ES2642262T3 - Método de análisis biologico para anticuerpo contra el receptor de la hormona estimuladora tiroidea, kit de medición para el anticuerpo, y célula modificada genéticamente novedosa para su uso en el método de análisis biológico o en el kit de medición - Google Patents

Método de análisis biologico para anticuerpo contra el receptor de la hormona estimuladora tiroidea, kit de medición para el anticuerpo, y célula modificada genéticamente novedosa para su uso en el método de análisis biológico o en el kit de medición Download PDF

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hipotiroidismo se añaden como muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo. La cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio (por ejemplo, aecuorina) emitida desde la célula puede compararse entre las muestras para determinar la eficacia del tratamiento. Como resultado del ensayo, cuando la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio tal como la aecuorina es mayor en la muestra tomada después del tratamiento que en la muestra tomada antes del tratamiento, se puede determinar que el tratamiento es eficaz.
Adicionalmente se describe un método para el diagnóstico del hipotiroidismo, que comprende las siguientes etapas
(A) a (C):
(A)
preparar una mezcla que contiene una célula de acuerdo con la presente invención, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio que contiene Ca2+, TSH o un anticuerpo monoclonal TSAb estimulador y una muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo;
(B)
añadir forskolina a la mezcla preparada en (A); y
(C)
cuantificar la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida desde la célula.
El medio que contiene Ca2+ utilizado en la etapa (A) del método puede ser seleccionado apropiadamente por los expertos en la técnica y puede ser, por ejemplo, un medio que contiene CaCl2. Además, el medio que contiene Ca2+ puede contener adicionalmente un catión que puede ser sustituido por calcio (por ejemplo, un ion de cadmio o un ión de estroncio), un ion de magnesio, un ion de zinc, un ion de ácido sulfúrico, y/o un ion de ácido carbónico. Las concentraciones de Ca2+, el catión que puede ser sustituido por el calcio, el ion de magnesio, el ión zinc, el ion de ácido sulfúrico y el ion de ácido carbónico que puede estar contenido en el medio que contiene Ca2+ pueden ser ajustadas apropiadamente por los expertos en la técnica, de manera que la célula pueda ser mantenida y la proteína sensible al calcio tal como la aecuorina emita apropiadamente luminiscencia.
El orden de adición de las sustancias descritas en la etapa (A) del método puede ser ajustado apropiadamente por los expertos en la técnica.
Se describe adicionalmente un método para el diagnóstico de hipotiroidismo (por ejemplo, enfermedad de Hashimoto), que comprende las siguientes etapas:
(1)
cultivar una célula de acuerdo con la presente invención, en un medio que contiene Ca2+ tratado con un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio;
(2)
añadir una muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo junto con TSH a la célula cultivada, que es cultivada adicionalmente; y
(3)
añadir forskolina a la célula cultivada, y la medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida desde la célula.
Las etapas (1) -(3) pueden ser llevadas a cabo apropiadamente por los expertos en la técnica con referencia al método para el diagnóstico de la enfermedad de Graves descrito anteriormente.
En algunos casos, en la etapa (2), se pueden utilizar una muestra derivada de la sangre de un individuo normal como control negativo y/o una muestra derivada de la sangre de un paciente hipotiroidismo como control positivo puede ser utilizado y cada una de ellas se puede añadir a la célula, respectivamente. Por otra parte, el tiempo de incubación en la etapa (2) no está limitado y se puede ajustar a 10-120 min, por ejemplo, 10 min. Además, en la etapa (2), la TSH puede ser TSH bovina. En algunos casos, se puede añadir TSAb en lugar de o además de TSH. El TSAb puede ser un anticuerpo monoclonal.
En la etapa (3), la concentración de forskolina puede ser ajustada apropiadamente por los expertos en la técnica.
Como resultado de llevar a cabo el método, cuando la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio (por ejemplo, aecuorina) emitida desde la célula tratada con la muestra derivada de la sangre de un sujeto de ensayo es mayor que la emitida desde la célula tratada con una muestra derivada de la sangre de un individuo normal, se puede diagnosticar el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo. Por otra parte, la concentración en suero de un anticuerpo puede ser determinada y comparada con una concentración patrón de anticuerpos en un paciente de hipotiroidismo y/o un individuo normal para diagnosticar o no el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo.
Por ejemplo, se miden la cantidad de luminiscencia emitida desde la célula tratada con una muestra de sangre de un sujeto de ensayo y la cantidad de luminiscencia emitida desde la célula tratada con la misma cantidad de una muestra de sangre (patrón) de un individuo normal como la de la muestra de sangre del sujeto de ensayo. Cuando la cantidad de luminiscencia emitida desde la célula tratada con la muestra de sangre de un sujeto de ensayo es mayor que la emitida desde la célula tratada con la muestra de sangre (patrón) de un individuo normal, se puede determinar que la concentración en suero de un anticuerpo de bloqueo de la estimulación de la tiroides (TSBAb) del sujeto de ensayo es mayor que la del individuo normal. Por lo tanto, se puede diagnosticar el hipotiroidismo en el sujeto de ensayo.
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olfativas de ratón y se clonó en un vector de expresión de 1994 pb (pCMVSPORT, Invitrogen Corp.) para preparar pmCNGα2 (Figura 18). Además, para mejorar la selectividad de AMPc y la sensibilidad al mismo, se preparó un constructo pmCNGα2MW que expresaba un canal de calcio dependiente de nucleótidos cíclicos modificados (SEQ ID NO: 6) en el que la cisteína 460a (C) estaba sustituida por triptófano (W) y el ácido glutámico 583o (E) estaba sustituido por metionina (M) mediante el método de mutación puntual por PCR. Por otra parte, se trató una secuencias de ADNc de apoaecuorina sintética (676 pb) (SEQ ID NO: 7) que se había optimizado para el uso de codones en seres humanos mediante el método de elongación de oligo ADN, y que tenía una señal de direccionamiento mitocondrial con las enzimas de restricción KpnI y NheI y se clonó en pcDNA3.1 (Invitrogen Corp.) tratado con KpnI y NheI para preparar un vector de expresión de apoaecuorina pcDNA mt sAEQ (Figura 19).
Las células CHO se sembraron a una concentración de células de 1,0 × 105 células/ml en una placa de petri de 10cm2. Al día siguiente, las células fueron transfectadas con 1 µg de pZeoSV2 hTSHR, 2 µg de pmCNGα2MW, y 2 µg de pcDNA mt sAEQ por placa de Petri utilizando FuGENE6 (TM) (Roche Applied Science). Al día siguiente, las células se disociaron de la placa de Petri por medio de la adición de 400 µl de una disolución de Versene (EDTA) a la placa de Petri y se suspendieron en un medio DMEM/F12 que contenía 10 ml de cFCS al 5%. La suspensión obtenida se centrifugó a 1000 rpm durante 5 min. A continuación, el sedimento se disolvió a una concentración de 25 x 106 células/ml en 1 ml de CELLBANKER y se almacenó a -80°C.
2. Curva dependiente de la concentración y sensibilidad de detección mínima de TSH (bTSH) obtenida utilizando células congeladas
Se descongeló 1 ml (3 × 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 en un baño caliente y se suspendió en 10 ml de un tampón de muestra (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, HEPES 20 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO3 4,8 mM, PEG6000 al 5%, pH 7,4). Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 10 ml de un tampón de muestra al precipitado obtenido, y se añadieron 7,5 µl de ViviRen 4 mM (Promega Corp.) a la misma. La mezcla se sembró a una concentración de 90 µl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Después del cultivo a 37°C durante 3 h en una atmósfera de CO2, se añadió a esto (n = 6) bTSH diluido seriadamente con PBS a una concentración de 10 µl/pocillo, y las células se cultivaron durante 30 min. A continuación, se añadió una disolución de CaCl2 3 mM a esto a una concentración de 50 µl/pocillo, y se midió la cantidad de luminiscencia utilizando un luminómetro (PerkinElmer Inc., ARVO-Sx; en lo sucesivo, se utilizó el mismo modelo en los Ejemplos). Se muestra una curva dependiente de la concentración bTSH en la Figura 1.
Como se muestra en la Figura 2 (vista aumentada del intervalo de baja concentración), la cantidad mínima detectable para bTSH fue de 0,16 µU/ml de manera que el valor detectado fue susceptible de ser discriminado significativamente del valor que se calcula por el valor del blanco + 3SD. Además, dado que aecuorina realiza una reacción luminiscente, se obtuvo una elevada relación de señal con respecto al blanco (razón S/N) (es decir, unos 100 µU/ml de bTSH, razón S/N de aproximadamente 45 veces (9000000/200000)) mediante el método de la presente invención.
Como se muestra en la Figura 2 (vista aumentada del intervalo de baja concentración), la cantidad mínima detectable para bTSH fue de 0,16 µU/ml de manera que el valor detectado fue susceptible de ser discriminado significativamente del valor que se calcula por valor del blanco + 3SD. Por lo tanto, la sensibilidad fue de un orden de magnitud mayor que la de la kit disponible existente de YAMASA CORP: cantidad mínima detectable para bTSH, 1 µU/mL (Atsuo Nagata, et al.: Clinical Endocrinology, 41: 1023, 1993).
Por otra parte, dado que la aecuorina realiza una reacción luminiscente, la elevada relación de señal con respecto a blanco (S/N), (es decir, unos 100 µU/ml de bTSH, razón S/N de aproximadamente 45 veces (9000000/200000)), obtenida mediante el método de la presente invención fue muy superior a la del kit YAMASA (100 µU/ml de bTSH, SN = 7).
3. Estudio de reproducibilidad
Se diluyó un patrón TASb derivado de pacientes con enfermedad de Graves humana: MRC Research Standard B 1966 Long-acting Thyroid Stimulator (NIBSC: National Institute for Biological Standards and Control, código 65/122) con suero de un individuo normal para preparar las muestras de control H (1,88 mU LAST/ml), M (1,25 mU LAST/ml) y L (0,94 mU LAST/ml). Se añadieron 150 µl de PEG600 al 30% a 50 µl de cada suero de control preparado, y las mezclas se agitaron y después se dejaron en reposo a 4°C durante 5 min. Después de centrifugación a 3000 rpm a 4°C durante 20 min, los precipitados obtenidos se disolvieron por separado en 400 µl de un tampón de muestra para preparar soluciones de muestras. Se descongeló 1 ml (3 × 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 se descongeló en un baño caliente y se suspendió en 10 ml de un tampón de muestra. Después de centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 10 ml de un tampón de muestra al precipitado obtenido, y a esto se le añadieron 7,5 µl de ViviRen 4 mM. La mezcla se sembró a una concentración de 80 µl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Después del cultivo a 37°C durante 3 h en una atmósfera de CO2, se añadieron a esto por separado las muestras preparadas (n = 2) a una concentración de 20 µl/pocillo, y las células se cultivaron durante 30 min. A
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