CN110157705A

CN110157705A - 在pdcd1基因表达的剪接水平抑制pd-1信号的反义寡核苷酸及其筛选方法与应用

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Publication number: CN110157705A
Application number: CN201910405276.0A
Authority: CN
Inventors: 华益民
Original assignee: Suzhou Antian Shengshi Pharmaceutical Technology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Antian Shengshi Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority date: 2019-05-16
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2019-08-23
Anticipated expiration: 2039-05-16
Also published as: CN110157705B

Abstract

本发明提供了一种在PDCD1基因表达mRNA前体剪接水平抑制PD‑1信号通路的反义寡核苷酸及其筛选方法与应用。本发明中的反义寡核苷酸能使编码PD‑1蛋白的基因PDCD1在mRNA前体剪接水平发生改变，促进转录产物外显子3发生跳跃，使生成的全长PD‑1蛋白量显著减少、缺乏外显子3的截短蛋白（称作PD‑1Δ3）显著增加。所述反义寡核苷酸可应用于抗癌药物。

Description

在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸及其筛选方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸及其筛选方法与应用。

背景技术

癌症已成为人类健康的第一杀手，但治疗癌症的手段和药物仍很有限。当前免疫检查点阻断是一种新的抗癌策略并已取得一定的成效。由PDCD1 基因编码的PD-1(亦称CD279)是免疫检查点通路中的关键分子，PD-1 定位于免疫细胞特别是T细胞的细胞膜上，通过与肿瘤细胞表面的配体分子PD-L1和PD-L2结合产生负调控信号，导致T细胞疲劳以及肿瘤细胞逃逸。阻断PD-1和其配体的结合可解除T细胞疲劳，抑制肿瘤生长。目前已有多个PD-1抗体和PD-L1抗体上市，对霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、小细胞肺癌等在内的多种恶心肿瘤有明显的治疗效果。

PDCD1基因共有5个外显子，编码288氨基酸，氨基端信号肽切除后的成熟蛋白为268个氨基酸。PDCD1基因存在多种可变剪接(alternative splicing)方式，其中外显子3跳跃是PDCD1基因的主要可变剪接方式；缺乏外显子3的PD-1剪接异构体称作PD-1Δ3。外显子3编码整个跨膜序列，缺乏膜定位序列的PD-1Δ3是一种可溶性蛋白，理论上既可以存在于细胞内也可以分泌进入组织液和血液，考虑其含有信号肽序列，PD-1Δ3 很可能是一种分泌性蛋白。现已在人的血清和组织液中发现了可溶性PD-1 (sPD-1)，根据基因表达分析确证其为PD-1Δ3。游离在血液和组织液中的PD-1Δ3保留了与配体结合的能力，可以和PD-1竞争结合PD-L1和 PD-L2等配体，起到天然自身抗体的作用。近期一项临床研究发现非小细胞肺癌患者在厄洛替尼(erlotinib)治疗后的存活期与血清中sPD-1/PD-1Δ3 浓度成正相关。因此，PD-1Δ3不仅仅是丢失了功能，它还能拮抗 PD-L1/PD-1的活性。

在以PD-1/PD-L1为靶点的药物研发领域，各大公司主要方向是抗体药。尽管抗体药已取得一定的效果，但癌症患者的反应率(responder rate) 并不高，药效也有待提高。

多外显子基因mRNA前体(pre-mRNA)上的主要剪接信号(primary splicingsignal)有5′剪接位点(5′splice site，简称5′ss)、3′剪接位点(3′ss) 和分支点序列(branch-point sequence)。如果主要剪接信号偏弱就可能导致可变剪接的发生，在这种情况下，mRNA前体上的辅助性剪接信号 (auxiliary splicing signal)会对剪接位点的识别起到重要作用。辅助性剪接信号也称作剪接调控元件(splicing regulatory element,简称SRE)包括外显子剪接增强子(exonic splicing enhancer,简称ESE)、外显子剪接沉默子(exonic splicing silencer,简称ESS)、内含子剪接增强子(intronic splicingenhancer,简称ISE)和内含子剪接沉默子(intronic splicing silencer,简称 ISS)。这些顺式作用元件(cis-acting element)通常被特异性的RNA结合蛋白识别，这些蛋白再通过蛋白-蛋白相互作用影响剪接体对剪接位点的识别。剪接激活蛋白(splicing activator)与剪接增强子结合促进剪接，剪接抑制蛋白(splicing repressor)与剪接沉默子结合抑制剪接。盒式外显子(即存在列入和跳跃两种状态的外显子)通常本身存在各种SRE，对自身的剪接起重要的调控作用。反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,简称ASO) 是一段经过化学修饰的单链寡核苷酸，通过Waston-Crick碱基配对机制与 mRNA前体上各种SRE配对结合，可以在空间上阻断SRE与其对应RNA 结合蛋白的结合，达到调控RNA剪接的目的。现已经上市的重磅药物 Spinraza就是一种ASO药，其与SMN2基因内含子7中的一个ISS配对结合促进外显子7的列入，使得该基因恢复SMN蛋白的表达。缺乏SMN蛋白是脊髓性肌萎缩症的致病原因。

近年来ASO药物已成为一个重要的药物平台，核酸化学修饰技术的进展使得ASO具有较好的药物特性，多个ASO药物已经上市或在临床试验中。其中，糖基2′-O-甲氧乙基(2′-O-methoxyethyl，简称MOE)修饰与硫代磷酸酯键(phosphorothioate，简称PS)修饰是Spinraza所使用的化学修饰。经过MOE/PS修饰的ASO与单链RNA的结合能力更强，并能抵抗各种核酸酶包括RNase H，与血液和组织液中蛋白具有一定的亲和力，因此在体内具有较高的稳定性，其中在脑脊液中半衰期达～200天、在外周组织也近3周。ASO通常20核苷酸(nucleotide，简称nt)左右，合成工艺简单，给药时不需要载体、能被多种细胞自动摄入，可直接注射到脑脊液或血液中进行治疗。

