよい。他の態様において、そのようなアレイは、米国特許番号５，８０７，５２２に記載される方法により生産する。

本明細書に引用される、すべての特許、出願の開示、および遺伝子アクセッション番号（関連情報を含む）、出版物、および例えば冊子または技術告示のような文献は、完全に援用により本明細書に明らかに取り込まれる。

当業者は、実施例、図面、配列表および付随する特許請求の範囲を含む本記載を使用して、本発明を最大限に利用することができると思われる。続く実施例は、本発明の実施の単なる説明として構築されたものであり、いずれのどんな方法において本開示の残りの限定ではない。

実施例
実施例１
ベータアクチンｍＲＮＡの放出対ＬＤＨにより測定される、ラット内皮細胞を使用したＨ _２Ｏ _２誘導細胞障害のインビトロアッセイ
不死化したラット内皮細胞（カタログ番号ＣＲＬ−２２２２、ＡＴＣＣ、ヴァージニア州マナッサス）を、６４．８ｍｇ／ｄｌヘパリン（カタログ番号Ｈ３３９３、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏｒｐ．，ミズーリ州セントルイス）および５％Ｇｉｂｃｏ^ＴＭＦＢＳ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）で補足したＶｉｔａｃｅｌｌ（登録商標）ダルベッコＭＥＭ（カタログ番号３０−２００２，ＡＴＣＣ）中で、およそ８０％密集度に至るまで、増殖させた。培地を細胞から取り除き、そして補足無しのＭＥＭで置き換えた。細胞を、最終濃度０．０００３％、０．００３％、０．０１％、０．０３％および０．１％のＨ_２Ｏ_２で１時間インキュベートした。コントロール細胞は、１０×ストックＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）でのみ処理した。処理期間の終わりに、上清を除去し、そして１６，０００ＲＰＭで、室温にて遠心分離した。生じた上清を、細胞および細胞の破片から分離した。上清を、ＬＤＨ放出の量の機能として、膜の完全性を測るために、ＬＤＨ解析により解析した（Ｍａｉｎｅｓら（１９９８）；Ｐｕｔｎａｍら（２００２）を参照されたい）。自動ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ／Ｈｉｔａｃｈｉ９１７Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、インディアナ州インディアナポリス）を使用して、製造業者の説明書にしたがってＬＤＨ解析を実行した。上清の一部（６５０μｌ）を、製造業者の説明書にしたがって、ＲＮｅａｓｙ^ＴＭミニキット（ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．，カリフォルニア州ヴァレンシア）を使用して、ＲＮＡ抽出のためにも使用した。上清を、前方プライマーとして５’−ＡＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣ−３’、後方プライマーとして５’−ＡＴＧＣＣＡＣＡＧＡＴＴＣＣＡＴＡＣＣＡ−３’、およびプローブとして５’−ＣＡＣＴＧＣＣＧＣＡＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣ−３’を使用して、ラットベータアクチン特異的ｍＲＮＡ（アクセッション番号Ｖ０１２１７およびＪ００６９１）の存在をＲＴ−ＰＣＲを使用して解析した。ＲＴ−ＰＣＲを、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）で実行した。鋳型無しの反応を負のコントロールとして役立て、そしてラット内皮細胞ＲＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）を正のコントロールとして役立てた。

この実施例１の結果を、以下の表１に表わす。表１は、ＬＤＨのレベルによるよりも放出されたベータアクチンのｍＲＮＡのレベルに基づき、細胞障害がＨ_２Ｏ_２の十分により低い濃度で検出できることを示す。

実施例１は、対象への薬剤の細胞損傷効果を評価するための本発明のインビトロ方法を説明する。さらに、実施例１は、ＬＤＨ放出により測定される、薬剤の細胞障害効果を評価する伝統的方法に対して、本発明の方法の利点を示す。

実施例２
ベータアクチンｍＲＮＡの放出により測定される、ラット内皮細胞を使用したＨ _２Ｏ _２誘導細胞障害のインビボアッセイ
２５０−４５０ｇの間の体重を有する、４匹のメスのＳｐａｒａｇｕｅ＿Ｄａｗｌｅｙ／Ｃｒｌ：ＣＤ（登録商標）（ＳＤ）ＩＧＳＢＲラット（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）に、０．５％メチルセルロース担体中の、１４００ｍｇ／ｋｇのアセトアミノフェン（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏｒｐ．）を経口で投与した（強制栄養（ｇａｖａｇｅ）による）。４匹のコントロールラットに、処理されたラットが受けたものとおよそ同じ量を有する多量のメチルセルロース担体（アセトアミノフェン無し）を投与した。２４時間後、すべてのラットを安楽死させ、そして肝臓を検視により収集した。検視の際に、血液試料をマイクロタイナー（ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ）チューブ中で大静脈から収集した（およそ０．５ｍｌ）。次いで、すべての肝臓を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、そしてトリミングし（ｔｒｉｍｍｉｎｇ）トリミングを受け（ｔｒｉｍｍｅｄ）、脱水し、パラフィンに包埋し、切片にし、ガラススライド上に乗せ、そしてヘマトキシリンおよびエオジン色素で染色することにより、組織病理学を進めた。

血液を、製造業者の説明書にしたがって、自動ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ／Ｈｉｔａｃｈｉ９１７Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、インディアナ州インディアナポリス）を使用して、肝細胞障害マーカー（ＡＬＴ，ＡＳＴおよび５’ＮＴ）で解析した（Ｄｕｎｃａｎ，Ｊ．Ｒ．（１９９４）を参照されたい）。

