CN117418009A - 环形RNA circLARP1B在肝细胞癌中的应用 - Google Patents

环形RNA circLARP1B在肝细胞癌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种环形RNA circLARP1B在肝细胞癌中的应用，本发明研究发现circLARP1B在转移的肝细胞癌组织中的表达显著高于非转移的肝细胞癌组织，且高表达circLARP1B的患者的生存期更短；干扰肝细胞癌细胞中circLARP1B的表达后，肝细胞癌细胞在动物体内的转移能力下降。基于本发明的研究结果，circLARP1B可以作为肝细胞癌恶性程度的临床诊断或肝细胞癌患者预后预测的检测靶点，还可以作为肝细胞癌治疗药物的研发靶点，为肝细胞癌恶性程度的临床诊断或肝细胞癌患者的预后预测，预治疗肝细胞癌药物的研发以及肝细胞癌的治疗提供重要的参考和应用价值。

Description

环形RNA circLARP1B在肝细胞癌中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种环形RNA circLARP1B在肝细胞癌中的应用。
背景技术
肝癌是常见且恶性程度极高的肿瘤之一，其发病隐蔽、病程进展迅速，死亡率常年居高不下。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的原发性肝癌亚型。根据世界卫生组织的数据，HCC是全球第五大常见肿瘤之一，也是癌症相关死亡的第二大常见原因。HCC在东亚和非洲的发病率和死亡率最高，同时欧洲和美国等地的HCC的发病率和死亡率正在陡然增加。早期HCC患者的5年内生存率高达70％，但是发生转移的HCC患者的平均存活期仅约1.5年，肿瘤转移机制的攻破将大幅提高患者的生存率。
环形RNA(circular RNA，circRNA)是一类共价闭环的单链RNA分子，大多由mRNA前体通过向后剪接(back-splicing)形成，即下游外显子剪接供体位点(splice-donor site)与上游外显子剪接受体位点(splice-acceptor site)共价连接。与线性RNA(linear RNA)相比，环形RNA通常表达量较低，并且表现出细胞特异性和组织特异性。环形RNA不具有3’端多聚腺苷化尾巴(poly-A tail)和5’端帽子结构，不会被核酸外切酶切割，因此环形RNA普遍比线性RNA的稳定性更高。
目前已经有一系列报道证明环形RNA在包括乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝细胞癌等多种肿瘤组织中异常表达，且对于肿瘤的发生发展具有重要作用。在肝细胞癌中，环形RNA以miRNA的海绵、与RNA结合蛋白结合或者翻译多肽等多种方式发挥功能。如circMTO1通过作为miR-9的海绵促进p21的表达来抑制肝细胞癌的进展。CircPABPC1通过降解ITGB1来抑制肝细胞癌的肝内和远端转移。Circβ-catenin通过编码一种小蛋白，进而稳定全长β-catenin以激活Wnt途径，促进肝细胞癌细胞生长和转移。很多在肿瘤中具有功能的环形RNA在人类和小鼠之间并不保守，这在某种程度上阻碍了利用动物模型对环形RNA功能及作用机制的深入研究。鉴定保守的环形RNA在肝细胞癌中的关键作用，对挖掘潜在的治疗肝细胞癌的生物靶点以及肝细胞癌恶性程度诊断指标具有重要意义。
本发明致力于阐明在哺乳动物中保守的环形RNA circLARP1B作为检测靶点或药物靶点在肝细胞癌中的应用，为肝细胞癌恶性程度的临床诊断、肝细胞癌患者的预后预测、治疗肝细胞癌药物的研发以及肝细胞癌的治疗提供重要的参考和应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明有必要提供环形RNA circLARP1B在肝细胞癌中的应用，该环形RNA circLARP1B可以作为肝细胞癌恶性程度的诊断指标，亦或作为肝细胞癌患者预后预测的检测靶点，也可以作为肝细胞癌治疗的药物靶点，为肝细胞癌恶性程度的临床诊断、肝细胞癌患者的预后预测、治疗肝细胞癌药物的研发以及肝细胞癌的治疗提供重要的参考和应用价值。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明第一个方面提供了环形RNA circLARP1B在肝细胞癌中的应用，所述应用为以下a～c中的至少一种：
