JPWO2007142208A1 - 温度感応タンパク質、ポリヌクレオチド、温度感応タンパク質発現プラスミド及び発現細胞、温度感応タンパク質の利用方法 - Google Patents
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Abstract
温度センサとして生体細胞の温度を感知することができる温度感応タンパク質を創出するとともに、当該温度感応タンパク質を利用した生体細胞の温度計測方法を提供するために、温度感応タンパク質として、温度変化に伴って構造変化を生じる複数のペプチド鎖からなる温度感受性領域と、この温度感受性領域を複数結合させたペプチド鎖からなり該温度感受性領域の構造変化に起因して所定のシグナルを呈するシグナル領域と、を含有して構成されるものを構築し、この温度感応タンパク質を形質導入した細胞における前記シグナルを計測することで、細胞の温度計測を可能とした。
Description
本発明は、コイルドコイルタンパク等の温度感受的に構造変化する高分子鎖を利用して細胞レベルの温度観察を可能にする温度感応タンパク質、及び当該温度感応タンパク質を利用する技術に関するものである。
ヒトをはじめとする恒温動物の生体は一定温度に保持されており、体温計等の温度計やサーモグラフィックカメラ等で外的に生体の温度を計測する方法は従来から種々利用されているところである。しかしながら、生体の個々の細胞に着目した場合、例えばミトコンドリアはエネルギー産生工場であったり、TRPチャネルは様々な温度領域で活性するものであったりするために、全体が均一な温度であるとは限らない。しかしながら、細胞内に温度分布があることが実験事実として確認されたという報告は今のところ存在しない。一方、細胞内には、種々の刺激に応答するためのパラメータ、例えば酸化・還元、pH、温度等、がいくつか存在しており、これらのパラメータの何れかに基づいて細胞内の温度を検知・追跡することにより、細胞の代謝変化や生理機能を定量化することが可能になると考えられる。すなわち、細胞内の局所温度を感知できるバイオセンサは、様々な生理機能の解明に応用することができるものと考えられる。
このような考えから、温度感受性に優れ、温度変化に応じて構造を変化させるサルモネラ菌由来のコイルドコイルタンパク質TlpA(Toll/interleukin-1 receptor like protein A)(非特許文献1参照)を使用した「温度センサ」が提案されている(非特許文献2参照)。この「温度センサ」は、蛍光タンパク質であるGFP(Green fluorescent protein)のC末端に全長TlpAを1つ融合させたタンパク質GFP-TlpAであり、同文献では試験管内で温度応答性が評価されたと報告されている。すなわち、同文献では、37℃近傍でTlpAが二量体と単量体との間で相互に変化するため、約37℃未満で二量体となったGFP-TlpAでのGFPの蛍光強度が高い一方で、約37℃以上で単量体となったGFP-TlpAでのGFPの蛍光強度が低下するため、このような性質を温度センサとして利用することができる、とされている。
ReiniHurme,et.al,「A Proteinaceous Gene RegulatoryThermometer in Salmonella」,Cell,90,pp55-64,July 11, 1997 RajeshR. Naik,et.al,「The thermostability of an a-helicalcoiled-coil protein and its potential use in sensor applications」,Biosensors & Bioelectronics,16,pp1051-1057,2001
ReiniHurme,et.al,「A Proteinaceous Gene RegulatoryThermometer in Salmonella」,Cell,90,pp55-64,July 11, 1997 RajeshR. Naik,et.al,「The thermostability of an a-helicalcoiled-coil protein and its potential use in sensor applications」,Biosensors & Bioelectronics,16,pp1051-1057,2001
ところが、非特許文献2には前記融合タンパク質GFP-TlpAを利用することにより試験管内で37℃付近で蛍光強度の変化が認められたとの記述があるものの、本発明者らが同文献に開示されている方法に従ってGFP-TlpAを用いて追試を行ったところ、蛍光強度測定によるGFP-TlpAの温度応答性は確認することができず、また、同文献に記載のGFP-TlpAでは細胞内に導入することができなかった。すなわち、引用文献2に開示されている技術を基礎にしては細胞内の温度を非破壊的な方法で測定することは不可能であり、それに基づく生体内、特に細胞レベルでの温度センサの実現は困難であるといえる。
このように、前記融合タンパク質GFP-TlpAを利用して温度応答性が認められない原因を探究した結果、このGFP-TlpAは、蛍光タンパク質GFPのC末端に全長TlpAを1つだけ結合させたものであるため、TlpAが二量体化してもそれぞれのTlpAとGFPとの結合領域での回転自由度が高く、2つのGFPを構造的に十分に近接させることができないことが一因なのではないか、と想定された。
斯かる観点に鑑みて、本発明は、TlpAとGFPに限らず、温度変化に伴って構造が変化するコイルドコイルタンパク質に代表される複数のペプチド鎖と、その構造変化に伴って所定のシグナルを発するペプチド鎖とを融合させて利用することで、真に温度センサとして生体細胞の温度を感知することができる温度感応タンパク質を創出するとともに、その有益な利用方法を提供することを目的とするものである。
すなわち本発明に係る温度感応タンパク質は、温度変化に伴って構造変化を生じる温度感受性領域と、当該温度感受性領域を複数結合させ当該温度感受性領域の構造変化に起因して所定のシグナルを呈するシグナル領域と、を含有して構成されることを特徴としている。
ここで、温度感受性領域及びシグナル領域を構成し得る物質としては、ペプチド鎖やヌクレオチド鎖等(これらにリンカー等の領域が一部に含まれていてもよい)の高分子鎖を挙げることができる。このような構成のタンパク質であれば、引用文献2に開示された融合タンパク質GFP-TlpAとは異なり、温度変化に伴って、温度感受性領域を構成する複数の物質が構造変化を生ずるので、これらの物質の構造変化に対応して各温度感応タンパク質のシグナル領域が発するシグナルを明確に把握することができるようになる。したがって、本発明の温度感応タンパク質は、温度センサとしての利用に供することができ、特にこの温度感応タンパク質を生体細胞に導入することで、これまで困難であった細胞ごとの温度分布や、細胞内での局所的な温度分布のいずれもが可能となる。
特に、温度感受性領域及びシグナル領域は、ペプチド鎖からなるものが、本発明の温度感応タンパク質の構成として適している。この場合、特に前述した引用文献2の融合タンパク質GFP-TlpAとの比較において、温度変化に伴って構造変化を生じるペプチド鎖が複数となるため、シグナル領域が発するシグナルをより明確に把握することができるようになる。
ここで、温度感受性領域には、例えば上述したTlpAだけでなく、温度変化に伴って構造が変化する部位を含むペプチド鎖であれば、現時点での既知又は未知に関わらず種々のものを利用することができる。このようなペプチド鎖としては、例えば、転写因子の1つであるc-Fos、c-Jun、GCN4、Tropomyosin、DNA
polymerase、Seryl tRNA synthase等を例示することができる。これらのペプチド鎖が構造変化を生じる温度は、それぞれ固有であるので、適宜のものを目的に応じて利用すればよい。また、温度感受性領域を構成するペプチド鎖の構造変化は、可逆的又は不可逆的な変化の何れであってもよく、適宜変更可能である。可逆的に構造変化をするものであれば、繰り返しの使用が可能であって好ましいが、不可逆的な構造変化をするものであっても、1度限りではあるが温度センサとしての機能は発揮することできる。
polymerase、Seryl tRNA synthase等を例示することができる。これらのペプチド鎖が構造変化を生じる温度は、それぞれ固有であるので、適宜のものを目的に応じて利用すればよい。また、温度感受性領域を構成するペプチド鎖の構造変化は、可逆的又は不可逆的な変化の何れであってもよく、適宜変更可能である。可逆的に構造変化をするものであれば、繰り返しの使用が可能であって好ましいが、不可逆的な構造変化をするものであっても、1度限りではあるが温度センサとしての機能は発揮することできる。
また、シグナル領域には、前記温度感受性領域の構造変化に伴って外部から観察可能なシグナルを呈するペプチド鎖であれば、現時点での既知又は未知に関わらず種々のものを利用することができる。
温度変化に伴って構造が変化するペプチド鎖として温度感受性領域に利用しやすいものとしては、主として所定の温度領域を境にした温度変化に伴って二量体と単量体との間を可逆的に相互変化するコイルドコイルタンパク質を含むものを適用することができ、この場合シグナル領域には、相互に近接又は離間することにより前記所定のシグナルを呈するペプチド鎖を含むものを利用することが好適である。なお、ペプチド鎖が構造変化を生じる温度領域は、それぞれ固有であり、測定しようとする細胞の目標温度に応じて適切なペプチド鎖を利用すればよい。
本発明の温度感応タンパク質は、シグナル領域に、少なくとも2以上の温度感受性領域が結合した態様が望ましく、本発明には3以上の温度感受性領域が結合した態様も含まれるのは勿論である。
すなわち、シグナル領域を構成するペプチド鎖に結合される温度感受性領域を構成する複数のペプチド鎖は、全て同一であっても異なっていてもよく、さらにその種類についても同一種類であってもよいし、異種類であってもよく、本発明の温度感応タンパク質の立体構造が許容する限り複数であれば温度感受性領域の数は制限されるものではない。
