MXPA04002766A - APT??MEROS QUE CONTIENEN SECUENCIAS DE áCIDOS NUCLEICOS O ANáLOGOS DE áCIDOS NUCLEICOS UNIDOS HOMOLOGAMENTE, O EN COMPLEJOS NUEVOS. - Google Patents

APT??MEROS QUE CONTIENEN SECUENCIAS DE áCIDOS NUCLEICOS O ANáLOGOS DE áCIDOS NUCLEICOS UNIDOS HOMOLOGAMENTE, O EN COMPLEJOS NUEVOS.

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MXPA04002766A
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Abstract

Un aptamero contiene por lo menos dos secuencias que contienen nucleobases heteropolimericas paralelas o antiparalelas unidas juntas por interaccion de bases complementarias de Watson-Crick o por interaccion de bases homologas, con la condicion de que: a) cuando el aptamero es de hebra sencilla, las por lo menos dos secuencias estan unidas juntas por interaccion de bases homologas; y b) cuando el aptamero es un duplex y las por lo menos dos secuencias son antiparalelas entre si, las por lo menos dos secuencias estan unidas juntas por interaccion de bases homologas. El aptamero puede ser usado para unir ligandos o para catalizar reacciones cuando funcionan como un aptasima.

Description

AP.CAMEROS QUE CONTIENEN SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS O ANALOGOS DE ACIDOS NUCLEICOS UNIDOS HO OLOGAMENTE, O EN COMPLEJOS NUEVOS ANTECEDENTES DE LA INVENCION 1. CAMPO DE LA INVENCION la invención se relaciona a aptámeros, y más particularmente a aptámeros que comprenden por lo menos dos secuencias que contienen nucleobases, que son paralelas o antiparalelas entre si, y unidas por preferencias de enlace de Watson-Crick u homologas. 2. DESCRIPCION DE LA TECNICA RELACIONADA Los complejos de proteina-ácido nucleico se conocen que desempañan una función importante en una variedad de procesos biológicos. Ver, por ejemplo, Hill y colaboradores "Fluorescence Approaches to Study of Protein-Nucleic Acid Complexation", 278 Methods in Enzymology 390 (1997) . Por e emplo, las proteínas de enlace de DNA. se conocen que desempañan una función importante en la regulación de genes. Los genes son típicamente regulados al nivel de trascripción por proteínas de enlace de DNA, que son referidas como factores de trascripción. Los factores de trascripción regulan la expresión del gen al enlazar específicamente a una secuencia de ácido nucleico objetivo en el DNA de promotor. Debido a la importancia biológica de la interacción de proteína-ácido nucleico, se han propuesto una variedad de métodos para estudiar las características de enlace de proteina-ácido nucleico. Ver, por ejemplo, Hill y colaboradores y las referencias citadas en la misma. Ver también, la solicitud de patente norteamericana No. de serie 09/224,505 previa de los inventores. Los aptámeros pueden ser diseñados para interactuar específicamente con sustancias que no son de ácido nucleico, tales como proteínas u otras sustancias corporales. Los aptámeros pueden funcionar como receptores de alta afinidad para ligandos de molécula pequeña o pueden interactuar estrechamente con proteínas objetivo para propósitos terapéuticos o de diagnóstico. El plegamiento de una molécula inicialmente no estructurada alrededor de su ligando y la formación de una red de enlace de hidrógeno con su ligando facilitan este enlace. arshall y colaboradores. "A biopolymer by any other ñame would bind as well: a comparison of the ligand-binding pockets of nucleic acids and proteins". 5(6) Structure 729-734 (1997). Estos aptámeros pueden ser ligandos usados para clasificar otras moléculas o puedan ser catalíticos. Los aptámeros que son catalíticos se consideran ribozimas aproximadas, o aptazimas. Hasta la fecha, los aptámeros han sido casi exclusivamente de RNA de una sola hebra. Los aptámeros también pueden ser diseñados para interactuar específicamente con sustancias de ácido nucleico, diferente a simplemente enlazarlas en la base del emparejamiento de bases de Watson-Crick entre bases en secuencias de ácido nucleico de orientación opuesta. Tales aptámeros, si son catalíticos, puede ser claramente llamados aptazimas. Tal acción especifica puede ser buscada para propósitos terapéuticos o de diagnóstico. Un número pequeño de moléculas de RNA se conoce que son activas como catalizadores y no simplemente sirven como el medio mediante el cual la información se mueve fuera del núcleo. Las ribozimas pueden ser de autosegmentación o pueden segmentar otro RNA. Esta actividad se entiende que es dependiente de la estructura secundaria del RNA, que puede ser dependiente de factores tales como la secuencia de bases y la inclusión de metalocationes . En el pasado, ha existido un gran esfuerzo dirigido en la construcción de ribozimas novedosas o mejoradas. Las ribozimas tienen gran utilidad en controlar artificialmente la expresión de los genes. Los desarrolladores han buscado tomar ventaja de los patrones de carga muy específicos de los ácidos nucleicos, sus bases y cadenas principales y habilidad del DNA para formar estructura secundaria predecible, basado en la secuencia de bases y el emparejamiento de bases de Watson-Crick predecible. Las dimensiones pequeñas del ácido nucleico y la naturaleza flexible lo hacen bien adecuado para la construcción de complejos capaces de reconocer y específicamente enlazar a cualidades de otras sustancias, tales como proteínas, y quizás en lo mismo adoptar la estructura terciaria. A través de la clasificación inducida de SELEX (patente norteamericana No. 5,567,588 de Gold y colaboradores), que depende del enlace a ácidos nucleicos de una sola hebra montados en biochips, los investigadores han descubierto ribozimas, que son 100 o aún 1000 veces más activas catalíticamente . Fernandez y colaboradores, "Pulling on Hair (pins)", 292 Science 563. (27 de Abril del 2001), reportan datos colectados de un cambio conformacional de una sola molécula en una ribozima. Fernández y colaboradores también reportan que tales estructuras de ácido nucleico esencialmente dúplex se someten "todas o ninguna" a transiciones discretas en la conformación, no el par progresivo mediante el enlace de pares que se esperaría. Los investigadores han descrito un RNA circular que tiene actividad enzimática para segmentar una molécula de RNA separada en un sitio de segmentación y moléculas de RNA capaces de conferir estabilidad al RNA in vivo a través de una proteína de enlace de ribozima endógena. Ver la patente norteamericana No. 5,712,128 de Been y colaboradores y la patente norteamericana No. 5,985,620 de Sioud. La patente norteamericana No. 5,840,867 de Toóle describe métodos para hacer aptámeros y aptámeros que enlazan a biomoléculas . Estos aptámeros pueden ser usados para interferir función biológica normal de las biomoléculas como una herramienta de separación, un medio de diagnóstico o un medio terapéutico. Los aptámeros pueden ser RNA o DNA de una sola cadena o dúplex. Sin embargo, esta patente solamente describe el enlace de Watson-Crick intramolecular o intermolecular de la variedad antiparalela. Los investigadores han aplicado aptámeros de RNA de una sola hebra dirigidos contra la proteina prión de hámster dorado de Siria y los aptámeros fueron capaces de reconocer su objetivo especifico dentro de una mezcla de cientos de diferentes proteínas contenidas en homogenados de tejido para de esta manera tender a validar la utilidad de los aptámeros. Korth y colaboradores "Prion (PrPSc) -specific epitope defined by a monoclonal antibody" . Nature 390:74-77 (1997). La patente norteamericana No. 6,207,388 de Grossman ——~ está dirigida a métodos, composiciones, kits y aparatos para identificar y detectar la presencia o ausencia de analitos objetivo. Las composiciones comprenden una molécula de RNA que puede ser un aptámero que enlaza a una molécula objetivo. Sin embargo, Grossman solamente enseña el enlace antiparalelo de Watson-Crick de nucleobases . La patente norteamericana No. 5,858,774 de Malbon y colaboradores proporciona un método para regular un gen al introducir en una célula una construcción de DNA de antisentido. Sin embargo, esta patente no enseña la utilización de un ácido nucleico para enlazar a una sustancia que no es de ácido nucleico. Los aptámeros se han usado para identificar y evaluar nuevas sustancias, o fármacos, que tienen una actividad de enlace especifica, o que predeciblemente alteran las caracteristicas de enlace de otros pares/complejos de enlace. Por ejemplo, los investigadores han encontrado un aptamero de DNA. de una sola hebra que enlaza el sitio activo de la trombina (una proteina implicada en la coagulación de la sangre) y muestra efectos de anticoagulación In vivo. Davis, "Kinetic characterization of Thrombin-Aptamer interactions" . Pharmacia Biosensor Application Note 305, 1994. A pesar de los desarrollos anteriores, aun existe espacio en la técnica para aptámeros de diseño novedoso con propiedades de enlace únicas y para usos novedosos de tales aptámeros . BREVE DESCRIPCION DE LA I VENCION La invención proporciona un aptámero que comprende por lo menos dos secuencias que contienen nucleobases heteropoliméricas, paralelas o antiparalelas, unidas con untamente por la interacción de bases complementarias de Watson-Crick o por la interacción de bases homólogas, con la condición de que: (a) cuando el aptámero es de una sola hebra, las por lo menos dos secuencias son unidas conjuntamente por la interacción de bases homologas; y (b) cuando el aptámero es un dúplex y las por lo menos dos secuencias son antiparalelas entre si, las por lo menos dos secuencias son unidas conjuntamente por la interacción de bases homologas. También se proporciona un método para enlazar un ligando. El método comprende poner en contacto el ligando con un aptámero de la invención. Aún además se proporciona un método para catalizar una reacción con un aptámero catalitico (aptazima) de la invención. BREVE DESCRIPCION DE LAS DIVERSAS VISTAS DE LOS DIBUJOS La invención será descrita en conjunción con los siguientes dibujos en los cuales los números de referencia similares designan elementos similares y en donde las Figs . 1A, IB, 1C, ID, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A, 4B, 5A, 5B, 6A, 6B, 7A y 7B son espectros fluorescentes. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La invención sale de la elucidación de los inventores de las propiedades de enlace especificas de las secuencias de nucleobases heteropoliméricas . Las solicitudes de patentes previas de los inventores describieron el enlace especifico de una hebra heteropolimérica al ácido nucleico dúplex y el enlace especifico del ácido nucleico dúplex a otro ácido nucleico dúplex. Las solicitudes de patentes previas de los inventores también han descrito que las secuencias heteropoliméricas de nucleobases (y/o sus análogos) pueden específicamente enlazarse entre si mediante la unión de bases homólogas asi como mediante la interacción de bases de Watson-Crick, y que tal unión de bases especifica no está limitada a secuencias sobre hebras que tienen direccionalidad antiparalela con relación entre si y a la formación dúplex. Asi, las secuencias de bases heteropoliméricas (y/o sus análogos) pueden específicamente enlazarse entre si con direccionalidad paralela o antiparalela en donde las bases unidas por la unión de bases homólogas y/o las reglas de unión de bases de Watson-Crick, ya sea presentes en la misma hebra de ácido nucleico o en diferentes hebras. La invención es más que meramente la descripción de propiedades de enlace no ortodoxas, pero especificas, de ácidos nucleicos. La invención comprende aptámeros novedosos, métodos para elaborar los aptámeros y métodos para usar los aptámeros para propósitos terapéuticos, de diagnóstico, profilácticos, de diseño u otros propósitos. Los aptámeros son ácidos nucleicos típicamente diseñados para enlazar específicamente con sustancias que no son de ácido nucleico, tales como proteínas u otras biomoléculas (por ejemplo, carbohidratos, lipidos, etc.) aunque también pueden enlazar ácidos nucleicos