JP2010207181A - ジンクフィンガーを用いた新規標識方法及び被検物質の測定方法 - Google Patents
ジンクフィンガーを用いた新規標識方法及び被検物質の測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010207181A JP2010207181A JP2009059430A JP2009059430A JP2010207181A JP 2010207181 A JP2010207181 A JP 2010207181A JP 2009059430 A JP2009059430 A JP 2009059430A JP 2009059430 A JP2009059430 A JP 2009059430A JP 2010207181 A JP2010207181 A JP 2010207181A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- labeling
- aptamer
- zinc finger
- test substance
- substance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】本発明のポリヌクレオチドの標識方法は、ジンクフィンガー領域を有する標識物質と、該ジンクフィンガー領域の認識部位を有するポリヌクレオチドとを接触させることにより、ジンクフィンガー領域とその認識部位との間の結合を介してポリヌクレオチドに標識物質を結合させることを含む。被検物質測定方法では、ジンクフィンガー領域の認識部位を含み被検物質に特異的に結合するポリヌクレオチドを用いる。該ポリヌクレオチドに標識物質と被検物質が結合して形成された複合体を分離し、該複合体中の標識物質からのシグナルを測定することにより、被検物質を測定できる。
【選択図】図1
Description
5'-ccccgcccc-3'
3'-ggggcgggg-5'
(1) アプタマーの構築
3つのジンクフィンガーを有し2本鎖DNAに対して塩基配列特異的に認識して結合する調節因子Sp1とルシフェラーゼとを融合したLuc-Sp1を用いてトロンビンをサンドイッチ形式で検出するためにトロンビンアプタマーを設計した。トロンビンをビーズに固定するためのアプタマーとして、トロンビンのフィブリノーゲン結合部位に結合する15 merのアプタマー(Bock L.C. et al., Nature, 1992, vol.355, pp.564-566、配列番号7)を用い、このアプタマーの5'末端側に3つのチミン残基を付加し、末端をビオチン修飾した(TA15(immobilize))。一方、トロンビンを検出するためのアプタマーとして、ヘパリン結合部位に結合する29 merのアプタマー(Diane M. Tasset et al., J.Mol.Bio., 1997, vol.272, pp.688-698、配列番号8)を用いた。5'末端、および3'末端から4塩基が相補鎖を形成しているので、この相補鎖に3塩基のスペーサーを介してSp1認識配列を付加し、末端に3塩基のスペーサーを加え、5'末端側にFITCを修飾した(TA29(detect))。また、コントロールとして、Sp1認識配列の代わりにランダム配列を付加したものを同様に作製した(TA29(control))。
Sp1のジンクフィンガーとルシフェラーゼとを融合したLuc-Sp1は、以下の方法により調製した。
Sp1構造遺伝子中のジンクフィンガー領域(配列番号2中のaa619-712、配列番号1中の1952〜2233nt)を増幅できるプライマー(配列番号12及び13、配列番号1中の1932〜2234ntを増幅)を用い、市販のヒトリンパ腺cDNAライブラリーからSp1のジンクフィンガーコード領域(303 bp)を増幅した。電気泳動によりPCR産物の大きさを確認し、目的の大きさの遺伝子断片を切り出し、精製した。そのサンプルを用いてpGEM-TベクターにTAクローニングし、DH5αを形質転換後、LBプレート(Amp 50μg/ml, IPTG 0.1 mM, X-gal 50μg/ml)上で培養した。得られた白色コロニーに対しコロニーPCRを行い、電気泳動によりinsertの確認を行った。Insertが確認できたサンプルについてシークエンス解析を行った。配列が確認できたpGEM-Sp1ベクターから、制限酵素サイト(SmaI、EcoRI)をデザインしたプライマー(配列番号14及び15)を用い、Sp1遺伝子断片(302 bp、配列番号1中の1952〜2233ntを含む)を増幅した。PCR産物を電気泳動により切り出し、pGEM-Tベクターに再度TAクローニングした。DH5αに形質転換し、LBプレート(Amp 100μM, IPTG 0.1 mM, X-gal 50μg/ml)上で培養した。得られた白色コロニーに対しコロニーPCRを行い、電気泳動によりinsertの確認を行った。Insertが確認できたサンプルについてシークエンスを確認した。制限酵素サイトが導入されたpGEM-Sp1(SmaI & EcoRI)及びpGEX-2TベクターをSmaI、EcoRIにより制限酵素処理した。それらを電気泳動後、Sp1遺伝子断片及びpGEX-2Tベクター断片をそれぞれ切り出し、精製した。これらを16℃で1 hライゲーション後、DH5αを形質転換し、プレート(50μg/ml Amp)上で培養した。得られたシングルコロニーからプラスミドを抽出後、SmaI、EcoRIにより制限酵素処理し、電気泳動によりinsertの確認を行った。Insertの確認が出来たサンプル(pGEX/Sp1)のシークエンスを確認した。
市販のOvernight Express(商標) Autoinduction System(メルク)を添付の説明書に従い使用した。上記で構築したpGEX/sp1-lucを用いて大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、150 mlのLB培地(Amp 50μg/ml、90μM ZnCl2、所定濃度のOnEx sol.1〜3、pH 7.3)中でOvernight Express(商標) Autoinduction Systemで20℃、24 h培養することにより、GST融合ジンクフィンガールシフェラーゼを発現させた。