さらに、シグナル領域を構成するペプチドに対して温度感受性領域を構成するペプチド鎖を2つ以上簡易に結合させるには、シグナル領域を構成するペプチド鎖のN末端とC末端とにそれぞれ温度感受性領域が少なくとも1つ結合した態様が好ましい。この場合も、各温度感受性領域を構成するペプチド鎖の異同は問われない。
前記シグナル領域が呈する前記所定のシグナルとしては、酵素反応又は蛍光反応によるシグナルを例示することができる。酵素反応には、例えば、ルシフェラーゼやエクオリンによる発光又は消光(あるいは発光の増減)、β-ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等による発色又は消色(あるいは発色度合いの増減)等を挙げることができる。蛍光反応としては、青色タンパク質(BFP)、シアン色タンパク質(CFP)、緑色タンパク質(GFP)、黄色タンパク質(YFP)、赤色タンパク質(DsRed)等の蛍光強度の増加あるいは減少、蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescence Resonance Energy Transfer;FRET)やProximity Imaging(PRIM)等を挙げることができる。
特に、シグナル領域として利用しやすい既知の物質としては、蛍光タンパク挙げることができる。蛍光タンパク質としては、上述したGFP、CFP若しくはYFP等の他にも、それらの強化蛍光タンパク質であるEGFP、ECFP若しくはEYFP等や、それらの改変体を利用することができる。例えばGFPは、オワンクラゲ(Aequorea coerulescens Brandt)から発見された蛍光タンパク質であり、238個のアミノ酸で構成される。第65から第67番目のアミノ酸から構成されるトリペプチドが発色団(p-hydroxylbenzylidenemidazolinone)を形成し(図1(a)に発色団の構造式を示す)、残りのアミノ酸で11本のβシートを形成して前記発色団を保護している(図1(b)にGFPの三次元モデル図を示す)。野生型(wild type)GFP(以下、「wtGFP」)は、励起スペクトルに395nmにメジャーピークを有し、475nmにマイナーピークを有する。これは発色団のチロシン残基のフェノールがイオン化されているか否かに由来する(参考文献;宮脇敦史,「GFPとバイオイメージング」,羊土社,2002年)。GFP同士を近接させると立体的な障害により、そのフェノール型とフェノレート型との平衡関係が変化し、395nmの吸収強度が減少し、475nmの吸収強度が増加する一方で、GFP同士を離間させると395nmの吸収強度が増加し、475nmの吸収強度が減少する(参考文献;Angelis et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A,1998年)。すなわち、本発明の温度感応タンパク質において、温度感受性領域の構造変化に伴ってシグナル領域としてのGFP同士が近接又は離間する場合、前記2つのスペクトルのピークについてレシオ(比率)を調べることで、温度変化を数値化することができるのである。
ところで、非特許文献2で提案された融合タンパク質GFP-TlpAが追試では温度応答性が認められなかった原因として、全長GFPを利用したことも一因である可能性が考えられる。すなわち、wtGFPのC末端の9アミノ酸は、発色団にもβシート構造にも関与していない領域であり、このC末端にTlpAを結合させていることによっても両者の回転自由度が高まっており、その結果としてGFP-TlpAの温度応答性が現れなかったとも考えられる。したがって、本発明においてシグナル領域としてGFP等の蛍光タンパク質又は強化蛍光タンパク質を利用する場合には、そのC末端側の9アミノ酸を除去したものを利用することも有効であるといえる。ただし、非特許文献2のGFP-TlpAとは異なり、本発明の温度感応タンパク質は温度感受性領域を複数有しているので、シグナル領域としてGFPを利用する場合に必ずしもC末端を削除しなければならないわけではない。
また、本発明において前記温度感受性領域には、サルモネラ菌由来のコイルドコイルタンパク質であるTlpAの温度感受性部位を適用することも有用である。TlpAは、サルモネラ菌(Salmonella)から発見された転写因子のひとつであり、N末端にDNA結合ドメインを持ち、残りはコイルドコイル(coiled-coil)と呼ばれるαへリックスダイマーを形成するドメインである(図2(a)にTlpAのモデル図を示す)。TlpAは、37℃付近の温度領域を超えるとコイルドコイルからモノマーへ完全可逆的に解離し(図2(b)に温度変化によるTlpAの構造変化モデル図を示す)、そのTm値は濃度に殆ど依存しない(参考文献;Hurme et al.,J. Bio. Chem,1996年,Cell,1997年)。したがって、本発明における温度感受性領域にTlpAの温度感受性部位を適用すれば、37℃近傍の温度領域での生体の温度変化の観測が可能となる。
具体的な本発明の温度感応タンパク質の好適な例としては、配列番号1に記載のアミノ酸配列、又は配列番号1に記載のアミノ酸配列の一部領域が欠失、置換若しくは付加した配列からなり、中央部に前記シグナル領域としてC末端側を除去した蛍光タンパク質であるGFPを配し、当該GFPのN末端及びC末端にそれぞれ前記温度感受性領域としてサルモネラ菌由来のコイルドコイルタンパク質であるTlpAの温度感受性部位を配したものである。
また、本発明は、上述した温度感応タンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
また、生体細胞での温度観察を可能にするためには、上述した温度感応タンパク質を発現するプラスミドを得ることが望ましく、斯かる本発明のプラスミドは、前記何れかの温度感応タンパク質をコードする塩基配列を含有する温度感応タンパク質発現プラスミドである。
さらに、このような前記温度感応タンパク質発現プラスミドにおいては、温度感応タンパク質をコードする塩基配列に、細胞膜移行シグナルをコードする塩基配列や、ミトコンドリア等の細胞小器官移行シグナルをコードする塩基配列をさら加えたプラスミドとすることで、細胞膜や細胞小器官をターゲットとして温度感応タンパク質を形質導入することができるプラスミドを得ることができる。なお、温度感応タンパク質を形質導入する細胞小器官としては、ミトコンドリアの他にも、核、小胞体、ゴルジ体、エンドソーム、リソソーム、葉緑体、ペルオキシソーム等をターゲットとして挙げることができる。
そして、このような温度感応タンパク質発現プラスミドを形質導入してなる温度感応タンパク質発現細胞であれば、当該細胞の内部の局所的な温度変化、例えば細胞小器官や細胞膜等の局所の温度変化をも温度感応タンパク質が呈するシグナルに基づいて計測することが可能となる。なお、温度感応タンパク質発現プラスミドを形質導入される細胞には、ヒトを含む動物細胞を適用することも可能である。
さらに、このような温度感応タンパク質を利用する本発明の温度計測方法は、前記温度感応タンパク質発現細胞において呈せられる前記温度感応タンパク質のシグナル領域に起因する前記所定のシグナルを計測する工程と、この計測されたシグナルを解析することにより前記細胞の温度を判断する工程と、を含む温度感応タンパク質を利用した細胞の温度計測方法である。
特に、温度感応タンパク質をコードする塩基配列に加えて細胞膜移行シグナルをコードする塩基配列や、細胞小器官移行シグナルをコードする塩基配列を有する温度感応タンパク質発現プラスミドを形質導入してなる温度感応タンパク質発現細胞においては、当該細胞の温度感応タンパク質が導入された部位で呈せられる温度感応タンパク質のシグナル領域に起因する所定のシグナルを計測する工程と、この計測されたシグナルを解析することにより細胞の局所的な温度を判断する工程と、を含む温度感応タンパク質を利用した細胞の温度計測方法とすることで、従来は困難とされてきた当該細胞内の局所的な温度変化を計測することが可能となる。
さらにまた、温度感応タンパク質とミトコンドリア移行シグナルとをコードする塩基配列を有する温度感応タンパク質発現プラスミドを形質導入してなる温度感応タンパク質発現細胞に試薬を添加する工程と、前記細胞内のミトコンドリアにおいて呈せられる前記温度感応タンパク質のシグナル領域に起因する所定のシグナルを計測する工程と、この計測されたシグナルを解析することにより前記ミトコンドリアの局所的な温度を判断する工程と、を含む温度感応タンパク質を利用したミトコンドリア(又は細胞自体)に対する安全性確認試験方法、換言すればミトコンドリア(又は細胞自体)に対する毒性試験方法を確立することが可能である。すなわち、細胞内において酸素呼吸を行うミトコンドリアでは、酸素呼吸によるエネルギー産生に伴って顕著に熱を発生していると考えられることから、試薬の添加により前記シグナルの変化が検出されるか否かによって、ミトコンドリア又はそれを含む細胞自体の安全性又は毒性を確認することが可能となるのである。
本発明の温度感応タンパク質は、温度感受性部位として温度変化に伴って構造が変化する複数のペプチド鎖を、その構造変化に伴って所定のシグナルを発するペプチド鎖に融合させたものであるので、温度センサとして生体細胞の温度を感知することを可能ならしめるものであり、斯かる温度感応タンパク質を動物等の細胞に導入することで、生体細胞単位や細胞内の局所単位での温度変化を計測することが可能である。さらにこのような温度変化の検出を利用することで、細胞又は細胞内のミトコンドリアに対する試薬の安全性確認試験を行うことも可能である。
以下、本発明の実施形態を、図面を参照して説明する。