para ciertos propósitos. El término "aptazimas" como se utiliza en la presente significa un catalizador de aptámero. Las aptazimas pueden enlazar específicamente ácidos nucleicos (particularmente para catalizar la segmentación de los misreos) , así como a proteínas y otras biomoléculas. "Enlace" en términos de aptámero y objetivo como se utiliza en la presente se refiere a una interacción o formación de complejo entre un objetivo y un aptámero, que da por resultado un complejo suficientemente estable para realizar un propósito terapéutico para permitir la detección de los complejos o la separación de los complejos de aptámero :objetivo de las estructuras no formadas en complejo bajo condiciones dadas. Los aptámeros pueden desempeñar muchas de las mismas funciones como las moléculas de proteína, incluyendo cambios específicos implícitos en su estructura de 2 o 3 dimensiones en respuesta al enlace del ligando. Los aptámeros pueden ser funcionalizados al incluir nucleobases no emparejadas o moléculas no de nucleobases. Los inventores describen aptámeros que emplean el presente descubrimiento de que las secuencias de nucleobases mezcladas pueden enlazar específicamente en ya sea la porción de enlace complementaria de atson-Crick o en la porción de enlace homóloga. La elucidación previa de los inventores de las secuencias de nucleobases mezclada triples y cuádruples demuestra que la especificidad del enlace de nucleobase no está restringido a un plano o superficie especifica de la nucleobase, y que una nucleobase es capaz de enlazar especificamente a dos o más nucleobases a la vez y, más notablemente, que una nucleobase puede enlazar una nucleobase en la manera complementaria de Watson-Crick mientras que especificamente enlaza complementariamente u homologamente a otra nucleobase. Todos estos descubrimientos hacen posible una gran expansión del diseño del aptámero. Sin que se desee que sea enlazada por alguna teoria en particular, los inventores creen que las secuencias de nucleobases son inherentemente ambivalentes como la porción de enlace y que el enlace es una función de las oportunidades de enlace presentadas por su medio ambiente. Los inventores creen también que la especificidad de porción de enlace es una propiedad de una secuencia de bases que es forzada en la nucleación que se ha alcanzado. Por consiguiente, los inventores creen que la preferencia de enlace de una hebra nucleada es el resultado del apilamiento de bases, las fuerzas electrostáticas o similares, que operan dentro de la hebra de nucleobases . Una vez que tal preferencia de porción ha sido establecida para una hebra fue posible observar "toda o nada de cinética" Markoviana en relación con la disociación forzada de las bases unidas y su reasociación "de dos estados" que no muestra el "cierre" secuencial gradual esperado de las bases re-templadas. Los inventores proponen que el comportamiento observado por Fernandez, supra es el producto de la ""preferencia de porción" o "memoria de porción" por la hebra de nucleobases. Fernandez sugiere que los experimentos que examinan el replegamiento mediante las unidades autónomas de proteina será llevado a cabo rápidamente. La "memoria" similar puede ser observada con respecto al replegamiento de la proteina. Los inventores además creen que es útil relacionar la preferencia de porción de enlace y el fenómeno de inestabilidad de desigualación. Los inventores están muy impresionados por la gran inestabilidad de introducida localmente por un par incompatible de nucleobases, aun nucleobases cuya geometría sugiere que ellas no deben ser desestabilizantes a sus vecinos de enlace. Los inventores relacionan esta inestabilidad con la contradicción del imperativo inherente en la preferencia de porción de las secuencias unidas. Los inventores encontraron*"'"útil relacionar la preferencia de porción de enlace a ciertos factores relacionados con la interacción de proteína-DNA, tal como mediante la traducción por Rec BCD a lo largo del DNA dúplex. Dohoney, Nature 2001 Jan 18; ¦ 409(6818) :370-374, reporta el movimiento de la proteina y el desenrrollamiento de DNA concurrente a una velocidad constante y excepcionalmente rápida. Los inventores imaginan que la estabilidad del DNA dúplex puede ser debilitada de una manera alostérica, precisamente como ellos imaginan que la nucleación es alostérica y crea o forza una preferencia de enlace en las secuencias adyacentes de las nucleobases. Las solicitudes previas de los solicitantes han mostrado que la preferencia de porción puede dar por resultado el enlace homólogo, que es especifico entre las secuencias de bases mezcladas en hebras antiparalelas. Como la deformación de la cadena principal, que se consideró previamente que es una barrera para tal emparejamiento, es concomitantemente improbable de tal enlace, es probable que los hechos inesperados sean aprendidos cuando tales dúplexes son observados mediante la exploración de MR u otras técnicas . Las solicitudes previas de los inventores también han mostrado que las hebras paralelas de nucleobases de secuencias mezcladas pueden enlazar especificamente bajo cualquier porción para formar un dúplex o que las secuencias de bases mezcladas paralelas o antiparalelas pueden enlazar específicamente al dúplex previamente formado. Más notablemente los inventores han mostrado que las bases unidas al dúplex permanecen reactivas específicamente como se consideran otras bases unidas al dúplex próximas ya sea conforme a la porción de enlace complementaria de atson Crick o la porción de enlace homóloga. Por consiguiente, las invenciones de los inventores relacionadas con los aptáme os dependen de muchos descubrimientos notables relacionados con el enlace de ácido nucleico, el comportamiento y las características, que pueden grandemente extender el campo del diseño y el uso de aptámeros. No es sorprendente que el emparejamiento de bases complementarias en el DNA dúplex, como es sugerido por Watson-Crick en 1953, debe haberse llevado a cabo todo antes cuando se propone y grandemente inhibió el pensamiento y la experimentación acerca del enlace de ácido nucleico. En 1940 Linus Pauling y Max Delbruck han expresado la opinión de que la complementariedad molecular fue la base de la especificidad biológica y el "secreto de la vida". Las opiniones del articulo, "The Nature of Intermolecular Forces Operative in Biological Processes" prepararon el terreno para la expectación de que tal enlace complementario seria por diferentes porciones y no por las mismas porciones. Por consiguiente, la disposición de Watson y Crick y otros para descartar el concepto de enlace homólogo por ácido nucleico. Las hebras de ácido nucleico tienen direccionalidad inherente. Los conocimientos convencionales sostienen que las hebras de direccionalidad opuesta, es decir, que son antiparalelas en su orientación entre si, pueden formar un dúplex a través del enlace complementario de Watson-Crick de sus secuencias de bases respectivas. Ciertos aptámeros dúplex de acuerdo con la invención, por otra parte, comprenden dos hebras de ácido nucleico (y/o análogos de ácido nucleico) hibridadas en re3.ación paralela entre si, en donde el enlace especifico es ya sea a través del empare amiento de bases homologas o el emparejamiento de bases de Watson-Crick. Los conocimientos convencionales sostienen que tales dúplexes no pueden existir, o por lo menos serian extremadamente inestables debido a, por ejemplo, las irregularidades de la cadena principal necesitadas por los requerimientos conformacionales de la unión de bases paralelas. Aun más sorprendente es el descubrimiento de los inventores de que bajo condiciones de hibridación moderadas apropiadas, la unión del dúplex homóloga paralela demuestra la especificidad y la estabilidad que rivaliza o excede a aquella del dúplex antiparalelo complementario de Watson-Crick. La invención también comprende aptámeros dúplex que contienen dos hebras de ácido nucleico (y/o análogos de ácido nucleico) hibridadas en relación antiparela entre si, en donde el enlace especifico notablemente, es a través del emparejamiento de bases homólogas. Como se utiliza en la presente, los términos "emparejamiento de bases de Watson-Crick", "empare amiento de bases complementarias" y similares se proponen para definir la asociación especifica entre los pares compuestos o adyacentes de las hebras de ácido nucleico y/o análogos de ácido nucleico por medio de bases igualadas (por ejemplo, A:T; G:C y/o A:U) . en el contexto de los complejos ""no canónicos" descritos en la presente, incluyendo dúplexes paralelos, triplexes paralelos y antiparalelos y cuadrúpleces paralelos, los términos similares a "unión de bases de atson-Crick" y "unión de bases complementarias" se proponen para denotar la unión entre A y T, A y U y/o G y C, pero no necesariamente en la conformación plana opuesta, de lado, primero sugerida por atson y Crick: Además de la porción de enlace convencional primero propuesta por Watson-Crick (la "porción W-C"), y las variantes conformacionales de las mismas comprendidas por la definición anterior de la unión de bases de Watson-Crick, la presente invención comprende aptámeros formados por la unión de bases homologas. En la unión de bases homólogas, las bases se unen especificamei.te con bases idénticas antes que bases complementarias pero no necesariamente de una manera simi lar a la conformación plana opuesta, de lado, primero sugerida por Watson-Crick. Asi, en la "porción homóloga", pares de bases homólogas incluyen A:A, G:G, C:C, T:T y U:U. Las referencias a ya sea la "porción" de enlace comprenden no solamente el enlace especifico por las nucleobases opuestas entre si que interactúan en el lado, como en el dúplex unido de Watson-Crick antiparalelo, sino también nucleobases en secuencias que están suficientemente próximas entre si ya sea establemente unidas en dúplexes antiparalelos o no unidas. Una nucleobase puede enlazar específicamente una base previamente unida en un dúplex de acuerdo con la porción de Watson-Crick y simultáneamente enlazar una segunda base en la base de la porción Homologa. El enlace por las bases de las hebras de ácido nucleico es afectado o condicionado por un número de factores, particularmente el enlace potencial de las hebras conforme a ya sea la porción W-C o la porción homologa, y las condiciones iónicas (por ejemplo la concentración y/o tipo de sal) . Las condiciones salinas tienden a favorecer la formación de la unión de Watson-Crick sobre la unión homóloga. Los cuadrúpleces de porción homólogas son favorecidos sobre los cuadrúpleces de porción W-C bajo condiciones de solución reguladora idénticas probablemente debido a que el medio ambiente localizado puede llegar a ser relativamente de baja salinidad sobre la presencia de las cadenas principales cargadas de los dos ácidos nucleicos dúple . Un aptámero de la invención puede comprender una o más secuencias de nucleobases y/o análogos de nucleobases, con la condición de que las nucleobases están relacionadas a las nucleobases a las cuales están para enlazar específicamente por ya sea la porción W-C o la porción homologa. Contrario a ciertas enseñanzas de la técnica previa, las nucleobases de enlace del aptámero no necesitan ser homopoliméricas para alcanzar el enlace, en el caso de la formación triplex o cuádruplex. Asi, en ciertas modalidades, las nucleobases de una primera secuencia de enlace están arregladas en una secuencia heteropolimérica de purinas y pirimidinas interdispersadas, y las nucleobases de una segunda secuencia de enlace están arregladas en una secuencia heteropoliméricas de purinas y pirimidinas interdispersadas, y está por lo menos parcialmente complementarias o parcialmente homólogas a la primera secuencia. Por ejemplo, la secuencia de enlace de una hebra puede contener 25% a 75% de bases de purina y 75% a 25% de bases de pirimidina en cualquier orden. Los aptámeros de la invención pueden formarse de