GST融合ジンクフィンガールシフェラーゼが発現していると思われる湿菌体をCell lysis buffer(1% Triton X-100, 4 mM Pefabloc, 90μM ZnCl2, 5 mM DTT in PBS, pH 7.3)で懸濁し、フレンチプレスにより破砕した。破砕液を遠心分離(20,000 g、4℃、30 min)し、上清を回収した。得られた上清をBinding buffer(5 mM DTT, 90μM ZnCl2 in PBS, pH 7.3)で平衡化したGSTrap HFカラム(1 ml)に添加した(流速0.5 ml/min)。次に、5倍量のWash buffer(1% Triton X-100, 5 mM DTT, 90μM ZnCl2 in PBS, pH 7.3)で洗浄し、その後、5倍量のBinding bufferでリンスした(流速0.5 ml/min)。最後に、Elution buffer(5 mM DTT, 1 mM Pefabloc, 90μM ZnCl2, 10 mM Reduced glutathione, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0)を添加し(流速1.5 ml/min)、溶出画分を回収した。得られた溶出画分の蛋白質濃度をDC protein assay kit(Bio-Rad)を用いてLowry法により測定した。また、ルシフェラーゼの基質溶液であるPicaGene(東洋インキ)を用い、活性測定を行った。SDS-PAGEでシングルバンドが見られ、かつ、最も活性の高い溶出画分を用いて以下の実験を行なった。
上記で設計したアプタマーを用いて、ビーズに固定化したアプタマーに先にトロンビンを結合させる方法(方法A)と、ジンクフィンガータンパク質を介してルシフェラーゼ標識したアプタマーに先にトロンビンを結合させる方法(方法B)の2通りの方法を検討した。
Buffer 1 (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 90μM ZnCl2, pH 7.0)中でNeutrAvidinビーズ(PIERCE)とビオチン修飾TA15(immobilize) (f.c. 200 nM)をインキュベートし、TA15(immobilize)をビーズに固定した。このビーズを洗浄した後、Buffer 2 (4%(w/v)スキムミルク、1 mM d-biotin、0.05%(v/v)tween 20 in Buffer 1)でビーズをブロッキングした。その後、Buffer 2中でビーズとトロンビン(f.c. 0, 50, 又は100 nM)をインキュベートした(1)。
Buffer 1中でNeutrAvidinビーズ(PIERCE)とビオチン修飾TA15(immobilize) (f.c. 200 nM)をインキュベートし、TA15(immobilize)をビーズに固定した。このビーズを洗浄した後、Buffer 2 (4%(w/v)スキムミルク、1 mM d-biotin、0.05%(v/v)tween 20 in Buffer 1)でビーズをブロッキングした(1)。
方法A、Bどちらを用いた場合にも、トロンビンの濃度依存的にFITCの蛍光強度の増加が観察された。方法AとBではBの方が、蛍光強度が大きいことが示された(図2、Sample 1〜3)。このことから、方法Bの方がサンドイッチが形成される割合が高いことが考えられる。
Claims (15)
- ジンクフィンガー領域を有する標識物質と、該ジンクフィンガー領域の認識部位を有するポリヌクレオチドとを接触させることにより、ジンクフィンガー領域とその認識部位との間の結合を介してポリヌクレオチドに標識物質を結合させることを含む、ポリヌクレオチドの標識方法。
- 前記標識物質が標識タンパク質であり、前記ジンクフィンガー領域を有する標識物質がジンクフィンガータンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質である請求項1記載の標識方法。
- 前記標識タンパク質が蛍光タンパク質又は酵素である請求項2記載の標識方法。
- 前記ポリヌクレオチドがプライマー、プローブ又は所望の標的分子に特異的に結合するアプタマーである請求項1ないし3のいずれか1項に記載の標識方法。
- ジンクフィンガー領域を有する標識物質を含むポリヌクレオチドの標識試薬。
- 前記標識物質が標識タンパク質であり、前記ジンクフィンガー領域を有する標識物質がジンクフィンガータンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質である請求項5記載の標識試薬。
- 前記標識タンパク質が蛍光タンパク質又は酵素である請求項6記載の標識試薬。
- 被検物質を含み得る試料と、請求項5ないし7のいずれか1項に記載の標識試薬と、該標識試薬中に含まれる前記ジンクフィンガー領域の認識部位を含み前記被検物質に特異的に結合するポリヌクレオチドとを同時又は逐次的に接触させ、次いで、標識物質とポリヌクレオチドと被検物質とを含む複合体を分離後、該複合体中の標識物質からのシグナルを測定し、該シグナルを指標として被検物質を測定することを含む、試料中の被検物質の測定方法。
- 前記ポリヌクレオチドがプローブ、プライマー又は被検物質結合性アプタマーである請求項8記載の測定方法。
- 前記ポリヌクレオチドが被検物質結合性アプタマーである請求項9記載の測定方法。
- 固相上に固定化されたアプタマーであって、前記被検物質結合性アプタマーとは異なる部位において前記被検物質と特異的に結合する固相アプタマーを、前記試料、前記標識試薬及び前記被検物質結合性アプタマーと同時又は逐次的に接触させ、次いで、固相を洗浄することにより前記複合体を分離する請求項10記載の測定方法。
- 前記試料と前記標識試薬と前記被検物質結合性アプタマーとを同時又は逐次的に接触させ、次いで、前記固相アプタマーを接触させる請求項11記載の測定方法。
- 請求項5ないし7のいずれか1項に記載の標識試薬と、該標識試薬中に含まれる前記ジンクフィンガー領域の認識部位を含むアプタマーであって測定すべき被検物質に特異的に結合する被検物質結合性アプタマーとを含む、被検物質の測定キット。
- 前記被検物質結合性アプタマーとは異なる部位において前記被検物質に特異的に結合する第2のアプタマーをさらに含む、請求項13記載の測定キット。
