KR20210096599A - 기능적 압타머의 선택을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

기능적 압타머의 선택을 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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리론 안나 바살리
엘리노 데비
리론 레비 에프라티
에레즈 라비
오메르 레비
노암 마메트 케뎀
아나스타시아 파즈
네리아 리스
이타이 루시넥.
일라 샤르프
니르 스칼카
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Abstract

본 개시내용은 기능적 압타머 선택을 위한 조성물 및 방법을 기재한다. 특정 실시양태에서, 압타머 라이브러리로부터 기능적 압타머를 식별하기 위해 압타머 클러스터-함유 입자를 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 기능적으로 보강된 압타머 집단이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 맞춤형 암 치료에서 사용하기 위한 압타머를 선택하는 방법 및 종양 전달 시스템을 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 압타머 클러스터-함유 입자, 표적 세포 (예를 들어, 암 세포, 면역 세포 등) 및/또는 세포 기능의 검출 가능한 지시인자 (예를 들어, 아폽토시스의 형광 지시인자, 세포 증식, 유전자 또는 단백질 발현 등)를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.

Description

기능적 압타머의 선택을 위한 방법 및 조성물
관련 출원
본 출원은 20018년 9월 28일에 출원된 미국 가특허출원 일변 번호 62/738,235를 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
압타머는 특이적 표적 분자에 결합할 수 있는 짧은, 단일 가닥 핵산 올리고머 또는 펩티드이다. 압타머는 전형적으로 반복 공정에서 후보의 대규모 무작위 풀로부터 선택된다. 보다 최근에, 세포, 생체내 및 시험관내에서 압타머가 성공적으로 선택되었다.
압타머의 선택, 그의 구조-기능 관계, 및 그의 작용 메커니즘은 모두 불충분하게 이해된다. 100개 초과의 압타머 구조가 해결되고 보고되었긴 하지만, 반복되는 구조적 모티프는 거의 식별되지 않았다.
특정한 표적에 결합할 수 있는 압타머에 대해 압타머 라이브러리를 보강하기 위한 여러 가지의 상이한 압타머 선택 공정이 기재되어 있다. 이러한 결합-보강 풀로부터 식별된 특정 결합 압타머는 나중에 세포에 대한 기능적 효과를 매개할 수 있는 것으로 결정되었다. 그러나, 압타머가 세포에 결합한다는 사실은 그것이 바람직한 세포 기능을 유도할 것이라는 것을 의미하지는 않는다. 예를 들어, 특정한 표적 세포에만 결합하는 많은 압타머는 그 세포의 기능에 어떤 영향도 미치지 않거나, 목적하는 것과 완전히 상이한 세포 기능을 유도할 수 있다. 게다가, 표적 세포에 약하게 결합하고/거나 표적 세포의 표면 상에서 낮은 수준으로 발현되는 항원에 결합하는 기능적 압타머는 기존의 압타머 선택 공정에 의해 보강되지 않을 것이다.
따라서, 목적하는 세포 기능을 매개하는 압타머에 대한 압타머 라이브러리의 직접적인 보강을 허용하는 조성물 및 방법에 대한 관련 기술분야에 큰 필요성이 있다. 중요하게는, 이러한 방법 및 조성물은 관심 표적 세포에 대한 바람직한 기능적 효과를 조정할 수 있는 압타머의 직접적인 식별을 가능하게 할 것이며, 이는 압타머 치료제에 심대한 영향을 미칠 것이다.
바람직한 세포 기능을 유도하는 압타머에 대한 압타머 라이브러리의 직접적인 보강을 용이하게 하는 조성물 및 방법이 본원에 개시된다. 본원에 개시된 바와 같이, 본원에 제공된 방법은 통상적인 결합-기반 압타머 보강 공정과는 상이한 압타머 서열에 대해 압타머 라이브러리를 보강하여, 목적하는 세포 기능을 유도하는 압타머에 대해 고도로 보강된 압타머 풀의 생산을 발생시킨다. 이는, 예를 들어, 압타머 치료제로서 유용한 기능적 압타머의 식별을 용이하게 한다. 또한, 본원에 제공된 방법에 따라 생성된 기능적으로 보강된 압타머 라이브러리, 뿐만 아니라 본원에 제공된 방법을 사용하여 식별된 기능적 압타머가 본원에 제공된다.
특정 측면에서, 기능적으로 보강된 압타머 집단을 생성시키는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 (a) 표적 세포를 압타머 클러스터의 라이브러리가 고정된 복수개의 입자 ("압타머 클러스터 입자")와 접촉시키는 단계이며, 여기서 고정된 압타머 클러스터의 적어도 하나의 서브세트가 표적 세포의 적어도 하나의 서브세트에 결합하여 세포-압타머 클러스터 입자 복합체를 형성하는 것인 단계; (b) 세포-압타머 클러스터 입자 복합체에서 표적 세포 중 적어도 일부가 세포 기능을 경험하기에 충분한 기간 동안 세포-압타머 클러스터 입자 복합체를 인큐베이션하는 단계; (c) 세포 기능을 경험하는 세포-압타머 클러스터 입자 복합체를 검출하는 단계; (d) 다른 세포-압타머 클러스터 입자 복합체로부터 단계 (c)에서 검출된 세포 기능을 경험하는 표적 세포를 포함하는 세포-압타머 클러스터 입자 복합체를 분리하는 단계; 및 (e) 분리된 세포-압타머 클러스터 입자 복합체에서 압타머를 증폭시켜 기능적으로 보강된 압타머 집단을 생성시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (c) 및 (d)는 유세포 분석기를 사용하여 수행된다.
일부 실시양태에서, 세포 기능은 세포 생존력, 세포 사멸 (예를 들어, 아폽토시스, 비-프로그램된 세포 사멸), 세포 증식, 유전자 발현 (예를 들어, 시토카인 발현), 세포 형태학, 세포 활성화, 인산화, 칼슘 가동화, 탈과립화, 세포 이동, 또는 세포 분화이다.
특정 실시양태에서, 표적 세포는 단계 (b) 전 및/또는 동안 세포 기능의 리포터 (예를 들어, 세포 기능의 형광 리포터)와 추가로 접촉된다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 표적 세포를 압타머 클러스터 입자와 접촉시키기 전, 접촉하는 동안, 또는 접촉시킨 후에 세포 기능의 리포터와 접촉된다. 특정 실시양태에서, 표적 세포는 그들이 세포 기능을 경험하는 경우 세포 기능의 리포터 (예를 들어, 형광 단백질)를 발현하도록 변형된다. 특정 실시양태에서, 세포 기능을 경험하는 세포-압타머 클러스터 입자 복합체는 세포 기능의 리포터를 검출함으로써 단계 (c)에서 검출된다. 특정 실시양태에서, 세포 기능의 리포터는 형광 염료이다. 일부 실시양태에서, 세포 기능의 리포터는 발광 염료이다. 일부 실시양태에서, 형광 및/또는 발광 염료는 칼슘 민감성 염료, 세포 추적자 염료, 친유성 염료, 세포 증식 염료, 세포 주기 염료, 대사산물 민감성 염료, pH 민감성 염료, 막 전위 민감성 염료, 미토콘드리아 막 전위 민감성 염료, 또는 산화환원 전위 염료이다. 특정 실시양태에서, 세포 기능의 리포터는 활성화 연관 마커, 산화 스트레스 리포터, 면역원성 세포 사멸 마커, 괴사 마커, 세포 분화에 대한 마커, 혈관신생 마커, 아폽토시스 마커, 자가포식 마커, 세포 생존력 마커, 또는 이온 농도에 대한 마커이다. 특정 실시양태에서, 표적 세포는 세포 기능의 리포터와 접촉되지 않는다. 일부 실시양태에서, 기능을 경험하는 세포는 형태학 및/또는 거동의 변화에 의해 검출된다.
일부 실시양태에서, 방법은 단계 (d)에서 분리된 세포-압타머 클러스터 입자 복합체에서 표적 세포로부터 압타머 클러스터 입자를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포-압타머 클러스터 입자 복합체에서 압타머 클러스터 입자는 세포 용해 및 원심분리를 통해 단계 (d)에서 분리된다.
특정 실시양태에서, 방법은 분리된 압타머 클러스터 입자에서 입자로부터 압타머를 해리시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 분리된 세포-압타머 클러스터 입자에서 압타머는 단계 (e) 전에 HPLC 정제에 의해 단리된다. 일부 실시양태에서, 방법은 단계 (e) 후에 서열결정을 통해 보강된 압타머 집단을 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 단계 (a) 전에 압타머 클러스터 입자를 생성하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 압타머 클러스터 입자를 생성시키는 단계는, (1) 입자 표면 상에 압타머 라이브러리로부터 복수개의 압타머를 고정시키는 단계; 및 (2) 복수개의 고정된 압타머를 입자 표면 상에 국지적으로 증폭시켜 압타머 클러스터 입자를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수개의 고정된 압타머는 에멀젼 PCR을 사용하여 단계 (2)에서 증폭된다.
일부 실시양태에서, 방법은 단계 (f): (i) 단계 (e)의 기능적으로 보강된 압타머 집단으로부터 압타머 클러스터 입자를 형성하는 단계; 및 (ii) 새로 형성된 압타머 클러스터 입자를 사용하여 단계 (a) - (e)를 반복하여 추가의 기능적으로 보강된 압타머 집단을 생성시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (f)는 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 7회, 또는 적어도 8회 반복된다. 일부 실시양태에서, 단계 (f)의 추가의 보강된 압타머 집단은 단계 (a)의 압타머 클러스터의 라이브러리와 비교하여, 예를 들어, 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 또는 2.5배만큼 감소된 서열 다양성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단계 (f)의 각각의 라운드는, 예를 들어, 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 또는 2.5배만큼 세포 기능을 조정하는 압타머에 대해 압타머의 집단을 보강한다.
특정 실시양태에서, 단계 (f)는 연속적인 보강 라운드에서 제한적 조건을 적용하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제한적 조건은, (i) 총 입자 수 감소, (ii) 입자당 압타머 카피 수 감소, (iii) 총 표적 세포 수 감소, 및/또는 (iv) 인큐베이션 기간 감소로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 방법은 오류-발생이 쉬운 폴리머라제를 사용하여 압타머 집단을 증폭시킴으로써 압타머 서열에 오류를 도입하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 압타머 클러스터에서 압타머는 분자 캡을 가진 노출되지 않은 단일 가닥 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 압타머 클러스터는 보존된 서열의 영역 및 무작위화된 서열의 영역을 포함하는 압타머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무작위화된 서열의 영역은 노출되고, 보존된 서열의 영역은 캡핑된다. 특정 실시양태에서, 압타머 클러스터는 화학적 변형 또는 비천연 뉴클레오티드를 포함하는 압타머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 압타머 클러스터는 DNA, RNA, 또는 그의 화학적 변형의 압타머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 압타머 클러스터는 형광 마커 또는 광학 현미경 하에 가시성을 가능하게 하는 요소로 표지된다. 일부 실시양태에서, 광학 현미경 하에 가시성을 가능하게 하는 요소는 나노입자이다.
특정 실시양태에서, 방법에 사용된 압타머 클러스터 입자의 적어도 85% (예를 들어, 적어도 90%, 또는 적어도 95%)는 개별적으로 3개 이하의 고유한 압타머 서열의 다수의 카피를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법에 사용된 압타머 클러스터 입자의 적어도 70% (예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%)는 개별적으로 2개 이하의 고유한 압타머 서열의 다수의 카피를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법에 사용된 압타머 클러스터 입자의 적어도 60% (예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75%)는 개별적으로 1개 이하의 고유한 압타머 서열의 다수의 카피를 포함한다.
일부 실시양태에서, 압타머 클러스터는 적어도 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 103, 104, 또는 105개의 동일한 압타머를 포함한다. 특정 실시양태에서, 압타머 클러스터의 라이브러리는 총괄하여 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 또는 1015개의 구별되는 압타머 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 압타머 클러스터의 라이브러리는 100 내지 1014 구별되는 압타머 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 압타머 클러스터 입자에서 입자는 중합체 비드, 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 아크릴아미드 비드, 고체 코어 비드, 다공성 비드, 상자성 비드, 유리 비드, 제어된 기공 비드, 마이크로비드, 및 나노입자로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 입자는 적어도 하나의 치수에서 약 3 nm 내지 약 30 μm (예를 들어, 약 25 nm 내지 약 30 μm)의 평균 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 입자는 적어도 하나의 치수에서 약 3 nm, 5 nm, 10 nm, 15 nm, 20 nm, 25 nm, 50 nm, 100 nm, 250 nm, 0.5 μm, 2 μm, 5 μm, 10 μm, 20 μm 또는 30 μm의 평균 직경을 갖는다.
특정 실시양태에서, 압타머 클러스터의 라이브러리는 결합 세포 SELEX, 음성 SELEX, 및 시험관내 진화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공정을 통해 이전에 선택된 압타머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 표적 세포에 결합하는 압타머에 대해 압타머의 초기 라이브러리를 보강하여 결합 보강된 압타머 집단을 생성시킨 다음에, 결합 보강된 압타머 집단을 사용하여 단계 (a)의 압타머 클러스터 입자를 생성시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 압타머 클러스터 입자를 생성시키는 단계는, (1) 결합 보강된 압타머 집단으로부터 복수개의 압타머를 입자 표면 상에 고정시키는 단계; 및 (2) 복수개의 고정된 압타머를 입자 표면 상에 국지적으로 증폭시켜 압타머 클러스터 입자를 형성하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 압타머의 초기 라이브러리는 결합 세포 SELEX의 하나 이상의 라운드 (예를 들어, 1 라운드, 2 라운드, 3 라운드, 4 라운드, 5 라운드)를 수행함으로써 보강된다. 일부 실시양태에서, 초기 라이브러리는 단계 (a) 전에 결합 압타머에 대해 보강되지 않는다.
특정 실시양태에서, 단계 (b)에서의 기간은 실질적인 순간이다. 특정 실시양태에서, 기간은 1 마이크로초 내지 약 1개월이다. 특정 실시양태에서, 기간은 약 10분 내지 약 5일이다. 특정 실시양태에서, 기간은 적어도 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 또는 12시간이다. 특정 실시양태에서, 기간은 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 또는 12시간 이하이다. 일부 실시양태에서, 기간은 약 10분 내지 약 1개월이다. 특정 실시양태에서, 기간은 약 1시간 내지 약 24시간이다. 일부 실시양태에서, 기간은 약 1시간 내지 약 2시간이다. 일부 실시양태에서, 기간은 약 1.5시간 내지 약 24시간이다. 특정 실시양태에서, 기간은 약 1.5시간 내지 약 2시간이다.
특정 실시양태에서 표적 세포는 원핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 원핵 세포는 박테리아이다. 특정 실시양태에서, 박테리아는 병원성 박테리아이다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 진핵 세포이다. 특정 실시양태에서, 진핵 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 암 세포 또는 면역 세포이다. 특정 실시양태에서, 포유동물 세포는 환자-유래 세포이다. 일부 실시양태에서, 환자-유래 세포는 환자-유래 암 세포 또는 환자-유래 면역 세포이다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 암 세포 (예를 들어, 환자 유래 암 세포)이다. 표적 세포가 암 세포인 특정 실시양태에서, 세포 기능은 세포 사멸 및/또는 아폽토시스이다. 표적 세포가 암 세포인 일부 실시양태에서, 세포 기능은 면역 체크포인트 단백질 (예를 들어, PD-L1, PD-L2)의 리간드 발현의 조정 (예를 들어, 억제)이다.
특정 실시양태에서, 표적 세포는 면역 세포 (예를 들어, T 세포 (예컨대 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 조절 T 세포), B 세포, 대식세포, 수지상 세포)이다. 표적 세포가 면역 세포인 경우의 일부 실시양태에서, 세포 기능은 면역 단백질 (예를 들어, 세포 표면 면역 단백질, 예컨대 면역 체크포인트 단백질 (예를 들어, PD-1, CTLA-4, 면역 활성화 마커))의 발현의 조정 (예를 들어, 증강 또는 억압)이다. 일부 실시양태에서, 면역 단백질은 시토카인 (예를 들어, 염증성 시토카인)이다. 표적 세포가 면역 세포인 경우의 일부 실시양태에서 기능은 세포 증식이다. 표적 세포가 면역 세포인 경우의 일부 실시양태에서 기능은 세포 사멸 (예를 들어, 아폽토시스)이다. 특정 실시양태에서, 기능은 면역 세포에 의한 증가된 세포독성이다.
특정 실시양태에서, 세포-압타머 클러스터 입자 복합체는, 평균적으로, 표적 세포당 약 1 내지 약 6개의 입자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포-압타머 클러스터 입자 복합체는, 평균적으로, 표적 세포당 약 2 내지 약 4개의 입자를 포함한다.
특정 실시양태에서, 복수개의 세포-압타머 클러스터 입자 복합체는 단계 (b) 동안 단일 반응 부피로 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 세포-압타머 클러스터 입자 복합체는 유세포 분석, 형광 현미경법, 광학 트위저, 마이크로피펫, 미세유체 분리, 미세조작, 또는 단리된 시딩을 통해 단계 (d)에서 분리된다.
특정 측면에서, 본원에 제공된 방법에 의해 생성된 기능적으로 보강된 압타머 집단이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 압타머 집단은 보강 전 압타머 클러스터의 라이브러리에서의 압타머와 비교하여 1.1배 초과의 기능적 보강 (예를 들어, 1.5배 초과의 기능적 보강)을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 세포 기능은 암 세포 사멸 또는 아폽토시스를 촉진한다. 특정 실시양태에서, 세포 기능은 면역 반응의 촉진이다.
특정 측면에서, 본원에 제공된 기능적으로 보강된 압타머 집단으로부터 환자-유래 암 세포의 세포 사멸 또는 아폽토시스를 촉진하는 적어도 하나의 압타머 후보를 선택하는 단계를 포함하는, 맞춤형 암 치료에서 사용하기 위한 압타머를 선택하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 선택된 압타머를 서열결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 서열결정된 압타머를 합성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 압타머는 선택 전에 서열결정되었다. 특정 실시양태에서 선택 공정은 고 처리량 기능적 검정 및 검정 결과의 추가 서열결정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이어서 모든 후보의 데이터가 분석된다 (예를 들어, 집단에서 최상의 기능적 후보를 검출하기 위해).
특정 측면에서, 본원에 제공된 기능적으로 보강된 압타머 집단으로부터 암 세포 사멸 또는 아폽토시스를 촉진하는 적어도 하나의 압타머 후보를 선택하는 단계 및 적어도 하나의 압타머를 종양 국소 전달을 위한 종양 치료와 조합하는 단계를 포함하는, 종양 전달 시스템을 제조하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 방법을 사용하여 기능적으로 보강된 압타머 집단을 제조하는 단계 및 기능적으로 보강된 압타머 집단으로부터 환자-유래 암 세포의 세포 사멸 또는 아폽토시스를 촉진하는 적어도 하나의 압타머 후보를 선택하는 단계를 포함하는, 맞춤형 암 치료에서 사용하기 위한 압타머를 선택하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 압타머는 선택 전에 서열결정되었다. 일부 실시양태에서, 방법은 선택된 압타머를 서열결정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 서열결정된 압타머를 합성하는 것을 추가로 포함한다.
특정 측면에서, (a) 표적 세포로서 대상체로부터의 암 세포를 사용하여 본원에 제공된 방법을 사용하여 기능적으로 보강된 압타머 집단을 제조하는 단계; (b) 기능적으로 보강된 압타머 집단으로부터 암 세포의 세포 사멸 또는 아폽토시스를 촉진하는 적어도 하나의 압타머를 선택하는 단계; 및 (c) 선택된 압타머를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터 암 세포를 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 측면에서, 압타머 클러스터의 라이브러리가 고정된 복수개의 입자 ("압타머 클러스터 입자), 표적 세포, 및, 임의로, 세포 기능의 리포터를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 세포 기능의 리포터는 형광 리포터이다. 특정 실시양태에서, 형광 리포터는 막 완전성 리포터이다. 일부 실시양태에서, 형광 리포터는 캡시드 완전성 리포터이다. 일부 실시양태에서, 형광 리포터는 단백질 완전성 리포터이다. 특정 실시양태에서, 형광 리포터는 단백질 변성 리포터이다. 일부 실시양태에서, 형광 리포터는 세포 사멸 리포터이다. 일부 실시양태에서, 형광 리포터는 산화환원 전위 리포터이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 약 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 또는 108개의 압타머 클러스터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 106 내지 1011개 (예를 들어, 106 내지 109개)의 압타머 클러스터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 각각의 압타머 클러스터는 적어도 약 10, 100, 103, 또는 104개 카피의 압타머를 포함한다. 특정 실시양태에서, 각각의 압타머 클러스터는 약 104 내지 106개 카피의 압타머를 포함한다.
일부 실시양태에서, 압타머 클러스터는 형광 마커로 표지된다. 일부 실시양태에서, 압타머 클러스터는 광학 현미경 하에 가시성을 가능하게 하는 요소로 표지된다. 특정 실시양태에서, 요소는 나노입자이다. 일부 실시양태에서, 압타머 클러스터는 안티센스 가닥으로 표지된다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 표적의 결합 직후 대치되거나 제거된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 효소를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 효소는 리가제, 폴리머라제, 뉴클레아제, 편집 효소, 및/또는 제한 효소이다.
본원에 제공된 조성물의 특정 실시양태에서, 표적 세포는 원핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 원핵 세포는 박테리아이다. 특정 실시양태에서, 박테리아는 병원성 박테리아이다.
본원에 제공된 조성물의 특정 실시양태에서, 표적 세포는 진핵 세포이다. 특정 실시양태에서, 진핵 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 암 세포 또는 면역 세포이다. 특정 실시양태에서, 포유동물 세포는 환자-유래 세포이다. 일부 실시양태에서, 환자-유래 세포는 환자-유래 암 세포 또는 환자-유래 면역 세포이다.
본원에 제공된 조성물의 특정 실시양태에서, 표적 세포는 암 세포 (예를 들어, 환자 유래 암 세포)이다. 표적 세포가 암 세포인 특정 실시양태에서, 세포 기능은 세포 사멸 및/또는 아폽토시스이다. 표적 세포가 암 세포인 일부 실시양태에서, 세포 기능은 면역 체크포인트 단백질 (예를 들어, PD-L1, PD-L2)의 리간드 발현의 조정 (예를 들어, 억제)이다.
본원에 제공된 조성물의 특정 실시양태에서, 표적 세포는 면역 세포 (예를 들어, T 세포 (예컨대 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 조절 T 세포), B 세포, 대식세포, 수지상 세포)이다. 표적 세포가 면역 세포인 일부 실시양태에서, 세포 기능은 면역 단백질 (예를 들어, 세포 표면 면역 단백질, 예컨대 면역 체크포인트 단백질 (예를 들어, PD-1, CTLA-4, 면역 활성화 마커))의 조정 (예를 들어, 증강 또는 억압)이다. 일부 실시양태에서, 면역 단백질은 시토카인 (예를 들어, 염증성 시토카인)이다. 표적 세포가 면역 세포인 일부 실시양태에서 기능은 세포 증식이다. 표적 세포가 면역 세포인 일부 실시양태에서 기능은 세포 사멸 (예를 들어, 아폽토시스)이다.