secuencias heteropoliméricas, que como se define en la presente, significa secuencias que contienen por lo menos una nucleobase de purina o análogo de purina y por lo menos una nucleobase de pirimidina o análogo de pirimidina en por lo menos sus segmentos de enlace. Las secuencias heteropoliméricas de preferencia carecen de fragmentos homopoliméricos mayores que 5 bases de largo. Otras nucleobases también son adecuadas para el uso en la invención, tales como, por ejemplo, análogos sintéticos de bases que surgen de manera natural que tienen afinidades de enlace de atson-Crick y/o homologas a otras bases. Además del autoenlace de ácidos nucleicos y dúplexes basados en el enlace homólogo, los aptámeros de la invención también incluyen ácidos nucleicos triplex y cuádruplex en donde las hebras heteropoliméricas opuestas están enlazadas por bases complementarias de aton-Crick o por bases homologas, y la direccionalidad relativa de las secuencias unidas está paralela o antiparalela entre si. Una primera secuencia de nucleobases puede específicamente enlazar en la mayor o menor ranura de un complejo de ácido nucleico de doble hebra. Además, las bases pueden simultáneamente interactuar específicamente con las bases en una o ambas hebras de un complejo de ácido nucleico de doble hebra, con el cual la primera secuencia está unida. De manera similar, las bases de cada hebra de un complejo de doble hebra pueden interactuar específicamente en una o más hebras de un complejo de doble hebra en aptámeros cuádruplex de la invención. En ciertas modalidades triplex y cuádruplex, cada nucleobase se enlaza a una o dos de otras nucleobases. Asi, además de los pares de bases de Watson-Crick dúplex tradicionales y los pares de bases homologas dúplex descritos en lo anterior, tales modalidades incluyen los siguientes tripletes de enlace de bases de Watson-Crick: A:T:A, T:A:T, U:A:T, T:A:U:, A:U:A, U:A:U, G:C:G y/o C:G:C (incluyendo C+:G:C, y/o cualquier otra especie ionizada de base) y/o los siguientes tripletes de bases homologas :A:A: T, T:T:A, U:U:A, T:U:A, A:A:U, U:T:A, G:G:C y/o C:C:G (incluyuendo C:C+:G, y/o cualquier otra especie ionizada de base) . Asi, en ciertas modalidades cuádruplex en donde el aptámero comprende una primera, segunda, tercera y cuarta hebra, se cree que las bases de la primera y la tercera hebra se enlazan entre si, además de: (a) el enlace entre las bases opuestas de la primera y la segunda hebra; (b) el enlace entre las bases opuestas de la tercera y la cuarta hebra; y (c) el enlace entre las bases opuestas de la segunda y la cuarta hebra. En ciertas modalidades de los aptámeros triplex y cuádruplex de la invención, ninguna secuencia de enlace de bases está contigua con otra secuencia de enlace de bases. Esto es, hay por lo menos tres hebras separadas. Aunque las conformaciones plegadas y similares (por ejemplo, vueltas de hair ina), -etc.) están dentro del alcance de la invención (particularmente cuando el aptámero se hace complejo con moléculas objetivo, tales como proteínas), porciones plegadas de una sola hebra no hacen la cuenta de hebra más de una vez en las descripciones de la invención. Los aptámeros de la invención de preferencia no dependen de la unión de Hoogsteen o cuartetos de G-G para el mantenimiento de la estructura compleja, aunque la unión de Hoogsteen y/o cuartetos de G-G pueden estar presentes. Esto es, los aptámeros de la invención de preferencia están sustancialmente libres de la unión de Hoogsteen y sustancialmente libre de los cuartetos G-G. Cada hebra del aptámero independientemente comprende un ácido nucleico que tiene un fosfato de desoxirribosa o cadena principal de fosfato de ribosa (por ejemplo, DNA, RNA, m NA, rRNA, tRNA o cDNA) o un análogo de ácido nucleico del mismo. Los análogos de ácido nucleico preferidos contienen una cadena principal sin carga o de manera parcial negativamente cargada (es decir, una cadena principal que tiene una carga que no es tan negativa como la cadena principal de DNA nativa) e incluye, por ejemplo, PNA y LNA. Ciertas modalidades están libres de PNA. Los análogos de ácido nucleico de la invención también pueden comprender cadenas principales de manera parcial positivamente cargadas. Por lo menos una porción del aptámero puede ser aislada, purificada, artificial o sintética. En modalidades, una porción del aptámero es un producto amplificado por PCR. Los aptámeros de la invención pueden estar presentes en solución, sobre un soporte sólido, in vitro, in vivo o in sílico. El soporte sólido puede ser eléctricamente conductor (por ejemplo, un electrodo) o no conductor. Además, los complejos pueden ser ópticamente mapeados o secuenciados después de ser alargados, como en enseñado en las patentes norteamericanas Nos. 6,147,198 y 5,720,928 de Sch artz. Los aptámeros de la invención pueden ser proporcionados por un método que comprende: (a) proporcionar una mezcla de hibridación que conprende una primera porción de una sola hebra o dobl -hebra que contiene una primera secuencia heteropolimérica de ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico, una segunda porción de una sola hebra o doble hebra que contiene una segunda secuencia heteropolimérica de ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico, agua y una solución reguladora; y (b) incubar- la mezcla de hibridación durante un tiempo de incubación efectivo para hibridar la primera secuencia heteropolimérica a la segunda secuencia heteropolimérica para proporcionar el aptámero. La mezcla de hibridación puede incluir cualquier medio convencional conocido que es adecuado para preservar nucleótidos. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, "Molecular Cloning: A Lab Manual", Vol. 2 (1989). Por ejemplo, el medio puede comprender nucleótidos, agua, soluciones reguladoras y concentraciones de sal estándares. Cuando se usan cationes divalentes exclusivamente para promover la. formación triplex o cuádruplex, los agentes quelantes tales como EDTA o EGTA no deben ser incluidos en las mezclas de reacción.
El enlace especifico entre las bases ocurre bajo una amplia variedad de condiciones que tienen variaciones en temperatura, concentración de sal, resistencia electrostática y composición de la solución reguladora. Ejemplos de estas condiciones y métodos para aplicarlos son ^conocidos en la ¾ técnica. La solicitud de patente norteamericana copendiente No. 09/885,731, presentada el 20 de Junio del 2001, de los inventores, describe condiciones particularmente adecuadas para el uso en esta invención. Distinto a mucho complejos de tipo Hoogsteen, que son inestables o no resistentes a niveles de pH arriba de aproximadamente 7.6, los complejos de la invención son estables sobre un amplio rango de niveles de pH, de preferencia de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 9. Los aptámeros de la invención se pueden proporcionar para propósitos analíticos, de diagnóstico, profilácticos, terapéuticos y/o de diseño. Los complejos pueden ser usados para analizar, diagnosticar, prevenir y/o tratar condiciones asociadas con la infección por un organismo o virus. El organismo o virus puede ser cuantificado, si es deseado. Un aptámero de la invención se puede usar como una herramienta de separación para recuperar los péptidos a los cuales específicamente se enlazan. En esta situación, el aptámero está funcionando muy similar a un anticuerpo monoclonal en tanto su especificidad como función- Mediante el acoplamiento de tal aptámero que contiene la secuencia de enlace específicamente a un soporte . sólido, se pueden recuperar sustancias objetivo deseadas. Esto es particularmente útil en la investigación o fabricación al efectuar el aislamiento y la purificación de sustancias a las cuales se enlaza. En aplicaciones de diagnóstico, los aptámeros inventivos pueden ser empleados en ensayos de enlace específicos para sustancias objetivo. Ellos pueden ser marcados usando métodos y marcas conocidas en la técnica incluyendo, pero no limitados a, porciones detectables tales como fluoróforos y radioisótopos, y luego usados para la formación de imagen in vivo o el análisis histológico. Debido a su alta especificidad, una aplicación de los aptámeros es detectar diferencias en el tipo y nivel de las modificaciones de proteína de postraducción y aún la presencia de proteínas mutantes . Terapéuticamente, el aptámero puede específicamente enlazar a sitios biológicamente activos sobre la molécula objetivo y afectar la actividad biológica. "Actividad biológica" se utiliza en la presente para describir cualquiera actividad que el objetivo posee en el contexto normal de su función metabólica u otra función in vivo en el organismo. Sin limitar a la invención, esto puede incluir la función catalítica de un enzima, o ribozima, la función reguladora de una hormona, o la función de reconocimiento de una molécula de superficie de célula. Los aptámeros pueden ser formulados para una variedad de modos de administración, incluyendo la adiainistración sistémica y tópica o la administración localizada. Para la administración sistémica, el aptámero puede ser dado por medio de inhalación o inyección, incluyendo la aplicación intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. La administración también puede ser transmucosal o transdérmica asi como oralmente. Los aptámeros también pueden ser usados en sistemas de expresión, por ejemplo en la aplicación de la terapia génica. El ciertas modalidades, el aptámero puede ser un fármaco o puede ser formado como un agente anticáncer, agente autopatógeno o para efectuar la regulación celular o la transcripción así como la expresión del gen. El aptámero puede estimular una respuesta inmune o la apoptósis. Esta invención permite el enlace del aptámero en un organismo vivo o virus, o en una célula. El complejo puede ser formado en solución, unido a una superficie o sustrato, una partición, una cuenta o un electrodo o biochip. La utilidad de estos biochips puede ser encontrada en, pero no limitada a, la formación de huellas dactilares moleculares de muestras de tejido, análisis de la respuesta molecular a la infección viral, análisis de la respuesta de inflamación y el análisis de rutas bioquimicas. Los aptámeros de la invención se pueden formar bajo condiciones de hibridación convencionales, bajo condiciones de hibridación de triplex, bajo condiciones de hibridación de cuádruplex o bajo condiciones de hibridación in situ. Se prefiere que los complejos sean formados a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 55°C durante aproximadamente 2 horas o menos. En ciertas modalidades, el tiempo de incubación de preferencia es menor que cinco minutos, aun a temperatura ambiente. Los tiempos de reacción más largos no pueden ser requeridos, pero la incubación por hasta 24 horas en muchos casos no afecta adversamente a los complejos. Los tiempos de enlace rápido de los complejos de la invención contrastan con los tiempos de enlace mucho más largos necesarios para la formación de complejos unidos de Hoogsteen. Las porciones de los aptámeros pueden ser reticuladas por muchos medios de reticulación conocidos en la técnica. Los aptámeros pueden comprender nucleobases no emparejadas y moléculas no de nucleobases. El promotor en el medio de hibridación de preferencia es un agente de intercalación o un catión, como es descrito en la solicitud de patente norteamericana No. 09/613,263, presentada el 10 de Julio del 2000. Los intercaladores son opcionalmente fluorescentes. El agente de intercalación puede ser, por ejemplo, un flúoróforo, tal como un elemento seleccionado del grupo que consiste de: Y0Y0-1, T0T0-1, YOYO-3, TOTO-3, P0P0-1, BOBO-1, POPO-3, BOBO-3, LOLO-1, J0J0-1, dimeros de cianina, Y0-PR0-1, TO-PRO-1, YO-PRO-3, TO-PRO-3, TO-PRO-5, P0-PR0-1, B0-PR0-1, P0-PR0-3, BO-PRO-3, L0-PR0-1, JO-PRO-1, monómeros de cianina, bromuro de etidio, homodimero-1 de etidio, homodimero-2 de etidio, derivados de etidio, acridina, acridina