CN107574241B

CN107574241B - 抑郁症家族基因ska1-3的检测方法

Info

Publication number: CN107574241B
Application number: CN201711054466.XA
Authority: CN
Inventors: 赵静洁; 李丽; 吴宁; 赵媚; 李明珍
Original assignee: Beijing Friendship Hospital
Current assignee: Beijing Friendship Hospital
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2017-11-01
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2037-11-01
Also published as: CN107574241A

Abstract

本发明涉及一种抑郁症家族基因SKA1‑3的检测方法，所述方法为：单独或同时的使用SEQ ID NO.1～6所述的三组引物，用QRT‑PCR法检测目标组织或细胞中的SKA1‑3基因的表达情况。

Description

抑郁症家族基因SKA1-3的检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种抑郁症家族基因SKA1-3的检测方法。

背景技术

抑郁症(Depression)是一种常见的精神疾病，是人类丧失工作能力和自杀死亡的首要病因,世界卫生组织(WHO)报告显示，全球估计有超过3.5亿的抑郁症患者，至少20％的患者有过自杀倾向,估计每年有100万抑郁患者自杀身亡。近年来，随着经济和社会的快速发展，对抑郁症的报道在我国呈现出爆发增长趋势。据《Nature》上发布的流行病学数据显示，我国的抑郁症患病率为3.02％，预计到2030年，抑郁症将成为我国医疗卫生领域负担位居第一的疾病，在未来50年内成为严重威胁公众心身健康的问题。大量的中青年抑郁症病例的出现，甚至在青少年群体中病例的出现，以及传统、多发的高知、高职的病例群体，都是对社会发展的极大威胁，尤其是在中国经济和社会发展的转型时期。对抑郁症的及时发现诊断，对患者的及时干预和有效治疗，不仅是亟待解决的学术问题，而且也是关系到国家实现长期稳定发展的社会问题。

目前抑郁症的临床诊断主要基于定式访谈工具《精神障碍诊断和统计手册第四版(DSM-IV)》和《国际精神障碍统计分类手册(ICD-10)》，没有分子诊断方法。我们前期研究成果表明，SKA1,SKA2,SKA3与抑郁症相关，为抑郁症临床辅助诊断标志物提供了一个指标。

发明内容

本发明首先涉及一组单独或任意组合后的用于检测抑郁症家族基因SKA1、SKA2、SKA3的检测引物组，所述的引物为：

检测SKA1的引物的序列如SEQ ID NO.1、2所示：

SEQ ID NO.1：5’-TTTCGGTCGTAGTCTGGTGC-3’，

SEQ ID NO.2：5’-GCATCTACTGAGCGATGCCT-3’；

检测SKA2的引物的序列如SEQ ID NO.3、4所示：

SEQ ID NO.3：5’-TGAAGTCTCACGTGCCAGAC-3’，

SEQ ID NO.4：5’-TCATCAGCCCCCAACCTCTA-3’；

检测SKA3的引物的序列如SEQ ID NO.5、6所示：

SEQ ID NO.5：5’-TCAGCGGTACATGGTTTCCC-3’，

SEQ ID NO.6：5’-ACCTGGACAGAGGGGTCTTT-3’。

本发明还涉及所述的引物组在制备检测抑郁症家族基因的检测试剂盒中的应用，其特征在于，

所述的检测试剂盒为QRT-PCR检测试剂盒；

所述的检测试剂盒检测的目标为组织或细胞提取物；

所述的引物可以单独的或任意组合后同时使用，检测所需的SKA1-3目标基因的表达量；

所述的qPCR参数为：

40个如下循环：

94℃ 2s，

60℃ 30s，

72℃ 30s。

本发明还涉及使用所述的引物组在制备检测遗传性抑郁症的检测试剂盒中的应用。

本发明还涉及使用所述的引物组在检测SKA1-3基因的表达量中的应用，所述的检测方法为QRT-PCR法。

本发明通细胞实验、动物实验、临床实验进行分子生物学基因分析，使用了一组qRT-PCR引物，通过一次实验，即可完成SKA1-3三个基因的表达量定量检测，能够快速的检测目标基因的表达情况。

附图说明

图1、皮质酮给药后P12细胞的存活情况。

图2、皮质酮给药对于P12细胞的形态影响。

图3、使用本发明所述的引物检测P12细胞给药前后的SKA1-3基因的表达量变化。

图4、使用本发明所述的引物检测抑郁症小鼠和正常小鼠脑部的SKA1-3基因的表达量变化。

具体实施方式

P12细胞株来自于中科院细胞库(Cell Bank of Chinese Academy of Sciences，Beijing,China)使用含5％胎牛血清，5％马血清，青霉素钠(100unit/ml)，链霉素(100ug/ml)的DMEM培养基在5％CO₂，37℃培养箱培养。

