CN109628583A - 血浆/血清外泌体miRNA作为青光眼诊断标志物中的应用 - Google Patents
血浆/血清外泌体miRNA作为青光眼诊断标志物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种hsa‑miR‑21‑5p和/或hsa‑miR‑15b‑5p和/或hsa‑miR‑424‑5p作为青光眼诊断标志物中的应用，研究实验表明hsa‑miR‑21‑5p和/或hsa‑miR‑15b‑5p和/或hsa‑miR‑424‑5p在原发性青光眼患者的血液分离出的外泌体中表达上调，本发明提供了hsa‑miR‑21‑5p和/或hsa‑miR‑15b‑5p和/或hsa‑miR‑424‑5p表达水平的产品在制备青光眼疾病诊断工具中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及到血浆/血清外泌体miRNA制备青光眼疾病诊断工具中的应用。
背景技术
视觉作为人和动物最重要的感觉，至少有80％以上的外界信息经视觉获得。青光眼是全球第二位致盲性眼病和首位不可逆性致盲眼病，是因为病理性高眼压等各种原因导致视神经萎缩、视野缺损，最终导致失明的一种神经退行性病变。目前临床治疗以降低眼压和神经保护为主，但仍有约10％的患者最终失明，不能有效的控制视网膜神经节细胞(RGCs)进行性凋亡和促进损伤后修复再生是瓶颈所在。青光眼意味着不可逆性RGCs损伤的开始，可能会伴随患者终身，严重威胁着身心健康和生活质量。目前，中国40岁以上青光眼患者已超过940万，预计到2020年，中国将有2100万的青光眼患者，产生近630万盲人及超过1000万的视觉残障人士，严重威胁着人们的身心健康和生活质量，已成为重大公共卫生问题。而研究认为，因青光眼早期并无明显症状，临床诊断时30-50％的RGCs已丢失，这也表明了早期诊断的重要性。
miRNA是一种内源性的具有调控功能的非编码单链小分子RNA，长度约为20-24个核苷酸，通过引导沉默复合体降解mRNA或阻碍其翻译，在转录后水平调控基因表达。在物种进化中相当保守，其组织特异性和时序性决定组织细胞的功能特异性。miRNA的生物学功能包括调控细胞增殖、分化、凋亡、代谢、迁移等等，在视网膜神经生长发育中也起着重要作用。目前，miRNA作为一种早期诊断的生物标志物在临床发展中已经显示出极大的前景。
外泌体是一种包含了复杂的RNA和蛋白质的直径约40-100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，广泛存在于各种体液中，包括：血清、血浆、细胞培养上清等。近年来的研究显示，外泌体作为一种细胞间的通讯分子，可参与诸多生理及病理过程。由于其本身对具有富集作用以及双层膜结构的保护作用，外泌体所携带的miRNA较循环miRNA更为稳定，因而外泌体来源RNA更有望在各种疾病早期筛查与诊疗方案指导、疗效评估及预后测评领域发挥作用，具有极高的临床应用价值和市场前景。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于青光眼早期诊断的miRNA标记物，对青光眼的发病检测有重要意义。
为实现上述目的，本发明提供一种检测样品中hsa-miR-21-5p和/或hsa-miR-15b-5p和/或hsa-miR-424-5p表达水平的产品在制备青光眼疾病诊断工具中的应用，其中hsa-miR-21-5p的序列如SEQ ID NO.19所示：
SEQ ID NO.19：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA；
其中hsa-miR-15b-5p的序列如SEQ ID NO.20所示：
SEQ ID NO.20：UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA；
其中hsa-miR-424-5p的序列如SEQ ID NO.21所示：
SEQ ID NO.21：CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA。
作为本发明的进一步改进，所述青光眼疾病的类别为原发性青光眼疾病。
作为本发明的进一步改进，其中包括使用实时荧光定量PCR检测hsa-miR-21-5p和/或hsa-miR-15b-5p和/或hsa-miR-424-5p表达水平的制剂，检测所述hsa-miR-21-5p和/或hsa-miR-15b-5p和/或hsa-miR-424-5p的表达水平。
作为本发明的进一步改进，用实时荧光定量PCR检测hsa-miR-21-5p和/或hsa-miR-15b-5p和/或hsa-miR-424-5p表达水平的制剂包括特异性扩增hsa-miR-21-5p和/或hsa-miR-15b-5p和/或hsa-miR-424-5p的引物。
作为本发明的进一步改进，用实时荧光定量PCR检测hsa-miR-15b-5p表达水平的特异性扩增hsa-miR-15b-5p的引物序列如SEQ ID NO.13-14所示：
F:5'-ACACTCCAGCTGGGTTAGCAGCACATCAT-3’；
R:5’-CACAGCTCGTAGAACAGGAGG-3’。
作为本发明的进一步改进，用实时荧光定量PCR检测hsa-miR-21-5p表达水平的特异性扩增hsa-miR-21-5p的引物序列如SEQ ID NO.15-16所示：
F:5'-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGAT-3’
R:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACA-3’。
作为本发明的进一步改进，用实时荧光定量PCR检测hsa-miR-424-5p表达水平的特异性扩增hsa-miR-424-5p的引物序列如SEQ ID NO.17-18所示：
F:5'-GGCAGCAGCAATTCATG-3’
R:5’-CAGTGCGTGTCGTGGAG-3’。
作为本发明的进一步改进，所述样品来源于血浆或血清或血浆外泌体或血清外泌体。
本发明发现相对于正常人群，hsa-miR-21-5p和/或hsa-miR-15b-5p和/或hsa-miR-424-5p在原发性青光眼患者的血液分离出的外泌体中表达上调。提示hsa-miR-21-5p和/或hsa-miR-15b-5p和/或hsa-miR-424-5p是有助于青光眼诊断的生物标志物。本发明为青光眼诊断提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。