采用在mRNA前体剪接水平改变PDCD1基因的表达，让PD-1表达量减少、PD-1Δ3表达量增加代表了一种巧妙的治疗策略，因为该策略在两个方面抑制PD-1活性：1)免疫细胞表面的PD-1减少，因而免疫抑制活性减弱；2)释放到肿瘤细胞微环境中的PD-1Δ3起到一个类似 PD-L1/PD-L2抗体的作用，因此PD-1Δ3的增加将干扰PD-L1/PD-L2对免疫细胞的攻击。可变剪接是一个可调控过程，改变RNA剪接的策略有很多，其中一种被证明具有药用价值的靶向策略是应用反义寡核苷酸，即 ASO。至今尚未有使用ASO在PDCD1基因mRNA前体剪接水平抑制PD-1 信号通路的报道。

发明内容

为了解决现有技术的不足和癌症药物的缺乏，本发明提供了一种在 PDCD1基因mRNA前体剪接水平抑制PD-1信号通路的反义寡核苷酸及其筛选方法与应用。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

在PDCD1基因表达的mRNA前体剪接水平抑制PD-1信号通路的反义寡核苷酸。

在PDCD1基因表达的mRNA前体剪接水平抑制PD-1信号通路的反义寡核苷酸的作用靶点。

优选地，所述反义寡核苷酸的作用靶点存在于所述PDCD1基因的外显子3中，且该作用靶点为PDCD1外显子3上从第12位核苷酸至第45 位的一段核苷酸序列，其在基因中的序列为SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1：GAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCA。其对应的mRNA前体序列为： GAAGUGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCUCACCCA。

优选地，所述的在PDCD1基因剪接水平抑制PD-1信号通路的反义寡核苷酸的作用靶点的筛选方法，包括如下步骤：

S1、构建PDCD1小基因(minigene)；

S2、寻找确认S1中PDCD1小基因中的两个外显子剪接增强子；

S3、初步筛选反义寡核苷酸；

S4、在初步筛选的反义寡核苷酸的基础上进行优化；

其中，所述S3和S4的初步筛选、优化均采用步移法进行。

优选地，所述S1中包括如下步骤，

S11、设计引物，将人基因组DNA中PDCD1基因片段克隆到质粒 pCI-neo构建PDCD1小基因，所述PDCD1小基因包括外显子1中76核苷酸(nucleotide,简称nt)的编码序列，355nt截短的内含子1(上游167nt +XbaI酶切位点+下游182nt)，完整的从外显子2到内含子4的DNA片段，外显子5前59nt的片段，最后加5′剪接位点序列(CAGGTAAGTACTT)。通过两步片段插入完成，第一步用XhoI和XbaI限制性酶切位点，第二步用XbaI和SalI位点。通过测序确证小基因序列无误。所述PDCD1小基因序列为SEQ ID NO.2所示；其中，下划线序列为克隆的酶切位点；大写为外显子；小写为内含子。SEQ ID NO.2:GCTAGCATGCAGATCCCACAGCCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAA CTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGgtaggtggggtcggcggtcaggtgtcccagagccaggggtctggaggg accttccaccctcagtccctggcaggtcggggggtgctgaggcgggcctggccctggcagcccaggggtcccggagcgaggggtctggagg gacctttcactctcagtccctggcaggtctcga gaggctctgcagtggaggccagtgcccatccccgggtggcagaggccccagcagagact tctcaatgacattccagctggggtggcccttccagagcccttgctgcccgagggatgtgagcaggtggccggggaggctttgtggggccaccca gccccttcctcacctctctccatctctcagACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACAT CGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTG GCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACA ACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCG GCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTG CGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGgtgcggcctcggaggccccggggcaggggtgagctgagccggtcctggggtgggtgtcccctcctgcacaggatcaggagctccagggtcgtagggcagggaccccccagctccagtccagggctctgtcctgcacctggggaatggtg accggcatctctgtcctctagctctggaagcaccccagcccctctagtctgccctcacccctgaccctgaccctccaccctgaccccgtcctaaccc ctgacctttgtgcccttccagAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAG GCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTGGTTGGTGTCGTGGGCGGCCTGCTGGGCAGCC TGGTGCTGCTAGTCTGGGTCCTGGCCGTCATCTGCTCCCGGGCCGCACGAGgtaacgtcatcccag cccctcggcctgccctgccctaaccctgctggcggccctcactcccgcctccccttcctccacccttccctcaccccaccccacctccccccatctc cccgccaggctaagtccctgatgaaggcccctggactaagaccccccacctaggagcacggctcagggtcggcctggtgaccccaagtgtgttt ctctgcagGGACAATAGGAGCCAGGCGCACCGGCCAGCCCCTGgtgagtctcactcttttcctgcatgatccactg tgccttccttcctgggtgggcagaggtggaaggacaggctgggaccacacggcctgcaggactcacattctattatagccaggaccccacctccc cagcccccaggcagcaacctcaatccctaaagccatgatctggggccccagcccacctgcggtctccgggggtgcccggcccatgtgtgtgcct gcctgcggtctccaggggtgcctggcccacgcgtgtgcccgcctgcggtctctgggggtgcccggcccacatatgtgcctgcctgcggtctcca ggtgtgcccggcccatgcgtgtgcccacctgcgagggcgtggggtgggcttggtcatttcttatcttacattggagacaggagagcttgaaaagtc acattttggaatcctaaatctgcaagaatgccagggacatttcagagggggacattgagccagagaggaggggtggtgtccccagatcacacag agggcagtggtgggacagctcagggtaagcagctcatagtggggggcccaggttcggtgccggtactgcagccaggctgtggagccgcggg cctccttcctgcggtgggccgtggggctgactccctctccctttctcctcaaagAAGGAGGACCCCTCAGCCGTGCCTGT GTTCTCTGTGGACTATGGGGAGCTGGATTTCCACAGGTAAGTACTTTCTAGA。

S12、将表达PDCD1小基因的质粒用支链聚乙烯亚胺试剂转入各种细胞检测其剪接模式，发现外显子3的列入和跳跃是PDCD1小基因的主要可变剪接模式，即外显子3是盒式可变剪接外显子。但在不同细胞外显子 3的列入有明显差异，比如黑色素瘤A375细胞外显子7列入较高，而肝细胞瘤则列入较低。剪接分析使用荧光标记RT-PCR，即至少一个引物上连接了荧光染料Cy5。