实施例1、细胞存活率检测(MTT法)及形态检测

取PC12细胞。对照组(with no drug added)和实验组(with皮质酮)PC12细胞株接种于(细胞密度为2x10⁴cell/well)96孔培养板，放入CO₂孵箱，培养3-4d，待细胞长满孔底后即可用于实验。吸去细胞液换上含有相应浓度皮质酮的无血清DMEM(对照组不含任何药品)，培养24h，吸去培养液，用D-Hanks液洗2遍，每孔加入含0.5mg/ml的MTT的无血清DMEM培养4h后吸去培养液，每孔加入10％十二烷基硫酸钠100ul，待蓝色颗粒完全溶解(约12-16h)，用多孔扫描分光光度计测定标本在570nm波长处的吸光度(A570nm)值，用于定量反映活细胞数(n＝4)。

结果显示，MTT结果显示，50μM皮质酮24小时时活细胞数明显减少(P<0.05)(图1)。此外，PC12细胞形态的光学显微镜观察表明，与50μM皮质酮一起孵育24小时后，活细胞数显着减少，细胞神经突明显缩短甚至消失(图2)。

实施例2、Q-RT-PCR验证抑郁症关联基因

取对照组和给药组的细胞，提取500ng总RNA，逆转录为cDNA。同时使用Seq IDNo.1、2；Seq ID No.3、4；Seq ID No.5、6所示的引物进行qPCR检测，qPCR使用QuantitectSYBR Green PCR试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)和ABI 7900仪器(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)进行。

qPCR参数为：40个如下循环的反应：

94℃ 2s，

60℃ 30s，

72℃ 30s。

对每个实验组测量三次重复。

结果如图3所示，相比于对照组细胞，使用皮质酮处理的细胞内的SKA1、SKA2、SKA3的基因表达有明显的降低，表明所述的引物能够特异性的扩增SKA1～SKA3基因。

实施例3、抑郁症小鼠模型的验证

使用皮质酮作为诱导药物，每天以40mg/kg剂量皮下注射SD大鼠(实验组)以及生理盐水(对照组)，21天后进行行为学检测，期间每周进行体重称量。结果显示，与对照组相比皮质酮注射组体重明显降低,强迫游泳的不动时间明显延长。证明抑郁样动物模型建立成功。

取对照组和实验组动物海马组织(hip)和海马区ca3区组织(ca3)，提取组织RNA，逆转录为cDNA，进行qPCR检测SKA1-3的表达情况，qPCR方法同实施例2。

结果如图4显示，相对正常未给药对照组，给药诱导抑郁症组小鼠脑部SKA1-3基因表达明显降低。

最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用做对本发明保护范围的限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 首都医科大学附属北京友谊医院

<120> 抑郁症家族基因SKA1-3的检测方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttcggtcgt agtctggtgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcatctactg agcgatgcct 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgaagtctca cgtgccagac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 热工序列

<400> 4

tcatcagccc ccaacctcta 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcagcggtac atggtttccc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acctggacag aggggtcttt 20

Claims

1.一组用于同时或单独检测抑郁症家族基因SKA1、SKA3的检测引物组，所述的引物组为：

检测SKA1的引物组的序列如SEQ ID NO.1、2所示：

SEQ ID NO.1：5’- TTTCGGTCGTAGTCTGGTGC -3’，

SEQ ID NO.2：5’- GCATCTACTGAGCGATGCCT -3’；

检测SKA3的引物组的序列如SEQ ID NO.5、6所示：

SEQ ID NO.5：5’- TCAGCGGTACATGGTTTCCC -3’，

SEQ ID NO.6：5’- ACCTGGACAGAGGGGTCTTT -3’。

2.权利要求1所述的引物组在制备检测抑郁症家族基因SKA1、SKA3的检测试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，

所述的检测试剂盒为QRT-PCR检测试剂盒；

所述的检测试剂盒检测的目标为组织或细胞提取物；

所述的试剂盒可以单独或同时检测SKA1、SKA3目标基因的表达量。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的QRT-PCR参数为：

40个如下循环：

94℃ 2s，

60℃ 30s，

72℃ 30s。

5.权利要求1所述的引物组在制备检测遗传性抑郁症的检测试剂盒中的应用。