本発明の第1実施形態は、本発明に係る温度感応タンパク質の一例として、図3にモデル図を示すように、温度感受性領域(11)に2つのTlpAを適用するとともにシグナル領域(12)にGFP(wtGFP)を適用した融合タンパク質(1)であり、37℃近傍の温度領域において2つの融合タンパク質(1)の温度感受性領域(11)が二量体又は単量体となってシグナル領域(12)同士が近接又は離間することで当該シグナル領域における励起波長の変化に伴う細胞内温度の変化を観察できるようにするものである。
本発明の第1実施形態は、本発明に係る温度感応タンパク質の一例として、図3にモデル図を示すように、温度感受性領域(11)に2つのTlpAを適用するとともにシグナル領域(12)にGFP(wtGFP)を適用した融合タンパク質(1)であり、37℃近傍の温度領域において2つの融合タンパク質(1)の温度感受性領域(11)が二量体又は単量体となってシグナル領域(12)同士が近接又は離間することで当該シグナル領域における励起波長の変化に伴う細胞内温度の変化を観察できるようにするものである。
具体的に、本実施形態における前記融合タンパク質(1)は、シグナル領域を構成するGFPのC末端とN末端に、それぞれTlpAのコイルドコイルドメインを結合させたものであり、以下、この融合タンパク質(1)を「wtGFP-TWIX」(図中の符号は1)と称することとする。「TWIX」とは、「Tandem winding coils thermosensor」から名付けた略称である。より詳細に図4を参照して説明すると、TlpAには、長短2つのコイルドコイルを形成するドメインがあり(前掲参考文献;Hurme et al.,J. Bio. Chem,1996年)、wtGFP-TWIX(1)の温度感受性領域(11)には、そのうち長い方のコイルドコイルドメイン(第94番目から第257番目のアミノ酸残基;TlpA-N)を2つ利用している(同図上段のTlpAのコイルドコイル性を表すグラフを参照)。一方、シグナル領域(12)には、wtGFPの発色団(第1番目から第229番目のアミノ酸残基)のみを利用し、C末端側9アミノ酸残基(第230番目から第238番目)を削除して、wtGFP-TWIX(1)のシグナル領域(12)として利用している。すなわち、wtGFP-TWIX(1)は、GFPの発色団を2つの同一のTlpAコイルドコイルドメイン(TlpA-N)で挟み込むように設計したものである(同図下段のTWIXの構造説明図を参照)。wtGFP-TWIX(1)のアミノ酸配列は、配列表の配列番号1に示したとおりである。以下、必要に応じて融合タンパク質(1)を少々する場合にはTWIX(1)と呼ぶものとする。
このwtGFP-TWIX(1)は、例えば大腸菌発現ベクターにライゲーションして発現させ、生成することで得ることができる(詳細は後述する実施例を参照のこと)。37℃を境にした加温、冷却に伴うwtGFP-TWIX(1)の構造変化については、37℃以上では、wtGFP-TWIX(1)が1分子ずつ独立しているのに対して、37℃未満では、一方のwtGFP-TWIX(1)における各温度感受性領域(11)を構成するTlpA-Nが他方のwtGFP-TWIX(1)における各温度感受性領域(11)のTlpA-Nと二量体化しているのに伴って、シグナル領域(12)を構成するGFPの発色団同士が近接することとなる。
このようなwtGFP-TWIX(1)の温度変化に伴う構造変化が生じていることを検証するために、wtGFP-TWIX(1)の発現・精製を行い、蛍光強度と温度変化との関係を試験した。図5(a)に、wtGFP-TWIX(1)の25μMでの熱変性曲線を示す。温度変化は15℃から50℃まで5℃刻みとして、横軸に波長、縦軸に蛍光強度を設定した。概ね450nm以下では温度が低い方が蛍光強度が大きく、450nm以上では温度が高い方が蛍光強度が大きいという結果が得られたが、何れの温度でも400nmにメジャーピーク、480nmにマイナーピークが認められた。このメジャーピークとマイナーピークの比率(Ratio (ex400/ex480))と温度との関係を同図(b)に示す。同図から明らかなように、37℃付近を中心として35℃から40℃の間で蛍光強度が大きく変化していることが示されており、この温度領域を高温側に超えることでwtGFP-TWIX(1)におけるGFPの立体障害が解消されていることが明らかとなった。なお、比較のため、wtGFPを例えば大腸菌発現ベクターにライゲーション(詳細は後述する実施例を参照のこと)して発現させ、生成したものを用いて、wtGFP-TWIX(1)と同様の試験を行い、メジャーピークとマイナーピークの比率と温度との関係を同様に調べたところ、同図(b)に×印で示す曲線のように、wtGFP単独では温度上昇に伴って前記比率がなだらかに変化しているに過ぎないことが分かる。
さらに、wtGFP-TWIX(1)の濃度を変化(5μM,1μM,0.2μM)させて、上記と同様に熱変性曲線を調べ、メジャーピークとマイナーピークの比率(Ratio (ex400/ex480))と温度との関係をプロットすると、図6(a1,a2,a3に熱変性曲線、b1,b2,b3にレシオ)に示すような結果となり、wtGFP-TWIX(1)の濃度により各温度での蛍光強度には差があるものの、400nmにメジャーピーク、480nmにマイナーピークが認められ、30℃強から35℃強の間で蛍光強度が大きく変化するという、25μMの場合と類似の結果が得られた。この場合も比較のため、GFPについても各濃度(5μM,1μM,0.2μM)でメジャーピークとマイナーピークの比率と温度との関係を調べたが、wtGFP-TWIX(1)のような温度による蛍光強度の大きな変化は認められなかった。
そこで、wtGFP-TWIX(1)の前述した各濃度(25μM,5μM,1μM,0.2μM)における熱変性曲線を二状態遷移理論に基づいてプロットすると、図7にグラフで示すように、具体的なTM値は、25μMで37.7℃、5μMで35.5℃、1μMで33.8℃、0.2μMで32.5℃である。以上の結果から、wtGFP-TWIX(1)のTM値には若干の濃度依存性があり、それには分子間相互作用が働いていることが示唆される。しかしながら、全体的な傾向としては、wtGFP-TWIX(1)は、0.2μMから25μMの濃度範囲では、30℃を少し超えたところから40℃を超えない温度領域において、メジャーピークとマイナーピークの比率が極端に変化する結果となった。
ここで、以上のようなwtGFP-TWIX(1)の温度感受性が可逆的であるかどうかを検証するために、wtGFP-TWIX(1)に対して加熱、冷却を繰り返したときにおける温度感受性の変化を蛍光強度の計測により調べた。その結果を図8に示す。同図(A)はwtGFP-TWIX(1)に対する加熱・冷却時における各温度での励起スペクトルの変化を示すものであり、(a)は20℃から50℃まで加熱したときの5℃毎の変化を、(b)は同じサンプルを50℃から20℃まで冷却したときの5℃毎の変化を、(c)はさらに同じサンプルを20℃から50℃まで加熱したときの5℃毎の変化を、(d)はさらに同じサンプルを50℃から20℃まで冷却したときの5℃毎の変化を、それぞれプロットしたグラフを示している。また同図(B)は、(A)におけるにメジャーピーク(400nm)とマイナーピーク(480nm)の比率(Ratio (ex400/ex480))と温度との関係を示している。これらの結果から判断すると、初回の加熱時(同図(A)(a))におけるレシオ値の変化(同図(B))は少しだけずれてはいるが、それ以外のレシオ値の変化曲線は完全に一致していることから、wtGFP-TWIX(1)の蛍光強度変化から分かる温度感受性は、ほぼ完全可逆的である。さらに、この可逆的なwtGFP-TWIX(1)の温度感受性には、タンパク質の相転移の場合にしばしば見受けられるヒステリシスがなく、加熱・冷却によるタンパク質の変性も生じていないことが確認された。以上により、wtGFP-TWIX(1)は細胞に対して繰り返し何度も使用することが可能な温度センサとして極めて有用であるといえる。
また、熱以外にもタンパク質の構造に影響を与える他の因子についても、wtGFP-TWIX(1)自体にどのような影響を及ぼすかを検証した。すなわち、熱以外の因子として、pH(7〜8)、酸化剤(H2O2;)、還元剤(DTT;Dithiothreitol)、Mg2+、Ca2+について、wtGFP-TWIX(1)への滴下実験によって評価した。具体的な実験方法については、後述の実施例の項において詳述する。結果を図9に示す。pHについては同図(a)に示すように、wtGFP-TWIX(1)を含む液のpHを徐々に変化させ、蛍光強度を測定してメジャーピーク(400nm)とマイナーピーク(480nm)の比率(Ratio (ex400/ex480))を縦軸、pHを横軸としたグラフで表すと、pHの変化によるwtGFP-TWIX(1)の蛍光強度のレシオ値はほとんど変化がなく安定していた。酸化剤については同図(b)に、還元剤については同図(c)に示すように、H2O2又はDTTを順次滴下してwtGFP-TWIX(1)を含む液の濃度を適宜変化させ、蛍光強度を測定してメジャーピーク(400nm)とマイナーピーク(480nm)の比率(Ratio (ex400/ex480))を縦軸、H2O2又はDTTの濃度の対数を横軸としたグラフで表すと、酸化剤・還元剤の濃度変化によってはwtGFP-TWIX(1)の蛍光強度のレシオ値はほとんど変化がなく安定していた。Mg2+、Ca2+については、タンパク質間相互作用に影響する可能性が考えられたため、それらの存在によって熱に対する感受性が影響を受けるかどうかを蛍光強度を測定することにより調べたものである。同図(d)(e)に示すように、縦軸を蛍光強度を測定してメジャーピーク(400nm)とマイナーピーク(480nm)の比率(Ratio (ex400/ex480))、横軸を温度としてグラフで表すと、Mg2+、Ca2+の濃度を変化させても、20℃から50℃の間でレシオ値に変化は認められなかった。以上の結果から、これら全ての外的環境因子は、wtGFP-TWIX(1)の機能に影響しないことが判明した。すなわち、wtGFP-TWIX(1)の温度感受性は、熱も含めて外的な環境の変化に極めて強く、細胞に対知る温度センサとして極めて優れたものであるといえる。
