CN103255137A

CN103255137A - 一种检测SKA1基因表达的方法及其siRNA的用途

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Publication number: CN103255137A
Application number: CN2012101774621A
Authority: CN
Inventors: 姚阳; 沈赞; 劳昕元; 余文熙
Original assignee: SHANGHAI HUANGLI BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Shanghai Eureka Mdt InfoTech Ltd
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2032-05-31
Also published as: CN103255137B

Abstract

本发明公开了一种抑制SKA1基因表达的siRNA，所述的siRNA的长度为15～27bp。本发明还公开了含有该siRNA的重组载体，该重组载体转染真核细胞，即得到SKA1基因沉默的细胞。本发明的siRNA序列能够有效降解SKA1基因的mRNA，从而特异性抑制SKA1基因的表达。本发明所述siRNA可用于制备与SKA1基因相关疾病包括肿瘤的治疗药物；同时对于研究SKA1基因在肿瘤耐药性中的作用，对肿瘤特别是骨肉瘤、结直肠恶性肿瘤的临床非手术治疗具有重要的意义。本项发明还公开了可以从组织或者细胞中有效检测SKA1的逆转录PCR引物，以及该引物在肿瘤诊断中的应用。

Description

一种检测SKA1基因表达的方法及其siRNA的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种抑制SKA1基因表达的siRNA，该siRNA的核苷酸序列以及含有该siRNA编码DNA的重组载体，以及它们的用途。本发明还涉及了可以从组织或者细胞中有效检测SKA1基因表达的逆转录引物，以及该引物在肿瘤诊断中的应用。

背景技术

RNA干扰是指由双链RNA诱发的基因沉默现象，主要通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。研究表明，长度为21～23nt的小干扰RNA分子（small interfering RNA，siRNA）是引起RNA干扰的直接原因（TuschlT,Zamore PD,Sharp PA,Bartel DP.RNAi:double-stranded RNA directs theATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals.Cell 2000,101:25-33.）。RNA干扰在抑制基因表达方面具有高效性、简单性和特异性，目前在基因功能研究和疾病治疗中发挥了重要作用。近几年来，RNA干扰已经在肿瘤治疗方面也取得了一些成果（Uprichard,Susan L.The therapeuticpotential of RNA interference.FEBS Letters 2005,579:5996-6007）。

SKA1（The spindle and kinetochore associated complex subunit 1）基因定位于染色体18q21.1，编码含有255个氨基酸、分子量约为30kDa的蛋白。目前对SKA1蛋白结构的研究还不深入，只明确了其在N端具有卷曲螺旋结构域（Rual JF,Venkatesan K,Hao T,et al.Towards a proteome-scale map of thehuman protein-protein interaction network.Nature 2005;437:1173-1178.Sauer G，Korner R,Hanisch A,et al.Proteome analysis of the human mitotic spindle.MolCell Proteomics 2005;4:35-43.）。最初质谱分析结果表明，SKA1蛋白被确定为纺锤体的组成部分（Cheeseman IM,Brew C,Wolyniak M,et al.Implicationof a novel multiprotein Dam1p complex in outer kinetochore function.J Cell Biol.2001;155:1137-1145.）。后来通过酵母双杂试验，发现了纺锤体着丝点复合物（The spindle and kinetochore associated complex，SKA）的另一个亚基SKA2，体外和体内研究结果均表明，SKA1和SKA2相互作用形成稳定的复合体，对于SKA2的稳定以及SKA蛋白在着丝点和微管中的定位是必须的（Hanisch A.,Sillje HHW，Nigg EA.Timely anaphase onset requires a novelspindle and kinetochore complex comprising Ska1 and Ska2.EMBO J.2006;25:5504-5515.）。SKA复合体对于有丝分裂至关重要，可以使所有染色体的着丝点都排列在赤道板平面上，这对于确保染色体均等分配和维持基因组稳定性十分必要。有丝分裂后期，染色体在纺锤体着丝点微管的作用下移向两极，并导致纺锤体检查点沉默，在这个过程中SKA1复合体也是必须的蛋白。然而在当时的研究中，SKA1在染色体分离中的作用并没有阐述清楚。2009年在Dev Cell和EMBO J杂志上的报道阐述了SKA1复合体在着丝点和微管界面上发挥功能，并与微管直接作用，在微管上形成低聚装配体，沿着微管以一种解聚-偶联的方式运动，参与有丝分裂期间染色体的运动（Welburn JPI,Grishchuk EL,Backer CB,et al.The human kinetochore Ska1 complexfacilitates microtubule depolymerization-coupled motility.Dev Cell 2009;16:374-385.）。

