CN109793749A - miR-145-3p在制备细胞凋亡与自噬增强剂中的应用 - Google Patents

miR-145-3p在制备细胞凋亡与自噬增强剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，本发明选择多发性骨髓瘤患者外周血浆中进行microRNAs表达谱的分析，并利用qPCR技术验证，相对于在正常健康人群，在多发性骨髓瘤患者外周血浆中miR‑145‑3p的表达水平显著降低。本发明又通过miR‑145‑3p过表达、miR‑145‑3p沉默，观察细胞凋亡与自噬的水平，结果发现，miR‑145‑3p能够促进细胞凋亡与自噬。本发明为诊断多发性骨髓瘤疾病提供了新的血清学标识物；也为多发性骨髓瘤疾病的防治提供了新的靶点。

Description

miR-145-3p在制备细胞凋亡与自噬增强剂中的应用
本申请是2016年9月23日提交的专利申请号为201610845836.0，发明名称为“miR-145-3p在制备预防或治疗多发性骨髓瘤疾病药物中的应用”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地讲，涉及miR-145-3p及其类似物的临床应用。
背景技术
MicroRNA是近年来在果蝇、线虫、小鼠和人等多种生命体中被发现的一类具有转录后调节活性的小分子RNA。这一内源性的小分子RNA的大量发现得益于两种技术，一种是microRNA cDNA文库的构建和测序技术；另一种是生物素标记的寡核苷酸探针捕获，通过接头引物进行PCR扩增的技术。通过文库的构建和测序，人们掌握了microRNA的大量序列信息，通过对这些序列进行生物信息学比对分析，人们发现大部分microRNA在物种间高度保守，在进化上高度同源。
生物信息学分析发现一个microRNA可能直接调控上百个基因的表达，进而调控了许多重要的细胞途径和生理病理过程。例如:MicroRNAs能够调控细胞的分裂、分化、增殖、凋亡和自噬；胚胎的发育,机体的能量代谢、激素分泌和造血功能等生理过程；肿瘤发生、迁移、侵袭等病理过程。在血液系统中，microRNAs参与了异常外周血及骨髓性疾病的发生过程。MicroRNAs表达的紊乱，参与多种血液系统恶性疾病的发生过程。
MicroRNAs在血液细胞凋亡与自噬中的功能研究有助于我们更好的理解其发病机理，进一步找到血液系统相关(尤其是多发性骨髓瘤,此外还包括淋巴瘤、意义未明的单克隆免疫球蛋白血症等)的药物靶点，从而为这类疾病的预防或治疗提供行之有效的途径。
诱导细胞凋亡是药物发挥重要的作用之一，在线粒体介导的细胞凋亡中，细胞色素c和线粒体蛋白Smac释放出来，还可与调亡蛋白酶活化因子(apoptotic proteaseactivating facter-1,Apaf-1)结合形成多聚复合物，并与Caspase9结合形成凋亡小体，激活Caspase3等级联反应，引起细胞凋亡。除了线粒体介导的凋亡外，还有内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)介导的凋亡，内质网应激活化未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)来调控细胞凋亡，Chop、凋亡信号激酶ASK1/JNK、Bcl-2家族和caspase-12等分子参与其中，内质网应激诱导的凋亡与线粒体诱导的凋亡的作用相互交叉，Chop和活化的JNK可以激活Bax等促凋亡蛋白，使线粒体凋亡途径激活，导致细胞凋亡。
多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是一种恶性血液疾病，其特征是骨髓(bonemarrow,BM)中浆细胞异常克隆增殖，分泌大量的单克隆免疫球蛋白或其片段，导致肾脏、骨骼等组织或器官的损伤。MM发病率约占所有恶性血液病的10％，好发于老年人，随着我国人口老龄化的进展，MM发病人数有增加的趋势。常见临床表现为骨痛、贫血、肾功能不全或免疫力低下等。目前治疗MM的主要手段有激素、免疫调节剂、烷基类药物、蛋白酶抑制剂等。