また、wtGFP-TWIX(1)の構造変化は、上述のようなシグナル領域(12)を構成するGFPの蛍光強度比だけでなく、温度感受性領域(11)を構成するTlpA-Nのαへリックス構造の含有量によっても確認することができる。すなわち、wtGFP-TWIX(1)の円二色性スペクトル(CDスペクトル)を測定することで、図10(a)のモデル図に示すように、各温度におけるwtGFP-TWIX(1)がTlpA-Nにおいて二量体化していれば222nmでθ値が低下するが、単量体であれば222nmにおけるθ値の低下は認められないこととなる。同図(b)に20℃から55℃まで5℃刻みでのCDスペクトルの計測データのグラフ、同図(c)に各温度におけるθ222の値のグラフ、同図(d)に同図(c)の値を二状態遷移理論を用いて補正したグラフを示す。同図(d)のグラフから、wtGFP-TWIX(1)のTM値としては、38.8℃が得られた。これらの結果と、前述した蛍光強度比と温度変化との関係の結果を総合すると、wtGFP-TWIX(1)は37℃を中心とした特に35℃から40℃の温度領域で大きな蛍光の変化を示し、この温度領域で二量体又は単量体に相互変化することが明らかとなった。
以上の結果に鑑みて、wtGFP-TWIX(1)の蛍光強度比を測定することで、少なくとも35℃から40℃の温度領域での細胞の温度変化を確認することができることが明らかとなったことから、wtGFP-TWIX(1)の動物細胞への導入を行い、次いでその細胞に対して温度を変化させながら蛍光強度を測定した。すなわち、哺乳動物発現ベクターにライゲーションしたwtGFP-TWIX(1)を、高分子ポリカチオン遺伝子導入剤を用いてヒト胎児腎臓由来のHEK293細胞に形質導入した(詳細は後述する実施例を参照のこと)。そして、wtGFP-TWIX(1)を導入したHEK293細胞をガラスプレートに載せ、灌流法にて昇温条件にて温度を変化させながらガラスプレート上の細胞それぞれの蛍光強度を測定した。具体的な細胞内蛍光強度の測定試験方法については、後述の実施形態の項で詳述する。複数の細胞(本試験例では11)について同様の試験を繰り返し、図11に示すような熱変性曲線を得た。同図(a)〜(c)は、11株のwtGFP-TWIX(1)を導入したHEK293細胞ごとの測定結果をプロットしたグラフであり、同図(a)は380nmで励起した場合の熱変性曲線を示し、同図(b)は480nmで励起した場合の熱変性曲線を示す。何れも横軸は温度、縦軸は蛍光強度を表す。なお、蛍光強度の測定には、一般的に広く利用される380nmの励起フィルターを使用したため、低波長側については400nmではなく380nmの蛍光強度を測定したが、380nmでも400nmを測定した場合と同様の結果が得られる。そして、細胞ごとの380nmと480nmの比率(Ratio (ex380/ex480))と温度との関係は同図(c)に示すようなものとなり、380nmと480nm蛍光強度比の平均値をプロットすると同図(d)に示す結果となった。すなわち、wtGFP-TWIX(1)を哺乳動物細胞(HEK293細胞)に導入した場合であっても、35℃から40℃の間の温度領域、特に37℃付近で蛍光強度比が大きく変化している。なお、比較のために、wtGFPを形質導入したHEK293細胞(詳細は後述する実施例を参照のこと)についても同様の試験を行い(細胞数12)、図12に示すような結果を得た。同図(a)〜(c)は、12株のwtGFPを導入したHEK293細胞ごとの測定結果をプロットしたグラフであり、同図(a)は380nmで励起した場合の熱変性曲線、同図(b)は480nmで励起した場合の熱変性曲線、同図(c)は細胞ごとの380nmと480nmの比率(Ratio (ex380/ex480))と温度との関係、同図(d)は380nmと480nm蛍光強度比の平均を表す。すなわち、wtGFPを導入したHEK293細胞では、蛍光強度比が大きく変化する温度領域は認められない。このことから、特に図11(d)と図12(d)の比較から分かるように、TWIXが存在するwtGFP-TWIX(1)を導入した細胞では、35〜40℃付近で蛍光強度が急激に変化しているが、wtGPFのみを導入した細胞では蛍光強度が比較的直線的に変化するため、温度感受性領域であるTWIXの存在により、本実施形態では少なくとも35〜40℃付近の温度変化を感度よく読みだして敏感に感知できるといえる。
さらに、細胞内の局所的な温度変化が観測可能であるか確認すべく、wtGFP-TWIX(1)を哺乳動物の細胞膜に移行させ発現させたうえで温度による蛍光強度変化を測定した。wtGFP-TWIX(1)の細胞膜への移行へは、哺乳動物発現ベクターにwtGFP-TWIX(1)をライゲーションする際にファルネシル化シグナルを付加し、その産物をヒト胎児腎臓由来のHEK293細胞に形質導入した。なお、比較のために同様の手法を用いてwtGFPにもファルネシル化シグナルを付加したうえで哺乳動物発現ベクターにライゲーションし、それをHEK293細胞に形質導入した(以上、詳細は後述する実施例を参照のこと)。そして、これらの細胞(wtGFP-TWIX-F,wtGFP-Fと称する)を、温度を変化させながら蛍光変化を測定した。図13(a1),(b1)は、それぞれwtGFP-TWIX-F,wtGFP-Fを488nmで励起した際の共焦点顕微鏡画像である(具体的な発現の確認方法については、後述の実施例の項に詳述する)。各画像の左側の写真から分かるように、細胞膜に蛍光(リング状に白く光っている部分)が認められる。また、同図(a2),(b2)は、wtGFP-TWIX-F,wtGFP-Fの温度による蛍光変化を計測し、その380nmと480nmの比率(Ratio (ex380/ex480))との関係を示すグラフである。wtGFP-TWIX-Fでは37℃付近で蛍光強度比が大きく変化しているが、wtGFP-Fではそのような大きな変化は認められない。
以上の結果から、本実施形態に係る温度感応タンパク質であるwtGFP-TWIX(1)は、哺乳動物細胞に形質導入した場合でも、約37℃を中心とする温度領域において、温度感受性領域(11)であるTlpA-Nが二量体と単量体との間を相互変換し、それに伴ってシグナル領域(12)であるGFPが近接又は離間して2つの励起スペクトルの蛍光強度比を変化させる。したがって、この2つの励起スペクトルの蛍光強度比を測定すれば、細胞ごとの温度変化、或いは細胞内の局所的な温度変化を測定することができることとなり、wtGFP-TWIX(1)は生体細胞の温度センサとして有用であることを明らかにすることができた。
次に、wtGFP-TWIX(1)が細胞内に導入しても温度センサとして機能することを検証するために、細胞内で温度センサを発現させた後に、細胞外液の温度を物理的に変化させると細胞内wtGFP-TWIX(1)の蛍光がどのように変化するのかを調べた。この実験では、wtGFP-TWIX(1)を導入する細胞として、ヒト子宮頸ガン由来のHeLa細胞を利用し、HeLa細胞内のミトコンドリアにwtGFP-TWIX(1)を発現させることとした。HeLa細胞を用いたのは、予備的な試験から、HEK293細胞と比較して、増殖能が高い上にミトコンドリアの数も多く、wtGFP-TWIX(1)を導入した場合の蛍光感度が高いことが確認されたからである。蛍光測定は、wtGFP-TWIX(1)について、細胞外液のコントロールは還流中の細胞外液を電熱線で過熱することでコントロールして行った(詳細は、後述の実施例の項を参照)。wtGFP-TWIX(1)の利点は、形質導入するプラスミドDNAが1つでよいこと、またレシオ値として算出するためにデータが細胞内のwtGFP-TWIX(1)の発現量に左右されないということなどにある。この実験では、温度感受性領域(11)とシグナル領域(12)の両方を持つwtGFP-TWIX(1)、wtGFP-TWIX-F、wtGFP-TWIX-Mitoをそれぞれ形質導入した細胞と、温度感受性領域のないwtGFP、wtGFP-F、wtGFP-Mitoをそれぞれ形質導入した細胞について、温度変化による蛍光強度の変化を比較することにより行った。ここでは各細胞を、それらに導入されたタンパク質の名称で呼ぶものとする。なお、タンパク質wtGFP-TWIX-Mito及びwtGFP-Mitoは、それぞれwtGFP-TWIX(1)又はwtGFPにミトコンドリア移行シグナルを付加したものである。HeLa細胞内のミトコンドリアへのwtGFP-TWIX(1)の形質導入については、後述の実施例の項に詳述する。
この実験結果を図14に示す。温度感受性部位の付いていないwtGFP(同図a2))、wtGFP-F(同図b2)、wtGFP-Mito(同図c2)を形質導入した細胞では特定の温度領域での急激な蛍光強度(レシオ値)の変化は認められなかったが、wtGFP-TWIX(1)(同図(同図a1))、wtGFP-TWIX-F(同図b1)、wtGFP-TWIX-Mito(同図c1)を形質導入した細胞では、何れも特定の温度領域(概ね35℃前後)において蛍光が大きく変化していることがわかった。これは3種のwtGFP-TWIX(1)がそれぞれ細胞外の物理的な温度変化を感知し、精製タンパク質での結果と同様に、特定の温度領域でレシオ値を変化させたためであると考えられる。この結果から、細胞内においても、wtGFP-TWIX(1)は温度センサとして機能するということがわかった。図15(a)(b)(c)は、それぞれwtGFP-TWIX(1)、wtGFP-TWIX-F、wtGFP-TWIX-Mitoを導入したHeLa細胞を488nmで励起した際の共焦点顕微鏡画像である(具体的な発現の確認方法については、後述の実施例の項に詳述する)。これら各図において白く光っている部分、すなわちHeLa細胞の細胞質全体(a)、細胞膜(b)、ミトコンドリア(c)に蛍光が認められる。すなわち、ターゲットとした細胞の特定部位にwtGFP-TWIXを発現させることができていることが分かる。