a：制备诊断肝细胞癌恶性程度的产品；
b：制备肝细胞癌患者预后预测的产品；
c：制备治疗肝细胞癌的药物。
本发明研究发现：在哺乳动物中保守的环形RNA circLARP1B在转移的肝细胞癌组织中的表达显著高于非转移的肝细胞癌组织，且高表达circLARP1B的患者的生存期更短；干扰肝细胞癌细胞中circLARP1B的表达后，肝细胞癌细胞在动物体内的转移能力下降。以上结果说明circLARP1B的高表达，能够促进肝细胞癌细胞在动物体内的转移和原发肝细胞癌的发生发展。故而circLARP1B可以作为诊断肝细胞癌恶性程度的检测靶点，为肝细胞癌恶性程度的诊断提供指标；也可以判断肝细胞癌细胞的转移倾向；亦可以作为肝细胞癌患者预后预测的检测靶点，其表达水平高于阈值，则判断为高风险患者，视为预后不良；此外，circLARP1B还可以作为治疗肝细胞癌的药物靶点，开发抗肝细胞癌的药物，为肝细胞癌的治疗提供新的思路。
需要说明的是，本文中所述的“转移的肝细胞癌组织”来自术后五年内发生复发的肝细胞癌患者；所述的“非转移的肝细胞癌组织”来自术后五年内未发生复发的肝细胞癌患者。
本发明第二个方面提供了检测环形RNA circLARP1B表达水平的检测试剂在制备诊断肝细胞癌恶性程度的产品中的应用。
进一步方案，所述产品为制剂、芯片或试剂盒。该产品由于含有能够检测环形RNAcircLARP1B表达水平的检测试剂，故而能够根据circLARP1B表达量的高低对肝细胞癌的恶性程度进行诊断，同时能够判断肝细胞癌细胞的转移倾向。
进一步方案，所述产品包括能够检测生物样本中环形RNA circLARP1B表达水平的检测试剂，本文中所述的检测试剂可以是通过本领域中常规的检测技术检测circLARP1B表达水平的试剂，具体可提及的实例包括但不限于核酸测序技术、聚合酶链式反应或实时荧光定量聚合酶链式反应。
进一步方案，本文中所述的生物样本为肝细胞癌患者的肿瘤组织。
进一步方案，所述检测试剂为引物或探针。在本发明的一些具体的实施方式中，所述检测试剂为能够特异性扩增circLARP1B的引物。在本发明的另一些具体的实施方式中，所述检测试剂为能够特异性识别circLARP1B的探针。
本发明的第三个方面提供了一种用于肝细胞癌恶性程度诊断的产品，所述产品包括能够检测生物样本中环形RNA circLARP1B表达水平的检测试剂。该产品由于含有能够检测环形RNA circLARP1B表达水平的检测试剂，故而能够根据circLARP1B表达量的高低对肝细胞癌的恶性程度进行诊断，同时可判断肝细胞癌细胞的转移倾向。
进一步方案，所述生物样本为肝细胞癌患者的肿瘤组织。
进一步方案，所述检测试剂为引物或探针，在本发明的一些具体的实施方式中，所述检测试剂为能够特异性识别circLARP1B的探针。
在本发明的另一些具体的实施方式中，所述检测试剂为能够特异性扩增circLARP1B的引物。当所述circLARP1B为人源circLARP1B时，所述引物为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。当所述circLARP1B为鼠源circLARP1B时，所述引物为SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10。
进一步的，所述产品中还包括内参引物，所述内参引物为人源和鼠源通用，所述内参引物为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
进一步方案，所述产品为体外检测产品，具体可提及的实例包括但不限于制剂、芯片或试剂盒。