특정 측면에서, 세포 기능을 조정하는 압타머 집단을 선택하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은, (i) 표지된 압타머 클러스터 입자 (예를 들어, 비드, 예컨대 마이크로비드 또는 나노비드)의 라이브러리를 세포-압타머 클러스터 입자 복합체를 형성하기 위한 조건 하에 및 기간 동안 단일 반응 부피로 표적 세포와 함께 인큐베이션하는 단계; (ii) 목적하는 효과 없이 세포-압타머 클러스터 입자 복합체, 유리 입자 및 유리 세포로부터 변경된 세포 기능을 갖는 세포-압타머 클러스터 입자 복합체를 분할하는 단계; (iii) 변경된 세포 기능을 갖는 세포-압타머 클러스터 입자 복합체로부터 압타머 클러스터 입자를 단리하는 단계; (iv) 상기 입자로부터 압타머를 해리시키는 단계; 및 (v) 개별 압타머 서열을 증폭시켜 기능적으로 보강된 압타머 집단을 제공하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 단계 (i) - (v)를 반복함으로써 (예를 들어, 단계 (i) - (v)를 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 초과의 추가 라운드로 반복함으로써) 압타머 집단의 추가의 기능적 보강의 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 압타머 집단의 추가의 기능적 보강의 단계는 제한적 조건 (예를 들어, 총 입자 수 감소, 입자당 압타머 카피 수 감소, 총 표적 세포 수 감소, 인큐베이션 기간 감소)을 연속적 라운드로 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 보강된 압타머 집단은 인큐베이션 단계로부터 복수개의 압타머에 비해, 적어도 2배 (예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9배)로 감소된 서열 다양성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 보강된 압타머 집단은 인큐베이션 단계로부터 복수개의 압타머에 비해 적어도 10, 102, 103, 104, 105, 또는 106배만큼 감소된 서열 다양성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 스크리닝의 각각의 추가 라운드의 압타머 집단은 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 또는 3배만큼 보강된다. 일부 실시양태에서, 수행된 라운드 수는 적어도 2 (예를 들어, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10)이다. 특정 실시양태에서, 방법은 단계 (v) 후에 서열결정을 통해 보강된 압타머 집단을 식별하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 단계 (i) 전에 표지된 압타머 클러스터 입자의 라이브러리를 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 압타머 클러스터 입자의 라이브러리는, (a) 입자 표면 상에 압타머 라이브러리로부터 복수개의 압타머를 고정시키는 단계; 및 (b) 복수개의 고정된 압타머를 입자 표면 상에 국지적으로 증폭시켜 복수개의 고정된 압타머 클러스터 입자를 형성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
특정 실시양태에서, 압타머 클러스터 입자는 입자 표면 (예를 들어, 비드, 예컨대 마이크로비드 또는 나노비드) 상에 고정된 노출된 단일 가닥 핵산의 클러스터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 노출된 단일 가닥 핵산은 천연 발생이 아니다. 일부 실시양태에서, 압타머 클러스터 입자는 분자 캡을 가진 노출되지 않은 단일 가닥 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자 캡, 3' 캡 및/또는 5' 캡은 특이적 PCR 프라이머 서열에 상보적인 서열을 가진 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 18개 뉴클레오티드 길이)이다. 일부 실시양태에서, 압타머 클러스터는 에멀젼 PCR을 사용하여 제조된다. 일부 실시양태에서, 각각의 압타머 클러스터 입자는 10 미만 (예를 들어, 7 미만, 5 미만, 3 미만, 또는 2 미만)의 상이한 압타머 서열의 클러스터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 압타머 클러스터 입자는 고유한 압타머 서열을 입자의 표면 상에 클러스터 입자로서 다수의 카피로 포함한다. 일부 실시양태에서, 압타머는 펩티드 압타머이다.
일부 실시양태에서, 각각의 압타머 클러스터는 적어도 2 (예를 들어, 적어도 50)개의 동일한 압타머를 포함한다. 특정 실시양태에서, 압타머 클러스터 입자의 라이브러리는 입자 표면 상에 고정된 100 내지 1014개의 구별되는 압타머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 압타머 클러스터 입자의 라이브러리는 입자 표면 상에 고정된 적어도 108개의 구별되는 압타머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 압타머 서열은 보존된 서열의 영역 및 무작위화된 서열의 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 무작위화된 서열은 노출되고, 보존된 서열은 캡핑된다.
특정 실시양태에서, 입자는 중합체 비드, 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 아크릴아미드 비드, 고체 코어 비드, 다공성 비드, 상자성 비드, 유리 비드, 제어된 기공 비드, 마이크로비드, 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 입자는 약 25 nm, 50 nm, 100 nm, 250 nm, 0.5 μm, 2 μm, 5 μm, 10 μm, 20 μm 또는 30 μm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 입자는 약 25 nm, 50 nm, 100 nm, 250 nm, 0.5 μm, 2 μm, 5 μm, 10 μm, 20 μm 또는 30 μm의 적어도 하나의 치수를 갖는다. 일부 실시양태에서, 압타머는 세포 SELEX, 음성 SELEX, 및 시험관내 진화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공정을 통해 이전에 선택된다. 특정 실시양태에서, 압타머 서열은 화학적 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 압타머는 단일 가닥 핵산 (예를 들어, DNA, RNA, 또는 그의 화학적 변형)이다. 일부 실시양태에서, 압타머는 부분-길이 상보성 가닥에 혼성화된 단일 가닥 핵산 (예를 들어, 압타머의 프라이머 서열은 캡핑되고 무작위화된 서열은 단일 가닥임)이다. 일부 실시양태에서, 압타머 서열은 비천연 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 기간은 압타머 클러스터가 표적 세포 상에 효과를 제공할 수 있기에 충분하다. 일부 실시양태에서, 기간은 약 10분 내지 약 5일 (예를 들어, 약 1.5시간 내지 약 24시간, 또는 약 1.5시간 내지 약 2시간)이다.
특정 실시양태에서, 표적 세포는 천연 에피토프를 갖는 전체 세포이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 원핵 세포 (예를 들어, 박테리아)이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 진핵 세포 (예를 들어, 포유동물 세포, 암 세포, 면역 세포, 또는 환자-유래 세포)이다. 특정 실시양태에서, 표적 세포는 실질적으로 고유 환경에 있다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 검출 가능하게 표지된다. 특정 실시양태에서, 표적 세포는 표지된 압타머 클러스터 입자의 라이브러리를 표적 세포와 인큐베이션하기 전에, 인큐베이션하는 동안, 및/또는 인큐베이션한 후에 검출 가능한 표지로 표지된다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 형광 염료 (예를 들어, 칼슘 민감성 염료, 세포 추적자 염료, 친유성 염료, 세포 증식 염료, 세포 주기 염료, 대사산물 민감성 염료, pH 민감성 염료, 막 전위 민감성 염료, 미토콘드리아 막 전위 민감성 염료, 또는 산화환원 전위 염료)이다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 활성화 연관 마커, 산화 스트레스 리포터, 혈관신생 마커, 아폽토시스 마커, 자가포식 마커, 세포 생존력 마커, 또는 이온 농도에 대한 마커이다. 일부 실시양태에서, 조정되는 세포 기능은 세포 생존력, 아폽토시스, 세포 증식, 유전자 발현, 세포 형태학, 세포 활성화, 인산화, 칼슘 가동화, 탈과립화, 세포 이동, 또는 세포 분화이다. 일부 실시양태에서, 조정되는 세포 기능은 아폽토시스이다. 특정 실시양태에서, 조정되는 세포 기능은 아폽토시스이고 표적 세포는 암 세포이다. 일부 다른 실시양태에서, 조정되는 세포 기능은 면역 기능 (예를 들어, 면역 세포 활성화, 면역 세포 억압, 면역 세포 증식; 시토카인 발현, 면역 세포 분화)이고 표적 세포는 면역 세포이다.
특정 실시양태에서, 세포-압타머 클러스터 입자 복합체는 표적 세포당 약 2 내지 4개의 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 압타머 클러스터 입자는 입자당 약 1 내지 6개의 클러스터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수개의 세포-압타머 클러스터 입자 복합체는 단일 반응 부피로 함유된다. 일부 실시양태에서, 분할 단계는 개별 세포로부터의 신호를 정량화한 다음에 변경된 세포 기능을 갖는 세포-압타머 클러스터 입자 복합체를 물리적으로 분할하는 것에 의한다 (예를 들어, 유세포 분석, 형광 현미경법, 광학 트위저, 마이크로피펫, 미세유체 분리, 미세조작, 또는 단리된 시딩을 통해). 일부 실시양태에서, 압타머 클러스터 입자는 세포 용해 및 원심분리를 통해 단리된다. 특정 실시양태에서, 압타머는 입자로부터 해리된 후 HPLC 정제에 의해 단리된다.
특정 측면에서, 암 세포 (예를 들어, 삼중-음성 유방암 세포)의 아폽토시스를 유발하는 압타머가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 압타머는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1-10 중 어느 하나에 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 압타머는 100, 90, 80, 70, 60, 59, 58, 57, 56, 55 또는 54개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 압타머는 RNA, DNA 및/또는 비천연 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 압타머는 화학적으로 변형된다. 일부 실시양태에서, 압타머는 PEG화된다. 특정 실시양태에서, 압타머는 삼중-음성 유방암 세포 (예를 들어, TNBC9) 세포의 아폽토시스를 유도한다. 일부 실시양태에서, 압타머는 서열식별번호: 1-10 중 하나로부터 선택된 서열로 이루어진다.
특정 측면에서, 본원에 제공된 압타머를 포함하는 제약 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제약 조성물의 투여를 포함하는, 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 암은 유방암이다. 일부 실시양태에서, 암은 삼중-음성 유방암이다.
도 1은 본원에 기재된 특정 실시양태에 따른 압타머 라이브러리 합성, 서열결정 및 표적 식별 작업 흐름의 개략도이다.
도 2는 본원에 기재된 결합 SELEX 검정 작업 흐름의 개략도이다. 도 2는 서열식별번호: 11을 개시한다.
도 3은 본원에 기재된 기능적 SELEX 검정 작업 흐름의 개략도이다.
도 4는 본원에 제공된 특정 예시적인 실시양태에 따른 특정 압타머 구조의 개략도이다.
도 5는 예시적인 유세포 분석 게이팅 및 분류 전략이다. 패널 A는 표적 세포와 함께 인큐베이션하기 전에 마이크로비드 클러스터링된 라이브러리의 히스토그램이다. 패널 B는 표적 세포와 함께 인큐베이션된 후에 카스파제-3/7 프로브 (Cas-3/7)와 함께 인큐베이션된 마이크로비드 클러스터링된 라이브러리의 산점도이다.
도 6은 2개의 기능적 프로브를 포함하는 예시적인 유세포 분석 게이팅 및 분류 전략이다. 패널 A는 흑색 직사각형에서 클러스터링된 비드 라이브러리에 결합된 세포를 나타내는 산점도이다. 패널 B는 패널 A에서 흑색 직사각형으로부터의 사건의 산점도이며, 이는 카스파제-3/7 및 미토콘드리아 막 전위 (미토프로브(MitoProbe) 레드(Red))에 대해 프로브된 사건을 나타낸다.
도 7은 표시된 세포의 아폽토시스를 유도하는 압타머에 대한 압타머 라이브러리의 본원에 제공된 예시적인 방법에 의한 기능적 보강을 나타낸다. 각각의 패널의 왼쪽에 있는 막대 그래프는 각각 상이한 기능적 보강 라운드에 대한 카스파제 -3/7 (Cas3/7) 또는 미토콘드리아 막 전위 (DilC1 (5))의 증가에 대한 배수(fold)를 반영한다. 각각의 패널의 우측에 있는 히스토그램은 기능적 보강의 첫 번째 라운드 (흑색) 및 최종 라운드 (회색)의 보강된 라이브러리의 오버레이를 나타낸다. Kasumi-1을 제외하고, 표시된 모든 결과는 결합 SELEX의 세 번째 라운드로부터 시작된 기능적 보강으로부터였다. 표시된 Kasumi-1 결과는 무작위 라이브러리로부터 시작된 기능적 보강 (결합-보강 아님)으로부터였다. 패널 A는 HCT116 인간 결장직장암 세포주로부터의 결과를 나타낸다. 패널 B는 4T1 뮤린 유방암 세포주로부터의 결과를 나타낸다. 패널 C는 CT26 뮤린 결장직장암 세포주로부터의 결과를 나타낸다. 패널 D는 Kasumi-1 인간 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포주로부터의 결과를 나타낸다. 패널 E는 공여자로부터의 AML1 원발성 AML PBMC로부터의 결과를 나타낸다. 패널 F는 공여자로부터의 AML9 원발성 AML PBMC로부터의 결과를 나타낸다. 패널 G는 공여자로부터의 CLL1 원발성 만성 림프구성 백혈병 (CLL) PBMC로부터의 결과를 나타낸다.
도 8은 다수의 라운드의 결합 세포-SELEX 및 기능적 보강으로부터의 압타머 보강된 라이브러리의 일루미나(Illumina) 서열결정 존재도 프로파일(abundance profile)을 나타낸다. x-축은 상이한 선택 라운드를 나타내고, 여기서 "B"는 결합 세포-SELEX 라운드에 상응하고 "F"는 기능적 보강 라운드에 상응한다. 기능적 보강은 결합 세포-SELEX의 라운드 #3으로부터 시작되었다. y-축은 개별 압타머의 상대 존재도를 로그 스케일로 반영한다. 각각의 결합-세포 SELEX 라운드에서 10,000개의 가장 풍부한 압타머는 흑색선으로 표시된다. 각각의 기능적-세포 SELEX 라운드에서 10,000개의 가장 풍부한 압타머는 청색으로 표시된다. 각각의 결합-세포 SELEX 라운드에서 10개의 가장 풍부한 압타머는 실선의 굵은 선으로 표시된다. 각각의 기능적 보강 라운드에서 10개의 가장 풍부한 압타머는 파선으로 표시된다. 패널 A는 AML1 원발성 인간 골수모세포에 대해 수행된 검정으로부터의 프로파일이다. 패널 B는 HCT116 결장직장암 세포주에서 대해 수행된 검정으로부터의 프로파일이다.
도 9는 결합-보강된 마이크로비드 클러스터링된 라이브러리 또는 기능적으로-보강된 클러스터링된 비드 라이브러리를 표적 세포와 함께 인큐베이션 후 카스파제-3/7 활성화의 비교이다. 마이크로비드-결합 세포 및 카스파제-3/7 양성 세포의 퍼센트를 유세포 분석에 의해 측정하였다. 패널 A는 AML1 표적 세포와 함께 보강-라이브러리 인큐베이션 후의 결과를 나타낸다. 패널 B는 HCT116 표적 세포와 함께 보강-라이브러리 인큐베이션 후의 결과를 나타낸다. 각각의 데이터 포인트는 4개의 기술 복제에서 측정되었으며 유의성은 웰치의 일원 t-검정(Welch's one-way t-test)에 의해 계산되었다.
도 10은 기능적으로-보강된 종양파괴성 압타머 라이브러리로부터, 선도(lead) 압타머 후보인 E8의 식별과 관련된 결과를 나타낸다. 패널 A는 다수의 기능적 SELEX 라운드로부터의 서열 존재도 플롯을 나타낸다. 플롯은 각각의 라운드에서 10,000개의 가장 풍부한 압타머 서열 중 1,000개의 압타머 서열의 무작위 샘플을 나타낸다. 10개의 가장 풍부한 압타머 서열은 강조 표시된다. 패널 B는 TNBC9 세포에서 비히클 (V) 및 무작위 올리고뉴클레오티드 (R)와 비교하여 유의한 카스파제-3/7 활성화에 대해 패널 A로부터 10개의 가장 풍부한 압타머의 대표적인 스크리닝이다. 1-10으로 표지된 압타머 ID (E1, E2, ... E10). 패널 C는 음성 MCF10A 표적 세포 (적색)와 비교하여 TNBC9 세포 (청색)에서 세포 사멸을 유도하는 압타머 후보 E8의 선택성을 나타낸다. STA, 스타우로스포린; PAC, 파클리탁셀; Random, 무작위 올리고뉴클레오티드. 패널 D는 MDA-MB-231 세포에 대한 E8의 효과를 나타낸다. 패널 E는 E8 및 PEG화-E8의 용량-반응 곡선을 나타낸다. 패널 F는 마우스 혈청에서 TNBC 세포에 대한 E8의 효과를 나타낸다.
도 11은 동물 모델에서 E8 압타머 후보의 생물학적 분배 및 효능을 입증하는 결과를 제공한다. 패널 A는 MDA-MB-231-유래 종양을 갖는 NOD/SCID 마우스에 주사한 후 0.1시간, 24시간, 및 48시간에 생체내에서 측정된 E8의 형광을 나타낸다. 백색 화살표는 종양 위치를 지시한다. 패널 B는 정맥 주사 3시간 후 종양 부위에서 E8의 체류를 나타낸다 (Ve, 비히클, K, 신장; T, 종양). 삽도 영역은 우측에 확대되어 표시되며, 백색 화살촉은 종양 부위를 지시한다. 패널 C는 48 h 기간에 걸쳐 종양에서 E8 형광 신호의 정량적 측정을 나타낸다. 패널 D는 마우스의 종양 부피 감소에서 E8의 효능을 나타낸다. 별표는 p < 0.05 (n = 8 마리 마우스/군)를 가진 통계적 차이를 나타낸다. 패널 E는 11일차에 희생된 마우스로부터 절제된 종양의 대표적인 사진을 나타낸다. 패널 F-G는 종양-유래 조직 절편에서 카스파제-3 활성의 조직화학적 분석을 나타낸다 (패널 F, 비히클-처리; 패널 G, E8-처리). 패널 H-I는 종양-유래 조직 절편의 TUNEL 분석을 나타낸다 (H, 비히클-처리; I, E8-처리).
도 12는 인간 생체외 기관 배양 (EVOC)에서 E8의 효능을 입증하는 결과이다. 패널 A는 환자 1 (P1)로부터 유래된 조직학적 샘플을 나타낸다. 패널 B는 환자 2 (P2)로부터 유래된 조직학적 샘플을 나타낸다. 등급이 매겨진 병리학적 평가가 2명의 맹검 병리학자에 의해 0-4의 척도로 이루어졌다. 백색 별은 효과가 적어도 3 등급에 도달한 샘플을 나타낸다. Rnd, 무작위.
일반
표적 세포 상에 기능적 효과를 조정하는 압타머의 식별과 관련된 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 표적 세포를 표면 (예를 들어, 마이크로비드, 나노비드를 포함한, 비드와 같은 입자의 표면) 상에 고정된 복수개의 압타머 클러스터에 접촉시키는 단계를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 압타머 클러스터 입자의 라이브러리를 세포-압타머 클러스터 입자 복합체를 형성하기 위한 조건 하에 및 기간 동안 단일 반응 부피로 표적 세포와 함께 인큐베이션하는 단계, 및 세포 기능을 조정하는 압타머 집단을 단리하고 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포 기능을 기능적으로 조정하는 압타머는 표적 세포에 조정되는 기능을 나타내는 검출 가능한 표지 (예를 들어, 형광 염료, 예컨대 칼슘 민감성 염료, 세포 추적자 염료, 친유성 염료, 세포 증식 염료, 세포 주기 염료, 대사산물 민감성 염료, pH 민감성 염료, 막 전위 민감성 염료, 미토콘드리아 막 전위 민감성 염료, 또는 산화환원 전위 염료)를 제공한 다음에, 검출 가능한 표지의 신호를 측정한 후 변경된 세포 기능을 갖는 세포-압타머 클러스터 입자 복합체를 물리적으로 분할함으로써 식별된다. 물리적 분할은, 예를 들어, 유세포 분석, 형광 현미경법, 광학 트위저, 마이크로피펫, 미세유체 분리, 미세조작, 또는 단리된 시딩을 통해서일 수 있다. 이어서 압타머 클러스터 입자는 예를 들어, 세포 용해 및 원심분리를 통해, 세포-압타머 클러스터 입자 복합체로부터 단리될 수 있다. 개별 압타머 서열은 입자로부터 해리되고, 증폭되고 서열결정될 수 있다.
특정 측면에서, 또한 표면 (예를 들어, 입자 표면) 상에 고정된 압타머 클러스터의 생성과 관련된 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 압타머 (예를 들어, 본원에 개시된 압타머 라이브러리로부터의)는 입자 상에 고정된다. 입자는 임의의 물질로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 입자는 플라스틱, 유리, 중합체, 또는 금속으로 제조되어 있다. 특정 실시양태에서, 입자는 중합체 비드, 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 아크릴아미드 비드, 고체 코어 비드, 다공성 비드, 상자성 비드, 유리 비드, 제어된 기공 비드, 마이크로비드 또는 나노입자이다. 일부 실시양태에서, 입자는 약 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 또는 200 마이크로미터의 평균 직경의 적어도 하나의 치수를 갖는다. 일부 실시양태에서, 입자는 차단제, 예컨대, 중합체, 단백질, 올리고, 지질, 및/또는 화학적 기로 코팅된다. 일부 실시양태에서, 입자는 클러스터에 근접한 표적 세포를 결합하기 위해 임의의 길이의 앵커를 함유한다. 앵커는 중합체, 단백질, 올리고, 지질, 및/또는 화학적 기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이어서 국지화 증폭 공정, 예컨대 에멀젼 PCR을 수행하여 압타머 클러스터를 생성시킨다. 상보성 가닥은 단일 가닥 압타머 클러스터를 생성시키기 위해 스트립핑될 수 있다. 이어서 압타머 클러스터 입자는 본원에 제공된 압타머 식별 방법에서 사용할 준비가 된다.
정의
편의상, 명세서, 실시예, 및 첨부된 청구범위에서 사용된 특정 용어가 여기에 수집되어 있다.
단수 형태 "하나"는 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과 (예를 들어, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "압타머"는 단백질 또는 펩티드 표적 또는 표적 세포 상의 지형에 특이적으로 결합할 수 있는 짧은 (예를 들어, 200개 미만의 염기), 단일 가닥 핵산 분자 (ssDNA 및/또는 ssRNA)를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "압타머 클러스터"는 동일한 서열의 국지적으로 고정된 압타머의 집합체 (예를 들어, 적어도 10개)를 지칭한다.
용어 "결합하는" 또는 "상호작용하는"은 예를 들어 생리 조건 하에, 예를 들어, 정전기적, 소수성, 이온성 및/또는 수소-결합 상호작용으로 인한, 두 분자 간의, 예를 들어, 압타머와 표적 간의 안정적인 회합일 수 있는 회합을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 2개의 핵산 서열은 서로 "보완"하거나 또는 이들이 각각의 위치에서 서로 염기 쌍을 형성하는 경우에는 서로에 대해서 "상보적"이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "접촉하는"은 서로 상호작용할 수 있도록 둘 이상의 분자 독립체를 합하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 2개의 핵산 서열은 이들 둘 다가 동일한 핵산 서열에 대해서 상보적인 경우 서로에 "상응한다".
용어 "조정" 또는 "조정하다"는 기능적 특성 및 생물학적 활성 또는 공정 (예를 들어, 효소 활성 또는 수용체 결합)과 관련하여 사용되는 경우, 이러한 특성, 활성도 또는 공정을 상향조절하거나 (예를 들어, 활성화시키거나 자극시키거나), 하향조절하거나 (예를 들어, 억제하거나 억압하거나) 또는 달리 변화시키는 능력을 지칭한다. 특정 경우에, 이러한 조절은 특이적 사건, 예컨대, 신호 전달 경로의 활성화의 발생에 좌우될 수 있고/있거나, 특정한 세포 유형에서만 나타날 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "특이적 결합"은 미리 결정된 표적에 결합하는 압타머의 능력을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 압타머는 비특이적 및 무관한 표적 (그러한 세포가 공정의 표적이 아니고 공정의 음성 표적으로서 사용된 경우에 예를 들어, BSA, 카제인, 또는 무관한 세포, 예컨대, HEK 293 세포 또는 이. 콜라이(E. coli) 세포))에 대한 결합에 대한 그의 KD보다 상당히 더 낮은 (예를 들어, 적어도 2배 더 낮은, 적어도 5배 더 낮은, 적어도 10배 더 낮은, 적어도 50배 더 낮은, 적어도 100배 더 낮은, 적어도 500배 더 낮은 또는 적어도 1000배 더 낮은) KD로 표적에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 압타머는 약 10-6 M 이하, 약 10-7 M 이하, 약 10-8 M 이하, 약 10-9 M 이하, 약 10-10 M 이하, 약 10-11 M 이하, 약 10-12 M 이하, 약 10-13 M 이하, 또는 약 10-14 M 이하의 KD에 상응하는 친화도로 그의 표적에 특이적으로 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이, 2개의 올리고뉴클레오티드의 Tm 또는 용융 온도는 올리고뉴클레오티드/표적의 50%가 결합하고, 올리고뉴클레오티드 표적 분자의 50%가 결합하지 않는 온도이다. 2개의 올리고뉴클레오티드의 Tm 값은 올리고뉴클레오티드 농도 의존적이고, 반응 혼합물 중의 1가, 2가 양이온의 농도에 영향을 받는다. Tm은 본원에 참조로 포함되는, 문헌 [Santa Lucia, J. PNAS (USA) 95:1460-1465 (1998)]에 기재된 바와 같이, 경험적으로 결정되거나 가장 가까운 이웃하는 식을 사용하여 계산될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 이들은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 그의 유사체의 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 공지되거나 공지되지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연결 분석으로부터 정의된 유전자좌들 (유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 합성 폴리뉴클레오티드, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 표지 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다.
압타머 라이브러리
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물은 압타머 라이브러리에 존재하는 압타머로부터 목적하는 특성을 갖는 압타머를 식별하는 것에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 압타머 라이브러리는 구별되는 서열 (예를 들어, 적어도 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 또는 10-15개의 구별되는 서열)을 갖는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 및/또는 RNA)의 집합체이고, 여기서 적어도 핵산 분자의 서브세트는 이들이 표적 단백질, 펩티드, 또는 세포 지형에 특이적으로 결합할 수 있도록 구조화된다. 일부 실시양태에서, 전위 압타머의 임의의 라이브러리가 본원에 제공된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에서 사용되는 압타머 라이브러리는 하기 식 (I)에 따른 서열을 갖는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 및/또는 RNA)를 포함하고/하거나, 그로 이루어지고/지거나 그로 본질적으로 이루어진다:
P1-R-P2 (I),
여기서, P1은 약 10 내지 100개 염기 길이, 약 10 내지 50개 염기 길이, 약 10 내지 30개 염기 길이, 약 15 내지 50개 염기 길이 또는 약 15 내지 30개 염기 길이의 5' 프라이머 부위 서열이고; P2는 약 10 내지 100개 염기 길이, 약 10 내지 50개 염기 길이, 약 10 내지 30개 염기 길이, 약 15 내지 50개 염기 길이 또는 약 15 내지 30개 염기 길이의 3' 프라이머 부위 서열이고; R은 약 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80개 염기 길이 및/또는 약 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 또는 50개 이하의 염기 길이의 무작위로 배치된 염기를 포함하는 서열이다.
한 실시양태에서, R은 약 25%의 A를 포함하는 서열이다. 또 다른 실시양태에서, R은 약 25%의 T를 포함하는 서열이다. 또 다른 실시양태에서, R은 약 25%의 G를 포함하는 서열이다. 또 다른 실시양태에서, R은 약 25%의 C를 포함하는 서열이다. 또 다른 실시양태에서, R은 약 25%의 A, 약 25%의 T, 약 25%의 G 및 약 25%의 C를 포함하는 서열이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에서 사용되는 압타머 라이브러리는 하기 식 (I)에 따른 서열을 갖는 핵산 분자 (DNA 및/또는 RNA)를 포함하고/하거나, 그로 이루어지고/지거나 그로 본질적으로 이루어진다:
P1-R"-P2 (I),
여기서, P1은 약 10 내지 100개 염기 길이, 약 10 내지 50개 염기 길이, 약 10 내지 30개 염기 길이, 약 15 내지 50개 염기 길이 또는 약 15 내지 30개 염기 길이의 5' 프라이머 부위 서열이고; P2는 약 10 내지 100개 염기 길이, 약 10 내지 50개 염기 길이, 약 10 내지 30개 염기 길이, 약 15 내지 50개 염기 길이 또는 약 15 내지 30개 염기 길이의 3' 프라이머 부위 서열이며; R"는 편향된 혼합물로부터의 무작위로 배치된 염기 또는 반복적 또는 편향된 스트링을 가진 무작위 스트링의 임의의 조합물을 포함하는 약 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80개 염기 길이 및/또는 약 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 또는 50개 이하의 염기 길이 서열이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에서 사용되는 압타머 라이브러리는 하기 식 II (예시적인 개략도는 도 4A에 제공됨)에 따른 서열을 갖는 핵산 분자 (DNA 및/또는 RNA)를 포함하고/하거나, 그로 이루어지고/지거나 그로 본질적으로 이루어진다:
P1-S1-L1-S1*-S2-L2-S2*-P2 (II),
여기서,
P1은 약 10 내지 100개 염기 길이, 약 10 내지 50개 염기 길이, 약 10 내지 30개 염기 길이, 약 15 내지 50개 염기 길이 또는 약 15 내지 30개 염기 길이의 5' 프라이머 부위 서열이고; P2는 약 10 내지 100개 염기 길이, 약 10 내지 50개 염기 길이, 약 10 내지 30개 염기 길이, 약 15 내지 50개 염기 길이 또는 약 15 내지 30개 염기 길이의 3' 프라이머 부위 서열이며; S1 및 S2는 각각 독립적으로 적어도 하나의 염기 (예를 들어, 약 4 내지 40개 염기 길이 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 염기 길이)의 줄기 영역 서열이고; S1*은 S1에 대한 상보성 서열이며; S2*는 S2에 대한 상보성 서열이고; L1 및 L2는 각각 독립적으로 적어도 하나의 염기 (예를 들어, 약 1 내지 50개 염기 길이 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 염기 길이)의 루프 영역 서열이며; S1-L1-S1*-S2-L2-S2*는 총괄하여 약 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80개 염기 길이 및/또는 약 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 또는 50개 이하의 염기 길이이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에서 사용되는 압타머 라이브러리는 하기 식 III (예시적인 개략도는 도 4B에 제공됨)에 따른 서열을 갖는 핵산 분자 (DNA 및/또는 RNA)를 포함하고/하거나, 그로 이루어지고/지거나 그로 본질적으로 이루어진다:
P1-S1-L1-S2-L2-S2*-L1-S1*-P2 (III),
여기서,
P1은 약 10 내지 100개 염기 길이, 약 10 내지 50개 염기 길이, 약 10 내지 30개 염기 길이, 약 15 내지 50개 염기 길이 또는 약 15 내지 30개 염기 길이의 5' 프라이머 부위 서열이고; P2는 약 10 내지 100개 염기 길이, 약 10 내지 50개 염기 길이, 약 10 내지 30개 염기 길이, 약 15 내지 50개 염기 길이 또는 약 15 내지 30개 염기 길이의 3' 프라이머 부위 서열이고;
S1 및 S2는 각각 독립적으로 적어도 하나의 염기 (예를 들어, 약 4 내지 40개 염기 길이 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 염기 길이)의 줄기 영역 서열이고; S1*은 S1에 대한 상보성 서열이며; S2*는 S2에 대한 상보성 서열이고;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 적어도 하나의 염기 (예를 들어, 약 1 내지 50개 염기 길이 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 염기 길이)의 루프 영역 서열이고;
S1-L1-S2-L2-S2*-L1-S1*는 총괄하여 약 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80개 염기 길이 및/또는 약 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 또는 50개 이하의 염기 길이이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에서 사용되는 압타머 라이브러리는 하기 식 IV (예시적인 개략도는 도 4C에 제공됨)에 따른 서열을 갖는 핵산 분자 (DNA 및/또는 RNA)를 포함하고/하거나, 그로 이루어지고/지거나 그로 본질적으로 이루어진다:
P1-Lib-M1/M2-D-M1/M2*-Lib-P2 (IV),
여기서,
P1은 약 10 내지 100개 염기 길이, 약 10 내지 50개 염기 길이, 약 10 내지 30개 염기 길이, 약 15 내지 50개 염기 길이 또는 약 15 내지 30개 염기 길이의 5' 프라이머 부위 서열이고; P2는 약 10 내지 100개 염기 길이, 약 10 내지 50개 염기 길이, 약 10 내지 30개 염기 길이, 약 15 내지 50개 염기 길이 또는 약 15 내지 30개 염기 길이의 3' 프라이머 부위 서열이고;
Lib은 (i) R; (ii) R"; (iii) S1-L1-S1*-S2-L2-S2*; 및 (iv) S1-L1-S2-L2-S2*-L1-S1*로부터 선택된 식을 갖는 서열이고;
R은 약 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80개 염기 길이 및/또는 약 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 또는 50개 이하의 염기 길이의 무작위로 배치된 염기를 포함하는 서열이며;
R"는 편향된 혼합물로부터의 무작위로 배치된 염기 또는 반복적 또는 편향된 스트링을 가진 무작위 스트링의 임의의 조합물을 포함하는 약 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80개 염기 길이 및/또는 약 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 또는 50개 이하의 염기 길이의 서열이고;
S1 및 S2는 각각 독립적으로 적어도 하나의 염기 (예를 들어, 약 4 내지 40개 염기 길이 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 염기 길이)의 줄기 영역 서열이고; S1*은 S1에 대한 상보성 서열이며; S2*는 S2에 대한 상보성 서열이고;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 적어도 하나의 염기 (예를 들어, 약 1 내지 50개 염기 길이 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 염기 길이)의 루프 영역 서열이고;
여기서 S1-L1-S1*-S2-L2-S2*는 총괄하여 약 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80개 염기 길이 및/또는 약 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 또는 50개 이하의 염기 길이고;
D는 적어도 하나의 염기 (예를 들어, 약 1 내지 20개 염기 길이 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 염기 길이)를 포함하는 스페이서 서열이고;
M1은 서열의 가닥이 상보성 도메인을 함유하는 또 다른 가닥과 상호작용하는 것을 가능하게 하는 약 10 내지 18개 염기 길이 또는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개 염기 길이의 다량체-형성 도메인 서열이며;
M2는 M1 서열의 가닥과 상호작용하는 가닥을 포함하는 M1의 상보성 도메인이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에서 사용되는 압타머 라이브러리는 하기 식 V에 따른 서열을 갖는 핵산 분자 (DNA 및/또는 RNA) (예시적인 개략도는 도 4D에 제공됨)를 포함하고/하거나, 그로 이루어지고/지거나 그로 본질적으로 이루어진다:
P1-Lib-T*-Lib-P2 (V),
상기 식에서,
P1은 약 10 내지 100개 염기 길이, 약 10 내지 50개 염기 길이, 약 10 내지 30개 염기 길이, 약 15 내지 50개 염기 길이 또는 약 15 내지 30개 염기 길이의 5' 프라이머 부위 서열이고; P2는 약 10 내지 100개 염기 길이, 약 10 내지 50개 염기 길이, 약 10 내지 30개 염기 길이, 약 15 내지 50개 염기 길이 또는 약 15 내지 30개 염기 길이의 3' 프라이머 부위 서열이고;
Lib는 (i) R; (ii) R"; (iii) S1-L1-S1*-S2-L2-S2*; 및 (iv) S1-L1-S2-L2-S2*-L1-S1*로부터 선택된 식을 갖는 서열이고;
R은 약 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80개 염기 길이 및/또는 약 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 또는 50개 이하의 염기 길이의 무작위로 배치된 염기를 포함하는 서열이고;
R"는 편향된 혼합물로부터의 무작위로 배치된 염기 또는 반복적 또는 편향된 스트링을 가진 무작위 스트링의 임의의 조합물을 포함하는 약 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80개 염기 길이 및/또는 약 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 또는 50개 이하의 염기 길이의 서열이고;
S1 및 S2 는 각각 독립적으로 적어도 하나의 염기 (예를 들어, 약 4 내지 40개 염기 길이 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 염기 길이)의 줄기 영역 서열이고; S1*은 S1에 대한 상보성 서열이며; S2*는 S2에 대한 상보성 서열이고;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 적어도 하나의 염기 (예를 들어, 약 1 내지 50개 염기 길이 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 염기 길이)의 루프 영역 서열이고;
여기서, S1-L1-S1*-S2-L2-S2*는 총괄하여 약 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80개 염기 길이 및/또는 약 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 또는 50개 이하의 염기 길이이고;
T는 Lib 서열 또는 T*의 임의의 부분과 쌍을 형성하는 왓슨/크릭(Watson/Crick) 또는 후그스틴(Hoogsteen) 염기에 의해 결합되는 제2 가닥이고, 여기서 가닥은 (예를 들어, 압타머에 대한 기능적 모이어티의 부착을 용이하게 하기 위해) 그의 5' 및 3' 말단부 상에 쌍형성되지 않은 도메인을 임의로 함유하고;
T*는 (예를 들어, 약 4 내지 40개 염기 길이 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 염기 길이의) 전용 도메인 서열이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에서 사용되는 압타머는 압타머 라이브러리는 다음으로부터 선택된 서열을 갖는 핵산 분자 (DNA 및/또는 RNA)를 포함하고/하거나, 그로 이루어지고/지거나 그로 본질적으로 이루어진다:
P1-R-P1*, P1-S1-R-S1-P2, 및 P1-R-S1-R-S1-R-P2
상기 식에서,
P1은 약 10 내지 100개 염기 길이, 약 10 내지 50개 염기 길이, 약 10 내지 30개 염기 길이, 약 15 내지 50개 염기 길이 또는 약 15 내지 30개 염기 길이의 5' 프라이머 부위 서열이고; P2는 약 10 내지 100개 염기 길이, 약 10 내지 50개 염기 길이, 약 10 내지 30개 염기 길이, 약 15 내지 50개 염기 길이 또는 약 15 내지 30개 염기 길이의 3' 프라이머 부위 서열이고; P1*은 P1에 대한 상보성 서열이고;
R은 약 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80개 염기 길이 및/또는 약 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 또는 50개 이하의 염기 길이의 무작위로 배치된 염기를 포함하는 서열이고;
S1은 적어도 하나의 염기 (예를 들어, 약 4 내지 40개 염기 길이 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 염기 길이)의 줄기 영역 서열이다;
상기 식의 일부 실시양태에서, R, P, 또는 S는 CpG 섬(island) 및/또는 G-4중 서열을 포함한다.
상기 식의 일부 실시양태에서, R은 약 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80개 염기 길이 및/또는 약 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 또는 50개 이하의 염기 길이의 임의의 무작위 혼합물 (예를 들어, 정규 염기의 경우, 25%의 A, 25%의 T, 25%의 G, 25%의 C)로부터 무작위로 배치된 염기이다.
상기 식의 한 실시양태에서, R은 약 25%의 A를 포함하는 서열이다. 또 다른 실시양태에서, R은 약 25%의 T를 포함하는 서열이다. 또 다른 실시양태에서, R은 약 25%의 G를 포함하는 서열이다. 또 다른 실시양태에서, R은 약 25% C를 포함하는 서열이다. 또 다른 실시양태에서, R은 약 25%의 A, 약 25%의 T, 약 25%의 G, 및 약 25% C를 포함하는 서열이다.
상기 식의 일부 실시양태에서, R"는 편향된 혼합물 (예를 들어, 정규 염기의 경우, 염기당 25%로부터 벗어난 임의의 혼합물)로부터 무작위로 배치된 염기를 포함하는 서열이다. 일부 실시양태에서, R"는 약 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75%의 A를 포함하는 서열이다. 일부 실시양태에서, R"는 약 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% T를 포함하는 서열이다. 일부 실시양태에서, R"는 약 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% C를 포함하는 서열이다. 일부 실시양태에서, R"는 약 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% G를 포함하는 서열이다. 일부 실시양태에서, R"는 무작위 스트링 (스트링은 단일 염기를 포함하는 임의의 서열이다)과 반복적 또는 편향된 스트링의 임의의 조합물을 포함하는 서열이다.
상기 식의 일부 실시양태에서, R"는 편향된 혼합물 (예를 들어, 정규 염기의 경우, 염기당 25%로부터 벗어난 임의의 혼합물)로부터 무작위로 배치된 염기; 또는 약 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80개 염기 길이 및/또는 약 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 또는 50개 이하의 염기 길이의 무작위 스트링 (스트링은 단일 염기를 포함하는 임의의 서열이다)과 반복적 또는 편향된 스트링의 임의의 조합물이다.
상기 식의 일부 실시양태에서, S1은 적어도 1개의 염기 또는 그 초과의 줄기 영역 서열이다. 다른 실시양태에서, S1은 약 4 내지 40개 염기 길이 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 염기 길이의 줄기 영역 서열이다.
상기 식의 일부 실시양태에서, S2는 적어도 1개의 염기 또는 그 초과의 줄기 영역 서열이다. 다른 실시양태에서, S2는 약 4 내지 40개 염기 길이 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 염기 길이의 줄기 영역 서열이다.
상기 식의 일부 실시양태에서, L1은 적어도 1개의 염기의 루프 영역 서열이다. 다른 실시양태에서, L1은 약 1 내지 50개 염기 길이 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 염기 길이의 루프 영역 서열이다.
상기 식의 일부 실시양태에서, L2는 적어도 1개의 염기의 루프 영역 서열이다. 다른 실시양태에서, L2는 약 1 내지 50개 염기 길이 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 염기 길이의 루프 영역 서열이다.
상기 식의 일부 실시양태에서, T는 그의 5' 말단부 및 3'말단부 상에 쌍형성되지 않은 도메인을 포함할 수 있거나, 그것은 패드락 테일(padlock tail) (예를 들어, 라이브러리와 쌍형성한 두 도메인 사이의 루프)일 수 있다. 본 개시내용의 압타머는 임의의 수의 줄기 및 루프, 및 줄기와 루프로 구성된 다른 구조 (예를 들어, 헤어핀, 벌지(bulge) 등)를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 압타머 내의 루프는, 라이브러리 주축과 직교하는 줄기를 형성하는 안정적인 루프-루프 WC 쌍형성을 형성하기 위해 이식된 염기를 함유한다. 다른 실시양태에서, 압타머 내의 2개의 루프는 함께 직교하는 줄기를 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 압타머 내의 루프는 라이브러리 주축을 따르는 기존의 줄기와 안정적인 후그스틴 쌍형성을 형성하기 위해 이식된 염기를 함유한다. 다른 실시양태에서, 압타머 내의 루프는 압타머 내의 임의의 줄기와 후그스틴 쌍형성을 형성할 수 있다.
상기 식의 일부 실시양태에서, 압타머 서열은 하나 이상의 다량체-형성 도메인을 추가로 함유한다.
상기 식의 일부 실시양태에서, 압타머 서열은 (예를 들어, 약 1 내지 20개 염기 길이 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 염기 길이의) 하나 이상의 스페이서를 추가로 함유한다.
본 개시내용의 압타머는 여러 가지의 방식으로 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 압타머는 화학적 합성을 통해 제조된다. 또 다른 실시양태에서, 압타머는 효소적 합성을 통해 제조된다. 한 실시양태에서, 효소적 합성은 주형을 사용하거나 사용하지 않으면서, 뉴클레오티드를 첨가하여 프라이머를 연장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 압타머는 k-량체 (예를 들어, k≥2 염기)를 함께 어셈블리함으로써 제조된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 압타머는 DNA, RNA, 및 그의 자연 및/또는 합성 유사체의 임의의 조합물을 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 압타머는 DNA를 포함한다. 한 실시양태에서, 압타머는 RNA를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용의 압타머는 5' 말단부, 3' 말단부 상에, 또는 내부에 임의의 변형을 함유할 수 있다. 압타머의 변형은 스페이서, 인산화, 링커, 접합 화학, 형광단, 소광제, 광반응성, 및 변형된 염기 (예를 들어, LNA, PNA, UNA, PS, 메틸화, 2-O-메틸, 할로겐화, 초염기, 이소-dN, 반전 염기, L-리보스, 백본으로서의 다른 당류 등)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 압타머는 5' 말단부, 3' 말단부 상에 외부, 비핵산 분자에, 또는 내부에 접합될 수 있다. 비핵산 분자의 비제한적인 예는 아미노산, 펩티드, 단백질, 소분자 약물, 모노사카라이드 및 폴리사카라이드, 지질, 항체 및 항체 단편, 또는 그의 조합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 압타머는 생물학적 기능을 갖는 임의의 도메인을 함유할 수 있다. 본원에 기재된 압타머의 생물학적 기능의 비제한적인 예는 RNA 전사에 대한 주형으로서 작용하는 것, 단백질에 결합하고/하거나, 이를 인식하고/하거나, 그의 활성도를 조정하는 것, 전사 인자에 결합하는 것, 특수화된 핵산 구조 (예를 들어, Z-DNA, H-DNA, G-quad 등), 및 엑소- 및 엔도뉴클레아제에 특이적인 제한 효소, 재조합 부위, 편집 부위, 또는 siRNA에 대한 효소적 기질로서 작용하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 압타머는 적어도 1종의 단백질의 활성도를 조정한다. 또 다른 실시양태에서, 압타머는 적어도 1종의 단백질의 활성도를 억제한다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용의 압타머는 몇몇 공지된 방법 중 어느 하나에 의해 제조된 핵산 나노구조 내의 통합을 위한 임의의 도메인을 함유할 수 있다 ([Shih et al., Nature 427:618-621 (2004); Rothemund, Nature 440:297-302 (2006); Zheng et al., Nature 461:74-77 (2009); Dietz et al., Science 325:725-730 (2009); Wei et al., Nature 485:623-626 (2012); Ke et al., Science 338:1177-1183 (2012); Douglas et al., Science 335:831-834 (2012)], 상기 문헌들 각각은 본원에 참조로 포함된다). 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 압타머는 분자 로직 및 계산의 기능을 제공하는 임의의 도메인을 함유할 수 있다 ([Seelig et al., Science 314:1585-1588 (2006); Macdonald et al., Nano Lett 6:2598-2603 (2006); Qian et al., Nature 475:368-372 (2011); Douglas et al., Science 335:831-834 (2012); Amir et al., Nat Nanotechnol 9:353-357 (2014)], ], 상기 문헌들 각각은 본원에 참조로 포함된다).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 압타머는 음성 선택 대 음성 대조군 표적 (생체내 또는 생체외에서, 진핵 세포 또는 원핵 세포, 바이러스 또는 바이러스 입자, 단백질, 분자, 조직 또는 전체 유기체를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 1회 이상의 주기를 경험한다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 압타머는 양성 선택 대 표적 (예를 들어, 생체내 또는 생체외에서, 진핵 세포 또는 원핵 세포, 바이러스 또는 바이러스 입자, 분자, 조직 또는 전체 유기체)의 1회 이상의 주기를 겪는다.
본 개시내용의 압타머는 용액에 있거나 고체상 (예를 들어, 표면, 입자, 수지, 매트릭스 등)에 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 압타머는 표면에 부착된다. 한 실시양태에서, 표면은 입자 표면이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 압타머는 압타머 라이브러리에서 합성된다. 본 개시내용의 압타머 라이브러리는 여러 가지의 방식으로 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 압타머 라이브러리는 화학적 합성을 통해 제조된다. 또 다른 실시양태에서, 압타머 라이브러리는 효소적 합성을 통해 제조된다. 한 실시양태에서, 효소적 합성은 주형을 사용하거나 사용하지 않으면서, 뉴클레오티드를 첨가하여 프라이머를 연장시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 압타머 라이브러리에서 합성된 압타머는 DNA, RNA, 및 그의 자연 및/또는 합성 유사체의 임의의 조합물을 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 압타머 라이브러리에서 합성된 압타머는 DNA를 포함한다. 한 실시양태에서, 압타머 라이브러리에서 합성된 압타머는 RNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 압타머 라이브러리에서 합성된 압타머는 10K개 종 (K≥2)의 핵산 (예를 들어, DNA, RNA, 자연 또는 합성 염기, 염기 유사체, 또는 그의 조합물) 수집체이고, 종당 Z 카피를 갖는다 (1≤Z≤K-1)이다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용의 압타머 라이브러리에서 합성된 압타머는 5' 말단부, 3' 말단부 상에, 또는 내부에 임의의 변형을 함유할 수 있다. 압타머의 변형은 스페이서, 인산화, 링커, 접합 화학, 형광단, 소광제, 광반응성 변형, 및 변형된 염기 (예를 들어, LNA, PNA, UNA, PS, 메틸화, 2-O-메틸, 할로겐화, 초염기, 이소-dN, 반전 염기, L-리보스, 백본으로서의 다른 당류)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 압타머 라이브러리에서 합성된 압타머 5' 말단부, 3' 말단부 상에 외부, 비핵산 분자에, 또는 내부에 접합될 수 있다. 비핵산 분자의 비제한적인 예는 아미노산, 펩티드, 단백질, 소분자 약물, 모노사카라이드 및 폴리사카라이드, 지질, 항체 및 항체 단편, 또는 그의 조합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
압타머 라이브러리에서 합성된 압타머는 생물학적 기능을 갖는 임의의 도메인을 함유할 수 있다. 본원에 기재된 압타머의 생물학적 기능의 비제한적인 예는 RNA 전사에 대한 주형으로서 작용하는 것, 단백질에 결합하고/하거나, 이를 인식하고/하거나, 그의 활성도를 조정하는 것, 전사 인자에 결합하는 것, 특수화된 핵산 구조 (예를 들어, Z-DNA, H-DNA, G-quad 등), 및 엑소- 및 엔도뉴클레아제에 특이적인 제한 효소, 재조합 부위, 편집 부위, 또는 siRNA에 대한 효소적 기질로서 작용하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 압타머 라이브러리에서 합성된 압타머는 적어도 1종의 단백질의 활성도를 조정한다. 또 다른 실시양태에서, 압타머 라이브러리에서 합성된 압타머는 적어도 1종의 단백질의 활성도를 억제한다.
다른 실시양태에서, 압타머 라이브러리에서 합성된 압타머는 몇몇 공지된 방법 중 하나에 의해 제조된 핵산 나노구조로의 통합을 위한 임의의 도메인을 함유할 수 있다 ([Shih et al., Nature 427:618-621 (2004); Rothemund, Nature 440:297-302 (2006); Zheng et al., Nature 461:74-77 (2009); Dietz et al., Science 325:725-730 (2009); Wei et al., Nature 485:623-626 (2012); Ke et al., Science 338:1177-1183 (2012); Douglas et al., Science 335:831-834 (2012)], 상기 문헌들 각각은 본원에 참조로 포함된다). 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 압타머는 분자 로직 및 계산의 기능을 제공하는 임의의 도메인을 함유할 수 있다 ([Seelig et al., Science 314:1585-1588 (2006); Macdonald et al., Nano Lett 6:2598-2603 (2006); Qian et al., Nature 475:368-372 (2011); Douglas et al., Science 335:831-834 (2012); Amir et al., Nat Nanotechnol 9:353-357 (2014)], 상기 문헌들 각각은 본원에 참조로 포함된다)
일부 실시양태에서, 압타머 라이브러리에서 합성된 압타머는 음성 선택 대 표적 (예를 들어, 진핵 또는 원핵 세포)의 1회 이상의 주기를 경험한다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 압타머는 양성 선택 대 표적 (예를 들어, 진핵 또는 원핵 세포)의 1회 이상의 주기를 경험한다.
압타머 라이브러리에서 합성된 압타머는 용액에 있거나 고체상 (예를 들어, 표면, 입자, 수지, 매트릭스 등)에 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 압타머 라이브러리에서 합성된 압타머는 표면에 부착된다. 한 실시양태에서, 표면은 입자 표면이다.
고정된 압타머 클러스터
특정 측면에서, 표적 세포를 포함하는 샘플을 입자 표면 상에 고정된 복수개의 압타머 클러스터 (예를 들어, 본원에 제공된 압타머 라이브러리로부터의 압타머의 클러스터)와 함께 인큐베이션함으로써 표적 세포를 조정하는 압타머를 식별하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 표면은 비드 (예를 들어, 마이크로비드, 나노비드)이다.
관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 입자 표면 상에서 고정된 압타머 클러스터를 생성시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 표면-고정된 압타머 클러스터는 먼저 압타머 (예를 들어, 본원에 개시된 압타머 라이브러리로부터)를 표면 (예를 들어, 입자 표면) 상에 고정시킴으로써 생성된다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 또는 1010개의 구별되는 압타머가 표면 (예를 들어, 입자 표면) 상에 고정된다. 이어서, 압타머 고정, 국지화 증폭 공정 (예를 들어, 에멀젼 PCR, 브릿지 증폭, 또는 롤링 서클 증폭)을 수행하여, 원래의 고정된 압타머의 고정 부위에 근접하게 위치된 각각의 고정된 압타머의 카피의 클러스터를 생성한다. 특정 실시양태 (예를 들어, 롤링 서클 증폭이 수행되는 실시양태)에서 압타머 클러스터는 표면 상에 직접 고정되기보다는 표면 상의 나노-피트(nano-pit) 또는 기공에 수용된다. 일부 실시양태에서, 압타머 클러스터는 에멀젼 PCR을 사용하여 제조된다. 일부 실시양태에서, 증폭은 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 또는 1000,000개의 동일한 압타머 분자를 포함하는 각각의 압타머 클러스터를 생성시킨다. 특정 실시양태에서, 이어서 압타머 클러스터를 서열결정한다 (예를 들어, 일루미나 서열결정 또는 폴로네이터(Polonator) 서열결정). 존재하는 경우, 단일 가닥 압타머의 클러스터를 생성시키기 위해 (예를 들어, 염 농도 및/또는 온도로 인해) 가닥 혼성화에 적합하지 않은 조건 하에 표면을 세척함으로써 압타머 클러스터로부터 상보성 가닥을 스트립핑할 수 있다. 이어서 표면 (예를 들어, 입자 표면)은 본원에 제공된 압타머 식별 방법에 사용할 준비가 된다. 일부 실시양태에서, 고정된 압타머 클러스터는 하나의 기기 상에서 제조 및/또는 서열결정된 다음에, 압타머 식별을 위해 별도의 기기로 옮겨진다. 다른 실시양태에서, 압타머 클러스터는 압타머 식별에 사용되는 바와 동일한 기기에서 제조 및/또는 서열결정된다.
일부 실시양태에서, 각각의 압타머 클러스터 입자는 1000 미만의 상이한 압타머 서열, 예를 들어, 900 미만, 800 미만, 700 미만, 600 미만, 500 미만, 400 미만, 300 미만, 또는 200 미만, 100 미만, 90 미만, 80 미만, 70 미만, 60 미만, 50 미만, 40 미만, 30 미만, 또는 20 미만, 10 미만, 9 미만, 8 미만, 7 미만, 6 미만, 5 미만, 4 미만, 3 미만, 또는 2 미만의 상이한 압타머 서열의 클러스터를 포함한다. 한 실시양태에서, 각각의 압타머 클러스터 입자는 고유한 압타머 서열을 표면 상에 클러스터 입자로서 다수의 카피로 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 압타머 클러스터는 적어도 2개의 동일한 압타머 (예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 또는 1,000,000개의 동일한 압타머)를 포함한다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 압타머 또는 압타머 클러스터 (예를 들어, 압타머 라이브러리로부터의)는 압타머를 표면 높이로 가져 오는 어댑터를 포함한다 (예를 들어, 표면이 편평하지 않은 경우에, 예컨대 기공을 포함하는 입자에서). 한 실시양태에서, 압타머 또는 압타머 클러스터는 입자 표면 상의 기공 내부에 고정되고, 어댑터는 압타머를 표면 높이로 가져 오기 위해 압타머를 표면에 결합시키기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 어댑터는 핵산 어댑터 (예를 들어, 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개 염기 길이의 서열)이다. 일부 실시양태에서, 어댑터 서열에 상보적인 서열은 압타머 스크리닝 전에 어댑터에 혼성화된다. 일부 실시양태에서, 어댑터는 화학적 어댑터 (예를 들어, 압타머를 표면에 연결하는 중합체)이다.
압타머 라이브러리 스크리닝
특정 측면에서, 표적 세포 기능을 특이적으로 조정하는 1종 이상의 압타머를 식별하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 일반적으로, (i) 라이브러리를 세포-압타머 클러스터 입자 복합체를 형성하기 위한 조건 하에 및 기간 동안 단일 반응 부피로 표적 세포와 함께 인큐베이션하는 단계; (ii) 목적하는 효과 없이 세포-압타머 클러스터 입자 복합체, 유리 입자 및 유리 세포로부터 변경된 세포 기능을 갖는 세포-압타머 클러스터 입자 복합체를 분할하는 단계; (iii) 변경된 세포 기능을 갖는 세포-압타머 클러스터 입자 복합체로부터 압타머 클러스터 입자를 단리하는 단계; (iv) 상기 입자로부터 압타머를 해리시키는 단계; 및 (v) 개별 압타머 서열을 증폭시켜 기능적으로 보강된 압타머 집단을 제공하는 단계를 포함한다.
특정 실시양태에서, 방법은 단계 (i) - (v)를 추가 라운드로 반복함으로써 기능적 압타머 집단을 보강하여 특이적이고 보강된 기능적 압타머 집단을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 기능적 압타머 집단을 보강하는 단계는 제한적 조건 (예를 들어, 총 입자 수 감소)을 연속적 라운드로 적용하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 보강된 압타머 집단은 인큐베이션 단계로부터 복수개의 압타머에 비해 적어도 1.5배 (예를 들어, 약 1.5, 1.6, 1.7. 1.8, 1.9, 또는 2.0배)만큼 감소된 서열 다양성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 스크리닝의 각각의 추가 라운드의 압타머 집단은 적어도 1.1배 (예를 들어, 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8, 1.9, 또는 2.0배)만큼 보강된다. 보강의 라운드 수는 목적하는 만큼 많을 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 라운드 수는 적어도 2 (예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100)이다. 특정 실시양태에서, 방법은 단계 (v) 후에 서열결정을 통해 보강된 기능적 압타머 집단을 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
압타머 클러스터 입자의 라이브러리는 세포-압타머 클러스터 입자 복합체를 형성하고 압타머 클러스터 입자가 표적 세포에 효과를 제공할 수 있도록 전도성이 있는 임의의 조건 하에 표적 세포와 함께 인큐베이션될 수 있다. 조건은, 예를 들어, 제어 기간, 최적 온도 (예를 들어, 37℃), 및/또는 인큐베이션 배지 (예를 들어, 표적 세포 배양 배지) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 인큐베이션 기간은 약 10분 내지 약 5일, 약 30분 내지 약 4일, 약 1시간 내지 약 3일, 약 1.5시간 내지 약 24시간, 또는 약 1.5시간 내지 약 2시간일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 기간은, 예를 들어, 10분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일일 수 있다.
표적 세포 및 압타머 클러스터 입자의 라이브러리는 형성된 세포-압타머 클러스터 입자 복합체가 표적 세포당 약 1 내지 10개의 입자 (예를 들어, 표적 세포당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 입자)를 포함하는 비율로 혼합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 형성된 세포-압타머 클러스터 입자 복합체는 표적 세포당 약 2 내지 4개의 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 형성된 세포-압타머 클러스터 입자 복합체 중 압타머 클러스터 입자는 입자당 약 1 내지 10개의 클러스터 (예를 들어, 입자당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 클러스터)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 형성된 세포-압타머 클러스터 입자 복합체 중 압타머 클러스터 입자는 입자당 약 1 내지 6개의 클러스터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 검출 가능한 표지로 표지되고/되거나 검출 가능한 표지를 포함한다. 표적 (예를 들어, 표적 세포)은 직접 (예를 들어, 직접적인 화학적 링커를 통해) 또는 간접 (예를 들어, 검출 가능하게 표지된 표적-특이적 항체를 사용하여) 검출 가능하게 표지된다. 표적이 세포인 실시양태에서, 검출 가능한 표지가 세포에 의해 내재화되는 조건 하에 표적 세포를 검출 가능한 표지와 함께 인큐베이션함으로써 표지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적은 본원에 기재된 압타머 스크리닝 방법을 수행하기 전에 검출 가능하게 표지된다. 일부 실시양태에서, 표적은 본원에 제공된 압타머 스크리닝 방법의 수행 동안 표지된다. 일부 실시양태에서, 표적은 압타머 클러스터에 결합된 후 (예를 들어, 결합된 표적을 검출 가능하게 표지된 항체와 접촉시킴으로써) 표지된다. 일부 실시양태에서, 임의의 검출 가능한 표지가 사용될 수 있다. 검출 가능한 표지의 예는 형광 모이어티, 방사성 모이어티, 상자성 모이어티, 발광 모이어티 및/또는 비색성 모이어티를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 표적은 형광 모이어티에 연결되거나, 이를 포함하고/거나 이에 의해 결합된다. 형광 모이어티의 예는 알로피코시아닌(Allophycocyanin), 플루오레세인(Fluorescein), 피코에리트린(Phycoerythrin), 페리디닌(Peridinin)-클로로필 단백질 복합체, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 350, 알렉사 플루오르 405, 알렉사 플루오르 430, 알렉사 플루오르 488, 알렉사 플루오르 514, 알렉사 플루오르 532, 알렉사 플루오르 546, 알렉사 플루오르 555, 알렉사 플루오르 568, 알렉사 플루오르 594, 알렉사 플루오르 633, 알렉사 플루오르 635, 알렉사 플루오르 647, 알렉사 플루오르 660, 알렉사 플루오르 680, 알렉사 플루오르 700, 알렉사 플루오르 750, 알렉사 플루오르 790, EGFP, 엠플럼(mPlum), 엠체리(mCherry), 엠오렌지(mOrange), mKO, EYFP, 엠시트린, 비너스(Venus), YPet, 에메랄드(Emerald), 세루리언(Cerulean) 및 CyPet를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
표적은 비분자 또는 초분자 표적일 수 있다. 본 개시내용의 압타머가 결합 하고/거나 조정할 수 있는 표적의 비제한적인 예는 세포, 박테리아, 진균, 고세균류, 원생동물, 바이러스, 비리온 입자, 합성 및 자연-발생 미시적 입자 및 리포좀을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 압타머 클러스터 입자와 접촉된 표적은 살아 있는/천연이다. 다른 실시양태에서, 압타머 클러스터 입자와 접촉된 표적은 고정되거나 용액에 있다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 원핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 박테리아 세포이다. 박테리아의 비제한적인 예는 아스퍼길루스(Aspergillus), 브루기아(Brugia), 칸디다(Candida), 클라미디아(Chlamydia), 콕시디아(Coccidia), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 디로필라리아(Dirofilaria), 고노코쿠스(Gonococcus), 히스토플라즈마(Histoplasma), 클레브시엘라(Klebsiella), 레지오넬라(Legionella), 레쉬마니아(Leishmania), (메닌고콕시(Meningococci), 마이코벡테리움(Mycobacterium), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 파라메시움(Paramecium), 퍼투시스(Pertussis), 플라스모듐(Plasmodium), 뉴모코쿠스(Pneumococcus), 뉴모시스티스(Pneumocystis), 슈모모나스(Pseudomonas), 리케트시아(Rickettsia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 톡소플라즈마(Toxoplasma) 및 비브리오콜레라(Vibriocholerae)를 포함한다. 예시적인 종은 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 해모필루스 바기날리스(Haemophilus vaginalis), 군 B 스트렙토코쿠스 종, 마이크로플라즈마 호미니스(Microplasma hominis), 헤모필루스 두크레이(Hemophilus ducreyi), 그래눌로마 인구이날(Granuloma inguinale), 림포패티아 베너레움(Lymphopathia venereum), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 브루셀라 아보투스(Brucella abortus), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 브루셀라 카니스(Brucella canis), 캄필로박터 페투스(Campylobacter fetus), 캄필로박터 페투스 인테스티날리스(Campylobacter fetus intestinalis), 렙토스피라 포모나(Leptospira pomona), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 브루셀라 오비스(Brucella ovis), 클라미디아 프시타시(Chlamydia psittaci), 트리코모나스 포에투스(Trichomonas foetus), 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii), 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli), 악티노바실루스 에쿨리(Actinobacillus equuli), 살모넬라 아보투스 오비스(Salmonella abortus ovis), 살모넬라 아보투스 에쿠이(Salmonella abortus equi), 슈노모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 코리네박테리움 에쿠이(Corynebacterium equi), 코리네박테리움 피오게네스(Corynebacterium pyogenes), 악티노바실루스 세미니스(Actinobaccilus seminis), 마이코플라즈마 보비게니탈리움(Mycoplasma bovigenitalium), 아스퍼길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 압시디아 라모사(Absidia ramosa), 트리파노소마 에퀴퍼둠(Trypanosoma equiperdum), 바베시아 카발리(Babesia caballi), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 및 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 진핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 동물 세포 (예를 들어, 포유동물 세포)이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 비인간 동물, 예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 소 (예를 들어, 젖소, 황소, 물소), 사슴, 양, 염소, 라마, 닭, 고양이, 개, 페럿, 또는 영장류 (예를 들어, 마모셋, 레서스 원숭이)로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 세포는 기생충 세포 (예를 들어, 말라리아 세포, 레슈마니아 세포, 크립토스포리듐 세포 또는 아메바 세포)이다. 일부 실시양태에서, 세포는 진균 세포, 예컨대, 예를 들어, 파라콕시디오이디스 브라질리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis)이다.
일부 실시양태에서, 세포는 암 세포 (예를 들어, 인간 암 세포 또는 환자-유래 암 세포)이다. 일부 실시양태에서, 세포는 임의의 암성 또는 전암성(pre-cancerous) 종양으로부터 유래된다. 암 세포의 비제한적인 예는 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 위장, 치은, 머리, 신장, 간, 림프절, 폐, 비인두, 목, 난소, 췌장, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀, 또는 자궁으로부터의 암 세포를 포함한다. 게다가, 암은 구체적으로 하기 조직학적 유형을 가질 수 있긴 하지만, 이들로 제한되지 않는다: 신생물, 악성, 암종, 암종, 미분화, 거대 및 방추 세포 암종, 소세포 암종, 유두상 암종, 편평 세포 암종, 림프상피 암종, 기저 세포 암종, 모기질(pilomatrix) 암종, 이행 세포 암종, 유두상 이행 세포 암종, 선암종, 가스트린종, 악성, 담관암종, 간세포 암종, 혼합 간세포 암종 및 담관암종, 섬유주 선암종, 선양 낭성 암종, 선종 용종 내의 선암종, 선암종, 가족성 결장 용종증, 고형 암종, 카시노이드 종양, 악성, 세기관지-폐포(branchiolo-alveolar) 선암종, 유두상 선암종, 혐색소성 암종, 호산성 암종, 호산세포성 선암종, 호염기구성 암종, 투명 세포 선암종, 과립 세포 암종, 여포성 선암종, 유두상 및 여포성 선암종, 비캡슐성 경화성 암종, 부신피질 암종, 자궁내막 암종, 피부 부속기관 암종, 아포크린 선암종, 피지선 선암종, 귀지선 선암종, 점액표피양 암종, 낭선암종, 유두상 낭선암종, 유두상 장액성 낭선암종, 점액성 낭선암종, 점액성 선암종, 인환 세포 암종, 침윤성 관 암종, 수질성 암종, 소엽성 암종, 염증성 암종, 파제트병(paget's disease), 유방, 선방 세포 암종, 선편평상피 암종, 편평상피화생 동반 선암종, 흉선종, 악성, 난소 기질 종양, 악성, 난포막종, 악성, 과립막 세포 종양, 악성, 남성모세포종, 악성, 세르톨리 세포 암종, 라이디히(leydig) 세포 종양, 악성, 지질 세포 종양, 악성, 부신경절종, 악성, 유방외 부신경절종, 악성, 크롬친화성세포종, 사구맥관육종, 악성 흑색종, 무멜라닌 흑색종, 표재 확산성 흑색종, 거대 색소 모반의 악성 흑색종, 상피양 세포 흑색종, 청색 모반, 악성, 육종, 섬유육종, 섬유성 조직구증, 악성, 점액육종, 지방육종, 평활근육종, 횡문근육종, 배아성 횡문근육종, 포상 횡문근육종, 간질 육종, 혼합 종양, 악성, 뮐러 혼합 종양, 신장모세포종, 간모세포종, 암육종, 중간엽종, 악성, 브레너(brenner) 종양, 악성, 엽상 종양, 악성, 활막 육종, 중피종, 악성, 미분화배세포종, 배아성 암종, 기형종, 악성, 난소 갑상선종, 악성, 융모막 암종, 중신종, 악성, 혈관육종, 혈관내피종, 악성, 카포시 육종(kaposi's sarcoma), 혈관주위세포종, 악성, 림프관육종, 골육종, 피질주위 골육종, 연골육종, 연골모세포종, 악성, 중간엽 연골육종, 뼈의 거대 세포 종양, 유잉 육종, 치원성 종양, 악성, 사기질모세포성 치아육종, 사기질모세포종, 악성, 사기질모세포성 섬유육종, 송과체종, 악성, 척삭종, 신경교종, 악성, 상의세포종, 별아교세포종, 원형질 별아교세포종, 원섬유성 별아교세포종, 별모세포종, 교모세포종, 희소돌기아교세포종, 희소돌기아교모세포종, 원시신경외배엽, 소뇌 육종, 연조직 육종, 신경절신경모세포종, 신경모세포종, 망막모세포종, 후각 신경원성 종양, 수막종, 악성, 신경섬유육종, 신경초종, 악성, 과립 세포 종양, 악성, 악성 림프종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 호지킨 림프종, 부육아종, 악성 림프종, 소림프구성, 악성 림프종, 대세포, 미만성, 악성 림프종, 여포성, 균상 식육종, 기타 특정된 비호지킨 림프종, 악성 조직구증, 다발성 골수종, 비만 세포 육종, 면역증식성 소장 질환, 백혈병, 림프성 백혈병, 형질 세포 백혈병, 적백혈병, 림프육종 세포 백혈병, 골수성 백혈병, 호염기구성 백혈병, 호산구성 백혈병, 단핵구성 백혈병, 비만 세포 백혈병, 거핵모구성 백혈병, 골수성 육종, 및 모발상 세포 백혈병.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 면역 세포 (예를 들어, 인간 면역 세포 또는 환자-유래 면역 세포)이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 세포"는 면역 반응에서 역할을 하는 세포를 지칭한다. 면역 세포는 조혈 기원이며, 림프구 예컨대 B 세포 및 T 세포; 자연 살해 세포; 골수성 세포, 예컨대 단핵구, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 호염기구, 및 과립구를 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 바이러스로 감염된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 바이러스는 HIV, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 헤르페스 바이러스(예를 들어, HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, 엡스타인 바 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 종두증 바이러스, HTLV, 뎅기 바이러스, 유두종 바이러스, 연속종 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스, 또는 에볼라 바이러스이다
일부 실시양태에서, 조정되는 세포 기능은 세포 생존력, 세포 증식, 유전자 발현, 세포 형태학, 세포 활성화, 인산화, 칼슘 가동화, 탈과립화, 세포 이동, 및/또는 세포 분화이다. 특정 실시양태에서, 표적은 표적에 대한 생물학적 또는 화학적 효과의 검출을 가능하게 하는 검출 가능한 표지에 연결되거나, 검출 가능한 표지에 의해 결합되거나 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 형광 염료이다. 형광 염료의 비제한적인 예는 칼슘 민감성 염료, 세포 추적자 염료, 친유성 염료, 세포 증식 염료, 세포 주기 염료, 대사산물 민감성 염료, pH 민감성 염료, 막 전위 민감성 염료, 미토콘드리아 막 전위 민감성 염료, 및 산화환원 전위 염료를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 표적은 칼슘 민감성 염료, 세포 추적자 염료, 친유성 염료, 세포 증식 염료, 세포 주기 염료, 대사산물 민감성 염료, pH 민감성 염료, 막 전위 민감성 염료, 미토콘드리아 막 전위 민감성 염료, 또는 산화환원 전위 염료로 표지된다.
특정 실시양태에서, 표적 세포는 활성화 연관 마커, 산화 스트레스 리포터, 혈관신생 마커, 아폽토시스 마커, 자가포식 마커, 세포 생존력 마커, 또는 이온 농도에 대한 마커로 표지된다. 또 다른 실시양태에서, 표적 세포는 압타머가 표적에 노출되기 전에 활성화 연관 마커, 산화 스트레스 리포터, 혈관신생 마커, 아폽토시스 마커, 자가포식 마커, 세포 생존력 마커, 또는 이온 농도에 대한 마커로 표지된다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 압타머가 표적에 노출된 후 표지된다. 한 실시양태에서, 표적은 형광-표지된 항체, 아넥신 V, 항체 단편 및 인공 항체-기반 구축물, 융합 단백질, 당류, 또는 렉틴으로 표지된다. 또 다른 실시양태에서, 표적 세포는 압타머가 표적에 노출된 후 형광-표지된 항체, 아넥신 V, 항체 단편 및 인공 항체-기반 구축물, 융합 단백질, 당류, 또는 렉틴으로 표지된다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 형광 염료로 표지된다. 형광 염료의 비제한적인 예는 칼슘 민감성 염료, 세포 추적자 염료, 친유성 염료, 세포 증식 염료, 세포 주기 염료, 대사산물 민감성 염료, pH 민감성 염료, 막 전위 민감성 염료, 미토콘드리아 막 전위 민감성 염료, 및 산화환원 전위 염료를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 칼슘 민감성 염료, 세포 추적자 염료, 친유성 염료, 세포 증식 염료, 세포 주기 염료, 대사산물 민감성 염료, pH 민감성 염료, 막 전위 민감성 염료, 미토콘드리아 막 전위 민감성 염료, 또는 산화환원 전위 염료로 표지된다. 특정 실시양태에서, 표적 세포는 활성화 연관 마커, 산화 스트레스 리포터, 혈관신생 마커, 아폽토시스 마커, 자가포식 마커, 세포 생존력 마커, 또는 이온 농도에 대한 마커로 표지된다. 또 다른 실시양태에서, 표적 세포는 압타머가 세포에 노출되기 전에 활성화 연관 마커, 산화 스트레스 리포터, 혈관신생 마커, 아폽토시스 마커, 자가포식 마커, 세포 생존력 마커, 또는 이온 농도에 대한 마커로 표지된다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 압타머가 표적에 노출된 후 표지된다. 한 실시양태에서, 표적 세포는 형광-표지된 항체 또는 그의 항체-결합 단편, 아넥신 V, 형광-표지된 융합 단백질, 형광-표지된 당, 또는 형광 표지된 렉틴으로 표지된다. 한 실시양태에서, 표적 세포는 압타머가 세포에 노출된 후 형광-표지된 항체 또는 그의 항체-결합 단편, 아넥신 V, 형광-표지된 융합 단백질, 형광-표지된 당, 또는 형광 표지된 렉틴으로 표지된다.
일부 실시양태에서, 세포 기능의 어떤 리포터도 본원에 제공된 방법에서 사용할 수 있다.
특정 실시양태에서, 세포 기능은 박테리아 막 완전성이다. 박테리아 막 완전성의 리포터의 예는 LIVE/DEAD 박라이트(BacLight) 박테리아 생존력 키트(Bacterial Viability Kit)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 세포 기능은 박테리아 산화 효소 및 환원 효소의 발현이다. 박테리아 산화 효소 및 환원 효소의 발현의 리포터의 예는 박라이트 레독스센서(RedoxSensor) 박테리아 생존력 검정을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 세포 기능은 박테리아 막 전위의 변화이다. 박테리아 막 전위의 변화의 리포터의 예는 박라이트 박테리아 막 전위 키트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 세포 기능은 아폽토시스이다. 예시적인 아폽토시스 리포터는 표 14에 제공되어 있다.
일부 실시양태에서, 세포 기능의 리포터는 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 형광 모이어티로 표지된다. 형광 모이어티의 예는 알로피코시아닌, 플루오레세인, 피코에리트린, 페리디닌-클로로필 단백질 복합체, 알렉사 플루오르 350, 알렉사 플루오르 405, 알렉사 플루오르 430, 알렉사 플루오르 488, 알렉사 플루오르 514, 알렉사 플루오르 532, 알렉사 플루오르 546, 알렉사 플루오르 555, 알렉사 플루오르 568, 알렉사 플루오르 594, 알렉사 플루오르 633, 알렉사 플루오르 635, 알렉사 플루오르 647, 알렉사 플루오르 660, 알렉사 플루오르 680, 알렉사 플루오르 700, 알렉사 플루오르 750, 알렉사 플루오르 790, EGFP, 엠플럼, 엠체리, 엠오렌지, mKO, EYFP, 엠시트린, 비너스, YPet, 에메랄드, 세루리언 및 CyPet를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 세포 기능은 자가포식이고 항체는 자가포식의 마커 (예를 들어, LC3, p62)에 결합한다.
일부 실시양태에서, 세포 기능은 세포 증식이고 항체는 증식 마커 (예를 들어, Ki67, MCM2, PCNA)에 결합한다.
일부 실시양태에서, 세포 기능은 종양 항원 발현이고 항체는 종양 항원 (예를 들어, 전립선-특이적 항원 (PSA), 전립선 막 항원 (PSMA) 암 항원 15-3 (CA-15-3), 암배아 항원 (CEA), 암 항원 125 (CA-125), 알파-태아단백 (AFP), NY-ESO-1, MAGEA-A3, WT1, hTERT, 티로시나제, gp100, MART-1, 멜란A, B 카네닌, CDC27, HSP70-2-m, HLA-A2-R17OJ, AFP, EBV-EBNA, HPV16-E7, MUC-1, HER-2/neu, 맘마글로빈(Mammaglobin)-A))에 결합한다.
일부 실시양태에서, 세포 기능은 면역 체크포인트 단백질의 발현이고 항체는 면역 체크포인트 수용체 및/또는 면역 체크포인트 수용체 리간드 (예를 들어, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), B7-H5 (VISTA), BTLA (CD272), CD96 (Tactile), CD112 (Nectin-2), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD137L (4-1BBL), CD152 (CTLA-4), CD155 (PVR), CD223 (LAG3), CD226 (DNAM1), CD252 (OX40L), CD258 (LIGHT), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), CD279 (PD-1), CD357 (GITR), DR3 (TNFRSF25), 갈렉틴(Galectin)-9, GITRL, HVEM, ICOSL (B7-H2), IDO, TIGIT, TIM3, TL1A, VSIG4)에 결합한다.
일부 실시양태에서, 세포 기능은 시토카인 발현이고 항체는 시토카인 (예를 들어, IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, GM-CSF, IL-2, IL-8, GRO-α, IL-10, MCP-1, MIP-1, MCP-3, MIG, IL-12, CCL5)에 결합한다.
일부 실시양태에서, 세포 기능은 대식세포 기능이고 항체는 대식세포 기능의 마커 (예를 들어, IDO, CD163, CD206, 아르기나제(Arginase)-1, CD204 (MSR-1), CD369, GPNMB, VSIG4, 마르코(Marco), MerTK, 오스테오폰틴(Osteopontin), Axl, VISTA)에 결합한다.
일부 실시양태에서, 세포 기능은 수지상 세포 기능이고 항체는 수지상 세포 기능의 마커 (예를 들어, CD103, CD11b, XCR1, CD80, CD86)에 결합한다.
도 1은 본원에 제공된 방법의 특정 실시양태를 도시하는 예시적인 작업 흐름을 제공한다. 작업 흐름은 일루미나 서열결정을 위해서인 것처럼 선택되고 제조된 초기 압타머 라이브러리 (예를 들어, 본원에 제공된 압타머 라이브러리)로 시작한다. 라이브러리는, 예를 들어, 새로 합성될 수 있거나, 이전의 선택 공정의 산출물일 수 있다. 이러한 공정은 하나 이상의 양성 선택 주기, 하나 이상의 음성 선택 주기, 또는 둘 다를 조합 및 순서대로 포함할 수 있다.
도 3은 공정의 일부 단계에 대한 예시적인 다이어그램을 제공한다. 도 3I는 표적 세포에 대한 결합 특이적 압타머를 선택하기 위한 순차적 결합 SELEX 단계 및 세포에 기능적 효과를 제공하는 결합 압타머로 집단을 보강하기 위해 수행되는 기능적 SELEX를 도시한다. 임의의 수의 결합에 대해 많은 옵션이 가능하며 기능적 SELEX가 반복될 수 있다. 도 3II는 검출 가능하게 표지된 압타머 클러스터 입자 세포 복합체 (C 참조)를 형성하기 위해 본원에 기재된 압타머 클러스터 입자 (B 참조) 및 세포 (A 참조)를 조합하는 단계를 도시한다. 도 3III은 세포 기능의 형광 마커의 강도 (y-축)뿐만 아니라 세포와의 입자 복합체화 (x-축)를 검출하는 결과적인 유세포 분석 결과의 도시이며, 이는 (ii로서 표지된) 변경된 세포 기능을 갖는 세포-압타머 클러스터 입자 복합체를, (iv로서 표지된) 목적하는 효과 없이 세포-압타머 클러스터 입자 복합체, 유리 입자 (v) 및 유리 세포로부터 분할할 수 있게 하며, 둘 다 (i로서 표지된) 목적하는 효과를 가지며 (iii으로서 표지된) 목적하는 기능이 없다.
제조된 라이브러리는 입자, 예컨대 비드 상에 탑재된다. 에멀젼 PCR (ePCR) 증폭은 초기 라이브러리로부터의 각각의 단일 서열을 동일한 서열의 적어도, 예를 들어 10,000개 카피의 클러스터로 바꾼다. 이어서 압타머 클러스터 입자의 라이브러리를 표적 세포와 함께 인큐베이션한다. 표적 세포는 표적 세포에 대한 생물학적 또는 화학적 효과를 보고하기 위해, 형광 염료를 사용하여 압타머 클러스터 입자에 도입하기 전에 표지될 수 있다. 표적 세포 및 압타머 클러스터 입자의 라이브러리는 효과가 발생할 수 있도록 일정량의 시간 동안 인큐베이션된다. 생물학적 또는 화학적 효과 (예를 들어, 세포 활성화, 아폽토시스 등)를 보고하기 위한 형광 염료 또는 마커를 표적 세포 내로 펌핑할 수 있다 (도 1 참조). 일부 실시양태에서, 리포터는 인큐베이션 전에 세포에 첨가된다. 일부 실시양태에서 리포터는 인큐베이션 동안 첨가된다. 특정 실시양태에서 리포터는 인큐베이션 후에 첨가된다. 일부 실시양태에서 압타머와의 인큐베이션 공정과 관계 없이 원하는 표현형 (예를 들어, 아폽토시스)을 발현하는 세포를 표시하기 위해 제2 리포터가 사용된다 (예를 들어, 인큐베이션 전). 특정 실시양태에서, 제2 리포터는 위양성을 구별하는 데 도움을 준다. 일부 실시양태에서, 검출된 표현형이 위양성이 아닌지를 확인하기 위해 제2 (또는 제3) 리포터 (예를 들어, 상이한 메커니즘을 통해 작동하는 리포터)가 사용된다. 이어서, 효과 양성 클러스터를 효과-음성 클러스터로부터 분류하고 상응하는 기능적 압타머 서열을 분석한다. 분류된 양성 클러스터는 또한 스크리닝의 추가 라운드를 위한 초기 라이브러리로서 입자 표면에 증폭 및 고정될 수 있다. 스크리닝의 각각의 라운드 후 보강된 기능적 압타머의 일부는 서열결정에 의해 압타머를 식별하기 전에 산출물 샘플링 및 비교 기능적 분석에 적용된다.
기타 조성물 및 방법
특정 측면에서, 또한, 기능적으로 보강된 압타머 집단, 예컨대 본원에 기재된 압타머 라이브러리 스크리닝 방법을 사용하여 선택된 압타머 집단을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 보강된 압타머 집단은 대조군 압타머와 비교하여 기능에서 1.1배 초과 증가, 예를 들어, 대조군 라이브러리와 비교하여 기능에서 1.2배 초과, 1.3배 초과, 1.4배 초과, 1.5배 초과, 1.6배 초과, 1.7배 초과, 1.8배 초과, 1.9배 초과, 2.0배 초과, 2.1배 초과, 2.2배 초과, 2.3배 초과, 2.4배 초과, 2.5배 초과, 2.6배 초과, 2.7배 초과, 2.8배 초과, 2.9배 초과, 3배 초과, 3.5배 초과, 4배 초과, 4.5배 초과, 5배 초과, 5.5배 초과, 6배 초과, 6.5배 초과, 7배 초과, 7.5배 초과, 8배 초과, 8.5배 초과, 9배 초과, 9.5배 초과, 또는 10배 초과 증가를 특징으로 한다. 대조군 라이브러리는, 예를 들어, 하나 이상의 비기능적 압타머, 압타머의 무작위 풀, 임의의 기능적 스크리닝 또는 보강 전의 압타머 클러스터의 라이브러리, 또는 관심 특이적 세포 기능을 조정하지 않는 압타머 집단일 수 있다. 특정 실시양태에서, 기능은 세포 기능의 검출 가능한 표지의 정량적 형광, 세포 기능의 검출 가능한 표지의 정량적 발광, 또는 세포의 형태학적 변화로서 측정된다. 일부 실시양태에서, 측정된 기능은 암 세포 사멸 또는 아폽토시스, 예를 들어 종양-유래 세포의 세포 사멸 또는 아폽토시스이다. 따라서, 압타머의 종양 유래 맞춤형 세포 변형 집단이 또한 본 발명에 의해 포함된다. 일부 다른 실시양태에서, 측정된 기능은 면역 세포 활성화/탈활성화 또는 다른 표현형 스위칭/스큐잉(skewing)/편광이다.
특정 측면에서, 압타머 클러스터 (예를 들어, 본원에 제공된 방법의 수행 동안 생성된 클러스터링된 압타머 라이브러리)를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 압타머 클러스터는 고체 지지체 (예를 들어, 입자 표면) 상에 고정된다. 특정 실시양태에서, 조성물을 표적 세포 (예를 들어, 암 세포, 면역 세포, 박테리아 세포)를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 세포 기능의 리포터를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 리포터는 형광 리포터 (예를 들어, 막 완전성 리포터, 캡시드 완전성 리포터, 단백질 완전성 리포터, 단백질 변성 리포터, 세포 사멸 리포터, 또는 산화환원 전위 리포터)이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 약 102개의 압타머 클러스터 (예를 들어, 적어도 약 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107, 108, 5 x 108, 또는 109개의 압타머 클러스터)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 적어도 약 106개의 압타머 클러스터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 105 내지 1010개의 압타머 클러스터 (예를 들어, 105 내지 5 x 109, 105 내지 109, 105 내지 5 x 108, 105 내지 108, 105 내지 5 x 107, 105 내지 107, 105 내지 5 x 106, 105 내지 106, 105 내지 5 x 105, 5 x 105 내지 1010, 106 내지 1010, 5 x 106 내지 1010, 107 내지 1010, 5 x 107 내지 1010, 108 내지 1010, 5 x 108 내지 1010, 109 내지 1010, 5 x 109 내지 1010, 5 x 105 내지 5 x 109 , 106 내지 109, 5 x 106 내지 5 x 108, 107 내지 108개의 압타머 클러스터)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 106 내지 109개의 압타머 클러스터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 압타머 클러스터는 적어도 약 2개 카피의 압타머 (예를 들어, 적어도 약 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 또는 106개 카피의 압타머)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 각각의 압타머 클러스터는 적어도 약 104개 카피의 압타머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 압타머 클러스터는 103 - 107개의 압타머 (예를 들어, 클러스터당 103 내지 5 x 106, 103 내지 106, 103 내지 5 x 105, 103 내지 105, 103 내지 5 x 104, 103 내지 104, 103 내지 5 x 103, 5 x 103 내지 107, 104 내지 107, 5 x 104 내지 107, 105 내지 107, 5 x 105 내지 107, 106 내지 107, 5 x 106 내지 107, 5 x 103 내지 5 x 106 , 104 내지 106, 또는 5 x 104 내지 5 x 105개의 압타머)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 각각의 압타머 클러스터는 104 내지 106개의 압타머를 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적은 임의의 유형의 세포 (예를 들어 원핵 세포, 예컨대 박테리아 또는 고세균류, 진핵 세포, 예컨대 동물 세포, 식물 세포, 원생 동물 세포, 포유동물 세포), 바이러스 등일 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 기능의 리포터는 형광 리포터이다. 일부 실시양태에서, 기능의 형광 리포터는 세포 사멸 리포터, 산화환원 전위 리포터, 막 완전성 리포터이다. 세포 사멸 리포터의 예는 7-AAD, 및 아넥신 V 형광단이다. 일부 실시양태에서, 기능의 형광 리포터는 바이러스 리포터, 예컨대 캡시드 완전성 리포터 (예를 들어, 캡시드 완전성 및 또는 바이러스의 기능을 측정하기 위한 리포터)이다. 일부 실시양태에서, 기능의 형광 리포터는 단백질 리포터, 예컨대 단백질 완전성 리포터 (즉, 단백질의 구조적 완전성 및 안정성을 측정하기 위한 리포터) 또는 단백질 변성 리포터 (즉, 단백질 변성을 검출하는 리포터)이다.
일부 측면에서, 암 치료를 위한 압타머를 선택하는 방법이 또한 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, a) 대조군 압타머와 비교하여 환자-유래 암 세포의 세포 사멸 또는 아폽토시스를 촉진하는 데 1.5배 초과의 증가를 특징으로 하는 압타머 집단을 제공하는 단계; b) 압타머 집단으로부터 적어도 하나의 압타머 후보를 선택하는 단계; 및 c) 맞춤형 암 치료에서 사용하기 위한 적어도 하나의 압타머를 제제화하는 단계를 포함하는, 맞춤형 암 치료에서 사용하기 위한 압타머를 선택하는 방법. 일부 실시양태에서, 기능적으로 보강된 압타머 집단은 본원에 기재된 압타머 라이브러리 스크리닝 방법을 사용하여 제조된다.
일부 측면에서, a) 대조군 압타머와 비교하여 환자-유래 암 세포의 세포 사멸 또는 아폽토시스를 촉진하는 데 1.1배 (예를 들어 1.5배) 초과의 증가를 특징으로 하는 압타머 집단을 제공하는 단계; b) 압타머 집단으로부터 적어도 하나의 압타머 후보를 선택하는 단계; 및 c) 종양 국소 전달을 위해 적어도 하나의 압타머를 종양 치료와 조합하는 단계를 포함하는, 종양 표적 전달 시스템을 제조하는 방법. 일부 실시양태에서, 기능적으로 보강된 압타머 집단은 본원에 기재된 압타머 라이브러리 스크리닝 방법을 사용하여 제조된다.
암 세포의 아폽토시스를 유발하는 압타머
특정 측면에서, 아폽토시스 유도를 포함하여, 암 세포 (예를 들어, 유방암 세포, 예컨대 삼중-음성 유방암 세포)에 선택적으로 결합 및/또는 상기 암 세포를 선택적으로 사멸하는 압타머가 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 이러한 압타머를 포함하는 제약 조성물, 이러한 압타머를 사용하여 암을 치료 및/또는 암 세포를 사멸시키는 방법 및 이러한 압타머를 제조하는 방법이 본원에 제공된다.
특정 측면에서, 서열식별번호: 1-10 중 어느 하나 (표 1)와 적어도 60% 동일한 (예를 들어, 적어도 65% 동일한, 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 98% 동일한) 핵산 서열을 포함하는 압타머가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 압타머는 서열식별번호: 1-10 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 압타머는 서열식별번호: 1-10 중 어느 하나의 적어도 20개 (예를 들어, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 41, 적어도 42, 적어도 43, 적어도 44, 적어도 45, 적어도 46, 적어도 47, 적어도 48, 적어도 49, 적어도 50, 적어도 51, 적어도 52, 적어도 53개)의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 압타머는 서열식별번호: 1-10 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 압타머는 서열식별번호: 1-10으로 본질적으로 이루어진 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 압타머는 서열식별번호: 1-10으로 이루어진 서열을 갖는다.
<표 1>
예시적인 압타머 서열. 특정 실시양태에서 티민 염기는 우라실 염기로 대체될 수 있다 (예를 들어, RNA 압타머의 경우).
Figure pct00001
2개 이상의 핵산과 관련하여, 용어 "동일한" 또는 "% 동일성"은 하기에 기재된 디폴트 파라미터를 가진 BLAST 또는 BLAST 2.0 시퀀스 비교 알고리즘을 사용하거나, 수동 정렬 및 육안 검사 (예를 들어, NCBI 웹 사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 등 참조)에 의해 측정한 바와 같이 동일하거나 동일한 뉴클레오티드의 특정된 백분율 (즉, 비교 창 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 상응을 위해 비교 및 정렬된 경우, 특정된 영역에 걸쳐 약 60% 동일성, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 동일성)을 갖는 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 지칭한다.
특정 실시양태에서, 압타머는 100개 이하의 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 90개 이하의 뉴클레오티드 길이, 85개 이하의 뉴클레오티드 길이, 80개 이하의 뉴클레오티드 길이, 75개 이하의 뉴클레오티드 길이, 70개 이하의 뉴클레오티드 길이, 65개 이하의 뉴클레오티드 길이, 60개 이하의 뉴클레오티드 길이, 59개 이하의 뉴클레오티드 길이, 58개 이하의 뉴클레오티드 길이, 57개 이하의 뉴클레오티드 길이, 56개 이하의 뉴클레오티드 길이, 55개 이하의 뉴클레오티드 길이, 또는 54개 이하의 뉴클레오티드 길이)이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 압타머는 암 세포 (예를 들어, 인간 암 세포)에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 압타머는 암 세포에 접촉시 암 세포 (예를 들어, 인간 암 세포)의 세포 사멸 (예를 들어, 아폽토시스)을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 환자-유래 암 세포이다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 고형 종양 세포이다. 특정 실시양태에서, 암 세포는 암종 세포이다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 유방암 세포이다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 삼중-음성 유방암 세포 (즉, 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR) 및 HER/2neu에 대한 유전자를 발현하지 않는 유방암 세포)이다. 일부 실시양태에서, 압타머는 시험관내에서 암 세포에 접촉시 세포 사멸을 유도한다. 특정 실시양태에서, 압타머는 생체내에서 (예를 들어, 인간 및/또는 동물 모델에서) 암 세포에 접촉시 세포 사멸을 유도한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 압타머는 하나 이상의 화학적 변형을 포함한다. 예시적인 변형은 표 2에 제공되어 있다.
<표 2>
예시적인 화학적 변형.
Figure pct00002
특정 실시양태에서, 압타머는 말단 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 압타머는 폴리-에틸렌 글리콜 (PEG) (예를 들어, 0.5-40 kDa) (예를 들어, 압타머의 5' 말단부에 부착됨)로 화학적 변형된다. 일부 실시양태에서, 압타머는 5' 말단부 캡을 포함한다 (예를 들어, 반전 티미딘, 비오틴, 알부민, 키틴, 키토산, 셀룰로스, 말단 아민, 알킨, 아지드, 티올, 말레이미드, NHS이다). 특정 실시양태에서, 압타머는 3' 말단부 캡을 포함한다 (예를 들어, 반전 티미딘, 비오틴, 알부민, 키틴, 키토산, 셀룰로스, 말단 아민, 알킨, 아지드, 티올, 말레이미드, NHS이다).
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 압타머는 1개 이상 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 또는 54개)의 변형된 당류를 포함한다. 일부 실시양태에서, 압타머는 하나 이상의 2' 당 치환 (예를 들어, 2'-플루오로, 2'-아미노, 또는 2'-O-메틸 치환)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 압타머는 그의 백본에 잠금 핵산 (LNA), 잠금해제 핵산 (UNA) 및/또는 2'데옥시-2'플루오로-D-아라비노핵산 (2'-F ANA) 당류를 포함한다.
특정 실시양태에서, 압타머는 1개 이상 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 또는 54개)의 메틸포스포네이트 인터뉴클레오티드 결합 및/또는 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 결합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 압타머는 1개 이상 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 또는 54개)의 트리아졸 인터뉴클레오티드 결합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 압타머는 콜레스테롤 또는 디알킬 지질 (예를 들어, 그의 5' 말단부 상에)로 변형된다.
일부 실시양태에서, 압타머는 1개 이상의 변형된 염기 (예를 들어, BzdU, 나프틸, 트립타미노, 이소부틸, 5-메틸 시토신, 알킨 (디벤조시클로옥틴, 아지드, 말레이미드)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 압타머는 DNA 압타머 (예를 들어, D-DNA 압타머 또는 R-DNA 압타머)이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 압타머는 RNA 압타머 (예를 들어, D-RNA 압타머 또는 R-RNA 압타머)이다. 일부 실시양태에서, 압타머는 DNA와 RNA의 혼합물을 포함한다.
압타머는 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 압타머는 예를 들어, 고체 지지체 상에서 화학적으로 합성될 수 있다. 고체상 합성은 포스포라미다이트 화학을 사용할 수 있다. 간단히 말하면, 고체 지지된 뉴클레오티드는 탈트리틸화된 다음에, 적절하게 활성화된 뉴클레오시드 포스포라미다이트와 커플링되어 포스파이트 트리에스테르 연결을 형성한다. 이어서 캡핑이 발생하고, 산화제, 일반적으로 아이오딘으로 포스파이트 트리에스테르를 산화시킨다. 이어서 주기를 반복하여 압타머를 어셈블리할 수 있다.