上記の検証結果から、生体細胞内のミトコンドリアに導入したwtGFP-TWIX(1)が生体内温度センサとして機能することが確認されたので、wtGFP-TWIX(1)を用いた細胞の熱産生を確認することとした。生体では様々な方法を用いて熱を産生している。中でもげっ歯類、冬眠明けの動物、赤ん坊などは褐色脂肪細胞において熱を産生していることが知られる。過去の報告から、褐色脂肪細胞ではミトコンドリア膜間スペースのプロトン勾配を脱共役タンパク質uncoupling protein1(UCP1)によって脱共役させることで熱が産生されると考えられている。それを人工的に模倣する系として、ミトコンドリア脱共役剤であるCCCP(carbonyl cyanide m-chloro phenyl hydrazone)を処置し人工的に脱共役状態すると、細胞培養液全体の温度が上昇することが知られている。そこで、CCCPによって生細胞で熱が産生されているかを蛍光性温度センサーであるwtGFP-TWIX(1)を用いて評価した。
具体的な実験としては、HeLa細胞にwtGFP-TWIX-Mitoを発現させたとき、CCCPによって蛍光がどのように変化するかを検証した。2mMのCa2+存在下においてwtGFP-TWIX-Mitoを発現させたHeLa細胞の蛍光強度を測定し、測定開始から120秒後に10μMのCCCPを同細胞に処置した。対照として、TWIXを有しないwtGFP-Mitoを発現させたHeLa細胞についても同様に試験した。具体的な実験方法については、後述の実施例の項において詳述する。その結果を図16に示す。同図Aは、蛍光強度の測定結果に基づいてレシオ値を時間毎にプロットしたグラフであり、(a)はwtGFP-TWIX-Mitoを発現させたHeLa細胞についての結果、(b)はwtGFP-Mitoを発現させたHeLa細胞についての結果である。同図B(a)(b)は、同図Aの傾きをキャンセルし、変化量を比較した結果である。同図より分かるとおり、10μMのCCCPをwtGFP-TWIX-Mitoを発現させたHeLa細胞に処置したころレシオ値の減少が見られた。この変化はwtGFP-Mitoを発現させたHeLa細胞では見られなかった。なお、脱共役剤として上記のような試験に用いられるものには、この実験で用いたCCCPの他にも、2,4-ジニトロフェノール等を挙げることができる。
またこの変化が、電子伝達系複合体I阻害剤であるRotenoneの存在下では起こり得るかについても検証した。図17にその結果を示す。同図Aにおいて、(a)は2mMのCa2+存在下においてwtGFP-TWIX-Mitoを発現させたHeLa細胞の蛍光強度を測定し、測定開始から120秒後に10μMのCCCPを同細胞に処置した場合の時間毎のレシオ値をプロットしたグラフであり、(b)は、(a)の条件に加えて10μMのRotenone存在下におけるグラフである。同図Bは、Aにおけるレシオ値の変化量を比較した結果を示している。この結果から、wtGFP-TWIX-Mitoを発現させたHeLa細胞にCCCPを添加することによる蛍光強度のピークのレシオ値の減少は、Rotenoneを処置することで抑制されることが明らかとなった。以上のことから、HeLa細胞においては、CCCPによるプロトン勾配の脱共役によって熱が産生されるということがわかった。
上記の検証結果に基づけば、添加する試薬の細胞内のミトコンドリアへの安全性試験(又は毒性試験)として応用することができる。つまり、上記の結果によると、脱共役剤はミトコンドリアの呼吸作用を止める働きをすることから、脱共役剤(CCCP)の添加によりミトコンドリアの呼吸が止まり熱産生が停止したことを細胞の蛍光変化を測定することで確認することができる。すなわち、シグナル領域(12)のC末端及びN末端にそれぞれ温度感受性領域(11)を備えた本発明の融合タンパク質(1)(例えばwtGFP-TWIX)にミトコンドリア移行シグナルを加えたものを用意し(例えばwtGFP-TWIX-Mito)、それを生体細胞に形質導入したものに対して試薬を添加して、当該シグナル領域(12)により呈せられるシグナル(例えば蛍光)を測定すれば、ある温度領域におけるシグナルの急激な変化が認められた場合には、当該試薬にはミトコンドリアへの呼吸停止といった毒性が存することが確認できる。
以上に述べた試験では、wtGFPが有するPRIM(Proximity Imaging)という性質を温度変化の検出方法として採用してきたが、他の方法としてFRET(蛍光共鳴エネルギー移動;Fluorescence Resonance Energy Transfer)によっても温度変化を検出できるかについて検証した。ここでは、wtGFP-TWIX(1)に代えて、オワンクラゲ由来の蛍光タンパク質CFPとYFPの強化蛍光タンパク質であるECFPとEYFP(何れも発色団である第1番目から第229番目のアミノ酸残基)を利用し、それぞれのC末端及びN末端にTlpAの長い方のコイルドコイルドメインである第94番目から第257番目のアミノ酸残基(TlpA-N)を融合させたECFP-TWIX(2)とEYFP-TWIX(3)を利用した。FRETによる温度変化検出の概念図を図18に示す。理論的には、ECFP-TWIX(2)とEYFP-TWIX(3)の混合溶液に395nmの光を照射すると、低温域では両融合タンパク質(2及び3)のTlpA-Nが二量体化してECFPとEYFPが近接し、EYFPに基づく励起された528nmの蛍光が観察され、高温域では両融合タンパク質(2及び3)のTlpA-Nが単量体となりECFPとEYFPが離間して、ECFPに基づく励起された457nmの蛍光が観察されると考えられる。そこで、種々の濃度(0.2μM、1μM、5μM、25μM)のECFP-TWIX(2)とEYFP-TWIX(3)の混合溶液(以下、「ECFP/EYFP-TWIX」と称する)について、20℃から50℃までの間で5℃毎に温度変化させた場合の蛍光強度を測定した。その結果を図19に示す。同図において、ECFP/EYFP-TWIXの濃度が(a)は0.2μM、(b)は1μM、(c)は5μM、(d)は25μMの場合における結果である。同図から明らかなように、ECFP/EYFP-TWIXの何れの濃度においても、低温側(20〜25℃)でEYFP-TWIXに由来する蛍光と考えられる527nmの蛍光ピークが認められた。なお、比較のため、図20に示すように、コイルドコイルドメインを有さない発色団ECFPとEYFPの混合溶液(「ECFP/EYFP」1μM(同図(a))、5μM(同図(b))、25μM(同図(c)))ついて、20℃から50℃までの間で5℃毎に温度変化させた場合の蛍光強度を測定したところ、35〜40℃付近における大きな蛍光変化は観測されなかった。
そこで、ECFP/EYFP-TWIXの温度変化による蛍光変化を詳細に解析するために、FRETによって転移した励起エネルギーによるEYFPの蛍光ピークF527を20℃における蛍光F527,20℃で一般化して温度に対してプロットし、EYFPのピークにおける温度依存性を検証した結果を図21に示す。同図に示す結果から、ECFP-TWIXとEYFP-TWIXとの混合タンパク質溶液(ECFP/EYFP-TWIX)では、何れの濃度(同図(a)1μM、同図(b)5μM、同図(c)25μM)においても温度を上昇させると、30〜35℃にかけて大きな変化が認められた。一方、対照としたECFPとEYFPとの混合タンパク質溶液(ECFP/EYFP)では、温度変化に伴う蛍光F527,20℃の変化は直線的であり、急激な蛍光変化がある温度領域は存在しなかった。これらの結果から、シグナル領域にECFPとEYFPを用いた場合でも、FRETを介して温度変化が検出できることがわかった。また、図22((a)は蛍光強度値、(b)はレシオ値を示す)に示すように、その変化領域における濃度依存性はないことが確認された。以上の結果は、wtGFP-TWIX(1)を用いてPRINによって温度変化を検出したときの結果と同じであることから、FRETによる温度検出も有用であることが示された。
なお、以上に説明した実施形態は本発明の一例であって、本発明は上述した実施形態に限定されるものではない。例えば、本発明の温度感応タンパク質のシグナル領域として上述のようなGFPを利用する場合、温度感受性領域である2つのTlpA-Nの結合部位は当該GFPの両端以外としても構わないし、GFPに3以上のTlpA-Nを結合させて温度感応タンパク質を構成してもよい。また、シグナル領域には上述した実施形態のGFPやwtGFPを利用したり、それら以外(青色タンパク質(BFP)、シアン色タンパク質(CFP)、黄色タンパク質(YFP)、赤色タンパク質(DsRed)等)の蛍光タンパク質又はそれらの強化蛍光タンパク質を利用してもよいし、2つの異なる蛍光タンパク質間の蛍光共鳴エネルギー移動も利用できる。シグナル領域に酵素反応を行うペプチド、例えば発光/消光反応であればルシフェラーゼやエクオリン等、発色/消色反応であればβ-ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等を、温度計測対象となる細胞に応じて適宜利用することができる。一方、温度感受性領域には、TlpA以外のコイルドコイルタンパク質や、所定の温度領域で構造が変化する適宜のペプチド(c-Fos、c-Jun、GCN4、Tropomyosin、DNA polymerase、Seryl tRNA synthase等)を利用することができ、シグナル領域に結合させる2つ以上の温度感受性領域は異なる種類(異なるアミノ酸配列)のものとしてもよく、測定温度や測定対象となる細胞との相性に応じて適宜のものを選択すればよい。また、本発明の温度感応タンパク質は、温度感受性領域を構成する複数のペプチドと、シグナル領域を構成するペプチドのみからなるものの他、温度感受性領域の構造変化やそれに伴うシグナル領域の反応性を阻害しない限り、他のアミノ酸配列が付加されたものとすることも可能である。さらに、TWIX(1)を発現させる動物細胞は、HEK293以外にも、CHO、PC12、MDCK、HeLa、BHKやCOS等の適宜のものを利用することができる。その他、各部の具体的構成についても上記実施形態に限られるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形が可能である。
以下、上述した実施形態で利用した各種プラスミドの作成方法、各種試験方法の例について説明する。
<1.pwtGFP-C1プラスミドの構築> まず、wtGFPを得るために、pEGFP-C1を変異させてpwtGFP-C1を作製した。変異はPCR法を用いて導入した。まず、pEGFP-C1を鋳型にしてPCR反応を行った。プライマーにはwtGFP-1(配列番号2)とwtGFP-2(配列番号3)を用いた。酵素はSTRATAGENE社のPfuUltra High-Fidelity DNA Polymeraseを使用し、反応液の組成や反応条件等は付属のマニュアルに従った。得られたPCR産物を制限酵素DpnIで処理した後、大腸菌DH5αに導入してサブクローニングすることでpwtGFP-C1を得た。
<2.pET23a-wtGFP-TWIX大腸菌発現プラスミドの構築> C末端側を除去したGFP(1-229)は、上記<1>のpwtGFP-C1プラスミドから、TlpAの長い方のコイルドコイルドメイン(TlpA-N)(以下、TlpA(94-257))は、N末端側,C末端側共にpKDSC50(Haneda, T. et al.,
Infect Immun., 69, 2612-2620, (2001))からそれぞれPCR法を用いて増幅させた。プライマーはwtGFP(1-229)の増幅にはGFP1-5’_EcoRI(配列番号4)とGFP229-3’_SpeI(配列番号5)、TlpA(94-257)の増幅にはN末端側,C末端側にそれぞれTlpA94-5’_BamHI(配列番号6)とTlpA257-3’_EcoRI(配列番号7)、TlpA94-5’_SpeI(配列番号8)とTlpA257-3’_HindIII(配列番号9)を用いた。酵素はPfuUltra DNA Polymeraseを使用し、反応条件等は付属のマニュアルに従った。得られた断片はpBluescript II SK(-)_EcoRV digestベクターにライゲーションし大腸菌DH5αに導入することによりサブクローニングした。このうちwtGFP(1-229)とTlpA-N(94-257)のC末端側については、それぞれ制限酵素EcoRIとSpeI、SpeIとHindIIIで処理し、それらをEcoRIとHindIIIで処理したpBluescript II SK(-)ベクターにライゲーションし大腸菌DH5αに導入してサブクローニングした。得られたwtGFP(1-229)-TlpA-N(94-257)とTlpA-N(94-257)のN末端側をそれぞれ制限酵素EcoRIとHindIII、BamHIとEcoRIで処理し、あらかじめBamHIとHindIIIで処理したpET23a(+)ベクターにライゲーションし、大腸菌DH5αに導入してサブクローニングすることでpET23a-wtGFP-TWIXプラスミドを得た。図23に、pET23a-wtGFP-TWIXプラスミドの作成工程及び構成図を示す。
Infect Immun., 69, 2612-2620, (2001))からそれぞれPCR法を用いて増幅させた。プライマーはwtGFP(1-229)の増幅にはGFP1-5’_EcoRI(配列番号4)とGFP229-3’_SpeI(配列番号5)、TlpA(94-257)の増幅にはN末端側,C末端側にそれぞれTlpA94-5’_BamHI(配列番号6)とTlpA257-3’_EcoRI(配列番号7)、TlpA94-5’_SpeI(配列番号8)とTlpA257-3’_HindIII(配列番号9)を用いた。酵素はPfuUltra DNA Polymeraseを使用し、反応条件等は付属のマニュアルに従った。得られた断片はpBluescript II SK(-)_EcoRV digestベクターにライゲーションし大腸菌DH5αに導入することによりサブクローニングした。このうちwtGFP(1-229)とTlpA-N(94-257)のC末端側については、それぞれ制限酵素EcoRIとSpeI、SpeIとHindIIIで処理し、それらをEcoRIとHindIIIで処理したpBluescript II SK(-)ベクターにライゲーションし大腸菌DH5αに導入してサブクローニングした。得られたwtGFP(1-229)-TlpA-N(94-257)とTlpA-N(94-257)のN末端側をそれぞれ制限酵素EcoRIとHindIII、BamHIとEcoRIで処理し、あらかじめBamHIとHindIIIで処理したpET23a(+)ベクターにライゲーションし、大腸菌DH5αに導入してサブクローニングすることでpET23a-wtGFP-TWIXプラスミドを得た。図23に、pET23a-wtGFP-TWIXプラスミドの作成工程及び構成図を示す。
<3.pET23b-wtGFP大腸菌発現プラスミドの構築> wtGFP(1-229)は上記<1>のpwtGFP-C1プラスミドからPCR法を用いて増幅させた。プライマーはGFP1-5’_BamHI(配列番号10)とGFP229-3’_EcoRI(配列番号11)を用いた。酵素はPfuUltra DNA Polymeraseを使用し、反応条件等はマニュアルに従った。得られた断片は共にpBluescript II SK(-)_EcoRV digestベクターにライゲーションし大腸菌DH5αに導入することによりサブクローニングした。これを制限酵素BamHIとEcoRIで処理し、あらかじめBamHIとEcoRIで処理したpET23a(+)ベクターにライゲーションし、大腸菌DH5αに導入してサブクローニングすることでpET23b-wtGFPプラスミドを得た。図24に、pET23b-wtGFPプラスミドの作成工程及び構成図を示す。
<4.pCI-wtGFP-TWIX哺乳類細胞発現プラスミドの構築> TlpA(94-257)のN末端側とGFP(1-229)-TlpA(94-257)は、上記<2>のpET23a-TWIXプラスミドからPCR法を用いて増幅させた。プライマーはそれぞれTlpa94-5’_NheI(配列番号12)とTlpA257-3’_EcoRI(配列番号7)、GFP1-5’_EcoRI(配列番号4)とTlpA257-3’_XhoI(配列番号13)を用いた。酵素はPfuUltra DNA Polymeraseを使用し、反応条件等はマニュアルに従った。得られた断片はpBluescript II SK(-)_EcoRV digestベクターにライゲーションし大腸菌DH5αに導入することによりサブクローニングした。それらをそれぞれ制限酵素NheIとEcoRI、EcoRIとXhoIで処理し、あらかじめNheIとXhoIで処理したpCI-neoベクターにライゲーションし、大腸菌DH5αに導入してサブクローニングすることでpCI-wtGFP-TWIXプラスミドを得た。図25に、pCI-wtGFP-TWIXプラスミドの作成工程及び構成図を示す。
<5.pCI-wtGFP-TWIX-F哺乳類細胞発現プラスミドの構築> 細胞膜への移行シグナルとしてはc-Ha-Rasのファルネシル化シグナル(FC)であるCAAX boxを利用した(参考文献;Aronheim, A. et al., Cell, 78, 949-961,
(1994))。ファルネシル化シグナルは、PCR法を用いて付加・増幅させた。まず上記<2>でpET23a-TWIXプラスミドを構築する際に用いたTlpA(94-257)のC末端断片(pBluescript II SK(-)に導入)を鋳型としてPCR反応を行った。プライマーはTlpA94-5’_SpeI(配列番号8)とTlpA257-3’_CAAX1(配列番号14)を用いた。酵素はSTRATAGENE社のPfu Turbo DNA Polymeraseを用い、反応液の組成や反応条件はマニュアルに従った。さらにこのPCR産物を鋳型としてPCR反応を行った。プライマーはTlpA94-5’_SpeI(配列番号8)とTlpA257-3’_CAAX2(配列番号15)を用いた。酵素はClontech社のBD Advantage2 PCR Kitを使用し、反応液の組成や反応条件等はマニュアルに従った。得られた断片はPromega社のpGEM-T-easyベクターにライゲーションし大腸菌DH5αに導入することによりサブクローニングした。これを制限酵素SpeIとXhoIで処理し断片を得た。またTlpA(94-257)-GFP(1-229)断片を、pCI-TWIXプラスミドを制限酵素SacIとSpeIで処理することで得た。これらの断片を、あらかじめSacIとXhoIで処理したpCI-TWIXプラスミドにライゲーションし、大腸菌DH5αに導入してサブクローニングすることでpCI-wtGFP-TWIX-Fプラスミドを得た。図26に、pCI-wtGFP-TWIX-Fプラスミドの作成工程及び構成図を示す。
(1994))。ファルネシル化シグナルは、PCR法を用いて付加・増幅させた。まず上記<2>でpET23a-TWIXプラスミドを構築する際に用いたTlpA(94-257)のC末端断片(pBluescript II SK(-)に導入)を鋳型としてPCR反応を行った。プライマーはTlpA94-5’_SpeI(配列番号8)とTlpA257-3’_CAAX1(配列番号14)を用いた。酵素はSTRATAGENE社のPfu Turbo DNA Polymeraseを用い、反応液の組成や反応条件はマニュアルに従った。さらにこのPCR産物を鋳型としてPCR反応を行った。プライマーはTlpA94-5’_SpeI(配列番号8)とTlpA257-3’_CAAX2(配列番号15)を用いた。酵素はClontech社のBD Advantage2 PCR Kitを使用し、反応液の組成や反応条件等はマニュアルに従った。得られた断片はPromega社のpGEM-T-easyベクターにライゲーションし大腸菌DH5αに導入することによりサブクローニングした。これを制限酵素SpeIとXhoIで処理し断片を得た。またTlpA(94-257)-GFP(1-229)断片を、pCI-TWIXプラスミドを制限酵素SacIとSpeIで処理することで得た。これらの断片を、あらかじめSacIとXhoIで処理したpCI-TWIXプラスミドにライゲーションし、大腸菌DH5αに導入してサブクローニングすることでpCI-wtGFP-TWIX-Fプラスミドを得た。図26に、pCI-wtGFP-TWIX-Fプラスミドの作成工程及び構成図を示す。