在本发明的一些典型的实施方式中，所述产品为芯片或试剂盒。
可以理解的是，所述产品还可以根据检测技术的不同而包括相应检测技术所需要的试剂，比如总RNA抽提试剂、逆转录试剂、实时荧光定量聚合酶链式反应试剂等，在此不再一一赘述。
进一步方案，所述芯片或试剂盒执行如下方法：获取受试者的生物样本，并检测所述生物样本中环形RNA circLARP1B的表达水平。
进一步方案，所述方法还包括根据环形RNA circLARP1B的表达水平，判断其表达量是否增高或降低的步骤。
在本发明的一些具体的实施方式中，所述判断根据环形RNA circLARP1B的表达水平的阈值进行，高于阈值则判断为表达量高，低于阈值则判断为表达量低，其中，所述阈值是给定肝细胞癌患者人群，其肿瘤组织中环形RNA circLARP1B的平均表达水平。
通过环形RNA circLARP1B的表达水平判断肝细胞癌的恶性程度，同时可以判断肝细胞癌细胞的转移倾向。
在本发明的另一些具体的实施方式中，该产品用于对肝细胞癌患者预后进行预测，当肝细胞癌患者的肿瘤组织中，环形RNA circLARP1B的表达水平高于阈值时，则判断为高风险患者，视为预后不良。
本发明第四个方面提供了一种治疗肝细胞癌的药物，所述药物包含环形RNAcircLARP1B的抑制剂。
其中，所述的circLARP1B可以为人源circLARP1B，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；也可以是鼠源circLARP1B，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本文中所述的抑制剂是指能够抑制circLARP1B的活性、下调circLARP1B的表达水平或沉默circLARP1B的试剂。
该药物通过抑制circLARP1B的活性、下调circLARP1B的表达水平或沉默circLARP1B能够显著抑制肝细胞癌细胞在动物体内的转移和原发肝细胞癌的发生发展，故而能够对肝细胞癌起到很好的抑制或治疗的作用。
在本发明的一些具体的实施方式中，所述抑制剂为沉默circLARP1B的核酸。
在本发明的一些实施方式中，所述circLARP1B为人源circLARP1B，所述抑制剂包括人源circLARP1B的siRNA sicircLARP1B。
其中，所述人源circLARP1B的siRNA具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。通过SEQID NO.3所示的核苷酸序列沉默人源circLARP1B的效率高、特异性强、毒性小。
进一步方案，所述人源circLARP1B的siRNA是由人源circLARP1B的shRNA介导产生，所述人源circLARP1B的shRNA具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
进一步方案，所述人源circLARP1B的shRNA由慢病毒包载。
在本发明的另一些实施方式中，所述circLARP1B为鼠源circLARP1B，所述抑制剂包括鼠源circLARP1B的siRNA sicircLARP1B。
其中，所述鼠源circLARP1B的siRNA具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。通过SEQID NO.5所示的核苷酸序列沉默鼠源circLARP1B的效率高、特异性强、毒性小。
进一步方案，所述鼠源circLARP1B的siRNA是由鼠源circLARP1B的shRNA介导产生，所述鼠源circLARP1B的shRNA具有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
进一步方案，所述鼠源circLARP1B的shRNA由8型腺相关病毒包载，所述8型腺相关病毒为AAV8。
可以理解的是，所述药物还包括能够与所述抑制剂相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。在此不再一一赘述。
本发明的有益效果：
本发明通过RNA高通量测序技术，比较转移的肝细胞癌组织和非转移肝细胞癌组织中环形RNA的表达谱，进而筛选出转移的肝细胞癌组织中高表达的环形RNA circLARP1B。该环形RNA circLARP1B可以作为肝细胞癌恶性程度的临床诊断或肝细胞癌患者预后预测的检测靶点，还可以作为肝细胞癌治疗的药物靶点，为肝细胞癌恶性程度的临床诊断或肝细胞癌患者的预后预测，治疗肝细胞癌药物的研发以及肝细胞癌的治疗提供重要的参考和应用价值。
附图说明
图1为本发明通过高通量测序筛选出环形RNA circLARP1B的过程及其在基因组上的位置及特异性筛查引物进行PCR以及RNaseR消化验证实验的PCR结果图；其中，图1A左侧的热图展示了转移(Metas)和非转移(Non-Metas)的肝细胞癌肿瘤组织中差异表达的环形RNA；图1A右侧的火山图显示，与非转移的肝细胞癌肿瘤组织相比，转移的肝细胞癌肿瘤组织中有38个环形RNA表达下调，有10个环形RNA表达上调，其中circLARP1B是10个上调的环形RNA中唯一一个跨物种保守的环形RNA(实心表示保守，空心表示非保守)；图1B左侧图示出了环形RNA circLARP1B在基因组上的位置；图1B右侧图示出了在基因组和cDNA中以circLARP1B特异性引物进行PCR扩增结果。
图2为circLARP1B在转移和非转移的肝细胞癌肿瘤组织中的表达情况及生存曲线；其中，图2A显示circLARP1B在转移的肝细胞癌肿瘤组织中的表达显著高于非转移的肝细胞癌肿瘤组织；图2B显示肿瘤组织中高表达circLARP1B的肝细胞癌患者的5年生存率显著低于肿瘤组织中低表达circLARP1B的肝细胞癌患者。
图3示出了体外肝细胞癌细胞系中沉默环形RNA circLARP1B后，细胞在动物体内的转移能力；其中，图3A显示人源circLARP1B的shRNA(shcircLARP1B)显著降低了circLARP1B的表达，但不影响LARP1B mRNA的表达；图3B显示利用裸鼠肺转移模型，人源circLARP1B的shRNA(shcircLARP1B)沉默circLARP1B的细胞与对照组细胞相比，形成肺转移点的数目变少。
图4示出了本发明筛选出来的环形RNA circLARP1B在人鼠中的序列比对率，以及AAV8-shcircLARP1B对小鼠肝脏组织中circLARP1B的沉默效率；其中，图4A示出了人源circLARP1B和鼠源circLARP1B的序列比对结果；图4B示出了鼠源circLARP1B的shRNA(AAV8-shcircLARP1B)显著降低了小鼠肝脏组织中circLARP1B的表达，但不影响LARP1BmRNA的表达。
图5显示小鼠肝脏中circLARP1B沉默之后，DEN诱导的小鼠原发肝细胞癌的发生发展进程；其中，图5A示出了利用AAV8-shcircLARP1B沉默肝脏组织中circLARP1B表达的小鼠与对照组小鼠相比，经过同样的原发性肝癌诱导后，AAV8-shcircLARP1B沉默组小鼠肝脏肿瘤产生的数目和肿瘤大小显著低于对照组；图5B示出了AAV8-shcircLARP1B沉默组小鼠血清中的AFP、ALT和AST水平均显著低于对照组；图5C示出了AAV8-shcircLARP1B沉默组小鼠肝脏组织中Vim的表达量显著低于对照组，Ecad表达量显著高于对照组(Vim和Ecad分别为促肿瘤转移marker和抑肿瘤转移marker)。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。另外，以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商业途径购买获得。
实施例1circLARP1B在转移和非转移的肝细胞癌肿瘤组织中的表达研究
1、肝细胞癌病人组织的收集
组织来源：所有肝细胞癌病人的癌组织都来自于浙江大学医学院附属邵逸夫医院。所有操作均通过浙江大学医学院附属邵逸夫医院伦理委员会的审核，以及病人及家属已经签署知情同意书。
具体操作如下：病人癌组织在手术切除离体后的半个小时之内，分别从这些组织上取下黄豆大小的组织，用DEPC水浸泡过的手术镊子轻轻的夹取放进DEPC水中冲洗除去多余的残留血液；然后放进RNAhold缓冲液(TransGen)中暂时保存。
2、RNA抽提
(1)1×PBS清洗组织后加入1mL Trizol和研磨珠子，于组织破碎仪中剧烈震荡，机械破碎。
(2)加入三氯甲烷进行萃取，一般而言，1mL Trizol对应200μL三氯甲烷，上下颠倒，充分混匀，室温静置5min。将样本放入低温离心机中，4℃、12000g、离心15min，注意配平。
(3)离心结束后小心取出样品，不要上下晃动，此时样品分为上中下三层，下层是红色的有机层，中间是薄薄的白色蛋白层，上层是包含RNA的透明水相。小心吸取上层水相于一个新的1.5mL的EP管中，为了防止沾染到蛋白层可残留少许水相。
(4)加入相等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，放入-20℃冰箱沉淀20min，本步骤亦可以于-80℃冰箱过夜沉淀。
(5)沉淀反应结束后，将样本放入低温离心机中，4℃、12000g、离心15min，注意配平。
(6)当离心结束，正常情况下可以在管底看到白色的RNA沉淀，倾倒上清，加入1mL80％的乙醇，上下颠倒，洗涤RNA沉淀，4℃、7500g、离心5min，注意配平。
(7)离心结束后，倾倒上清，将1.5mL EP管倒扣在RNA实验台上，室温晾干，RNA沉淀完全晾干的时候会由白色转变成透明。
(8)RNA沉淀晾干后，加入39μL的RNase-free水，1μL RNA酶抑制剂，5μL DNase Ibuffer，5μL DNase I，轻弹EP管，使管内溶液充分混匀，放入37℃水浴锅中反应30min，因为RNA单链分子易断裂，故不可剧烈震荡。
(9)DNase I消化后，加入5μL 0.5M EDTA，置于70℃金属浴上终止消化5min。
(10)加入300μL预冷的3M醋酸钠：无水乙醇(1：50)溶液，上下颠倒混匀，放入-20℃冰箱沉淀20min，或者放在-80℃冰箱过夜沉淀。
(11)沉淀反应结束后，将样本放入低温离心机中，4℃、12000g、离心15min，注意配平。
(12)当离心结束，正常情况下可以在管底看到白色的RNA沉淀，倾倒上清，加入1mL80％的乙醇，上下颠倒，洗涤RNA沉淀，4℃、7500g离心5min，注意配平。
(13)离心结束后，倾倒上清，将1.5mL EP管倒扣在RNA实验台上，室温晾干，待RNA沉淀由白色转变成透明。
(14)RNA沉淀晾干后，加入适量的RNase-free水，在冰上静置使RNA沉淀充分溶解，RNA极易溶于水，一般10min后便可溶解均匀。
3、反转录
(1)测量RNA浓度，取500ng的RNA加入到RNase-free的PCR管中，补充RNase-free水至终体积为5μL。
(2)加入1μL dNTPs(10mM)，2μL Oligo d(T)(50TM)或者Random primer(60μM)，轻轻震荡充分混匀，放到70℃金属浴上变性5min，然后冰上静置5min，使引物序列结合到RNA分子上。
(3)加入10μL ABScript II反应预混液(2×)，再加入2μL ABScript II酶预混液(10×)，轻轻震荡充分混匀。
(4)将配置好的反应体系放到PCR仪中，设置如下程序：
(5)PCR仪的反转录程序结束后，得到的cDNA可适当稀释，用于后续的实时定量PCR实验中。
4、实时定量PCR
(1)实时定量PCR体系如下：
(2)上述体系为一个样本的50μL体系，要将此体系加入到96孔板小孔里去，每个复孔15μL，每个样本做3个复孔。
(3)用热封膜将96孔板封好，离心，上机。
(4)按如下程序运行实时PCR：
(5)数据分析：使用Pikoreal software 2.2软件分析数据，使用管家基因ACTBmRNA作为内参，分别用每个样品的circLARP1B的CT值减去ACTB的CT值，得出的差值Δ1和Δ2，然后分别计算2-Δ1和2-Δ2的量值即分别为肝细胞癌组织中circLARP1B相对于ACTB mRNA的表达量。
