ES2665906T3 - Método para identificar materiales odorantes de pachulí - Google Patents
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Abstract
Un método para identificar un material odorante de pachulí candidato, que comprende las etapas de: 1) poner en contacto una muestra que expresa el receptor OR11A1 con un compuesto de prueba, y 2) medir la actividad del receptor OR11A1 mediante un método que comprende: i) medir la respuesta del receptor OR11A1 al compuesto de prueba y la respuesta del receptor OR11A1 al tampón de ensayo (nivel de referencia), y calcular un primer factor de cambio (FOC1: respuesta de OR11A1 al compuesto de prueba/respuesta de OR11A1 al nivel de referencia); ii) medir la respuesta de una muestra de control que no expresa el receptor OR11A1 al compuesto de prueba y la respuesta de la muestra de control que no expresa el receptor OR11A1 al tampón de ensayo (nivel de referencia) y calcular un segundo factor de cambio (FOC2: respuesta de la muestra de control al compuesto de prueba/respuesta de la muestra de control al nivel de referencia); en el que el compuesto de prueba se identifica como un material odorante de pachulí candidato si la relación de FOC1 a FOC2 es mayor que 1.
Description
5
15
25
35
45
55
65
a) identificar un material odorante de pachulí candidato por el método descrito anteriormente; y b2) someter el candidato identificado a una prueba olfativa.
La prueba olfativa comprende comparar una muestra que contiene aceite de pachulí, preferiblemente una muestra que contiene solo aceite de pachulí, con una muestra que contiene aceite de pachulí y el candidato identificado, preferiblemente una muestra que contiene aceite de pachulí, el candidato identificado y un disolvente. El candidato identificado pasa la prueba si no hay diferencia sensorial perceptible entre las dos muestras, esta diferencia se evalúa mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica de la perfumería. En una realización, la prueba olfativa se lleva a cabo siguiendo el método de prueba estándar para análisis sensorial (prueba triangular) tal como se define en la norma ASTM (American Society for Testing and Materials) E 1885 -97 (edición aprobada el 10 de julio de 1997; publicada en agosto de 1998). Este método de prueba cubre un procedimiento para determinar si existe una diferencia sensorial perceptible entre muestras de dos productos. En el protocolo de la prueba olfativa, se realiza una comparación entre dos muestras solamente, a saber, una muestra que contiene 100 % en peso de aceite de pachulí y una muestra que contiene 50 % en peso de aceite de pachulí + x % en peso del “candidato” + (100-50x) % en peso de disolvente (generalmente dipropilenglicol, DPG). Un material candidato pasa la prueba si no hay diferencia sensorial perceptible entre las dos muestras en la prueba triangular como se define en la norma mencionada anteriormente. El material candidato que pasa la prueba olfativa es por lo tanto adecuado como sustituyente del olor característico de pachulí, y puede formularse en una composición de fragancia. El experto apreciará que la cantidad (x % en peso) de material candidato a usar depende de la concentración olfativa de ese material.
En otro aspecto, la identificación de un material odorante de pachulí adecuado como un sustituto de aceite de pachulí se lleva a cabo mediante un método que comprende las etapas de o consiste en:
a) identificar un material odorante de pachulí candidato por el método descrito anteriormente; b1) someter el candidato identificado a una prueba de persistencia; b2) someter el candidato identificado a una prueba olfativa; siendo dicha prueba de persistencia y la prueba olfativa como se han definido anteriormente.
En una realización, las etapas de este método se llevan a cabo en el siguiente orden: a), b1), b2).
En otra realización, las etapas de este método se llevan a cabo en el siguiente orden: a), b2), b1).
En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de una muestra que expresa el receptor OR11A1 para identificar un material odorante de pachulí candidato después del aumento de la actividad de dicho receptor por dicho material.
Todas las realizaciones preferidas mencionadas anteriormente con respecto al método de identificación de un material odorante de pachulí son también realizaciones preferidas del uso de acuerdo con la presente invención.
La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitativos y los dibujos adjuntos, en los que:
Las Figuras 1A y 1B muestran las respuestas de cada uno de los 65 receptores olfativos analizados frente a la concentración 10 μM de isoproterenol o androstenona (A) y a las concentraciones 10 μM, 30 μM y 100 μM de aceite de pachulí (B).
La Figura 2 representa un dendrograma de la subfamilia OR11A1.