附图说明
图1为韦恩图显示PACG与POAG差异血浆外泌体miRNAs；
图2为Control、PACG、AACG、CACG患者血液外泌体中的hsa-miR-29a-3p表达量；
图3为Control、PACG、AACG、CACG患者血液外泌体中的hsa-miR-29b-3p表达量；
图4为Control、PACG、AACG、CACG患者血液外泌体中的hsa-miR-29c-3p表达量；
图5为Control、PACG、AACG、CACG患者血液外泌体中的hsa-miR-15b-5p表达量；
图6为Control、PACG、AACG、CACG患者血液外泌体中的hsa-miR-21-5p表达量；
图7为Control、PACG、AACG、CACG患者血液外泌体中的hsa-miR-424-5p表达量。
具体实施方式
下面将结合附图以及实施例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明。
1.1实验组标本的准备：
收集的231例患者血样均来自于2016年4月至2018年3月间温州医科大学附属眼视光医院门诊或住院患者，其中原发性开角型青光眼80例，原发性闭角型青光眼131例。同期收集单纯性白内障对照组120例。受试者中排除了伴有全身性疾病、眼部患有其它疾病以及手术等病例，排除糖尿病、高血压等慢性疾病以及感染等伴有全身性疾病患者；排除眼部患有其它疾病或手术史患者。病例的情况如表1所示。下文中出现的简称分别表示：PACG:原发性闭角型青光眼，POAG:原发性开角型青光眼，Control为单纯性白内障，AACG为原发性急性闭角型青光眼；CACG为原发性慢性闭角型青光眼。
表1
(1)提取血浆：用EDTA抗凝管采集患者静脉血5ml，4℃静置30min，4℃2000×g离心10min后抽提上层黄色半透明血浆并分装至EP管中，保存于-80℃。
(2)分离外泌体：使用外泌体提取试剂盒(锐博生物Exosome Isolation Reagent)提取血浆外泌体，步骤均按照使用说明进行，如下：①将血浆样本取出，并置于冰上；②4℃，2000×g离心20min，以去除残留细胞及碎片；③转移上清至新管；④4℃，10000×g离心40min；⑤转移上清至新管；⑥加入1/3体积的外泌体提取试剂；⑦颠倒混合或移液器混合，直至完全混匀样本；⑧放入4℃冰箱静置30min；⑨4℃，15000×g离心2min；⑩弃上清，剩余液体即所得外泌体，保存于-80℃备用。
1.2差异表达lncRNA筛选
(1)青光眼患者以及对照组分别提取其血浆中外泌体总RNA，外泌体总RNA的提取方法如下：采用Omega Bio-Tek公司的miRNA Kit试剂盒进行，向0.1ml外泌体沉淀中加入1ml RNA-Solv Reagentl混匀后室温孵育2-3min；加入0.2ml氯仿，混匀后冰上孵育10min；4℃，12000×g离心15min；提取80％上清液置于新管，加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀；每次加不超过700μl的混合液于RNA结合柱，室温，12000×g离心1min；弃去管内液体，加入500μl洗涤缓冲液，室温，10000×g离心30s；弃去管内液体，室温，以最大速度离心2min，甩干结合柱；将DEPC水30μl滴于结合柱基质上，室温孵育5min后，以最大速度离心1min，所得液体即为外泌体总RNA，冻存于-80℃。
取2μl RNA溶液于紫外线分光光度计测量浓度与纯度。
(2)miRNAs表达差异分析：经Q5000仪器测量各管RNA浓度，进行建库并转录组测序，其测序通过测序平台：illumina Hiseq2500以及测序方式：SE50进行测序。
结果如图1所示：上述两种不同类型青光眼患者分别对比对照组，筛选差异miRNAs，并进行韦恩图分析其中PACG、POAG二者共有差异miRNAs有：143个；PACG独有差异miRNAs有：50个；POAG独有差异miRNAs有：83个。
1.3筛选出的目的miRNA实时定量PCR验证:
(1)miRNA实时定量PCR定量分析：筛选30名病人，参照上述RNA提取方法，提取其血浆中外泌体来源总RNA，对其中筛选出的目的miRNA实时定量PCR验证，具体步骤如下：
1)茎环法逆转录：取总RNA2μl，DEPC水4.4μl，70℃变性8min后，迅速置于冰上约5min，再依次加入茎环引物0.4μl，逆转录缓冲液2μl，dNTP mix0.5μl，RNase抑制剂0.2μl，逆转录酶MMLV 0.5μl，总反应体系为10μl，均在冰上制备。混匀反应体系，42℃反应1h，然后于72℃孵育10min。
2)qRT-PCR反应：Forward Primer 0.4μl，Reverse Primer 0.4μl，SYBR GreenⅠ2μl，Taq酶0.5μl，dNTP mix 1μl，PCR buffer 1μl，cDNA1μl，DEPC水3.7μl，总反应体系10μl，反应条件：95℃10min；95℃2s，60℃20s，70℃10s，循环40次。
茎环引物分别如SEQ ID NO.1-6所示：：
has-miR-29a-3p:5’–GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTAACCGAT–3’；
has-miR-29b-3p:5’–GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACAACACTGA–3’；
has-miR-29c-3p:5’–GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTAACCGAT–3’；
hsa-miR-15b-5p:5’–GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGTAAACC–3’；
hsa-miR-21-5p:5’–GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACATC–3’；
hsa-miR-424-5p:5’–GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCAAAAC–3’；
