CN108410867A

CN108410867A - 一种新的抑郁症的标记物

Info

Publication number: CN108410867A
Application number: CN201810148418.5A
Authority: CN
Inventors: 朱海兵
Original assignee: Cardiovascular Disease Institute of Guangzhou Panyu Central Hospital
Current assignee: Cardiovascular Disease Institute of Guangzhou Panyu Central Hospital
Priority date: 2018-02-13
Filing date: 2018-02-13
Publication date: 2018-08-17

Abstract

本发明公开了一段在抑郁症中低表达的基因，并且公开了检测该基因的引物序列。该基因在抑郁症人群和非抑郁症人群中具有比较明显的表达差异，目前用于抑郁症的临床辅助诊断技术尚不完善，因此该该基因具有作为抑郁症相关的生物标志物的潜能。

Description

一种新的抑郁症的标记物

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种新的抑郁症的标记物。

背景技术

抑郁症的核心症状是情绪低落、兴趣减退、精力缺失，在全球范围内有超过3.5亿人患有抑郁症。世界卫生组织预测，到2020年，抑郁症将占据世界疾病负担的第二位。

抑郁症对社会造成的重大负担，其原因有发病率高、发病年轻化、呈慢性发展、损害其社会功能和认知能力，及非自然死亡，抑郁症患者中自杀死亡与自杀未遂的比例远远高于在普通人群中的比值。因此研究抑郁症发病机理及可以体现其严重程度的生物标志物，并及时针对病因进行干预与治疗是治疗疾病、减轻社会负担的关键因素。

关于抑郁症的发病机制及治疗原理目前尚不明确，既往认为遗传因素、生物学因素、心理社会因素对抑郁症的发生有一定的影响，后来学术界开展了神经生化、神经内分泌、神经可塑性、神经电生理以及神经影像学等多方面研究，提出了多种病因假说、可能有关的内分泌轴、脑区结构及功能的变化、脑区环路以及信号通路的变化等，均取得了相应的进展，但目前仍然无法完全解释抑郁症的发病原因。现代分子遗传学认为很多社会环境或自身经历等因素可引起基因表达的变化，可导致某些特定的基因发生表观遗传改变，这些变化可引起神经元的可塑性和功能异常，而这些异常表现可以被遗传下来，即表观遗传机制，基于基因水平的发病机理及生物标志物的研究逐步引起学者们的关注。因此找到一种抑郁症的生物标记物对具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于公开一种新的抑郁症的标记物。

本发明所采取的技术方案是：一段在抑郁症中低表达的基因，其序列是：GGAGCGGAGGTGGTTGGGTTTCTGAGTTTGAGTCTGTCGCTCCTGGCTCTCCCGACACAACAGCGGCGCCCACCTTCCCGCAACGGACTCCCAGGAGCCTCGAGCTCCTCATTTCCAAAGCTGAACTGCCCCGTGTCTGATTCCGATTTCTCTTGAGCGCGTTTCGGAGCCGGCCCAGAACAGAGGGAAGCCAGACACACCATACCCGGCCCAACAGTGGCAGGGCGGCTGCGGGTGCTGGTCAAGCTGGGTCACCCGGCACTGAGTGACGATCAGCAAATACTCAGTGGACGAAATATTTGCAGTGCAGTGAGGTGAGGGGCATAACCGCGGAGCGTATTCGAAGAGATGAGAGAGACTGGGGATTAGGCCAGGCTTGAAGGGAAGAATGGTTTGAGCACCGAGGACAAGAATTAATTCCCCAGGCCTGGGTTTCAGCCTTGTGCGGCTATCACGTGCTTGAAACCTGGCTAGTCCGGAGTGAGATGCGCTTTACGTGTAAAATACAGGATTCCAAAGACGTCGTATACAATAATCTGCATACTGTCTGCATGTCAGGTACACATCTCCAACGGTCTCCGGCATCCCCACTACACATGCATCTACCACTGCACCCACAACACACCACACACACACTCTCCAGGACCACCACTCCACGCGCCGCGGCCAAACACGGCACCGCACCAGGGCCCATGCGCCAACAGCAGAGCACACCGGACCCACAGCTCACTGGCACAACACGCGGCACAACCCGGCCGGGCCACCCACAACCGCGGACCCACATACATACCAGACAGCCACGGTAACCGGGCTAGACAACCCCGAAGCGACAAAGCACACACACCACGACAGGGCGACGCGGGCAGGCACAAAAGGGGGCACCGAACAGGGGGGCCAAGCAGATGAACGGAGAAAAACAAGACAGACACGGAGACGAAGCGACGACACAGCAGCAGAACAAAGAGCAGCACCAACGCAGAACCGAAGACACCACGCACAACGGAGACGAACACAAGAAGACGACGCAGGCACACGAAACACGAACAGGCAAGCAGCACCACGCCCGGCCACAGCA(SEQ ID NO：5)。