naranja, derivados de acridina, heterodímero de etidio-acridina, monoazida de etidio, yoduro de propidio, tintes SYTO, SYBR Green 1, tintes SYBR, Pico Green, tintes Sytox y 7-aminoactinomicina D. Los cationes adecuados incluyen, por ejemplo, cationes monovalentes, tales como Na+ (de preferencia a una concentración de 40 mM a 200 niM) , K* (de preferencia a una concentración de 40 mM a 200 mM) , y otros iones de metales alcalinos; cationes di alentes tales como iones de metales alcalinotérreos (por ejemplo, Mg+2 y Ca+2) y iones metálicos de transición divalentes (por ejemplo, Mn+2, Ni+2, Cd+2, Co+2 y Zn+2); y cationes que tienen una carga positiva de por lo menos tres, tales como Co(NH3)6+3, espermidina trivalente y espermina tetravalente. Mn+2 de preferencia se proporciona a una concentración de 10 mM a 45 mM. Mg+2 de preferencia se proporciona a una concentración de 10 mM a 45 mM. Ni+2 de preferencia se proporciona a una concentración de aproximadamente 20 mM. En las modalidades, Mg+2 y Mn+2 se proporcionan en combinación a xana concentración de 1 mM cada uno, 2 mM cada uno, 3 mM cada uno... 0 mM cada uno (es decir, 1-40 mM cada uno) . La cantidad de catión adicionada al medio en el cual el complejo se forma depende de un número de factores, incluyendo la naturaleza del enlace que ocurre, la naturaleza del catión, la concentración de las hebras de enlace, la presencia de cationes adicionales y el contenido de base de la sonda y el objetivo. Las concentraciones de catión preferidas y las mezclas ordinariamente pueden ser descubiertas experimentalmente . Para triplexes se prefiere, se prefiere adicionar catión(es) al medio en las siguientes cantidades: (a) Mn+2 10 mM-30 mM; (b) Mg+2 10 mM-20 mM; (c) Ni+2 20 mM; o (d) 1 mM-30 mM de cada uno de Mn+2 y Mg+2. Para cuádruplexes, se prefiere adicionar catión(es) al medio en las siguientes cantidades: (a) Mn+2 10 mM-45 mM; (b) Mg+2 10 mM-45 mM; o (c) 10 mM-40 mM de cada uno de Mn+2 y Mg+2. Aunque no es requerido, otros promotores de enlace incluye, por ejemplo, proteinas de enlace de una sola hebra tal como la- proteina Réc A, el gen T4 de proteina 32, proteina de enlace de una sola hebra de E. coli, proteinas de enlace de la ranura de ácido nucleico mayor o menor, viológeno y sustancias de intercalación adicionales tales como actinomicina D., psoralren y angelicina. Tal facilitación de reactivos puede probarse útil en condiciones de operación extrema, por ejemplo, bajo niveles de pH normales o temperaturas extremadamente altas. Ciertos métodos para proporcionar complejos de la invención son conducidos en la ausencia de promotores de proteina, tal como Rec A y/o otras proteínas de recombinación. Además de proporcionar aptámeros novedosos, la invención también proporciona un método rápido, sensible, ambientalmente favorable y seguro para analizar el enlace entre aptámeros y objetivos. Las modalidades de la invención comprenden la calibración de la señal debida (por ejemplo, propiedades ópticas, de fluorescencia, quimioluminiscencia, electroluminiscencia, eléctricas o electromecánicas) para una primera mezcla de aptámero-objetivo contra el mismo tipo de señal mostrada por otros aptámeros combinados con el mismo objetivo, en donde cada uno de los otros aptámeros difieren del primer aptámero por al menos una nucleobase. Una curva de calibración puede ser generada, en donde la magnitud de la señal medida (por ejemplo intensidad fluorescente) es una función de la afinidad de enlace entre el objetivo y el aptámero. En modalidades, la señal medida puede ser la intensidad fluorescente de un fluoróforo incluido en la muestra de prueba. En tales modalidades, la afinidad de enlace entre el aptámero y el objetivo puede ser directamente o inversamente correlacionado con la intensidad, dependiendo de si el flúoróforo señaliza la hibridación a través del enfriamiento de la señal o amplificación de la señal. Bajo condiciones seleccionadas, la intensidad fluorescente generada por los agentes de intercalación puede ser directamente correlacionada con la afinidad de enlace del aptámero-obj etivo mientras que la intensidad de las modalidades preferidas emplea un fluoróforo de no intercalación covalentemente unido al aptámero objetivo puede ser inmensamente correlacionada con la afinidad de enlace del aptámero-obj etivo . La invención permite la cuantificación de la afinidad de enlace entre el aptámero y el objetivo. Tal información puede ser valiosa para una variedad de usos . Incluyendo el diseño de fármacos con características de enlace optimizadas . El ensayo de la invención de preferencia es homogéneo. El ensayo puede ser conducido sin separar el aptámero libre y el aptámero libre del complejo de aptámero-obj etivo antes de detectar la magnitud de la señal de vida. El ensayo no requiere una etapa de separación de gel, permitiendo de esta manera un gran incremento en el rendimiento de la prueba. De los análisis cuantitativos son simples y precisos. Consecuentemente, el ensayo de enlace ahorra una gran cantidad de tiempo y costo y puede ser fácilmente automatizado. Además, permite enlazar variables tales como la solución reguladora, pH, concentración iónica, temperatura, tiempo de incubación, concentraciones relativas de secuencias de aptámero y de objetivo, concentración de intercalador, el objetivo de las secuencias objetivo, longitud de las secuencias de aptámero y los requerimientos de cofactor posibles (es decir, promotor) para ser rápidamente determinada. El ensayo puede ser conducido en, por ejemplo, una solución dentro de una cavidad o microcanal, sobre una superficie impermeable o sobre un biochip. En ciertas modalidades, el objetivo se proporciona en el medio de hibridación antes del aptámero y el aptámero se proporciona en forma deshidratada antes de la rehidratación mediante el contacto con el medio de hibridación. En ciertas modalidades, el ensayo invertido es conducido sin proporcionar un agente de enfriamiento de señal solo el objetivo sobre el aptámero. Los aptám¿ros de la invención de preferencia son de 2 a 100 bases de largos (más de preferencia 5 a 45 bases de largo) y comprenden por lo menos una hebra que contiene nucleobases. Como se utiliza en la presente, El término "hebra (s) que contiene nucleobase" denota, por ejemplo ssDNA, RNA, ssPNA, LNA, dsDNA, dsRNA, híbridos de D ArRNA, dsPNA, híbridos de PNA:DNA y otros ácidos nucleicos de una sola y doble hebra y análogos de ácido nucleico que tienen cadenas principales de azúcar fosfato y/o péptido no cargadas, de manera parcial negativamente cargadas. También denota hebras de nucleobases que tienen cadenas principales positivamente cargadas o de manera parcial positivamente cargadas. El ensayo de la invención no requiere el uso de sondas radioactivas, que son peligrosas, tediosas y consumidoras de tiempo para la utilización, y necesitan ser constantemente regeneradas. Los aptámeros de la invención de preferencia son seguros de utilizar y estables durante años. Los objetivos de la invención son porciones que están sustancialmente libres de nucleobases. Los objetivos preferidos incluyen, por ejemplo, proteínas, péptidos (por ejemplo, péptidos, dipéptidos, tripéptidos, etc.), polipéptidos, proteínas, complejos multiproteinas, hormonas, lípidos, etc. Una variedad de complejos de aptámeros-objetivo pueden ser analizados con el método de la invención. La invención puede ser usada para analizar las características de enlace (incluyendo la presencia o la ausencia de enlace, y la agilidad de enlace) entre un aptámero y, por ejemplo un péptido, una proteína o un complejo de muítiproteína. Las proteínas adecuadas para el análisis incluyen, por ejemplo, de tipo silvestre, mutantes, aisladas, producidas in vitro y/o sintetizadas. La invención es particularmente adecuada para el análisis del enlace de la proteina de enlace de DNA. Las muestras de prueba no necesitan ser 100% puras, sino más bien, pueden comprender, por ejemplo, una preparación purificada, una preparación sintetizada, un extracto de proteina semipurificado, un extracto de proteina cruda o una preparación traducida in vitro. El complejo de aptámero-objetiv© de preferencia es detectado por un cambio en por lo menos una marca. La por lo menos una marca puede ser unida al aptámero y/o al objetivo, y/o puede estar libre en el medio de prueba. La por lo menos una marca puede comprender por lo menos dos porciones. La marca es de preferencia por lo menos un elemento seleccionado del grupo que consiste de una marca de giro, un fluoróforo, un cromóforo, un agente quimioluminiscente, un agente electro-quimioluminiscente, un radioisótopo, una enzima, un hapteno, un anticuerpo y un anticuerpo marcado. De preferencia, el complejo se detecta por al menos una emisión de la marca o por la inspección de una característica electrónica del complejo. El complejo de aptámero-objetivo puede ser detectado bajo por lo menos una condición variada, tal como es descrito en la patente norteamericana No. 6,265,170 de Picard y colaboradores. Las condiciones variadas adecuadas incluyen, por ejemplo, (a) un cambio en los componentes no acuosos del medio de prueba, (b) un cambio en un pH del medio de prueba, (c) un cambio en una concentración de sal del medio de prueba, (d) un cambio de un contenido de solvente orgánico del medio de prueba, (e) un cambio en un contenido de formamida del medio de prueba, (f) un cambio en una temperatura del medio de prueba, y (g) un cambio en la concentración de sal caotrópica en el medio de prueba-Además, la condición variada puede ser la aplicación de un estimulo, tal como, por ejemplo corriente eléctrica (DC y/o AC) , radiación fotónica (por ejemplo, luz láser), o fuerza electromagnética. El estimulo puede ser aplicado constantemente o pulsado. La detección puede ser llevada a cabo a través del uso de una condición variada individual, o a través de una combinación de condiciones variadas en serie. La respuesta de una caracteristica del complejo de aptámero-objetivo en el medio de prueba a la condición variada o estimulo puede ser inspeccionada para detectar el complejo. La caracteristica puede ser, por ejemplo, conductancia eléctrica o Q (una estructura resonante de una linea de transmisión o cambios en fase o amplitud de una señal propagada en la linea de transmisión y medio de prueba. En las modalidades, el método de detección comprende: (a) detectar una señal de una marca, en donde la señal está correlacionada con una afinidad de enlace entre el aptámero y el objetivo; (b) variar una condición de un medio de prueba; (c) detectar una señal subsecuente; y (d) comparar la señal y la señal subsecuente. La variación y la detección pueden ser repetidas al menos una vez o realizadas solamente una vez. La marca es de preferencia un fluoróforo. Arabos fluoróforos de intercalación y de no intercalación son adecuados para el uso en la invención. El fluoróforo puede estar libre en solución, covalentemente unido al aptámero y/o covalentemente unido al objetivo. Cuando el fluoróforo está covalentemente unido al aptámero, este de preferencia está unido a un extremo del mismo. Los marcadores fluorescentes preferidos incluyen biotina, rodamina, acridina y fluoresceina, y otros marcadores que emiten fluorescencia cuando se irradian con energía excitante. Los fluoróforos de no intercalación adecuados incluye, por ejemplo, los tintes alexa, tintes BODIPY, conjugados de biotina, sondas reactivas de tiol, fluoresceína y sus derivados (incluyendo las "sondas encerradas") tintes de Oregón Green, Rhodamine Green y QSY (que detienen la fluorescencia de los fluorosforos excitados coio luz visible) . La longitud de onda de excitación es seleccionada (mediante la experimentación de rutina y/o conocimiento convencional) para corresponder a este máximo de excitación del fluoróforo que es usado, y es de preferencia de 200 a 1000 nm. Los fluoróforos son de preferencia seleccionados para tener una longitud de onda de emisión de 200 a 1000 mn.