基因组研究表明，SKA1基因所处的18q21.1与慢性淋巴细胞白血病的发生有关（Crowther-Swanepoel D,Broderick P，Di Bernardo MC,et al.Common variants at 2q37.3,8q24.21,15q21.3 and 16q24.1 influence chroniclymphocytic leukemia risk.Nature genetics 2010;42:132-136.）。这意味着SKA1可能通过调节有丝分裂过程、细胞周期进展的方式参与肿瘤细胞的恶性增殖。另外，在最初解析SKA1功能的研究中，以微管解聚药物噻氨酯哒唑（nocodazole）和秋水仙碱（colchicine）处理细胞，发现SKA1在着丝点中的积聚水平降低；对阻滞于有丝分裂期间的细胞，加nocodazole处理，可导致SKA1和微管先后从着丝点上脱离；相反地，当细胞免除了nocodazole的处理时，SKA1蛋白在着丝点上的定位得以恢复，相应的，纺锤体重新形成。而微管稳定剂紫杉醇（taxol），并没有影响SKA1在着丝点上的定位（SauerG，Korner R,Hanisch A,et al.Proteome analysis of the human mitotic spindle.Mol Cell Proteomics 2005;4:35-43.）。这些研究都提示了SKA1可能影响某些抗肿瘤药物敏感性。但是目前并没有关于SKA1与化疗耐药的报道，了解SKA1蛋白在骨肉瘤中的功能以及对原发耐药的影响，具有很强的临床实用价值。

逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的一种广泛应用方式。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。该技术在疾病诊断领域具有广阔的应用前景。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对目前在肿瘤原发耐药临床诊断和治疗中缺乏有效的预测肿瘤原发耐药的分子诊断标记物和治疗肿瘤原发耐药的分子靶点，提供一种有效的解决方法，即一组能够有效抑制SKA1基因表达的siRNA，所述siRNA作用的标靶序列以及能够从组织及细胞中检测SKA1基因表达的逆转录PCR引物和它们在制备或筛选抗肿瘤药物中的应用。

本发明解决上述技术问题采取的技术方案之一是：一种分离的SKA1基因小分子干扰核糖核酸（siRNA）标靶DNA，其中所述标靶DNA是：

（1）SKA1编码基因上的连续15～27个核苷酸组成的DNA；

（2）SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4中任意一条DNA；或

（3）与（1）或（2）所述的DNA在严紧杂交条件下杂交的多核苷酸组成的DNA，或者与其互补的DNA。

本发明所述分离的SKA1基因小分子干扰核糖核酸（siRNA）标靶DNA分子，较佳地由SKA1编码区基因上的连续10～30个核苷酸构成，更佳地为15～27个核苷酸组成的DNA；最佳地，本发明所述SKA1小分子干扰核糖核酸的标靶基因是SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4中任意一条DNA分子。

其中所述杂交条件根据测量杂交时所用条件的严紧性程度来分类。严紧性程度可以核酸结合复合物或探针的解链温度Tm为依据，或者以杂交液的盐或离子强度条件为依据。所述杂交较佳地在标准条件下进行，可根据“分子克隆”中描述的方式进行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology)。更佳地，多聚核苷酸杂交可以按照如下步骤进行，将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交。杂交缓冲液的组成为0.1wt%SDS、5 wt%硫酸右旋糖苷、加入1/20的稀释抑制剂以及2~8×SSC。20×SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液。杂交温度为50~70℃。在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜。清洗温度较佳地为室温，优选为杂交温度。清洗缓冲液的组成较佳地为6×SSC+0.1%SDS（wt）溶液，优选为5×SSC+0.1%SDS（wt）。当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。

本发明解决上述技术问题采取的技术方案之二是：本发明所述标靶DNA在筛选抗肿瘤药物中的应用。

本发明所述标靶DNA在筛选抗肿瘤药物中的应用较佳地为作为药物靶点。所述药物靶点是指药物在体内的作用结合位点，选择确定新颖的有效药物点靶是新药开发的首要任务。合理化药物设计（rational drugdesign）可以依据生命科学研究中所揭示的包括酶、受体、离子通道、核酸等潜在的药物作用靶位，或其内源性配体以及天然底物的化学结构特征来设计药物分子，以发现选择性作用于靶点的新药。通过药物靶点的选择和利用，可以大大提高筛选抗肿瘤药物的效率，缩短抗肿瘤药物研究的周期。

本发明解决上述技术问题采取的技术方案之三是：一种重组载体，其中所述重组载体包含本发明所述的标靶DNA或包含SEQ ID NO：5～SEQ IDNO：8中任意一条序列。

其中所述的标靶DNA包括人工合成的DNA分子或通过PCR等技术从基因组中扩增分离到的DNA分子。本发明所述的重组载体优选地包含SEQID NO：5～SEQ ID NO：8中任意一条序列。

其中所述的重组载体选自本领域常规的由逆转录病毒衍生的载体。所述的病毒衍生的载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关载体、疱疹病毒载体或痘苗病毒载体等，本发明优选慢病毒载体。慢病毒载体的优点是它们能使编码siRNA的DNA整合到宿主细胞的基因组中，得以产生特定基因被特异性阻抑的细胞系，某些病毒载体可用于体内转化细胞，从而可直接操纵体内和整个生物的基因表达。