치료 방법
특정 측면에서, 본원에 제공된 압타머 (예를 들어, 치료 유효량의 압타머)를 포함하는 제약 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 비경구 투여용으로 제제화된다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 암을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 특정 실시양태에서, 암은 암종이다. 일부 실시양태에서, 암은 유방암이다. 일부 실시양태에서, 유방암은 삼중-음성 유방암이다.
"제약상 허용되는 담체"는 활성제의 투여 및 대상체에 의한 흡수를 보조하며 환자에게 심각한 유해한 독성 효과를 일으키지 않으면서 본원에 기재된 조성물에 포함될 수 있는 물질을 지칭한다. 제약상 허용되는 부형제의 비제한적인 예는 물, NaCl, 생리 식염수 용액, 락테이트화 링거(lactated Ringer's), 생리 수크로스(normal sucrose), 생리 글루코스(normal glucose), 결합제, 충전제, 붕해제, 윤활제, 코팅제, 감미제, 향료, 염 용액 (예컨대, 링거액), 알콜, 오일, 젤라틴, 탄수화물 예컨대 락토스, 아밀라제 또는 전분, 지방산 에스테르, 히드록시메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리딘, 및 색소 등을 포함할 수 있다. 이러한 제제는 멸균될 수 있으며, 목적하는 경우, 본원에 기재된 조성물과 유해하게 반응하지 않는, 보조제 예컨대 윤활제, 방부제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 주는 염, 완충제, 착색제, 및/또는 방향족 물질 등과 혼합될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다른 제약 부형제가 유용하다는 것을 인식할 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 1종 이상의 압타머를 포함하는 제약 조성물의 투여를 포함하는, 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 암은 유방암이다. 일부 실시양태에서, 암은 삼중-음성 유방암이다. 따라서, 특정 측면에서, 본원에 기재된 압타머 및/또는 제약 조성물을 대상체에게 전달하는 방법이 본원에 제공된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물 및 압타머는, 예를 들어, 방사선 요법 및 종양의 외과적 절제와 같은 임의의 다른 통상적인 항암 치료와 함께 투여될 수 있다. 이들 치료는 필요에 따라 및/또는 지시된 바와 같이 적용될 수 있고 본원에 기재된 제약 조성물, 투여 형태, 및 키트의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 발생할 수 있다.
특정 실시양태에서, 방법은 압타머의 다중 용량의 투여를 포함한다. 별도의 투여는 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회 투여를 포함하여 임의의 수의 2회 이상의 투여 (예를 들어, 용량)를 포함할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 치료 방법을 모니터링하기 위해 관련 기술분야에 공지된 방법 및 본원에 제공된 다른 모니터링 방법에 따라, 수행할 투여 횟수, 또는 1회 이상의 추가 투여를 수행하는 것의 바람직함을 쉽게 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 용량은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일 또는 1, 2, 3, 또는 4주에 의해 분리될 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 방법은 대상체에게 박테리아의 1회 이상의 투여를 제공하는 방법을 포함하며, 여기서 투여 횟수는 대상체를 모니터링함으로써 결정될 수 있고, 모니터링 결과에 기초하여, 1회 이상의 추가 투여를 제공할 지 여부를 결정한다. 1회 이상의 추가 투여를 제공할 지 여부를 결정하는 것은 종양 성장의 표시 또는 종양 성장의 억제, 새로운 전이의 출현 또는 전이의 억제, 항-박테리아 항체 역가, 대상체의 항-종양 항체 역가, 대상체의 전반적인 건강 및/또는 대상체의 체중을 포함하나 이에 제한되지는 않는 여러 가지의 모니터링 결과에 기초할 수 있다.
투여 사이의 기간은 여러 가지의 기간 중 어느 하나일 수 있다. 투여 사이의 기간은 투여 횟수, 대상체가 면역 반응을 일으키는 기간 및/또는 대상체가 정상 조직으로부터 박테리아를 제거하는 기간과 관련하여 기재된 바와 같은, 모니터링 단계를 포함한 여러 가지의 인자 중 어느 하나의 함수일 수 있다. 한 예에서, 기간은 대상체가 면역 반응을 일으키는 기간의 함수일 수 있고; 예를 들어, 기간은 약 1주 초과, 약 10일 초과, 약 2주 초과, 또는 약 1개월 초과와 같이 대상체가 면역 반응을 일으키는 기간보다 길 수 있고; 다른 예에서, 기간은 약 1주 미만, 약 10일 미만, 약 2주 미만, 또는 약 1개월 미만과 같이 대상체가 면역 반응을 일으키는 기간보다 짧을 수 있다. 또 다른 예에서, 기간은 대상체가 정상 조직으로부터 박테리아를 제거하는 기간의 함수일 수 있고; 예를 들어, 기간은 약 1일 초과, 약 2일 초과, 약 3일 초과, 약 5일 초과 또는 약 1주 초과와 같이 대상체가 정상 조직으로부터 박테리아를 제거하는 기간보다 길 수 있다.
본원에 기재된 압타머의 유효 용량은 환자에 대한 독성이 거의 없이, 특정한 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 압타머의 양이다. 유효 용량 수준은 본원에 기재된 방법을 사용하여 확인될 수 있으며 투여되는 특정한 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배설 속도, 치료 기간, 사용되는 특정한 화합물과 조합하여 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료 중인 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전 병력, 및 의료 분야에 널리 공지된 유사 인자를 포함한 여러 가지의 약물동태학적 인자에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 암 요법의 유효 용량은 치료 효과를 생성하는 데 효과적인 최저 용량인 치료제의 양이 될 것이다. 이러한 유효 용량은 일반적으로 상기에 기재된 인자에 따라 달라질 것이다.
투여 경로의 예는 경구 투여, 직장 투여, 국소 투여, 흡입 (비강) 또는 주사를 포함한다. 주사에 의한 투여는 정맥내 (IV), 병변내, 종양 주위, 근육내 (IM), 및 피하 (SC) 투여를 포함한다. 본원에 기재된 조성물은 경구, 비경구, 장내, 정맥내, 종양내, 복강내, 국소, 경피 (예를 들어, 임의의 표준 패치 사용), 피내, 안과, 비강(내)로, 비-경구, 예컨대 에어로졸, 흡입, 피하, 근육내, 협측, 설하, (경)직장, 질, 동맥내, 및 척수강내, 경점막 (예를 들어, 설하, 설측, (경)협측, (경)요도, 질 (예를 들어, 경질 및 질주위), 이식, 방광내, 폐내, 십이지장내, 위내, 및 기관지내를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 효과적인 경로에 의해 임의의 형태로 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 박테리아 조성물은 경구, 직장, 국소, 방광내로, 배액 림프절 내로 또는 그에 인접하여 주사에 의해, 또는 정맥내로, 흡입 또는 에어로졸에 의해, 또는 피하로 투여된다
투여 요법은 여러 가지의 방법 및 양 중 임의의 것일 수 있고, 공지된 임상 인자에 따라 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 의학 분야에 공지된 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 대상체의 종, 크기, 신체 표면적, 연령, 성별, 면역적격성, 종양 치수 및 일반 건강, 투여할 특정한 미생물, 투여 기간 및 경로, 질환의 종류 및 단계, 예를 들어, 종양 크기, 및 동시에 투여되는 약물과 같은 다른 화합물을 포함한 다수의 인자에 따라 달라질 수 있다.
본원에 기재된 치료 방법은 원발성 종양, 이차성 종양 또는 전이의 치료, 뿐만 아니라 재발성 종양 또는 암의 치료에 적합할 수 있다. 본원에 기재된 제약 조성물의 용량은 투여 형태, 투여 경로, 표적 질환의 정도 또는 단계 등에 따라 적절하게 설정 또는 조정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 용량은 암을 예방하거나, 그의 발병을 지연시키거나, 그의 진행을 둔화시키거나 중지시키거나, 암의 재발을 예방하거나, 대상체의 전체 생존에 기여하기에 충분하다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 투여량이 사용되는 특정 화합물의 강도, 뿐만 아니라 대상체의 연령, 종, 상태, 및 체중을 포함한 여러 가지의 인자에 따라 달라질 것임을 인식할 것이다. 용량의 크기는 또한 투여의 경로, 시기, 및 빈도뿐만 아니라 특정한 화합물의 투여 및 목적하는 생리적 효과를 동반할 수 있는 임의의 유해 부작용의 존재, 본성, 및 정도에 의해 결정될 것이다.
적합한 용량 및 투여 요법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 범위-측정 기술에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 치료는 화합물의 최적 용량보다 더 적은 투여량으로 시작된다. 그 후, 투여량은 상황 하에 최적의 효과가 도달될 때까지 조금씩 증가시킨다. 효과적인 투여량 및 치료 프로토콜은 예를 들어, 실험실 동물에서 낮은 용량으로 시작한 다음에 효과를 모니터링하면서 투여량을 증가시키고 투여 요법을 또한 체계적으로 변경하는 등 일상적이고 통상적인 수단에 의해 결정될 수 있다. 동물 연구는 통상 킬로그램 중량당 생물 활성제의 최대 허용 용량 ("MTD")을 결정하는 데 사용된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 인간을 포함한, 다른 종에서, 독성을 피하면서 효능에 대한 용량을 통상적으로 외삽한다.
상기에 따라, 치료적 적용에서, 본원에 제공된 압타머의 투여량은 선택된 투여량에 영향을 미치는 다른 인자들 중에서, 특이적 압타머, 수용 환자의 연령, 체중, 및 임상 상태, 그리고 요법을 투여하는 임상의 또는 개업의의 경험 및 판단에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 용량은 종양의 성장을 둔화시키고, 바람직하게는 퇴행시키고, 가장 바람직하게는 암의 완전한 퇴행을 유발하기에 충분하여야 한다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료될 수 있는 암의 예는 혈액 악성종양, 급성 비림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 전골수성 백혈병, 성인 T-세포 백혈병, 무백혈병성 백혈병, 백혈구증가성 백혈병, 호염기구성 백혈병, 모세포 백혈병, 소 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 피부 백혈병, 배아성 백혈병, 호산구성 백혈병, 그로스 백혈병(Gross' leukemia), 리이더 세포성 백혈병(Rieder cell leukemia), 실링 백혈병(Schilling's leukemia), 줄기 세포 백혈병, 아백혈성 백혈병, 미분화 세포 백혈병, 모발상 세포 백혈병, 혈모세포성 백혈병, 혈구모세포성 백혈병, 조직구성 백혈병, 줄기 세포 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 백혈구감소성 백혈병, 림프성 백혈병, 림프모구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프원성 백혈병, 림프성 백혈병, 림프육종 세포 백혈병, 비만 세포 백혈병, 거핵구성 백혈병, 소골수모구성 백혈병, 단핵구성 백혈병, 골수모구성 백혈병, 골수구성 백혈병, 골수성 과립구성 백혈병, 골수단핵구성 백혈병, 내겔리(Naegeli) 백혈병, 형질 세포 백혈병, 형질세포성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 선방 암종, 선방상 암종, 선낭성 암종, 선양 낭성 암종, 선종성 암종, 부신 피질의 암종, 폐포 암종, 폐포 세포 암종, 기저 세포 암종, 기저세포성 암종(carcinoma basocellulare), 기저세포양 암종, 기저편평세포 암종, 기관지폐포 암종, 세기관지성 암종, 기관지원성 암종, 대뇌양 암종, 담관세포 암종, 융모막 암종, 콜로이드 암종, 면포 암종, 자궁체부 암종, 사상 암종, 흉갑 암종, 피부 암종, 원통 암종, 원통 세포 암종, 관 암종, 경성 암종(carcinoma durum), 배아성 암종, 뇌양 암종, 표피양(epiennoid) 암종, 선양 상피 암종, 외방성 암종, 궤양 바깥 암종(carcinoma ex ulcere), 섬유성 암종, 젤라틴양 암종, 젤라틴성 암종, 거대 세포 암종, 인환 세포 암종, 단순 암종, 소세포 암종, 솔라노이드 암종, 구상 세포 암종, 방추 세포 암종, 해면체 암종, 편평 암종(squamous carcinoma), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma), 스트링 암종(string carcinoma), 모세혈관확장 암종(carcinoma telangiectaticum), 모세혈관확장성 암종(carcinoma telangiectodes), 이행 세포 암종, 결절 암종(carcinoma tuberosum), 결절성 암종(tuberous carcinoma), 사마귀양 암종, 융모 암종, 거대세포성 암종, 선상 암종, 과립막 세포 암종, 모발-기질 암종, 혈액양 암종(hematoid carcinoma), 간세포성 암종, 허슬 세포 암종(Hurthle cell carcinoma), 유리질 암종, 부신양(hypernephroid) 암종, 유아 배아성 암종, 상피내 암종(carcinoma in situ), 표피내 암종, 상피내 암종(intraepithelial carcinoma), 크롬페처 암종(Krompecher's carcinoma), 쿨치츠키 세포 암종(Kulchitzky-cell carcinoma), 대세포 암종, 수정체 암종, 수정체성 암종, 지방종성 암종, 림프상피 암종, 수질 암종, 수질성 암종, 멜라닌 암종, 연성 암종, 점액성 암종(mucinous carcinoma), 점액분비성 암종(carcinoma muciparum), 점액세포성 암종(carcinoma mucocellulare), 점액표피양 암종, 점액 암종(carcinoma mucosum), 점액성 암종(mucous carcinoma), 점액종성 암종(carcinoma myxomatodes), 비인두 암종, 귀리 세포 암종, 골화성 암종, 유골 암종, 유두상 암종, 문맥주위 암종, 자궁경부상피내암, 가시 세포 암종, 수질양 암종(pultaceous carcinoma), 신장의 신장 세포 암종, 예비 세포 암종, 육종양 암종, 슈나이더 암종, 경성 암종, 음낭 암종, 연골육종, 섬유육종, 림프육종, 흑색육종, 점액육종, 골육종, 자궁내막 육종, 간질 육종, 유잉 육종, 근막 육종, 섬유모세포 육종, 거대 세포 육종, 아베메티 육종(Abemethy's sarcoma), 지방 육종(adipose sarcoma), 지방육종(liposarcoma), 포상연부육종, 사기질모세포성 육종, 포도상 육종, 녹색종 육종, 융모막 암종, 배아성 암종, 빌름즈 종양 육종(Wilms' tumor sarcoma), 과립구성 육종, 호지킨 육종, 특발성 다발성 색소침착 출혈 육종, B 세포의 면역모세포성 육종, 림프종, T-세포의 면역모세포성 육종, 옌센 육종(Jensen's sarcoma), 카포시 육종, 쿠퍼 세포 육종(Kupffer cell sarcoma), 혈관육종, 백혈육종, 악성 중간엽종 육종, 방골성 육종, 망상내피 육종, 횡문근육종, 장액낭종 육종, 활막 육종, 모세혈관확장성 육종, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경모세포종, 방광암, 유방암, 난소암, 폐암, 결장직장암, 횡문근육종, 원발성 혈소판증가증, 원발성 거대글로불린혈증, 소세포 폐 종양, 원발성 뇌종양, 위암, 결장암, 악성 췌장 인슐린종, 악성 유암종, 전암성 피부 병변, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경모세포종, 식도암, 비뇨생식기암, 악성 고칼슘혈증, 자궁경부암, 자궁내막암, 부신 피질 암, 하딩-파세이 흑색종(Harding-Passey melanoma), 소아 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 악성 흑색종, 선단-흑자성 흑색종, 무멜라닌 흑색종, 양성 소아 흑색종, 클라우드만 흑색종(Cloudman's melanoma), S91 흑색종, 결절성 흑색종 손발톱밑 흑색종, 표재 확산성 흑색종, 형질세포종, 결장직장암, 직장암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물은 육종의 치료에 관한 것이다. 용어 "육종"은 일반적으로 배아 결합 조직과 같은 물질로 구성되고 일반적으로 원섬유성, 이종, 또는 균질 물질에 매립된 밀집된 세포로 구성된 종양을 지칭한다. 육종은 연골육종, 섬유육종, 림프육종, 흑색육종, 점액육종, 골육종, 자궁내막 육종, 간질 육종, 유잉 육종, 근막 육종, 섬유모세포성 육종, 거대 세포 육종, 아베메티 육종, 지방 육종, 지방육종, 포상연부육종, 사기질모세포성 육종, 포도상 육종, 녹색종 육종, 융모막 암종, 배아성 암종, 빌름즈 종양 육종, 과립구성 육종, 호지킨 육종, 특발성 다발성 색소침착 출혈 육종, B 세포의 면역모세포성 육종, 림프종, T-세포의 면역모세포성 육종, 옌센 육종, 카포시 육종, 쿠퍼 세포 육종, 혈관육종, 백혈육종, 악성 중간엽종 육종, 방골성 육종, 망상내피 육종, 라우스 육종(Rous sarcoma), 장액낭종 육종, 활막 육종, 및 모세혈관확장성 육종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 추가의 예시적인 신생물은 호지킨병, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경모세포종, 유방암, 난소암, 폐암, 횡문근육종, 원발성 혈소판증가증, 원발성 거대글로불린혈증, 소세포 폐 종양, 원발성 뇌종양, 위암, 결장암, 악성 췌장 인슐린종, 악성 유암종, 전암성 피부 병변, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경모세포종, 식도암, 비뇨생식기암, 악성 고칼슘혈증, 자궁경부암, 자궁내막암, 및 부신 피질 암을 포함한다.
일부 실시양태에서, 치료되는 암은 흑색종이다. 용어 "흑색종"은 피부 및 기타 기관의 멜라닌세포계로부터 발생하는 종양을 의미하는 것으로 간주된다. 흑색종의 비제한적인 예는 하딩-파세이 흑색종, 소아 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 악성 흑색종, 선단-흑자성 흑색종, 무멜라닌 흑색종, 양성 소아 흑색종, 클라우드만 흑색종, S91 흑색종, 결절성 흑색종 손발톱밑 흑색종, 및 표재 확산성 흑색종이다.
본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 치료할 수 있는 특정한 범주의 종양은 림프증식성 장애, 유방암, 난소암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁내막암, 골암, 간암, 위암, 결장암, 결장직장암, 췌장암, 갑상선의 암, 두경부암, 중추 신경계의 암, 말초 신경계의 암, 피부암, 신장암, 뿐만 아니라 상기 모두의 전이를 포함한다. 특정한 유형의 종양은 간세포성 암종, 간세포종, 간모세포종, 횡문근육종, 식도 암종, 갑상선 암종, 신경절신경모세포종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 유잉 종양, 평활근 육종, 횡문근 육종, 침윤성 관 암종, 유두상 선암종, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종 (널리 분화, 중등도 분화, 거의 분화되지 않음 또는 미분화), 세기관지 폐포 암종, 신장 세포 암종, 부신종, 부신양 선암종, 담관 암종, 융모막 암종, 정상피종, 배아성 암종, 빌름즈 종양, 고환 종양, 소세포, 비소세포 및 대세포 폐 암종을 포함한 폐 암종, 방광 암종, 신경교종, 별아교세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 망막모세포종, 신경모세포종, 결장 암종, 직장 암종, 다음을 포함한 모든 유형의 백혈병 및 림프종을 포함한 조혈 악성종양: 급성 골수 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 비만 세포 백혈병, 다발성 골수종, 골수성 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종을 포함한다.
특정 실시양태에서 치료되는 암은 또한 전암성 병변, 예를 들어, 광선 각화증 (일광 각화증), 기태 (이형성 모반), 광선 입술염 (농부 입술), 피각, 바렛 식도(Barrett's esophagus), 위축성 위염, 선천성 각화이상증, 철결핍성 연하곤란, 편평태선, 구강 점막하 섬유증, 광선 (일광) 탄력섬유증 및 자궁경부 이형성증을 포함한다.
일부 실시양태에서 치료되는 암은 담관종, 결장 용종, 선종, 유두종, 낭선종, 간 세포 선종, 포상 기태, 신세관성 선종, 편평 세포 유두종, 위 용종, 혈관종, 골종, 연골종, 지방종, 섬유종, 림프관종, 평활근종, 횡문근종, 별아교세포종, 모반, 수막종, 및 신경절신경종을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 예를 들어 내배엽, 외배엽 또는 간엽 기원의, 비-암성 또는 양성 종양을 포함한다.
실시예
실시예 1 - 실시예 2 및 3에서 사용하기 위한 시약
결합 완충제 (x10)를 제조하기 위해, 50 mg tRNA를 칭량하고 50 ml 튜브에 분배하고, 5 ml의 아지드 용액 (PBSX1 중 10% 아지드), 0.5 ml MgCl2 (1M) 및 44.5 mL PBSX1을 첨가하였다. 10% 인간 혈청을 가진 배지는 표적 암 세포의 표준 성장 배지 (예를 들어, DMEM, IMDM, RPMI 등)에 10% 인간 혈청을 첨가함으로써 제조하였다. 무작위 DNA 라이브러리는 DNA 라이브러리를 DNase/RNase 미함유 초순수 (UPW)에 최종 농도 1 mM으로 용해시키고 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에 분취함으로써 생성시켰다. 압타머 캡핑 (캡 3'및 캡 5') 용액은 프라이머 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열을 제조하고 DNase/RNase 미함유 UPW에 캡 3'및 캡 5' 각각을 최종 농도 100 mM으로 용해시키고 상기 부피를 에펜도르프 튜브에 분취함으로써 제조하였다. 50 mM 농도의 캡 3'및 캡 5' 둘 다의 튜브를 준비하였다. 상기 용액은 새로 제조하여 4℃에서 보관한 다음에, 각각의 실험 전에 실온으로 예열하였다.
실시예 2 - 결합 세포-SELEX: 표적 세포에 대한 결합 압타머의 선택 (도 2 참조)
a. 암 세포에 SELEX 결합, 라운드 #1
세포를 하루 전에 준비하였다. 세포를 시험되는 세포의 성장 속도에 따라 1:2 또는 1:3의 비로 분할하였다. 세포를 PI로 계수하고 시토플렉스(cytoflex)에서 시행하였다.
압타머 풀은 표 3에 기재된 바와 같이 DNase/RNase 미함유 에펜도르프 튜브에서 제조하였다.
<표 3>
결합 SELEX의 라운드 1을 위한 라이브러리 제조
Figure pct00003
압타머 풀은 95℃에서 5분 동안 가열하고, 스핀 다운한 다음에, 얼음에서 10분 동안 냉각시킴으로써 변성시켰다. 438.21 μl 배지와 10% 인간 혈청을 압타머 풀에 첨가하고, 튜브를 실온에서 적어도 10분 동안 인큐베이션하였다. 5.0E6 세포를 에펜도르프 튜브에 옮기고 300xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고 세포를 1 ml의 배지에 재현탁시켰다. 세포를 다시 300xg에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버렸다. 이어서 압타머 풀을 세포 펠렛에 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 37℃, 50 rpm에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 300xg에서 5분 동안 원심분리하고, 결합되지 않은 서열은 대부분의 상청액 (튜브에 약 10 μl 상청액만 남김)을 제거함으로써 제거하였다. 이어서 세포는 세포를 1 ml 배지로 현탁시키고, 세포를 300xg에서 5분 동안 원심분리하고, 대부분의 상청액 (튜브에 약 10 μl 상청액만 남김)을 제거하고, 세포를 새로운 튜브에 옮기는 단계를 2회 반복함으로써 1 ml 배지를 사용하여 세척하였다. 결합된 DNA를 용리시키기 위해, 590 μL UPW를 펠렛에 첨가한 다음에 95℃에서 10분 동안 가열하였다. 이어서 반응을 13.1xg에서 5분 동안 실온에서 원심분리하고, 상청액을 새로운 튜브에 옮겼다.
PCR 보정은 하기 조건으로 준비하였다: 30% 및 60% 주형, 30 및 36 사이클, 프라이머 비율 1:10이며, Tm은 2개의 프라이머 중 더 낮은 Tm이다. 반응은 표 4에 따라 어셈블리되고, 볼텍싱되고 스핀 다운되었다. 실험을 얼음 상에서 그리고 헤르큘라제 첨가 후 신속하게 수행하였다.