En modalidades preferencias, un láser de ion argón es usado para irradiar el fluoróforo con luz que tiene una longitud de onda en un rango de 400 a 540 nm, y la emisión fluorescente es detectada en un rango de 500 a 750 nm. El ensayo de la invención puede ser realizado según amplia variedad de temperaturas, tales, por ejemplo, de aproximadamente 2 a aproximadamente 60°C. Ciertos ensayos de la técnica previa requieren temperaturas elevadas, adicionando costo y retardo al ensayo. Por otra parte, la invención puede ser conducida a temperatura ambiente o bajo de ésta, por ejemplo, a un temperatura por debajo de 25°C) . La invención será ilustrada en más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos, pero se debe entender que la presente invención no se considera que esté limitada a los mismos. Ejemplos Los Ejemplos demuestran el enlace de tres clases diferentes de proteínas de enlace de DNA a sus sitios de reconocimiento de DNA respectivos, y la detección del complejo formado. Las tres proteínas representativas seleccionadas para los Ejemplos son c-JUN (Ejemplos 1, 2 y 4), Spl (Ejemplo 3) y Oct-1 (Ejemplos 5-6). Ejemplo 1 c-JUN es un miembro de la familia AP-1 de factores de transcripción que enlazan y regulan los sitios de enlace de DMA. de AP-1 naturalmente presentes en las secuencias de promotor o de aumentador de muchos genes celulares y virales. Ver, Por ejemplo, Bohmann y colaboradores, "Human proto-oncogene c.jun encodes a DNA binding protein with structural and functional properties of transcription factor AP-1". 239 Science 1386-1392 (1987). Ademas,, la proteina c-JUN humana pertenece a una clase de .proteínas (que incluye c-FOS y c-MYC) , designadas proto-oncoproteinas, que cuando son desrreguladas y activadas ocasionan tumurogénesis y cáncer . c-JUN, c-FOS y c-MYC constituyen un grupo especifico de proteínas de enlace de DNA, cuyo dominio de enlace de DNA consiste de una región rica en aminoácidos básicos (comúnmente llamada la "región básica" o "dominio básico") que yace inmediatamente adyacente a un dominio estructural, designado el "cierre de leucina" . El cierre de leucina consiste de 4 a 5 residuos de leucina (c-JUN tiene 5), que están separados en intervalos regulares de 7 aminoácidos, que forman estructuras bimoleculares enroscadas-enroscadas . El contacto especifico con su secusncia de DNA palindrómica ocurre principalmente por medio de la región básica. El cierre de leucina permite la dimerización de c-JUN por si mismo, formando homodimeros de c-JUN: c-JUN, o a c-FOS que forma heterodimeros c-JUN: c-FOS. Los homodimeros de c-JUN doblan el DNA dúplex 79° hacia dentro en la ranura menor de un hélice de DNA, mientras que los heterodimeros c-JUN: c-FOS doblan el DNA dúplex 94° en la dirección opuesta, hacia dentro en la ranura mayor. Un dominio de enlace de DNA. completamente funcional requiere tanto la región básica como en el cierre de leucina. Como la proteina c-JU humana es usada en los siguientes ensayos, los ejemplos muestran el enlace de los homodimeros c-JUN: c-JUN a un SQIO sitio AP-1 (JD1F/2F) . Un oligonucleótido de dsDNA de tipo silvestre marcado con fluoresceina, JDlF/2f, que contiene un sitio de enlace de DNA de AP-1 de 7 bp consensual se derivó de la secuencia de promotor del gen de colagenasa humano. JD1F y JD2F de 17-mers de ssDNA marcado con 5' -fluoresceina complementaria, que tiene 5 nucleótidos que flanquean ambos extremos del sitio AP-1 consensual se sintetizaron en un sintetizador de ácido nucleico PerSeptive Biosystems Expedite y se purificaron mediante HPLC. Cantidades equimolares de los oligos JD1F y JD2F se templaron en Tris 10 mM pH 7.5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM mediante desnaturalización a 95°C durante 5 minutos, seguido por la incubación a 42°C, 35°C y 21°C por 40 minutos cada uno. Los oligos templados se precipitaron con etanol durante 2 horas a -20°C, se formaron en pelotillas por centrifugación a 14K rpm durante 20 minutos a 0°C, se lavaron con etanol al 100%, se volvieron a formar en pelotillas a 14K rpm durante 20 minutos a 0°C, se secaron y se disolvieron en ddH20 a una concentración final de 100 ng/µ?. Los oligos de dsDNA formados tuvieron una molécula de fluoresceina individual en ambos extremos 5' . Secuencia para JDIF de tipo silvestre (SEQ ID NO:l): 5'-Flu-GTG TCT GAC TCA TGC TT-3' Secuencia para JD2F de tipo silvestre (SEQ ID N0:2): 5'-Flu-AAG CAT GAG TCA GAC AC-3' JD3F/4F de 17-mer de dsDNA mutante fue idéntico en la secuencia a JD1F/2F de tipo silvestre, excepto por un solo cambio de par de bases (subrayado) de GC a TA dentro del sitio de enlace de DNA consensual de AP-1 de tipo silvestre. Secuencia para JD3F mutante. (SEQ ID NO: 3): 5' -FLU-GTG TCT TAC TCA TGC TT-3' Secuencia para JD4F mutante (SEQ ID NO:4) : 5' -FLU-AAG CAT GAG TAA GAC AC-3' La mezcla de reacción de enlace de c-JUN:DNA (30 µ?) contuvo lo siguiente: HEPES 9.25 mM, pH 7.9, MgCl2 2.23 mM, EDTA 0.03 mM, NaCl 50 mM, DTT 5.0 mM, glicerol al 3.75% (v/v) , 0.15 µg/µl de albúmina de suero bovino (BCA) , 0-2.0 µg de proteina c-JUN pura (Promega, Madison, Wisconsin) o 0-400 ng de peptido c-JUN puro y 0.075 pmole de oligonucleótido de dsDNA marcado con 5' fluoresceina. Cuando se usó c-JUN de longitud completa, 3 ng/µ? de poli (di) -poli (dC) se incluyó en la mezcla de reacción, y se adicionó antes de la adición de la proteina y el DNA marcado con fluoresceina. Los ejemplos en las Figs. IB y ID contuvieron KCl 50 mM en lugar de NaCl 50 mM. Los péptidos de dominio de enlace de DNA de c-JUN de tipo silvestre y mutante se suministraron generosamente por el Dr. Dirk Bohmann (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germany) . Las mezclas de reacción se incubaron a 21°C durante 30 minutos, se colocaron en una probeta de cuarzo, se irradiaron con un haz de láser de ion argón que tiene una longitud de onda de 488 nm y se inspeccionaron para la emisión fluorescente. El péptido de dominio de enlace de DNA. de c-JUN de tipo silvestre consistió de los 132 residuos de aminoácido C-terminales de c-JUN (de Gln y 209 Phe 340) . El péptido de dominio de enlace de DNA de c-JUN mutante 14 fue idéntico en secuencia al péptido de tipo silvestre, excepto por una sustitución de dos aminoácidos (subrayada) que convirtió lisina a isoleucina en la posición 277 y cisteina a ácido aspártico en la posición 278 dentro del dominio básico central . Secuencia para el péptido c-JUN de tipo silvestre (SEQ ID NO: 5) : 210 220 230 240 QPQQQQQPPHHLPQQMPVQHPRLQALKEEPQTVPEMPGE 250 260 270 280 TPPLSPIDIffiSQERIKAERKRMRNRIAASKCRKRKLERIA 290 300 310 320 RLEEKVKTLKAQNSEIJASTANMLREQVAQLKQKVMNHV NSGCQLMLTQQLQTF Secuencia para el péptido c-JUN mutante 14 (SEQ ID NO: 6} : 210 220 230 240 QPQQQQQPPHHLPQQMPVQHPRLQALKEEPQ VPEMPGE 250 260 270 280 TPPLSPIDMESQERIKAERKRMRI^IAASIDRKRKLERIA 290 300 310 320 RLEEKV LKAQNSEIAST.¾ ELREQVAQLKQKVMNHV 330 340 NSGCQLMLTQQLQTF Los espectros de fluorescencia obtenidos para el enlace de 2 µg, 1 µ o 0.05 de c-JUN de longitud completa a 0.075 pmol de JD1F/2F de tipo silvestre o 0.075 pmol de JD3F/ F mutante. son mostrados en las Figs. 1A-1D. La concentración de DNA se mantuvo constante a 2.5 fmol/µ? para cada muestra probada. Todas las muestras, ya sea de DNA solo, o en la presencia de c-JUN, se probaron bajo condiciones de reacción idénticas. La intensidad fluorescente máxima ocurrió a 525 nm, puesto que el fluoróforo usado fue fluoresceina. La intensidad máxima observada cuando 1 g o 0.05 de c-JUN se enlazó a JD1F/2F fue 54% y 49% menor, respectivamente, que aquella observada con JD1F/2F solo (Fig. LA) . Una disminución del 55% en intensidad resultó cuando 2 g de c-JUN se enlazó a JD1F/2F de tipo silvestre (datos no mostrados) . Las disminuciones similares en la intensidad obtenidas con tanto 1 y 2 µ? de c-JUN, sugieren que los niveles de saturación de enlace se alcanzaron mediante la adición de 1 g de proteina . Para probar la preferencia de c-JUN para el enlace de DNA dúplex bajo condiciones diferentes de sal, el experimento anterior se realizó simultáneamente en una solución reguladora de reacción que contiene KCl 50 mM en lugar de NaCl 50 mM (Fig. IB) . Cuando 2 g de c-JUN se enlazaron a JD1F/2F de tipo silvestre en la solución reguladora de reacción de KCl, se observó una disminución del 57% en la intensidad, comparado con el nivel alcanzado con DNA solo. 1 y 0.5 de c-JUN enlazado al JD1F/2F de tipo silvestre. en la solución reguladora de KCl 50 mM produjo una disminución del 40% y 34%, respectivamente, sugiriendo por debajo de los niveles de saturación de enlace. Por lo tanto, c-JUN enlaza a su sitio AP-1 con más alta afinidad de enlace en una mezcla de reacción de NaCl 50 mM en una mezcla de reacción de KCl 50 mM. Asi, el ensayo de enlace por láser de acuerdo con la invención no podría sólo confiablemente detectar el enlace de c-JUN:DNA, pero también podría identificar las condiciones de enlace preferenciales. Durante el mismo experimento, cuando las mismas cantidades exactas de c-JUN se hicieron reaccionar con 0.075 pmol de JD3F/4F mutante en la mezcla de reacción de NaCl 50 mM (Fig. 1C) o la mezcla de reacción de KC1 -50 mM (Fig. ID) no se observó disminución en la intensidad fluorescente en cada muestra, indicando ningún enlace de la proteina en la secuencia DNA mutada. Estos estudios de enlace de DNA mutante confirman la especificidad de tanto las condiciones de enlace de DNA de c-JUN:tipo silvestre y como el método de detección por láser. Resultados idénticos se obtuvieron cuando las intensidades fluorescentes emitidas se midieron en tres diferentes tipos de integración (datos no mostrados), demostrando los resultados consistentes sin considerar el tiempo de integración. Ejemplo 2 La proteina c-JUN de longitud completa es de 40 KDa o de 340 aminoácidos en tamaño. El dominio de enlace de DNA de c-JUN está localizado a los 132 residuos de aminoácido C-terminales de c-JUN (de glutamina en el residuo 209 a fenilalanina en el residuo 340) y es capaz de enlazar el DNA dúplex con afinidad de enlace similar como la proteina de longitud completa. Las Figs. 2A-2B demuestran que el enlace y la detección del enlace de DNA dúplex a tal péptido, consiste de solamente este dominio de enlace de DNA de 132 aminoácidos. 20 ng, 100 ng y 200 ng de péptido de dominio de enlace de DNA de c-JUN de tipo silvestre enlazados a 0.075 pmol de JD1F/2F de tipo silvestre en la mezcla de reacción de NaCl 50 mM, dieron por resultado una disminución del 13%, 28% y 43% en la intensidad fluorescente, respectivamente, comparada con la intensidad emitida por JD1F/2F solo (Fig. 2A) . El hecho de que el enlace de solo 20 ng de péptido de c-JUN a 0.075 pmol de DNA podria ser confiablemente detectado, demuestra la alta sensibilidad del ensayo por láser. Además, el ensayo de enlace de péptido :DNA es cuantitativo puesto que cantidades incrementadas de péptidos de c-JUN dieron por resultado progresivamente más enlace al DNA de tipo silvestre. En contraste, 20 ng, 100 ng y 200 ng de péptido de c-JUN de tipo silvestre no enlazan al mutante JD3F/4F, dando por resultado incrementos menores en la intensidad fluorescente arriba de aquella observada con el DNA mutante solo (Fig. 2B) , confirmando la especificidad del ensayo de enlace por láser. La disminución de 43% en la intensidad fluorescente observada para 200 ng de péptido de c-JUN enlazado a JD1F/2F, es menor que las disminuciones del 54% y 49% observadas para 1 ig y 0.5 µg de proteina de c-JUN de longitud completa, respectivamente, como es predicho. Se podria esperar obtener menos detección estática que ocurre con un péptido, que con una proteina de longitud completa, puesto que menos masa de proteina absorberla la luz fluorescente emitida en un péptido .
Ejemplo 3 Spl pertenece a una clase significante de proteínas de enlace de DNA dúplex designadas proteínas de enlace de DNA de extensión de zinc. Ver, por ejemplo, Kadonaga y colaboradores, "Isolation of cDNA encoding transcription _ factor Spl and functional analysis of t e DNA binding domain". 51 Cell 1079-1090 (1987). Spl controla la trascripción de un número grande de promotores o aumentadores virales y celulares, incluyendo la repetición terminal larga HIV-I (LTR) . El número, espaciamiento, orientación y secuencia de los sitios de enlace de Spl varían ampliamente entre los promotores, dando por resultado sitios de enlace de alta, mediana o baja afinidad. Aunque Spl es una proteina relativamente grande (95 Kda y 105 Kda en su forma glicosilada y fosforilada) , su actividad de enlace de DNA está localizada cerca del cDNA terminal de la proteina (de la cisteina en el residuo 539 de la histidina en el residuo 619) . Esta región contiene tres porciones de extensión de ¡Tn(II) contiguas, que son estructuras de metaloproteina que interactúan con el DNA. La especificidad de secuencia del enlace de DNA es conferida completamente por las tres extensiones de Zn(II) . La extensión 3 es la extensión más critica (con respecto a la afinidad de enlace) seguido por la extensión 2 y por último la extensión 1. Dos residuos de cisteina y dos residuos de histidina enlazan en un ion Zn(II) para formar cada extensión. La remoción del zinc colapsa la estructura secundaria de las tres extensiones de zinc. La extensión en estas clases de proteinas de enlace de DNA dúplex tienen una secuencia consensual de Cys2-X2,4_Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His, referida como extensiones de C S2/CVS2 . Un segundo tipo de porción de extensión de Zn(Il) referida como extensión Cys2/Cys2 con la forma de Cys-X2-Cys-Xi3-Cys-X3-Cys, son encontradas en otras proteinas de enlace de DNA, tales como muchos receptores de hormona. Un oligonucleótido de dsDNA marcado con fluoresceina de tipo silvestre JD11F/12F, que contiene un solo sitio de enlace de DNA Spl de 10 bp consensual, se derivó de la secuencia de promotor del gen metalotioneina-ÜA humano. JD11F y JD12F de 20-mers de ssDNA marcados con 5'-fluoresceina complementarios se sintetizaron, se purificaron y se templaron como antes . Secuencia para JD11F de tipo silvestre (SEQ ID N0:7): 5'-Flu-CCG GCC GGG GCG GGG CTT TT-3' Secuencia para JD12F de tipo silvestre (SEQ ID NO:8): 5' -Flu-AAA AGC CCC GCC CCG GCC GG-3' JD13F/14 de 20 mer de dsDNA mutante fue idéntico en la secuencia a JD11F/12F de tipo silvestre, excepto por un cambio de 6 bp (subrayado) que convirtió el sitio de enlace Spl consensual GGG GCG GGG C a TAA ATA GGG C. Secuencia para JD13F mutante (SEQ ID NO:9) : 5'-Flu-CCG GCC TAA ATA GGG CTT TT-3' Secuencia para JD14F mutante (SEQ ID NO:10) : 5'-Flu-AAA AGC CCT ATT TAG GCC GG-3' La mezcla de reacción de enlace de Spl:DNA (30 µ?) contuvo lo siguiente: HEPES 25 mM, pH 7.8, KCl 100 mM) , ZnS04 100 uM, DDT 1 mM, glicerol 20* ~(v/v) , 0.5 pg/µ? de BSA, 0-200 ng de proteina Spl — pura (Promea) y 0.1 pmol de oligonucleótido de dsDNA marcado con 5' -fluoresceina. Las mezclas de reacción de incubaron a 0°C durante 15 minutos, se colocaron en una probeta de cuarzo, se irradiaron con un haz de láser de ion argón que tiene una. longitud de onda de 488 mM y se inspeccionó para la emisión fluorescente. La Fig. 3 ilustra el enlace de la proteina de enlace Spl de extensión de zinc a JD11F/12F de tipo silvestre o JD13F/14F mutante. Cuando 200 ng de Spl se enlazó a 0.1 pmol de JD11F/12F se observó una disminución del 44% de la intensidad fluorescente, comparada con el nivel de intensidad alcanzado con JD11F/12F solo (Fig. 3A) . Además, el enlace de 25 ng de proteina Spl de longitud completa podria ser confiablemente detectado (datos ¦ no mostrados) demostrando la alta sensibilidad del ensayo por láser. Puesto que sPl es una proteina relativamente grande (95 KDa) , mientras que c-JUN es solamente de 40 KDa, una cantidad menor de proteina se requirió para alcanzar una reducción del 44% en la intensidad fluorescente para él DNA enlazado a Spl que el DNA enlazado a c-JUN debido a la absorción más grande y la retención de la luz fluorescente emitida por la proteina más grande. Cuando 200 ng de Spl se hicieron reaccionar con 0.1 pmol de JD13F/14F mutante, no se observó disminución en la intensidad fluorescente (Fig. 3B), indicando ningún enlace de la proteina a la secuencia de DNA mutada. -Jlstos estudios confirmaron la especificidad del ensayo . de detección por láser para una clase completamente diferente de proteinas de enlace de DNA. Ejemplo 4 Este ejemplo ilustra la habilidad del método de la invención para estudiar el enlace de un anticuerpo dirigido a una proteina especifica, que está directamente unido a la secuencia de- DNA marcada. La adición de anticuerpos especificos a los complejos de proteina: DNA (especialmente complejos de multi-proteina:DNA) es una técnica usada para identificar la presencia de proteinas desconocidas en complejos de proteina : DNA. El enlace del anticuerpo ya sea que inhibirá o prevendrá totalmente al complejo de proteina: DNA de que se forme (dando por resultado una disminución mínima o ningún cambio en la intensidad fluorescente cuando se compara con el DNA libre) o dará por resultado un complejo de anticuerpo de proteína: DNA que disminuye la intensidad de la fluorescencia aun más que el comple o de proteína: DNA. 1 g, 500 ng y 250 ng de c-JUN se hicieron reaccionar con 0.075 pmol de JD1F/2F de tipo silvestre o la mezcla de reacción de NaCl 50 mM o KC1 50 mM como es descrito previamente. Después de una incubación de 15 minutos a 21°C, cantidades variables del anticuerpo IgGi monoclonal, c-JUN (KM-1) (de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) » cultivado con un péptido correspondiente a los aminoácidos 56 a 69 de c-JUN humana, se adicionó a alguna de las mezclas de c-JUN:DNA. Las mezclas de reacción se incubaron durante 40 minutos adicionales a 21°C, se colocaron en una probeta de cuarzo, se irradiaron con un haz de láser de ion argón que tiene una longitud de onda de 488 nm y se inspeccionaron para la emisión fluorescente. Las Figs. 4A y 4B muestran el enlace de 1 ig o 250 ng de c-JUN a JD1F/2F, respectivamente, en la mezcla de reacción de NaCl 50 mM. Cuando 1 ]ig o 250 ng de c-JUN se enlazó con JD1F/2F, se observó una disminución en la intensidad del 25% y 11%, respectivamente, comparada con el nivel alcanzado con el DNA solo. La adición de 5 ]ig o 1 g de anticuerpo c-JUN a 1 g de c-JUN dio por resultado una disminución del 42% y 37%, respectivamente (es decir, una disminución adicional del 17% y 12%), indicativa de la formación del complejo IgG: c-JUN:DNA (Fig. 4A) . Disminuciones idénticas en la intensidad se observaron cuando el anticuerpo c-JUN se enlazó al 1 µg de c-JUN enlazado a JD1F/2F en la mezcla de reacción de KC1 50 M (datos no mostrados) . De manera similar, la adición de 750 ng de anticuerpos c-JUN a 250 ng de c-JUN enlazado a JD1F/2F, produjo una disminución del 20% en intensidad, una disminución adicional de 16% del nivel alcanzado del completo de proteinarDNA solo (Fig. 4B) . Los complejos IgG: c-JUN no enlazan al DNA JD3F/4F mutantes (datos no mostrados), confirmando la especificidad del ensayo por láser. Este ejemplo demuestra que el método de detección por láser puede diferenciar entre un complejo de anticuerpo .proteina :DNA y un complejo de proteinarDNA. Además, se establece la habilidad de la invención para detectar confiablemente complejos de multiproteina heterologos enlazados a DNA y no sólo monómeros u homodimeros de proteina enlazados a DNA. Solamente una de las proteinas en el complejo de multiproteina :DNA necesita ser enlazado a DNA. Los complejos de multiproteina : DNA, donde más de una proteina interactúa con DNA también pueden ser analizados por el método de la invención. Ej emplo 5 La proteina de enlace de octámero celular ubicua (Oct-1) se enlaza directamente mediante un dominio de enlace de DNA característico, que es completamente diferente que los dominios de enlace de DNA de c-JUN o Spl. Oct-1 es un miembro de las proteinas de enlace de DNA de dominio POU, que regulan la transcripción especifica de células y el desarrollo. Ver, por ejemplo, Sturm y colaboradores, "The ubiquitous octamer-ginding protein Oct-1 contains a POU domain with a horneo box subdomain". 2 Genes and Development 1582-1599 (1988) . La estructura del dominio POU es única entre los dominios de enlace de DNA, debido a que contiene dos dominios estructuralmente independientes que cooperan funcionalmente como solo una unidad de enlace de DNA. Oct-1 enlaza a DNA por medio de este dominio de POU, compuesto de un dominio especifico de POU de 75 aminoácidos (POUs), una región enlazadora corta de 24 aminoácidos, y un dominio horneo de tipo POU de 60 aminoácidos (POUH) . Tanto el dominio POUs y el dominio POUH contienen estructuras de hélice-vuelta-hélice (HTH) . Distinto a los Ejemplos 1-4, que usaron proteina purificada, este ejemplo usa extractos nucleares de células HeLA (de Promega, adison, Wisconsin) como la fuente de Oct-1. El uso de extractos nucleares de células HeLa que contienen una basta multitud de varias proteínas de enlace de DNA y factores de trascripción, muestran la posibilidad de usar extractos de proteina cruda para detectar el enlace de proteina especifica de secuencia:DNA de ensayo de enlace de la invención. Un oligonucleótido de dsDNA marcado con fluoresceina de tipo silvestre, JD49A/50F, que contiene un solo sitio de enlace de DNA de Oct-1 de 8 bp consensual, se derivó del promotor de cadena pesada de inmonoglubulina humana. JD49F y JD50F de 18-mers de ssDNA marcados con 5'-fluoresceina complementaria, se sintetizaron, se purificaron y se templaron como antes . Secuencia para JD49F de tipo silvestre (SEQ ID NO:ll) : 5'-Flu-GAG TAT GCA AAT CAT GTG-3' Secuencia para JD50F de tipo silvestre (SEQ ID NO:12) : 5'-Flu-CAC ATG ATT TGC ATA CTC-3' JD51F/52F de 18-mer de dsDNA mutante fue idéntico en la secuencia JD49F/50F de tipo silvestre, excepto por una mutación de doble punto (A1 2 -? CG) (subrayado) que inactivó el sitio de enlace de POUs y una segunda mutación de doble punto (A6A7 — CC) (subrayado) que inactivo el sitio de enlace POUH, para convertir de esta manera el sitio de enlace a un Oct-1 consensual ATGCAAAT a CGGCACCT. Secuencia para JD51F mutante (SEQ ID NO:13) : 5'-Flu-GAG TCG GCA CCT CAT GTG-3' Secuencia para JD52F mutante (SEQ ID NO: 14): 5'-Flu-CAC ATG AGG TGC CGA CTC-3' La mezcla de reacción de enlace Oct-1:DNA (30 µ?) contuvo lo siguiente: HEPES 9.25 mM, pH 7.9, MgCl2 2.23 mM, EDTA 0.03 mM, NaCl 63 mM, DTT 1.0 mM, glicerol al 3.75% (v/v), 0.10 mg/ml de BSA, PMSF 0.01 mM, 67 µg/ml de poli(dG-dC) -poli(dG-dC) , 0-15 g de extracto nuclear de células HeLa (Promega) y oligonucleótidos de dsDNA marcado con 5' fluoresceina. Las concentraciones relativamente altas de poli (di) -poli (dC) y poli (dG-dC) -poli (dG-dC) son requeridas para asegurar el enlace de proteína:DNA específico de secuencia, cuando se usan extractos de proteina nuclear cruda. Las mezclas de reacción se probaron * 21°C durante 30 minutos, se colocaron en una probeta de cuarzo, se irradiaron con un haz de láser de ion argón que tiene una longitud de onda de 488 mM y se inspeccionaron para la emisión fluorescente . Los espectros fluorescentes obtenidos cuando 10 µg de extracto nuclear de células Hela se hizo reaccionar con 0.05 pmol de JD49F/50F de tipo silvestre o 0.05 pmol de JD51F/52F imitantes son mostrados en las Figs . 