KR20040035878A - 상동적으로 결합되거나 신규 복합체에 존재하는 핵산 또는핵산 동족체의 서열을 함유하는 아프타머 - Google Patents

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글렌 에이치. 에릭슨
자스민 아이. 닥시스
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Abstract

본 발명의 아프타머는 왓슨-크릭 상보적 염기 상호작용 또는 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합된 2개 이상의 평행 또는 역평행 이종중합 핵염기-함유 서열을 포함하나, 단 (a) 상기 아프타머가 단일-가닥인 경우, 상기 2개 이상의 서열이 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합되고, (b) 상기 아프타머가 이중나선이고 상기 2개 이상의 서열이 서로 역평행인 경우, 상기 2개 이상의 서열이 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합된다. 아프타머는 리간드를 결합시키고 아프타자임으로 작용하는 경우의 반응을 촉매하는데 사용될 수 있다.

Description

상동적으로 결합되거나 신규 복합체에 존재하는 핵산 또는 핵산 동족체의 서열을 함유하는 아프타머 {Aptamers Containing Sequences of Nucleic Acids or Nucleic Acid Analogues Bound Homologously, or in Novel Complexes}
단백질-핵산 복합체는 각종 생물학적 과정에서 중요한 역할을 한다고 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Hill et al. "Fluorescence Approaches to Study of Protein-Nucleic Acid Complexation," 278 Methods in Enzymology 390 (1997)]을 참조한다. 예를 들어, DNA-결합 단백질은 유전자 조절에서 중요한 역할을 한다고 공지되어 있다. 전형적으로, 유전자는 전사 인자로 지칭되는 DNA-결합 단백질에 의해 전사 수준에서 조절된다. 전사 인자는 프로모터 DNA에서의 표적 핵산 서열에 특이적으로 결합함으로써 유전자 발현을 조절한다.
단백질-핵산 상호작용의 생물학적 중요성 때문에, 단백질-핵산 결합 특성을 연구하는 각종 방법들이 제안되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Hill et al.] 및 여기에 인용된 참고문헌을 참조한다. 또한 본 발명자의 우선하는 미국 특허 출원제09/224,505호를 참조한다.
아프타머는 비-핵산 물질, 예를 들어 단백질 또는 기타 신체 물질과 특이적으로 상호작용하도록 고안될 수 있다. 아프타머는 소분자 리간드에 대한 고 친화도 수용체로서 기능할 수 있거나, 치료 또는 진단의 목적을 위해 표적 단백질과 강하게 상호작용할 수 있다. 초기에 구조화되지 않은 분자가 그의 리간드 주위에서 폴딩(folding)하고 그의 리간드와 수소-결합 네트워크를 형성하게 되면 상기 결합은 용이해 진다. [Marshall et al. "A biopolymer by any other name would bind as well: a comparison of the ligand-binding pockets of nucleic acids and proteins." 5(6) Structure 729-734 (1997)]. 상기 아프타머는 다른 분자에 대해 스크리닝하기 위해 사용되는 리간드일 수 있거나, 촉매일 수 있다. 촉매인 아프타머는 리보자임 또는 아프타자임(aptazyme)과 유사하다고 여겨진다. 현재까지, 아프타머는 거의 단일-가닥 RNA뿐이었다. 아프타머는 마주보는 배향의 핵산 서열 중의 염기들 사이에서 왓슨-크릭 염기쌍을 바탕으로 단순히 그들과 결합하기 보다는, 핵산 물질과 특이적으로 상호작용하도록 고안될 수도 있다. 이러한 아프타머는 만약 촉매라면, 아프타자임이라 불리는 것이 정당할 수 있다. 치료 또는 진단의 목적상 이러한 특이적인 작용을 추구할 수 있다.
소수의 RNA 분자는 촉매로서 활성이라고 공지되어 있고, 또한 핵으로부터 정보를 전달하는 수단으로 작용한다. 리보자임은 자가-절단할 수 있거나 다른 RNA를 절단할 수 있다. 상기 활성은 RNA의 2차 구조에 의존하며, 이는 염기 서열 및 금속삽입물 (metallocation)의 함유 등과 같은 인자에 의존할 수 있다고 이해된다.과거에는, 신규 또는 개선된 리보자임을 정립하기 위한 막대한 수고가 있었다. 리보자임은 유전자 발현을 인위적으로 제어하는 데에 크게 유용하다. 개발자들은 염기 서열 및 예측가능한 왓슨-크릭 염기쌍을 바탕으로 핵산, 그의 염기 및 백본(backbone)의 매우 특이적인 하전 패턴 및 예측가능한 2차 구조를 형성하는 DNA의 능력을 이용하기 위해 노력해 왔다. 핵산의 작은 치수 및 유연한 본성으로 인해, 단백질과 같은 다른 물질상의 특징을 인식하고 이에 특이적으로 결합할 수 있는 복합체를 구축하고 아마도 이로써 3차 구조를 취하는 것이 매우 적합하게 되었다.
바이오칩에 장착된 단일-가닥 핵산과의 결합에 의존하는 셀렉스 (SELEX)-유도 스크리닝 (골드 (Gold) 등의 미국 특허 제5,567,588호)를 통해, 연구원들은 100배 또는 1000배 이상으로 촉매적으로 더욱 활성인 리보자임을 발견하였다.
문헌 [Fernandez et al. "Pulling on Hair(pins)," 292 Science 653. (27 April 2001)]은 리보자임에서의 단일 분자 형태적 변화로부터 수집한 데이타를 보고하였다. 페르난데즈 (Fernandez) 등은 또한 이러한 본질적으로 이중가닥인 핵산 구조가 형태 면에서 개별적인 변이를 "전부 경험하거나 전혀 경험하지 않으며", 점진적 쌍 대 쌍 결합은 기대할 수 없다고 보고하고 있다.
연구원들은 절단 부위에서의 별개의 RNA 분자 및 내생적 리보자임 결합 단백질을 통해 생체내 RNA에 안정성을 부여할 수 있는 RNA 분자들을 절단하는 효소적 활성을 갖는 원형 RNA를 개시한다. 빈 (Been) 등의 미국 특허 제5,712,128호 및 시오우드 (Sioud)의 미국 특허 제5,985,620호를 참조한다.
툴 (Toole)의 미국 특허 제5,840,867호는 아프타머 및 생분자에 결합하는 아프타머의 제조 방법을 개시하고 있다. 상기 아프타머는 분리 도구, 진단기구 또는 치료기구로서 생분자의 정상 생물학적 기능을 방해하기 위해 사용될 수 있다. 아프타머는 단일 사슬이거나 이중가닥 RNA 또는 DNA일 수 있다. 그러나, 상기 특허는 역평행한 종류의 분자내 또는 분자간 왓슨-크릭 결합만을 기술하였다.
연구원들은 시리안 골든 (Syrian golden) 햄스터 프리온 단백질에 대항하는 단일-가닥 RNA 아프타머를 사용하였고, 아프타머는 조직 균질액 내에 함유된 수백의 상이한 단백질의 혼합물 내에서 그의 특이적인 표적을 인식할 수 있어, 이로 인해 아프타머의 유용성을 확인할 수 있었다. [Korth et al. "Prion (PrPSc)-specific epitope defined by a monoclonal antibody." Nature 390: 74-77 (1997)].
그로스만 (Grossman)의 미국 특허 제6,207,388호는 표적 분석물의 존재 또는 부재를 확인하고 검출하기 위한 방법, 조성물, 키트 및 장치에 관한 것이다. 조성물은 표적 분자에 결합하는 아프타머일 수 있는 RNA 분자를 포함한다. 그러나 그로스만은 단지 핵염기와의 왓슨-크릭 역평행 결합만을 교시하였다.
말본 (Malbon) 등의 미국 특허 제5,858,774호는 안티센스 DNA 구성체를 세포내로 도입하여 유전자를 조절하는 방법을 제공한다. 그러나 이 특허에서는 비-핵산에 결합하는 핵산을 사용하는 것에 대해서는 교시하지 않는다.
아프타머는 특이적인 결합 활성도를 갖거나, 다른 결합 쌍/복합체의 결합 특성을 예상가능하게 변경시키는 신규 물질 또는 약물을 확인하고 평가하는데에 사용되어 왔다. 예를 들어, 연구자들은 트롬빈 (혈액 응고 관여하는 단백질)의 활성 부위에 결합하고, 생체내에서 항-응고 효과를 나타내는 단일-가닥 DNA 아프타머를 발견하였다 [데이비드 (David), "Kinetic characterization of Thrombin-Aptamer interactions." Pharmacia Biosensor Application Note 305, 1994].
이러한 선행 연구에도 불구하고, 당업계에는 독특한 결합 특성을 갖는 신규 디자인의 아프타머 및 상기 아프타머의 신규 용도에 대한 여지가 여전히 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 왓슨-크릭 상보적 염기 상호작용 또는 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합된 2개 이상의 평행 또는 역평행 이종중합 핵염기-함유 서열을 포함하는 아프타머로서, 단 (a) 상기 아프타머가 단일-가닥인 경우, 상기 2개 이상의 서열이 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합되고, (b) 상기 아프타머가 이중나선이고 상기 2개 이상의 서열이 서로 역평행인 경우, 상기 2개 이상의 서열이 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합되는 것인 아프타머를 제공한다.
또한 본 발명은 리간드의 결합 방법을 제공한다. 상기 방법은 리간드를 본 발명의 아프타머와 접촉시키는 것을 포함한다.
또한 본 발명의 촉매성 아프타머 (아프타자임)와의 반응을 촉매하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 아프타머(aptamer)에 관한 것이며, 더욱 구체적으로는 서로 평행하거나 역평행하고, 주로 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 상동성 결합으로 결합된 2개 이상의 핵염기-함유 서열을 포함하는 아프타머에 관한 것이다.
본 발명은 하기 도면과 연결되어 설명될 것이며, 도면에서 유사한 참고 번호는 유사한 요소를 나타내고, 도 1A, 1B, 1C, 1D, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A, 4B, 5A, 5B,6A, 6B, 7A 및 7B는 형광 스펙트럼이다.
본 발명은 이종중합 핵염기 서열의 특이적 결합 특성에 대한 본 발명자의 설명으로부터 시작한다. 본 발명자의 우선하는 특허 출원은 이종중합 가닥의 이중나선 핵산과의 특이적 결합 및 이중나선 핵산의 다른 이중나선 핵산과의 특이적 결합에 대해 개시하고 있다. 본 발명자의 우선하는 특허 출원은 또한 핵염기의 이종중합 서열 (및(또는) 이들의 동족체)이 상동성 염기 결합에 의해서 뿐만 아니라 왓슨-크릭 염기 상호작용에 의해 서로 특이적으로 결합할 수 있고, 이같은 특이적인 염기 결합이 서로에 대해 또는 이중나선 형성체에 대해 역평행 방향성인 가닥상의 서열에만 제한되는 것은 아니라는 것을 개시하였다. 따라서, 이종중합 염기 서열 (및(또는) 이들의 동족체)는 평행 또는 역평행 방향으로 서로 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 염기는, 그 염기가 동일한 핵산 가닥에 존재하든지 상이한 가닥에 존재하든지 간에, 상동성 염기 결합 및(또는) 왓슨-크릭 염기 결합 규칙에 의해 결합된다.
본 발명은 일반적이지 않은, 그러나 특이적인 핵산의 결합 특성을 제시한 것 이상이다. 본 발명은 신규 아프타머, 아프타머의 제조 방법, 및 치료, 진단, 예방, 조작 또는 다른 목적을 위해 아프타머를 사용하는 방법을 포함한다.
아프타머는 통상적으로 비-핵산 물질, 예컨대 단백질 또는 다른 생분자 (예를 들어, 탄화수소, 지질 등)와 특이적으로 결합하도록 고안된 핵산이나, 이들은 특정 목적을 위해서 핵산과도 결합할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "아프타자임"은 아프타머 촉매를 의미한다. 아프타자임은 핵산 (특히 핵산의 절단을 촉매하는 핵산) 뿐만 아니라 단백질 및 다른 생분자와도 특이적으로 결합한다. 본원에서 사용되는 아프타머 및 표적에 있어서, "결합"은, 치료 목적을 달성하거나, 복합체를 검출하거나, 주어진 조건하에 비복합체화된 구조로부터 아프타머:표적 복합체를 분리하기에 충분히 안정한 복합체가 생성되는, 표적과 아프타머 사이의 상호작용 또는 복합체화를 의미한다. 아프타머는 리간드-결합에 대한 반응으로 이들의 2- 또는 3-차원 구조를 특이적으로 변화시켜, 단백질 분자로서 다수의 동일한 기능을 수행할 수 있다. 아프타머는 쌍형성되지 않은 핵염기 또는 비-핵염기 분자를 포함함으로써 기능화되어질 수 있다.
