JP6473366B2 - 温度判定方法、標的ペプチドの検出方法および温度判定試薬 - Google Patents
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Description
本実施形態に係る温度判定方法は、試料の温度が所定温度まで上昇したか否かを判定する方法であって、アルブミンを含む試料と温度判定用ペプチドとを混合する工程(以下、「混合工程」ともいう)、得られた混合物を加熱する工程(以下、「加熱工程」ともいう)、混合物の光学的変化を検出する工程(以下、「光学的変化検出工程」ともいう)、および光学的変化の検出結果に基づき、混合物の温度が所定温度まで上昇したか否かを判定する工程(以下、「判定工程」ともいう)、を含む。温度判定用ペプチドとアルブミンとの結合の解離定数(Kd)が、500μM以上であり、温度判定用ペプチドは、第1標識物質と第2標識物質とを含むことを特徴とする。
本実施形態に係る標的ペプチドの検出方法(以下、単に「検出方法」ともいう)は、標的ペプチドとアルブミンとを含む試料と、温度判定用ペプチドとを混合する工程(混合工程)、混合物を加熱する工程(加熱工程)、混合物の光学的変化を検出する工程(光学的変化検出工程)、および光学的変化の検出結果に基づき、混合物の温度が所定の温度まで上昇したか否かを判定する工程(判定工程)を含む。温度判定用ペプチドは上述の通りである。判定工程において、混合物の温度が所定温度まで上昇したと判定された場合、混合物の上清を回収する工程(以下、「回収工程」ともいう)および上清中の標的ペプチドを検出する工程(以下、「標的ペプチド検出工程」ともいう)を実行する。本実施形態に係る検出方法における混合工程、加熱工程、光学的変化検出工程および判定工程は、前述の温度判定方法における混合工程、加熱工程、光学的変化検出工程および判定工程と同様である。
本実施形態に係る温度判定試薬は、上述した温度判定用ペプチドを含む。この試薬は、温度判定用ペプチドのみからなる試薬であってもよく、水などの溶媒に温度判定用ペプチドを溶解させた試薬であってもよい。また、温度判定用試薬は、ペプチドなどを安定に保持するための助剤をさらに含有していてもよい。助剤としては、緩衝液、防腐剤などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
0.1M塩化カルシウム含有0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.0)を用いて健常者の血清150μLを10倍希釈し、血清含有試料を得た。得られた血清含有試料1.5mLを水熱処理用ガラス容器に入れた。つぎに、希釈液が入った水熱処理用ガラス容器をマイクロ波合成反応装置〔マイルストーンゼネラル社製、商品名:MultiSYNTH〕にセットし、160℃の水熱処理を行なった。その後、水熱処理後の試料から上清を回収した。なお、160℃の水熱処理の温度条件を、常温(20℃)から100℃までの昇温を30秒間、100℃から160℃までの昇温を1分間の条件に設定した。
分離カラム:(財)化学物質評価研究機構製、商品名:L−column ODS(0.1×150mm)
溶出溶媒A:2体積%アセトニトリル/0.1体積%ギ酸混合溶媒
溶出溶媒B:90体積%アセトニトリル/0.1体積%ギ酸混合溶媒
流速:500nL/min
濃度勾配:表2に記載の濃度勾配
イオン化方式:Nanoflow−LC ESI
イオン化モード:Positive mode
キャピラリー電圧:1.8kV
コリジョンエネルギー:35eV
解析ソフトウェア:マトリクス・サイエンス・インク(Matrix Science,Inc.)提供、Mascot Server(In−houseでのデータベース検索)
データベース:NCBIInr
生物種:all entries(全ての生物種)
消化酵素:なし
修飾:Oxidation(M)