目的基因circLARP1B的引物序列：
F：CAGAGCGTCCTCAGCCAAGG(SEQ ID NO.7)；
R：TGGATTTCTTTGTCTTGAGC(SEQ ID NO.8)。
内参基因ACTB mRNA的引物序列：
F：CCAACACAGTGCTGTCTGG(SEQ ID NO.11)；
R：GAGTACTTGCGCTCAGGAG(SEQ ID NO.12)。
通过分别抽提转移和非转移的肝细胞癌组织的总RNA，进行高通量测序，共找到了48个差异表达的环形RNA(38个下调，10个上调)，对这48个差异表达的环形RNA进行保守性分析，发现38个下调的环形RNA中有4个是保守的，而circLARP1B是10个上调的环形RNA中唯一保守的环形RNA。circLARP1B位于4号染色体中，是LARP1B基因的第2-4个外显子构成的，全长294nt，并且circLARP1B可以抵抗Rnase R的切割，结果如图1所示。
并且，在90例肝细胞癌病人的临床样本中验证发现，circLARP1B在转移的肝细胞癌肿瘤组织中的表达显著高于非转移的肝细胞癌肿瘤组织，并且肿瘤组织中高表达circLARP1B的肝细胞癌患者的生存率显著低于肿瘤组织中低表达的circLARP1B的肝细胞癌患者，结果可参见图2。
实施例2携带沉默circLARP1B的核酸的慢病毒感染肝细胞癌细胞后，研究细胞在动物体内的转移能力
以下所有动物实验经由中国科学技术大学动物管理委员会批准通过。
1、将针对人源circLARP1B的shRNA核酸序列(SEQ ID NO.4)构建到pLKO.1质粒中，导入感受态大肠杆菌。37℃培养24h扩增，提取质粒，Sanger测序鉴定。
2、用脂质体转染试剂Lipofectamin 2000(Invitrogen美国)将circLARP1B-shRNA(shcircLARP1B)质粒、对照shRNA质粒以及慢病毒包装质粒分别瞬时共转染生长状态较好的70％～80％密度的HEK293T细胞系。具体步骤如下：
(1)准备两个1.5mL的EP管，各加入250μL无血清培养基OPTI-MEM。
(2)向其中一份无血清培养基OPTI-MEM中加入4μg要转染的质粒；向另一份无血清培养基OPTI-MEM中加入10μL Lipofectamine 2000转染试剂。分别充分混匀之后室温静置5min。
(3)将含有Lipofectamine 2000的无血清培养基OPTI-MEM加入到含有质粒的无血清培养基OPTI-MEM中，充分混匀，室温静置20min。
(4)当静置时间接近尾声，取出准备转染的细胞，弃去原有的培养基，加入1500μL新鲜的不含有FBS和青霉素/链霉素双抗的空培养基，并将静置好的500μL转染试剂轻轻的加入到培养皿中，注意滴入过程要轻柔缓慢。十字摇匀法摇晃培养皿，放入37℃培养箱进行培养。
(5)6至8h后，弃去转染培养基，换成新鲜的完全培养基，放入37℃培养箱进行培养。
(6)转染48-72h后，收集含慢病毒的细胞上清。2000rpm离心20min，去除细胞沉淀，用孔径0.45μm的细胞过滤器过滤掉细胞碎片获得高浓度的病毒浓缩液，-80℃贮存备用。
3、慢病毒转染
准备两组处于对数期的细胞密度～70％的肝细胞癌细胞系HepG2细胞，分别标记shCtrl组和shcircLARP1B组。将步骤2中收集的shCtrl和shcircLARP1B慢病毒分别感染对应HepG2细胞，感染6h后更换为新鲜培养基。24h后更换为新鲜的含有5mg/mL puromycin的筛选培养基。根据细胞生长状态，每2～3天更换一次筛选培养基，直到筛选出耐药的稳转细胞群。
4、裸鼠肺转移模型
将肿瘤细胞通过尾静脉注射到裸鼠(BALB/c nude mice，5周龄)体内，制备尾静脉接种转移模型，通过检测肿瘤细胞在裸鼠肺部的成瘤情况，评估细胞在动物体内的转移能力。具体操作如下：