본 발명자들은 혼합된 핵염기 서열이 왓슨-크릭 상보적 결합 모티프 또는 상동성 결합 모티프에 의해 특이적으로 결합할 수 있다는 본 발명자들의 발견을 통해아프타머를 개시하고 있다. 혼합된 핵염기 서열 삼중나선 및 사중나선에 대한 본 발명자의 사전 설명은 염기 결합의 특이성이 핵염기의 특정 면 또는 표면으로 제한되지 않고, 상기 핵염기가 한번에 2개 이상의 핵염기와 특이적으로 결합할 수 있으며, 가장 현저하게는 핵염기가 상보적으로 또는 상동적으로 다른 핵염기에 특이적으로 결합하는데 반해, 왓슨-크릭 상보적 방법으로 하나의 핵염기에 결합할 수 있다는 것을 설명하고 있다. 모든 이러한 발견은 아프타머의 고안을 크게 확장시킬 수 있다.
본 발명자들은 임의의 특정한 이론에 얽매이는 것을 바라지 않으며, 핵염기 서열이 결합 모티프로서 유전적이지 않고, 그 결합은 그들의 환경에 의해 나타나는결합 기회의 작용이라고 생각한다.
본 발명자들은 또한 결합 모티프 특이성이 달성된 핵형성에 의해 염기 서열에 부과된 성질이라고 생각한다. 따라서, 본 발명자들은 핵형성된 가닥의 결합 선호성이 핵염기 가닥 내에서의 염기 스태킹(staking), 정전기력 등에 의한 것이라고 생각한다. 일단, 이러한 모티프 선호성이 가닥에 대하여 수립되면, 결합된 염기의 분리 및 재-어닐링되는 염기에서 예상되는 단계별의 순차적 "지프 업(zipping up)"이 나타나지 않는 상기 염기의 "2-상태" 재결합에 관련하여 마르코브(Markovian)의 "반응속도론을 모두 관찰하거나 전혀 관찰할 수 없었다". 본 발명자들은 페르난데즈의 상기 문헌에서 관찰된 거동이 핵염기 가닥에 의한 "모티프 선호성" 또는 "모티프 메모리"에 의한 것이라고 제안한다. 페르난데즈는 단백질의 자발적 단위에 의한 리폴딩(refolding)을 검사하는 실험을 곧 수행할 것이라고 시사하였다. 리폴딩 단백질에 대하여 이와 유사한 "메모리"를 관찰할 수 있다.
추가로, 본 발명자들은 결합 모티프 선호성과 미스매치 불안정성 현상을 연관짓는 것이 유용하다고 생각한다. 본 발명자들은, 핵염기의 기하학적 배열이 상기 핵염기가 이들과 결합된 인근 핵염기에 대해 불안정하게 되지 않는다는 것을 시사하고 있음에도 불구하고, 부적합한 핵염기 쌍에 의해 국소적으로 도입된 큰 불안정성에 매우 관심을 갖게 되었다. 본 발명자들은 이러한 불안정성을 결합된 서열의 모티프 선호성에 대한 고유한 본질의 모순과 연관지었다.
본 발명자들은 결합 모티프 선호성을 이중나선 DNA를 따라 Rec BCD가 변역시키는 것과 같은 단백질-DNA 상호작용에 관련된 특정 사실에 대해 연관시키는 것이유용하다는 것을 알게되었다. 문헌[Dohoney, Nature 2001 Jan 18; 409(6818): 370-374]는 일정한 속도 및 예외적으로 빠른 속도로 단백질이 이동하며 이에 따라 DNA 풀림이 동반된다고 보고하고 있다. 본 발명자들은 핵형성이 알로스테릭성이고 이에 의해 인접한 핵염기 서열에 결합 선호성이 생성되거나 부과된다고 예상된다는 점에서, 이중나선 DNA의 안정성이 알로스테릭 방식으로 훼손될 수 있다고 예상한다.
본 발명자들의 우선하는 출원에는 역평행 가닥 상에서 혼합된 염기 서열 간의 특이적인 상동성 결합이 모티프 선호성에 의해 생성할 수 있다는 것이 제시되어 있다. 기존에 상기 쌍형성에 대한 장벽으로 여겨지던 백본 변형이 상기 결합에 수반되지 않기 때문에, NMR 주사 또는 기타 기술에 의해 상기 이중나선을 관찰하는 경우 기대하지 않은 사실을 알게될 수 있다.
본 발명자들의 우선하는 출원에는 또한, 혼합된 핵염기 서열의 평행 가닥이 이중나선을 형성하는 하나의 모티프 하에 특이적으로 결합할 수 있다는 것, 또는 혼합된 평행 또는 역평행 염기 서열이 이전에 형성된 이중나선에 특이적으로 결합할 수 있다는 것이 제시되어 있다. 가장 현저하게, 본 발명자들이, 왓슨-크릭의 상보적 결합 모티프 또는 상동성 결합 모티프에 따르면 이중나선-결합된 염기가 다른 인접한 이중나선-결합된 염기에 대하여 특이적으로 반응성이라는 것을 나타내고 있다. 따라서, 본 발명은 핵산 결합, 거동 및 특징에 관련된 본 발명자들의 많은 놀라운 발견에 따른 아프타머에 관한 것이며, 이는 아프타머의 고안 및 사용 분야에 널리 적용될 수 있다.
왓슨과 크릭에 의해 1953년에 제안된 이중나선 DNA에서의 상보적 염기 쌍형성이 그 이전에 제안된 모든 것을 지지하며 핵산 결합에 대한 생각과 실험을 크게 억제할 수 있었다는 것은 놀라운 일이 아니다.
1940년에 리너스 파울링(Linus Pauling)과 맥스 델브룩(Max Delbruck)은 분자 상보성이 생물학적 특이성 및 "생명의 비밀(secret of life)"에 근거한다는 관점을 제시하였다. 문헌["The Nature of Intermolecular Forces Operative in Biological Processes"]의 관점은 상기 상보적 결합이 동일한 잔기에 의해서가 아니라 상이한 잔기에 의한 것이라는 설명을 바탕으로 제안되었다. 따라서, 왓슨과 크릭 및 다른 이들의 초기 발견은 핵산에 의한 상동성 결합의 개념을 고려하지 않았다.
핵산 가닥은 본질적인 방향성을 갖는다. 종래 지식에서는 반대 방향성을 갖는 가닥들, 즉 이들의 배향에 있어서 다른 하나와 역평행인 가닥들이 이들 각각의 염기 서열에 대한 왓슨-크릭의 상보적 결합을 통하여 이중나선을 형성할 수 있다고 시사하고 있다.
이와 반대로, 본 발명에 따른 특정 이중나선 아프토머는 2개의 가닥이 서로 평행하도록 혼성화된 핵산 (및(또는) 핵산 동족체)을 포함하는데, 여기서 특이적 결합은 동종 염기 쌍형성 또는 왓슨-크릭 염기 쌍형성에 의한 것이다. 종래 지식에서는 이러한 이중나선이 존재하지 않거나, 평행 염기 결합에서 요구되는 배열 조건으로 인한 백본의 불규칙성 때문에 상기 이중나선이 적어도 매우 불안정해질 것이라고 여겼다. 보다 더 놀라운 것은 적절히 온화한 혼성화 조건 하에서라도 평행상동성 이중나선 결합의 특이성 및 안정성이 왓슨-크릭의 상보적 역평행 이중나선의 특이성 및 안정성과 경쟁하거나 이를 능가한다는 것이 본 발명에서 입증되었다는 사실이다.
본 발명은 또한 2개의 가닥이 서로 역평행하도록 혼성화된 핵산 (및(또는) 핵산 동족체)을 함유하는 이중나선 아프토머를 포함하는데, 여기서 특이적 결합은 놀랍게는 동종 염기 쌍형성에 의한 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "왓슨-크릭 염기 쌍형성", "상보적 염기 쌍형성" 등은 매치된 염기 (예를 들어, A:T; G:C 및(또는) A:U)를 통한 핵산 및(또는) 핵산 동족체의 동종 가닥에 대해 마주보는 쌍 또는 인접한 쌍 간의 특이적 결합을 정의하는 것을 의미한다. 본원에 기재된, 평행 이중나선, 평행 및 역평행 삼중나선 및 평행 사중나선을 비롯한 "일반적이지 않은" 복합체에 관하여, "왓슨-크릭 염기 결합" 및 "상보적 염기 결합"과 같은 용어는 A와 T, A와 U 및(또는) G와 C의 결합을 제공하지만, 반드시 왓슨과 크릭에 의해 처음 제안된 가장자리형 대향 평면 구조 (edgewise opposed planar conformation)는 아니다.
왓슨과 크릭에 의해 처음 제안된 종래의 결합 모티프 ("W-C 모티프"), 및 상기 왓슨-크릭 염기 결합의 정의에 포함된 이들의 구조적 변이체 이외에, 본 발명은 상동성 염기 결합에 의해 형성된 아프타머를 포함한다. 상동성 염기 결합에 있어서, 염기들은 상보적 염기보다는 동일한 염기와 특이적으로 결합하지만, 반드시 왓슨과 크릭에 의해 처음 제안된 가장자리형 대향 평면 구조와 유사한 방식은 아니다. 따라서, "상동성 모티프"에 있어서, 상동성 염기쌍에는 A:A, G:G, C:C, T:T및 U:U가 포함된다. 어느 하나의 결합 "모티프"에 대한 언급은, 역평행 왓슨-크릭 결합 이중나선에서와 같이 가장자리형으로 서로 상호작용하는 대향 핵염기에 의한 특이적인 결합 뿐만 아니라, 역평행 이중나선으로 안정하게 결합하든 결합하지 않든 무관하게 서로 충분히 인접한 서열 내의 핵염기도 포함한다. 핵염기는 왓슨-크릭 모티프에 따라 이중나선으로 미리 결합한 염기에 특이적으로 결합할 수 있으며, 동시에 상동성 모티프에 기초하여 제2 핵염기와 결합할 수도 있다.
핵산 가닥의 염기에 의한 결합은 다수의 인자, 특히 W-C 모티프 또는 상동성 모티프에 따른 가닥의 결합 가능성, 및 이온 조건 (예를 들어, 염 농도 및(또는) 염 유형)에 의해 영향을 받거나 조절된다. 염 조건은 상동성 결합보다 왓슨-크릭 결합의 형성을 선호하는 경향이 있다. 상동성 모티프 사중나선은 동일한 완충 조건 하에서 W-C 모티프 사중나선보다 선호되는데, 이는 국한된 환경이 2개의 이중나선 핵산의 하전된 주쇄의 존재에 기초하여 비교적 낮은 염 농도가 되기 때문일 것이다.
본 발명의 아프타머는 하나 이상의 핵염기 서열 및(또는) 핵염기 동족체를 포함할 수 있으며, 단 상기 핵염기는 이들이 W-C 모티프 또는 상동성 모티프에 의해 특이적으로 결합하는 핵염기와 관계된 것이어야 한다. 선행 기술의 특정 교시내용과 반대로, 아프타머의 결합 핵염기는 삼중나선 또는 나중나선 형성의 경우에 결합을 달성하기 위해 반드시 동종중합성일 필요는 없다. 따라서, 특정 실시양태에서 제1 결합 서열의 핵염기는 퓨린과 피리미딘이 산재된 이종중합 서열로 배열되며, 제1 서열에 적어도 부분적으로 상보적이거나 적어도 부분적으로 상동성이 있다. 예를 들어, 가닥의 결합 서열은 25％ 내지 75％의 퓨린 염기, 및 75％ 내지 25％의 피리미딘 염기를 어느 순서로든 함유할 수 있다. 본 발명의 아프타머는 이종중합 서열을 형성할 수 있으며, 이는 본원에 정의된 바와 같이 하나 이상의 퓨린 핵염기 또는 퓨린 동족체와 하나 이상의 결합 세그먼트를 함유하는 서열을 의미한다. 이종중합 서열은 길이가 5 염기보다 큰 동종중합 단편이 없는 것이 바람직하다. 또한, 예를 들어 다른 염기와 특이적인 왓슨-크릭 및(또는) 상동성 결합 친화도를 갖는 자연 발생 염기들의 합성 동족체와 같은 다른 핵염기도 본 발명에 사용하기에 적합하다.
상동성 결합에 기초한 자가-결합 핵산 및 이중나선 이외에, 본 발명의 아프타머에는 삼중나선 및 사중나선 핵산이 포함되며, 이들 핵산은 대향하는 이종중합 가닥이 왓슨-크릭 상보적 염기 또는 상동성 염기에 의해 연결되어 있고, 결합된 서열의 상대적인 방향성은 서로 평행하거나 역평행하다.