<6.pCI-wtGFP-F哺乳類細胞発現プラスミドの構築> ファルネシル化シグナルは、PCR法を用いて付加・増幅させた。まず<1>のpwtGFP-C1プラスミドを鋳型としてPCR反応を行った。プライマーはGFP1-5’_EcoRI-2(配列番号16)とGFP229-3’_CAAX1(配列番号17)を用いた。酵素はPfu Turbo DNA Polymeraseを用い、反応液の組成や反応条件はマニュアルに従った。さらにこのPCR産物を鋳型としてPCR反応を行った。プライマーはGFP1-5’_EcoRI(配列番号16)とGFP229-3’_CAAX2(配列番号18)を用いた。酵素はAdvantage2 PCR Kitを使用し、反応液の組成や反応条件等はマニュアルに従った。得られた断片はpGEM-T-easyベクターにライゲーションし大腸菌DH5αに導入することによりサブクローニングした。これを制限酵素EcoRIとNotIで処理し、あらかじめ制限酵素EcoRIとNotIで処理したpCI-neoにライゲーションし、大腸菌DH5αに導入してサブクローニングすることでpCI-wtGFP-Fプラスミドを得た。図27に、pCI-wtGFP-Fプラスミドの作成工程及び構成図を示す。
<7.pCI-wtGFP-TWIX-Mito哺乳類動物発現プラスミドの構築> ミトコンドリアへの移行は、ヒトシトクロムc酸化酵素サブユニットVIIIのミトコンドリア移行シグナルを用いた。移行シグナル断片はオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることで作成した。まずオリゴヌクレオチドMito1(+)(配列番号19)、Mito1(−)(配列番号20)、Mito2(+)(配列番号21)、Mito2(−)(配列番号22)、Mito3(+)(配列番号23)、Mito3(−)(配列番号24)をリン酸化した。酵素はTOYOBO社製のT4 Polynucleotide Kinaseを用い、反応はそのマニュアルに従った。その後、6つのオリゴヌクレオチドを全て混ぜ合わせ、100℃で1分間加熱し、その場で放冷した。得られたミトコンドリア移行シグナル断片を、あらかじめ制限酵素NheIで処理していたpCI-wtGFP-TWIXとライゲーションし、大腸菌DH5αに導入してサブクローニングすることでpCI-wtGFP-TWIX-Mitoを得た。図28に、pCI-wtGFP-TWIX-Mitoの作成工程及び構成図を示す。
<8.pCI-ECFP/EYFP-TWIX哺乳類動物発現プラスミドの構築> ECFP(1-229)、EYFP(1-229)は、それぞれpECFP−N1、pEYFP-N1からPCR法を用いて増幅させた。プライマーはGFP(1-229)の増幅にはGFP1-5’_EcoRI(配列番号4)とGFP229-3’_SpeI(配列番号5)を用いた。酵素はPfu Turbo DNA Polymeraseを用い、反応条件等は付属のマニュアルに従った。得られた断片はpBluescript II SK(−)_EcoRV digestベクターにライゲーションし大腸菌DH5αに導入することによりサブクローニングした。これをそれぞれ制限酵素EcoRIとSpeIで処理し、ECFP(1-229)、EYFP(1-229)を得た。またN末端側のTlpA(94-257)はpCI-wtGFP-TWIXを制限酵素SacIとEcoRIで処理することで、C末端側のTlpA(94-257)はpCI-wtGFP-TWIXを制限酵素SpeIとXhoIで処理することそれぞれ得た。これらの断片をあらかじめSacIとXhoIで処理したpCI-neoベクターとライゲーションして、大腸菌DH5αに導入してサブクローニングすることでpCI-ECFP-TWIX、pCI-EYFP-TWIXを得た。図29にpCI-ECFP-TWIX、図30にpCI-EYFP-TWIXの作成工程及び構成図をそれぞれ示す。
<9.温度感応タンパク質の発現・回収・精製> 大腸菌発現プラスミドを大腸菌BL21に形質転換した。得られたシングルコロニーは抗生物質として100μg/mLアンピシリンを含むLB培地5mLに懸濁し37℃で8時間培養し、さらに抗生物質を含むLB培地200mLに加えてOD600が約0.3になるまで37℃で培養した。得られた懸濁液にタンパク質発現誘導剤であるIPTGを0.1mMになるように加えて、14℃で16時間培養した。発現誘導後、菌体を回収してPhosphate−Buffer Saline(PBS:137mM NaCl,8.1mM Na2HPO4,2.68mM KCl,1.47mM KH2PO4)で洗浄した後、超音波で破砕し、可溶画分と不溶画分に分離した。可溶画分はHisタグを用いて精製した。精製法はNovagen社のHis Bind Kitのマニュアルに従った。不溶画分は2%Triton-PBSで処理した後Urea Lysis Buffer(4M Urea,0.5M NaCl,PBS)で可溶化し、透析でUreaを除去することで精製した。発現の確認は、PIERCE社のBCA Protein Assay Reagentで濃度を見積もった後、SDS−PAGEでタンパク質を分離し、クマシー染色することにより行った。
<10.蛍光励起スペクトル測定> 測定にはHitachi社の分光蛍光光度計F-4500を用いた。タンパク質の温度は加熱した水をセルホルダーに灌流させることでコントロールした。タンパク質溶液はPBSを用いて希釈した後、セルホルダー内で設定した温度まで灌流液で加熱もしくは冷却し、設定温度になってからもさらに3分間インキュベートした。wtGFP-TWIXの測定においては、まず励起波長を380nmに設定し、400〜650nm間の蛍光スペクトルを測定した。次に蛍光波長を得られた蛍光スペクトルのピーク値に設定し、温度を20℃から50℃に設定したときの300〜495nm間の励起スペクトルを測定した。得られたスペクトルから400nmと480nmのピークのレシオ値を計算し、温度に対して評価した。タンパク質の温度は加熱した水をセルホルダーに灌流させることでコントロールした。
pHの調整にはHCl、NaOHを用いた。また酸化剤と還元剤としてはそれぞれH2O2とDTTを用いた。これらの試薬を加えた後、25℃におけるレシオ値を評価した。Mg2+、Ca2+にはそれぞれMgCl2、CaCl2を用いた。これらの試薬を加えた後、20℃から50℃に設定したときの300〜490nm間の励起スペクトルを測定した。得られたスペクトルから400nmと480nmのピークのレシオ値を計算し、温度に対して評価した。
ECFP-TWIXとEYFP-TWIXにおいては、ヘテロダイマーにするために測定前に等量混合し、ブロックインキュベータで10分間加熱し、その後氷浴で冷却した。測定時には、まず蛍光波長を527nmに設定し、300〜450nm間の励起スペクトルを測定した。次に励起波長を得られた励起スペクトルの最小値に設定し、温度が20℃から50℃に設定したときの440〜590nm間の蛍光スペクトルを測定した。得られたスペクトルから527nmのピークを温度に対して評価した。
<11.円二色性スペクトルの測定> 測定にはJASCO社のJ-725 CD spectrometerを用いた。タンパク質溶液はPBSを用いて希釈した後、セルホルダー内で設定した温度まで灌流液で加熱もしくは冷却し、設定温度になってからもさらに3分間インキュベートした。タンパク質の温度はペルチェ式恒温槽でコントロールした。スペクトルは、温度が20℃から50℃に設定したときの190〜250nm間を測定し、積算回数は4回とした。得られたモル楕円率から、α−へリックス性を示すθ222の値を温度に対して評価した。
タンパク質の温度はペルチェ式恒温槽でコントロールした。
タンパク質の温度はペルチェ式恒温槽でコントロールした。
<12.細胞培養及びcDNA発現> HEK293細胞及びHeLa細胞は10%FBS、30units/mLペニシリン、30mg/mL硫酸スプレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。形質導入にはQiagen社のSuperfectを使用した。方法は付属のマニュアルに従った。形質導入の24時間後に、細胞をトリプシン/EDTAで剥がして、あらかじめpoly−L−Lysineでコートしたガラスプレートもしくはガラスボトムディッシュに撒きなおした。蛍光測定は撒きなおしてから6〜12時間後に行った。
発現確認にはOLYMPUS社の共焦点レーザ走査型顕微鏡FLUOVIEWを用いた。ミトコンドリアのマーカーとしてはMolecular Probes社のMitoTracker(登録商標名) Orange CMTMRosを用いた。細胞の張り付いたガラスボトムディッシュの培地中に、25nMのMitoTrackerを加え37℃で10分間インキュベートすることでミトコンドリアを染色した。
<13.細胞内蛍光強度測定> ガラスプレートに貼り付いた細胞の試料は顕微鏡ステージの灌流チャンバー上に置いて蛍光強度を測定した。温度は電熱線により灌流液を加熱することで制御した。図31に、上記実施形態における細胞内蛍光強度測定に用いた測定装置の概略図を示す。細胞外液(灌流液)には2mM Ca2+−HBS(107mM NaCl,6mM KCl,11.5mM Glucose,20mM HEPES,2mM CaCl2,1.2mM MgSO4,pH7.4)を用いた。細胞の蛍光イメージはMolecular Device社のMetaMorphイメージングシステムで解析した。任意の温度において「Multipul Wavelength」という方法で個々の細胞について380nmと480nmの励起光を照射したときの510nmの蛍光画像を撮影した。その値を元に、蛍光強度比(レシオ値)(Ratio(ex380/ex480))を算出し、温度に対してプロットすることで評価した。