(1)用不含青霉素、链霉素的培养基培养shCtrl稳转HepG2细胞和shcircLARP1B稳转HepG2细胞至对数生长期，用胰酶消化后，重悬在1×PBS中，调整细胞浓度为每毫升1×106个。
(2)将100μL细胞悬液分别注射入BALB/c裸鼠尾静脉，分为shCtrl组和shcircLARP1B组，每组5只。
(3)8周后，处死小鼠，解剖出肺组织，进行H&E染色。H&E染色使用H&E StainingKit(Abcam，ab245880)。
实验结果请参见图3。由图3中的结果可知，沉默circLARP1B可以显著抑制肝细胞癌细胞系HepG2细胞的在裸鼠肺部成瘤。
实施例3靶向沉默circLARP1B后，DEN诱导的小鼠原发肝细胞癌的发生发展进程研究
所有动物实验经由中国科学技术大学动物管理委员会批准通过。
1、构建DEN诱导的原发HCC小鼠模型
2周龄的小鼠(C57BL/6，野生型)，腹腔注射DEN(20mg/kg bodyweight；Sigma)，之后每隔两周腹腔注射一次TCPOBOP(3mg/kg body weight；ApexBio)。
2、AAV8-shcircLARP1B的包装与纯化，具体步骤如下：
(1)把鼠源shcircLARP1B(SEQ ID NO.6)克隆到pAV.GFP载体中。
(2)重组pAV.GFP-shcircLARP1B质粒同pHelper质粒和pAAV-RC8质粒共转染进AAV-293细胞。转染2到3天后重组AAV在包装细胞中组装完成。
(3)从被感染AAV-293细胞中收集AAV病毒颗粒。将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15mL的离心管中；200g，离心3min，离心分离细胞和上清，将上清另外存放，细胞用1mL PBS重悬；将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37℃水浴中反复转移，冻融四次，每次融解后稍加震荡；10000g离心去除细胞碎片，将离心上清转移到一个新离心管中。
(4)浓缩并纯化第(3)步的病毒上清液，原上清液里面包含了许多细胞蛋白分子和碎片，通过2次CsCl密度梯度离心和1次超滤可以去除绝大部分的细胞蛋白和残留的CsCl离子。
(5)测定所得到病毒的滴度。
3、DEN诱导后的第十周，将小鼠分成两组，分别尾静脉注射AAV8(1012vg/mouse)，一组注射AAV8-shcircLARP1B，另一组注射AAV8-shCtrl。AAV8只注射一次，TCPOBOP保持每两周注射一次的频率。
4、DEN注射18周后，所有小鼠禁食12h(21：00-9：00)后取材(9：00AM)(外周血血清和肝脏组织)。H&E染色使用H&E Staining Kit(Abcam，ab245880)；血清alpha-fetoprotein(AFP)检测使用Alpha-fetoprotein ELISA Kit(NJJC，H226-1-1)；血清alaninetransaminase(ALT)检测使用Micro Glutamic-pyruvic Transaminase(GPT/ALT)AssayKit(Solarbio，BC1555)；血清aspartate transaminase(AST)检测使用Micro Glutamic-oxalacetic Transaminase(GOT/AST)Assay Kit(Solarbio，BC1565)；免疫组化使用抗兔免疫组化检测试剂盒(Proteintech，PK10009)，所用抗体分别为anti-Vim(Bioss，bs-8533R)和anti-Ecad(Bioss，bs-10009R)。实验过程中，小鼠均无意外死亡。
实验结果请参见图4。从图4中的结果可知，circLARP1B在人鼠中保守存在，人鼠的circLARP1B序列比对率超过85％，且AAV8-shcircLARP1B可以显著沉默小鼠肝脏组织的circLARP1B。