핵염기의 제1 서열은 이중-가닥 핵산 복합체의 메이저 그루브 (major groove) 또는 마이너 그루브 (minor groove)에 특이적으로 결합할 수 있다. 동시에, 이 염기들은 제1 서열이 결합된 이중-가닥 핵산 복합체의 하나 또는 둘 다의 가닥에 존재하는 염기와 특이적으로 상호작용할 수도 있다. 이와 유사하게, 이중-가닥 복합체의 각 가닥에 존재하는 염기는 본 발명 아프타머의 사중나선 중의 이중-가닥 복합체의 하나 또는 둘 다의 가닥과 특이적으로 상호작용할 수 있다.
특정 삼중나선 및 사중나선 실시양태에서, 각 핵염기는 하나 또는 두개의 다른 핵염기에 결합한다. 따라서, 그러한 실시양태는 전통적인 이중나선 왓슨-크릭염기쌍 및 상기한 이중나선 상동성 염기쌍 이외에, A:T:A, T:A:T, U:A:T, T:A:U, A:U:A, U:A:U, G:C:G 및(또는) C:G:C (C+:G:C 및(또는) 임의의 다른 이온화 염기 종 포함)의 왓슨-크릭 염기 결합 삼중나선, 및(또는) A:A:T, T:T:A, U:U:A, T:U:A, A:A:U, U:T:A, G:G:C 및(또는) C:C:G (C:C+:G 및(또는) 임의의 다른 이온화 염기 종 포함)의 상동성 염기 삼중나선을 포함한다.
따라서, 아프타머가 제1, 제2, 제3 및 제4 가닥을 포함하는 특정 사중나선 실시양태에서는, (a) 제1 및 제2 가닥의 대향 염기들 사이의 결합, (b) 제3 및 제4 가닥의 대향 염기들 사이의 결합, 및 (c) 제2 및 제4 가닥의 대향 염기들 사이의 결합 이외에, 제1 및 제3 가닥의 염기가 서로 결합할 것으로 여겨진다.
본 발명의 삼중나선 및 사중나선 아프타머의 특정 실시양태에서, 염기의 결합 서열은 다른 염기의 결합 서열과 인접하여 위치하지 않는다. 즉, 3개 이상의 독립된 가닥이 존재한다. 접힌 형태 (예를 들어, 헤어핀 턴 (hairpin turn) 등)가 본 발명의 범위에 포함되기는 하지만 (특히 아프타머가 단백질과 같은 표적 분자와 복합체를 형성하는 경우), 단일 가닥의 접힌 부분은 본 발명의 상세한 설명에서 1회 이상 세지 않는다.
본 발명의 아프타머는 비록 훅스틴 (Hoogsteen) 결합 또는 G-G 4분체가 존재하더라도, 복합체 구조를 유지하기 위해 훅스틴 결합 또는 G-G 4분체에 의존하지 않는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명의 아프타머는 실질적으로 훅스틴 결합을 포함하지 않으며, 실질적으로 G-G 4분체를 포함하지 않는 것이 바람직하다.
아프타머 각각의 가닥은 독립적으로 데옥시리보스 포스페이트 또는 리보스 포스페이트 백본을 갖는 핵산 (예를 들어, DNA, RNA, mRNA, hnRNA, rRNA, tRNA 또는 cDNA) 또는 이들의 핵산 동족체를 포함한다. 바람직한 핵산 동족체는 비하전되거나 부분적으로 음하전된 백본 (즉, 천연 DNA 백본보다 적게 음으로 하전된 백본)를 함유하며, 예를 들어 PNA 및 LNA를 포함한다. 특정 실시양태는 PNA를 제외시킨다. 또한, 본 발명의 핵산 동족체는 부분적으로 양하전된 백본을 포함할 수 있다.
아프타머의 적어도 일부가 단리된 것, 정제된 것, 인공물 또는 합성된 것일 수 있다.
실시양태에서, 아프타머의 일부는 PCR로 증폭시킨 생성물이다.
본 발명의 아프타머는 용액 중에, 고형 지지체 상에, 시험관내에, 생체내에, 또는 컴퓨터내에 존재할 수 있다. 고형 지지체는 전도체 (예를 들어, 전극) 또는 부도체일 수 있다. 또한 복합체는 슈바르츠 (Schwartz)의 미국 특허 제6,147,198호 및 제5,720,928호에 교시된 바와 같이 신장된 후에 광학적으로 맵핑되거나 서열분석될 수 있다.
본 발명의 아프타머는 (a) 핵산 또는 핵산 동족체의 제1 이종중합 서열을 함유하는 제1 단일-가닥 또는 이중-가닥 잔기, 핵산 또는 핵산 동족체의 제2 이종중합 서열을 함유하는 제2 단일-가닥 또는 이중-가닥 잔기, 물 및 완충액을 포함하는 혼성화 혼합물을 제공하는 단계, 및 (b) 상기 제1 이종중합 서열이 상기 제2 이종중합 서열에 혼성화되어 아프타머를 생성하는데 효과적인 인큐베이션 시간 동안 상기 혼성화 혼합물을 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제공될 수 있다.
혼성화 혼합물은 뉴클레오티드를 보존하기에 적합한 것으로 공지된 임의의 통상적인 매질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Lab Manual" Vol. 2 (1989)]을 참조한다. 예를 들어, 매질은 뉴클레오티드, 물, 완충액 및 표준 농도의 염을 포함할 수 있다. 삼중나선 또는 사중나선 형성을 촉진하기 위해 2가의 양이온만을 사용하는 경우에는 킬레이트제 (예를 들어, EDTA 또는 EGTA)가 반응 혼합물에 포함되어서는 안된다.
염기들 사이의 특이적인 결합은 온도, 염의 농도, 정전기력 및 완충액 조성을 변화시켜 조성된 매우 다양한 조건하에서 발생한다. 이러한 조건의 예 및 이들의 적용 방법이 당업계에 공지되어 있다. 본 출원인의 동시 계류중인 미국 특허 출원 제09/885,731호 (2001년 6월 20일 출원)가 본 발명에 사용하기에 특히 적합한 조건을 개시하고 있다.
다수의 훅스틴-타입 복합체 (약 7.6을 초과하는 pH 수준에서 불안정하거나 존재하지 못함)와는 달리 본 발명의 복합체는 넓은 범위의 pH 수준 (바람직하게는 약 pH 5 내지 약 pH 9)에 걸쳐서 안정하다.
본 발명의 아프타머는 분석, 진단, 예방, 치료 및(또는) 공학 목적을 위해 제공될 수 있다. 복합체는 생물체 또는 바이러스에 의한 감염과 연관된 증상을 분석, 진단, 예방 및(또는) 치료하는데 사용될 수 있다. 생물체 또는 바이러스는 원한다면 정량할 수 있다.
본 발명의 아프타머는 자신과 특이적으로 결합하는 표적을 회수하기 위한 분리 기구로서 사용될 수 있다. 이러한 상황에서, 아프타머는 특이성과 기능 두가지측면에서 모노클로날 항체와 매우 유사한 기능을 한다. 상기 고형 지지체에 특이적으로 결합하는 서열을 함유하는 아프타머를 커플링시킴으로써, 원하는 표적 물질을 회수할 수 있다. 이는 아프타머가 결합하는 물질을 단리하고 정제하는 연구 및 제조에 특히 유용하다.
진단 용도에 있어서, 본 발명의 아프타머는 표적 물질을 위한 특이적인 결합 검정에 사용될 수 있다. 이들은 형광발색단 및 방사선 동위 원소 등의 검출 가능한 잔기 (이에 한정되지 않음)를 포함하는 당업계에 공지된 방법 및 표지를 사용하여 표지된 후 생체내 영상 또는 조직학적 분석에 사용될 수 있다. 이들의 높은 특이성으로 인해, 아프타머의 한 용도는 번역 후 단백질 변형의 유형 및 농도차의 검출 및 심지어는 돌연변이 단백질 존재의 검출이다.
치료학적으로, 아프타머는 표적 분자의 생물학적 활성 부위에 특이적으로 결합하여 생물학적 활성에 영향을 줄 수 있다. "생물학적 활성"은 본원에서 생물체 중 그의 대사 또는 다른 생체내 기능의 정상 환경에서 표적이 보유하는 임의의 활성을 기술하는데 사용된다. 본 발명을 제한함이 없이, 이것은 효소 또는 리보자임의 촉매적 기능, 호르몬 조절 기능, 또는 세포 표면 분자의 인식 기능을 포함할 수 있다.
아프타머는 전신 및 국소 또는 국부 투여를 포함하는 다양한 투여 방식으로 제형될 수 있다. 전신 투여의 경우, 아프타머는 흡입을 통하여, 또는 근육내, 정맥내, 복강내 및 피하 주사를 포함하는 주사에 의해 투여될 수 있다. 투여는 또한 경구투여 뿐만 아니라 경점막 또는 경피적 투여일 수도 있다.
아프타머는 또한 발현 시스템, 예를 들어 유전자 치료의 적용에도 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 아프타머는 약제일 수 있거나 항암제로 형성될 수 있으며, 또는 세포 조절 또는 전사뿐만 아니라 유전자 발현의 수행에 사용될 수 있다. 아프타머는 면역 반응 또는 세포 소멸을 자극할 수 있다.
본 발명은 아프타머가 생물체 또는 바이러스, 또는 세포 내에 결합하는 것을 가능하게 한다. 표면 또는 기질, 분배, 비드 또는 전극 또는 바이오칩 (biochip)에 부착된 복합체가 용액 중에 형성될 수 있다. 이러한 바이오칩의 유용성은 조직 샘플의 분자상 지문의 형성, 바이러스 감염에 대한 분자상 반응의 분석, 염증 반응의 분석 및 생화학적 경로의 분석에서 찾아볼 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 아프타머는 종래의 혼성화 조건, 삼중나선 혼성화 조건, 사중나선 혼성화 조건 또는 정상 소재 혼성화 조건하에 형성될 수 있다. 약 2 ℃ 내지 약 55 ℃의 온도 및 약 2 시간 이하에서 복합체가 형성되는 것이 바람직하다. 특정 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 심지어는 실온에서도 5분 미만인 것이 바람직하다. 더 긴 반응 시간이 요구되는 것은 아니지만, 24시간까지의 인큐베이션은 많은 경우에 복합체에 악영향을 끼치지 않는다. 훅스틴 결합 복합체의 형성에 필요한 매우 긴 결합 시간과 비교하여 본 발명의 복합체는 짧은 결합 시간을 나타낸다. 아프타머의 일부는 당업계에 공지된 많은 가교 수단에 의해 가교될 수 있다. 아프타머는 쌍형성되지 않은 핵염기 및 비-핵염기 분자를 포함할 수 있다.
혼성화 매질 중 프로모터는 2000년 7월 10일 출원된 미국 특허출원 제09/613,263호에 개시된 중격제 또는 양이온인 것이 바람직하다. 중격제는 임의로 형광일 수 있다. 중격제는 예를 들어 형광발색단, 예컨대 YOYO-1, TOTO-1, YOYO-3, TOTO-3, POPO-1, BOBO-1, POPO-3, BOBO-3, LOLO-1, JOJO-1, 시아닌 이량체, YO-PRO-1, TO-PRO-1, YO-PRO-3, TO-PRO-3, TO-PRO-5, PO-PRO-1, BO-PRO-1, PO-PRO-3, BO-PRO-3, LO-PRO-1, JO-PRO-1, 시아닌 단량체, 브롬화 에티듐, 에티듐 동종이량체-1, 에티듐 동종이량체-2, 에티듐 유도체, 아크리딘, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 유도체, 에티듐-아크리딘 이종이량체, 에티듐 모노아자이드, 요오드화 프로피듐, SYTO 염료, SYBR 그린 1, SYBR 염료, Pico 그린, SYTOX 염료 및 7-아미노악티노마이신 D로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종일 수 있다.
적합한 양이온은, 예를 들면 Na+(바람직하게는 농도 40 mM 내지 200 mM), K+(바람직하게는 농도 40 mM 내지 200 mM) 및 다른 알칼리 금속 이온 등의 1가 양이온; 알칼리 토금속 이온 (예를 들면 Mg+2및 Ca+2) 및 2가 전이 금속 이온 (예를 들면 Mn+2, Ni+2, Cd+2, Co+2및 Zn+2) 등의 2가 양이온; 및 Co(NH3)6 +3, 3가 스페르미딘 및 4가 스페르민 등의 3가 이상의 양전하를 갖는 양이온을 포함한다. Mn+2는 바람직하게는 농도 10 mM 내지 45 mM로 제공된다. Mg+2는 바람직하게는 농도 10 mM 내지 45 mM로 제공된다. Ni+2는 바람직하게는 농도 약 20 mM로 제공된다. 실시 양태에서 Mg+2및 Mn+2는 각각 1 mM, 각각 2 mM, 각각 3 mM, …, 각각 40 mM (즉, 각각 1 내지 40 mM)의 농도로 조합되어 제공된다.