HSA(シグマ・アルドリッチ社製)をその濃度が1μMになるようにリン酸緩衝生理食塩水に溶解させ、A液を得た。また、HSAの397〜413位のアミノ酸からなるHSA397−413断片(配列番号:29)、テトラメチルローダミン(以下、「TMR」ともいう)標識HSA397−413断片およびHSAをそれぞれの濃度が833μM、7μMおよび1μMになるように、リン酸緩衝生理食塩水に溶解させ、B液を得た。つぎに、A液とB液とを種々の混合比で混合することにより、HSA濃度が一定で、かつHSA397−412断片濃度が異なる種々の混合液を調製した。得られた各混合液を、分光蛍光光度計〔(株)日立ハイテクノロジー製、商品名:F−7000〕に供し、励起波長:540nmで蛍光波長:580nmにおける蛍光強度(以下、「蛍光強度A」という)を測定した。
で表わされるヒルの式とを用い、HSAに対するHSA397−412断片のKdを求めた。
(1)水熱処理
表3に示される各ペプチドをTMRで標識した。
SDS−PAGE用添加緩衝液〔タカラバイオ(株)製、商品名:10×Loading Buffer〕10μLと60体積%グリセロール水溶液20μLとを混合し、試料用緩衝液を得た。得られた試料用緩衝液3μLにTMR標識ACTH(1−24)含有試料1.5μLを添加し、被験試料を得た。また、前記において、TMR標識ACTH(1−24)含有試料の代わりに、TMR標識ACTH(1−39)含有試料または各試料の水熱処理後の上清を用いたことを除き、前記と同様に、被験試料を得た。
電気泳動装置〔インビトロジェン社製、商品名:垂直型ミニ電気泳動システム〕と、泳動ゲル〔インビトロジェン社製、商品名:NuPAGE 4−12% Bis−Tris Gels、1.0mm、10ウェル〕と、ランニングバッファー〔インビトロジェン社製、商品名:NuPAGE MES SDSランニングバッファー(20×)を20倍希釈した希釈液〕とを用い、電圧:200V下で、前記実施例2(2)で得られた各被験試料のSDS−PAGEを行なった。得られた泳動ゲルを蛍光イメージャー〔バイオ−ラッド(BIO−RAD)社製、商品名:Pharos FX Molecular Imager〕に供し、TAMRA用波長(励起波長:532nm)のHigh Sample Intensityモードで泳動ゲルの蛍光像を取得した。
(1)水熱処理
TMR標識HSA237−249断片、TMR標識HSA397−413断片またはTMR標識HSA599−609断片をその濃度が5μMになるようにリン酸緩衝生理食塩水1mLに溶解させ、試料A(TMR標識HSA237−249断片含有)、試料B(TMR標識HSA397−413断片含有)または試料C(TMR標識HSA599−609断片含有)を得た。
実施例2(2)において、TMR標識ACTH(1−24)含有試料、TMR標識ACTH(1−39)含有試料または各試料の水熱処理後の上清の代わりに、試料A〜Cまたは水熱処理後の各試料を用いたことを除き、実施例2(2)と同様に被験試料を得た。
実施例2(2)において、実施例2(2)で得られた各被験試料の代わりに、実施例3(2)で得られた被験試料を用いたことを除き、実施例2(2)と同様に、SDS−PAGEの泳動ゲルの蛍光像を取得した。
(1)水熱処理
TMR標識SA21およびHSAをそれぞれの濃度が8μMおよび300μMになるようにリン酸緩衝生理食塩水1mLに溶解させ、TMR標識SA21含有試料を得た。
実施例2(2)において、TMR標識ACTH(1−24)含有試料、TMR標識ACTH(1−39)含有試料または各試料の水熱処理後の上清の代わりに、未処理のTMR標識SA21含有試料または水熱処理後のTMR標識SA21含有試料の上清を用いたことを除き、実施例2(2)と同様に、被験試料を得た。
実施例2(2)において、実施例2(2)で得られた各被験試料の代わりに、比較例1(2)で得られた被験試料を用いたことを除き、実施例3(2)と同様に、SDS−PAGEを行なった。得られた泳動ゲルを蛍光イメージャー〔バイオ−ラッド(BIO−RAD)社製、商品名:Pharos FX Molecular Imager〕に供し、TAMRA用波長(励起波長:532nm)のHigh Sample Intensityモードで泳動ゲルの蛍光像を取得した。また、得られた泳動ゲルを銀染色し、銀染色像を取得した。
(1)水熱処理