- 前記第2のアプタマーが固相に固定化されている請求項14記載の測定キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009059430A JP5626673B2 (ja) | 2009-03-12 | 2009-03-12 | ジンクフィンガーを用いた新規標識方法及び被検物質の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009059430A JP5626673B2 (ja) | 2009-03-12 | 2009-03-12 | ジンクフィンガーを用いた新規標識方法及び被検物質の測定方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010207181A true JP2010207181A (ja) | 2010-09-24 |
JP5626673B2 JP5626673B2 (ja) | 2014-11-19 |
Family
ID=42968074
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009059430A Active JP5626673B2 (ja) | 2009-03-12 | 2009-03-12 | ジンクフィンガーを用いた新規標識方法及び被検物質の測定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5626673B2 (ja) |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001103975A (ja) * | 1999-10-08 | 2001-04-17 | Agency Of Ind Science & Technol | モジュレートアプタマー及びこれを用いた標的タンパク質の検出方法 |
JP2004511210A (ja) * | 2000-05-23 | 2004-04-15 | バリアジェニックス インコーポレーテッド | 配列変動を検出する、dnaを遺伝分析するための方法 |
JP2005052061A (ja) * | 2003-08-04 | 2005-03-03 | Nokodai Tlo Kk | ジンクフィンガー蛋白質を用いる標的核酸の検出方法 |
JP2008092948A (ja) * | 2006-09-12 | 2008-04-24 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | 検体中の標的核酸を検出するためのキットおよび方法 |
WO2008075520A1 (ja) * | 2006-12-18 | 2008-06-26 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | マイコバクテリウム・アビウム検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・アビウムの検出方法 |
JP2008259496A (ja) * | 2007-03-14 | 2008-10-30 | Korea Inst Of Science & Technology | Dnaアプタマーを用いて標的タンパク質を検出する方法及びキット |
JP2009505106A (ja) * | 2005-08-19 | 2009-02-05 | ナノスフェアー インコーポレイテッド | Dna及び抗体を含むハイブリッド基板を調製するための方法及びその使用 |
-
2009
- 2009-03-12 JP JP2009059430A patent/JP5626673B2/ja active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001103975A (ja) * | 1999-10-08 | 2001-04-17 | Agency Of Ind Science & Technol | モジュレートアプタマー及びこれを用いた標的タンパク質の検出方法 |
JP2004511210A (ja) * | 2000-05-23 | 2004-04-15 | バリアジェニックス インコーポレーテッド | 配列変動を検出する、dnaを遺伝分析するための方法 |
JP2005052061A (ja) * | 2003-08-04 | 2005-03-03 | Nokodai Tlo Kk | ジンクフィンガー蛋白質を用いる標的核酸の検出方法 |
JP2009505106A (ja) * | 2005-08-19 | 2009-02-05 | ナノスフェアー インコーポレイテッド | Dna及び抗体を含むハイブリッド基板を調製するための方法及びその使用 |
JP2008092948A (ja) * | 2006-09-12 | 2008-04-24 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | 検体中の標的核酸を検出するためのキットおよび方法 |
WO2008075520A1 (ja) * | 2006-12-18 | 2008-06-26 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | マイコバクテリウム・アビウム検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・アビウムの検出方法 |
JP2008259496A (ja) * | 2007-03-14 | 2008-10-30 | Korea Inst Of Science & Technology | Dnaアプタマーを用いて標的タンパク質を検出する方法及びキット |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6013058417; 2008年光化学討論会 講演要旨集 Vol.2008, 2008, p.203 * |
JPN6013058419; 第8回バイオテクノロジー部会シンポジウム講演要旨集 , 20041015, 第60頁, P-44 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP5626673B2 (ja) | 2014-11-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Mascini et al. | Nucleic acid and peptide aptamers: fundamentals and bioanalytical aspects | |