복합체가 형성되는 매질에 첨가되는 양이온의 양은 결합이 일어나는 특성, 양이온의 특성, 결합 가닥의 농도, 부가 양이온의 존재 프로브 및 표적의 염기 함량을 포함하여, 다수의 인자에 좌우된다. 바람직한 양이온 농도 및 혼합물은 통상적인 실험에 의해 결정할 수 있다. 삼중나선의 경우, (a) 10 mM 내지 30 mM의 Mn+2; (b) 10 mM 내지 20 mM의 Mg+2; (c) 20 mM의 Ni+2; 또는 (d) 각각 1 mM 내지 30 mM의 Mn+2및 Mg+2의 양으로 양이온 (들)을 매질에 첨가하는 것이 바람직하다. 사중나선의 경우, (a) 10 mM 내지 45 mM의 Mn+2; (b) 10 mM 내지 45 mM의 Mg+2; 또는 (c) 각각 10 mM 내지 40 mM의 Mn+2및 Mg+2의 양으로 양이온 (들)을 매질에 첨가하는 것이 바람직하다.
요구되는 것은 아니지만, 다른 결합 프로모터는 예를 들어 Rec A 단백질, T4 유전자 32 단백질, E. 콜라이 단일 가닥 결합 단백질, 메이저 또는 마이너 핵산 그루브 결합 단백질, 비올로겐 및 악티노마이신 D, 소라렌 및 안젤리신 등의 부가 개재 물질을 포함한다. 이러한 촉진 시약은 극단적인 작업 조건, 예를 들면 비정상적인 pH 수준 또는 초고온에서 유용할 수 있다. 본 발명의 복합체를 제공하기 위한 어떤 방법은 Rec A 단백질 및(또는) 다른 재조합 단백질 등의 단백질 프로모터의 부재하에 수행된다.
신규한 아프타머를 제공하는 것 이외에, 본 발명은 아프타머와 표적 사이의 결합을 분석하는 신속하고 민감하며 환경 친화적이고 안전한 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태는 다른 아프타머가 동일한 표적과 결합하여 발현된 동일 형태의 신호에 대하여 제1 아프타머-표적 혼합물의 측정 신호 (예를 들면, 광학, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 전기적 또는 전기 기계적 특성)를 검정하는 것을 포함하며, 각각의 다른 아프타머는 핵염기 1종 이상이 제1 아프타머와 상이하다.
검정 곡선이 생성될 수 있으며, 측정 신호 (예를 들면, 형광 강도)의 크기 는 표적과 아프타머 사이의 결합 친화도의 함수이다.
실시양태에서, 측정 신호는 시험 표본 중에 포함된 형광발색단의 형광 강도일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 아프타머와 표적 사이의 결합 친화도는 신호 소멸 또는 신호 증폭을 통한 형광발색단 신호의 혼성화에 따라, 강도와 정비례 또는 반비례 관계를 나타낼 수 있다. 선택된 조건하에서, 아프타머 또는 표적과 공유 결합된 비-개재 형광발색단을 사용하는 바람직한 실시양태의 강도가 아프타머-표적 결합 친화도와 반비례 관계를 나타낼 수 있는 반면, 중격제에 의해 발생된 형광 강도는 아프타머-표적 결합 친화도와 정비례 관계를 나타낼 수 있다.
본 발명은 아프타머와 표적 사이의 결합 친화도의 정량을 가능하게 한다. 이는 최적화된 결합 특성을 갖는 약제를 고안하는 것을 포함하여, 여러 가지 용도면에서 가치있는 정보일 수 있다.
본 발명의 분석은 바람직하게는 균질하다. 분석은 측정된 신호의 크기를 검출하기 전에, 아프타머-표적 복합체로부터 유리 아프타머 및 유리 표적을 분리시키지 않고도 수행될 수 있다. 분석은 시험 처리량을 크게 증가시키는 겔 분리 공정을 요구하지 않는다. 정량 분석이 간단하고 정확하다. 따라서, 결합 분석은 많은 시간 및 비용을 절약하며, 용이하게 자동화될 수 있다. 또한, 완충액, pH, 이온 농도, 온도, 인큐베이션 시간, 아프타머 및 표적 서열의 상대 농도, 중격제의 농도, 표적 서열의 길이, 아프타머 서열의 길이, 및 가능한 보조 인자 (즉, 프로모터)의 요구 등의 결합 변수들을 신속하게 결정할 수 있다.
본 발명의 분석은, 예를 들면 웰 또는 마이크로 채널 내, 불투과성 표면 또는 바이오칩 상의 용액에서 행해질 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적은 아프타머 이전의 혼성화 매질내에 제공되고, 아프타머는 혼성화 매질과 접촉하여 재수화되기 전에 탈수 형태로 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 분석은 표적상 또는 아프타머 상에 신호 소멸제를 제공하지 않고서도 수행할 수 있다.
본 발명의 아프타머는 2 내지 100개의 염기 길이 (보다 바람직하게는 5 내지 45개의 염기 길이)이며, 1개 이상의 핵염기-함유 가닥을 포함하는 것이 바람직하다. 본원에서 사용되는 "핵염기-함유 가닥(들)"이란 용어는 예를 들어 ssDNA, RNA, ssPNA, LNA, dsDNA, dsRNA, DNA:RNA 하이브리드, dsPNA, PNA:DNA 하이브리드, 하전되지 않은 일부 음으로 하전된 당 포스페이트 및(또는) 펩티드 백본을 갖는 기타 단일 및 이중-가닥 핵산 및 핵산 동족체를 말한다.
본 발명의 분석법은 사용하기에 어렵고, 지겹고, 시간 소모적이며, 자주 재생될 필요가 있는 방사활성 프로브를 사용할 필요가 없다. 본 발명의 아프타머는바람직하게 사용하기 안전하며 경시적으로 안정하다.
본 발명의 표적은 핵염기가 실질적으로 없는 잔기이다. 바람직한 표적으로는 예를 들어 단백질, 펩티드 (예, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드 등), 폴리펩티드, 단백질, 다중-단백질 복합체, 호르몬, 지질 등이 포함된다.
각종의 아프타머-표적 복합체가 본 발명의 방법으로 분석될 수 있다. 본 발명은 아프타머와 예를 들어 펩티드, 단백질 또는 다중-단백질 복합체 간의 (결합 존재 여부 및 결합 친화도를 비롯한) 결합 특성을 분석하는 데 이용될 수 있다. 분석에 적합한 단백질로는 예를 들어 야생형, 돌연변이형, 단리된 것, 시험관내 번역된 것 및(또는) 합성된 것이 포함된다. 본 발명은 DNA-결합 단백질의 결합 분석에 특히 적합하다. 시험 샘플은 100% 순수할 필요는 없으나, 오히려 예를 들어 정제 제제, 합성 제제, 반정제 단백질 추출물, 원료 단백질 추출물 또는 시험관내 번역된 제제를 포함할 수 있다.
아프타머-표적 복합체는 바람직하게는 1개 이상의 표지에서의 변화로 검출된다. 1개 이상의 표지가 아프타머 및(또는) 표적에 부착되어 있을 수 있고(거나), 시험 매질 중에 유리되어 있을 수 있다. 1개 이상의 표지가 2개이 상의 잔기를 포함할 수 있다.
표지는 스핀 표지, 형광단, 발색단, 화학 발광제, 전기화학 발광제, 방사성 동위원소, 효소, 불완전 항원, 항체 및 표지된 항체로 구성된 군 중에서 선택되는 구성원 1종 이상이 바람직하다. 바람직하게, 복합체는 표지에서의 하나 이상의 방출에 의해, 또는 복합체의 전기 특성을 모니터링하여 검출한다.
아프타머-표적 복합체는 미국 특허 제6,265,170호 (Picard 외)에 기재되어 있는 바와 같이 한가지 이상의 변화 조건하에서 검출될 수 있다. 적합한 변화 조건에는 예를 들어, (a) 시험 매질의 비수성 성분의 변화, (b) 시험 매질의 pH의 변화, (c) 시험 매질의 염 농도의 변화, (d) 시험 매질의 유기 용매 함량의 변화, (e) 시험 매질의 포름아미드 함량의 변화, (f) 시험 매질의 온도의 변화 및 (g) 시험 매질의 카오트로픽염 (chaotropic salt) 농도의 변화가 포함된다. 추가로, 변화 조건으로 예를 들어 전류 (DC 및(또는) AC), 광자 방사 (예, 레이저광) 또는 전자기력과 같은 자극을 가할 수 있다. 자극은 연속적으로 또는 규칙적으로 가할 수 있다. 검출은 한가지 변화 조건을 사용하거나, 연속해서 변화되는 조건들을 조합하여 수행할 수 있다.
변화 조건 또는 자극에 대한 시험 매질 중의 아프타머-표적 복합체 특성의 반응을 모니터링하여 복합체를 검출할 수 있다. 상기 특성은 예를 들어 전기 전도율 또는 Q (전송선의 공명 구조 또는 시험 매질의 전송선에서 전파되는 신호의 상 또는 고도의 변화)일 수 있다.
실시양태에서, 검출 방법은 (a) 표지로부터 신호의 검출 (신호는 아프타머와 표적간의 결합 친화도와 상관 관계가 있음), (b) 시험 매질 조건의 변화, (c) 후속 신호의 검출 및 (d) 신호과 후속 신호의 비교를 포함한다. 변화 및 검출을 1회 이상 반복하거나, 또는 1회만 수행할 수 있다.
표지는 형광단이 바람직하다. 본 발명에서 사용하기에는 개입 및 비-개입 형광단 모두가 적합하다. 형광단은 용액에 유리되어 있을 수도 있으며, 아프타머에 공유 결합되고(거나) 표적에 공유 결합될 수도 있다. 형광단이 아프타머에 공유 결합되어 있는 경우에는, 그의 말단에 결합되는 것이 바람직하다. 바람직한 형광 마커에는 비오틴, 로다민, 아크리딘 및 플루오레세인, 및 자기 에너지를 조사할 경우 형광을 내는 기타 마커가 포함된다. 적합한 비-개입 형광단으로는 예를 들어 알렉사 염료, 보디파이 (BODIPY) 염료, 비오틴 콘쥬게이트, 티올 반응성 프로브, 플루오레세인 및 그의 유도체 ("케이지드 프로브 (caged probe)" 포함), 오레곤 그린 (Oregon Green), 로다민 그린 (Rhodamine Green) 및 QSY 염료 (가시광 여기된 형광단의 형광을 켄칭함)가 포함된다.
여기 파장은 사용되는 형광단에 대해 최대 여기에 상응하도록 (일상적인 실험 및(또는) 통상적인 지식에 의해) 선택하는데, 200 내지 1000 nm이 바람직하다. 형광단은 방출 파장이 200 내지 1000 nm가 되도록 선택하는 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서는, 400 내지 540 nm 범위의 파장을 갖는 광으로 형광단을 조사하기 위해 아르곤 이온 레이저를 사용하며, 형광 방출은 500 내지 750 nm의 범위에서 검출된다.
본 발명의 분석법은 폭넓은 온도, 예를 들면 약 2 내지 약 60 ℃에 걸쳐 수행할 수 있다. 어떠한 선행 기술 분석법에서는 승온이 요구되며, 이는 비용을 증가시키며 분석을 지연시킨다. 이에 반해, 본 발명은 실온에서 또는 그 온도 미만에서 (예를 들어, 25 ℃ 미만의 온도에서) 수행할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 참고로 하여 더욱 상세히 설명될 것이나 본 발명이 그에 제한되는 것으로 이해되어서는 안된다.
본 실시예는 3종의 상이한 종류의 DNA-결합 단백질의 그의 각각의 DNA 인식 부위로의 결합 및 형성된 복합체의 검출을 입증한다. 실시예에 대해 선택된 3종의 대표적 단백질은 c-JUN(실시예 1, 2 및 4), Sp1(실시예 3) 및 Oct-1(실시예 5 내지 6)이었다.