TMR標識HSA397−413断片をその濃度が5μMになるようにリン酸緩衝生理食塩水1mLに溶解させ、試料Dを得た。また、TMR標識HSA599−609断片をその濃度が5μMになるようにリン酸緩衝生理食塩水1mLに溶解させ、試料Eを得た。TMR標識HSA397−413断片およびHSAをそれぞれの濃度が5μMおよび600μMになるようにリン酸緩衝生理食塩水1mLに溶解させ、試料Fを得た。また、TMR標識HSA599−609断片およびHSAをそれぞれの濃度が5μMおよび600μMになるようにリン酸緩衝生理食塩水1mLに溶解させ、試料Gを得た。HSAをその濃度が600μMになるようにリン酸緩衝生理食塩水1mLに溶解させ、対照試料を得た。
実施例2(2)において、実施例2(2)で得られた各被験試料の代わりに、試料D〜G、対照試料または水熱処理後の各試料の上清を用いたことを除き、実施例2(2)と同様に、被験試料を得た。
実施例3(2)において、実施例3(2)で得られた各被験試料の代わりに、実施例4(2)で得られた被験試料を用いたことを除き、実施例3(2)と同様に、泳動ゲルの銀染色像および蛍光像を取得した。
(1)未処理の試料の調製
HSA397−413断片の両末端(N末端およびC末端)が標識されたDABCYL−HSA397−413断片−EDANSをその濃度が20μMになるように、100mMグリシン−塩酸緩衝液(pH2.5)6mLに溶解させ、試料Hを得た。DABCYL−HSA397−413断片−EDANSは、未開裂の状態では、DABCYLによってEDANSの蛍光が消光されるが、開裂することによってEDANSに起因して蛍光強度が上昇するように設計された。
実施例5(1)で得られた試料H 1.5mLを水熱処理用ガラス容器に入れた。つぎに、試料Hが入った水熱処理用ガラス容器をマイクロ波合成反応装置〔マイルストーンゼネラル社製、商品名:MultiSYNTH〕にセットし、表4に示される条件にしたがって80℃、120℃または160℃の水熱処理を行なった。
実施例5(1)で得られた未処理の試料Hおよび実施例5(2)で得られた水熱処理後の試料Hそれぞれを、分光蛍光光度計〔(株)日立ハイテクノロジー製、商品名:F−7000〕に供し、励起波長:335nmで蛍光波長:360〜600nmにおける蛍光スペクトルを測定した。
実施例3(1)において、試料A〜Cまたは水熱処理後の各試料の代わりに、実施例5(1)で得られた未処理の試料Hまたは実施例5(2)で得られた水熱処理後の試料Hを用いたことを除き、実施例3(1)と同様に、被験試料を得た。
実施例2(2)において、実施例2(2)で得られた各被験試料の代わりに、実施例5(4)で得られた被験試料を用いたことを除き、実施例2(2)と同様に、SDS−PAGEを行なった。泳動後のゲルに対し、トランスイルミネーター(UVP社製 型式NM−15 95−0219−03)によってUV照射して、オレンジフィルターをセットしたカメラ(Nicon社製 COOLPIX 4500)にて撮影することで励起光を排除した状態の蛍光像のみの泳動パターンを可視化した。EDANS由来の蛍光を発するバンドの位置に基づき、水熱処理によるDABCYL−HSA397−413断片−EDANSの開裂状態を確認した。実施例5において、未処理のDABCYL−HSA397−413断片−EDANSおよびDABCYL−HSA397−413断片−EDANSの水熱処理後の産物それぞれについて、SDS−PAGEを行なった後の泳動ゲルの蛍光像を図14に示した。図中、レーン1は未処理のDABCYL−HSA397−413断片−EDANSの泳動パターン、レーン2はDABCYL−HSA397−413断片−EDANSの水熱処理後の産物の泳動パターンを示した。
(1)未処理の試料の調製
実施例5(1)において、100mMグリシン−塩酸緩衝液(pH2.5)の代わりに、50μM pH11CAPS−水酸化ナトリウム緩衝液を用いたことを除き、実施例5(1)と同様に、試料Iを得た。
実施例5(2)において、実施例5(1)で得られた試料Hの代わりに、実施例6(1)で得られた試料Iを用いたことを除き、実施例5(2)と同様に、160℃の水熱処理を行なった。