Las Figuras 3A a 3C muestran las respuestas dependientes de la concentración de OR11A1 y OR11L1 después de la estimulación con aceite de pachulí (A) y R2335 (B) o la comparación directa de las respuestas de OR11A1 frente al aceite de pachulí y R2335 (C).
La Figura 4 muestra las respuestas de los receptores relacionados con OR11A1 frente a los odorantes (corte en el eje y en 2) alcohol de pachulí y pacho 315. La Figura 5 muestra las respuestas de OR11A1 frente a los odorantes pacho 315, alcohol de pachulí, terranol, andrano, pogostona y alcohol de norpachulí. La Figura 6 muestra las respuestas dependientes de la concentración de OR11A1 después de la estimulación
con los odorantes pogostona, alcohol de norpachulí, alcohol de pachulí y pacho 315. Las Figuras 7A y 7B muestran el análisis de persistencia del alcohol de pachulí. La Figura 8 muestra el análisis de persistencia de pogostona.
Ejemplos
Los experimentos se realizaron usando una línea celular HEK293 (depositada en la ATCC con N.º de acceso CRL1573) que expresaba establemente la proteína G Gαolf y la subunidad A2 del canal iónico regulado por nucleótidos cíclicos (CNGA2) (denominada en la presente memoria HEKOlf). Como se describe por Shirokova et al., 2005, el
ADNc de la Gαolf humana se clonó en el vector de expresión de mamíferos pPuro y se clonó el ADNc de la subunidad A2 del canal iónico regulado por nucleótidos cíclicos (CNGA2) en el vector de expresión de mamíferos pcDNA3. Ambas construcciones se transfectaron usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se obtuvieron clones celulares que expresan establemente Gαolf y CNGA2 por selección de
5 antibióticos con puromicina 0,5 μg/ml y geneticina 200 μg/ml.
La línea celular HEKOlf se mantuvo en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Euroclone) complementado con 10 % de FBS (suero fetal bovino, Euroclone cat. ECS0180L), penicilina/estreptomicina 1 % (Euroclone cat. B3001D), G418 50 μg/ml, higromicina 25 μg/ml y blasticidina 2,5 μg/ml, puromicina 0,5 μg/ml y zeocina 3 μg/ml.
10 Las condiciones de propagación estándar consisten en sembrar 1,5 -1,8x106 células en un matraz T75 dos veces por semana, recuperándose aproximadamente 10-15x106 células con ~ 80 % de confluencia.
15 El ADNc de los receptores olfativos humanos se obtuvo por PCR a partir de ADN genómico humano (Clonetech), y se clonó en el marco 3' de un epítopo de localización transmembrana en un vector de expresión pcDNA5 (Bufe et al., 2002). La identidad correcta de cada receptor olfativo individual se verificó por secuenciación automática.
20 La correspondencia entre los nombres de los receptores olfativos como se usa en la presente memoria y en las figuras y los respectivos números de acceso de GeneBank se describen en la Tabla 1 a continuación:
Tabla 1
- Receptor
- N.º Acceso en GeneBank Nombre
- OR6A2
- NM_003696 OR1
- OR6Q1
- NM_001005186 OR2
- OR6C68
- NM_001005519 OR3
- OR6F1
- NM_001005286 OR4
- OR6X1
- NM_001005188 OR5
- OR6N2
- NM_001005278 OR6
- OR7A10
- NM_001005190 OR7
- OR7E24
- BK004227 OR8
- OR7D4
- NM_001005191.2 OR9
- OR8K5
- NM_001004058 OR10
- OR8A1
- NM_001005194 OR11
- OR8B4
- NM_001005196 OR12
- OR9G1
- NM_001005213 OR13
- OR9K2
- NM_001005243 OR14
- OR10A5
- NM_178168 OR15
- OR10V1
- NM_001005324 OR16
- OR10G2
- NM_001005466 OR17
- OR10G8
- NM_001004464 OR18
- OR11A1
- BK004208.1 OR19
- OR11L1
- NM_001001959.1 OR20
- OR12D2
- NM_013936 OR21
- OR12D3
- NM_030959 OR22
- OR13C2
- NM_001004481 OR23
- OR13C3
- NM_001001961 OR24
- OR13C4
- NM_001001919 OR25
- OR13C5
- NM_001004482 OR26
- OR13C8
- NM_001004483 OR27
- OR13C9
- NM_001001956 OR28
- OR14A16
- NM_001001966 OR29
- OR14I1
- NM_001004734 OR30
- OR1A1