慢病毒载体主要是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础，通过去除env、vif、vpr、vpu等毒性基因改造而来，用水泡口炎病毒G糖蛋白来代替HIV-1的包膜进行包装，宿主范围广，能增加病毒的滴度。慢病毒载体的毒性基因已被删除并被外源基因取代，属于假型病毒，并且该病毒感染细胞后不能再感染其它细胞，生物安全性高。慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期稳定的表达。本发明所用的慢病毒载体选自本领域常规的慢病毒载体，优选为pFH1UGW载体。

本发明解决上述技术问题采取的技术方案之四是：一种抑制SKA1基因表达的小分子干扰核糖核酸（siRNA），其中所述的siRNA包括正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段包含如上所述标靶DNA编码的RNA分子，所述正义RNA片段和反义RNA片段能够互补形成双链RNA分子。

本发明所述siRNA是一种寡聚RNA分子（长度一般在21~25核苷酸）。siRNA的主要功能是激发与之互补的目标mRNA的沉默。

本发明所述siRNA包括正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段和反义RNA片段通过彼此间互补碱基的互补配对作用形成双链RNA区域。当正义RNA片段和反义RNA片段位于不同的RNA链时，形成双链RNA分子；当正义RNA片段和反义RNA片段位于同一条RNA链时，则形成具有颈环结构的单链RNA分子。本发明所述的小分子干扰核糖核酸（siRNA）长度为较佳地为8～50个核苷酸，其正义片段和反义片段之间互补区域的碱基对较佳地为15～18个碱基对。

本发明所述siRNA优选地为：SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：8任意一条序列及其互补序列所编码的RNA，所述的siRNA包括形成双链的RNA分子或单链的RNA分子。

本发明中所述的核糖核酸分子（DNA）或者脱氧核糖核酸分子（RNA）通过人工合成的方式或者通过从基因组扩增的方式获得，其方法均为本领域常规使用的方法。

本发明所述siRNA包括人工合成的双链干扰RNA（dsRNA），转染细胞后在细胞内通过Dicer酶系统加工获得的siRNA；通过人工合成直接获得的siRNA；或者通过构建相应的慢病毒载体，在标靶细胞内持续表达获得的siRNA。

本发明解决上述技术问题采取的技术方案之五是：一种慢病毒颗粒，其中所述慢病毒颗粒包含本发明所述的重组载体。

所述慢病毒颗粒（Lentivirus）是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

慢病毒颗粒制备方法较佳地包括以下步骤：将siRNA干扰的目的片段构建到慢病毒载体中，然后与包装载体共转染到真核细胞中，所述真核细胞优选地为293T细胞，经过培养后进行慢病毒的回收纯化，即得包装好的慢病毒颗粒。

本发明通过siRNA技术沉默SKA1基因，一较佳的实例包括如下步骤：首先根据SKA1基因的mRNA设计RNA干扰的序列，然后化学全合成编码该RNA分子的DNA分子，将该DNA插入质粒中，获得的重组质粒转染293T细胞，包装成重组慢病毒。该重组慢病毒的shRNA（short hairpinRNA,shRNA）表达框中含有本发明所述siRNA编码序列。然后用于转染肿瘤细胞。重组慢病毒进入细胞后，可能经过了如下步骤：利用逆转录酶转录出cDNA，然后将含有本发明的cDNA重组到细胞基因组中，利用宿主细胞的酶系统，转录出本发明所述针对SKA1基因的shRNA，本发明的SKA1shRNA与RNaseIII核酶家族的Dicer结合，并将其剪切成本发明的siRNA。随后siRNA与若干个蛋白组成的RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，解旋成单链，并由该复合体主导RNAi效应。RISC被活化后，活化型RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在SKA1基因mRNA上并切断SKA1基因mRNA，引发SKA1基因mRNA的特异性分解。

本发明解决上述技术问题采取的技术方案之六是：一种SKA1基因沉默的细胞模型，所述细胞模型包含本发明所述的慢病毒颗粒。

本发明所述细胞模型较佳地为真核细胞，更佳地为肿瘤细胞，优选的为人骨肉瘤细胞或结直肠癌肿瘤细胞。本发明所述的SKA1基因沉默的细胞模型的制备方法较佳地包括将本发明所述的慢病毒颗粒转染真核细胞。

其中所述的转染方法为本领域常规方法，如DEAE-葡聚糖法，磷酸钙法，阳离子脂质体法，阳离子聚合物法，病毒介导法，生物颗粒传法（基因枪粒子轰击法），显微注射法，电穿孔法等，本发明优选磷酸钙法。将包装好的慢病毒颗粒转染到细胞系中，进行筛选，得到稳定遗传的基因沉默细胞模型。其中所述细胞系较佳地为真核细胞系，本发明优选人骨肉瘤细胞，直结肠肿瘤细胞。

本发明所述的SKA1基因沉默的细胞模型的制备方法的一较佳实例包括：将包装成功的重组慢病毒感染人肿瘤细胞，然后用嘌呤霉素进行筛选，挑取筛选的肿瘤细胞克隆，用western-blot方法检测不同的肿瘤细胞克隆的SKA1蛋白量的情况。结果表明编码本发明siRNA的DNA序列成功重组到肿瘤细胞基因组中，而且初步证实本发明的siRNA序列能够抑制SKA1基因的表达。然后挑取SKA1蛋白量较低的肿瘤细胞克隆，连续传代2代、4代、6代、8代后，用Trizol提取肿瘤细胞mRNA，半定量RT-PCR方法分析肿瘤细胞中SKA1mRNA的降解情况。表明本发明的SKA1siRNA能够有效降解肿瘤细胞SKA1基因的mRNA。提取传代6次和8次的肿瘤细胞克隆中的蛋白，用western-blot方法检测细胞内SKA1蛋白的含量，表明本发明的siRNA序列能够稳定抑制SKA1基因的表达。

本发明的SKA1基因的siRNA能够有效降解SKA1基因的mRNA，从而抑制SKA1基因的表达。本发明已经成功的用RNA干扰技术来抑制SKA1基因的表达，获得了SKA1基因沉默的细胞模型。

本发明的细胞模型与本领域常规的肿瘤细胞培养方法、保存、活化、传代一样，通常用10％血清的DMEM培养基，在37℃、含5%CO₂的细胞培养箱中进行培养，用含20％血清、10％DMSO的DMEM培养基作为冻存液冻存细胞。用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的细胞消化液进行消化。

本发明解决上述技术问题采取的技术方案之七是：本发明所述的SKA1基因沉默的细胞模型在筛选抗肿瘤药物中的应用。

所述SKA1基因沉默的细胞模型在筛选抗肿瘤药物中的应用较佳地包括以下步骤：

（1）使候选药物与SKA1基因沉默的肿瘤细胞接触；

（2）测试肿瘤细胞的数目；

（3）选择使肿瘤数目下降的候选药物。

本发明利用未进行SKA1基因沉默的普通肿瘤细胞作为对照组。根据本发明，所述的肿瘤细胞较佳地包括人骨肉瘤细胞或结直肠癌肿瘤细胞。利用本发明建立的细胞模型可进行肿瘤原发耐药性机制以及肿瘤增殖和扩增方面的研究。

本发明解决上述技术问题采取的技术方案之八是：本发明所述的小分子干扰核糖核酸（siRNA）在制备抗肿瘤药物中的应用。

实验证实SKA1基因在肿瘤细胞的原发耐药过程中有重要作用。含有SKA1-siRNA的慢病毒颗粒感染了骨肉瘤原发耐药细胞株后，通过荧光定量PCR和免疫印迹实验证实内源性SKA1基因的mRNA和蛋白水平都显著降低。内源性SKA1表达受到抑制后，骨肉瘤原发耐药细胞株细胞的增殖能力、致瘤能力都显著降低，对抗肿瘤药物的敏感性大大增强。本发明所述小分子干扰核糖核酸（siRNA）应用于抗肿瘤药物的制备和筛选，较佳地作为一种抗肿瘤药物的增敏剂。本发明所述应用较佳地包括一种药物组合物，所述药物组合物至少包括一种本发明所述的小分子干扰核糖核酸（siRNA）作为活性成分和一种药学上可接受的载体。

其中所述的药物组合物制备方法较佳地采取本领域常规的方法，将本发明所述siRNA作为活性成分，与药学上可接受的载体制成各种剂型。其中所述的载体是本领域常规的药用载体，如填充剂、稀释剂和赋形剂等。在各种制剂中，活性成分的重量含量较佳地为0.1%～99.9%，优选的重量含量为0.5～90%。

本发明解决上述技术问题采取的技术方案之九是：一种SKA1基因的逆转录PCR引物。

本发明所述SKA1基因的逆转录PCR引物分子包括单链DNA，通过体外人工合成或通过本领域其他常规技术例如从基因组中分离扩增等方法制备而得。

本发明所述的引物为一段寡聚单链DNA或RNA分子，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。本发明还提供所述SKA1基因的逆转录PCR引物分子在肿瘤诊断中的应用。所述应用一较佳实例是：以样本组织或细胞中提取的RNA为模板，利用本发明所述SKA1基因的逆转录PCR引物分子，逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板扩增目标片段，检测组织样本或细胞中SKA1基因的表达量变化，从而诊断肿瘤或肿瘤细胞的发育状况。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明设计了针对SKA1基因的逆转录PCR引物，RNA干扰靶点序列，构建相应的SKA1 shRNA表达载体，其中siRNA能够显著下调SKA1基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒作为基因操作工具携带RNA干扰载体pFH1UGW-SKA1-siRNA-1能够靶向地将针对SKA1基因的RNA干扰序列高效导入人骨肉瘤细胞Saos-2、SF-86和人结直肠癌细胞RKO，显著降低SKA1基因的表达水平，显著提高上述肿瘤细胞的化疗药物敏感性，使其原发耐药细胞株细胞的增殖能力、致瘤能力都显著降低，是骨肉瘤和结直肠肿瘤的潜在临床非手术治疗方式之一。本发明提供的SKA1基因的逆转录PCR引物，该引物能够通过检测SKA1基因在细胞或组织内的表达量变化，对肿瘤进行诊断。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是载体图谱。