Ilgu et al. | Aptamers in analytics | |
Hesselberth et al. | In vitro selection of nucleic acids for diagnostic applications | |
Liu et al. | Functional nucleic acid sensors | |
Ikebukuro et al. | Novel electrochemical sensor system for protein using the aptamers in sandwich manner | |
Hamula et al. | Selection and analytical applications of aptamers | |
Iliuk et al. | Aptamer in bioanalytical applications | |
Hianik et al. | Electrochemical aptasensors–recent achievements and perspectives | |
US20080293051A1 (en) | proximity ligation assay | |
Zhang et al. | Binding-induced DNA assembly and its application to yoctomole detection of proteins | |
Liu et al. | The current and future role of aptamers in electroanalysis | |
JP5596903B2 (ja) | インスリン結合性アプタマー | |
Yang et al. | Aptamers 101: aptamer discovery and in vitro applications in biosensors and separations | |
Thomas et al. | Analyte-driven switching of DNA charge transport: de novo creation of electronic sensors for an early lung cancer biomarker | |
Liu et al. | A label-free sensitive method for membrane protein detection based on aptamer and AgNCs transfer | |
Liu et al. | Microbead-based platform for multiplex detection of DNA and protein | |
Guo et al. | Thrombin-linked aptamer assay for detection of platelet derived growth factor BB on magnetic beads in a sandwich format | |
Liao et al. | Aptamer-based sensitive detection of target molecules via RT-PCR signal amplification | |
JP6041408B2 (ja) | 核酸素子候補分子、および、これを用いたターゲット分析用核酸素子のスクリーニング方法 | |
Song et al. | Label-free visual detection of nucleic acids in biological samples with single-base mismatch detection capability | |
Guo et al. | Determination of the platelet-derived growth factor BB by a competitive thrombin-linked aptamer-based Fluorometric assay | |
Němcová et al. | Electrochemical detection of DNA binding by tumor suppressor p53 protein using osmium-labeled oligonucleotide probes and catalytic hydrogen evolution at the mercury electrode | |
KR100828936B1 (ko) | 단일가닥핵산 압타머와 금-나노입자를 이용한 생체분자분석방법 | |
Banu et al. | Prospects for the application of aptamer based assay platforms in pathogen detection | |
MXPA04002766A (es) | APT??MEROS QUE CONTIENEN SECUENCIAS DE áCIDOS NUCLEICOS O ANáLOGOS DE áCIDOS NUCLEICOS UNIDOS HOMOLOGAMENTE, O EN COMPLEJOS NUEVOS. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120309 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120315 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20131203 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140203 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140902 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140919 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5626673 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |