KR101957979B1

KR101957979B1 - 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법

Info

Publication number: KR101957979B1
Application number: KR1020170076403A
Authority: KR
Inventors: 성백린; 김정민
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2017-06-16
Filing date: 2017-06-16
Publication date: 2019-03-13
Also published as: KR20180137148A

Abstract

본 발명은 진핵 세포의 번역 시스템을 이용한 목적 단백질의 고효율 형광 표지방법에 관한 것이다. 본 발명은 정제된 메티오닌, 및 적어도 1개 이상의 유리 카르복시기를 포함하는 형광 염료 등을 사용한 세포 배양을 통해서, 진핵 세포의 번역 시스템을 이용하여, 목적 단백질의 합성과 함께 부위 특이적인 고효율 형광표지 효과를 제공한다. 또한, 본 발명은 메티오닌 흡광도를 이용한 표준 곡선을 통해 형광 메티오닌의 정량화를 가능하게 하였고, 바이오틴이 결합된 형광 염료를 이용함으로써 FRET 분석을 위한 고정화 과정을 단순화시키고, 형광 표지 효율을 현저하게 향상시켰는바, 본 발명은 FRET 기술을 이용한 목적 단백질의 구조 분석 과, 단일 생체분자(아미노산 및 단백질) 응용을 위한 생명공학, 화학, 전기, 물리, 의약학 등이 결합된 식품, 인체, 환경 유해인자 검출 및 바이오나노 분야 등에 폭넓게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법 {Regionally selective high-efficiency fluorescent tagging method of a single protein}

본 발명은 진핵 세포의 번역 시스템을 이용한 목적 단백질의 고효율 형광 표지방법에 관한 것이다.

진핵 세포 내에서 단백질 합성을 위한 단백질 번역 기작을 통한 목적 단백질의 특정 부위에 광학 또는 형광 소재 표지자를 선택적으로 도입하는 것은, 단일 분자(single molecule) 연구를 위한 천연 구조의 단백질 연구를 강화할 뿐만 아니라, 세포 기능 분석에 기반한 생체 분자에 대한 연구의 효율을 향상시킴에 크게 기여한다. 형광은 광원의 한 종류로서 들뜬 분자의 물리적 현상에 의해서 나오는 빛으로 화학과 생물학 연구, 빛 에너지 전환, 분자로 조립된 미래의 광분자 소자 개발등의 아주 다양한 분야에서 중요하게 활용되고 있다.

단일 분자 형광 공명 에너지 전달 (single molecule FRET) 기술은 이러한 연구의 수행에 앞서서, 목적 단백질의 특정의 선택적인 위치에 형광 표지가 이루어질 것을 필수적 조건으로 요구하고 있다. 따라서, 광범위하게 적용할 수 있는 천연 구조를 유지하는 수용성 목적 단백질, 즉, 목적 단백질 내 부위 선택적인 지역의 고효율 형광 표지를 위한 단백질 공학의 필요성 요구가 증가되어진다.

FRET (fluorescence resonance energy transfer) 분석은, 접힘 구조를 지닌 단백질의 구조 변화 및 이에 따른 기능 변화를 연구하는데 강력한 도구로 이용되고 있으며, 매우 손쉬운 형광 검출을 통해 단백질의 구조 변화를 모니터링 하는데 유용하다, 또한, FRET 분석은 전역 또는 하위 도메인 구조 변화에 대한 거리 의존성이 높은 경우에 특히 효과적이며, FRET 적용을 위한 가장 효과적인 설계는 형광 프로브 쌍이 목적 단백질의 2차 또는 3차 구조와 관련된 부위에 부착될 때 이루어진다.

부위 선택적인 형광 소재 표지를 위한 방법으로, 부위 특이적인 돌연변이 유발법, 천연 시스테인 잔기 의존적 방법, 및 비천연 아미노산 및 클릭 화학법을 이용한 기술이 보고되어 있다 (Haran et al., 1992; Pennington, 1994; Sinev et al., 1996, 2000 DeSantis et al., 1998; Navon et al., 2001; Ortiz, 2001). 이 중에서도, 비천연 아미노산 도입 및 부위 특이적인 돌연변이 유발법은 단백질의 고유의 소수성 성질 또는 여분의 정전기적 전하의 변화에 의해, 단백질의 접힘과 같은 구조 변형 및 이에 따른 단백질의 기능 변화를 야기할 수 있다는 단점이 있다. 또한, 다중 시스테인 잔기의 제거 혹은 비특이적인 시스테인 잔기의 표지의 제거 역시 목적 단백질의 구조적 특성을 바꿀 수 있을 뿐만 아니라, 시스테인 표지 방법은 그 범위가 제한되어 있다는 문제가 있다. 이 밖에도, FRET 분석에 필요한 다중 색상 부위 특이적 단백질 표지를 수용하기 위한 시스테인/말레이 미드(malemide) 시스템이 있으나, 단량체/다량체 구조를 확인하기 위한 과정으로, 천연 단백질 샘플의 이중 부위 특이적 표지 유도를 위해 필수적인 Affinity 크로마토 그래피 실험단계 과정, 대장균 발현 시스템에서의 활성 단백질 생산 과정 요구, 및 고효율 형광효율의 수득 과정에서의 기술 재현성이 크게 떨어진다.