优选地，所述S2包括如下步骤，

S21、对S1中PDCD1小基因中156nt的外显子3做序列删除分析，每个突变体删除12nt，构建13个突变体，并根据删除的位置进行命名： D1-12、D13-24、D25-36、D37-48、D49-60、D61-72、D73-84、D85-96、D97-108、D109-120、D121-132、D133-144、D145-156。同时，由于第一个和最后一个突变体删除了部分3′和5′剪接位点序列，为避免剪接位点受损造成的影响，在13个突变体的基础上，补充两个不影响剪接位点的删除突变体D3-12和D145-154；

S22、将构建的野生型(wild type,缩写WT)PDCD1小基因和突变体共16个质粒用支链聚乙烯亚胺法转入A375细胞进行RNA剪接分析，跟野生型相比，其中两个不涉及剪接位点删除的突变体D13-24和D133-144 强烈地抑制PDCD1外显子3列入，分别减少26％和65％,从而确认这两个突变体所删除的序列包含剪接增强子，D13-24删除位点的增强子命名为ESE3a，D133-144删除位点的增强子命名为ESE3b。

进一步的对ESE3b附近序列进行分析，发现一段GC丰富序列(外显子3核苷酸117位到148位)能形成一个较强的RNA颈环二级结构。我们构建了多个突变体分析该RNA结构与PDCD1外显子3剪接的关系，发现野生型和突变体中该二级结构的稳定性与外显子3列入的比例成明显的负相关(R²＝0.76)。二级结构的存在将不利ASO与靶点序列的结合。

优选地，所述S3包括如下步骤，

S31、首先设计16个长度为15nt(即15mer)的ASO，靶点覆盖一段长165nt的序列：内含子2最后5nt、整个156nt外显子3和内含子3的前 4nt；每个ASO与前一个ASO存在5nt的重叠；ASO根据它们的作用位置依次命名为：ASOin2-10、ASO6-20、ASO16-30、ASO26-40、ASO36-50、 ASO46-60、ASO56-70、ASO66-80、ASO76-90、ASO86-100、ASO96-110、 ASO106-120、ASO116-130、ASO126-140、ASO136-150、ASO146-in3。每个ASO分别与PDCD1小基因共转染到A375细胞，观察ASO对外显子3 剪接的影响；从细胞收集的总RNA样品用荧光RT-PCR方法分析全长 (full-length,缩写FL)mRNA和缺乏外显子3(exon 3-skipped,缩写Δ3) mRNA丰度的变化，计算外显子3的列入百分比(percentage of inclusion,缩写％incl)。结果显示，作用于外显子3中从16位到40位的一段序列的两条ASO能显著抑制外显子3的列入，即ASO16-30和ASO26-40显著抑制外显子3的剪接。ASO16-30的靶点包含ESE3a,ASO26-40的靶点为紧靠 ESE3a的下游序列，两个ASO的靶点覆盖25nt，该序列含64％的C,提示 C-丰富序列是ESE3a剪接刺激活性的关键序列。所有作用于ESE3b的ASO 不具有明显抑制PDCD1外显子3剪接的效应，说明该部位的二级结构妨碍了ASO与其靶序列的配对结合。

其中，以上所述的16个ASO序列为：

ASOin2-10:GCCCTTCTCTCTGGA

ASO6-20:GGGCACTTCTGCCCT

ASO16-30:GGTGGGCTGTGGGCA

ASO26-40:GAGGGGCTGGGGTGG

ASO36-50:TGGCCTGGGTGAGGG

ASO46-60:ACTGGCCGGCTGGCC

ASO56-70:AGGGTTTGGAACTGG

ASO66-80:ACCAACCACCAGGGT

ASO76-90:CGCCCACGACACCAA

ASO86-100:CCCAGCAGGCCGCCC

ASO96-110:CACCAGGCTGCCCAG

ASO106-120:AGACTAGCAGCACCA

ASO116-130:GCCAGGACCCAGACT

ASO126-140:GCAGATGACGGCCAG

ASO136-150:CGGCCCGGGAGCAGA

ASO146-in3:TTACCTCGTGCGGCC

S32、进一步的对S31中两个ASO进行剂量依赖性反应分析，对其抑制PDCD1外显子3剪接的抑制强度确认；共6个浓度(0、1、5、10、20、 50nM)分别和PDCD1小基因共转染A375细胞，转染试剂为Lipofectamine 2000。接着用荧光RT-PCR方法分析RNA剪接，结果显示，20nM浓度时， ASO16-30和ASO26-40都能显著抑制PDCD1外显子3剪接。ASO26-40 的抑制效果比ASO16-30强。

S33、在人B淋巴细胞来源的RPMI 8226细胞检测ASO26-40对内源基因PDCD1剪接的影响并确认。RPMI 8226细胞为不贴壁的悬浮细胞，转染核酸物质有较高的难度，因此在ASO26-40的3′端连接上一个胆固醇分子，并重新命名为chol-ASO26-40。将chol-ASO26-40，分别0、0.5、1、 2μM共4个浓度，直接加入RPMI 8226细胞的培养基中，两天后观察RNA 剪接变化。浓度为1μM时，ASO26-40显著抑制PDCD1外显子3列入，在2μM时，外显子3的列入百分比从90％下降到54％。因此，ASO26-40 对内源基因的效果也非常明显。

优选地，所述S4包括如下步骤，

S41、初筛的目的是发现靶点的大致区域，而ASO优化可以精确定位作用靶点。且作为ASO药物的长度一般20nt比较合适。因此我们在初筛有效ASO的作用区域(16位至40位)及两侧各5nt的序列，即覆盖外显子 3从11位到45位的序列中，设计共20个20nt和18nt长的ASO，相邻 ASO移动一个位置，根据其作用位置命名：ASO11-30、ASO12-31、 ASO13-32、ASO14-33、ASO 15-34、ASO 16-35、ASO 17-36、ASO 18-37、 ASO 19-38、ASO 20-39、ASO 21-40、ASO 22-41、ASO 23-42、ASO 24-43、 ASO 25-44、ASO 26-45、ASO 14-31、ASO 15-32、ASO16-33、ASO 17-34。以100nM为终浓度，将每个ASO分别与PDCD1小基因共转染，观察ASO 对外显子3剪接的影响，除了ASO11-30没有效果，其他ASO都显著抑制外显子3的列入，因此12位至45位是ASO的有效作用区域。细胞RNA 样品用荧光RT-PCR方法分析RNA剪接。筛选出六个强烈抑制外显子3 列入的ASO，分别为ASO16-35、ASO17-34、ASO17-36、ASO21-40、 ASO22-41和ASO23-42。