実施例6(1)で得られた未処理の試料Iが入った容器および実施例6(2)で得られた水熱処理後の試料Iが入った容器のそれぞれをトランスイルミネーター(UVP社製 型式NM−15 95−0219−03)によってUV照射しながら、オレンジフィルターをセットしたカメラ(Nicon社製 COOLPIX 4500)にて撮影することで励起光を排除した状態の蛍光像を撮影した。得られた画像と、画像処理ソフトウェア〔アメリカ国立衛生研究所提供、商品名:Image J〕とを用い、DABCYL−HSA397−413断片−EDANSの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した。
(1)未処理の試料の調製
HSA397−413断片の両末端(N末端およびC末端)が標識されたMCA−HSA397−413断片−DNPをその濃度が20μMになるように、リン酸緩衝生理食塩水6mLに溶解させ、試料Jを得た。MCA−HSA397−413断片−DNPは、未開裂の状態では、MCAによってDNPの蛍光が消光されるが、開裂することによってDNPに起因して蛍光強度が上昇するように設計された。
実施例5(2)において、実施例5(1)で得られた試料Hの代わりに、実施例7(1)で得られた試料Jを用いたことを除き、実施例5(2)と同様に、160℃の水熱処理を行なった。
実施例6(3)において、未処理の試料Iが入った容器および水熱処理後の試料Iが入った容器の代わりに、実施例7(1)で得られた未処理の試料Jが入った容器および実施例7(2)で得られた水熱処理後の試料Jが入った容器を用いたことを除き、実施例6(3)と同様に、MCA−HSA397−413断片−DNPの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した。
(1)未処理の試料の調製
DABCYL−HSA397−413断片−EDANSおよびHSAをそれぞれの濃度が20μMおよび300μMになるようにリン酸緩衝生理食塩水1.5mLに溶解させ、試料Kを得た。
実施例5(2)において、実施例5(1)で得られた試料Hの代わりに、実施例8(1)で得られた試料Kを用いたことを除き、実施例5(2)と同様に、160℃の水熱処理を行なった。
実施例6(3)において、未処理の試料Iが入った容器および水熱処理後の試料Iが入った容器の代わりに、実施例8(1)で得られた未処理の試料Kが入った容器および実施例8(2)で得られた水熱処理後の試料Kが入った容器を用いたことを除き、実施例6(3)と同様に、DABCYL−HSA397−413断片−EDANSおよびHSAの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した。
(1)未処理の試料の調製
DABCYL−HSA397−413断片−EDANSが濃度60μM、全血〔プロメドクス(PROMEDDX)社製、商品名:EDTA Whole bload(女性20歳)〕が5倍希釈濃度、グリシンが濃度1Mとなるよう3mLに調製し、試料Lを得た。
実施例5(2)において、実施例5(1)で得られた試料Hの代わりに、実施例9(1)で得られた試料Lを用いたことを除き、実施例5(2)と同様に、160℃の水熱処理を行なった。
未処理の試料Lおよび水熱処理後の試料Lを15000×gで3分間の遠心分離に供した。得られた上清が入った容器を可視光下に撮影した。また、得られた上清が入った容器を、トランスイルミネーター(UVP社製 型式NM−15 95−0219−03)によってUV照射しながらオレンジフィルターを介してカメラ(ニコン社製 COOLPIX 4500)によって撮影した。UV照射下に撮影した画像と、画像処理ソフトウェア〔アメリカ国立衛生研究所提供、商品名:Image J〕とを用い、DABCYL−HSA397−413断片−EDANSの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した。
(1)未処理の試料の調製
DABCYL−HSA397−413断片−EDANSおよびTMR−SA21をそれぞれの濃度が200μMおよび20μMとなるように0.1倍リン酸緩衝生理食塩水に溶解させた。得られた溶液750μLと、健常な女性(22歳)から得た血清〔プロメドクス(PROMEDDX)社製、商品名:Normal Serum Pool〕300μLとを混合した。得られた血清含有溶液1050μLに2Mグリシン溶液375μLとリン酸緩衝生理食塩水75μLとを添加し、試料Mを得た。
実施例5(2)において、実施例5(1)で得られた試料Hの代わりに、実施例9(1)で得られた試料Mを用いたことを除き、実施例5(2)と同様に、160℃の水熱処理を行なった。