실시예 1
c-JUN은 많은 세포 및 바이러스 유전자의 프로모터 또는 인핸서에 천연적으로 존재하는 AP-1 DNA-결합 부위를 결합 및 조절하는 전사 인자의 AP-1 과중 구성원이다(예를 들어, 문헌(Bohmann et al., "Human proto-oncogene c-jun encodes a DNA binding protein with structural and functional properties of transcription factor AP-1." 238 Science 1386-1392(1987)) 참조). 더욱이, 인간 c-JUN 단백질은 탈조절 및 활성화되는 경우 종양발생 및 암을 초래하는 종양단백질 (oncoprotein)로 명명되는 단백질 유형(c-FOS 및 c-MYC)에 속한다. c-JUN, c-FOS 및 c-MYC는 DNA-결합 도메인이 "류신 지퍼"라 명명되는 구조 도메인에 바로 인접하여 놓여있는 염기성 아미노산이 풍부한 영역(통상 "염기성 영역" 또는 "염기성 도메인"이라 불림)으로 이루어진 DNA-결합 단백질의 특정 군으로 이루어져 있다. 류신 지퍼는 생분자 나선형-나선형 구조를 형성하는 7개의 아미노산의 규칙적 간격으로 분리되어 있는 4 내지 5개의 류신 잔기(c-JUN은 5개를 가짐)로 이루어진다. 그의 팔린드롬 DNA 서열과의 특이적 접촉은 주로 염기성 영역을 통해 일어난다. 류신 지퍼는 c-JUN을 자체로 이량화하여 c-JUN:c-JUN 동종이량체를 형성하거나, c-FOS로 이량화하여 c-JUN:c-FOS 이종이량체를 형성하였다. c-JUN의 동종이량체는 DNA 나선형의 소수 홈 내부로 이중나선 DNA를 79°구부리는 반면, c-JUN:c-FOS 이종이량체는 주요 홈에서 내부로 반대 배향으로 이중나선 DNA를 94°구부렸다. 완전히 기능적인 DNA-결합 도메인은 염기성 영역과 류신 지퍼 둘다를 요구하였다. 순수한 인간 c-JUN 단백질을 하기 분석에서 사용하기 때문에, 실시예는 c-JUN:c-JUN 동종이량체의 단일 AP-1 부위(JD1F/2F)로의 결합을 나타내었다.
컨센서스 7 bp AP-1 DNA 결합 부위를 함유하는 플루오레세인 표지된 야생형 dsDNA 올리고뉴클레오티드 JD1F/2F는 인간 콜라겐분해효소 유전자의 프로모터 서열로부터 유래하였다. 컨센서스 AP-1 부위의 양 말단의 측면에 위치하는 5개의 뉴클레오티드를 갖는 상보적 5'-플루오레세인 표지된 ssDNA 17-량체 JD1F 및 JD2F를 퍼셉티브 바이오시스템스 엑스퍼다이트(PerSeptive Biosystems Expedite) 핵산 합성기에서 합성하고, HPLC로 정제하였다. 등몰량의 JD1F 및 JD2F 올리고를 10 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA중 95℃에서 5분 동안 변성시킨 후 42℃, 35℃ 및 21℃에서 각각 40분 동안 인큐베이션하여 어닐링하였다. 어닐링된 올리고를 -20℃에서 2시간 동안 에탄올 침전시키고, 0℃에서 20분 동안 14 K rpm에서 원심분리하여 펠렛화하고, 100% 에탄올로 세척하고, 0℃에서 20분 동안 14 K rpm에서 재펠렛화하고, 건조하고, 최종 농도 100 ng/㎕에서 ddH2O에 용해시켰다. 형성된 dsDNA 올리고는 5' 양쪽 말단에 단일 플루오레세인 분자를 함유하였다.
야생형 JD1F에 대한 서열(서열 1):
5'-Flu-GTG TCT GAC TCA TGC TT-3'
야생형 JD2F에 대한 서열(서열 2):
5'-Flu-AAG CAT GAG TCA GAC AC-3'
돌연변이형 dsDNA 17-량체 JD3F/4F는 야생형 AP-1 컨센서스 DNA-결합 부위내에 GC 내지 TA의 단일 염기쌍 변화(밑줄침)를 제외하고는 야생형 JD1F/2F와 서열이 동일하였다.
돌연변이형 JD3F에 대한 서열(서열 3):
5'-Flu-GTG TCTTAC TCA TGC TT-3'
돌연변이형 JD4F에 대한 서열(서열 4):
5'-Flu-AAG CAT GAG TAA GAC AC-3'
c-JUN:DNA 결합 반응 혼합물(30 ㎕)은 9.25 mM HEPES, pH 7.9, 2.23 mM MgCl2, 0.03 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5.0 mM DTT, 3.75%(v/v) 글리세롤, 0.15 ㎍/㎕ 소 혈청 알부민(BSA), 0 내지 2.0 ㎍ 순수 c-JUN 단백질(Promega, 미국 위스콘신주 매드슨 소재) 또는 0 내지 400 ng 순수 c-JUN 펩티드 및 0.075 pmole 5'-플루오레세인 표지된 dsDNA 올리고뉴클레오티드를 함유하였다. 전장 c-JUN을 사용하는 경우, 3 ng/㎕ 폴리(dI)-폴리(dC)를 반응 혼합물에 포함시켰고, 단백질 및 플루오레세인 표지된 DNA의 첨가전에 첨가하였다. 도 1B 및 1D에서 예는 50 mM NaCl 대신에 50 mM KCl을 함유하였다. 야생형 및 돌연변이형 c-JUN DNA-결합 도메인 펩티드는 더크 보만(Dirk Bohmann) 박사(독일 하이델베르크 소재의 European MolecularBiology Laboratory)에 의해 관대하게 제공되었다. 반응 혼합물을 21℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 석영 큐벳에 배치하고, 파장 488 nm의 아르곤 이온 레이저 빔으로 조사하고, 형광 방출에 대해 모니터링하였다.
야생형 c-JUN DNA-결합 도메인 펩티드는 c-JUN의 C-말단 132 아미노산 잔기(Gln 209 내지 Phe 340)로 이루어졌다. c-JUN 돌연변이형 14 DNA-결합 도메인 펩티드는 중심 염기성 도메인내 277 위치에서 리신을 이소류신으로 전환시키고 278 위치에서 시스테인을 아스파르트산으로 전환시키는 2개의 아미노산 치환(밑줄침)을 제외하고는 야생형 펩티드와 서열이 동일하였다.
야생형 c-JUN 펩티드에 대한 서열(서열 5):
돌연변이형 14 c-JUN 펩티드에 대한 서열(서열 6):
2 ㎍, 1 ㎍ 또는 0.05 ㎍ 전장 c-JUN의 0.075 pmole 야생형 JD1F/2F 또는 0.075 pmole 돌연변이형 JD3F/4F로의 결합에 대해 얻어진 형광 스펙트럼이 도 1A 내지 1D에 나타나 있다. DNA 농도를 모든 시험 샘플에 대해 2.5 fmole/㎕에서 일정하게 유지하였다. DNA 단독이든 c-JUN의 존재하에든 간에 모든 샘플을 동일한 반응 조건하에 시험하였다. 최대 형광 강도는 사용된 형광단이 플루오레세인이었기 때문에 525 nm에서 발생하였다. 1 ㎍ 또는 0.05 ㎍ c-JUN을 JD1F/2F에 결합할 때 관찰되는 최대 강도는 JD1F/2F 단독으로 관찰되는 것보다 각각 54% 및 49% 더 낮았다(도 1A). 2 ㎍ c-JUN을 야생형 JD1F/2F에 결합할 때 55% 강도 감소가 발생되었다(데이타는 나타내지 않음). 1 ㎍ 및 2 ㎍ c-JUN 둘다의 경우 얻어진 유사한 강도 감소는 결합의 포화 수준이 1 ㎍ 단백질의 첨가에 의해 달성되었다는 것을 나타낸다.
상이한 염 조건하에 이중나선 DNA를 결합하기 위한 c-JUN의 선호도를 시험하기 위해, 상기 실험을 50 mM NaCl 대신에 50 mM KCl을 함유하는 반응 완충액에서동시에 수행하였다(도 1B). 2 ㎍ c-JUN을 KCl 반응 완충액에서 야생형 JD1F/2F에 결합시키는 경우, DNA 단독으로 달성되는 수준과 비교하여 57% 강도 감소가 관찰되었다. 50 mM KCl 완충액에서 야생형 JD1F/2F에 결합되는 1 ㎍ 및 0.5 ㎍ c-JUN은 각각 40% 및 34% 감소를 얻었고, 결합의 포화 수준 미만을 나타내었다. 따라서, c-JUN은 50 mM KCl 반응 혼합물에서보다 50 mM NaCl 반응 혼합물에서 더 높은 결합 친화도로 그의 AP-1 부위에 결합하였다. 따라서, 본 발명에 따른 레이저 결합 분석은 c-JUN:DNA 결합을 신뢰성있게 검출할 뿐만 아니라 우선적인 결합 조건을 확인할 수 있다.
동일한 실험 동안, 정확한 동일량의 c-JUN이 50 mM NaCl 반응 혼합물(도 1C) 또는 50 mM KCl 반응 혼합물(도 1D)에서 0.075 pmole 돌연변이형 JD3F/4F와 반응하는 경우, 모든 샘플에서 형광 강도의 어떠한 감소도 관찰되지 않았고 이는 단백질의 돌연변이된 DNA 서열로의 비결합을 나타내었다. 이러한 돌연변이형 DNA 결합 연구는 c-JUN:야생형 DNA 결합 조건 및 레이저 검출 방법 둘다의 특이성을 확인하였다.
동일한 결과가 3개의 상이한 적분 시간에서 방출 형광 강도를 측정하는 경우 얻어졌고(데이타는 나타내지 않음), 이는 적분 시간에 관계없는 일관된 결과를 입증하였다.
실시예 2
전장 c-JUN 단백질은 크기가 40 KDa 또는 340개 아미노산이었다. c-JUN의 DNA 결합 도메인을 c-JUN의 C-말단 132 아미노산 잔기(잔기 209에서의 글루타민으로부터 잔기 340에서의 페닐알라닌까지)에 국소화시키고, 전장 단백질로서 유사한 결합 친화도로 이중나선 DNA를 결합시킬 수 있었다.
도 2A 및 도 2B는 이러한 132개 아미노산의 DNA-결합 도메인으로만 구성된 펩티드에 대한 이중나선 DNA의 결합 및 검출을 입증한다. 50 mM NaCl 반응 혼합물 중 0.075 pmol 야생형 JD1F/2F에 결합한 야생형 c-JUN DNA-결합 도메인 펩티드 20 ng, 100 ng 및 200 ng은 JD1F/2F 단독일 경우에 방출된 형광 강도와 비교할 때 각각 13％, 28％ 및 43％의 강도 감소를 초래했다 (도 2A). 0.075 pmol DNA에 단지 20 ng의 c-JUN 펩티드가 결합한 것을 신뢰성있게 검출할 수 있다는 사실은, 상기 레이저 분석법의 민감도가 높음을 입증하는 것이다. 추가로, c-JUN 펩티드의 양이 증가하면 야생형 DNA에 점진적으로 더 많이 결합한다는 점에서 상기 펩티드:DNA 결합 분석은 정량적이다.
대조적으로, 야생형 c-JUN 펩티드 20 ng, 100 ng 및 200 ng은 돌연변이형 JD3F/4F에 결합하지 않았기 때문에 돌연변이형 DNA 단독일 경우에 관찰된 형광 강도와 비교할 때 약간의 강도를 초래하였으며, 이것으로 상기 레이저 결합 분석법의 특이성이 확인된다.
예견된 바와 같이, JD1F/2F에 결합한 c-JUN 펩티드 200 ng에 대해 관찰된 형광 강도에서의 43％ 감소는 전장 c-JUN 단백질이 1 ㎍ 및 0.5 ㎍인 각각의 경우에 관찰된 54％ 및 49％ 감소에 못 미치는 것이었다. 당업자라면, 펩티드를 사용할 경우에는 전장 단백질을 사용한 경우에 비해 정적 켄칭 발생 (static quenching occurring)이 덜하다고 예측할 것이며, 이는 단백질 크기가 적은 펩티드가 방출된형광을 덜 흡수할 것이기 때문이다.
실시예 3
Sp1은 아연 핑거 (zinc finger) DNA-결합 단백질이라고 명명된 이중나선 DNA-결합 단백질의 중요한 클래스에 속한다. 예를 들어 문헌 [Kadonaga et al., "Isolation of cDNA encoding transcription factor Sp1 and functional analysis of the DNA binding domain." 51 Cell 1079-1090 (1987)]을 참조한다. Sp1은 HIV-I 장쇄 말단 반복부 (LTR) 등을 비롯한 다수의 바이러스 및 세포 프로모터 또는 인핸서의 전사를 제어한다. Sp1 결합 부위의 수, 간격, 배향 및 서열은 프로모터마다 크게 달라져서, 결합 부위에서의 친화도가 높거나 중간 정도이거나 낮다. Sp1은 비교적 대형 단백질 (글리코실화 및 인산화 형태의 경우에 95 KDa 및 105 KDa)이기 때문에, 이의 DNA-결합 활성은 단백질의 C-말단 부근 (잔기 539의 시스테인부터 잔기 619의 히스티딘까지)에 집중되어 있다. 이 영역은 3개의 인접한 Zn(II) 핑거 모티프를 함유하는데, 이는 DNA와 상호작용하는 금속단백질(metalloprotein) 구조이다. DNA 결합의 서열 특이성은 전적으로 이들 3개의 Zn(II) 핑거에 의해 부여된 것이다. 핑거 3은 가장 중요한 핑거 (결합 친화도와 관련하여)이고, 그 다음이 핑거 2이며 마지막이 핑거 1이다. 2개의 시스테인 및 2개의 히스티딘 잔기가 Zn(II) 이온과 결합하여 각 핑거를 형성한다. 아연을 제거하면 이들 3개 아연 핑거의 2차 구조가 붕괴된다. 이러한 클래스의 이중나선 DNA-결합 단백질에 존재하는 핑거는 Cys2/His2핑거라고 지칭되는 Cys-X2,4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His의컨센서스 서열을 갖는다. Zn(II) 핑거 모티프의 제2 유형은 Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-Cys의 형태로서 Cys2/Cys2핑거라고 지칭되며 여러가지 호르몬 수용체 등과 같은 다른 DNA-결합 단백질에서 발견된다.