이러한 배경 하에서, 목적 단백질의 구조 변화를 최소화하면서, 부위 특이적으로 고효율의 형광 표지를 할 수 있는 기술에 대한 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이나 (한국 등록특허 10-1515723), 아직은 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 부위 특이적인 형광 표지 기술의 일환으로, FRET 효율을 향상시키기 위하여 예의 노력한 결과, 고해상도 크로마토 그래피 분리를 기반으로 정제된 형광표지 메티오닌, 및 적어도 1개 이상의 카르복시기를 포함하는 형광 염료를 이용하여 진핵 세포의 번역 시스템에 기반한, 목적 단백질의 양 말단에 효과적인 형광 표지가 가능함을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은, 목적 단백질의 양 말단에 부위 특이적이면서, 정량적으로 형광 표지할 수 있는, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은, 상기 방법에 의해 표지된 단백질을 이용한 형광 공명 에너지 전이 분석방법을 제공하는데 있다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 체외로 분리된 진핵 세포내에, 목적 단백질, 및 상기 목적 단백질의 C 말단에 결합되고 유리 아민기(free amine group)를 포함하는 태그를 코딩 유전자를 포함하는 벡터; 및 정제된 형광 메티오닌 또는 정제된 형광 메티오닌-진핵세포 유래의 tRNA 복합체를 도입하는 단계를 포함하며, 상기 도입하는 단계는, 적어도 1개 이상의 유리 카르복시기(free carboxyl group)를 포함하는 형광 염료가 제공되는 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 방법은, 상기 도입된 진핵 세포의 번역 시스템에 의해 부위 선택적으로 형광 표지된 목적 단백질을 합성할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 목적 단백질은, 천연적으로 코딩된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 목적 단백질의 C 말단에 결합된 태그는, 상기 형광 염료의 유리 아민기를 지닌 라이신(K)을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 정제된 형광 메티오닌은, 형광물질과 메티오닌을 반응시키고, 반응물에 대해 역상 크로마토그래피 및 크기 분리 크로마토그래피로 순차적으로 분리하여 정제한 것일 수 있고; 또는 형광이 없는 메티오닌 흡광도에 따라 작성된 표준 곡선에 적용하여, 형광 표지된 메티오닌을 함량을 정량화한 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 메티오닌은, 목적 단백질의 N-말단의 개시 메티오닌이거나, 목적 단백질 내 존재하는 메티오닌일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 상기 형광물질은, 5-카르복시플루오레세인(5-carboxyfluorescein), Dansyl, Fluorescein, Texas Red, Q dot® probes, CF633 dye, Alexa Fluor probes, ATTO dyes, Cascade Blue, Cascade Yellow, Erythrosin, Coumarin, NBD, Pacific Blue, PyMPO, Pyrene, Phycoerythrin, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7 및 NBD-Phallacidin으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고; 또는 N-하이드록시석시니마이드 에스테르(NHS ester), 이소티오시아네이트(isothiocyanates), 카르복실산(carboxylic acids) 및 술포닐 클로라이드(sulfonyl chlorides)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 반응성 유도체일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 진핵세포는, 포유동물의 세포일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 도입하는 단계는, 메티오닌 결핍 조건에서 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 적어도 1개 이상의 유리 카르복시기를 포함하는 형광 염료는, 바이오틴과 결합되어 있을 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 방법은 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 분석에 사용하기 위한 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 방법으로 표지된 목적 단백질에 광원을 조사하는 단계를 포함하는, 형광 공명 에너지 전이 분석방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 광원을 조사하는 단계 전, 기질 상에 존재하는 스트렙타비딘과 목적 단백질의 C-말단의 형광 염료와 결합되어 있는 바이오틴간 결합에 의해 고정화 (immobilization)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 체외로 분리된 진핵 세포내에, 목적 단백질, 및 상기 목적 단백질의 C 말단에 결합되고 유리 아민기(free amine group)를 포함하는, 태그를 코딩 유전자를 포함하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하며, 상기 도입하는 단계는, 적어도 1개 이상의 유리 카르복시기(free carboxyl group)를 포함하고 바이오틴과 결합되어 있는, 형광 염료가 제공되는 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 목적 단백질의 C-말단 선택적인 고효율 형광 표지방법을 제공한다.

본 발명은 정제된 메티오닌, 및 적어도 1개 이상의 유리 카르복시기를 포함하는 형광 염료 등을 사용한 세포 배양을 통해서, 진핵 세포의 번역 시스템을 이용하여, 목적 단백질의 합성과 함께 부위 특이적인 고효율 형광표지 효과를 제공한다.