未処理の試料Mが入った容器および水熱処理後の試料Mが入った容器それぞれを可視光下に撮影した。その結果、容器の壁面に不溶性画分が付着していることが確認された。また、不溶性画分は、TMR由来の赤色を呈していることが確認された。また、得られた画像から、画像処理ソフト〔アドビ(Adobe)社製、商品名:Photoshop〕を用いてレッドチャンネルのみのデータ画像を取得した。得られたレッドチャンネルのみのデータ画像と、画像処理ソフトウェア〔アメリカ国立衛生研究所提供、商品名:Image J〕とを用い、DABCYL−HSA397−413断片−EDANSの開裂に起因する蛍光の強度を濃淡値として数値化した。
配列番号:2は、β−アミロイド(1−42)断片の配列である。
配列番号:3は、RSA21の配列である。
配列番号:4は、グルカゴン(1−29)の配列である。
配列番号:5は、ACTH(7−11)の配列である。
配列番号:6は、(Lys)10の配列である。
配列番号:7は、キニノゲンの配列である。
配列番号:8は、C3f(16アミノ酸残基)の配列である。
配列番号:9は、SA21の配列である。
配列番号:10は、ACTH(2−16)の配列である。
配列番号:11は、(His)3の配列である。
配列番号:12は、フィブリノゲンαの配列である。
配列番号:13は、lqpの配列である。
配列番号:14は、ACTH(1−24)の配列である。
配列番号:15は、血液凝固第XIII因子の配列である。
配列番号:16は、ACTH(1−39)の配列である。
配列番号:17は、ACTH(1−41)の配列である。
配列番号:18は、(Glu)10の配列である。
配列番号:19は、ダイノルフィンAの配列である。
配列番号:20は、(Gly)10の配列である。
配列番号:21は、(Arg)10の配列である。
配列番号:22は、Cp6の配列である。
配列番号:23は、C4aの配列である。
配列番号:24は、BNPの配列である。
配列番号:25は、ブラジキニンの配列である。
配列番号:26は、HSA237−249断片の配列である。
配列番号:27は、C3f(8アミノ酸残基)の配列である。
配列番号:28は、ITIH4の配列である。
配列番号:29は、HSA397−413断片の配列である。
配列番号:30は、HSA599−609断片の配列である。
配列番号:31は、C−ペプチドの配列である。
配列番号:32は、コリスチンの配列である。4位のXaaは、6−メチル−1−オキソオクチル−Dbuまたは6−メチル−1−オキソヘプチル−Dbuである。3位、4位、5位、8位および9位のXaaは、Dbuである。4位のXaaと10位のThrは結合して環を形成する。6位のLeuはD−ロイシンである。10位のThrは末端ではない。
Claims (16)
- 試料の温度が所定温度まで上昇したか否かを判定する方法であって、
アルブミンを含む試料と温度判定用ペプチドとを混合する工程、
得られた混合物を加熱する工程、
前記混合物の光学的変化を検出する工程、および
前記光学的変化の検出結果に基づき、前記混合物の温度が前記所定温度まで上昇したか否かを判定する工程、
を含み、
前記温度判定用ペプチドとアルブミンとの結合の解離定数(Kd)が、500μM以上であり、
前記温度判定用ペプチドは、第1標識物質と第2標識物質とを含むともに、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、セリン残基、グリシン残基、ロイシン残基、アラニン残基、プロリン残基およびリジン残基からなる群より選ばれた少なくとも1種のアミノ酸残基を含み、かつ前記第1標識物質と前記第2標識物質との間の位置に前記アミノ酸残基を含んでいる、
温度判定方法。 - 前記試料が、全血、血清または血漿である、請求項1に記載の方法。
- 前記温度判定用ペプチドが、配列番号:16〜32のいずれかに示されたアミノ酸配列を有する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記光学的変化が、前記温度判定用ペプチドに起因する光学的シグナルの波長の変化である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記光学的シグナルの波長の変化が、蛍光の発生である、請求項4に記載の方法。