단일 컨센서스 10 bp Sp1 DNA 결합 부위를 함유하는, 플루오레세인 표지된 야생형 dsDNA 올리고뉴클레오티드 JD11F/12F는 인간 메탈로티오네인-IIA유전자의 프로모터 서열에서 유래한 것이었다. 5'-플루오레세인 표지된 상보적 ssDNA 20-mer JD11F 및 JD12F를 상기와 같이 합성하여 정제 및 어닐링시켰다.
야생형 JD11F의 서열 (서열 7): 5'-Flu-CCG GCC GGG GCG GGG CTT TT-3'
야생형 JD12F의 서열 (서열 8): 5'-Flu-AAA AGC CCC GCC CCG GCC GG-3'
돌연변이형 dsDNA 20-mer JD13F/14F는 야생형 JD11F/12F의 서열에서 6 bp 변화 (밑줄)로 인하여 컨센서스 Sp1 결합 부위가 GGG GCG GGG C에서 TAA ATA GGG C로 전환되었음을 제외하면 상기 서열과 동일하였다.
돌연변이형 JD13F의 서열 (서열 9): 5'-Flu-CCG GCC TAA ATA GGG CTT TT-3'
돌연변이형 JD14F의 서열 (서열 10): 5'-Flu-AAA AGC CC T ATT TA G GCC GG-3'
Sp1:DNA 결합 반응 혼합물 (30 ㎕)은 다음을 함유했다: 25 mM HEPES (pH 7.8), 100 mM KCl, 100 μM ZnS04, 1 mM DTT, 20％ (v/v) 글리세롤, 0.05 ㎍/㎕ BSA, 순수한 Sp1 단백질 (프로메가 제품) 0 내지 200 ng 및 5'-플루오레세인 표지된 0.1 pmol dsDNA 올리고뉴클레오티드. 반응 혼합물을 0℃에서 15분 동안 인큐베이션하고, 석영 큐벳에 넣어 파장 488 nm의 아르곤 이온 레이저 빔을 조사하여 형광 방출량을 모니터링했다.
도 3은 야생형 JD11F/12F 또는 돌연변이형 JD13F/14F에 대한 아연 핑거 DNA-결합 단백질 Sp1의 결합을 예시한다. Sp1 200 ng이 0.1 pmol JD11F/12F에 결합한 경우에는 JD11F/12F 단독인 경우에 달성된 형광 강도 수준과 비교할 때 44％의 강도 감소가 관찰되었다 (도 3A). 추가로, 전장 Sp1 단백질 25 ng의 결합을 신뢰성있게 검출할 수 있다 (데이타는 나타내지 않음)는 것은, 상기 레이저 분석법의 민감도가 높음을 입증하는 것이다. c-JUN이 단지 40 KDa 크기인 반면에 Sp1은 비교적 대형 단백질 (95 KDa)이므로 c-JUN-결합된 DNA와 비교할 때 Sp1-결합된 DNA에 대한 형광 강도에서 44％ 저하를 달성하는데 필요한 단백질의 양은 더 적으며, 이는 더욱 대형인 단백질인 경우에는 방출된 형광의 흡수 및 보유력이 더 뛰어나기 때문이다.
Sp1 200 ng을 0.1 pmol 돌연변이형 JD13F/14F와 반응시킬 경우에는 형광 강도에서의 감소가 관찰되지 않았는데 (도 3B), 이는 돌연변이된 DNA 서열에 단백질이 결합하지 않음을 지시하는 것이다. 이러한 연구를 통해 완전히 상이한 클래스의 DNA-결합 단백질에 대한 상기 레이저 검출 분석법의 특이성이 확인된다.
실시예 4
본 실시예는, 본 발명의 방법에 따르면 표지된 DNA 서열에 직접 결합한 특이적 단백질에 대해 지시된 항체의 결합을 연구할 수 있음을 예시한다. 단백질:DNA 복합체 (특히, 다중-단백질:DNA 복합체)에 특이적 항체를 첨가하는 것은, 단백질:DNA 복합체 중에 존재하는 미지의 단백질을 확인하는데 이용되는 기술이다.항체의 결합은 단백질:DNA 복합체가 형성되는 것을 억제 또는 완전히 저해 (상기 복합체가 형성되면, 유리 DNA의 경우에 비하여 형광 강도 감소가 최소이거나 아예 변화하지 않음)하거나 또는 형광 강도를 단백질:DNA 복합체보다 훨씬 더 감소시키는 항체:단백질:DNA 복합체가 생성되게 한다.
c-JUN 1 ㎍, 500 ng 및 250 ng을 50 mM NaCl 또는 50 mM KCl 반응 혼합물 중 0.075 pmol 야생형 JD1F/2F와 상기한 바와 같이 반응시켰다. 15분 동안 21℃에서 인큐베이션한 후에, 인간 c-JUN의 아미노산 56 내지 69에 상응하는 펩티드에 대해 생성된 다양한 양의 모노클로날 IgG1항체, c-JUN (KM-1) (미국 캘리포니아주 산타 크루즈에 소재하는 산타 크루즈 바이오테크놀로지 (Santa Cruz Biotechnology)에서 구입함)를 몇가지 c-JUN:DNA 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 추가의 40분 동안 21℃에서 인큐베이션하고, 석영 큐벳에 넣어 파장 488 nm의 아르곤 이온 레이저 빔을 조사하여 형광 방출량을 모니터링했다.
도 4A 및 도 4B는 50 mM NaCl 반응 혼합물 중에서 JD1F/2F에 대한 c-JUN 1 ㎍ 또는 250 ng 각각의 결합을 나타낸다. c-JUN 1 ㎍ 또는 250 ng이 JD1F/2F에 결합한 경우에는 DNA 단독인 경우에 달성된 수준과 비교할 때 각각 25％ 및 11％의 강도 감소가 관찰되었다. c-JUN 1 ㎍에 c-JUN 항체 5 ㎍ 또는 1 ㎍을 첨가하면, 각각 42％ 및 37％ 감소를 초래 (즉, 17％ 및 12％가 추가로 감소됨)하였는데, 이는 IgG:c-JUN:DNA 복합체 형성에 대한 지표이다 (도 4A). c-JUN 항체가 50 mM KCl 반응 혼합물 중의 JD1F/2F에 결합된 c-JUN 1 ㎍에 결합한 경우에는 동일한 정도의강도 감소가 관찰되었다 (데이타는 나타내지 않음). 유사하게, JD1F/2F에 결합된 c-JUN 250 ng에 c-JUN 항체 750 ng을 첨가하면, 27％의 강도 감소가 달성되었고, 이는 단백질:DNA 복합체 단독인 경우에 달성된 수준에서 16％가 추가로 감소된 것이다 (도 4B). IgG:c-JUN 복합체는 돌연변이형 DNA JD3F/4F에 결합하지 않았으며 (데이타는 나타내지 않음), 이것으로 상기 레이저 분석법의 특이성이 확인된다.
본 실시예는 상기 레이저 검출법이 항체:단백질:DNA 복합체와 단백질:DNA 복합체를 구별할 수 있음을 입증한다. 추가로, 본 실시예는 본 발명이 DNA에 결합된 이종 다중-단백질 복합체를 신뢰성있게 검출할 수 있으나, DNA에 결합된 단백질 단량체 또는 동종이량체는 검출할 수 없음을 수립하는 것이다. 다중-단백질:DNA 복합체의 단백질 중 오직 하나만이 DNA에 결합할 것이 요구된다. 1개 초과의 단백질이 DNA와 상호작용하는 다중-단백질:DNA 복합체를 본 발명의 방법으로 분석할 수도 있다.
실시예 5
편재해 있는 세포내 8-량체-결합 단백질 (Oct-1)은, c-JUN 또는 Sp1의 DNA-결합 도메인과는 완전히 상이한 특징적인 DNA-결합 도메인을 통해 DNA에 직접 결합한다. Oct-1은 POU 도메인 DNA-결합 단백질의 구성원으로서, 세포-특이적 전사 및 발생을 조절한다. 예를 들어, 문헌 [Sturm et al., "The ubiquitous octamer-binding protein Oct-1 contains a POU domain with a homeo box subdomain." 2 Genes and Development 1582-1599 (1988)]을 참조한다. DNA 결합 도메인 중에서 POU 도메인의 구조는, 기능적으로는 단일 DNA-결합 유닛으로서 협력하는 2개의 구조적으로 독립적인 도메인을 함유한다는 점에서 독특하다. Oct-1은 75개 아미노산의 POU-특이적 (POUS) 도메인, 24개 아미노산의 짧은 링커(linker) 영역 및 60개 아미노산의 POU-형 호메오(homeo) (POUH) 도메인으로 구성된 상기 POU 도메인을 통해 DNA에 결합한다. POUS도메인 및 POUH도메인은 둘다 HTH (Helix-Turn-Helix) 구조를 함유한다.
정제된 단백질을 사용한 실시예 1 내지 실시예 4와는 달리, 본 실시예에서는 Oct-1의 공급원으로서 HeLa 세포의 핵 추출물 (미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 프로메가 제품)을 사용했다. 매우 광범위하게 다양한 DNA-결합 단백질 및 전사 인자를 함유하는 HeLa 세포의 핵 추출물을 사용하는 것은, 본 발명의 레이저 분석법에 의한 서열-특이적 단백질:DNA 결합 검출시에 조질의 단백질 추출물을 사용할 수 있다는 가능성을 나타내는 것이다.
단일 컨센서스 8 bp Oct-1 DNA 결합 부위를 함유하는, 플루오레세인 표지된 야생형 dsDNA 올리고뉴클레오티드 JD49F/50F는 인간 이뮤노글로불린 중쇄 프로모터에서 유래한 것이었다. 5'-플루오레세인 표지된 상보적 ssDNA 18-mer JD49F 및 JD50F를 상기와 같이 합성하여 정제 및 어닐링시켰다.
야생형 JD49F의 서열 (서열 11): 5'-Flu-GAG TAT GCA AAT CAT GTG-3'
야생형 JD50F의 서열 (서열 12): 5'-Flu-CAC ATG ATT TGC ATA CTC-3'
돌연변이형 dsDNA 18-mer JD51F/52F는 야생형 JD49F/50F의 서열에서 POUS결합 부위를 실활시키는 이중 점 돌연변이형 (A1T2→CG) (밑줄) 및 POUH결합 부위를 실활시키는 제2의 이중 점 돌연변이 (A6A7→CC) (밑줄)로 인하여 컨센서스 Oct-1 결합 부위가 ATGCAAAT에서 CGGCACCT로 전환되었음을 제외하면 상기 서열과 동일하였다.
돌연변이형 JD51F의 서열 (서열 13): 5'-Flu-GAG T CG GCA CC T CAT GTG-3'
돌연변이형 JD52F의 서열 (서열 14): 5'-Flu-CAC ATG A GG TGC CG A CTC-3'
Oct-1:DNA 결합 반응 혼합물 (30 ㎕)은 다음을 함유했다: 9.25 mM HEPES (pH 7.9), 2.23 mM MgCl2, 0.03 mM EDTA, 63 mM NaCl, 1.0 mM DTT, 3.75％ (v/v) 글리세롤, 0.10 mg/㎖ BSA, 0.01 mM PMSF, 67 ㎍/㎖ 폴리(dI)-폴리(dC), 67 ㎍/㎖ 폴리(dG-dC)-폴리(dG-dC), HeLa 세포의 핵 추출물 (프로메가 제품) 0 내지 15 ㎍ 및 5'-플루오레세인 표지된 0.05 pmol dsDNA 올리고뉴클레오티드. 조질의 핵 단백질 추출물을 사용하는 경우에 서열 특이적 단백질:DNA 결합이 확실히 일어나도록 하기 위해서는 비교적 고 농도의 폴리(dI)-폴리(dC) 및 폴리(dG-dC)-폴리(dG-dC)가 필요하다. 반응 혼합물을 21℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 석영 큐벳에 넣어 파장 488 nm의 아르곤 이온 레이저 빔을 조사하여 형광 방출량을 모니터링했다.