<표 4>
PCR 보정
Figure pct00004
8개의 PCR 튜브를, 60% 주형용으로 4개 및 30% 주형용으로 4개 준비하였다. 음성의 60% 주형에 12 μl UPW를 첨가하고 음성의 30% 주형에 6 μl UPW를 첨가하였다. 동일한 부피의 용리액을 시험 튜브에 첨가하였다. 8 μl의 PCR 보정 믹스를 각각의 60% 주형 튜브에 첨가하고 14 μl의 믹스를 각각 30% 주형 튜브에 첨가하였다. 마커를 UPW로 10 μM 농도로 희석하고 로딩 염료와 혼합함으로써 lib의 마커를 제조하였다. 마커를 4℃에서 보관할 수 있으며 라이브러리 보정에 사용할 수 있다. 다음과 같이 프로그램을 사용하여 PCR 반응을 시행한다 (Tm은 프라이머 Tm에 기초하여 변경될 수 있다):
<표 5>
결합을 위한 PCR 프로그램
Figure pct00005
20 μl의 각각의 샘플을 4 μl 로딩 염료와 함께 3% 아가로스 겔에 로딩하였다. 마커 크기에서 가장 강한 단일 가닥 밴드가 단리되었다. 가장 강한 밴드를 발생시킨 PCR 반응 조건을 사용하여 대규모 PCR 반응을 시행하였다. 예를 들어, 30% 주형, 30 사이클, 1:10, 및 Tm=56℃의 조건을 대규모 PCR 반응에 사용하였다.
<표 6>
대규모 PCR
Figure pct00006
샘플은 10k 아미콘(Amicon)® 울트라 센트리퓨갈 필터(Ultra Centrifugal Filter)로 농축하였다. 컬럼을 지정된 튜브에 삽입하고 500 μl의 샘플을 각각의 튜브에 첨가하였다. 튜브를 14,000xg에서 20분 동안 원심분리하였다. 각각의 컬럼을 거꾸로 새로운 에펜도르프 튜브에 옮기고 새로운 튜브를 1000xg에서 2분 동안 원심분리하였다. 모든 튜브의 샘플을 병합하여 총 약 80 내지 100 μl를 수득하였다.
인서트를 가진 HPLC 바이알을 준비하였다. 샘플의 부피를 측정하고 최대 102 μl의 샘플을 인서트에 옮겼다. 샘플은 완료될 때까지 HPLC 바이알을 통해 시행되었으며, 이는 약 20분이 소요되었다. HPLC로부터의 결과를 분석하였다. 분획을 3% 아가로스 겔 상에서 시행하고 목적하는 분획을 병합하였다. DNA를 세척하고 나노 드롭(Nano drop)을 사용하여 농도를 결정하였다.
b. 암 세포에 SELEX 결합, 라운드 #2
라운드 #2는 하기에 기재된 변경으로 라운드 #1의 단계를 반복함으로써 수행하였다. 압타머 풀은 표 7에 기재된 바와 같이 DNase/RNase 미함유 에펜도르프 튜브에서 제조하였다.
<표 7>
라운드 #2에 대한 풀 제조
Figure pct00007
5.0E6 세포를 에펜도르프 튜브에 옮겼다 (이 번호는 세포 유형에 따라 변경될 수 있으나 이전 조건보다 더 제한되어야 한다). 에펜도르프 튜브를 37℃, 50 rpm에서 50분 동안 (라운드 # 1에서와 같이 1시간이 아님) 인큐베이션하였다. 세척 및 용리 단계는 라운드 #1과 동일하였다. 예를 들어, PBMC에 대해 음성 선택을 수행하였다. 80 μl 결합 완충제X1을 아지드 없이 펠렛에 첨가하였다. 결합된 DNA는 95℃에서 10분 동안 가열함으로써 용리하였고 13.1xg에서 5분 동안 실온에서 원심분리하였다. 상청액을 새로운 튜브에 옮겼다. 용리된 DNA는 95℃에서 5분 동안 가열 (스핀 다운)한 다음에 얼음에서 10분 동안 냉각함으로써 변성시켰다. 220 μl 배지와 10% 인간 혈청을 첨가하였다. PBMC의 바이알을 해동하고 계수하고, 5.0E6 세포의 양을 에펜도르프 튜브에 분취하였다. 세포를 300xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고 1 ml의 깨끗한 배지 (보충제 없이)를 첨가하여 세포를 현탁시켰다. 세포를 다시 300xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고 신선한 배지를 펠렛에 첨가하였다. 에펜도르프 튜브는 37℃, 50 rpm에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 300xg에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 새로운 튜브에 옮겨졌다. 증폭 및 정제는 용리액으로부터 150 μl (총 500 μl 샘플)로 라운드 #1의 반복 절차에 의해 수행하였다.
c. 암 세포에 SELEX 결합, 라운드 #3
라운드 #3은 조건의 제한을 증가시키면서 라운드 #2의 단계를 반복함으로써 수행하였다: 예를 들어, 3.0E6 세포를 인큐베이션에 사용하고 인큐베이션 시간을 40분으로 단축하였다.
실시예 3 - 현탁된 세포에 대한 기능적 SELEX: 표적 세포에 대한 기능적 압타머의 선택 (도 3 참조)
로그 PCR 보정은 실시예 3에서 라운드 #3으로부터의 상청액에 대해 준비하였다. 샘플은 8, 10, 12 및 14 사이클의 PCR로 표 8을 사용하여 제조하였다 (처음 3 사이클은 Tm 56℃를 사용하고 나머지는 프라이머의 Tm을 사용). 각각의 샘플 20 μl를 4 μl 로딩 염료와 함께 3% 아가로스 겔에 로딩하였다.
<표 8>
로그 PCR 보정
Figure pct00008
예를 들어, 15% 주형, 12 사이클, 및 Tm = 56℃의 조건을 사용하여 대규모 PCR 반응을 시행하였다.
<표 9>
대규모 PCR
Figure pct00009
모든 PCR 튜브로부터의 샘플을 병합하고, HPLC를 사용하여 102 μl의 샘플을 정제하였다. 정제된 DNA의 농도는 큐빗(Qubit)으로 측정하였다.
비드는 표 10에 따라 이온 토렌트(Torrent)™를 위한 인비트로겐(Invitrogen)의 주형 비드 2 nM을 사용하여 제조하였다.
<표 10>
비드 제조
Figure pct00010
정제된 DNA 샘플을 95℃에서 5분 동안 가열함으로써 변성시키고, 원심분리한 다음에 얼음에서 10분 동안 냉각시켰다. 튜브는 실온에서 30분 동안, 90/60rpm에서 인큐베이션하였다. 800 μl 배지와 10% 인간 혈청을 풀에 첨가하였다.
5.0E6 세포를 에펜도르프 튜브에 옮겼다. 음성 (세포만) 및 양성 (세포 및 독소)의 두 가지 대조군을 준비하였다. 세포를 300xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고 1 ml의 깨끗한 배지 (보충제 없이)를 첨가하였다. 세포를 300xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고 비드 풀을 펠렛에 첨가하고 부드럽게 혼합하였다. 에펜도르프 튜브는 37℃, 90/60 rpm에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음에, 300xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하였다. 800 μl 배지와 10% 인간 혈청 및 0.8 μl 카스파제 3/7 그린을 첨가하였다. 튜브는 37℃에서 15분 인큐베이션하였다. 사멸 복합체와 생존 복합체로서 표시된 BSA로 코팅된 두 개의 FACS 튜브를 준비하였다. 샘플은 BD 팩스멜로디(FACSMelody)™ 세포 분류기에서 시행하였다 (수득량을 조정하기 위해 대조군을 먼저 시행하였다). 샘플은 라운드 1의 경우의 수율과 라운드 2의 경우의 순도에 기초하여 분류하였다. 분류된 세포, 튜브 #1에서 비드 압타머와 복합체로 사멸 암 세포, 및 튜브 #2에서 비드 압타머와 복합체로 생존 암 세포를 둘 다 수득하였다. 결합된 DNA는 95℃에서 10분 동안 가열함으로써 용리하고 300xg에서 5분 동안 실온에서 원심분리하였다. 상청액을 새로운 튜브에 옮겼다.
PCR 보정은 하기 조건으로 준비하였다: 15% 주형 (충분하지 않은 경우 30% 초과로 업스케일), 및 처음 3 사이클을 변경하지 않으면서 14 내지 22 사이클 (표 11) 및 2개의 프라이머 중 더 낮은 Tm을 Tm으로서 사용.
<표 11>
비드 전 PCR 보정
Figure pct00011
PCR 반응은 다음과 같은 프로그램으로 수행하였다:
<표 12>
PCR 프로그램
Figure pct00012
20 μl의 각각의 샘플을 4 μl 로딩 염료와 함께 3% 아가로스 겔에 로딩하였다. 대규모 PCR을 다음과 같이 시행하였다:
<표 13>
대규모 PCR
Figure pct00013
인서트를 가진 HPLC 바이알을 준비하였다. 샘플의 부피를 측정하고 부피 (102 μl)를 인서트에 옮겼다. 바이알을 캡으로 닫고 위치 P1A1에 배치하였다. 샘플은 완료될 때까지 HPLC 바이알을 통해 시행되었으며, 이는 약 20분이 소요되었다. HPLC로부터의 결과를 분석하고, 필요한 경우, 분획을 3% 아가로스 겔 상에서 시행하였다. 농도는 큐빗으로 측정하고 2 nM 비드를 준비하였다. 라운드 #2의 절차는 필요한 만큼 많은 라운드를 반복하였다. 생성된 풀에서 가장 풍부한 기능적 압타머는 표준 방법에 기초하여 서열결정하였다. 식별된 압타머는 암 세포를 사용한 아폽토시스 검정에서 검증하였다.
실시예 4 - 예시적인 기능적 세포-SELEX 절차
암 세포에 대한 3 라운드의 결합 SELEX를 수행하였다 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같이). 구체적으로, 불변 영역에 의해 플랭크된 무작위 코어로 구축된 ssDNA 라이브러리는 불변 영역-상보성 올리고뉴클레오티드 (캡으로 칭함)의 존재하에 폴딩된다. 폴딩은 95℃에서 5분 동안 인큐베이션하고 얼음에서 10분 동안 냉각시키고, 추가로 37℃에서 10분 인큐베이션에 의해 수행하였다. 폴딩된 라이브러리와 세포를 10% 인간 혈청이 보충된 표적 세포 배지에서 1시간 동안 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 단계의 라이브러리 농도는 500 nM으로 설정하였다. 각각의 라운드 후, 샘플은 세척하여 결합되지 않은 후보를 첫 번째 선택 라운드에서는 104배로, 그리고 두 번째 라운드에서는 106배로 희석하였다. 다음 라운드의 입력 라이브러리를 제조하기 위해, 결합된 분획은 95℃에서 10분 동안 인큐베이션에 의해 용리되었다. 음성 선택에 대한 제2 라운드로부터 첨가되었다. 용리된 라이브러리를 다시 폴딩하고 상기에 기재된 바와 같이 비표적 세포와 함께 인큐베이션하였고, 이번에는 결합되지 않은 분획은 비대칭 PCR (aPCR) 공정의 입력으로서 간주되었다. ssDNA는 아질런트(Agilent) 1100 기기에서 분취용 HPLC를 사용하여 aPCR 생성물로부터 정제하였다. 평가를 위해 모든 라운드로부터의 산출물 라이브러리의 샘플을 보관하였다.
3 라운드의 결합 SELEX 후에, 결합-보강된 라이브러리는 각각의 피코리터 액적이, 평균적으로, 결합-보강된 라이브러리의 단일 서열을 함유하도록 유-중-수 에멀젼에서 마이크로비드로 증폭된다. 이어서 이온토렌트(IonTorrent) 원터치(OneTouch)를 통해, 에멀젼 PCR을 수행하여, 각각의 압타머를 액적 피코반응기 내부의 비드 표면 상에 증폭시킨다. 이어서 에멀젼이 파단된다. 압타머 비드 라이브러리는 10^8개의 마이크로비드로 구성되며, 각각 단일 올리고의 다수의 카피로 클러스터링된다. 이 라이브러리는 기능적 SELEX의 첫 번째 라운드에서 사용된다. 비드 라이브러리는 라이브러리의 플랭킹 영역을 보완하는 올리고 캡을 포함하는 신속한 열적 램프(thermal ramp)로 세포와의 인큐베이션을 위해 제조되며, 이들은 형광 기능적 표지를 한다 (도 5A).
비드는 몇몇 후보를 보유할 수 있다. 각각의 비드가 보유한 후보가 많을수록, 주어진 수의 비드에 대해 더 많은 여러 가지의 후보를 스크리닝할 수 있다. 그러나, 단일 비드에서 후보 수의 증가는 후보 각각에 대한 유효 농도를 감소시킨다. 클러스터링된 비드를 생성시키기 위해 이온 양성자(Ion Proton) 샘플 제조 이온(Ion) PI™ Hi-Q™ OT2 200 키트 및 이온 원터치(Ion OneTouch)™ 자동화 샘플 제조 시스템을 사용하였다. 키트와 함께 제공되는 프로토콜은 높은 백분율의 모노클로날 비드 생성이 우선 순위인 양성자 서열결정 기술에 최적화되어 있다. 약 10% 주형화된 비드를 생성시키기 위해 제조업체가 권장하는 6-8 μl의 100 pM 스톡 대신에, 1 μl의 2 nM 스톡을 사용하여 약 40% 주형화된 비드를 생성시켰다. 이 주형화된 비드 퍼센트에 맞는 푸아송(Poisson) 분포는 주형화된 비드 집단의 > 0.75가 모노클로날이고, ~ 0.195의 주형화된 비드는 바이클로날이며 이 모집단의 단지 ~ 0.05가 3개 이상의 올리고 후보를 보유함을 나타낸다. 반응당 비드의 수를 제한 인자로서 사용하면, 이는 ~ 500 x106개의 비드를 통해 표시되는 ~ 642 x 106개 올리고로 번역된다. 권장되는 양보다 더 많은 주형을 제외하고, 이온 PI™ Hi-Q™ OT2 200 키트 사용자 매뉴얼 지침을 따랐다. 제조업체 지침에 따라 이온 스피어(Ion Sphere)™ 품질 관리 키트(Quality Control Kit)를 사용하여 보강 QC를 수행하였다. 이온 구체를 멜로디 FACS에서 그의 검출을 돕기 위해 Cy5 공액 캡을 사용하여 표지하였다.
표적 암 세포는 배양 접시에서 90% 전면생장에 도달하도록 세포를 1:2/1:3의 비율로 분할함으로써 하루 전에 준비하였다. 2개의 대조군을 준비하였다: 세포 만 (음성 대조군) 및 독소를 가진 세포 (양성 대조군). 세포 배양 배지는 비드 라이브러리를 첨가하기 1시간 전에 조건 배지로 변경하였다. 배양 배지를 흡인하고 10% 인간 혈청을 함유하는 배지에 희석된 압타머 비드 라이브러리를 세포에 첨가하고 부드러운 진탕 조건 하에 37℃에서 1.5-2 시간 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 압타머를 배지 상청액으로부터 수집하여 새로운 튜브에 옮겼다. 결합된 압타머를 함유하는 표적 세포를 플레이트에서 부드럽게 들어 올려 하나의 수집 튜브 내로 병합하였다. 세포를 어두운 곳에서 37℃에서 15분 동안 500 nM의 스톡 농도로부터 1.5 μL의 기능적 프로브 셀이벤트 카스파제(CellEvent Caspase)-3/7과 함께 인큐베이션하였다. 일부 경우에, 셀이벤트 카스파제-3/7 및 미토프로브 Dilc1과 같은, 표적 세포 및 비드 라이브러리 혼합물에서 두 개의 기능적 프로브를 동시에 인큐베이션하였다 (도 6). FACS 분석에서 신호 대 잡음을 더 잘 구별하기 위해 하나의 기능적 프로브로 초기에 염색된 세포에 이어서 제2 기능적 프로브와 함께 인큐베이션하는 기능적 표지도 수행하였다. 기능적 세포 Selex 절차에서 사용될 수 있는 예시적인 대체 프로브가 표 14에 제공되어 있다.
<표 14>
예시적인 프로브
Figure pct00014
BSA로 사전 코팅된 2개의 FACS 튜브를 사멸 복합체 (튜브 #1) 및 생존 복합체 (튜브 #2)로 표지하였다. 샘플은 BD 팩스멜로디™ 세포 분류기에서 시행하였다 (수득량을 조정하기 위해 대조군을 먼저 시행하였다). 샘플은 라운드 1의 경우의 수율과 라운드 2의 경우의 순도에 기초하여 분류하였다. 분류 동안 형태학적 무손상 세포만을 게이트 온하였다. 비드에 결합되어 있고 카스파제-3/7 염색에 대해 양성인 세포 (clust+/cas+)는 '양성 사건(Positive Event)'으로서 간주하였다. 비드에 결합하나 카스파제3/7 염색에 대해 음성인 세포 (clust+)는 또한 향후 분석을 위해 수집하고 "음성 사건(Negative Event)'으로 분류하였다. 예시적인 게이팅 전략이 도 5B에 도시되어 있다. 분류된 세포, 튜브 #1에서 비드 압타머와 복합체로 사멸 암 세포, 및 튜브 #2에서 비드 압타머와 복합체로 생존 암 세포를 둘 다 수득하였다. 결합된 DNA는 95℃에서 10분 동안 가열함으로써 용리하고 300xg에서 5분 동안 실온에서 원심분리하였다. 상청액을 새로운 튜브에 옮겼다. 카스파제-3/7 염료 및 비드 표지에 대해 양성인 사건을 에멀젼 PCR에 의해 증폭시켜 다음 라운드의 기능적 SELEX를 위한 비드 라이브러리를 수득하였다. 기능적 SELEX 및 에멀젼 PCR을 비드와 함께 인큐베이션된 표적 세포 집단에서 기능적 보강이 관찰될 때까지 반복하였다.
실시예 5 - 기능적으로-보강된 압타머 라이브러리에 의한 상이한 종양 세포에 대한 세포독성의 검증
실시예 7에 기재된 기능적 세포 SELEX 공정의 다수의 라운드를 하기 암 세포주에서 수행하였다:
A. HCT116 인간 결장직장암 세포주
B. 4T1 뮤린 유방암 세포주
C. CT26 뮤린 결장직장암 세포주
D. Kasumi-1 인간 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포주
E. 공여자로부터의 AML1 원발성 AML 골수모세포
F. 공여자로부터의 AML9 원발성 AML 골수모세포
G. 공여자로부터의 CLL1 원발성 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 림프구
Kasumi-1 세포를 제외하고, 기능적 세포 SELEX 공정은 3 라운드의 결합 SELEX 후에 시작되었고 카스파제-3/7 아폽토시스를 측정하였다. Kasumi-1 세포의 경우, 기능적 SELEX를 무작위 라이브러리 (결합-보강 아님)로부터 시작하였고 미토콘드리아 막 전위 (미토프로브 DilC1 (5))를 측정하였다.
기능적 보강은 모든/대부분의 기능적 SELEX 라운드로부터의 비드 라이브러리가 표적 세포 집단과 함께 인큐베이션되고 아폽토시스 보강이 상이한 비드 집단에 걸쳐 비교되는 기능적 검정을 통해 검증된다 (도 7). Kasumi-1을 제외하고, 표시된 모든 기능적 공정은 카스파제3/7을 아폽토시스 프로브로서 사용하여 수행하였으며, 3 라운드의 결합 SELEX 후, 결합이 보강된 라이브러리로 시작하였다. Kasumi-1은 미토프로브 DilC1 (5) 미토콘드리아 막 전위 프로브로 수행하였으며, 초기 기능적 라이브러리는 무작위 라이브러리 (결합-보강 아님)로부터 시작하였다.
최종 라운드의 기능적 SELEX를 수행하였으며 여기서 최종 클러스터링된 마이크로비드 라이브러리를 양성 표적 세포와 함께 그리고 이어서 음성 카운터 선택 세포와 함께 인큐베이션하였다. 인간 현탁된 세포 (원발성 또는 세포주)의 경우, 건강한 공여자로부터의 PBMC를 음성 카운터 선택 세포에서 사용하였다. 인간 부착 세포주의 경우, 건강한 공여자로부터의 MCF10a 세포주 또는 PBMC를 음성 카운터 선택 세포에서 사용하였다. 마우스 부착 세포주의 경우, 새로 단리된 비장세포를 음성 카운터 선택 세포에서 사용하였다. 카운터 선택 동안 나타난 양성 사건을 사용하여 일루미나 서열결정 분석 동안에 무차별 기능적 선도를 제거하였다.
실시예 6 - 결합-보강된 압타머 라이브러리와 기능적으로-보강된 압타머 라이브러리의 비교
각각의 라운드의 음성 사건과 카운터 선택 세포로부터의 양성 사건을 포함한, 상기에서 생성된 모든 기능적 SELEX 라운드로부터의 라이브러리를 일루미나 서열결정을 위해 제조하였다. NextSeq 500/550 고출력(High Output) 키트를 사용하여 일루미나 NextSeq 500 시퀀서 상에서 서열결정을 수행하였다. 서열결정 존재도 프로파일은 결합 세포-SELEX 라운드의 압타머를 기능적 세포-SELEX 라운드의 압타머와 선택을 위해 비교하며 AML1 원발성 인간 골수모세포 및 HCT116 결장직장암 세포주에서 수행하였다. 각각의 SELEX 공정은 10-6 log 존재도로 시작하여 최종 보강 압타머 라이브러리에 대해 10-3 또는 10-2 log 존재도로 완료하였다. 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 두 조직 공급원에 대해, 최종 SELEX 라운드에서 결합-보강된 라이브러리와 기능적으로 보강된 라이브러리 사이에 10,000개의 가장 풍부한 압타머에 대해 관찰된 교차점이 거의 없었다. 또한, 최종 SELEX 라운드에서 결합-보강된 라이브러리와 기능적으로 보강된 라이브러리 사이에 10개의 가장 풍부한 압타머에 대해 관찰된 교차점이 전혀 없었다.
결합 SELEX로부터의 최종 보강된 라이브러리를 또한 AML1 및 HCT116 조직/세포 공급원에서 선택 후 그의 카스파제-3/7 활성화 능력에 대해 기능적 SELEX의 최종 보강된 라이브러리와 비교하였다. 결합-보강된 라이브러리 또는 기능적으로-보강된 라이브러리를 마이크로비드 상에 클러스터링하고 37℃에서 2시간 동안 표적 세포와 함께 인큐베이션한 후에 카스파제-3/7 프로브와 함께 인큐베이션하였다. 마이크로비드-결합 및 카스파제-3/7-양성 세포의 퍼센트를 게이트 온하고 유세포 분석에 의해 측정하였다. 기능적으로 보강된 라이브러리는 카스파제-3/7 활성의 증가를 나타냈다. AML1 표적 세포의 경우, 결합-보강된 라이브러리의 라운드 #7을 기능적으로-보강된 라이브러리의 라운드 #7과 비교하였고, 기능적으로-보강된 라이브러리와의 인큐베이션은 카스파제-3/7에서 1.5배 증가한 것으로 나타났다 (도 9, 패널 A). HCT116 표적 세포의 경우, 결합-보강된 라이브러리의 라운드 #7을 기능적으로-보강된 라이브러리의 라운드 #8과 비교하였고, 기능적으로-보강된 라이브러리와의 인큐베이션은 카스파제-3/7에서 2배 증가한 것으로 나타났다 (도 9, 패널 B).
실시예 7 - 선도 압타머 올리고뉴클레오티드 후보의 선택 및 기능적 검증
환자-유래 이종이식 (PDX)-유래 삼중 음성 유방암 (TNBC) 세포 (TNBC9로 칭함) (실시예 8)의 아폽토시스를 매개하는 압타머의 기능적 보강에 이어서, 선도 분자를 선택하였다. 서열검정 분석 (도 10, 패널 A)에 기초하여, 기능적으로 보강된 압타머 집단에서 가장 풍부한 10개의 서열을 선택하고, 합성하고, 폴딩하였다. 선택된 후보 압타머의 서열은 표 15에 제공되어 있다.
<표 15>
삼중 음성 유방암 세포의 아폽토시스 유도를 위해 기능적으로 보강된 압타머 풀로부터 식별된 후보 압타머의 서열.