또한, 본 발명은 메티오닌 흡광도를 이용한 표준 곡선을 통해 형광 메티오닌의 정량화를 가능하게 하였고, 바이오틴이 결합된 형광 염료를 이용함으로써 FRET 분석을 위한 고정화 과정을 단순화시키고, 형광 표지 효율을 현저하게 향상시켰는바, 본 발명은 FRET 기술을 이용한 목적 단백질의 구조 분석과, 단일 생체분자(아미노산 및 단백질) 응용을 위한 생명공학, 화학, 전기, 물리, 의약학 등이 결합된 식품, 인체, 환경 유해인자 검출 및 바이오나노 분야 등에 폭넓게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은, 본 발명의 형광 메티오닌 또는 형광 메티오닌-개시 tRNA 복합체를 이용한 N 말단 형광 표지화 및 본 발명의 카르복시기 및/또는 바이오틴을 포함하는 형광 염료를 이용한 C 말단 형광 표지화 기술의 도식도이다.
도 2는, 본 발명의 형광 표지화 기술에 의해 N-말단 및 C-말단이 각각 형광 표지된 HIV Tat 단백질의 개략적인 모식도이다 (다만, TAMRA-Biotin, Atto565-Biotin의 경우에는 링커 및 His 태그없이도 표지가 가능함).
도 3은, 표준 곡선에 의한 정제된 형광 표지된 L-메티오닌의 정량화 결과(209nm)이다. 아민 반응성 Cy5 단독 그래프와 L-메티오닌의 음성 대조군 피크는 각각 209nm에서 L-메티오닌(자주색)은 농도 의존적 증가 곡선인 반면, 209nm에서 Cy5 단독 그래프(파란색)은 형광농도 포화도에서도 일정한 약 0.5의 흡광도의 곡선을 일정하게 유지한다. 표준 곡선은 L-메티오닌 농도에 따른 평균 흡광도로부터 얻었으며, 정제된 형광 표지된 L-메티오닌에서 L-메티오닌을 측정하기 위해 사용되었다.
도 4는, C-말단이 TAMRA_바이오틴 복합체로 표지된 HIV Tat 단백질의 단일 분자 수준의 형광 이미지를 터프 현미경 (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope)으로 확인한 결과이다 (파란색=473nm, 녹색=532nm).
도 5는, C-말단이 5(6) Carboxyfluorescein으로 표지되고 His 태그가 부착된 HIV tat 단백질의 단일 분자 수준의 형광 이미지를 바이오틴과 His 태그간 결합에 의한 고정화 유무에 따라 터프 현미경 (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope)을 통해 확인한 결과이다 (파란색=473nm, 적색=545nm).
도 6은, C-말단이 5(6) Carboxyfluorescein으로 표지된 HIV Tat 단백질을 확인하기 위하여, 크기 분리 크로마토그래피 및 LC-MS 분석 (오른쪽 하단)을 실시한 결과이다.
도 7은, 본 발명의 표지화 기술에 따라 제조된, N-말단 및 C-말단이 각각 5-Cy5 및 ATTO 565-바이오틴 복합체로 표지된 HIV Tat 단백질(His 태그 포함)을 이용하여, 양 말단의 표지화를 NTA (nitrilotriacetic acid) 비드 분석 및 광학 또는 형광 현미경으로 확인한 결과이다.
도 8은, 본 발명의 표지화 기술에 따라 제조된, N-말단 및 C-말단이 각각 5-Cy5 및 ATTO 565-바이오틴 복합체로 표지된 HIV Tat 단백질(His 태그 포함)을 이용하여, 양 말단의 표지화를 NTA (nitrilotriacetic acid) 비드 분석 및 FACS (Fluoerscence activated cell sorting) 분석으로 확인한 결과이다.
도 9는, 본 발명의 표지화 기술에 따라 제조된, 5(6)-FAM_HIV Tat_ATTO-Biotin 단백질을 이용하여, 본 발명의 FRET pair로서 활용을 확인하기 위한 실험의 개략적인 모식도이다.
도 10은, 본 발명의 표지화 기술에 따라 제조된, N-말단 및 C-말단이 각각 5-Cy5 및 ATTO 565-바이오틴 복합체로 표지된 HIV Tat 단백질 (fold stat)을 공초점 현미경을 통해 FRET 분석을 실시한 결과이다.
도 11은, 본 발명의 표지화 기술에 따라 제조된, 5(6)-FAM_HIV Tat_ATTO-Biotin 단백질이 방출하는 적색 또는 녹색 형광의 강도를 시간의 변화 따라 확인한 결과이다.
도 12는, 본 발명의 표지화 기술에 따라 제조된, N-말단 및 C-말단이 각각 5(6)-FAM(녹색) 및 ATTO 565-바이오틴 복합체(적색)로 표지된 HIV Tat 단백질 (5(6)-FAM_HIV Tat_ATTO-Biotin)이 방출하는 형광들간 비율 (R/G ratio)을 확인한 결과이다.
도 13은, 본 발명의 표지화 기술에 따라 Hela 세포 용해물로부터 수득한, 5(6)-FAM_HIV Tat_ATTO-Biotin 단백질을 이용하여, UREA 처리 유무에 따라 방출하는 적색 또는 녹색 형광의 강도 및 형광들간 비율 (R/G ratio)을 확인한 결과이다.
도 14는, 본 발명의 표지화 기술에 따라 토끼 망상적혈구 용해물로부터 수득한, 5(6)-FAM_HIV Tat_ATTO-Biotin 단백질을 이용하여, UREA 처리 유무에 따라 방출하는 적색 또는 녹색 형광의 이미지 (FRET 분석), 강도 및 형광들간 비율 (R/G ratio)을 확인한 결과이다.
도 15는, 본 발명에서 제조한 TAMRA-Biotin 복합체를 HPCL로 정제한 후, MALDI-TOF QC 결과를 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 체외로 분리된 진핵 세포내에, 목적 단백질, 및 상기 목적 단백질의 C 말단에 결합되고 유리 아민기(free amine group)를 포함하는 태그를 코딩 유전자를 포함하는 벡터; 및 정제된 형광 메티오닌 또는 정제된 형광 메티오닌-진핵세포 유래의 tRNA 복합체를 도입하는 단계를 포함하며,

상기 도입하는 단계는, 적어도 1개 이상의 유리 카르복시기(free carboxyl group)를 포함하는 형광 염료가 제공되는 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법을 제공한다,

본 발명의 표지방법은 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 분석을 위하여 사용될 수 있다.

본 발명에 사용되는 용어, "형광 공명 에너지 전이 (fluorescence resonance energy transfer, FRET)"는 도너(Donor)와 억셉터(Acceptor) 두 개의 형광 물질 중 도너 분자의 발광 스펙트럼이 다른 억셉터 분자의 여기 스펙트럼에 해당하는 경우, 두 개의 분자가 수 나노미터(nm) 정도로 가까워지면 도너가 여기되어서 발광하는 에너지가 거리에 따라서 억셉터로 전달되어 도너는 여기 빛이 꺼지고 억셉터가 여기되어서 발광하게 되는 현상을 말한다. 이러한 FRET의 원리는 단분자 연구에서 분자간의 거리나 상호 작용을 연구하기 위해서 널리 사용되고 있으며, 이를 위해서는 도너와 억셉터, 즉, 두개의 형광 물질인 FRET pair를 목적 단백질에 표지하여야할 필요가 있다.

그러나, 현재 기술 수준에서는, 대장균 및 포유류 내 발현 과정 또는 이들의 정제 과정에서, 단백질의 구조나 활성이 변화될 수 있고, 선택된 부위에 1:1의 비율로 형광 표지되지 않으므로, 목적 단백질에 대한 FRET 효율을 저하시키는 요소로 작용하고 있는 실정이다. 본 발명은 이러한 종래의 문제점을 해소하기 위한 것으로, 고해상도 크로마토 그래피 분리를 기반으로 정제된 형광표지 메티오닌 복합체, 및 적어도 1개 이상의 카르복시기를 포함하는 형광 염료를 이용하여, 부위 선택적으로 형광 표지하여 FRET의 효율을 향상시킬 수 있다는 점에 기술적 특징이 있다.

본 발명은 형광 표지 메티오닌을 분리 정제한 후 개시 tRNA와 결합시켜 제조된 「형광물질-Met-tRNA 복합체」 및 목적 단백질의 코딩 유전자를 탑재한 벡터로 형질전환시켜 N-말단을 표지하고, 이와 동시에, 유리 카르복시기를 갖는 형광염료를 C-말단에 결합된 태그와 결합시켜 표지함으로써, 진핵 세포의 번역 시스템을 이용하여 부위 선택적으로 형광 효율을 향상시킴과 동시에, 양 말단의 표지 단계를 일원화시켰다는 점에 다른 기술적 특징이 있다.