图2是siRNA阳性克隆鉴定图谱。

图3是MTX药敏试验结果。

图4是IFO药敏实验结果。

图5是荧光定量PCR结果柱状图。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。

实施例1针对SKA1的siRNA设计

通过Invitrogen的在线siRNA设计软件，选取网站评价较高的四条siRNA序列。通过NCBI网站，对siRNA序列进行比对分析（Blast分析）。发现这四条siRNA序列与除SKA1以外的其他基因没有显著地同源性。四条针对SKA1的siRNA序列见表1。

表1SKA1基因的siRNA作用标靶序列

编号	序列编号	序列
			siRNA-1	SEQ ID NO.1	GGAGATGAGATCATTGTAA
siRNA-2	SEQ ID NO.2	GAGGACTTACTCGTTATGTTA
			siRNA-3	SEQ ID NO.3	CCGCTTAACCTATAATCAAAT
siRNA-4	SEQ ID NO.4	GGGAGGACTTACTCGTTATGTTA

实施例2构建含有SKA1-siRNA的载体

2.1分子合成

根据上述表格中的序列，由上海生工生物公司分别合成编码siRNA的正义链和反义链。用ddH₂O将合成的序列稀释到100μM的浓度备用。

其中合成的4条siRNA正义链的序列分别为：

1、（SEQ ID NO.5）：

5’-CTAGCGGAGATGAGATCATTGTAATTCA AGAGATTACA ATGATCTCATCTCCTTTTTTGGAATTAAT-3’；

2、（SEQ ID NO.6）：

5’-CTAGCGAGGACTTACTCGTTATGTTATTCAAGAGATAACATAACGAGTAAGTCCTCTTTTTTGGAATTAAT-3’；

3、（SEQ ID NO.7）：

5’-CTAGCCCGCTTAACCTATAATCAAATTTCAAGAGAATTTGATTATAGGTTAAGCGGTTTTTTGGAATTAAT-3’；

4、（SEQ ID NO.8）：

5’-CTAGCGGGAGGACTTACTCGTTATGTTATTCAAGAGATAACATAACGAGTAAGTCCTCCCTTTTTTGGAATTAAT-3’。

其中合成的4条siRNA反义链的序列分别为：

5、（SEQ ID NO.9）：

5’-TAATTCCAAAAAAGGAGATGAGATCATTGTAATCTCTTGAATTACAATGATCTCATCTCCG-3’

6、（SEQ ID NO.10）：

5’-TAATTCCAAAAAAGAGGACTTACTCGTTATGTTATCTCTTGAATAACATAACGAGTAAGTCCTCG-3’

7、（SEQ ID NO.11）：

5’-TAATTCCAAAAAACCGCTTAACCTATAATCAAATTCTCTTGAAATTTGATTATAGGTTAAGCGGG-3’

8、（SEQ ID NO.12）：

5’-TAATTCCAAAAAAGGGAGGACTTACTCGTTATGTTATCTCTTGAATAACATAACGAGTAAGTCCTCCCG-3’

2.2退火程序按照如下比例，将各组分混和：

溶液	体积
		10×退火缓冲液	5μl
正义链	5μl
		反义链	5μl
H₂O	35μl

按照如下程序，进行退火反应

2.3酶切

本发明中所使用的载体是pFH1UGW（参见“Fasano CA,Dimos JT,Ivanova NB,et al.shRNA knockdown of Bmi-1reveals a critical role for p21-Rbpathway in NSC self-renewal during development[J].Cell Stem Cell,2007Jun7.1(1):87-99”）。pFH1UGW的结构见图1。

按照下表将各组分混合均匀。

载体双酶切（其中缓冲液1和PacI/NheI酶均来自于NEB公司）

载体	5μl
		水	11.8μl
10×缓冲液1	2μl
		100×BSA	0.2μl
PacI	0.5μl
		NheI	0.5μl

连接反应（连接酶购自NEB公司）

载体	0.5μl
		退火反应产物	7.5μl
10×连接缓冲液	1μl
		T4连接酶	1μl

室温连接1个小时。

2.4转化

1)将50μl感受态大肠杆菌HB101细胞取出，并置于冰上融化；

2)将5μl连接产物加入到50μl感受态细胞中，并置于冰上孵育30分钟；

3)将含有连接产物的感受态细胞置于42℃水浴中，孵育90秒；然后置于冰上，3分钟；

4)在管中加入900μl无抗生素的LB培养基；37℃，200rpm，孵育45分钟；

5)4000rpm，离心2分钟；

6)弃上清，然后将沉淀轻轻吹打并悬浮后，滴加到LB固体培养基表面；

7)用涂布棒将溶液在培养基表面涂匀，并置于37℃培养箱，培养12～16小时。

2.5克隆菌液PCR鉴定

1)挑选单个克隆菌落并在3ml LB培养基中培养4个小时，250rpm；

2)按照如下的比例将各组分混匀。

其中5′引物:5’-GACAAATGGCAGTATTCATCC-3’(SEQ ID NO.13)；

3’引物:5’-ATTTGCATGTCGCTATGTGT-3’(SEQ ID NO.14)。

2×PCR Mix	7.5μl
		H₂O	4.5μl
菌液	2μl
		5′引物	0.5μl
3′引物	0.5μl

注：本实施例中，使用天根公司的Taq PCR MasterMix系列产品。

反应条件：

3)通过电泳，鉴定阳性克隆(如图2所示)。

2.6小量抽提质粒DNA测序

本实施例中采用天根公司的质粒小提取试剂盒。

1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中加入500μl的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2)取2ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用台式离心机，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。