<14.脱共役剤によるミトコンドリアでの熱産生測定> CCCP(Carbonyl cyanide m−chloro phenyl hydrazone)とRotenoneはSigma社から購入したものを使用した。これらの試薬は100mMずつDNSOに溶解させ、ストック溶液とした。測定はガラスプレートに貼り付いた細胞を顕微鏡ステージの灌流チャンバ上に置いて蛍光強度を測定した。灌流液は2mM Ca2+−HBS(107mM NaCl,6mM KCl,11.5mM Glucose,20mM HEPES,2mM CaCl2,1.2mM MgSO4,pH7.4)を用いた。灌流液の温度は電熱線により加熱することで制御した。ミトコンドリア脱共役剤や複合体I阻害剤は灌流液に溶解させて細胞に処置した。細胞の蛍光イメージはHamamatsu Photonics社のEM−CCDカメラC9100で撮影し、Molecular Device社のMetaFluorイメージングシステムで解析した。個々の細胞について380nmと480nmの励起光を照射したときの510nmの蛍光強度を測定した。その蛍光強度比(レシオ値))(Ratio(ex380/ex480))を算出し、時間に対してプロットすることで評価した。
本発明は、斬新な温度感応タンパク質を提供し、この温度感応タンパク質を生体内温度センサとして細胞に形質発現させることができるものであるため、従来は不可能であった動物細胞も含めた細胞内の局所的な温度計測方法及び温度計測装置として利用することができる。また、特に細胞内のミトコンドリアをターゲットにしてもこの温度感応タンパク質を導入・発現できることから、ミトコンドリア又は細胞自体に対する試薬の安全性確認試験にも利用可能である。
Claims (20)
- 温度変化に伴って構造変化を生じる温度感受性領域と、当該温度感受性領域を複数結合させ当該温度感受性領域の構造変化に起因して所定のシグナルを呈するシグナル領域と、を含有して構成されることを特徴とする温度感応タンパク質。
- 前記温度感受性領域と前記シグナル領域は、ペプチド鎖からなるものである請求項1に記載の温度感応タンパク質。
- 前記温度感受性領域は、主として所定の温度領域を境にした温度変化に伴って二量体と単量体との間を可逆的に相互変化するコイルドコイルタンパク質を含み、前記シグナル領域は、相互に近接又は離間することにより前記所定のシグナルを呈するペプチド鎖を含む請求項2に記載の温度感応タンパク質。
- 前記シグナル領域に、少なくとも2以上の温度感受性領域が結合する請求項2又は3に記載の温度感応タンパク質。
- 前記シグナル領域を構成するペプチド鎖のN末端とC末端とにそれぞれ温度感受性領域が少なくとも1つ結合する請求項4に記載の温度感応タンパク質。
- 前記シグナル領域が呈する前記所定のシグナルは、酵素反応又は蛍光反応によるシグナルである請求項2乃至5の何れかに記載の温度感応タンパク質。
- 前記シグナル領域には、蛍光タンパク質を適用している請求項2乃至5の何れかに記載の温度感応タンパク質。
- 前記蛍光タンパク質は、C末端側のDNA結合部位を除去したものである請求項7に記載の温度感応タンパク質。
- 前記温度感受性領域には、サルモネラ菌由来のコイルドコイルタンパク質であるTlpAの温度感受性部位を適用している請求項2乃至8の何れかに記載の温度感応タンパク質。
- 配列番号1に記載のアミノ酸配列、又は配列番号1に記載のアミノ酸配列の一部領域が欠失、置換若しくは付加した配列からなり、中央部に前記シグナル領域としてC末端側を除去した蛍光タンパク質であるGFPを配し、当該GFPのN末端及びC末端にそれぞれ前記温度感受性領域としてサルモネラ菌由来のコイルドコイルタンパク質であるTlpAの温度感受性部位を配している請求項3に記載の温度感応タンパク質。
- 請求項1乃至10の何れかに記載の温度感応タンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。
- 温度感応タンパク質を発現するプラスミドであって、請求項1乃至10の何れかに記載の温度感応タンパク質をコードする塩基配列を含有することを特徴とする温度感応タンパク質発現プラスミド。
- 前記温度感応タンパク質発現プラスミドにおいて、細胞膜移行シグナルをコードする塩基配列をさらに含有する請求項12に記載の温度感応タンパク質発現プラスミド。
- 前記温度感応タンパク質発現プラスミドにおいて、細胞小器官移行シグナルをコードする塩基配列をさらに含有する請求項12に記載の温度感応タンパク質発現プラスミド。
- 前記細胞小器官移行シグナルは、ミトコンドリア移行シグナルである請求項14に記載の温度感応タンパク質発現プラスミド。
- 請求項12乃至15の何れかに記載の温度感応タンパク質発現プラスミドを形質導入してなることを特徴とする温度感応タンパク質発現細胞。
- 前記温度感応タンパク質発現プラスミドを形質導入される細胞は、動物細胞である請求項16に記載の温度感応タンパク質発現細胞。
- 請求項16又は17の何れかに記載の温度感応タンパク質発現細胞において呈せられる前記温度感応タンパク質のシグナル領域に起因する前記所定のシグナルを計測する工程と、この計測されたシグナルを解析することにより前記細胞の温度を判断する工程と、を含む温度感応タンパク質を利用した細胞の温度計測方法。
- 請求項12乃至15の何れかに記載の温度感応タンパク質発現プラスミドを形質導入してなる温度感応タンパク質発現細胞において呈せられる前記温度感応タンパク質のシグナル領域に起因する前記所定のシグナルを計測する工程と、この計測されたシグナルを解析することにより前記細胞の局所的な温度を判断する工程と、を含む温度感応タンパク質を利用した細胞の温度計測方法。
- 請求項15に記載の温度感応タンパク質発現プラスミドを形質導入してなる温度感応タンパク質発現細胞に試薬を添加する工程と、前記細胞内のミトコンドリアにおいて呈せられる前記温度感応タンパク質のシグナル領域に起因する前記所定のシグナルを計測する工程と、この計測されたシグナルを解析することにより前記ミトコンドリアの局所的な温度を判断する工程と、を含む温度感応タンパク質を利用したミトコンドリアに対する安全性確認試験方法。
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CN102471760B (zh) * | 2009-06-30 | 2018-04-17 | 大塚制药株式会社 | 针对甲状腺刺激激素受体的抗体的生物测定法、所述抗体的测量试剂盒、以及用于所述生物测定法或测量试剂盒中的新的遗传修饰的细胞 |
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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US20020146701A1 (en) * | 2000-05-12 | 2002-10-10 | Hamilton Andrew D. | Methods of detecting interactions between proteins, peptides or libraries thereof using fusion proteins |
JP2005512087A (ja) * | 2001-12-06 | 2005-04-28 | ニユー センチュリー フアーマシウテカルス,インコーポレイテッド | 検知及び検出デバイスに熱スイッチングタンパク質を使用する方法及び装置 |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001124768A (ja) * | 1999-05-27 | 2001-05-11 | Univ Rockefeller | 細胞の温度を求めるための蛍光ビーズ及びその使用方法 |
US20020146701A1 (en) * | 2000-05-12 | 2002-10-10 | Hamilton Andrew D. | Methods of detecting interactions between proteins, peptides or libraries thereof using fusion proteins |
JP2005512087A (ja) * | 2001-12-06 | 2005-04-28 | ニユー センチュリー フアーマシウテカルス,インコーポレイテッド | 検知及び検出デバイスに熱スイッチングタンパク質を使用する方法及び装置 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
JPN6012042489; KRYLOV, D. et al.: EMBO J. Vol.13, 1994, pp.2849-2861 * |
JPN6012042490; RAJESH, R. et al.: Biosensors Bioelectron. Vol.16, 2001, pp.1051-1057 * |
JPN6012042492; 清中茂樹: 日本化学会講演予稿集 Vol.87, No.2, 20070312, p.1306 * |
JPN6012042494; GHOSH, I. et al.: J. Am. Chem. Soc. Vol.122, 2000, pp.5658-5659 * |
JPN6012042496; HURME, R. et al.: Cell Vol.90, 1997, pp.55-64 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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