인간 세포에서의 최적화된 조건에서 목적 단백질의 N-말단 표지화는 종래의 번역 후 과정(posttranslation)에 의한 변형으로 대장균 시스템에서는 인간 유래 단백질의 발현이 제한적인 단점을 극복한 것으로, 인간 유래 단백질을 인간세포에서 발현하여 N-말단을 100% 형광 효율로 표지화함으로써 기능적 구조적 제한 없이도 N-말단 형광 표지할 수 있다. 또한, 본 발명의 정제된 형광 메티오닌을 단독 사용하여 목적 단백질 내 연장 메티오닌의 형광 표지할 수 있다.

본 명세서 사용되는 용어, 번역 시스템은 천연 발생 아미노산을 합성하는데 필요한 성분을 지칭하는 것으로, 예컨대, 리보솜, tRNA, 합성효소, mRNA 등을 포함할 수 있다. 본 발명에서는 세포 내 번역 시스템, 더 구체적으로 진핵세포 번역 시스템을 사용한다. 세포 내 번역 시스템은 원하는 핵산 서열을 mRNA에 전사하고, mRNA를 번역할 수 있는 전세포 제제, 예컨대, 투과화된 세포 또는 세포 배양물을 포함한다.

본 발명은 목적 단백질의 메티오닌 형광 표지용 tRNA 복합체에 따른 tRNA는 개시 tRNA 또는 메티오닐 tRNA 중 어느 하나일 수 있다. 따라서, 개시 tRNA일 경우 목적 단백질의 N-말단의 개시 메티오닌을 합성하는데 사용되고, 메티오닐 tRNA는 목적 단백질 내 연장 메티오닌 합성에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 방법에 의해 표지되는 메티오닌은 목적 단백질의 N-말단의 개시 메티오닌이거나, 필요에 따라 목적 단백질 내에 존재하는 메티오닌일 수 있다.

한편, 상기 정제된 형광 메티오닌은, 형광 물질과 메티오닌을 반응시키고, 반응물에 대해 역상 크로마토그래피 및 크기 분리 크로마토그래피로 순차적으로 분리하여 정제한 것일 수 있고; 또는 형광이 없는 메티오닌 흡광도에 따라 작성된 표준 곡선에 적용하여, 형광 표지된 메티오닌을 함량을 정량화한 것일 수 있다.

세포에서 아미노산의 표지화를 위해서는 형광 표지된 아미노산의 정량화가 요구된다. 아미노산이 단일-결합으로 이루어져 가시광선 영역의 흡광을 갖고 있지 않으므로 다양한 종래기술을 이용하여 아미노산을 유도체화하여 크로마토그래피 분석을 통한 복잡한 분석이 필요하고, 이에 따른 시간 소요, 유도체화를 위한 시약, 비용, 노동력 등이 필요하다. 또한, 형광 표지된 아미노산은 형광 신호를 기준으로 하여 정량하기는 불가능하다. 다만, 본 발명에서는 종래에 확립한 아미노산의 분리 조건을 적용하여, 정량화된 형광 메티오닌을 이용하였다는 점에 또 다른 기술적 특징이 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 메티오닌은 209nm에서 0 내지 31.25mM의 농도 범위에서 농도의존적인 정량곡선(직선의 기울기)을 보임을 확인하고, 이로부터 메티오닌의 농도별 흡광도의 함수를 설정하고, 이를 기준으로 하여, 형광 메티오닌의 209nm에서의 형광 강도를 측정하여 상기 함수에 따른 정량 곡선(또는 표준 곡선)에 대입항 형광 메티오닌의 함량을 측정할 수 있다. 상기 정량 곡선의 농도 범위는 메티오닌의 포화 값에 도달하기 전의 농도, 즉, 직선 기울기를 가지는 범위를 의미한다.

본 발명에서, 목적 단백질의 N-말단에 표지되는 형광물질은 5-카르복시플루오레세인(5-carboxyfluorescein), Dansyl, Fluorescein, Texas Red, Cascade Blue, Cascade Yellow, Erythrosin, Coumarin, NBD, Pacific Blue, PyMPO, Pyrene, Phycoerythrin, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7 또는 NBD-Phallacidin 등일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 형광물질은 메티오닌과 결합하기 위한 화학반응의 구현에 적합한 유도체 형태일 수 있다. 예컨대, N-하이드록시석시니마이드 에스테르(NHS ester), 이소티오시아네이트(isothiocyanates), 카르복실산(carboxylic acids) 또는 술포닐 클로라이드(sulfonyl chlorides) 등에서 선택될 수 있다. 이러한 유도체는 합성을 통해 제조하거나, 상용화되어 있는 것을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 형광물질은 Cy5 NHS ester 또는 5(6)-FAM일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 목적 단백질의 C-말단에 표지되는 형광 염료는, 바이오틴 또는 목적 단백질의 C-말단에 결합된 태그와의 결합을 위하여, 적어도 1개 이상의 유리 카르복시기를 포함하는 염료일 수 있다. 바람직하게 상기 형광 염료는, 바람직하게 바이오틴과 결합된 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 구조를 갖는 형광 염료이거나, 바이오틴과 비결합된 하기 화학식 3의 구조를 갖는 형광 염료일 수 있으나, 이 밖에도 Texas Red, Q dot® probes, CF633 dye, Alexa Fluor probes, ATTO dyes, Cy2, Cy3, Cy5, 또는 Cy7 등에 대해서도 확장 적용가능하다.

특히, 상기 기술된 형광 염료 중에서도, 바이오틴과 일체로 구성된 형광 염료는, 그 자체로 스트랩타비딘과 같은 물질과 결합할 수 있으므로, 고정화 물질의 처리 없이 표지된 목적 단백질을 기질 상에 손쉽게 고정화시킬 수 있어, 고정화 단계를 필수적으로 포함하는 FRET 분석을 용이하게 하는데 기여한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

또한, 전술한 목적 단백질의 N-말단 및 C-말단에 각각 표지되는 형광물질, 형광 염료는 당업계의 기술 수준에 비추어, 다양한 형광체 소재로 대체 적용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 양자점 (quantum dot), 금 또는 은 나노입자와 같이 생체 적합성이 우수하고, 광 안정성을 지닌 형광체 소재 및 다양한 광원들에 대해서도 확대 적용이 가능하다.