3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1，使用移液器彻底悬浮细菌沉淀。

4)向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转8次使菌体充分裂解。

5)向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转8次，充分混匀。12,000rpm离心10min。

6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

7)向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。

8)向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

9)重复操作步骤8。

10)将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心2分钟，将吸附柱中的残余漂洗液去除。

11)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μl H₂O。室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟。将质粒溶液收集到离心管中。

取5μl小抽的质粒送到公司进行测序，确定SKA1-siRNA序列已经正确插入到pFH1UGW载体中。

实施例3表达SKA1-siRNA的病毒包装

3.1质粒中抽（中抽试剂盒购自普洛麦格生物公司，货号：A7640）

1)取50μL新鲜的菌液接种到15～50mL的LB培养基（含适量抗生素），37℃震荡培养14～16小时。室温下5,000×g离心10分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。

2)加入2.5mL已加入RNase A的BufferA1，重新悬浮菌体。

3)加入2.5mL Buffer B1，轻轻地反转5～10次以混合均匀，然后静置2～5分钟至溶液粘稠而澄清。

4)加入3.0mL Buffer C1，立即反转5次，用手用力摇晃3～5次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。

5)将离心管转至高速离心机，在室温下14,000g离心10分钟；小心吸取离心后的上清液至15mL管中，加入3.0mL 100%乙醇，立即摇匀，需马上离心过DNA回收柱。

6)立即转移6.0mL裂解液/收集管至带收集管的DNA柱中，室温下5,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中；重复此步直至所有的溶液通过DNA柱。

7)向离心柱中加入4mL 70%乙醇，室温下5,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。

8)将离心柱放回高速离心机中，室温下5,000g开盖离心10分钟。

9)将离心柱转至一个新的15mL离心管中，向DNA柱膜的正中加入0.5mL的ddH₂O（pH在7.0～8.5之间）或溶解缓冲液，室温放置1分钟，5,000g离心5分钟，以洗脱质粒DNA。

10)DNA浓度及纯度：DNA浓度(μg/mL)=OD₂₆₀×50×稀释倍数。

3.2质粒共转染

1)检测质粒浓度和纯度：抽提获取纯化好的质粒，确定质粒浓度（1.28μg/μl，OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.75~2.0之间显示无蛋白污染），和纯度（0.8%~1.0%琼脂糖凝胶电泳结果显示质粒为超螺旋单带，无RNA污染）。

2)细胞铺板：通过胰酶消化收集293T细胞（293T购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心，货号：GNHu17），用适当的完全培养基稀释后（完全培养基:DMEM+10%FBS。培养基DMEM，购自Hyclone公司，货号为：SH30243.01B；胎牛血清购自GIBCO公司，货号：10099141；抗生素购自Hyclone公司，货号：SV30010，工作浓度青霉素是100U/mL，链霉素是100μg/mL）以1×10⁵至4×10⁵细胞/cm²的密度接种细胞于细胞培养皿上。将293T细胞置于含5％CO₂的37℃温箱中孵育8~24h，当细胞贴壁完全后即开始转染。转染前2h换液（用新鲜的完全培养基置换旧的培养基）。

3)制备磷酸钙－DNA沉淀：DNA与CaCl₂混合。在60mm组织培养皿中反应总体积为500μl。在灭菌水中加入质粒DNA（3~5μg），再加入31μl 2MCaCl₂，使三者总体积达到250μl，混匀。

4)将质粒和CaCl₂的混合物逐滴加入250μl（等体积）2×HBS缓冲溶液。同时轻弹管壁，使每滴加入后及时混匀。静置20min后，将这500μl的磷酸钙－DNA悬液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀。

5)置于含5%CO₂的37℃温箱孵育。培养一段时间后（8~24h）吸去培养基与DNA沉淀，加入5ml 37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育，培养24~48h后观察蛋白的表达情况，并收集病毒。

3.3病毒纯化

1)收集转染后48h的293T细胞培养上清液；

2)使用低温离心机3000~4000g离心10~15min，除去细胞碎片；

3)使用0.45μm滤头过滤细胞培养上清液，并分装到40ml超速离心管中；

4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中，盖好盖子；将过滤杯插入到收集管中；本过滤装置是MILLIPORE的plus-20离心过滤装置；