5A y 5B, respectivamente. La proteína Oct-1 presente en el extracto nuclear de células HeLa, enlazada específicamente al sitio de enlace Oct-1 de alta afinidad de tipo silvestre, que da por resultado una disminución del 22% en la intensidad fluorescente comparada con el nivel observado con JD49F/50F solo (Fig. 5A) . En contraste, Oct-1 no enlaza al mutante Jd51F/52F, como es indicado por el incremento en la intensidad fluorescente arriba de aquella observada con el DNA mutante solo (Fig. 5B) , confirmando la especificidad de secuencia del ensayo. Estos experimentos demostraron la detección específica de otra clase completamente diferente de proteínas de enlace de DNA. Además, este ejemplo confirmó que el enlace de proteina:DNA especifico puede ser confiablemente medido mediante la invención aun cuando se utilizan extractos nucleares de células HeLa crudo, que contienen cientos de otras proteínas de enlace de DNA. La especificidad es conferida por la selección de la secuencia de DNA apropiadamente manejada, que reconoce la proteina de enlace de DNA particular que es estudiada. Ejemplo 6 Este ejemplo claramente demuestra que el método de la invención puede medir el enlace de un complejo de multiproteina (que consiste de dos o más diferentes proteínas) a uno (o más) sitios de enlace en una secuencia de DNA. Los estudios se condujeron en el enlace de las proteínas — celulares humanas, la proteina de enlace de octámero (Oct-1) y un factor celular del huésped (HCF - ver, por ejemplo, ilson y colaboradores, "The VP16 accessory protein HCF es a family of polipeptides processed from a large precursor protein". 74 Cell 115-125 (1993)) con el virus de herpes simple tipo 1 (HSV-1) proteina VP16 (o Vmw65) a la secuencia de DNA TAATGARAT (en donde R es una purina) . Este complejo de multi-proteina : DNA es llamado el complejo temprano inmediato (IEC) o complejo inducido de VP16. Aunque VP16 es el transactivador más potente del gen siempre identificado, este no puede enlazar DNA eficientemente por si mismo. En cambio esta interactúa específicamente con Oct-1 y HCF para inducir genes. VP16 enlaza a Oct-1 de HCF por medio de sus 461 aminoácidos aminoterminales . El dominio altamente acidico C-terminal de VP16, definido pro los aminoácidos 411 y 490, funciona como la región de activación transcripcional potente. Ver, por ejemplo., Dalrymple y colaboradores, "DNA seguence of the herpes simplex virus type 1 gene whose product is responsible for transcriptional activation of inmediate early promoters". 13 Nucleic Acids Research 7865-7879 (1985). Oct-1 enlaza al DNA por medio de su dominio de POU bipartita, es capaz de mostrar flexibilidad y reconocimiento de secuencia de DNA es opcional. El dominio POU de Oct-1 enlaza a la secuencia del octámero ATGCAAAT como un monómero, con el dominio de POUs que hace contacto con la mitad de 5' de este sitio (ATGC) y el dominio POUH que interactúa con la mitad 3' de este sitio (AAA.T) en los lados opuestos del DNA. Cuando Oct-1 es enlazado al sitio de enlace ATGCAAAT de alta afinidad, este es incapaz de interactuar con VP16. Oct-1 también enlaza los sitios de DNA que llevan poca semejanza al octámero consensual. Por ejemplo, Oct-1 por si mismo o en asociación con HCF y VP16 puede enlazar la secuencia de DNA TAATGARAT, que lleva tan pocos como 4 de 8 bp de igualación, al sitio consensual del octámero. Dos formas del sitio TAATGARAT son encontrados en las secuencias de promotor de los genes tempranos inmediatos del virus de herpes simple (HGV IE) . El primero, designado la porción (OC A' ) TAATGARAT, contiene un octámero sobrepuesto/secuencia "de TAATGARAT, - que enlace Oct-1 con alta afinidad. El segundo, llamada (OCTA' ) TAATGARAT, carece de una secuencia de octámero sobrepuesta y enlaza Oct-1 con relativamente baja afinidad. El POUH de Oct-1 enlaza de la secuencia 5'TAAT, mientras que el dominio POUS enlaza la secuencia GARAT en el sitio (OCTA' ) TAATGARAT. En el sitio de enlace (OCTA' ) AATGARAT, el dominio POUH permanece fijo a la secuencia TAAT, mientras que el dominio POUS puede enlazar ya sea la secuencia 5'ATGC o el elemento 3'GARAT. El dominio POUH de Oct-1 es suficiente para interactuar con VP16. El HCF es requerido para estabilidad la asociación de Oct-1 con VP16 en un sitio TAATGARAT, al primero formar un complejo estable con VP16 independiente de Oct-1 o el elemento TAATGARAT. El mecanismo exacto mediante el cual HCF estabiliza la asociación VP16 con Óct-1 es desconocido. El HCF puede inducir un cambio conformacional dentro de VP16, que ceba VP16 para interactuar con Oct-1 y el elemento GARAT del sitio TAATGARAT. Alternativamente, dentro del complejo IEC, el HCF puede poner en contacto Oct-1 o el DNA, y asi conferir más grande estabilidad al complejo.
Un oligonucleótido dsDNA marcado con fluoresceina de tipo silvestre, JD41F/42F, que contiene un sitio (OCTA- ) TAATGARAT se derivó de una región 20 bp (-343 a -324) del promotor 4/5 del gen ííSV-1. Los JD41F y JD42F de 20-mers de ssDNA marcados con 5'-fluoresceina complementario se sintetizaron, se purificaron y se templaron como antes. Secuencia para JD4VF de tipo silvestre (SEQ ID NO: 15): 5'-Flu-GGC GGT AAT GAG ATA CGA GC-3' Secuencia para JD41F de tipo silvestre (SEQ ID NO: 16): 5'-Flu-GCT-CGT ATC TCA TTA CCG CC-3' JD43F/ F de 20-mer de dsDNA mutante fue idéntico en la secuencia JD41F/42F de tipo silvestre, excepto por una mutación de doble punto (A2A3 ? CC) (subrayado) que inactivo el sitio de enlace P0UH, y una segunda mutación de doble punto ( sAg - CG) (Subrayada) que inactivó el sitio de enlace de POUs, para de esta manera convertir el sitio de enlace Oct-1 TAATGAGAT a TCCTGAGCG. Secuencia para JD 3F mutante (SEQ ID NO: 17) : 5'-Flu-GGC GGT CCT GAG CGA CGA GC-3' Secuencia para JD44F mutante (SEQ ID NO: 18: 5'-Flu-GCT CGT CGC TCA GGA CCG CC-3' Un oligonutleótido dsDNA marcado con fluoresceina de tipo silvestre, JD45F/46F, que contiene un sitio (OCTA' )TAATGARAT se derivó de una región de 23 bp (-170 a -148) del promotor 1 del gen HSV-1 IE. Los JD45F y JD46F de 23-mers ssDNA marcados con 5' -fluoresceina complementarios se sintetizaron, se purificaron y se templaron como antes. Secuencia para JD45F de tipo silvestre (SEQ ID NO:19): 5'-Flu-GTG CAT GCT AAT GAT ATT CTT TF-3' Secuencia para JD46F de tipo silvestre (SEQ ID NO: 20): 5'-Flu-CAA AGA ATA TCA TTA GCA TGC AC-3' JD47F/48F de 23-mes dsDNA mutante fue idéntico en la secuencia a JD45F/46F de tipo silvestre, excepto por una mutación de doble punto (AeA7 — CG) (subrayada) que inactivo el sitio de enlace POUH, y dos mutaciones de doble punto adicionales (AiA2 ? CG) y (Ai2Ai3. -* CG) (subrayado) que inactivo los dos sitios de enlace POUs, para de esta manera convertir el sitio de enlace OCT-1 ATGCTAATGATAT a CGGCTCCTGATCG. Secuencia para JD 7F mutante (SEQ ID NO: 21) : 5'-Flu-GTG CCG GCT CCT GAT CGT CTT TG-3' Secuencia para JD 8F mutante (SEQ ID NO: 22) : 5'-Flu-CAA AGA CGA TCA GGA GCC GGC AC-3' La mezcla de reacción de enlace Oct-l:HCF-VP16:DNA (30 µ? contuvo lo siguiente: HEPES 9.25 mM, pH 7.9, MgCl2 2.23 mM, EDTA 0.03 mM, NaCl 63 mM, DTT 1.0 mM, glicerol al 3.75% (v/v), 0.10 mg/ml de BSA, PMSF 0.01 mM, 133 g/ml de poli (di) -poli (dC) , 67 µg/ml poli (dG-dC) -poli (dG-dC) , 0-25 \xg de extracto nuclear de células HeLa (Promega) 0-0.1 µg de extracto de virión de HSV-1 y 0.025 pmol de oligonucleótido de dsDNA marcado con 5' -fluoresceína. El extracto de virión HSV-1 que contiene VP16 80% puro fue cordialmente proporcionado por el Dr. Chris Preston (MRC Institute of V-irology, Gasgow, Scotland) . los extractos nucleares, de células HeLa sirvieron como la fuente para Oct-1 y HCF. Todos los componentes excepto el DNA y el extracto de virión se incubaron a 21°C durante 10 minutos. Luego se adicionó DNA seguido por la adición de extracto de virión HSV-1 (donde es apropiado) . Las mezclas de reacción se incubaron durante 30 minutos adicionales a 21°C, se colocaron en una probeta de cuarzo y se radiaron con un haz de láser de ion argón que tiene una longitud de onda de 488 nM y se inspeccionaron para la emisión fluorescente. La proteina Oct-1, presente en 10 ]ig y 20 µg de extracto nuclear de células HeLa, específicamente unida a 0.025 pmol de JD41F/42F de tipo silvestre, que da por resultado una disminución del 10% y del 43%, respectivamente, en la intensidad fluorescente comparada con el nivel alcanzado con JD41F/42F solo (Fig. 6A) . La baja cantidad de DNA de 0.025 pmol estuvo en exceso molar de la cantidad de Oct-1 presente en el extracto nuclear de células HeLa. La observación de que 10 pg de extracto nuclear de células HeLa produjo una disminución del 22% en la intensidad fluorescente cuando Oct-1 se enlazó a 0.05 pmol de su sitio de enlace JD49F/50F de alta afinidad (en el Ejemplo 5), mientras que la misma cantidad de extracto nuclear de células HeLa dio por resultado solamente una disminución del 10% en la intensidad fluorescente cuando Oct-1 se enlazó a 0.025 pmol de su sitio de enlace JD41|F/42F de baja afinidad (que está en exceso molar a la cantidad de Oct-1 presente) , verificó la habilidad del ensayo de enlace por láser para discriminar entre los sitios de enlace de DNA de alta afinidad y baja afinidad para la misma proteina. Cuando se adicionó 0.1 ig de VP16 a la mezcla de reacción OCT-1 :JD41F/42F se observó una disminución del 20% en la intensidad fluorescente, representando una disminución adicional de 10% del nivel alcanzado a partir del complejo Oct-1 : JD41F/42F solo (Figura 6A) . Esta disminución adicional se elevó de la formación de complejo de multiproteina Oct-1:HCF:VP16:JD41F/42F, que fue capaz de absorber y retener más luz fluorescente en vida que el complejo Oct-1:JD41F/42F de proteina individual. No se observó disminución en la intensidad fluorescente cuando 10 µ? o 20 µg de extracto nuclear de células HeLa en la ausencia o en la presencia de VP16, se hicieron reaccionar con 0.025 pmol de JD43F/44F mutante, indicando ningún enlace de Oct-1 o el complejo Oct-1 :HCF:VP16 a la secuencia de DNA mutada (Fig. 6b). Estos estudios de enlace de DNA mutante confirmaron la especificidad del método de detección por láser para medir la formación del complejo de multiproteina :DNA especifico usando extractos nucleares crudos . Cuando 10 µg de extracto nuclear de células HeLa se hizo reaccionar con 0.025 pmol de JD45F/46F de tipo silvestre, ocurrió una disminución del 32% con la intensidad