한편, 상기 목적 단백질의 C-말단에 결합된 태그는, 바람직하게 상기 형광 염료의 유리 카르복시기와 반응하는 유리 아민기(free amine group)를 포함하는 태그일 수 있고, 바람직하게 유리 아민기를 지닌 라이신을 포함하는 태그일 수 있으며, 보다 바람직하게 Avi 태그 또는 Avi 및 His 태그의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 진핵세포는 효모, 진균류, 포유동물, 곤충, 식물 등을 포함할 수 있다. 더 구체적으로, 진핵세포는 포유동물의 세포일 수 있다. 보다 구체적으로, 진핵세포는 인간세포일 수 있다.

상기 정제된 형광 메티오닌 또는 정제된 형광 메티오닌-진핵세포 유래의 tRNA 복합체 및 목적 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 벡터를 진핵세포에 도입하는 것은 통상의 형질전환 기법을 사용할 수 있다.

상기 벡터는 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 또는 바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

상기 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.

상기 진핵세포의 인 비트로 배양은 배지 내에 메티오닌이 결핍된 조건에서 수행될 수 있다.

상기 인 비트로 배양을 위한 배양배지, 배양조건, 배양장치 등은 진핵세포의 종류에 따라 당업자 수준에서 적절히 채택될 수 있다.

또한, 본 발명의 목적 단백질은 천연적으로 코딩된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 더 구체적으로, 종류가 제한되지 않은 인간 유래 단일 단백질일 수 있다.

한편, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기의 방법으로 표지된 목적 단백질에 광원을 조사하는 단계를 포함하는, 형광 공명 에너지 전이 분석방법을 제공한다.

본 발명의 형광 공명 에너지 전이 분석방법은 전술한 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법에서 기술한 바 있는 기술적 구성을 이용하기 때문에 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명에서, 상기 광원을 조사하는 단계 전, 기질 상에 존재하는 스트렙타비딘과 목적 단백질의 C-말단의 형광 염료와 결합되어 있는 바이오틴간 결합에 의해 고정화 (immobilization)하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 형광 염료의 특이적 구성 (바이오틴과의 결합)으로 인해, 고정화 물질의 처리 없이 표지된 목적 단백질을 기질 상에 손쉽게 고정화시킬 수 있어, FRET 분석 단계를 단순화시킬 수 있다.

본 발명에서, 상기 광원은 적당한 필터와 자외선 램프와 같은 광대역 UV 광원, 목적하는 파장을 추출하는 모노크로마터를 통과시킨 후의 제논 램프 또는 자외선 램프와 같은 백광원의 방출, 연속 파장 가스 레이저, 고형 상태 다이오드 레이저, 또는 임의의 펄스된 레이져일 수 있다. 상기 형광물질 또는 형광 염료 등으로부터 방출된 광은 당업계에 공지되어 있는 다양한 장치 또는 기술을 통해 검출할 수 있다. 예를 들어, 형광측정기 또는 분광광도계 등을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 또 다른 양태로서, 체외로 분리된 진핵 세포내에, 목적 단백질, 및 상기 목적 단백질의 C 말단에 결합되고 유리 아민기(free amine group)를 포함하는, 태그를 코딩 유전자를 포함하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하며, 상기 도입하는 단계는, 적어도 1개 이상의 유리 카르복시기(free carboxyl group)를 포함하고 바이오틴과 결합되어 있는, 형광 염료가 제공되는 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 목적 단백질의 C-말단 선택적인 고효율 형광 표지방법을 제공한다.

본 발명의 목적 단백질의 C-말단 선택적인 고효율 형광 표지방법은 전술한 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법에서 기술한 바 있는 기술적 구성을 이용하기 때문에 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 제조예 ]

제조예 1. 실험 준비 및 실험 재료

1-1. 클로닝

HIV Tat 플라스미드는 다음과 같이 구축하였다. 213 개의 염기쌍을 갖는 HIV Tat 단백질에 대한 PCR 후, 증폭은 다음의 서열을 포함하는 EcoRI Avitag Tat 프라이머를 이용하여 수행하였고, BamH1, EcoRI 제한효소 사이트 및 MSGLNDIFEAQKIEWHE 서열을 갖는 Avitag는 표준 제한 클로닝 방법에 따라 형성되었으며, 상기 제조된 단편을 pcDNA3에 삽입하였다.

정방향 프라이머 (BamH1) : 5'-ggatcc-atggagccagtagatcctagactagag-3'

역방향 프라이머 (EcoRI, Avitag) : 5'-gaattc- ttattcgtgccattcgattttctgagcctcgaagatgtcgttcagaccttccttcgggcctgtcgg-3'

1-2. 고순도 형광 메티오닌 정제

시아닌5(Cy5) NHS 에스테르(GE Healthcare, Little Chalfont, UK) 또는 5(6)-FAM과 L-메티오닌의 알파 아미노기의 결합을 통해 형광 메티오닌을 제조하였다. 간단히 말해, 1mg의 Cy5 NHS 에스테르 등을 62.5mM 소듐 테트라보레이트 버퍼(pH8.5)에 녹였다. L-메티오닌을 첨가한 후, 혼합물을 4에서 오버나이트 동안 인큐베이션 하였다. 역상 크로마토그래피(reverse-phase chromatography on a 1290 Infinity Ultra-High-Performance liquid chromatograpy system(Agilent) equipped with an EclipsePlus C18 column(RRHD, 1.8㎛; 2.1×50mm) 및 UV 및 FLD 형광 검출 시스템을 통해 형광-결합된 메티오닌을 정제하였다. 용매 시스템은 용매 A[0.1% trifluoroacetic acid(99.5% 순도; Sigma) in water] 및 용매 B(0.1% TFA in acetonitrile)로 구성되고, 20-80% 솔벤트 B의 직선 구배를 통해 40분 동안 0.5mL/min의 유속에서 수행하였다. 형광-결합된 메티오닌을 포함하는 분획을 동결-건조로 건조하였다. 최종 분말에 최소량의 물(약 50㎕)을 첨가하여 재현탁하고, 이후 인간 개시 tRNA의 아미노아실화에 사용하였다. 형광-결합된 메티오닌의 제조에서 결합되지 않은 메티오닌의 함량은 Acquity UPLC C18 column(BEH C18 2.1×100mm, 1.8 μm, Waters, Milford, MA, U.S.A.)이 구비된 액체 크로마토그래피 질량 스펙트로메트리(LC-MS)(Ultimate 3000 RS UHPLC, Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, U.S.A.)에서 평가하였다. 용매 시스템은 용매 A[0.1% TFA (99.5% purity) in water] 및 용매 B[0.1% TFA in acetonitrile]로 구성되며, 0-100% 솔벤트 B의 직선 구배를 통해 22분 동안 0.40mL/min의 유속에서 수행하였다. 질량 분석(Mass spectrometric analyses)은 ThermoFinnigan LCQ Deca XP plus ion trap mass spectrometer, with ESI interface(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, U.S.A.)에서 수행하였다.