5)将过滤管重量调节平衡后组装，放入离心机；

6)在低温离心机上3000~4000g离心10~15min；

7)离心结束后取出离心装置，将过滤杯和下面的过滤液收集杯分离；

8)将过滤杯倒扣在样品收集杯上；

9)使用低温离心机500~1000g离心2~5min；把离心杯从样品收集杯上移走；样品收集杯中液体为病毒纯化浓缩液。

3.4滴度检测

1)粗提液滴度测定：

a)收集病毒上清4℃保存；

b)提前一天在96孔板中铺293T细胞，每孔细胞数为：2×10⁴个，体积为100μl；

c)将病毒原液按照100μl、50μl、20μl、10μl、1μl加入细胞中；

d)感染3天后观察荧光；

e)同时确定一个标尺病毒（病毒标准品从纽恩生物公司订购），每次做10⁸、10⁷、10⁶的标准品。

2)浓缩病毒滴度测定：

a)收集病毒上清进行过滤并超速离心，-80℃冻存；

b)提前一天在96孔板中铺293T细胞，每孔细胞数为：4×10⁴个，体积为100μl；

c)根据病毒的预期滴度，准备7～10个无菌的EP管，每管加入90μlopti-MEM；

d)取待测病毒4℃解冻，吸取10μl加入到第1个管中，混匀后取10μl加入到第2个管中。继续相同操作直到最后一管；

e)选取所需要的细胞孔，吸去90μl培养基，加入90μl稀释好的病毒溶液，放入培养箱培养；

f)感染24h后，加入完全培养基100μl，小心操作不要吹起细胞；

g)感染3天后，观察荧光。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少；

说明：

管子标记

第1管

第2管

第3管

......

第7管

第8管

原液病毒量

1E+1μl

1E+0μl

1E-1μl

......

1E-5μl

1E-6μl

h）滴度计算：根据实际观察的荧光状况，假设在第8管中观察到3个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，第8个管的病毒原液量为1E-6μl，所以滴度=3/（1E-6）=3E+6，单位为TU/μl,也就是等于3E+9TU/ml。通过上述病毒滴度计算方法，可知本次包装SKA1-siRNA的病毒滴度为5×10e8 TU/ml。

实施例4SKA1基因表达抑制后对耐药细胞株的耐药性的影响

4.1主要仪器与试剂

Cellomics(Thermo)；

CO₂培养箱（MCO-15A SANYO）；

倒置显微镜（XDS-100上海蔡康光学仪器有限公司）；

超净台（EQR/GL-41ESCO）；

离心机（TDL-50B安亭）；

SF-86细胞为骨肉瘤耐药细胞株，为CCTCC NO：C201002（参见中国专利申请CN201010110746.X）。

MTX：氨甲喋呤，来源于上海科兴实验室设备有限公司，货号：100138；

IFO：异环磷酰胺，上海科兴实验室设备有限公司，货号：100595。

4.2实验步骤

1)药敏实验

a)用对照干扰(control)病毒（所述对照病毒为PSCN，该慢病毒载体中所包含的siRNA序列为TTCTCCGAACGTGTCACGT，不针对任何人体内的基因，用于排除由病毒本身所带来的对细胞的毒性作用，该慢病毒购自纽恩生物公司）和实施例3所得的包含SKA1基因siRNA的标靶序列并可表达绿色荧光蛋白的慢病毒颗粒，分别感染SF-86细胞，实验包括以下步骤：1，细胞按照10%的密度铺12孔板；2，次日，换新鲜培养基；3，加入聚凝胺至终浓度为5μg/ml；4，加入实施例3所得的慢病毒颗粒和对照病毒；5，第三日，换液维持培养三天；6，通过荧光显微镜，观察细胞感染效率，感染效率达到90%。

b)感染4天后观察细胞，发现每个感染组中的大部分细胞都被感染上病毒，因为病毒载体上有GFP标签蛋白，因此细胞感染后，会表达GFP蛋白，即可通过荧光显微镜观察细胞内GFP的表达强弱和表达GFP细胞的比例高低，判断感染效率。

c)将各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基（同上所述）重悬细胞，铺至96孔板。每组8个复孔，每孔100μl，铺好板后，置37℃5%CO₂培养箱培养。

d)待细胞贴壁后，将每个感染组再分为加MTX药（3复孔）、加IFO药（3复孔）、不加药（2复孔）三组，加入相应的药物处理，MTX工作浓度为1μg/ml；IFO工作浓度为222μg/ml。

e)加药24小时、48小时、72小时时分别用CELLOMICS仪器检测并分别计算不同处理组细胞的数目。

f)数据处理

分别计算在加药24小时、48小时和72小时后，每组RNA干扰慢病毒感染的细胞在MTX和IFO药物作用下的细胞存活率：

存活率=药物存在时的细胞数目/无药物处理时的细胞数目。

细胞的存活率可以反映肿瘤细胞对药物的敏感性。通过比较对照组（control）和RNA干扰组，细胞对药物敏感性的改变，分析该基因在细胞耐药性中的作用。利用未加药组的细胞数的变化，分析基因对细胞增殖的影响：24h时的细胞数作为1，计算48h、72h的细胞数的比值变化。

2)有效靶点敲减验证

a)从4个目的基因干扰靶点中筛选获得2个使药物敏感性增加的靶点进行敲减效率的验证。

b)用实施例3所得的包含2个siRNA靶点序列（siRNA-1和siRNA-2）的慢病毒颗粒和阴性对照病毒（阴性对照病毒同上所述）分别感染骨肉瘤耐药细胞株SF-86，感染4天后消化细胞，离心收集细胞沉淀。所述实验步骤包括：1，细胞按照10%的密度铺12孔板；2，次日换新鲜培养基；3，加入聚凝胺至终浓度为5μg/ml；4，加入实施例3所得慢病毒颗粒，所述慢病毒滴度为5×10e8TU/ml，病毒颗粒按照1:500稀释，细胞感染复数为10；5，细胞换液维持培养三天；6，细胞培养第三天通过荧光显微镜，观察细胞感染效率＞90%。

c)使用裂解液trizol裂解细胞，抽提总RNA，反转录成cDNA，进行荧光定量PCR。检测SKA1mRNA。

其中SKA1-5引物：5’-GATGAGTTCAATGGTGTTCCTTC-3’(SEQ IDNO.15)；

SKA1-3引物：5’-CCTTTGGTATCCTTCGTTTCTTC-3’(SEQ IDNO.16)。

d)分析荧光定量PCR结果数据（表2、图5所示）。

表2荧光定量PCR结果统计分析

4.3实验结果：

1)药敏实验结果与分析

a）针对SKA1基因的siRNA-3靶点的RNA干扰慢病毒感染耐药SF-86细胞后，细胞对MTX的敏感度增加，该基因在SF-86细胞中的高表达可能与其耐MTX药物有关（见图3）。由于SF-86细胞是耐药细胞株，因此该细胞株在无药物情况下和有MTX的情况下，生长状况相似。

b）实施例3所得包含SKA1基因siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4靶点的RNA干扰慢病毒感染耐药SF-86细胞后，细胞对IFO的敏感度增加，SF-86细胞中SKA1基因的高表达可能与其耐IFO药有关（见图4）。

2)根据药物敏感性试验，本实验选择其中药物敏感性升高最明显的siRNA-1靶点与siRNA-3靶点进行SKA1基因抑制有效性验证。验证结果SKA1基因抑制效果明显（见表2）。经过荧光定量PCR反应后，我们首先分析了SKA1和内参actin的溶解曲线，结果说明荧光定量PCR能特异性地扩增SKA1基因和内参actin。通过2^-ΔΔCt法分析，可以获得结论：即相对于无病毒感染的对照细胞，感染了包含SKA1-siRNA的慢病毒的实验组细胞中，SKA1的基因表达水平显著降低。

3)结果分析：SKA1是着丝粒、纺锤丝相关复合体的组成成分，参与有丝分裂时着丝粒的形成及染色体的凝聚，并参与actin的延伸与解聚具有促进细胞运动性的功能。但对于该基因在肿瘤中的功能尚无报道。本实验中siRNA-1靶点的细胞增殖减缓，siRNA-3靶点对MTX敏感性增加，siRNA2、3、4靶点对IFO敏感性增加。从MTX和IFO两种药的耐药机制上看，都与DNA合成抑制有关，表明它们在功能上有一定的交叉。总体来看改变基因的表达后，细胞对IFO药物的敏感型更容易显现出来。

实施例5SKA1的逆转录PCR引物在骨肉瘤细胞中对于SKA1基因的检测

利用本发明提供的SKA1基因逆转录PCR引物，以从骨肉瘤细胞系中提取的RNA为模板反转录合成cDNA，再以该cDNA为模板扩增合成目的片段，该方法能够检测骨肉瘤细胞中SKA1基因的表达水平。

实施例6SKA1的逆转录PCR引物在骨肉瘤临床病理标本中对于SKA1基因的检测

利用本发明提供的SKA1基因逆转录PCR引物，从骨肉瘤临床病理标本中提取RNA，并以此RNA为模板逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。该方法能够检测骨肉瘤临床病理标本中SKA1基因的表达水平。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种分离的SKA1基因小分子干扰核糖核酸（siRNA）标靶DNA，其特征在于，所述标靶DNA是：

（1）SKA1编码基因上的连续15～27个核苷酸组成的DNA；

（2）SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4中任意一条序列；或

2.权利要求1所述的标靶DNA在筛选抗肿瘤药物中的应用。

3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如权利要求1所述的标靶DNA或包含SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：8中任意一条序列。

4.一种抑制SKA1基因表达的小分子干扰核糖核酸（siRNA），其特征在于，所述的siRNA包括正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段包含权利要求1所述标靶DNA编码的RNA分子，所述正义RNA片段和反义RNA片段能够互补形成双链RNA分子。

5.一种慢病毒颗粒，其特征在于，其包含如权利要求3所述的重组载体。

6.一种SKA1基因沉默的细胞模型，其特征在于，其包含如权利要求5所述的慢病毒颗粒。

7.如权利要求6所述的SKA1基因沉默的细胞模型在筛选抗肿瘤药物中的应用。

8.权利要求4所述的小分子干扰核糖核酸（siRNA）在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.一种SKA1基因的逆转录PCR引物。

10.如权利要求9所述的SKA1基因的逆转录PCR引物在诊断肿瘤中的应用。