- 前記第1標識物質が、蛍光物質であり、前記第2標識物質が、前記蛍光物質から生じる蛍光を消光するクエンチャーである、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記第1標識物質が、5−((2−アミノエチル)アミノ)ナフタレン−1−スルホン酸または7−メトキシクマリン−4−酢酸であり、前記第2標識物質が4−[4−(ジメチルアミノ)フェニルアゾ]安息香酸または2,4−ジニトロフェノールである、請求項6に記載の方法。
- 前記判定工程において、前記検出された光学的シグナルの強度が所定の閾値以上である場合は前記混合物の温度が前記所定温度まで上昇したと判定し、
前記判定工程において、前記検出された光学的シグナルの強度が所定の閾値未満である場合は前記混合物の温度が前記所定温度まで上昇していないと判定する、請求項4〜7のいずれかに記載の方法。 - 前記所定温度が120〜250℃である、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 標的ペプチドとアルブミンとを含む試料と、温度判定用ペプチドとを混合する工程、
得られた混合物を加熱する工程、
前記混合物の加熱前後の光学的変化を検出する工程、および
前記光学的変化の検出結果に基づき、前記混合物の温度が所定温度まで上昇したか否かを判定する工程を含み、
前記温度判定用ペプチドとアルブミンとの結合の解離定数(Kd)が、500μM以上であり、
前記温度判定用ペプチドは、第1標識物質および第2標識物質を含むともに、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、セリン残基、グリシン残基、ロイシン残基、アラニン残基、プロリン残基およびリジン残基からなる群より選ばれた少なくとも1種のアミノ酸残基を含み、かつ前記第1標識物質と前記第2標識物質との間の位置に前記アミノ酸残基を含んでいる、
前記判定工程において、前記混合物の温度が前記所定温度まで上昇したと判定された場合、前記混合物の上清を回収する工程および上清中の標的ペプチドを検出する工程を実行する、
標的ペプチドの検出方法。 - 前記判定工程において、前記混合物の温度が前記所定温度まで上昇したと判定されなかった場合、前記回収工程および前記標的ペプチド検出工程を実行しない、請求項10に記載の方法。
- 前記光学的変化が、前記温度判定用ペプチドに起因する光学的シグナルの波長の変化である、請求項10または11に記載の方法。
- 前記光学的シグナルの波長の変化が、蛍光の発生である、請求項12のいずれかに記載の方法。
- 前記光学的変化検出工程において、前記混合物の上清の蛍光が検出され、
前記上清の蛍光が、前記温度判定用ペプチドに含まれる標識物質に基づく蛍光であり、
前記判定工程において、前記上清の蛍光の強度が所定の閾値以上である場合は前記混合物の温度が前記所定温度まで上昇したと判定し、
前記判定工程において、前記上清の蛍光の強度が所定の閾値未満である場合は前記混合物の温度が前記所定温度まで上昇していないと判定する、請求項13に記載の方法。 - 前記混合工程において、前記試料と前記温度判定用ペプチドとに加え、蛍光物質を含む相分配判定用ペプチドをさらに混合し、
前記相分配判定用ペプチドとアルブミンとの結合の解離定数(Kd)が、500μM未満であり、
前記判定工程において、前記混合物中に前記相分配判定用ペプチドの蛍光物質に基づく蛍光を生じる析出物が検出され、前記析出物から生じる蛍光の強度が所定の閾値以上である場合は、前記アルブミンが自己会合体を形成し、前記標的ペプチドが前記上清に存在すると判定する、請求項14に記載の方法。 - 溶液が所定温度まで上昇したか否かを判定するための試薬であって、
前記試薬は、温度判定用ペプチドを含み、
前記温度判定用ペプチドとアルブミンとの結合の解離定数(Kd)が、500μM以上であり、
前記温度判定用ペプチドは、第1標識物質と第2標識物質とを含む、
温度判定試薬。
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