1-3. 정제된 형광 표지된 L-메티오닌의 정량화

일반적으로, 세포 배지에는 아미노산들이 일정 농도 첨가된다. DMEM 배지의 경우 소량의 L-메티오닌(0.1mM, 15mg/L)이 존재한다. 따라서, 형광 메티오닌을 정량적으로 사용해야 하는 세포 배지에 첨가할 경우 정량된 형광 메티오닌 (본 실험예에서는 0.1mM, 15mg/L 메티오닌이 사용)이 필요하다. 그러나, 형광 신호로는 정량화가 안되나, Cy5가 농도 의존적인 포화 값을 보이고, 메티오닌 단독 역시 농도 의존적인 정량 곡선이 가능하므로 이로부터 형광 메티오닌을 정량화할 수 있었다.

구체적으로, X축의 L-메티오닌의 농도에 따른 표준 계산 그래프를 작성하였다. L-메티오닌의 농도는 31.25mM의 L-메티오닌을 희석한 농도로 하였다. Cy5 염료 단독의 수치가 그래프 내에 포함되어 있고, 형광-표지된 메티오닌의 L-메티오닌의 농도는 형광물질이 결합된 메티오닌과 표준물질의 기울기로 나누어 얻었다. 그 결과, Cy5 단독의 경우 매우 낮은 농도 또는 고농도 즉 농도 의존적인 포화 값이 209nm에서 확인되었고, 메티오닌 단독으로는 농도 의존적으로 209nm에서 증가하는 표준 곡선이 그려졌고, 따라서, 메티오닌을 표준물질로 한 표준 곡선을 계산하고, 형광 메티오닌의 209nm에서의 Y 값을 읽으면 형광 메티오닌의 정량이 가능함을 확인할 수 있었다 (도 3 참조).

1-4. 정제된 형광 메티오닌-인간 개시 tRNA 복합체의 제조

정제된 형광 표지된 메티오닌-개시 tRNA 복합체를 생산하기 위한 인간 개시 tRNA를 생산하였다.

인간 개시 tRNA 유전 정보를 가진 PCR 산물을 생산하기 위한 프라이머를 제작하여 PCR을 시행하였다. 인 비트로 전사에서 주형으로 사용하고, T7 RNA polymerase(Promega) kit를 사용하여 인간 개시 tRNA 생산 시 전사 버퍼에 AMP(인간 개시 tRNA에 A 서열 첨가를 위함)를 첨가하여 생산하였다. 생산된 인간 개시 tRNA와 정제된 형광(Cy5) 표지된 메티오닌의 아미노아실화 반응을 위해 아미노아실화 버퍼(30mM Hepes(pH 7.4), 100mM potassium acetate, 10mM magnesium acetate 및 100mM ATP)을 37℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 에탄올 침전 반응을 통해 상기 아미노아실 반응을 정지시켰다. 이를 위해, 아미노아실화 반응액에 대해 0.1 부피의 2.5M NaOAc(pH 4.5) 첨가하고 페놀(10 mM NaOAc(pH 4.5)로 포화된 페놀)을 넣어 에탄올 침전 실험을 수행하여 최종 분리 정제된 형광(Cy5) 표지된 메티오닌을 개시 tRNA의 펠렛을 RNase-프리 워터에 녹여 생산하였다. 정제된 형광(Cy5) 메티오닌-개시 tRNA 복합체의 생산은 아가로즈 젤과 MALDI-TOF/TOF 5800(AB sciex) 시스템을 이용해서 확인하였다. 매트릭스 용액은 3-하이드록시피콜린산(50g/L in H₂O) 및 디암모늄 시트레이트(50g/L in H₂O)로 구성된다. 질량 정확도는 시나핀산 매트릭스에 녹인 소혈청알부민을 이용하여 외부 검량선 작성을 통해 이 크기의 tRNA에 대해 25kDa의 약 ±0.2%가 되도록 평가하였다.

1-5. 목적 단백질의 C-말단 표지를 위한 형광 염료의 준비

C-말단 표지를 위한 본 발명에 따른 형광 염료는, 목적 단백질의 Avitag 내 라이신 (K)의 아민기와 결합할 수 있는 카르복시기와 함께, 스트랩타비딘 (Streptavidin)과 결합되어 고정화될 수 있는 바이오틴을 포함하도록 제조하였다.

현재 Oligonucleotide 합성기에서 가장 보편적으로 사용되는 합성방법으로 Koster에 의해 개발된 β-cyanoethyl phosphoramidite를 이용하였다. 구체적으로, DNA 구조의 골격을 이루는 phosphodiester 결합을 연결하여 추가하는 ‘phosphite triester’ 방법 (Nucl. Acids Res. 1984, 12, ; Tetrahedron Lett. 1983,)을 이용하여, 링커(목적 단백질의 활성 및 천연 구조에 영향을 주지않는 다양한 올리고 첨가부분)로 연결이 되어 있는 하기 화학식 1의 TAMRA-Biotin 복합체를 제작하였다(도 15 참고: 분자량(Molecular weight) -5662.1g/mol). 또한, 화학식 2의 Atto565-Biotin 복합체를 Sigma로부터 수득하여 본 실험에 사용하였다(이하, TAMRA-Biotin 복합체 및 Atto565-Biotin 복합체는 TAMRA-Biotin 및 Atto565-Biotin으로 명명함.).