- NM_014565 OR31
- OR1D2
- NM_002548 OR32
- OR1L1
- NM_001005236 OR33
- OR1Q1
- NM_012364 OR34
- OR2A1
- NM_001005287 OR35
- OR2A7
- NM_001005328 OR36
- OR2B11
- NM_001004492 OR37
- OR2F2
- NM_001004685 OR38
- OR2J3
- NM_001005216 OR39
- OR2AE1
- NM_001005276 OR40
- OR2Z1
- NM_001004699 OR41
- OR2T1
- NM_030904 OR42
- OR2T34
- NM_001001821 OR43
- OR2AJ1
- AB065626 OR44
- OR2AG2
- NM_001004490 OR45
- OR2AP1
- AB065868 OR46
- OR2AT4
- NM_001005285 OR47
- OR2S2
- NM_019897 OR48
- OR3A1
- NM_002550 OR49
- OR3A4
- NM_001005334 OR50
- OR4A15
- NM_001005275 OR51
- OR4S1
- NM_001004725 OR52
- OR4D1
- NM_012374 OR53
- OR4Q3
- NM_172194 OR54
- OR4F15
- NM_001001674 OR55
- OR4E2
- NM_001001912 OR56
- OR5AP2
- NM_001002925 OR57
- OR5I1
- NM_006637 OR58
- OR5AC2
- NM_054106 OR59
- OR5K4
- NM_001005517 OR60
- OR5A1
- NM_001004728 OR61
- OR5AK2
- NM_001005323 OR62
- OR5D13
- NM_001001967 OR63
- OR5J2
- NM_001005492 OR64
- OR5M1
- NM_001004740 OR65
- pcDNA5
- vector vacío
- OR7D4
- NM_001005191 receptor control positivo
- hTAS2R16
- NM_016945 receptor control negativo
Todos los odorantes se almacenaron en la oscuridad a 4 °C hasta el momento de su utilización. Se prepararon en
5 soluciones madre 100 mM usando DMSO como disolvente y se almacenaron a -20 °C. El día del experimento, las diferentes soluciones madre se diluyeron directamente en el tampón de ensayo (tampón de Tyrode) que tenía la siguiente composición: KCl 5 mM, NaCl 130 mM, CaCl2 2 mM, NaHCO3 5 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 20 mM, pH 7,4. Los odorantes se usaron en las concentraciones indicadas en las tablas 2-4 a continuación.
Los experimentos se realizaron usando FLIPRTETRA (Molecular Devices). Las células se transfectaron y se sembraron en placas de ensayo negras de poliestireno de 384 pocillos, fondo negro/transparente (MATRIX Nº Artículo CPL-4332).
15
amargo humano TAS2R16 (Bufe et al., 2002) sirvió como un control negativo adicional.
La aplicación de 10 μM de isoproterenol condujo a señales detectables en todas las células transfectadas, lo que corroboró la vitalidad celular y la funcionalidad correcta de la cascada de señalización. Además, la androstenona 10 5 μM activó intensamente el OR7D4, mientras que los 65 receptores olfativos ensayados, incluido el receptor de control negativo (hTAS2R16), no respondieron a este compuesto.
El cribado de los odorantes frente al conjunto de 65 receptores olfativos humanos (OR) identificó que OR11A1 es específicamente sensible al aceite de pachulí. Ningún otro OR humano respondió a este odorante. Además, todas
10 las concentraciones probadas activaron este receptor. Las Figuras 1A y 1B muestran las respuestas del OR ensayado a isoproterenol, androstenona y a tres concentraciones de aceite esencial de pachulí.
Ejemplo 2: Caracterización del receptor olfativo humano identificado para el aceite de pachulí
15 Para determinar la potencia y la eficacia del aceite de pachulí, las células HEKOlf se transfectaron con el ADNc del OR11A1 (SEC ID Nº: 1). Adicionalmente, las células también se transfectaron con el ADNc de OR11L1 de la secuencia SEC ID N.º: 3, un receptor olfativo humano que pertenece a la misma subfamilia que OR11A1.
20 La Figura 2 representa un dendrograma de la subfamilia OR11A1.
Las células transfectadas con los ADNc de OR11A1 y OR11L1 se estimularon después con concentraciones crecientes (0,1 μM/0,3 μM/1 μM/3 μM/10 μM/30 μM/60 μM/100 μM) de aceite de pachulí (Takasago, peso molecular:
25 500) y una fracción de aceite de pachulí enriquecida en alcohol de pachulí, denominado R2335, disponible comercialmente y proporcionado por Robertet con la referencia “Patchouli Heart” o “Patchouli Coeur”.