以上所述的20个ASO序列如下所示：

ASO11-30：GGTGGGCTGTGGGCACTTCT

ASO12-31：GGGTGGGCTGTGGGCACTTC

ASO13-32：GGGGTGGGCTGTGGGCACTT

ASO14-33：TGGGGTGGGCTGTGGGCACT

ASO15-34：CTGGGGTGGGCTGTGGGCAC

ASO16-35：GCTGGGGTGGGCTGTGGGCA

ASO17-36：GGCTGGGGTGGGCTGTGGGC

ASO18-37：GGGCTGGGGTGGGCTGTGGG

ASO19-38：GGGGCTGGGGTGGGCTGTGG

ASO20-39：AGGGGCTGGGGTGGGCTGTG

ASO21-40：GAGGGGCTGGGGTGGGCTGT

ASO22-41：TGAGGGGCTGGGGTGGGCTG

ASO23-42：GTGAGGGGCTGGGGTGGGCT

ASO24-43：GGTGAGGGGCTGGGGTGGGC

ASO25-44：GGGTGAGGGGCTGGGGTGGG

ASO26-45：TGGGTGAGGGGCTGGGGTGG

ASO14-31：GGGTGGGCTGTGGGCACT

ASO15-32：GGGGTGGGCTGTGGGCAC

ASO16-33：TGGGGTGGGCTGTGGGCA

ASO17-34：CTGGGGTGGGCTGTGGGC

S42、进一步对以上S41筛选出的ASO进行了剂量依赖效应分析，并以不相关ASO(称作ASO0-0)和初筛ASO26-40为对照，再次确认六个 ASO都能显著抑制外显子3的列入。在A375细胞分析了6个浓度(0、1、 5、10、50、100nM)对小基因PDCD1剪接的影响。在50nM时，6个ASO都能显著抑制外显子3的列入；在低浓度(5nM和10nM)时， ASO22-41仍然具有较强的抑制效果，明显好于初筛的ASO26-40。

优选地，在PDCD1基因剪接水平抑制PD-1信号通路的反义寡核苷酸在抗癌药物上的应用。

优选地，在PDCD1基因剪接水平抑制PD-1信号通路的反义寡核苷酸在抗癌药物上的应用，应用于抗癌药物中的所述反义寡核苷酸具有在 mRNA前体剪接时抑制外显子3列入的作用。因此反义寡核苷酸的使用将使得细胞PD-1蛋白的表达减少而PD-1Δ3的表达增加。一方面，PD-1水平减少直接导致其免疫抑制活性减弱；另一方面，由于PD-1Δ3缺乏细胞膜定位序列但仍能与配体结合、其分泌到血液和组织液中能起到PD-L1和 PD-L2抗体的作用，PD-1Δ3表达增加将进一步地削弱PD-L1/PD-1信号通路的免疫抑制活性，增强免疫细胞对癌细胞的识别和攻击能力。

本发明的有益效果体现在：本发明中的反义寡核苷酸能使编码PD-1 蛋白的基因PDCD1在mRNA前体剪接水平发生改变，促进转录产物外显子3发生跳跃，使生成的全长PD-1蛋白量显著减少、缺乏外显子3的截短蛋白PD-1Δ3显著增加。应用本发明所述的反义寡核苷酸的药物具有治疗癌症的潜力。

附图说明

图1：PDCD1小基因的结构示意图。

图2：对图1小基因在6种人细胞中剪接模式分析图。

图3：代表性聚丙烯酰胺胶显示野生型和删除突变体在A375细胞中外显子3剪接的变化分析图。

图4：通过柱形图显示各突变体剪接变化的定量结果。

图5：实施例2中代表性RNA剪接分析的聚丙烯酰胺胶的荧光图。

图6：所有小基因二级结构最小自由能和外显子3列入存在高相关性的散点图。

图7：通过步移法初筛设计的16个ASO的作用靶点序列的示意图。

图8：显示实施例3中各ASO对PDCD1小基因剪接影响的聚丙烯酰胺胶荧光图。

图9：在A375细胞分析两个初筛有效ASO的剂量依赖效应的聚丙烯酰胺胶荧光图。

图10：ASO16-30和ASO26-40剂量依赖效应的定量分析柱形图。

图11：在RPMI 8226细胞分析ASO26-40对PDCD1内源基因影响的聚丙烯酰胺胶荧光图和定量分析柱形图。

图12：18mer和20mer的细筛ASO对PDCD1小基因外显子3剪接的抑制效果的聚丙烯酰胺胶荧光图。

图13：实施例4中细筛中最好6个ASO做不同浓度的效果分析聚丙烯酰胺胶荧光图，每个ASO与小基因共转染A375细胞观察其对PDCD1外显子3剪接的影响。无关序列ASO0-0(Con)为阴性对照，初筛ASO26-40为阳性参照。确定ASO22-41的抑制效果最佳。

图14：实施例4中最优ASO22-41与初筛ASO26-40的比较分析柱形图。

具体实施方式

以下结合实施例及附图具体阐述本发明的技术方案，本发明揭示了一种用于抑制PD-1信号通路的反义寡核苷酸及其筛选方法与应用。本发明中所使用的ASO都具有糖基位点的2′-O-甲氧乙基、硫代磷酸酯键和5甲基胞嘧啶修饰(5-methylcytosine，简称5mC)三种修饰；用于内源基因检测的ASO在3′端连接一个胆固醇(cholesterol)分子，称作chol-ASO。