在多发性骨髓瘤中，浆细胞恶性增殖产生大量的免疫球蛋白，引起内质网应激，错误折叠蛋白增多，细胞需要自噬来清除这些蛋白质以维持生存，此外骨髓瘤细胞的快速增殖以及免疫球蛋白大量合成，机体能量需求增多，也使得自噬增加，这时自噬可起到保护细胞的作用，但是当外界刺激作用过强时，过度自噬可能会导致细胞凋亡，当错误折叠蛋白超过蛋白酶体和自噬的处理能力时，则造成错误折叠蛋白堆积，出现过度自噬，使得自噬由抑制凋亡向诱导死亡转换(Grandér D,Kharaziha P,Laane E,et al.Autophagy as themain means of cytotoxicity by glucocorticoids in hematologicalmalignancies.Autophagy.2009Nov；5(8):1198-200.)。因此，促进过度自噬可以导致细胞死亡增多，增强临床治疗效果，这提示我们调控细胞自噬(autophagy)及其所诱导的细胞死亡也是MM临床治疗的方向之一。
microRNA-145-3p(miR-145-3p)为一种本领域已知的microRNA(miRNA)小分子，miRBase编号：MIMAT0004601，其对于调控RNA是有用的。然而，现有技术中对于miR-145-3p生物学功能目前并不清楚。
与miR-145-3p相关的miR-145、miR-145-5p生物学功能的报导有：
中国专利文献CN103966328A公开了一种与结直肠炎恶性转变相关的miRNA标志物，该标志物为miR-138-5p、miR-145-5p、miR-146a-5p和miR-150-5p的组合。
中国专利文献CN105177173A公开了一种用于卵巢癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒，所述microRNA生物标志物由has-miR-193b-3p、has-miR-155-5p、has-miR-145-5p、has-miR-132-3p和has-miR-143-3p组成。
中国专利文献CN103667441A公开一种Hsa-miR-145-5p试剂盒及其成熟体模拟物的应用。Hsa-miR-145-5p可用于诊断或治疗喉鳞癌。
中国专利文献CN104470543A公开了一种治疗心肌梗塞、脑梗塞等梗塞的医药组合物，具体是将hsa-miR-145等自噬增强剂用作为梗塞治疗用医药组合物的有效成分。
中国专利文献CN103814131A公开了一种治疗或预防肺动脉高血压的方法，即对该受试者施用miR-145表达或活性的抑制剂。
中国专利文献CN105671179A公开了一组由血清microRNAs组成的肝细胞肝癌诊断标志物组合，所述肝癌诊断标志物组合包括：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-145、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-miR-505、hsa-miR-29c以及hsa-miR-192。可用于肝癌诊断。
中国专利文献CN101843632A公开了在高糖、高脂情况下，miR-145参与了糖尿病血管病变等代谢疾病的炎症病变发生发展，可用于制备治疗炎症药物，尤其是制备治疗糖尿病等炎症代谢性疾病药物及制备检测糖尿病制剂。miR-145可成为糖尿病病人检测指标之一，并作为糖尿病大血管病变等炎症性疾病的治疗靶点。
另外，与多发性骨髓瘤相关的microRNA报导较少，具体如下：
中国专利文献CN102149401A公开了一组可用于诊断多发性骨髓瘤的microRNAs，包括miR-21、miR-25、miR-106b～25簇、miR-181a、miR-181b、miR-106a、miR-17～92簇、miR-19a、miR-19b和miR-32。中国专利文献CN104531706A、CN103320444A、CN103882020A分别公开了针对miR-92a、miR-21、miR-155设计的微小反义寡聚核苷酸，可作用于多发性骨髓瘤RPMI-8266细胞株，使其细胞生长显著受到抑制，细胞凋亡明显增加；可用于制备抗多发性骨髓瘤的药物。
目前国内外尚无有关miR-145-3p与细胞凋亡与自噬相关的文献报道。也无miR-145-3p与多发性骨髓瘤相关的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供miR-145-3p的新的医药用途。
本发明的主要技术方案如下：