该基因序列在作为抑郁症检测、治疗、预后靶点的应用。

一种抑郁症检测试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测该基因序列的试剂。

优选的，该试剂盒中含有实时荧光定量检测该基因序列的引物序列。

优选的，定量检测该基因序列的引物是：

F：5’-GGAGCGTATTCGAAGAGATGAGA-3’(SEQ ID NO：3)；

R：5’-GTCCTCGGTGCTCAAACCAT-3’(SEQ ID NO：4)。

定量检测该基因序列的试剂在制备抑郁症检测试剂中的应用。

本发明的有益效果是：本发明申请公开的标志物在抑郁症人群和非抑郁症人群中具有比较明显的表达差异，可以在治疗、诊断抑郁症中起到重要的作用。

具体实施方式

以下具体实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。

实验例1材料与处理：

样本的收集

取新鲜抗凝血1ml，与全血及组织匀浆稀释液液1:1混匀后，小心加于2ml的细胞分离液之液面上，以1500-2000转/分离心(半径15cm水平转子)15分钟，此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层；为血浆层。第二层；为环状乳白色淋巴细胞。第三层；为透明分离液层。第四层；为红细胞层，收集第二层细胞放入含细胞洗涤液4-5毫升的试管中，充分混匀后，以1500-2000转/分离心10-30分钟。沉淀经反复洗2次即得所需细胞。

2)样品的制备与评估

RNA样品制备

每组取2ml样本，用1mL TRIzol试剂和移液管将细胞吹吸裂解液几次，而悬浮细胞则是在离心的沉淀中加入TRIzol试剂并用移液管反复吹吸以裂解细胞，在TRIzol试剂加入前不要洗涤细胞以免增加mRNA降解的可能。

为了将核酸蛋白复合体完全解离，把加了TRIzol的样品于15-30℃放置5min；每1mL的TRIzol试剂匀浆的样品中加入0.2mL的氯仿，盖紧管盖；手动剧烈振荡管体15s后，15-30℃孵育2-3min；4℃下12,000×g离心15mim；离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相；RNA全部被分配于水相中；水相的体积大约使匀浆时加入的TRIzol试剂的60％。

将水相转移到新离心管中；水相与异丙醇混合使其中的RNA沉淀(加入异丙醇的量为每个样品匀浆加入1mL TRIzol试剂时加0.5mL的异丙醇)；混匀后15-30℃孵育10min后，于4℃12,000×g离心10min；RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

移去上清液，每1mL TRIzol试剂匀浆的样品中加入至少75％的乙醇1mL用于清洗RNA沉淀；振荡后，4℃7,500×g离心5min。

最后，为了不降低RNA的可溶性，在空气中不完全干燥RNA沉淀5-10min。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55-60℃孵育10min。获得的RNA溶液保存于-70℃。

总RNA纯化及质检

使用NanoDrop ND-1000评估RNA量和质量，吸光度在260和280mn处测定，A260/A280的比值需要接近2.0(1.8-2.1之间均可)，并且A260/A230比值要大于1.8。RNA完整性和纯度通过标准变性凝胶电泳进行评估。具体实验过程如下。