fluorescente, comparada con la intensidad fluorescente observada con JD45F/46F solo (Fig. 7A) . Esta disminución relativamente grande en intensidad es una función de la habilidad del Oct-1 para enlazar con alta afinidad al sitio (OCTA+) TAATGARAT- La adición de 0.1 pg de VP16 a 10 pg de extracto nuclear de células HeLa de 0.025 pmol de JD45F/46F de tipo silvestre, dio por resultado una disminución de 69% de intensidad fluorescente, representando una disminución adicional de 37% de nivel de intensidad obtenido del complejo Oct-1: JD45F/46F solo (Fig. 7A) . Puesto que Oct-1, HCF y VP16 son 110 KDa, -300 KDa y 65 KDa en tamaño, respectivamente, la disminución de 69% enorme es un resultado directo del enlace de multiproteina Oct-1 : HCF:VP16 altamente eficiente al sitio (OCTA' ) TAATGARAT presente en JD45F/46F. En contraste, ninguna disminución en la intensidad fluorescente fue observada cuando 10 g de extracto nuclear de células HeLa, en la ausencia o en la presencia de 0.1 pg de VP16 más hizo reaccionar co 0.025 pmol de JD47F/48F mutante (Fig. 7B) , claramente indicando la interrupción del enlace de DMA. a la secuencia de DNA mutada, y además probando la especificidad del ensayo de enlace por láser. Este ejemplo claramente demuestra- que el método de la invención puede reproductiblemente medir el enlace especifico de un complejo de- multiproteina (que consiste de dos o más proteínas diferentes) a uno (o más) sitios de enlace en una secuencia de DNA, cuando se usan extractos de célula nuclear crudo. Además, el ensayo de enlace por láser puede evaluar la afinidad de una proteína específica de complejo de multiproteina para cualquier secuencia de DNA dada . Como es demostrado por los Ejemplos, la invención es aplicable a todas las clases de proteína de enlace de DNA. Por ejemplo, cuando la oncoproteína c-JUN enlaza a su sitio de reconocimiento de DNA específico, se observa una disminución del 55% en unidades medibles, comparado con el nivel alcanzado por el DNA no enlazado (Figs. 1A y IB) . No se observa disminución cuando c-JUN se hace reaccionar con una secuencia de DNA mutante (Figs. 1C y ID) indicando ningún enlace y confirmando la especificidad del método de detección. Además, el enlace específico de los péptidos que contiene sólo una línea de enlace de DNA de la proteína puede ser detectado en ninguna manera cuantitativa. Por ejemplo, 20 ng, 100 ng y 200 ng de péptido c-JUN enlazado al DNA de tipo silvestre da por resultado disminuciones del 13%, 28%, 43%, respectivamente, comparado con el nivel observado para el DNA libre (Fig. 2A) . El hecho de que el enlace de solo 20 ng, 100 ng y 200 ng de péptido c-JUN puede ser confiablemente medido, demuestra la alta sensibilidad del ensayo de detección. En contrate, 20 ng, 100 ng y 200 ng de péptjdo c-JUN un enlace en el DNA imitante, dando por resu3 tado incrementos menores arriba del nivel observado con el DNA mutante solo (Fig. 2B) . El enlace de los péptidos en lugar de las proteínas de longitud completa puede ser de particular interés para diseñar y/o clasificar sustancias farmacéuticas. Las Figs . 3A y 3B ilustran el enlace de la proteína de enlace de DNA de extensión de zinc SP1 a los sitios de enlace de DNA de tipo silvestre o mutante, respectivamente. Cuando 200 ng de Spl es enlazado al DNA de tipo silvestre, se observa una disminución del 44%, comparada con el nivel de vida para el DNA solo. Ningún enlace de 200 ng de Spl es observado para la secuencia de DNA mutada. El ensayo de la invención puede diferenciar entre un complejo de anticuerpo :proteína: DNA y un complejo de proteína :DNA. Por ejemplo, una disminución del 42% y 37% de intensidad fluorescente se observó cuando 5 µg o 1 µg de anticuerpo c-JUN, respectivamente, se enlazó a 1 ]ig de c-JUN formado en complejo con el DNA de tipo silvestre, comparado con la disminución del 25% obtenida de los complejos de c-JUN.DNA (Fig. 4A) . Los complejos IgG:c-JUN no enlazan a la secuencia de DNA mutante. Las Figs. 5, 6 y 7 ilustran el enlace de la proteina de enlace de DNA de dominio POU tripartita Oct-1 a tres diferentes sitios de reconocimiento de secuencia de DNA, con diferentes afinidades de enlace. Además, los Ejemplos 5 y 6 prueban la factibilidad de usar extractos de proteina nuclear crudos como una fuente de proteínas de enlace de DNA, mientras que aún se retienen el enlace de proteína-DNA altamente específico. Dependiendo de la afinidad de enlace de cada sitio de DNA, 10 g de extractos nucleares de células HeLa enlazaron a los sitios de enlace de DNA Oct-1 de tipo silvestre con una disminución del 10%, 22% o 32%, comparados con los niveles alcanzados por el DNA no enlazado . De manera significante, el método de la invención puede medir confiablemente el enlace de complejo de multiproteína (que consiste de dos o más proteínas diferentes) a uno (o más) del enlace de DNA, si se usar proteínas puras o extractos nucleares crudos. Por ejemplo, Oct-l:HCF:VP16:DNA produjeron una disminución de 69% y 20% de intensidad fluorescente cuando se enlazaron a un sitio (OCTA^) TAATGARAT de alta afinidad o a un sitio (OCTA" ) TAATGARAT de baja afinidad, respectivamente (Figs. 7 y 6) . Ningún enlace de la proteína Oct-1 o el complejo de proteína Oct-1 :HCF:VP16 es observado para todas las secuencias de DNA mutadas . Los complejos de multi-proteina :DNA son muchos más prevalentes en --la naturaleza y biológicamente significantes que los complejos de proteina individual: DNA. La habilidad del método de la invención para emplear extractos de proteina nucleares crudos para analizar el enlace de una sola proteina o multiproteinas al DNA de una manera altamente especifica es de mayor relevancia clínica. Mientras que la invención se ha descrito en detalle y con referencia a los ejemplos específicos de la misma, será evidente para un experto en la técnica que se pueden hacer varios cambios y modificaciones en la misma sin apartarse del espíritu y alcance de la misma.

Claims (18)

  1. REI INDICACIONES 1. Un método para enlazar un ligando, el método caracterizado porque comprende: proporcionar un aptámero que comprende por lo menos dos secuencias que contienen nucleobases heteropoliméricas paralelas' -o antiparalelas unidas conjuntamente por la interacción de bases complementarias de atson-Crick o por la interacción de bases homologas, en donde: (a) el aptámero comprende un dúplex, y las dos por lo menos dos secuencias están unidas conjuntamente por la interacción de bases complementarias de aton-Crick con direccionalidad paralela; (b) el aptámero comprende un dúplex, y las por lo menos dos secuencias están unidas con untamente por la interacción de bases homólogas con la direccionalidad paralela o antiparalela; (c) el aptámero comprende un triplex y las por lo menos dos secuencias están unidas conjuntamente por la interacción de bases complementarias de Watson-Crick con direccionalidad paralela o antiparalela; (d) el aptámero comprende un triplex, y las por lo menos dos secuencias están unidas conjuntamente por la interacción de bases homólogas con direccionalidad paralela o antiparalela; (c) el aptámero comprende un cuadrúplex y las por lo menos dos secuencias están unidas conjuntamente por la interacción de bases complementarias de Watson-Crick con direccionalidad paralela o antiparalela; o (f) el aptámero comprende un cuadrúplex, y las por lo menos dos secuencias están unidas conjuntamente por la interacción de bases homologas con direccionalidad paralela o antiparalela/ y poner en contacto el aptámero con el ligando para enlazar el ligando al aptámero mediante la interacción diferente por el emparejamiento de bases de Watson-Crick de nucleobase a nucleobsse.
  2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la provisión comprende colocar el aptámero en solución, sobre un soporte sólido, in vitro, in vivo o in sílico.
  3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la provisión comprende administrar el aptámero a un organismo.
  4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el aptámero es administrado en una cantidad efectiva para alterar una actividad biológica del ligando .
  5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el aptámero es marcado y es administrado en una cantidad efectiva para detectar el ligando o el ligando y un segundo ligando enlazado al ligando .
  6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la provisión comprende colocar el aptámero en un medio de prueba, y se detecta una presencia o una ausencia del ligando en el medio de prueba.
  7. 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el aptámero comprende un dúplex, y las por lo menos dos secuencias están unidas co juntamente por la interacción de bases complementarias de Watson-Crick co -direccionalidad paralela.
  8. 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el aptámero comprende un dúplex, y las por lo menos dos secuencias están unidas conjuntamente por la interacción de bases homologas con direccionalidad paralela o antiparalela.
  9. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el aptámero comprende un triplex, y las por lo menos dos secuencias están unidas conjuntamente por la interacción de bases complementarias de Watson-Crick con direccionalidad paralela o antiparalela .
  10. 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el aptámero comprende un triplex, y las por lo menos dos secuencias están unidas con untamente por la interacción de bases homólogas con direccionalidad paralela o antiparalela.
  11. 11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el aptámero comprende un cuádruplex, y las por lo menos dos secuencias están unidas conjuntamente por la interacción de bases complementarias de Watson-Crick con direccionalidad paralela o antiparalela.
  12. 12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el aptámero comprende un cuádruplex, y las por lo menos dos secuencias están unidas conjuntamente por la interacción de bases homologas - con direccionalidad paralela o antiparalela.
  13. 13. El método de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el ligando comprende una proteina o péptido.
  14. 14. El método de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el ligando está libre de nucleobases.
  15. 15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque algunas nucleobases en las por lo menos dos secuencias no están emparejadas.
  16. 16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y 15, caracterizado porque las por lo menos dos secuencias están contenidas en por lo menos dos hebras de ácido nucleico que están reticuladas.
  17. 17. El método de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el aptámero es una aptazima y el método además comprende catalizar una reacción que implica el ligando.
  18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el ligando contiene por lo menos una de una secuencia de aminoácidos, una secuencia de ácido nucleico, un carbohidrato y un lipido.
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