本发明选择多发性骨髓瘤患者外周血浆中进行microRNAs表达谱的分析，其中miR-145-3p、miR-29等表达显著降低，而miR-21、miR-517、miR-15a、miR-99b等表达显著升高，进一步地，我们利用qPCR技术验证了，相对于在正常健康人群，在多发性骨髓瘤患者外周血浆中miR-145-3p的表达水平显著降低。此后，在多种人多发性骨髓瘤细胞株(LP-1、H929、U266、RPMI-8266等)中进一步验证上述表达差异较明显的miRNA，发现miR-145-3p的表达水平显著减少，这些结果提示在多发性骨髓瘤中miR-145-3p并不存在细胞特异性。
多发性骨髓瘤细胞LP-1经miR-145-3p类似物(mimic)转染后，流式细胞术技术结果提示细胞凋亡增加，蛋白印迹结果提示自噬增加，进一步检测细胞增殖，发现细胞增殖降低，在多发性骨髓瘤细胞H929中的结果同样验证了这一点。
本发明进一步探讨miR-145-3p在不同MM患者疾病进展中的表达情况，探索其可能的病理意义及预后价值，发现miR-145-3p可能在多发性骨髓瘤的发生和发展过程中起重要功能。
本发明又通过miR-145-3p过表达、miR-145-3p沉默，观察细胞凋亡与自噬的水平。结果发现，在MM细胞中过表达miR-145-3p水平：经miR-145-3pmimic转染后，提示MM细胞凋亡水平增加，自噬水平增加。而转染miR-145-3p的反义RNA72h后，结果表明：与对照组相比，MM细胞的凋亡水平受到明显抑制，自噬水平降低，并且发现，当与地塞米松联合应用时，miR-145-3p能够增强地塞米松诱导细胞凋亡作用。
本发明的第一方面，提供了miR-145-3p及其类似物在制备预防或治疗多发性骨髓瘤疾病药物中的应用。
所述的miR-145-3p的具体序列如下：
5’-GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU-3’(SEQ ID NO:1)。
本发明所述的miR-145-3p，可以来自被分离细胞，或者可通过人工合成的方式获得。
所述的miR-145-3p类似物，指能够生成类似于miR-145-3p序列的重组质粒、病毒载体，或者是化学合成的类似miR-145-3p的序列。
进一步地，所述的miR-145-3p在制备预防或治疗多发性骨髓瘤疾病的药物中的应用，所述的多发性骨髓瘤细胞疾病主要是针对调控细胞凋亡与自噬等方面。
本发明的第二方面，提供了miR-145-3p及其类似物在制备调控细胞凋亡与自噬药物(细胞凋亡与自噬增强剂)中的应用。
本发明还提供了一种细胞凋亡与自噬增强剂，包括但不限于：
1)miR-145-3p；
2)含有miR-145-3p编码基因的重组载体；
3)含有miR-145-3p编码基因的重组病毒；
4)含有miR-145-3p编码基因的重组病毒载体；
5)化学合成的类似miR-145-3p的序列；
6)活性等同于miR-145-3p的其他化学物质。
miR-145-3p及其类似物作为细胞凋亡与自噬药物(包括地塞米松)增强剂与其联合应用。
进一步地，本发明还提供了miR-145-3p和地塞米松联合应用，在制备调控细胞凋亡与自噬药物(细胞凋亡与自噬增强剂)中的应用，miR-145-3p与地塞米松联合应用增强细胞的凋亡与自噬。
本发明的第三方面，还提供了miR-145-3p在制备诊断多发性骨髓瘤疾病试剂或试剂盒中的应用。
所述的试剂，为检测miR-145-3p表达量或有效量的试剂。
所述的试剂盒，包含检测miR-145-3p表达量或有效量的试剂。
所述的试剂盒，其包含：(i)检测miR-145-3p有效量的一种或多种试剂；(ii)选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂，例如用于混悬或固定细胞的溶液，可检测的标签或标记，使核酸易于杂交的溶液，用于裂解细胞的溶液，或用于核酸纯化的溶液。
在本发明的优选例中，所述的药物为药物组合物，所述的药物组合物含有有效量的所述的miR-145-3p及其类似物，以及药学上可接受的载体。
所述“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。