Figure pct00015
표적 사멸에서 선택된 후보 압타머의 효과는 TNBC9 세포에서 측정하였다. 구체적으로, 후보 압타머를 합성하고, 폴딩하고, TNBC9 세포에서 카스파제-3/7 활성화 유도에 대해 직접 시험하였다. 도 10의 패널 B에서 볼 수 있듯이, 선택된 후보 압타머 모두가 비히클 단독 또는 무작위 올리고뉴클레오티드와 비교하여 이들 세포에서 상당한 수준의 아폽토시스를 유도하였다.
압타머 E8이 아폽토시스를 유도하는 데 가장 효과적인 선택된 압타머로 식별되었으며 (도 10, 패널 B), 추가 분석을 위해 선택되었다. 특히, E8 시험관내 및 생체외에 의해 직접 표적 사멸의 관찰된 수준은 독립적인 생물학적 복제 실험에서 ~20-40% 범위였으며, 이는 승인된 항암 생물학적 제제로 관찰된 수준에 필적하였다. (예를 들어, 문헌 [Yamashita, M. et al. A novel method for evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by flow cytometry using cryopreserved human peripheral blood mononuclear cells. Sci. Rep. 6 , 19772 (2016); Romano, E. et al. Ipilimumab-dependent cell-mediated cytotoxicity of regulatory T cells ex vivo by nonclassical monocytes in melanoma patients. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 6140-6145 (2015); Kumar, R. et al. PD-1 blockade restores impaired function of ex vivo expanded CD8 T cells and enhances apoptosis in mismatch repair deficient EpCAMPD-L1 cancer cells. Onco. Targets. Ther. 10 , 3453-3465 (2017)]을 참조하며, 상기 문헌들 각각은 본원에 참조로 포함된다.). E8은 표적 세포 수준에서 현저한 선택성을 나타내어, TNBC9 세포는 사멸시켰으나 MCF10A 세포는 사멸시키지 않았으며, 이들은 시험관내 진화 공정에서 음성 표적으로서 사용되었다 (도 10, 패널 C). E8은 TNBC9에만 국한되지 않았으며 MDA-MB-231 세포에도 현저한 효과를 나타냈다 (도 10, 패널 D). 생체내 시험을 위한 준비에서, 이들 효과는 생체내 안정성과 올리고뉴클레오티드의 반감기를 연장하는 변형인, 폴리-에틸렌 글리콜 (PEG)로 변형된 E8을 사용하여 재검증하였는데, 이는 상기 효과가 PEG로 유지되었음을 입증하는 것이다 (도 10, 패널 E). 게다가, E8은 마우스 혈청에서 기능을 유지하였다 (도 10, 패널 F).
실시예 8 - 동물 모델에서 선도 압타머 후보의 생물학적 분배 및 효능
압타머 E8 (실시예 10에 기재됨)의 생체내 생물학적 분배는 형광-표지된 E8을 사용하여 결정되었다. E8은 압타머 생체내 이미징 프로브에 대해 이전에 설명한 바와 같이 표지하였다 ([Bouvier-M
Figure pct00016
ller, A. & Ducong
Figure pct00017
, F. Application of aptamers for in vivo molecular imaging and theranostics. Adv. Drug Deliv. Rev. 134, 94-106 (2018); Kryza, D. et al. Ex Vivo and In Vivo Imaging and Biodistribution of Aptamers Targeting the Human Matrix MetalloProtease-9 in Melanomas. PLoS One 11, e0149387 (2016); Th
Figure pct00018
odorou, I. et al. In Vitro and In Vivo Imaging of Fluorescent Aptamers. Methods Mol. Biol. 1380, 135-150 (2016)], 상기 문헌들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다). 압타머 분자는 5'에서 Cy5.5로 그리고 3'에서 폴리-에틸렌 글리콜 (PEG)로 변형되었으며, 이는 올리고뉴클레오티드의 생체내 안정성과 반감기를 연장하는 변형이다. 형광-표지된 E8은 MDA-MB-231 종양이 우측 뒷다리에 유도된 NOD/SCID 마우스에 2회 용량 (6 및 60 mg/kg)으로 정맥내 주사하였다. 형광은 주사 후 0.1시간, 24시간 및 48시간에 생체내에서 측정하였다. E8 선도 압타머 후보는 국지화되었고 주사 후 24시간 및 48시간에 종양에서 유의하게 유지되었다 (도 11, 패널 A-C). 구체적으로, E8 체류 수준은 주사 후 1-3 시간에 정점에 도달한 다음에 떨어졌으나, 주사 후 48시간까지 계속 유지되었다.
다양한 농도의 E8 압타머 후보를 적혈구와 함께 그리고, 건강한 공여자로부터의 PBMC와는 별도로 인큐베이션하여, E8 투여가 임상 환경에서 적용 가능하도록 보장하였다. 혈액 응집 또는 적혈구 용혈의 어떤 영향도 측정되지 않았다. PBMC에서 시토카인 항체 어레이 검정 후 특정 시토카인의 단지 소량 방출이 검출되었다.
종양 부피에 대한 E8의 효능을 평가하기 위해, PEG화 압타머는 11일 기간의 과정 동안 2일마다 1회 100 mg/kg의 용량 (표준 화학요법에 몰 단위로 등가)으로 주사하였다. 이 11일 기간에 걸쳐, E8-처리 동물에서 종양 부피는 비히클-처리 동물과 비교하여 상당히 감소하였으며, 여기서 E8-처리 동물로부터 추출된 종양은 조직 사멸의 거시적 징후를 나타냈다 (11일차에 최종 부피: E8-처리 동물 및 비히클-처리 동물에서 각각 168±39 대 301±51 mm3) (도 11, 패널 D). E8-처리 동물로부터 추출된 종양은 조직 사멸의 거시적 징후를 나타냈다 (도 11, 패널 E). 비히클-처리 및 E8-처리 동물의 종양-유래 조직 절편에서의 카스파제-3 활성의 조직화학적 분석은 E8-처리 동물의 종양에서 유의한 염색을 나타냈다 (도 11, 패널 F-I). 아폽토시스성 DNA 단편화를 측정하는 TUNEL 분석은 E8-처리 동물의 종양-유래 조직 절편으로부터 세포 사멸의 증가를 추가로 입증하였다. PBS 대조군과 비교하여 E8 주사 후 물리적 외관 또는 체중의 어떤 유의한 변화도 관찰되지 않았다.
실시예 9 - 인간 생체외 기관 배양 (EVOC)에서 선도 압타머 후보의 효능
압타머 E8 (실시예 10에 기재됨)의 효능은 인간 생체외 기관 배양 (EVOC)에서 평가되었다. EVOC는 두 명의 대표적인 TNBC 환자로부터 새로 유래하였으며 큐레스판스(Curesponse)에서 준비하였다. 250 μm 폭의 조직 슬라이스를 높은 산소 조건에서 배양 배지에서 24 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 원발성 종양의 암 세포를 최대 14일 동안 생존 가능하게 유지하였다.
E8 압타머 및 기타 화학요법 (팔보시클립, 에베롤리무스, 풀베스트란트)은 EVOC에 20-50 μM의 농도로 투여하였다. 1일차 후, 샘플 배지를 교체하고 동일한 농도의 요법의 제2 용량을 투여하였다. 5일차 후, 샘플을 4% w/v 파라포름알데히드로 고정하고 조직학적 절편을 준비하고 헤마톡실린-에오신으로 염색하였다. 2명의 맹검 병리학자에 의해 0-4의 척도로 효과를 등급화하였다. 병리학적 평가는 E8 후보가 적어도 하나의 화학요법에 대한 내성을 둘 다 나타낸 2명의 환자로부터 유래된 EVOC 샘플에서 종양 세포에 유의한 영향 (0-4 척도에서 3-4 등급)을 미침을 나타냈다 (도 12).
참조에 의한 포함
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 본원에서의 임의의 정의를 포함한 본 출원이 우선할 것이다.
등가물
관련 기술의 통상의 기술자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식할 것이거나, 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> AUGMANITY NANO LTD AUMMUNE LTD. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTION OF FUNCTIONAL APTAMERS <130> ANB-00425 <140> PCT/IB2019/001082 <141> 2019-09-27 <150> 62/738,235 <151> 2018-09-28 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 taagggtagc aatgcgttag tcgcttaaaa ttcgatttgc gcataacacc tcat 54 <210> 2 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2 cacaagggca gtactctcga gattaatgtg tacatgcact cgcgaaatgt tgag 54 <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 3 tgcgtagtat aaccgctaat caatcgtaca atgtaacctt gaccgcacac ggcc 54 <210> 4 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 4 cacacagcga cagcatagtc tcgtactggc ttaaaacatg aagttgcgat taat 54 <210> 5 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 5 aacaccgcta tctatcgtca tgtcaggcgt gtacttgact tacatctatt gacc 54 <210> 6 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6 acatcacatt tgcctgcgat caagctaaca cgcatgatac catcatgatt aacc 54 <210> 7 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 7 ttgctgctcg gatcaggcaa gacgctaccc acaactcggt ttgtaagact acac 54 <210> 8 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 8 cggactcacg caagagcgtt tggcagtgta aaactgttta acgtatctgc tcgc 54 <210> 9 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 9 attgcgagat cactatgttt tagtctaggc tagcacgcta cttgggactg taga 54 <210> 10 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 10 cacgacgaga taccgtggtc ctttggacgc gaatgtcatt tagcacttag catt 54 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 11 actggtaccg ctacccgtat aaggtcaa 28

Claims (110)

  1. (a) 표적 세포를 세포 기능의 리포터 및 압타머 클러스터의 라이브러리가 고정된 복수개의 입자 ("압타머 클러스터 입자")와 접촉시키는 단계이며, 여기서 고정된 압타머 클러스터의 적어도 하나의 서브세트가 표적 세포의 적어도 하나의 서브세트에 결합하여 세포-압타머 클러스터 입자 복합체를 형성하는 것인 단계;
    (b) 세포-압타머 클러스터 입자 복합체에서 표적 세포 중 적어도 일부가 세포 기능을 경험하기에 충분한 기간 동안 세포-압타머 클러스터 입자 복합체를 인큐베이션하는 단계;
    (c) 세포 기능의 리포터를 사용하는 세포 기능을 경험하는 세포-압타머 클러스터 입자 복합체를 검출하는 단계;
    (d) 다른 세포-압타머 클러스터 입자 복합체로부터 단계 (c)에서 검출된 세포 기능을 경험하는 표적 세포를 포함하는 세포-압타머 클러스터 입자 복합체를 분리하는 단계; 및
    (e) 분리된 세포-압타머 클러스터 입자 복합체에서 압타머를 증폭시켜 기능적으로 보강된 압타머 집단을 생성시키는 단계
    를 포함하는, 기능적으로 보강된 압타머 집단을 생성시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (c) 및 (d)가 유세포 분석기를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (d)에서 분리된 세포-압타머 클러스터 입자 복합체에서 표적 세포로부터 압타머 클러스터 입자를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 분리된 압타머 클러스터 입자에서 입자로부터 압타머를 해리시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f): (i) 단계 (e)의 기능적으로 보강된 압타머 집단으로부터 압타머 클러스터 입자를 형성하는 단계; 및 (ii) 새로 형성된 압타머 클러스터 입자를 사용하여 단계 (a) - (e)를 반복하여 추가의 기능적으로 보강된 압타머 집단을 생성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 단계 (f)가 적어도 2회 반복되는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 단계 (f)가 적어도 3회 반복되는 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 단계 (f)가 적어도 4회 반복되는 것인 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)가 연속적인 보강 라운드에서 제한적 조건을 적용하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 제한적 조건이 (i) 총 입자 수 감소, (ii) 입자당 압타머 카피 수 감소, (iii) 총 표적 세포 수 감소, (iv) 인큐베이션 기간 감소, 및 (v) 오류-발생이 쉬운 폴리머라제를 사용하여 압타머 집단을 증폭시키는 것에 의한 압타머 서열에의 오류 도입으로부터 선택된 것인 방법.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)의 추가의 보강된 압타머 집단이 단계 (a)의 압타머 클러스터의 라이브러리와 비교하여 2배만큼 감소된 서열 다양성을 갖는 것인 방법.
  12. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)의 각각의 라운드가 세포 기능을 조정하는 압타머에 대해 압타머의 집단을 적어도 1.1배만큼 보강하는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e) 후에 서열결정을 통해 보강된 압타머 집단을 식별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 전에 압타머 클러스터 입자를 생성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 압타머 클러스터 입자를 생성시키는 단계가
    (1) 입자 표면 상에 압타머 라이브러리로부터 복수개의 압타머를 고정시키는 단계; 및
    (2) 복수개의 고정된 압타머를 입자 표면 상에 국지적으로 증폭시켜 압타머 클러스터 입자를 형성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 복수개의 고정된 압타머가 에멀젼 PCR을 사용하여 단계 (2)에서 증폭되는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터에서 압타머가 분자 캡을 가진 노출되지 않은 단일 가닥 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터 입자 상에 고정된 압타머 클러스터가 에멀젼 PCR을 사용하여 제조되는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터 입자의 적어도 95%가 개별적으로 10개 이하의 고유한 압타머 서열의 다수의 카피를 포함하는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터 입자의 적어도 95%가 개별적으로 7개 이하의 구별되는 압타머 서열의 다수의 카피를 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터 입자의 적어도 95%가 개별적으로 5개 이하의 구별되는 압타머 서열의 다수의 카피를 포함하는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터 입자의 적어도 95%가 개별적으로 3개 이하의 구별되는 압타머 서열의 다수의 카피를 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터 입자의 적어도 95%가 개별적으로 2개 이하의 구별되는 압타머 서열의 다수의 카피를 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터 입자의 적어도 95%가 개별적으로 1개 이하의 구별되는 압타머 서열의 다수의 카피를 포함하는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터 입자가 개별적으로 1개 이하의 구별되는 압타머 서열의 다수의 카피를 포함하는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터가 적어도 50개의 동일한 압타머를 포함하는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터의 라이브러리가 100 내지 1014개의 구별되는 압타머 서열을 포함하는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터의 라이브러리가 적어도 108개의 구별되는 압타머 서열을 포함하는 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터가 보존된 서열의 영역 및 무작위화된 서열의 영역을 포함하는 압타머를 포함하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 무작위화된 서열의 영역이 노출되고, 보존된 서열의 영역이 캡핑되는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 입자가 중합체 비드, 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 아크릴아미드 비드, 고체 코어 비드, 다공성 비드, 상자성 비드, 유리 비드, 제어된 기공 비드, 마이크로비드, 및 나노입자로부터 선택된 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 입자가 적어도 하나의 치수에서 약 25 nm 내지 약 30 μm의 평균 직경을 갖는 것인 방법.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 입자가 적어도 하나의 치수에서 약 25 nm, 50 nm, 100 nm, 250 nm, 0.5 μm, 2 μm, 5 μm, 10 μm, 20 μm 또는 30 μm의 평균 직경을 갖는 것인 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터의 라이브러리가 결합 세포 SELEX, 음성 SELEX, 및 시험관내 진화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공정을 통해 이전에 선택된 압타머를 포함하는 것인 방법.
  35. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포에 결합하는 압타머에 대해 압타머의 초기 라이브러리를 보강하여 결합 보강된 압타머 집단을 생성시킨 다음에, 결합 보강된 압타머 집단을 사용하여 단계 (a)의 압타머 클러스터 입자를 생성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 압타머의 초기 라이브러리가 결합 세포 SELEX의 하나 이상의 라운드를 수행함으로써 보강되는 것인 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 압타머 클러스터 입자를 생성시키는 단계가
    (1) 결합 보강된 압타머 집단으로부터 복수개의 압타머를 입자 표면 상에 고정시키는 단계; 및
    (2) 복수개의 고정된 압타머를 입자 표면 상에 국지적으로 증폭시켜 압타머 클러스터 입자를 형성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터가 화학적 변형 또는 비천연 뉴클레오티드를 포함하는 압타머를 포함하는 것인 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터가 DNA, RNA, 또는 그의 화학적 변형의 압타머를 포함하는 것인 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터가 형광 마커 또는 광학 현미경 하에 가시성을 가능하게 하는 요소로 표지되는 것인 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 기간이 약 10분 내지 약 5일인 방법.
  42. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 기간이 약 1.5시간 내지 약 24시간인 방법.
  43. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 기간이 약 1.5시간 내지 약 2시간인 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 원핵 세포인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 표적 세포가 박테리아인 방법.
  46. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 진핵 세포인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 진핵 세포가 포유동물 세포인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 포유동물 세포가 암 세포 또는 면역 세포인 방법.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포가 환자-유래 세포인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 환자-유래 세포가 환자-유래 암 세포 또는 환자-유래 면역 세포인 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 표적 세포를 압타머 클러스터 입자와 접촉시키기 전에, 접촉시키는 동안, 또는 접촉시킨 후에 세포 기능의 리포터와 접촉되는 것인 방법.
  52. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 단계 (b) 전에, 동안, 또는 후에 세포 기능의 리포터와 접촉되는 것인 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 기능의 리포터가 형광 염료인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 형광 염료가 칼슘 민감성 염료, 세포 추적자 염료, 친유성 염료, 세포 증식 염료, 세포 주기 염료, 대사산물 민감성 염료, pH 민감성 염료, 막 전위 민감성 염료, 미토콘드리아 막 전위 민감성 염료, 또는 산화환원 전위 염료인 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 기능의 리포터가 활성화 연관 마커, 산화 스트레스 리포터, 혈관신생 마커, 아폽토시스 마커, 자가포식 마커, 세포 생존력 마커, 또는 이온 농도에 대한 마커인 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 기능이 세포 생존력, 아폽토시스, 세포 증식, 유전자 발현, 세포 형태학, 세포 활성화, 인산화, 칼슘 가동화, 탈과립화, 세포 이동, 또는 세포 분화인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 표적 세포가 암 세포인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 세포 기능이 아폽토시스인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 세포 기능이 면역 체크포인트 단백질의 리간드의 발현의 조정인 방법.
  60. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 면역 세포인 방법.
  61. 제59항에 있어서, 세포 기능이 면역 단백질의 발현의 조정인 방법.
  62. 제60항에 있어서, 면역 단백질이 세포 표면 면역 단백질인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 세포 표면 단백질이 면역 체크포인트 단백질인 방법.
  64. 제61항에 있어서, 면역 단백질이 시토카인인 방법.
  65. 제60항에 있어서, 세포 기능이 증식인 방법.
  66. 제60항에 있어서, 세포 기능이 아폽토시스인 방법.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 세포-압타머 클러스터 입자 복합체가 표적 세포당 약 2 내지 4개의 입자를 포함하는 것인 방법.
  68. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터 입자가 입자당 평균 1 내지 6개의 압타머 클러스터를 포함하는 것인 방법.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 복수개의 세포-압타머 클러스터 입자 복합체가 단계 (b) 동안 단일 반응 부피로 인큐베이션되는 것인 방법.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 세포-압타머 클러스터 입자 복합체가 유세포 분석, 형광 현미경법, 광학 트위저, 마이크로피펫, 미세유체 분리, 미세조작, 또는 단리된 시딩을 통해 단계 (d)에서 분리되는 것인 방법.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 용해 및 원심분리를 통해 단계 (d)에서 분리된 세포-압타머 클러스터 입자 복합체에서 압타머 클러스터 입자를 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 세포-압타머 클러스터 입자에서 압타머가 단계 (e) 전에 HPLC 정제에 의해 단리되는 것인 방법.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 기능적으로 보강된 압타머 집단.
  74. 제73항에 있어서, 압타머 집단이 보강 전 압타머 클러스터의 라이브러리에서의 압타머와 비교하여 2배 초과의 기능에서의 보강을 특징으로 하는 것인, 기능적으로 보강된 압타머 집단.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 세포 기능이 암 세포 사멸 또는 아폽토시스를 촉진하는 것인 기능적으로 보강된 압타머 집단.
  76. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 기능이 면역 반응의 촉진인 기능적으로 보강된 압타머 집단.
  77. 제75항의 기능적으로 보강된 압타머 집단으로부터 환자-유래 암 세포의 세포 사멸 또는 아폽토시스를 촉진하는 적어도 하나의 압타머 후보를 선택하는 단계를 포함하는, 맞춤형 암 치료에서 사용하기 위한 압타머를 선택하는 방법.
  78. 제77항에 있어서, 선택된 압타머를 서열결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 서열결정된 압타머를 합성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  80. 제75항의 기능적으로 보강된 압타머 집단으로부터 암 세포 사멸 또는 아폽토시스를 촉진하는 적어도 하나의 압타머 후보를 선택하는 단계 및 적어도 하나의 압타머를 종양 국소 전달을 위한 종양 치료와 조합하는 단계를 포함하는, 종양 전달 시스템을 제조하는 방법.
  81. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 따라 기능적으로 보강된 압타머 집단을 제조하는 단계 및 기능적으로 보강된 압타머 집단으로부터 환자-유래 암 세포의 세포 사멸 또는 아폽토시스를 촉진하는 적어도 하나의 압타머 후보를 선택하는 단계를 포함하는, 맞춤형 암 치료에서 사용하기 위한 압타머를 선택하는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 선택된 압타머를 서열결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 서열결정된 압타머를 합성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  84. (a) 대상체로부터 암 세포를 수득하는 단계;
    (b) 표적 세포로서 암 세포를 사용하여 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 따라 기능적으로 보강된 압타머 집단을 제조하는 단계;
    (c) 기능적으로 보강된 압타머 집단으로부터 암 세포의 세포 사멸 또는 아폽토시스를 촉진하는 적어도 하나의 압타머를 선택하는 단계; 및
    (d) 압타머를 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  85. 압타머 클러스터의 라이브러리가 고정된 복수개의 입자 ("압타머 클러스터 입자), 표적 세포, 및 세포 기능의 리포터를 포함하는 조성물.
  86. 제85항에 있어서, 세포 기능의 리포터가 형광 리포터인 조성물.
  87. 제86항에 있어서, 형광 리포터가 막 완전성 리포터인 조성물.
  88. 제86항에 있어서, 형광 리포터가 캡시드 완전성 리포터인 조성물.
  89. 제86항에 있어서, 형광 리포터가 단백질 완전성 리포터인 조성물.
  90. 제86항에 있어서, 형광 리포터가 단백질 변성 리포터인 조성물.
  91. 제86항에 있어서, 형광 리포터가 세포 사멸 리포터인 조성물.
  92. 제86항에 있어서, 형광 리포터가 산화환원 전위 리포터인 조성물.
  93. 제85항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 106개의 압타머 클러스터를 포함하는 조성물.
  94. 제85항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 106 내지 109개의 압타머 클러스터를 포함하는 조성물.
  95. 제85항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 압타머 클러스터가 적어도 약 104개 카피의 압타머를 포함하는 것인 조성물.
  96. 제85항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 압타머 클러스터가 104 내지 106개 카피의 압타머를 포함하는 것인 조성물.
  97. 제85항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터가 형광 마커로 표지된 것인 조성물.
  98. 제85항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터가 광학 현미경 하에 가시성을 가능하게 하는 요소로 표지된 것인 조성물.
  99. 제98항에 있어서, 요소가 나노입자인 조성물.
  100. 제85항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머 클러스터가 안티센스 가닥으로 표지된 것인 조성물.
  101. 제100항에 있어서, 안티센스 가닥이 표적의 결합 직후 대치되거나 제거되는 것인 조성물.
  102. 제85항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 효소를 추가로 포함하는 조성물.
  103. 제102항에 있어서, 효소가 리가제, 폴리머라제, 뉴클레아제, 편집 효소, 및/또는 제한 효소인 조성물.
  104. 제85항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 원핵 세포인 조성물.
  105. 제104항에 있어서, 표적 세포가 박테리아인 조성물.
  106. 제85항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 진핵 세포인 조성물.
  107. 제106항에 있어서, 진핵 세포가 포유동물 세포인 조성물.
  108. 제107항에 있어서, 포유동물 세포가 암 세포 또는 면역 세포인 조성물.
  109. 제107항 또는 제108항에 있어서, 포유동물 세포가 환자-유래 세포인 조성물.
  110. 제109항에 있어서, 환자-유래 세포가 환자-유래 암 세포 또는 환자-유래 면역 세포인 조성물.
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