[화학식 1]

[화학식 2]

또한, 목적 단백질의 Avitag 내 라이신 (K)의 아민기와 결합할 수 있는 카르복시기를 포함하는 형광 염료 자체로서, 하기 화학식 3의 5(6) Carboxyfluorescein을 Sigma로부터 수득하였다 (이하, 5(6) Carboxyfluorescein는 5(6) FAM으로 명명함.).

[화학식 3]

1-6. 목적 단백질 합성을 위한 세포 확립

목적 단백질 합성을 위한 인간세포로 HeLa 세포를 선택하고, 10% FBS(v/v) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(v/v)이 첨가된, 페놀 레드가 없는 MEM 배지(Welgene Inc.)에서 5% CO₂, 37의 조건에서 배양하였다. 단백질 생산을 위한 트랜스펙션은 리포펙타민을 사용하여 500ng 플라스미드 당 2×10⁶개의 세포 조건에서 시행하였다. 메티오닌이 제거된 배지 조성을 위해 HeLa 세포를 키운 배지를 2회 이상 세척하였다. 성장 배지로 1회 세척하고, 10×PBS(pH7.4)로 2회 세척한 후 PBS로만 1회 세척하였다. 세척 후 메티오닌이 없는 배지를 세포에 첨가하여 최소 6~12시간 5% CO₂에서, 37℃의 온도에서 인큐베이션하였다.

C-말단이 표지된 목적 단백질 생산을 위하여, 미리 ATTO 565-biotin 또는 TAMRA-Biotin을 배지에 첨가하고, HIV Tat 플라스미드와, Bir A 플라스미드를 리포펙타민 2000을 이용하여 37℃에서 24시간 동안 트랜스펙션을 수행한 후, 5% CO₂에서, 37℃의 온도에서 배양하였다. 반면, 5(6) Carboxyfluorescein 혹은 카르복시기 구조를 가진 형광 염료만을 세포 내에 넣을 시에는 HIV Tat 플라스미드와, Bir A 플라스미드를 리포펙타민 2000을 이용하여 37℃에서 24시간 동안 트랜스펙션을 수행함과 동시에 상기 형광 염료를 처리한 뒤, 5% CO₂, 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양하였다.

또한, 양 말단이 표지된 목적 단백질을 생산하기 위해서는, 미리 ATTO 565-biotin 또는 TAMRA-Biotin을 배지에 첨가한 후에 EGFP 또는 HIV Tat 플라스미드와, 정제된 형광 메티오닌 단독 또는 정제된 형광 메티오닌-개시 tRNA(<100 pmol 당 2×10⁶cells) 및 Bir A 플라스미드를 리포펙타민 2000을 이용하여 37℃에서 24시간 동안 트랜스펙션을 수행한 후, 5% CO₂에서, 37℃의 온도에서 배양하였다. 위와 동일하게, 5(6) Carboxyfluorescein 혹은 카르복시기 구조를 가진 형광 염료만을 세포내에 넣을 시에는 EGFP 또는 Tat 플라스미드와, 정제된 형광 메티오닌 단독 또는 정제된 형광 메티오닌-개시 tRNA(<100 pmol 당 2×10⁶cells) 및 Bir A 플라스미드를 리포펙타민 2000을 이용하여 37℃에서 24시간 동안 트랜스펙션을 수행함과 동시에 상기 형광 염료를 처리한 뒤, 5% CO₂, 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양하였다.

1-7. LC-MS 분석

LC-MS 분석은 LTQ OrbitrapVelos mass spectrometer(ThermoFinnigan, USA)으로 수행하였다. 데이터는 데이터-의존적 방식으로 전체-스캔 및 CID(collision-induced dissociation) 스펙트럼을 동시에 기록하여 얻고, Sequest(Bioworks; Thermo Electron, USA)를 이용하여 HIV-1 Tat의 서열을 비교하였다.

1-8. Hela 세포 추출물에서 목적 단백질의 정제

메티오닌이 없는 배지를 세포에 첨가하여 공-트랜스펙션을 실시한 후 5% CO₂에서, 37℃의 온도에서 24시간 동안 배양하고, 세포를 라이시스시켜 단백질을 추출하였다. 이때, 포유동물 세포 프로토콜을 위한 Tansey Lab 프로토콜의 기본 동결-융해 라이시스에 따라 600mM KCl, 20mM Tris-Cl(pH 7.8) 및 20% Glycerol glycerol을 각각 포함하는 FT 라이시스 버퍼를 사용하였다. 세포 용해물을 15,000rpm에서 4℃의 온도로 15분 동안 원심분리하고, 단백질을 포함하는 맑은 상등액을 정제 분석에 사용하였다. 단백질을 포함하는 상등액을 취하고, HIV Tat 단백질을 정제하기 위해, 필요한 경우, 목적 단백질의 C-말단에 His tag을 부가하여 니켈 어피니티 레진 실험을 수행하였다. 원심분리 후, 용해물의 용해성 분획을 HisPur™ Ni-NTA Spin Columns's modified protocol(Pierce Biotechnology, 88224)에 로딩하였다. 결합 및 용출을 위해 각각 pH 7.2 및 pH 5.8의 버퍼(50mM sodium phosphate, 300mM sodium chloride(PBS) without 10 mM imidazole)를 사용하였다.

C-말단에 형광 표지된 HIV Tat 단백질의 합성을 확인하기 위해, 크기 분리 크로마토그래피(Size exclusion chromatography(SEC)-high performance liquid chromatography)을 수행하였다.

이를 위해, Yarra SEC-2000 column(300×7.8mm)(Phenomenex, USA)를 사용하여 Agilent HPLC 시스템에서 크기 분리 크로마토그래피를 이용하여, HeLa 세포에서 C-말단 표지된 정제된 HIV Tat 단백질을 분석하였다.