HeLa 세포의 핵 추출물 10 ㎍을 0.05 pmol 야생형 JD49F/50F 또는 0.05 pmol 돌연변이형 JD51F/52F과 반응시킨 경우에 얻은 형광 스펙트럼을 각각 도 5A 및 5B에 나타내었다. HeLa 세포의 핵 추출물에 존재하는 Oct-1 단백질은 야생형 Oct-1 결합 부위에 고 친화도로 특이적으로 결합하여, JD49F/50F 단독인 경우에 관찰된형광 강도 수준과 비교할 때 22％의 감소를 초래했다 (도 5A). 대조적으로, Oct-1은 돌연변이형 JD51F/52F에 결합하지 않았는데, 이는 이에 의한 형광 강도가 돌연변이형 DNA 단독인 경우에 관찰된 것보다 증가하였다는 점으로 지시되며 (도 5B), 이것으로 본 분석법의 서열 특이성이 확인된다. 이들 실험은 완전하게 상이한 다른 클래스의 DNA-결합 단백질의 특이적 검출을 입증하는 것이다.
추가로, 수백종의 다른 DNA-결합 단백질을 함유하는 HeLa 세포의 조질의 핵 추출물을 사용하는 경우라 할지라도 본 발명에 의해 특이적 단백질:DNA 결합이 신뢰성있게 측정될 수 있음이 본 실시예를 통하여 확인되었다. 특이성은 연구할 특정 DNA-결합 단백질을 인식하는, 적당하게 표지된 DNA 서열을 선택함으로써 부여된다.
실시예 6
이 실시예는 본 발명의 방법에 의해 다중-단백질 복합체 (2종 이상의 상이한 단백질로 구성됨)가 DNA 서열상의 하나 (또는 그 이상)의 결합 부위에 결합하는 것을 측정할 수 있음을 분명하게 입증한다. 인간 세포 단백질인 8-량체-결합 단백질 (Oct-1) 및 숙주 세포 인자 (HCF, 예를 들어 문헌 [Wilson et al., "The VP16 accessory protein HCF is a family of polypeptides processed from a large precursor protein." 74 Cell 115-125 (1993)] 참조)와 단순 포진 (herpes simplex) 바이러스 유형 1 (HSV-1) 단백질 VP16 (또는 Vmw65)가 DNA 서열 TAATGARAT (여기서, R은 퓨린임)에 결합하는 것에 대하여 연구를 수행하였다. 이러한 다중-단백질:DNA 복합체는 즉시 초기 (immediate early) 복합체 (IEC) 또는VP16-유도 복합체라 불린다. VP16이 지금까지 확인된 유전자의 가장 강력한 트랜스-활성자이지만, VP16은 스스로 DNA와 효과적으로 결합할 수 없다. 대신, VP16은 Oct-1 및 HCF와 특이적으로 상호작용하여 유전자를 유도한다. VP16은 그의 아미노 말단의 411개의 아미노산을 통해 Oct-1 및 HCF와 결합한다. VP16의 C-말단에서 아미노산 411 내지 490에 의해 형성되는 고도로 산성인 도메인은 강력한 전사 활성화 영역으로 기능한다. 예를 들어, 문헌 [Dalrymple et al., "DNA sequence of the herpes simplex virus type 1 gene whose product is responsible for transcriptional activation of immediate early promoters." 13 Nucleic Acids Research 7865-7879 (1985)]을 참조한다.
Oct-1은 예외적인 DNA 서열 인식의 유연성을 나타낼 수 있는 그의 상호간 (bipartite) POU 도메인을 통해 DNA에 결합한다. Oct-1 POU 도메인은 단량체로서 8-량체 서열 ATGCAAAT와 결합하는데, POUS도메인은 이 부위의 5' 절반 (ATGC)과 결합하며, POUH도메인은 DNA의 반대 측면상에서 상기 부위의 3' 절반 (AAAT)과 상호작용한다. Oct-1이 고 친화도 ATGCAAAT 결합 부위와 결합하는 경우, Oct-1은 VP16과 상호작용할 수 없게 된다.
또한, Oct-1은 상기 8-량체 컨센서스와 거의 유사하지 않은 DNA 부위에 결합한다. 예를 들어, Oct-1은 그 단독으로 또는 HCF 및 VP16과 연합하여, 상기 8-량체 컨센서스 부위에 매치하는 8 bp 중에서 4 bp 만큼 적게 보유하는 DNA 서열 TAATGARAT와 결합할 수 있다. TAATGARAT 부위의 2가지 형태는 단순 포진 바이러스의 즉시 초기 (HSV IE) 유전자의 프로모터 서열내에 존재한다. 먼저, (OCTA+) TAATGARAT로 표시되는 제1 모티프는 Oct-1과 고 친화도로 결합하는 중복성 8-량체/TAATGARAT 서열을 포함한다. (OCTA-) TAATGARAT라 불리는 제2 모티프에는 중복성 8-량체 서열이 결여되어 있어서 이 모티프는 Oct-1과 비교적 낮은 친화도로 결합한다. Oct-1의 POUH도메인은 5' TAAT 서열과 결합하며, 반면 POUS도메인은 (OCTA-) TAATGARAT 부위상의 GARAT 서열과 결합한다. (OCTA+) TAATGARAT 결합 부위상에서, POUH도메인은 TAAT 서열에 고정된 채로 남아있지만, POUS도메인은 5' ATGC 서열 또는 3' GARAT 구성원과 결합할 수 있다. Oct-1 POUH도메인은 VP16과 상호작용하기에 충분한다.
HCF는 먼저 Oct-1 또는 TAATGARAT 구성원과 독립적인 VP16과 안정한 복합체를 형성함으로써 TAATGARAT 부위상에서 Oct-1과 VP16의 결합을 안정화하는 데 필요하다. HCF가 VP16과 Oct-1의 결합을 안정화하는 정확한 메카니즘은 알려져 있지 않다. HCF는 VP16 내부의 형태적 변화를 유도할 수 있으며, 이는 VP16이 Oct-1 및 TAATGARAT 부위의 GARAT 구성원과 상호작용하도록 준비시킨다. 또는, IEC 복합체내에서, HCF는 Oct-1 또는 DNA와 접촉할 수 있으며, 따라서 상기 복합체에 대해 큰 안정성을 부여한다.
(OCTA-) TAATGARAT 부위를 포함하는, 플루오레세인 표지된 야생형 dsDNA 올리고뉴클레오티드인 JD41F/42F는 HSV-1 IE 유전자 4/5 프로모터의 20 bp 영역 (-343 내지 -324)으로부터 유도되었다. 5'-플루오레세인 표지된 상보적 ssDNA 20-mer인 JD41F 및 JD42F를 상기와 같이 합성하여 정제 및 어닐링시켰다.
야생형 JD41F에 대한 서열 (서열 15):
5'-Flu-GGC GGT AAT GAG ATA CGA GC-3'
야생형 JD42F에 대한 서열 (서열 16):
5'-Flu-GCT CGT ATC TCA TTA CCG CC-3'
돌연변이형 dsDNA 20-mer인 JD43F/44F는, POUH결합 부위를 실활시킨 이중 점 돌연변이형(A2A3→CC)(밑줄), 및 POUS결합 부위를 실활시킴으로써 Oct-1 결합 부위 TAATGAGAT를 TCCTGAGCG로 전환시킨 제2의 이중 점 돌연변이형(A8T9→CG)(밑줄)를 제외하면, 야생형 JD41F/42F의 서열과 동일하였다.
돌연변이형 JD43F에 대한 서열 (서열 17):
5'-Flu-GGC GGTCCT GAGCGA CGA GC-3'
돌연변이형 JD44F에 대한 서열 (서열 18):
5'-Flu-GCT CGTCGC TCAGGA CCG CC-3'
(OCTA+) TAATGARAT 부위를 포함하는 플루오레세인 표지된 야생형 dsDNA 올리고뉴클레오티드인 JD45F/46F는 HSV-1 IE 유전자 1 프로모터의 23 bp 영역 (-170 내지 -148)으로부터 유도되었다. 5'-플루오레세인 표지된 상보적 ssDNA 23-mer인 JD45F 및 JD46F를 상기와 같이 합성하여 정제 및 어닐링시켰다.
야생형 JD45F에 대한 서열 (서열 19):
5'-Flu-GTG CAT GCT AAT GAT ATT CTT TG-3'
야생형 JD46F에 대한 서열 (서열 20):
5'-Flu-CAA AGA ATA TCA TTA GCA TGC AC-3'
돌연변이형 dsDNA 23-mer인 JD47F/48F는, POUH결합 부위를 실활시킨 이중 점 돌연변이형(A6A7→CC)(밑줄), 및 2개의 POUS결합 부위를 실활시킴으로써 Oct-1 결합 부위 ATGCTAATGATAT를 CGGCTCCTGATCG로 전환시킨 2개의 추가의 이중 점 돌연변이형 (A1T2→CG) 및 (A12T13→CG)(밑줄)를 제외하면, 야생형 JD45F/46F의 서열과 동일하였다.
돌연변이형 JD47F에 대한 서열 (서열 21):
5'-Flu-GTGCCG GCTCCT GATCGT CTT TG-3'
돌연변이형 JD48F에 대한 서열 (서열 22):
5'-Flu-CAA AGACGA TCAGGA GCC GGC AC-3'
Oct-1:HCF:VP16: DNA 결합 반응 혼합물 (30 ㎕)은 9.25 mM HEPES, pH 7.9, 2.23 mM MgCl2, 0.03 mM EDTA, 63 mM NaCl, 1.0 mM DTT, 3.75％(v/v) 글리세롤, 0.10 mg/ml BSA, 0.01 mM PMSF, 133 ㎍/ml 폴리(dI)-폴리(dC), 67 ㎍/ml 폴리(dG-dC)-폴리(dG-dC), 0 내지 25 ㎍ HeLa 세포의 핵 추출물 (프로메가 제품), 0 내지 0.1 ㎍ HSV-1 비리온 (virion) 추출물 및 0.025 pmol 5'-플루오레세인 표지된 dsDNA 올리고뉴클레오티드를 포함하였다. 80％ 순수 VP16을 포함하는 HSV-1 비리온 추출물은 크리스 프리스턴 박사 (Dr. Chris Preston)(MRC Institute of Virology, Glasgow, Scotland)로부터 제공받았다. HeLa 세포의 핵 추출물은 Oct-1 및 HCF에 대한 공급원 역할을 하였다. 상기 DNA 및 비리온 추출물을 제외한 모든 성분들을 21℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, DNA를 첨가한 다음, HSV1 비리온 추출물을 (경우에 따라) 첨가하였다. 반응 혼합물을 21℃에서 30분 더 인큐베이션하고 나서 석영 큐벳에 넣고, 488 nm의 파장을 갖는 아르곤 이온 레이저 빔으로 조사한 다음, 형광 방출을 모니터링하였다.
HeLa 세포의 핵 추출물 10 ㎍ 및 20 ㎍ 중에 존재하는 Oct-1 단백질은 0.025 pmol 야생형 JD41F/42F에 특이적으로 결합하여, 형광 강도를 JD41F/42F 단독에 의해 달성되는 수준에 비해 각각 10％ 및 43％ 감소시키는 것으로 나타났다 (도 6A). 0.025 pmol의 적은 DNA 양은 HeLa 세포의 핵 추출물에 존재하는 Oct-1의 양에 대해 몰 과량이었다. Oct-1이 그의 고 친화도 JD49F/50F 결합 부위 0.05 pmol에 결합한 경우 HeLa 세포의 핵 추출물 10 ㎍의 형광 강도는 22％ 감소되었지만 (실시예 5에서), Oct-1이 그의 저 친화도 JD41F/42F 결합 부위 0.025 pmol (이는 존재하는 Oct-1의 양에 대해 몰 과량임)에 결합한 경우 HeLa 세포의 핵 추출물의 동일한 양의 형광 강도는 단지 10％ 감소되었다는 관찰 결과는, 레이저 결합 분석에 의해 동일한 단백질에 대한 고 친화도 및 저 친화도 DNA 결합 부위를 구별할 수 있음을 입증한다.
VP16 0.1 ㎍을 Oct-1:JD41F/42F 반응 혼합물에 첨가한 경우 형광 강도가 20％ 감소되었으며, 이는 Oct-1:JD41F/42F 복합체 단독에 의해 달성된 수준에서 10％더 감소하였음을 나타낸다 (도 6A). 이러한 추가의 감소는 방출된 형광을 단일 단백질 Oct-1:JD41F/42F 복합체보다 더 많이 흡수 및 보유할 수 있는 다중-단백질 Oct-1:HCF:VP16:JD41F/42F 복합체 형성으로부터 유발되었다.
HeLa 세포의 핵 추출물 10 ㎍ 또는 20 ㎍이 VP16의 존재 또는 부재하에 돌연변이형 JD43F/44F 0.025 pmol과 반응했을 때 형광 강도의 감소는 관찰되지 않았으며, 이는 Oct-1 또는 Oct-1:HCF:VP16 복합체가 돌연변이된 DNA 서열에 결합하지 않았음을 암시한다 (도 6B). 이러한 돌연변이 DNA 결합 연구에 의해, 조질의 핵 추출물을 사용하여 특이적 다중-단백질:DNA 복합체 형성을 측정하는 레이저 검출 방법의 특이성을 확인하였다.