同时参见图5结果，利用AAV8靶向沉默小鼠肝脏组织circLARP1B后，DEN诱导的肝细胞癌小鼠肝脏组织中的肿瘤数目减少，肿瘤大小减小。外周血血清中的肝细胞癌生物标志物AFP以及肝损伤标志物ALT和AST水平均下降。肝脏肿瘤中的促转移标志物Vim表达量下降，抑转移标志物Ecad表达量上升。
综合实施例1-3的实验结果，说明环形RNA circLARP1B在转移的肝细胞癌肿瘤组织中高表达，且与肝细胞癌患者愈后相关；在人鼠中分别利用核酸序列shcircLARP1B沉默环形RNA circLARP1B后，均抑制了肝细胞癌的转移能力以及发生发展进程。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.环形RNA circLARP1B在肝细胞癌中的应用，其特征在于，所述应用为以下a～c中的至少一种：
a：制备诊断肝细胞癌恶性程度的产品；
b：制备肝细胞癌患者预后预测的产品；
c：制备治疗肝细胞癌的药物。
2.检测环形RNA circLARP1B表达水平的检测试剂在制备诊断肝细胞癌恶性程度的产品中的应用；
优选的，所述产品为制剂、芯片或试剂盒；
优选的，所述产品包括能够检测生物样本中环形RNA circLARP1B表达水平的检测试剂；
优选的，所述生物样本为肝细胞癌患者的肿瘤组织；
优选的，所述检测试剂为引物或探针。
3.一种用于肝细胞癌恶性程度诊断的产品，其特征在于，所述产品包括能够检测生物样本中环形RNA circLARP1B表达水平的检测试剂；
优选的，所述生物样本为肝细胞癌患者的肿瘤组织；
优选的，所述检测试剂为引物或探针；
优选的，所述产品为制剂、芯片或试剂盒。
4.如权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品为芯片或试剂盒。
5.如权利要求4所述的产品，其特征在于，所述芯片或试剂盒执行如下方法：获取受试者的生物样本，并检测所述生物样本中环形RNA circLARP1B的表达水平；
优选的，所述方法还包括根据环形RNA circLARP1B的表达水平，判断其表达量是否增高或降低的步骤。
6.如权利要求5所述的产品，其特征在于，所述判断根据环形RNA circLARP1B的表达水平的阈值进行，高于阈值则判断为表达量高，低于阈值则判断为表达量低；
优选的，所述阈值是给定肝细胞癌患者人群，其肿瘤组织中环形RNA circLARP1B的平均表达水平。
7.一种治疗肝细胞癌的药物，其特征在于，所述药物包含环形RNA circLARP1B的抑制剂。
8.如权利要求7所述的药物，其特征在于，所述circLARP1B为人源circLARP1B或鼠源circLARP1B。
9.如权利要求8所述的药物，其特征在于，所述circLARP1B为人源circLARP1B，所述抑制剂包括人源circLARP1B的siRNA sicircLARP1B，所述人源circLARP1B的siRNA具有SEQID NO.3所示的核苷酸序列；
优选的，所述人源circLARP1B的siRNA是由人源circLARP1B的shRNA介导产生，所述人源circLARP1B的shRNA具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
优选的，所述人源circLARP1B的shRNA由慢病毒包载。
10.如权利要求8所述的药物，其特征在于，所述circLARP1B为鼠源circLARP1B，所述抑制剂包括鼠源circLARP1B的siRNA sicircLARP1B，所述鼠源circLARP1B的siRNA具有SEQID NO.5所示的核苷酸序列；
优选的，所述鼠源circLARP1B的siRNA是由鼠源circLARP1B的shRNA介导产生，所述鼠源circLARP1B的shRNA具有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
优选的，所述鼠源circLARP1B的shRNA由8型腺相关病毒包载，所述8型腺相关病毒为AAV8。
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