Las células transfectadas con OR11A1 respondieron al aceite de pachulí y R2335 de una manera dependiente de la concentración (figura 3C). Curiosamente, ninguno de los compuestos pudo activar OR11L1, un OR humano que 30 pertenece a la misma subfamilia de 8 receptores (figuras 3A y 3B). R2335 tenía una potencia ligeramente mayor sobre OR11A1 (EC50 3,3 ± 0,8 mM) que el aceite de pachulí (EC50 7,6 ± 0,6 mM). Notablemente, la aplicación de ambos odorantes en concentraciones superiores a 30 μM condujo a una fuerte reducción de la señal, presumiblemente debido a interacciones tóxicas inespecíficas de ambos compuestos con las células. En conjunto,
estos resultados muestran que OR11A1 responde específicamente a los odorantes de pachulí.
Ejemplo 3: Respuesta de receptores relacionados con OR11A1 frente a diferentes odorantes
5 Para investigar la respuesta de los receptores relacionados con OR11A1 frente a diferentes odorantes (alcohol de pachulí (peso molecular (MW) 222) y pacho 315 (MW 220), la estructura de este último se muestra a continuación), las células fueron transfectadas transitoriamente con ADN plasmídico de siete receptores relacionados con OR11A1 que pertenecen a un pequeño subconjunto de receptores relacionados estructuralmente (ver figura 2) y un plásmido de control que sirvió como control negativo.
10 Los diferentes odorantes probados en receptores relacionados con OR11A1 y OR11L1 son como se menciona en la Tabla 3:
Tabla 3
- Compuesto
- Concentraciones utilizadas (μM)
- Alcohol de pachulí
- 10/30/100
- Pacho 315*
- 10/30/100
* 6a, 7,7-trimetildecahidro-1,4-metanociclopropa[de]naftalen-1-ol (Fórmula química: C14H22O; masa exacta: 206,17), divulgado en solicitudes de patente japonesa N.º 2012-103867 y N.º 2012-103868.
20 Veinticuatro horas después de la transfección, las células se estimularon con tres concentraciones diferentes de los odorantes como se menciona anteriormente.
Los resultados se muestran en la Figura 4. Como se observó en experimentos previos, pacho 315 y el alcohol de
25 pachulí activaron fuertemente OR11A1 pero no pudieron provocar una respuesta detectable en células transfectadas con OR11L1. Además, ninguno de los otros siete receptores olfativos relacionados con OR11A1 respondieron a los odorantes probados (figura 4, factor de cambio alrededor de 1).
Una posible explicación para esto podría ser la identidad de aminoácidos relativamente baja de los siete receptores 30 olfativos relacionados con OR11A1 en comparación con OR11A1, que no es superior al 46 %.
Para investigar la respuesta del receptor OR11A1 frente a diferentes odorantes (alcohol de pachulí, pacho 315,
35 terranol (N.º CAS 57566-26-4, MW 222), andrano (N.º CAS 13567-39-0, MW 220), pogostona (N.º CAS 23800-56-8, MW 224), alcohol norpachulí, MW 206), las células HEKOlf se transfectaron transitoriamente con el ADN del plásmido para el receptor OR11A1 como se describió anteriormente.
Los diferentes odorantes probados en el receptor OR11A1 son como se menciona en la Tabla 4: 40
Tabla 4
- Compuesto
- Concentraciones utilizadas (μM)
- Alcohol de pachulí
- 0,03/0,1/0,3/1/3/6/10/30/100
- Pacho 315
- 0,03/0,1/0,3/1/3/6/10/30/100
- Terranol
- 3/10/30
- Andrano
- 3/10/30
- Pogostona
- 0,03/0,1/0,3/1/3/6/10/30/100
- Alcohol de norpachulí
- 0,03/0,1/0,3/1/3/6/10/30/100
Los resultados obtenidos con concentraciones de prueba de 3, 10 y 30 μM se muestran en la Figura 5. 12
5
15
25
35
45
55
Como se observó en experimentos previos, pacho 315 activó fuertemente OR11A1. Además, el alcohol de pachulí también activó OR11A1. Esto confirma nuevamente la actividad de estos dos odorantes de pachulí sobre OR11A1. De los cuatro odorantes recién probados, solo el alcohol de pogostona y el alcohol de norpachulí pudieron provocar la activación en células transfectadas con OR11A1. El terranol y el andrano no activaron OR11A1 hasta 100 μM. Las células que se transfectaron con el plásmido de control no respondieron a ninguno de los odorantes probados (no mostrados).