PDCD1小基因的构建

为构建PDCD1小基因，首先设计了两对引物，一对是上游引物NheI-F1 (5’-ATGCTAGCATGCAGATCCCACAGG)和下游引物XhoI-R1 (5’-ATCTCGAGACCTGCCAGGGACTG)，另一对是上游引物XhoI-F2 (5’-ATCTCGAGAGGCTCTGCAGTGGAG)和下游引物XbaI-R2 (5’-ATTCTAGATGGAAATCCAGCTCCCCATAG)，以人HEK293细胞基因组DNA为模板扩增了两个片段，PCR体系程序如下：

5×Phusin HF buffer	4μl
		10mM dNTPs	0.4μl
10μM正向引物	1.2μl
		10μM反向引物	1.2μl
模板DNA	1～10ng
		DMSO	1.2μl
Phusion DNA聚合酶	0.3μl
		DEPC水	加至20μl

扩增获得的两段序列通过NheI/XhoI和XhoI/XbaI酶切位点先后克隆到pCI-neo载体上。获得的PDCD1小基因从NheI位点开始包括：外显子 1的后76nt、355nt截短的内含子1(167nt和182nt两片段由XhoI连接起来，中间大片段缺失)、360nt的外显子2、267nt的内含子2、156nt的外显子3、214nt的内含子3、35nt的外显子4、651nt的内含子4和截短的外显子5(前59nt)，最后在XbaI位点前有一个共识5′剪接位点序列 (CAGGTAAGTACTT)。所有PDCD1小基因突变体用半重叠引物对 (partially overlapping primer pairs)经定点突变法(site-specific mutagenesis) 生成。

细胞培养

本专利中使用的A375细胞和RPMI 8226细胞均购自中科院细胞库。贴壁细胞A375培养在DMEM完全培养基中(含10％胎牛血清、100U/ml 青霉素和100μg/ml链霉素)，悬浮细胞RPMI 8226培养在1640完全培养基中(含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)。所有的细胞培养在37℃、5％二氧化碳的环境中。

ASO转染

(1)本专利中的ASO用DEPC水溶解，储存浓度为20μM。

(2)第一天在12孔板每孔中种植适当密度的细胞(～1.5×10⁵)，每孔加入1ml完全培养基，培养过夜至细胞密度80％。

(3)配制转染混合液。A液：ASO适量和500ng小基因质粒加到50μl Opti-MEM中，混匀。B液：1.5μl Lipofectamine 2000加到50μl Opti-MEM 中，混匀。室温静置5分钟。

(4)A液和B液混合，手指轻弹混匀，短暂离心，室温静置20分钟。

(5)吸走每个孔中的旧培养基，迅速加入预热的无血清培养基400μl。

(6)将(4)中混合液加入到每个孔里，轻轻摇晃。于37℃培养箱中5-6 小时后用预热的完全培养基换液。

(7)培养箱中培养30h后抽提总RNA。

减血清转染chol-ASO

(1)第一天将5×10⁵RPMI 8226细胞传至10cm培养皿中。使用新配制的1640完全培养基(含6％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)。

(2)用DEPC水配制chol-ASO溶液，储存浓度为500μM；将适量的 chol-ASO加入到500μl无血清1640培养基中，轻轻混匀。

(3)将过夜10cm皿中的细胞移至15ml离心管中1000rpm离心5分钟。弃上清，用3.1ml新的1640完全培养基轻轻将细胞吹散。以500μl/孔加入到六孔板中。

(4)将(2)中含chol-ASO的培养基加入到每个孔中，轻轻混匀，此时血清浓度为3％，于培养箱中37℃培养48h后抽提总RNA。

RNA抽提

(1)弃细胞培养基(悬浮细胞离心后弃上清)，加入1ml Trizol，室温静置10min，用枪头吹打几次并将Trizol转移至1.5ml RNase-free离心管中。

(2)加入200μl(Trizol体积的1/5)的氯仿，上下摇晃混匀，室温静置直至管中液体分层。

(3)4℃12000rpm离心15分钟，样品分为三层：底部为浑浊的有机相，中间层呈白色，上层为无色透明水相。把上层液体(约550μl)小心的转移到新的RNase-free的离心管中，注意不要吸到中间层。

(4)加入等体积的预冷异丙醇，上下反转混匀，4℃静置10min。

(5)4℃、12000rpm离心10分钟，弃上清。此时可以看到白的沉淀。加入1ml 75％乙醇(RNase-free双蒸水配制)洗涤沉淀。

(6)加入1ml 75％乙醇，上下摇晃至白色沉淀飘起来。

(7)4℃12000rpm离心5分钟，弃尽上清。

(8)打开离心管盖子，样品于超净台中吹至看不到白色沉淀。根据沉淀量加入适量DEPC水，待RNA充分溶解后，用Nanodrop测定RNA浓度及纯度，于-80℃保存。

Cy5标记的RT-PCR

(1)逆转录体系如下：

5×RT buffer	4μl
		dNTP混合液(10nM each)	1μl
Oligo(dT)<sub>18</sub>(50μM)	1μl
		总RNA	1μg
M-MLV反转录酶(200U/μl)	1μl
		DEPC水	20μl

(2)PCR仪上42℃50min，65℃15min，获得cDNA

(3)PCR反应体系如下

2×Tag master mix	12.5μl
		上游引物	1μl
下游引物	1μl
		cDNA	1μl(<10％总体积)
双蒸水	9.5μl

(4)PCR程序

注：以上程序适用于扩增PDCD1小基因表达的mRNA产物，检测内源PDCD1的mRNA产物应使用33循环。

(5)反应引物

上游引物(CD279-F)：Cy5-GCGGCCAGGATGGTTCTTA

下游引物(CD279-R)：Cy5-AGAGAACACAGGCACGGCTGAG

对于小基因的PDCD1扩增，两条引物只一条标记cy5，内源PDCD1 表达较低，为增强荧光强度，两条引物都有cy5标记。

(6)将cy5标记的PCR样品加到6％非变性PAGE胶中，100V电压运行4h。

(7)使用G:BOX系统显影，用Image J软件分析条带灰度值，并计算PDCD1外显子3列入百分比(％incl)，公式如下：

外显子3列入百分比＝全长转录本/(全长转录本+Δ3转录本)×100

实施例1：PDCD1小基因(minigene)的构建

PD-1只在少数悬浮细胞中表达，难以在内源基因水平进行大规模的 ASO筛选，因此构建PDCD1小基因是必要的。小基因须满足以下条件： (1)可真实反映内源基因的剪接情况(2)长度较小便于操作(3)可转染到细胞中。本专利中使用的小基因包括：外显子1的后76nt；内含子1由内源基因内含子1的前167nt以及后182nt的两片段加上酶切位点6nt构成，总计355nt；外显子2(360nt)、内含子2(267nt)、外显子3(156nt)、内含子3(214nt)、外显子4(35nt)、内含子4(651nt)都是天然的未经改造的基因组序列；基因组外显子5前59nt作为小基因的最后一个外显子，如图1所示。其中，框为外显子、线为内含子。

小基因质粒分别转染到6种人源细胞：人转移性黑色素瘤C8161细胞、人肝瘤HepG2细胞、恶性黑色素瘤A375细胞、人胚胎肾HEK293细胞和人上皮瘤HeLa细胞，30h后收集细胞，抽提总RNA样品，分析小基因的剪接模式，发现PDCD1基因的主要剪接模式为外显子3的列入或跳跃，其剪接分析如图2所示，即小基因在6种人细胞株中皆发生外显子3可变剪接，但外显子列入百分比有较大差异。Blank:空载体，Minigene:PDCD1 小基因，FL:全长转录本(full-length transcript)，Δ3:外显子3跳跃的转录本(exon 3-skipped transcript)。*为内含子3部分保留的条带；GAPDH的 PCR产物为内参照。结果显示外显子3是盒式外显子(cassette exon)。小基因的剪接模式与内源基因剪接模式一致。

实施例2：剪接调控序列的发现

盒式外显子本身序列通常含有重要的剪接调控元件。构建一系列的序列删除突变体寻找外显子3上的剪接调控元件，每次删除12nt，根据删除的位置命名，分别称作D1-12、D13-24、D25-36、D37-48、D49-60、D61-72、 D73-84、D85-96、D97-108、D109-120、D121-132、D133-144、D145-156。内含子和外显子交界处的几个碱基是剪接位点信号的组成部分，为避开剪接位点损伤造成的影响，在最靠近剪接位点的位置又设计了10nt删除突变体(D3-12和D145-154)使其保留最边上的两个碱基。具体突变体的名称和删除序列及附近序列如下图所示：其中，WT(野生型)显示了外显子3的部分序列，突变体中删除的每个碱基用横杠“-”代替。

突变体和野生型质粒分别转染到A375细胞中，30h后收集细胞，提取总RNA样品，分析小基因外显子3的剪接变化。如图3所示，与野生型相比，共有8个突变体外显子3的剪接发生了明显变化，其中D25-36 和36-48的外显子3列入有轻微增加，而D3-12、D13-24、D73-84、D109-120、 D133-144和D145-156的外显子3列入则明显减少。其中D145-156变化最大(从82％降至1％)，但因为D145-154的外显子3剪接没变化，说明 D145-156的剪接恶化是破坏剪接位点引起的。另外，D13-24和D133-144 外显子3列入百分比分别下降了28％和65％，说明删除的两段序列可能包含促进剪接的序列即外显子剪接增强子(ESE)，是ASO结合的潜在靶点。我们命名D13-24删除位点的ESE为ESE3a，D133-144删除位点的ESE为 ESE3b。并通过柱形图显示各突变体剪接变化的定量结果(n＝3)。％incl: 外显子3列入百分比，*:P<0.05,**:P<0.01,***P<0.001(和野生型相比)，结果如图4所示。

然而，根据软件UNAFold预测，在外显子3的ESE3b附近存在一个较强的RNA颈环(stem-loop)结构，该结构存在于外显子3核苷酸117 位到148位，结构如下所示：

构建了一系列影响该RNA二级结构的PDCD1小基因突变体，对突变体的二级结构进行了预测和最小自由能(ΔG，单位：kcal/mol)计算，同时在A375细胞中测定了各突变体的外显子3列入百分比(n＝3)，结果如下表所示：

可以发现这个RNA二级结构越稳定则PDCD1外显子3的列入百分比越低，提示该结构对外显子3的剪接起抑制作用，可能是因为其靠近5′剪接位点，在空间上阻碍剪接相关蛋白与单链RNA的结合。其具体发现可通过图5、图6获得。图5代表性RNA剪接分析的聚丙烯酰胺胶的荧光图，野生型和突变体小基因的剪接在A375细胞中检测。图6显示了所有小基因二级结构最小自由能和外显子3列入存在高相关性。相关系数 (correlation coefficient)R²＝0.76。

实施例3：ASO步移法初筛(initial ASO-walk)

本专利中设计了16条ASO进行初步筛选，每条长度为15nt，相邻两条ASO之间有5nt重叠，其设计如图7所示。ASO序列与靶点序列根据Watson-Crick原理互补配对，并依据靶点位置命名。第一个ASO的靶点为内含子2的最后5nt和外显子3的前10nt；最后一个ASO的靶点为外显子3最后11nt和内含子3的前4nt。初筛16个ASO的名称依次为 ASOin2-10、ASO6-20、ASO16-30、ASO26-40、ASO36-50、ASO46-60、 ASO56-70、ASO66-80、ASO76-90、ASO86-100、ASO96-110、ASO106-120、 ASO116-130、ASO126-140、ASO136-150、ASO146-in3。使用常规Lipofectamine 2000转染方法将终浓度为100nM的ASO和PDCD1小基因共转染到A375细胞中验证各ASO对外显子3列入的影响，以无ASO (Buffer)和ASO0-0(Con)为对照。30h后收集细胞，抽提总RNA。荧光 RT-PCR结果显示ASO16-30和ASO26-40有较强的剪接抑制作用，结果如图8所示，其中小基因质粒和100nM的ASO共转染A375细胞，PDCD1 小基因转录本由荧光RT-PCR检测。由于从117到148位的序列存在较强的RNA二级结构，作用于该范围内的ASO包括ASO06-120、ASO116-130、 ASO126-140、ASO136-150皆没有效果。

我们对ASO16-30和ASO26-40进行了剂量依赖性分析，采用了6个浓度(0、1、5、10、20、50nM)与小基因共转染A375细胞，用上述方法分析PDCD1外显子3的剪接变化。图9、图10可见，20nM的ASO16-30 已有显著抑制效果；而ASO26-40的效果更加明显，在10nM处理后外显子3的列入百分比下降了27％，20nM处理后降低了一半以上，因此 ASO26-40的抑制效果更好。

接着我们分析了ASO26-40在小基因背景下观察到的效果是否能体现在内源基因上。我们用RPMI 8226细胞进行了检测分析，由于该细胞是悬浮细胞，很难转染核酸，为了解决这一问题我们在ASO26-40的3′端连接了一个胆固醇分子，称作chol-ASO26-40。连接胆固醇的ASO可以被细胞自动吸收，这一技术曾用于体内和体外实验中促进细胞吸收siRNA。我们在RPMI 8226细胞的培养基中加入了一系列浓度的chol-ASO26-40，48小时后收集细胞、纯化RNA，分析RNA剪接的变化。Chol-ASO26-40呈现出明显的剂量依赖效应，在0.5μM浓度时，已能明显抑制内源PDCD1外显子3列入，在2μM浓度时，外显子3列入平均值从90％降至54％，结果如图11所示，不相关ASO0-0作为对照(Con)。

实施例4：ASO微步移法(ASO microwalk)细筛优化

ASO初筛确定了ASO结合的大致靶点区域，由于相邻两个ASO相隔 10nt，初筛中有效ASO并不代表最优ASO，因此本专利中进一步使用了ASO microwalk进行ASO优化。本发明中设计了20mer和18mer两种长度的ASO；同上，根据靶点的位置命名。ASO11-30是microwalk的起始，之后每次向3′端移动一个碱基，到ASO26-45结束。使用常规Lipofectamine 2000方法将终浓度100nM的ASO和小基因共转染到A375细胞中验证 ASO的剪接抑制效果，以无ASO(Buffer)和ASO0-0(Con)为对照，RT-PCR 结果显示，ASO11-30没有明显抑制效果，ASO12-31、ASO13-32、ASO15-34 和ASO14-31效果一般，其他ASO皆有很强的剪接抑制作用，如图12所示。本实验中，小基因质粒和100nM的ASO共转染A375细胞，30h后检测ASO的效果。绝大部分ASO都强烈抑制外显子3列入。

在较低剂量有效的ASO才具有药的特征，低浓度可降低核酸毒性和脱靶效应。本专利选择上文细筛中最有效的6个ASO：ASO16-35、 ASO17-34、ASO17-36、ASO21-40、ASO22-41、ASO23-42与小基因共转染，以不相关ASO0-0为阴性对照，以初筛ASO26-40为有效参照对象。设置了6种浓度梯度(0、1、5、10、50、100nM)进行了剂量依赖效应分析，实验重复了3次，皆获得了相似的结果。PDCD1外显子3列入情况如图13和图14所示，RT-PCR结果显示对照ASO0-0(Con)在各种浓度下皆无作用，而细筛的6个ASO在50-100nM浓度都具有很强的剪接抑制作用，其中ASO22-41的抑制效果最强，在5nM的低浓度时已经具有较强的抑制效果，明显优于初筛ASO26-40和细筛其他ASO。

当然本发明尚有多种具体的实施方式，在此就不一一列举。凡采用等同替换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。

序列表

<110> 苏州安天圣施医药科技有限公司

<120> 在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸及其筛选方法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人PDCD1小基因(human PDCD1 minigene)

<400> 1

gaagtgccca cagcccaccc cagcccctca ccca 34

<210> 2

<211> 2198

<212> DNA

<213> 人PDCD1小基因(human PDCD1 minigene)

<400> 2

gctagcatgc agatcccaca gccgccctgg ccagtcgtct gggcggtgct acaactgggc 60

tggcggccag gatggttctt aggtaggtgg ggtcggcggt caggtgtccc agagccaggg 120

gtctggaggg accttccacc ctcagtccct ggcaggtcgg ggggtgctga ggcgggcctg 180

gccctggcag cccaggggtc ccggagcgag gggtctggag ggacctttca ctctcagtcc 240

ctggcaggtc tcgagaggct ctgcagtgga ggccagtgcc catccccggg tggcagaggc 300

cccagcagag acttctcaat gacattccag ctggggtggc ccttccagag cccttgctgc 360

ccgagggatg tgagcaggtg gccggggagg ctttgtgggg ccacccagcc ccttcctcac 420

ctctctccat ctctcagact ccccagacag gccctggaac ccccccacct tctccccagc 480

cctgctcgtg gtgaccgaag gggacaacgc caccttcacc tgcagcttct ccaacacatc 540

ggagagcttc gtgctaaact ggtaccgcat gagccccagc aaccagacgg acaagctggc 600

cgccttcccc gaggaccgca gccagcccgg ccaggactgc cgcttccgtg tcacacaact 660

gcccaacggg cgtgacttcc acatgagcgt ggtcagggcc cggcgcaatg acagcggcac 720

ctacctctgt ggggccatct ccctggcccc caaggcgcag atcaaagaga gcctgcgggc 780

agagctcagg gtgacaggtg cggcctcgga ggccccgggg caggggtgag ctgagccggt 840

cctggggtgg gtgtcccctc ctgcacagga tcaggagctc cagggtcgta gggcagggac 900

cccccagctc cagtccaggg ctctgtcctg cacctgggga atggtgaccg gcatctctgt 960

cctctagctc tggaagcacc ccagcccctc tagtctgccc tcacccctga ccctgaccct 1020

ccaccctgac cccgtcctaa cccctgacct ttgtgccctt ccagagagaa gggcagaagt 1080

gcccacagcc caccccagcc cctcacccag gccagccggc cagttccaaa ccctggtggt 1140

tggtgtcgtg ggcggcctgc tgggcagcct ggtgctgcta gtctgggtcc tggccgtcat 1200

ctgctcccgg gccgcacgag gtaacgtcat cccagcccct cggcctgccc tgccctaacc 1260

ctgctggcgg ccctcactcc cgcctcccct tcctccaccc ttccctcacc ccaccccacc 1320

tccccccatc tccccgccag gctaagtccc tgatgaaggc ccctggacta agacccccca 1380

cctaggagca cggctcaggg tcggcctggt gaccccaagt gtgtttctct gcagggacaa 1440

taggagccag gcgcaccggc cagcccctgg tgagtctcac tcttttcctg catgatccac 1500

tgtgccttcc ttcctgggtg ggcagaggtg gaaggacagg ctgggaccac acggcctgca 1560

ggactcacat tctattatag ccaggacccc acctccccag cccccaggca gcaacctcaa 1620

tccctaaagc catgatctgg ggccccagcc cacctgcggt ctccgggggt gcccggccca 1680

tgtgtgtgcc tgcctgcggt ctccaggggt gcctggccca cgcgtgtgcc cgcctgcggt 1740

ctctgggggt gcccggccca catatgtgcc tgcctgcggt ctccaggtgt gcccggccca 1800

tgcgtgtgcc cacctgcgag ggcgtggggt gggcttggtc atttcttatc ttacattgga 1860

gacaggagag cttgaaaagt cacattttgg aatcctaaat ctgcaagaat gccagggaca 1920

tttcagaggg ggacattgag ccagagagga ggggtggtgt ccccagatca cacagagggc 1980

agtggtggga cagctcaggg taagcagctc atagtggggg gcccaggttc ggtgccggta 2040

ctgcagccag gctgtggagc cgcgggcctc cttcctgcgg tgggccgtgg ggctgactcc 2100

ctctcccttt ctcctcaaag aaggaggacc cctcagccgt gcctgtgttc tctgtggact 2160

atggggagct ggatttccac aggtaagtac tttctaga 2198

Claims

1.在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸在PDCD1基因表达的mRNA前体剪接水平抑制PD-1信号通路。

2.在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸的作用靶点。

3.如权利要求2所述的在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸的作用靶点，其特征在于：所述反义寡核苷酸的作用靶点存在于所述PDCD1基因的外显子3中，且该作用靶点为PDCD1外显子3上从第12位核苷酸至第45位核苷酸的一段序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求2所述的在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸的作用靶点的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、构建PDCD1小基因；

S2、寻找确认S1中PDCD1小基因中的两个外显子剪接增强子；

S3、初步筛选反义寡核苷酸；

S4、在初步筛选的反义寡核苷酸的基础上进行优化；

其中，所述S3和S4的初步筛选、优化均采用步移法进行。

5.如权利要求4所述的在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸的作用靶点的筛选方法，其特征在于：所述S1中包括如下步骤，

S11、设计引物，将人基因组DNA中PDCD1基因片段克隆到质粒pCI-neo构建PDCD1小基因，并通过测序验证其序列的正确性；所述PDCD1小基因序列为SEQ ID NO.2所示；

S12、将表达PDCD1小基因的质粒用支链聚乙烯亚胺（branched polyethylenimine）试剂转入各种细胞检测其剪接模式，发现外显子3的列入和跳跃是PDCD1小基因的主要可变剪接模式。

6.如权利要求4所述的在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸的作用靶点的筛选方法，其特征在于：所述S2包括如下步骤，

S21、对S1中PDCD1小基因中156nt的外显子3做序列删除分析，每个突变体删除12nt，构建13个突变体，由于第一个和最后一个突变体删除了部分3′和5′剪接位点序列，为避免剪接位点受损造成的影响，在13个突变体的基础上，补充两个不影响剪接位点的删除突变体；

S22、将构建的野生型PDCD1小基因和突变体共16个质粒用支链聚乙烯亚胺法转入A375细胞进行RNA剪接分析，跟野生型相比，其中两个不涉及剪接位点删除的突变体强烈抑制PDCD1外显子3列入，从而确认这两个突变体所删除的序列包含剪接增强子，分别命名为ESE3a和ESE3b。

7.如权利要求4所述的在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸的作用靶点的筛选方法，其特征在于：所述S3包括如下步骤，

S31、首先设计16个15nt长的反义寡核苷酸，靶点覆盖一段长165nt的序列：内含子2最后5nt、整个156nt 外显子3和内含子3的前4nt；每个ASO与前一个ASO存在5nt 的重叠；每个ASO分别与PDCD1小基因共转染到A375细胞，观察ASO对外显子3剪接的影响；从细胞收集的RNA样品用荧光RT-PCR方法分析全长mRNA和缺乏外显子3 mRNA丰度的变化，计算外显子3的列入百分比，结果显示作用靶点为外显子3从16位到40位的一段序列的两条ASO能显著抑制外显子3的列入，且两条所述的ASO作用于ESE3a及其下游序列，靶点序列含64%的C，提示C-丰富序列是剪接增强子的关键序列；

S32、进一步对S31中两个ASO进行剂量依赖性反应分析，对其抑制PDCD1外显子3剪接的抑制强度确认；

S33、选择两个ASO中效果较好的ASO，在人B淋巴细胞来源的RPMI 8226细胞检测并确认其对内源基因PDCD1剪接的影响。

8.如权利要求4所述的在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸的作用靶点的优化方法，其特征在于：所述S4包括如下步骤，

S41、在作用位点覆盖外显子3序列从11位到45位中，设计共20个 20nt和18nt长的ASO，相邻ASO移动一个位置，以100 nM为终浓度，将每个ASO分别与PDCD1小基因共转染，观察ASO对外显子3剪接的影响，除了ASO11-30没有效果，其他ASO都显著抑制外显子3的列入，因此确认12位至45位是ASO的有效作用区域，挑选出六个强烈抑制外显子3列入的ASO；

S42、进一步对以上S41挑选出的ASO进行了剂量依赖效应分析，并以不相关ASO为对照，再次确认六个ASO都能显著抑制外显子3的列入，其中ASO22-41效果最好。

9.如权利要求1所述的在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸在抗癌药物上的应用。

10.如权利要求9所述的在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸在抗癌药物上的应用，其特征在于，应用于抗癌药物中的所述反义寡核苷酸与PDCD1基因表达的mRNA前体结合、抑制外显子3的列入，将使得细胞PD-1蛋白的表达减少而PD-1Δ3的表达增加。