hsa-miRNA-29a-3p的正向和反向引物序列，如SEQ ID NO.7-8所示：
F:5'-ACACTCCAGCTGGGTAGCACCATCTGAAAT-3’
R:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTAACCGAT-3；
hsa-miRNA-29b-3p的引物序列，如SEQ ID NO.9-10所示：
F:5'-TAGCACCATTTGAAATCAGTGTT-3’
R:5’-GCTGTCAACGATACGCTACCT-3’；
hsa-miRNA-29c-3p的引物序列如所示，如SEQ ID NO.11-12所示：
F:5'-CCCCGCCTAGCACCATTTGAAAT-3’
R:5’-CAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3’；
hsa-miR-15b-5p的引物序列如所示，如SEQ ID NO.13-14所示：
F:5'-ACACTCCAGCTGGGTTAGCAGCACATCAT-3’；
R:5’-CACAGCTCGTAGAACAGGAGG-3’。
hsa-miR-21-5p的引物序列如所示，如SEQ ID NO.15-16所示：
F:5'-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGAT-3’
R:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACA-3’；
hsa-miR-424-5p的引物序列如所示，如SEQ ID NO.17-18所示：
F:5'-GGCAGCAGCAATTCATG-3’
R:5’-CAGTGCGTGTCGTGGAG-3’；
(2)数据分析：以cel-miR-39为外参，对miRNA表达量的进行标准化处理，ΔCtmiRNA＝CtmiRNA-CtmiR-39，ΔΔCT＝ΔCtmiRNA-ΔCt对照组，相对表达量RQ＝2ΔΔCT，(15<CT<35)。最终验证6个miRNA分别为hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-29b-3p，hsa-miR-29c-3p，hsa-miR-15b-5p，hsa-miR-21-5，hsa-miR-424-5p，其表达量如表2所示，青光眼患者血浆外泌体miRNA水平相比对照组显著升高且与测序结果一致。
表2
(3)目标miRNAs的ROC曲线分析：以原发性青光眼组和单纯性白内障对照组样本中hsa-miR-29a-3p,hsa-miR-29b-3p,hsa-miR-29c-3p,hsa-miR-15b-5p,hsa-miR-21-5p,hsa-miR-424-5p的相对外参表达量作为自变量，以组别作为因变量(原发性青光眼组设为1，单纯性白内障对照组设为2)，据此绘制ROC曲线，计算灵敏度和特异度，结果如表3所示：
表3
(4)结论：原发性青光眼血浆外泌体hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-29b-3p,hsa-miR-29c-3p，hsa-miR-15b-5p，hsa-miR-21-5p,，hsa-miR-424-5p表达量与对照组相比均有显著上调。因此，本研究发现这6种miRNA的血浆外泌体表达水平与原发性青光眼发生发展有相关，早期检测有助于判断患者是否有患原发性青光眼的风险，从而指导临床上的预防或治疗方案，并或可作为预后评估等具有重要意义。
综上，hsa-miR-15b-5p，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-424-5p对原发性青光眼疾病均具有一定的诊断价值，联合诊断的效能、灵敏度、特异度优于单个miRNA。可以任意一个或者两个以上的miRNA作为标记物进行诊断。
由此，本次发明筛选出的hsa-miR-15b-5p，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-424-5p标志物具有诊断原发性青光眼疾病的特异性，诊断原发性青光眼疾病操作简单，灵敏度高，适用于大规模筛查。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 温州医科大学
<120> 血浆/血清外泌体miRNA作为青光眼诊断标志物中的应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gtcgtatcca gtcgagggtc cgaggtattc cgactggata cgactaaccg at 52
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gtcgtatcca gtcgagggtc cgaggtattc cgactggata cgacaacact ga 52
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gtcgtatcca gtcgagggtc cgaggtattc cgactggata cgactaaccg at 52
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactgtaaa cc 52
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactcaaca tc 52
<210> 6
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacttcaaa ac 52
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
acactccagc tgggtagcac catctgaaat 30
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagtaac cgat 44
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
tagcaccatt tgaaatcagt gtt 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gctgtcaacg atacgctacc t 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
ccccgcctag caccatttga aat 23
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
cagtcgaggg tccgaggtat tccg 24
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
acactccagc tgggttagca gcacatcat 29
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
cacagctcgt agaacaggag g 21
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
acactccagc tgggtagctt atcagactga t 31
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagtcaa ca 42
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
ggcagcagca attcatg 17
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
cagtgcgtgt cgtggag 17
<210> 19
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 20
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
uagcagcaca ucaugguuua ca 22
<210> 21
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
cagcagcaau ucauguuuug aa 22
Claims (8)
1.检测样品中hsa-miR-21-5p和/或hsa-miR-15b-5p和/或hsa-miR-424-5p表达水平的产品在制备青光眼疾病诊断工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述青光眼疾病的类别为原发性青光眼疾病。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其中包括使用实时荧光定量PCR检测hsa-miR-21-5p和/或hsa-miR-15b-5p和/或hsa-miR-424-5p表达水平的制剂，检测所述hsa-miR-21-5p和/或hsa-miR-15b-5p和/或hsa-miR-424-5p的表达水平。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用实时荧光定量PCR检测hsa-miR-21-5p和/或hsa-miR-15b-5p和/或hsa-miR-424-5p表达水平的制剂包括特异性扩增hsa-miR-21-5p和/或hsa-miR-15b-5p和/或hsa-miR-424-5p的引物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，用实时荧光定量PCR检测hsa-miR-15b-5p表达水平的特异性扩增hsa-miR-15b-5p的引物序列如SEQ ID NO.13-14所示：
F:5'-ACACTCCAGCTGGGTTAGCAGCACATCAT-3’；
R:5’-CACAGCTCGTAGAACAGGAGG-3’。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，用实时荧光定量PCR检测hsa-miR-21-5p表达水平的特异性扩增hsa-miR-21-5p的引物序列如SEQ ID NO.15-16所示：
F:5'-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGAT-3’
R:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCA ACA-3’。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，用实时荧光定量PCR检测hsa-miR-424-5p表达水平的特异性扩增hsa-miR-424-5p的引物序列如SEQ ID NO.17-18所示：
F:5'-GGCAGCAGCAATTCATG-3’
R:5’-CAGTGCGTGTCGTGGAG-3’。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述样品来源于血浆或血清或血浆外泌体或血清外泌体。
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|---|---|---|---|---|
| CN108721315A (zh) * | 2018-05-08 | 2018-11-02 | 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院 | 小分子核酸miR-21在治疗青光眼中的应用 |
-
2019
- 2019-01-31 CN CN201910094763.XA patent/CN109628583B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN108721315A (zh) * | 2018-05-08 | 2018-11-02 | 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院 | 小分子核酸miR-21在治疗青光眼中的应用 |
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| CN117607462B (zh) * | 2024-01-19 | 2024-04-05 | 天津医科大学眼科医院 | 生物标志物在制备诊断后巩膜炎的产品中的应用 |
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