ＲＮＡ抽出のために、ラットごとにおよそ２．５ｍｌの血液を、ＰＡＸｇｅｎｅ^ＴＭＢｌｏｏｄチューブ（ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．，カリフォルニア州ヴァレンシア）中に収集した。ＲＮＡを、ＰＡＸｇｅｎｅ^ＴＭＢｌｏｏｄＲＮＡキットとともに提供される製造業者の説明書にしたがって抽出した。アルブミン（アクセッション番号Ｖ０１２２２およびＪ００６９８）のレベルを測定するために、前方プライマーとして５’−ＡＧＡＡＧＣＴＴＧＧＡＧＡＧＴＡＴＧＧＡＴＴＣＣ−３’、後方プライマーとして５’−ＣＴＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＧＡＧＡＧＴ−３’ を有する第一プライマーセット、およびプローブとして５’−ＴＴＣＧＡＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣＣＴＣＡＧＧＴ−３’を使用して、抽出したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに使用した。ＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州フォスターシティー）で、ＲＴ−ＰＣＲを実行した。

結果を以下の表２に表わす。表２は、肝細胞の障害のためのＡＬＴ、ＡＳＴおよび５’ＮＴマーカーと比較して、血液中のアルブミンＲＮＡを測定することにより、より高いレベルの感度で、細胞障害を検出できることを示す。ラットの組織病理学的解析が、中程度のレベルの障害を示唆した。顕微鏡によれば、２匹の動物において多病巣性の、そして他の２匹の動物において、肝細胞の退化およびネクローシス、浮腫液、出血、並びに単核細胞および場合によっては好中球の進入により特徴づけられる、中程度の小葉中心性退化があった。顕微鏡的損傷の重傷度および分布は、ＡＬＴ、ＡＳＴ、５’ＮＴ、およびアルブミンＲＴ−ＰＣＲにおける測定の増加と十分に相関した。

実施例２は、肝細胞を使用した薬剤の細胞障害効果を評価するための、本発明のインビボ方法を説明する。さらに、実施例２は、肝細胞障害のＡＬＴ、ＡＳＴおよび５’ＮＴマーカーを測定する伝統的方法に対して、本発明の方法の利点を示す。

Claims

細胞に対する薬剤の毒性を評価する方法であって：薬剤で１つまたはそれより多くの、哺乳類から取り出された細胞を処理し；そして前記細胞により放出されたＲＮＡ量への前記薬剤の効果を測定することを含んでなる、前記方法。
前記細胞が、１つまたはそれより多くのヒト由来細胞を含んでなる、請求項１の方法。
前記測定が、前記細胞により放出された１つまたはそれより多くのＲＮＡマーカーの量への前記薬剤の効果を測定することを含んでなる、請求項１の方法。
前記細胞が哺乳類肝臓由来であり、そして前記１つまたはそれより多くのＲＮＡマーカーがアルブミンを含んでなる、請求項３の方法。
前記細胞が哺乳類心臓由来であり、そして前記１つまたはそれより多くのＲＮＡマーカーが１つまたはそれより多くのトロポニンＴおよび心臓アクチンより選択される、請求項３の方法。
前記細胞が哺乳類平滑筋由来であり、そして前記１つまたはそれより多くのＲＮＡマーカーが１つまたはそれより多くのＳＭ２２および平滑筋アクチンより選択される、請求項３の方法。
前記細胞が哺乳類腎臓由来であり、そして前記１つまたはそれより多くのＲＮＡマーカーが１つまたはそれより多くのタム−ホースフォール（Ｔａｍｍ−Ｈｏｒｓｆａｌｌ）タンパク質およびアクアポリン−２より選択される、請求項３の方法。
前記薬剤を細胞損傷を起こしうる薬剤として特徴付けることをさらに含んでなる、ここにおいて前記細胞によるＲＮＡ放出量が少なくとも２倍に増加する場合に、前記損傷は増加したＲＮＡ放出により特徴づけられる、請求項１の方法。
薬剤の細胞保護的特徴を評価する方法であって：１つまたはそれより多くの、動物から取り出された細胞を細胞損傷を引き起こす第一薬剤で処理し、ここで前記損傷は損傷を受けた細胞からの増加したＲＮＡ放出により特徴づけられ、ただし、前記細胞によるＲＮＡ放出量が少なくとも２倍増加し；前記細胞を第二薬剤で処理し；そして前記第一薬剤により引き起こされた前記細胞によるＲＮＡ放出の量を削減する前記第二薬剤の効果を測定することを含んでなる、前記方法。
対象に対する薬剤の毒性を評価する方法であって：薬剤で非ヒト哺乳類対象を処理し；そして１つまたはそれより多くのＲＮＡマーカーの血液中への放出を増加する前記処理の効果を測定することを含んでなり、ここで、前記遺伝子マーカーが１つまたはそれより多くの：アルブミン、心臓アクチン、トロポニンＴ、ＳＭ２２、平滑筋アクチン、腎臓アンドロゲン特異的タンパク質、タム−ホースフォールタンパク質およびアクアポリン−２、より選択される、前記方法。
ＲＮＡの量の測定が、前記対象から血液を取り出し、そしてＲＴ−ＰＣＲを使用して前記血液中のＲＮＡレベルを測定することを含んでなる、請求項１０の方法。