HeLa 세포의 핵 추출물 10 ㎍을 야생형 JD45F/46F 0.025 pmol과 반응시킨 경우, 형광 강도는 JD45F/46F 단독에서 관찰되는 형광 강도에 비해 32％ 감소하였다 (도 7A). 이와 같이 강도에 있어서의 비교적 큰 감소는 Oct-1이 (OCTA+) TAATGARAT 부위에 고 친화도로 결합하는 능력에 대한 함수이다.
VP16 0.1 ㎍을 HeLa 세포의 핵 추출물 10 ㎍ 및 야생형 JD45F/46F 0.025 pmol에 첨가하자 형광 강도가 69％ 감소하였으며, 이는 Oct-1:JD45F/46F 복합체 단독에 의해 달성되는 강도 수준에서 37％ 더 감소된 것이다 (도 7A). Oct-1, HCF 및 VP16은 각각 110 KDa, 약 300 KDa 및 65 KDa의 크기이기 때문에, 69％의 큰 감소는 다중-단백질 Oct-1:HCF:VP16이 JD45F/46F에 존재하는 (OCTA+) TAATGARAT 부위에 매우 효과적으로 결합한 직접적인 결과이다.
대조적으로, HeLa 세포의 핵 추출물 10 ㎍을 VP16 0.1 ㎍의 존재 또는 부재하에 돌연변이형 JD47F/48F 0.025 pmol과 반응시킨 경우 형광 강도의 감소가 관찰되지 않은 것은 (도 7B), 돌연변이된 DNA 서열에 대한 DNA 결합의 파괴를 분명하게 나타내며, 레이저 결합 분석의 특이성을 추가로 입증한다.
이 실시예는 본 발명의 방법에 의해, 조질의 핵 세포 추출물을 사용하는 경우, 다중-단백질 복합체 (2종 이상의 상이한 단백질로 구성됨)가 DNA 서열상의 하나 (또는 그 이상)의 결합 부위에 특이적으로 결합하는 것을 재현가능하게 측정할 수 있음을 분명하게 입증한다. 또한, 레이저 결합 분석에 의해 임의의 주어진 DNA 서열에 대한 특이적 단백질 또는 다중-단백질 복합체의 친화도를 평가할 수 있다.
실시예에 의해 입증된 바와 같이, 본 발명을 모든 종류의 DNA-결합 단백질에 적용할 수 있다. 예를 들어, 종양단백질인 c-JUN이 그의 특이적 DNA 인식 부위에 결합하는 경우, 측정가능한 단위는 결합되지 않은 DNA에 의해 달성되는 수준에 비해 55％ 감소하는 것으로 관찰되었다 (도 1A 및 1B). c-JUN을 돌연변이형 DNA 서열과 반응시킨 경우 감소는 관찰되지 않았는데 (도 1C 및 1D), 이는 결합 반응이 일어나지 않았음을 나타내며, 이로서 상기 검출 방법의 특이성을 확인하였다.
또한, 단백질의 DNA-결합 도메인만을 포함하는 펩티드의 특이적 결합은 정량적인 방식으로 검출할 수 있다. 예를 들어, 야생형 DNA에 결합된 c-JUN 펩티드 20 ng, 100 ng 및 200 ng은 자유 DNA에 대해 관찰된 수준에 비해 각각 13％, 28％ 및 43％의 감소를 나타냈다 (도 2A). 20 ng의 c-JUN 펩티드만이 결합한 것을 신뢰성있게 측정할 수 있다는 사실은 검출 분석법의 높은 민감도를 입증한다. 대조적으로, c-JUN 펩티드 20 ng, 100 ng 및 200 ng은 돌연변이형 DNA에 결합하지 않았으며, 돌연변이형 DNA 단독에서 관찰되는 수준을 초과하는 증가는 적은 것으로 나타났다 (도 2B). 전장 단백질을 대신하는 펩티드의 결합은 약제의 고안 및(또는) 스크리닝에 있어서 특별한 관심의 대상이 될 수 있다.
도 3A 및 3B는 각각 아연 핑거 DNA-결합 단백질인 Sp1과 야생형 또는 돌연변이형 DNA 결합 부위의 결합을 나타낸다. Sp1 200 ng이 야생형 DNA에 결합한 경우, DNA 단독에 대해 측정된 수준에 비해 44％의 감소가 관찰되었다. 돌연변이된 DNA 서열의 경우 200 ng Sp1가 결합하지 않은 것으로 관찰되었다.
본 발명의 분석법에 의해 항체:단백질:DNA 복합체와 단백질:DNA 복합체를 구별할 수 있다. 예를 들어, c-JUN 항체 각각 5 ㎍ 또는 1 ㎍이 야생형 DNA에 복합체화된 c-JUN 1 ㎍과 결합한 경우, 형광 강도는 c-JUN:DNA 복합체에 대해 나타난 25％ 감소에 비해 42％ 및 37％ 감소한 것으로 관찰되었다 (도 4A). IgG:c-JUN 복합체는 돌연변이형 DNA 서열에 결합하지 않았다.
도 5, 6 및 7은 상호간 POU 도메인 DNA-결합 단백질 Oct-1이 3개의 상이한 DNA 서열 인식 부위와 상이한 결합 친화성으로 결합하는 것을 나타낸다. 또한, 실시예 5 및 6은 DNA-결합 단백질의 공급원으로서 조질의 핵 단백질 추출물을 사용하는 가능성을 입증하지만, 여전히 고도로 특이적인 단백질-DNA 결합을 보유한다. 각 DNA 부위의 결합 친화도에 따라, HeLa 세포의 핵 추출물 10 ㎍은 야생형 Oct-1 DNA 결합 부위와, 결합되지 않은 DNA에서 달성된 수준에 비해 10％, 22％ 또는 32％ 감소하여 결합하였다.
중요한 것은, 순수 단백질을 사용하든지 조질의 핵 추출물을 사용하든지 간에, 본 발명의 방법에 의해 다중-단백질 복합체 (2종 이상의 상이한 단백질로 구성됨)가 하나 (또는 그 이상)의 DNA 결합 부위에 결합하는 것을 신뢰성있게 측정할 수 있다는 것이다. 예를 들어, Oct-1:HCF:VP16:DNA 복합체는 각각 고 친화도 (OCTA+) TAATGARAT 부위 또는 저 친화도 (OCTA-) TAATGARAT 부위와 결합하는 경우 69％ 및 20％의 형광 감도 감소를 나타냈다 (도 7 및 6). 돌연변이된 모든 DNA 서열의 경우 Oct-1 단백질 또는 Oct-1:HCF:VP16 단백질 복합체의 결합은 관찰되지 않았다.
다중-단백질:DNA 복합체는 단일 단백질:DNA 복합체보다 자연에 더 많이 존재하며, 생물학적으로 중요하다. 본 발명의 방법을 이용하여 조질의 핵 단백질 추출물을 사용함으로써 DNA에 대한 단일 또는 다중-단백질 결합을 고도로 특이적인 방식으로 분석하는 것은 주로 임상에서 적절하다.
이상, 특정 실시예를 참고로 본 발명을 상세히 설명하였지만, 당업자라면 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명을 다양하게 변화 및 변형시킬 수 있음은 물론이다.

Claims (26)

  1. 왓슨-크릭 상보적 염기 상호작용 또는 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합된 2개 이상의 평행 또는 역평행 이종중합 핵염기-함유 서열을 포함하는 아프타머(aptamer)를 제공하나, 단 (a) 상기 아프타머가 단일-가닥인 경우, 상기 2개 이상의 서열이 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합되고, (b) 상기 아프타머가 이중나선이고 상기 2개 이상의 서열이 서로 역평행인 경우, 상기 2개 이상의 서열이 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합되는 것인 단계; 및
    상기 아프타머를 리간드와 접촉시켜 핵염기:핵염기의 왓슨 크릭 염기 쌍형성이 아닌 상호작용에 의해 상기 리간드가 상기 아프타머에 결합되도록 하는 단계
    를 포함하는, 리간드의 결합 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제공 단계가 상기 아프타머를 용액중에, 고형 지지체상에, 시험관내에, 생체내에 또는 컴퓨터내(in silico)에 위치시키는 것을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제공 단계가 상기 아프타머를 생물체에 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 아프타머가 상기 리간드의 생물학적 활성을 변경시키는 유효량으로 투여되는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 아프타머를 표지하고, 상기 리간드 또는 상기 리간드와 리간드에 결합된 제2 리간드의 검출 유효량으로 투여하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제공 단계가 상기 아프타머를 시험 매질에 위치시키는 것을 포함하고, 상기 시험 매질 중에서 상기 리간드의 존재 또는 부재를 검출하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 아프타머가 이중나선을 포함하고, 상기 2개 이상의 서열이 평행 방향으로 왓슨-크릭 상보적 염기 상호작용에 의해 함께 결합된 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 아프타머가 이중나선을 포함하고, 상기 2개 이상의 서열이 평행 또는 역평행 방향으로 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합된 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 아프타머가 삼중나선을 포함하고, 상기 2개 이상의 서열이 평행 또는 역평행 방향으로 왓슨-크릭 상보적 염기 상호작용에 의해 함께 결합된 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 아프타머가 삼중나선을 포함하고, 상기 2개 이상의 서열이 평행 또는 역평행 방향으로 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합된 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 아프타머가 사중나선을 포함하고, 상기 2개 이상의 서열이 평행 또는 역평행 방향으로 왓슨-크릭 상보적 염기 상호작용에 의해 함께 결합된 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 아프타머가 사중나선을 포함하고, 상기 2개 이상의 서열이 평행 또는 역평행 방향으로 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합된 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 리간드가 단백질 또는 펩티드를 포함하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 리간드에 핵염기가 없는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 2개 이상의 서열에서 일부 핵염기가 쌍형성되지 않은 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 2개 이상의 서열이 가교된 2개 이상의 핵산 가닥에 함유된 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 아프타머가 아프타자임(aptazyme)인 방법.
  18. 왓슨-크릭 상보적 염기 상호작용 또는 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합된 2개 이상의 평행 또는 역평행 이종중합 핵염기-함유 서열을 포함하는 아프타자임을 제공하나, 단, (a) 상기 아프타자임이 단일-가닥인 경우, 상기 2개 이상의 서열이 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합되고, (b) 상기 아프타자임이 이중나선이고 상기 2개 이상의 서열이 서로 역평행인 경우, 상기 2개 이상의 서열이 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합되는 것인 단계; 및
    리간드를 상기 아프타자임과 접촉시켜 상기 리간드가 관여하는 반응을 촉매하는 단계
    를 포함하는, 상기 반응의 촉매화 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 리간드가 1개 이상의 아미노산 서열, 핵산 서열, 탄수화물 및 지질을 함유하는 방법.
  20. 왓슨-크릭 상보적 염기 상호작용 또는 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합된 2개 이상의 평행 또는 역평행 이종중합 핵염기-함유 서열을 포함하나, 단 (a)상기 아프타머가 단일-가닥인 경우, 상기 2개 이상의 서열이 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합되고, (b) 상기 아프타머가 이중나선이고 상기 2개 이상의 서열이 서로 역평행인 경우, 상기 2개 이상의 서열이 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합되는 것인 아프타머.
  21. 제20항에 있어서, 이중나선을 포함하고, 상기 2개 이상의 서열이 서로 평행하며 왓슨 크릭 상보적 염기 상호작용에 의해 함께 결합된 것인 아프타머.
  22. 제20항에 있어서, 이중나선을 포함하고, 상기 2개 이상의 서열이 평행 또는 역평행 방향으로 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합된 것인 아프타머.
  23. 제20항에 있어서, 삼중나선을 포함하고, 상기 2개 이상의 서열이 평행 또는 역평행 방향으로 왓슨-크릭 상보적 염기 상호작용에 의해 함께 결합된 것인 아프타머.
  24. 제20항에 있어서, 삼중나선을 포함하고, 상기 2개 이상의 서열이 평행 또는 역평행 방향으로 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합된 것인 아프타머.
  25. 제20항에 있어서, 사중나선을 포함하고, 상기 2개 이상의 서열이 평행 방향으로 왓슨-크릭 상보적 염기 상호작용에 의해 함께 결합된 것인 아프타머.
  26. 제20항에 있어서, 사중나선을 포함하고, 상기 2개 이상의 서열이 평행 방향으로 상동성 염기 상호작용에 의해 함께 결합된 것인 아프타머.
KR20047004251A 2001-09-24 2002-09-16 상동적으로 결합되거나 신규 복합체에 존재하는 핵산 또는핵산 동족체의 서열을 함유하는 아프타머 KR20040035878A (ko)

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