在微量离心管中分别加入重新溶解的RNA≤85μL、10×反应缓冲液10μL、Baseline-ZERO DNA酶5μL、无RNA酶的水至100μL；37℃孵育30min；加入350μL缓冲液RLT，混匀；加入250μL乙醇(96–100％)，吸打混匀；将上述700μL的样品加入到安装在2mL收集管上的RNeasy小型离心柱中，小心地盖上盖子，在≥8000×g的离心机上离心15s，弃去流体；在RNeasy小柱中加入500μL缓冲液RPE(RPE缓冲液第一次使用前，按瓶上所述加入4倍体积的96-100％乙醇配成工作溶液)，小心地盖上盖子≥8000×g离心15s，洗涤RNeasy膜，弃去流体；再次加入500μL缓冲液RPE，盖上盖子，≥8000×g离心2min，洗涤RNeasy膜；把RNeasy柱放在一新的2mL的收集管中，用过滤法去除旧的收集管，全速离心1min；RNeasy柱转移到一新的1.5mL的离心管中，吸取适量无RNA酶的水直接加入到RNeasy膜中；盖上管盖，≥8000×g离心1min，洗脱；最后进行RNA定量和质量控制。

实验例2实时荧光定量PCR检测

引物设计

随机挑选验证的TFCP2L1进行荧光定量验证。以2^-ΔΔCt法计算差异倍数，通过RT-PCR检测。PCR引物序列如下：

表1 RT-PCR引物列表

检测该基因的序列，该基因序列为：

GGAGCGGAGGTGGTTGGGTTTCTGAGTTTGAGTCTGTCGCTCCTGGCTCTCCCGACACAACAGCGGCGCCCACCTTCCCGCAACGGACTCCCAGGAGCCTCGAGCTCCTCATTTCCAAAGCTGAACTGCCCCGTGTCTGATTCCGATTTCTCTTGAGCGCGTTTCGGAGCCGGCCCAGAACAGAGGGAAGCCAGACACACCATACCCGGCCCAACAGTGGCAGGGCGGCTGCGGGTGCTGGTCAAGCTGGGTCACCCGGCACTGAGTGACGATCAGCAAATACTCAGTGGACGAAATATTTGCAGTGCAGTGAGGTGAGGGGCATAACCGCGGAGCGTATTCGAAGAGATGAGAGAGACTGGGGATTAGGCCAGGCTTGAAGGGAAGAATGGTTTGAGCACCGAGGACAAGAATTAATTCCCCAGGCCTGGGTTTCAGCCTTGTGCGGCTATCACGTGCTTGAAACCTGGCTAGTCCGGAGTGAGATGCGCTTTACGTGTAAAATACAGGATTCCAAAGACGTCGTATACAATAATCTGCATACTGTCTGCATGTCAGGTACACATCTCCAACGGTCTCCGGCATCCCCACTACACATGCATCTACCACTGCACCCACAACACACCACACACACACTCTCCAGGACCACCACTCCACGCGCCGCGGCCAAACACGGCACCGCACCAGGGCCCATGCGCCAACAGCAGAGCACACCGGACCCACAGCTCACTGGCACAACACGCGGCACAACCCGGCCGGGCCACCCACAACCGCGGACCCACATACATACCAGACAGCCACGGTAACCGGGCTAGACAACCCCGAAGCGACAAAGCACACACACCACGACAGGGCGACGCGGGCAGGCACAAAAGGGGGCACCGAACAGGGGGGCCAAGCAGATGAACGGAGAAAAACAAGACAGACACGGAGACGAAGCGACGACACAGCAGCAGAACAAAGAGCAGCACCAACGCAGAACCGAAGACACCACGCACAACGGAGACGAACACAAGAAGACGACGCAGGCACACGAAACACGAACAGGCAAGCAGCACCACGCCCGGCCACAGCA(SEQ ID NO：5)。

RT-PCR进行验证

采用RT-PCR进行验证。建立8μL体系，加入2×Master Mix 5μL，正、反向引物各0.5μL，蒸馏水2μL。将8μL混合液加到384-PCR板对应的每个孔中，加入对应的2μL cDNA，小心粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合。将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。反应程序如下：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10s；60℃，60s收集荧光)。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10s；60℃，60s；95℃，15s)；并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/s)。由于受RNA浓度定量误差和RNA逆转录效率误差等的影响，每个样品的2μL体积的cDNA其含量并不完全相同，为校正此差异，我们使用Gapdh(不同样品间表达量基本恒定)作为内参，以样品待测基因的值除以此样品内参的值，最终得到的比值为样品的待测基因相对含量。