Se probaron adicionalmente cuatro odorantes relacionados con el pachulí diferentes como se describió anteriormente para determinar su capacidad de activar OR11A1, el receptor identificado que responde específicamente a los odorantes de pachulí.
Los resultados obtenidos con concentraciones mayores de pacho 315, alcohol de pachulí, alcohol de norpachulí y pogostona desde 0,1 hasta 100 μM se muestran en la Figura 6.
Los resultados muestran que las células transfectadas con el receptor OR11A1 respondían a los diferentes odorantes de una manera dependiente de la concentración. La potencia y eficacia en OR11A1 fue más alta para Pacho 315. La activación de OR11A1 por el alcohol de pachulí, el alcohol de norpachulí y la pogostona fue comparable, lo que está indicada por solo pequeñas diferencias en los valores EC50 (tabla 5).
Tabla 5
- Compuesto
- EC50 (μM)
- Pacho 315
- 2,9 ± 0,9
- Alcohol de pachulí
- 12,1 ± 1,7
- Pogostona
- 14,8 ± 3,3
- Alcohol de norpachulí
- 14,8 ± 3,3
Se añadieron 50 μl de una solución al 1 % de alcohol de pachulí en etanol con una pipeta a la punta a una serie de diferentes tiras de prueba de perfume (SARL H. GRANGER-VEYRON, Privas, Francia). Las tiras se dejaron secar en condiciones ambientales de laboratorio.
Después de diferentes tiempos (t0, t0 + 1 hora, t0 + 2 horas, t0 + 4 horas, t0 + 8 horas), se cortó la punta de una tira donde se habían aplicado los 50 μl de la solución del material ensayado y se colocó en una botella de 30 ml y se extrajo usando 3 ml de etanol, que contenía 50 μl de decanoato de metilo como patrón interno (10.000 ppm de solución en ciclohexano), añadido a cada botella. Se tuvo cuidado de asegurar que toda el área alrededor del punto de aplicación se incluyera en el área que se cortó y se extrajo. El contenido de las botellas se mezcló durante 30 minutos en un lecho de rodillos, y se llenaron viales de 2 ml con cada muestra.
Las muestras se triplicaron, es decir, se analizaron 3 puntas de tira de prueba de perfume para cada punto temporal.
En una primera serie de experimentos, las muestras tomadas a t0, t0 + 1 hora y t0 + 2 horas se analizaron por GC-MS en una columna de cromatografía de gases no polar (columna BC-WAX (50 m * 0,25 mm * 0,15 μm) que es una Columna GC Sciences suministrada por Interchim, Montluçon, Francia). Los resultados se muestran en las Tablas 68 y en la Figura 7A.
En una segunda serie de experimentos, las muestras tomadas a t0, t0 + 4 horas y t0 + 8 horas se analizaron por GC-MS en una columna de cromatografía de gases no polar (HP-5MS UI (30 m * 0,25 mm * 0,25 μm) que es una Columna Agilent suministrada por Chromoptic, Courtaboeuf, Francia). Los resultados se muestran en las Tablas 911 y en la Figura 7B.
En las Tablas 6-11, AP significa alcohol de pachulí y PI significa el patrón interno, es decir, decanoato de metilo. Cuando se trazó la concentración residual de pachulí en la tira de prueba de perfume en función del tiempo, la relación media en t0 se normalizó a 100 y luego se calcularon t0 + 1h, t0 + 2h, t0 + 4h y t0 + 8h; t0 se define como 2 minutos después de dosificar los 50 μl de la solución del material analizado, que se aplicó hacia la punta de la tira de prueba de perfume.
Estos resultados muestran que el AP conserva al menos 10 % de su concentración inicial después de 1 hora cuando se aplica a un sustrato específico.
Tabla 6: t0 (AP)
- muestra 1
- muestra 2 muestra 3 valor medio desv. est. %
- AP
- 2,98E+06 2,87E+06 2,94E+06 2,93E+06 1,84
- PI
- 3,16E+06 2,90E+06 3,03E+06 3,03E+06 4,28
- Relación AP/PI
- 9,42E-01 9,89E-01 9,69E-01 9,67E-01 2,47
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-
imagen1 imagen2
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