所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s PharmaceuticalSciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
本发明的miR-145-3p及其类似物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：miR-145-3p及其类似物的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的miR-145-3p及其类似物每天以约0.001-100mg/kg(优选的为0.01-20mg/kg)动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以2-4次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为0.005-100mg，较佳地约为0.008-50mg。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
任何适用的给药途径都是可以的，包括但不限于：口服、静脉内注射、皮下注射、肌肉给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。
本发明的第四方面，提供一种筛选预防或治疗多发性骨髓瘤的潜在物质的方法，所述方法包括：
(1)用候选物质处理表达miR-145-3p的体系；
(2)检测所述体系中miR-145-3p的表达或活性；
其中，若所述候选物质可增强miR-145-3p的表达或活性，则表明该候选物质是预防或治疗多发性骨髓瘤疾病的潜在物质。
在一个优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到增强miR-145-3p的体系中；和/或
步骤(2)包括：检测测试组的体系中miR-145-3p的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的增强miR-145-3p的体系；
如果测试组中miR-145-3p的表达或活性在统计学上高于(优选显著低高于，如高20％以上，较佳的高50％以上；更佳的高80％以上)对照组，就表明该候选物是预防或治疗多发性骨髓瘤疾病的潜在物质。
所述的体系包括但不限于：溶液体系、亚细胞体系、细胞体系、组织体系、器官体系、或动物体系。
在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于预防或治疗多发性骨髓瘤疾病有用的物质。
另一方面，本发明采用所述筛选方法获得的可用于预防或治疗多发性骨髓瘤疾病的潜在物质，这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出真正有用的物质。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
有益效果：
本发明通过在MM细胞中过表达miR-145-3p表明，miR-145-3p可促进细胞凋亡与自噬。此外，在MM患者中，血浆miR-145-3p与其无进展生存期密切相关，提示血浆miR-145-3p水平可能作为MM患者临床预后的重要标记物。为治疗MM及临床预后提供了诊断依据和作用靶点。
本发明首次揭示了miR-145-3p的表达与多发性骨髓瘤疾病密切相关，其高表达促进细胞凋亡与自噬，抑制细胞增殖，并且可以增强地塞米松诱导细胞凋亡作用。
本发明为诊断多发性骨髓瘤疾病提供了新的血清学标识物；也为多发性骨髓瘤疾病的防治提供了新的靶点。
附图说明
图1：在MM中表达有差异的循环miRNA分子及临床验证。通过芯片筛选MM患者与正常对照人群血浆中miRNA分子，结果发现，在两组比较中共有25个miRNA分子表达水平异常，相对于正常对照组，在MM患者组有23个表达水平异常升高，有2个异常降低(fold change>2，p<0.05)，这两个异常降低的包括miR-29b和miR-145-3p，具体结果见图1A，进一步采用qPCR方法在30例MM患者和30例正常健康人(healthy control，HC)的外周血浆中检测miR-145-3p的相对含量，结果提示，在MM患者中，miR-145-3p相对含量较低，与芯片结果相一致，具体结果见图1B，我们在多种人多发性骨髓瘤细胞株(LP-1、H929、U266、RPMI-8266、KM3等)进一步检测miR-145-3p的表达水平，结果发现，相对于正常人群的浆细胞，miR-145-3p在多种细胞株(LP-1、H929、U266、RPMI-8266)中显著低表达(p<0.01)，提示在MM中不具备细胞特异性，具体结果见图1C。这些提示miR-145-3p在多发性骨髓瘤中显著低表达。
图2：miR-145-3p在临床参数及预后中的价值。其中A为miR-145-3p与临床MM重要指标间的相关性分析，B为miR-145-3p在MM患者无进展生产期中的应用价值，提示miR-145-3p具有一定的诊断和预后价值。
图3：miR-145-3p过表达诱导细胞发生凋亡增加，并且能增强地塞米松诱导细胞凋亡作用，而低表达时则能缓解细胞凋亡。A为流式检测miR-145-3p过表达或低表达时细胞凋亡情况。B为Western Blot检测相关凋亡蛋白的表达水平。
图4：miR-145-3p过表达抑制细胞增殖、诱导细胞发生自噬。过表达miR-145-3p抑制细胞增殖，并且呈现时间依赖性，见图4A，当过表达miR-145-3p时，可以促进MM细胞发生自噬，见图4B。
图5：自噬抑制剂降低miR-145-3p诱导细胞凋亡作用。A为自噬抑制剂羟基氯喹(HCQ)降低miR-145-3p诱导细胞自噬作用，B为自噬抑制剂羟基氯喹(HCQ)降低miR-145-3p诱导细胞凋亡作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、MM患者中microRNAs表达分析及验证
MM患者外周血浆中存在多种microRNAs。本实验采用经典的芯片筛选方法筛选了在MM患者及正常对照人群中差异表达的microRNAs。
我们选择的患者标准如下：所有30名多发性骨髓瘤患者来自上海长征医院住院患者(男为21例、女为9例，年龄为40-74岁，中位数为60岁、ISS分期为2期和3期患者)，住院时间为2013年2月-2014年7月，这些患者均符合NCCN2013年推荐的多发性骨髓瘤诊断标准：(1)组织活检或骨髓涂片检查：浆细胞>30％，常伴有形态改变；(2)单克隆免疫球蛋白(M蛋白)：IgG>35g/L，IgA>20g/L，IgM>15g/L，IgD>2g/L，IgE>2g/L，尿中单克隆K或λ轻链>1g/24小时，并排除淀粉样变；(3)骨髓检查发现浆细胞在10％～30％之间；(4)单克隆免疫球蛋白或其片段的存在，但低于上述标准；(5)X线检查有溶骨性损害和(或)广泛骨质疏松；(6)正常免疫球蛋白量降低：IgM<0.5g/L,IgA<1.0g/L,IgG<6.0g/L。此为MM患者组。
正常对照组为30名健康体检者，年龄与疾病组相匹配。
每个血液样本置血常规EDTA-K2抗凝管，采用QIAGEN试剂盒抽提miRNA分子，于-80℃标记贮存备用。
采用Exiqon miRNA芯片技术进行表达谱分析，并利用定量PCR对结果进一步验证。
实时荧光定量PCR：常规方法抽提RNA，通过颈环结构的特异性引物反转录相应的microRNA，然后进行实时荧光定量PCR检测，以双标准曲线方法定量，分析各样本的microRNA浓度，并通过溶解曲线和琼脂糖凝胶电泳确定基因扩增的特异性。
结果发现，相对于正常对照组，在MM患者组有23个表达水平异常升高，有2个异常降低，即为miR-29b和miR-145-3p(图1A)。进一步我们收集正常人群和MM患者(各30例)的血浆进行qPCR检测，qPCR结果验证了芯片的筛选结果，发现miR-145-3p在MM中显著低表达(图1B)。在多种人多发性骨髓瘤细胞株(LP-1、H929、U266、RPMI-8266等)中，提取RNA后，qPCR方法进一步验证上述表达差异较明显的miR-145-3p，发现miR-145-3p的表达水平显著减少，这些结果提示在多发性骨髓瘤中miR-145-3p并不存在细胞特异性(图1C)。
我们进一步选择miR-45-3p纳入后续的实施例。
实施例2、miR-145-3p在临床参数及预后中的价值
患者血清收集与临床参数检测：无抗凝剂采样管采集MM患者血清后，放置一段时间，3500rpm，10min离心，收集上清备用。对于各种临床指标的检测，白蛋白采用BCG比色法方法检测，β2-MG采用免疫透射比浊法方法检测，肌酐采用比色法检测，Ca2+采用可视吸光光度法方法检测。
患者临床预后信息收集：通过随访等方法获得患者的生存信息。
统计方法：我们采用相关分析和Kaplan-Meier生存分析miR-145-3p的临床应用价值。
结果如图2所示，MM患者循环miR-145-3p表达水平与各种临床指标间的相关性分析结果显示，MM患者血清循环miR-145-3p水平与β2-MG呈显著负相关(r＝-0.429,p＝0.02)，与血清白蛋白呈正相关(r＝0.419,p＝0.021)，与血清肌酐呈负相关(r＝-0.370,p＝0.044)，与血清Ca2+呈负相关(r＝-0.644,p<0.01)，具体见图2A。接下来，采用Kaplan-Meier分析评估循环miR-145-3p的表达水平和疾病进展情况(无进展生存期)之间的关系，取30例患者的miRNA表达水平的ΔCt值的中位数1.53作为判断表达高或低值的折点，随访时间为5-31个月，中位数为13个月，p<0.05被认为是有统计学差异的。结果发现，在miR-145-3p较高的患者人群中(16/30)，无进展生存期较长(p＝0.003)，具体见图2B。这些提示miR-145-3p具有一定的诊断和预后价值。
实施例3、miR-145-3p过表达诱导细胞发生凋亡增加
MM细胞培养：人骨髓瘤细胞株LP-1(购自中科院细胞所)在常规条件培养，即37℃、5％二氧化碳培养箱中，培养基为含10％胎牛血清(FBS)及1％双抗(青霉素100U/ml和链霉素0.1mg/ml)的1640。
miR-145-3p类似物及其抑制剂，委托广州锐博生物技术公司设计合成，然后进行转染：
miR-145-3p mimic，序列如SEQ ID NO:1所示；
miR-145-3p inhibitor，序列为5’-AGAACAGUAUUUCCAGGAAUCC-3’(SEQ ID NO:2)；
调整LP-1细胞为最佳状态，计数后调整浓度，细胞密度为1x105/ml；吸取2.5μlmiR-145-3p mimic/inhibitors加入到100ul Opti-MEM中，轻轻混匀。同时设立转染对照，以保证转染效率；取1μl RNAimax试剂(用之前混匀)加入上Opti-MEM混合液，轻柔混匀，将稀释好的试剂于室温静置15-20分钟；在24孔细胞平板中加入500μl细胞悬液，轻轻前后移动平板混匀，miR-145-3pmimic终浓度为150nM(miR-145-3p inhibitor为250nM)；然后加入药物DEX，终浓度为50μM，CO2培养箱中培养72h，收集细胞待检测。
细胞凋亡测定：细胞凋亡率采用Annexin-V染色，流式细胞仪进行凋亡检测；对于凋亡相关蛋白的测定，收集蛋白后，采用Western Blot方法进行表达相对量的测定。
结果表明：相对于对照组，miR-145-3p mimic组可以诱导细胞凋亡，miR-145-3pinhibitor组能减少细胞凋亡，并且mimic还能增强DEX诱导的凋亡作用，具体结果见图3A，凋亡相关蛋白检测结果显示，相对于对照组，miR-145-3p mimic组可以显著诱导凋亡蛋白caspase-3和Apaf-1的表达水平升高，Bcl-2的表达水平降低。
实施例4、miR-145-3p过表达抑制细胞增殖、诱导细胞发生自噬。
细胞增殖测定：将培养的MM细胞分别给予miR-145-3p mimic刺激后，CCK-8试剂作用2小时，按试剂盒说明利用多功能酶标仪在560nm处检测细胞增殖情况。
细胞自噬测定：MM细胞经miR-145-3p mimic转染后，收集蛋白后，采用WesternBlot方法进行自噬相关蛋白表达相对量的测定。
结果发现相对于对照组，miR-145-3p mimic在第二天时就可以抑制细胞增殖，并且随着时间的延长，两组间的差异更加显著，当到第5天时，OD值仅为0.62，而对照组可以达到0.89(p<0.05)，结果见图4A。过表达miR-145-3p后，WB结果显示LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例增加，同时P62减少，beclin-1增加，结果见图4B，p均小于0.05，这些结果提示miR-145-3p可以抑制细胞增殖、诱导细胞自噬发生。
实施例5、自噬抑制剂降低miR-145-3p诱导细胞凋亡作用
前一部分实验结果表明，miR-145-3p过表达能够显著诱导细胞凋亡。为更好的探讨miR-145-3p对细胞凋亡与自噬的调控功能，我们通过加入自噬抑制剂羟氯喹观察miR-145-3p对细胞凋亡与自噬的影响。
实验方法：LP-1细胞在转染miR-145-3p mimic及相应的对照，作用72小时后，直接加入终浓度为50mmol/L的羟氯喹(hydroxychloroquine，HCQ)处理细胞4小时，然后收集细胞，自噬检测和凋亡检测同上述实施例3和4。
通过检测自噬与凋亡相关蛋白和现象外，结果发现自噬抑制剂羟氯喹HCQ能够显著抑制miR-145-3p诱导细胞自噬作用，结果见图5A，进一步我们发现，自噬抑制剂羟氯喹HCQ还可以降低miR-145-3p诱导细胞凋亡作用，结果见图5B。
这些结果提示自噬抑制剂能够降低miR-145-3p诱导细胞凋亡作用。
实施例6：miR-145-3p能够显著增强地塞米松诱导细胞凋亡作用。
调整LP-1细胞为最佳状态，计数后调整浓度，细胞密度为1x105/ml，分别设立对照组、mimic组、inhibitor组、地塞米松DEX(50uM)组、mimic+DEX组、inhibitor+DEX组，其中对于mimic组，inhibitor及其对照的转染，采用RNAimax转染miR-145-3p mimic(150nM)和miR-145-3p inhibitor(250nM)后，同时转染negative control，具体实施例见实施例3。对于地塞米松DEX的加入，将DEX粉剂加入1mL超纯水后调成浓度为1mM的液体，计算后直接加入终浓度为50uM的DEX，作用72小时后，收集细胞，进行Annexin-V染色，采用流式细胞仪进行凋亡检测，结果显示相对于对照组，miR-145-3pmimic组可以诱导细胞凋亡，miR-145-3pinhibitor组能减少细胞凋亡，并且mimic还能增强DEX诱导的凋亡作用，具体结果见图3A。
该结果提示，miR-145-3p过表达能够显著增强地塞米松诱导细胞凋亡作用，而沉默miR-145-3p能显著降低地塞米松诱导细胞凋亡作用。
本发明主要利用芯片技术在MM患者中筛选表达差异明显的miRNA，并经定量PCR进行验证，发现miR-145-3p在MM中显著低表达，通过进一步的临床应用价值分析，发现miR-145-3p与MM临床重要参数存在显著的相关性，并且具有一定的预后价值。这些提示miR-145-3p可能在MM病理过程或者临床应用中发挥着一定作用。
本发明通过miR-145-3p过表达、miR-145-3p沉默，观察细胞凋亡与自噬的水平。结果发现，在MM细胞中过表达miR-145-3p水平：经miR-145-3p mimic转染后，提示MM细胞凋亡水平增加，自噬水平增加。而转染miR-145-3p的反义RNA72h后，结果表明：与对照组相比，MM细胞的凋亡水平受到明显抑制，自噬水平降低。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 中国人民解放军第二军医大学第二附属医院
<120> miR-145-3p在制备细胞凋亡与自噬增强剂中的应用
<130> 说明书，权利要求书
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 1
ggauuccugg aaauacuguu cu 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 2
agaacaguau uuccaggaau cc 22

Claims (2)

1.miR-145-3p及其类似物在制备细胞凋亡与自噬增强剂中的应用，其特征在于，该应用是指miR-145-3p及其类似物作为增强剂与细胞凋亡与自噬药物联合应用，所述的细胞凋亡与自噬药物为地塞米松。
2.根据权利要求1所述的miR-145-3p及其类似物在制备细胞凋亡与自噬增强剂中的应用，其特征在于，所述的miR-145-3p及其类似物，选自以下任一：
1)miR-145-3p；
2)含有miR-145-3p编码基因的重组载体；
3)含有miR-145-3p编码基因的重组病毒；
4)含有miR-145-3p编码基因的重组病毒载体；
5)化学合成的类似miR-145-3p的序列；
6)活性等同于miR-145-3p的其他化学物质。
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