实验例3 RT-PCR检测结果分析

选取番禺中心医院抑郁症105例(男54例，女51例)与体检正常人群132例(男69例，女63例)资料，进行分析，结果如下

表2抑郁症患者和正常人群的△Ct值

	Average Ct	ΔCt	2-ΔCt
				抑郁症人群	20.803949	2.688596333	1.55E-01
正常人群	20.98206767	2.289011	2.05E-01

结果表明，相对于正常人群，抑郁症人群的该基因表达量有显著的降低，因此，检测表达该基因可以作为辅助诊断抑郁症的标记物。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州市番禺区中心医院

<120> 一种新的抑郁症的标记物

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgacttcaac agcgacaccc a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caccctgttg ctgtagccaa a 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggagcgtatt cgaagagatg aga 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtcctcggtg ctcaaaccat 20

<210> 5

<211> 1075

<212> DNA

<213> 目的基因序列

<400> 5

ggagcggagg tggttgggtt tctgagtttg agtctgtcgc tcctggctct cccgacacaa 60

cagcggcgcc caccttcccg caacggactc ccaggagcct cgagctcctc atttccaaag 120

ctgaactgcc ccgtgtctga ttccgatttc tcttgagcgc gtttcggagc cggcccagaa 180

cagagggaag ccagacacac catacccggc ccaacagtgg cagggcggct gcgggtgctg 240

gtcaagctgg gtcacccggc actgagtgac gatcagcaaa tactcagtgg acgaaatatt 300

tgcagtgcag tgaggtgagg ggcataaccg cggagcgtat tcgaagagat gagagagact 360

ggggattagg ccaggcttga agggaagaat ggtttgagca ccgaggacaa gaattaattc 420

cccaggcctg ggtttcagcc ttgtgcggct atcacgtgct tgaaacctgg ctagtccgga 480

gtgagatgcg ctttacgtgt aaaatacagg attccaaaga cgtcgtatac aataatctgc 540

atactgtctg catgtcaggt acacatctcc aacggtctcc ggcatcccca ctacacatgc 600

atctaccact gcacccacaa cacaccacac acacactctc caggaccacc actccacgcg 660

ccgcggccaa acacggcacc gcaccagggc ccatgcgcca acagcagagc acaccggacc 720

cacagctcac tggcacaaca cgcggcacaa cccggccggg ccacccacaa ccgcggaccc 780

acatacatac cagacagcca cggtaaccgg gctagacaac cccgaagcga caaagcacac 840

acaccacgac agggcgacgc gggcaggcac aaaagggggc accgaacagg ggggccaagc 900

agatgaacgg agaaaaacaa gacagacacg gagacgaagc gacgacacag cagcagaaca 960

aagagcagca ccaacgcaga accgaagaca ccacgcacaa cggagacgaa cacaagaaga 1020

cgacgcaggc acacgaaaca cgaacaggca agcagcacca cgcccggcca cagca 1075

Claims

1.一段在抑郁症中低表达的基因，其序列是：

2.权利要求1所述的基因序列在作为抑郁症检测、治疗、预后靶点的应用。

3.一种抑郁症检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有能够定量检测权利要求1所述基因序列的试剂。

4.根据权利要求3所述的抑郁症检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有实时荧光定量检测权利要求1所述基因序列的引物序列。

5.根据权利要求3所述的抑郁症检测试剂盒，其特征在于，所述定量检测权利要求1所述基因序列的引物是：

F：5’-GGAGCGTATTCGAAGAGATGAGA-3’(SEQ ID NO：3)；

R：5’-GTCCTCGGTGCTCAAACCAT-3’(SEQ ID NO：4)。

6.定量检测权利要求1所述基因序列的试剂在制备抑郁症检测试剂中的应用。