*용매 시스템은 1mL/min의 유속에서 70분 이상 용매 B에 대해 직선 구배 없이 평형화된 용매 A[150 mM sodium chloride, 50 mM sodium]로 구성되었다.

[ 실험예 ]

실험예 1. HIV Tat 단백질에 대한 C-말단 표지화 분석

본 실험예에서는, C-말단 형광 표지된 HIV-Tat 단백질의 합성을 확인하기 위하여, C-말단에 TAMRA-Biotin이 표지된 HIV Tat 단백질에 대한 단일분자 수준의 형광 이미지를 터프 형광현미경으로 관찰하였고 (파란색=473nm, 녹색=532nm), (5(6) Carboxyfluorescein; 5(6) FAM)으로 표지된 HIV Tat 단백질에 대한, 고정화 유무에 따른 형광의 차이를 역시 터프 형광현미경을 통해 관찰하였다 (파란색=473nm, 적색=545nm). 한편, 상기 단백질은 4 × 10⁸의 HeLa 세포 (2 × 10⁴ / 6cm, Nunc / 덴마크)로부터 단백질을 추출한 뒤, Ni 친화성 스핀 컬럼을 사용하여 C-말단 His 태그를 함유한 HIV Tat 단백질을 정제 회수하였다. 이어서, 상기와 같이 정제된, 5(6) FAM)으로 표지된 HIV Tat 단백질에 대한 크기 분리크로마토그래피(Size exclusion chromatography(SEC)-high performance liquid chromatography) 및 LC-MC를 실시하여 C-말단의 형광 표지를 확인하였다.

그 결과, 또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, C-말단에 TAMRA-Biotin이 표지된 HIV Tat 단백질에 대한 단일 분자 수준의 형광 분석을 통해, Green (ex=532nm) 레이저 여기 상태에서 TAMRA 염료를 나타내는 단분자 spot를 관찰하였다. 또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 고정화되지 않은 5(6) FAM으로 표지된 HIV Tat 단백질에서는 형광이 거의 검출되지 않은 반면, His 태그와 바이오틴간 결합에 의해 고정화가 실시된 경우에는, blue (ex=473nm) 레이저 여기 상태에서 단분자 spot이 관찰되었는바, 형광 검출을 위한 고정화 과정은 필수적임을 알 수 있었다. 아울러, 도 6에 나타낸 바와 같이, 7.201 분에서 가장 높은 피크를 통해, C-말단 5(6) Carboxyfluorescein 표지된 HIV Tat 단백질을 확인할 수 있었을 뿐만 아니라, LC-Mass를 통해서도 상기 형광 표지된 단백질이 HIV Tat 단백질임을 재차 검증할 수 있는바, 본 발명에 따른 표지방법을 통해 효과적으로 C-말단 특이적으로 형광을 표지할 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 2. HIV Tat 단백질에 대한 양 말단의 정량적인 표지화 분석

본 실험예에서는, 목적 단백질의 N-말단과 C 말단에 각각 양 말단에 1: 1로 형광 표지되는 고효율 형광 표지화 확인을 위하여, Avi tag과 His tag의 복합 Tag으로 구성된 HIV Tat 단백질의 C-말단이 포함된 플라스미드를 제작하였다. 이후, 제조예 1-6에 기술한 바와 같이 트랜스펙션 등을 수행한 뒤, His tag의 GFP binding NTA (nitrilotriacetic acid) 단일 아가로즈 비드(agarose nano particle, 50-150μm pore size)와 단일 자성 비드(magnetic nano particle, 1μm pore size) 를 이용하여 실험을 실시하였다. 구체적으로, HIV-Tat-EGFP 및 Cy5-Tat-ATTO565-Biotin에 대해서는, 단일 아가로즈 비드(agarose nano particle, 50-150μm pore size) 이미지를 형광 현미경으로 관찰하였고, His tag의 GFP binding NTA (nitrilotriacetic acid) 단일 자성 비드(magnetic nano particle, 1μm pore size) 분석, Cy5-HIV Tat-ATTO565-Biotin에 대한 FACS (fluorescence activated cell sorting)를 실시하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, HIV Tat-EGFP의 미세한 농도 (50pg, 200pg, 500pg, 2.5ng) 증가에도 녹색 형광이 유의적으로 증가하였는바, 본 실험의 높은 민감성을 확인할 수 있었다. 또한, 단일 아가로즈 비드 (agarose nano particle, 50-150μm pore size)만을 처리한 음성 대조군, HIV-Tat-EGFP를 처리한 군에서는 예상되는 바와 같이, 형광이 검출되지 않거나, 녹색 형광이 검출된 반면, 본 발명에 따른 Cy5-Tat-ATTO565-Biotin에서는 Cy5 및 ATTO565-Biotin으로부터 기인하는 형광이 관찰되었다. 이러한 실험 결과를 통하여, 본 발명에 따른 표지방법은 목적 단백질의 양 말단에 약 1:1의 비율로 형광 표지시킬 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, FACS를 사용하여 형광 신호가 있는 단일 자성 비드(magnetic nano particle, 1μm pore size)를 확인하기 위해 HIV Tat-EGFP의 농도 (0μg, 0.5μg, 1μg, 2μg) 증가에도 녹색 형광이 유의적으로 증가하였는바, 본 실험의 높은 녹색 형광 단백질의 형광 표지 효율를 확인했다. 또한, FACS를 사용하여 히스토그램 사용한 분석에서 단일 자성 비드( magnetic nano particle, 1μm pore size)를 만을 처리한 음성 대조군, HIV-Tat-EGFP를 처리한 군에서는 예상되는 바와 같이, 형광이 검출되지 않거나, 녹색 형광 히스토그램이 왼쪽 방향에서 검출된 반면, 본 발명에 따른 Cy5-Tat-ATTO565-Biotin에서는 Cy5 및 ATTO565-Biotin으로부터 기인하는 형광 히스토그램이 오른쪽 방향에서 관찰되었다. 이러한 FACS를 사용하여 히스토그램 사용한 분석에 X 축에 의한 두 가지 매개 변수 Cy5, PE를 매개로 한 결과, 본 발명에 따른 Cy5-Tat-ATTO565-Biotin에서는 Cy5 및 ATTO565으로부터 기인하는 형광이 중복된 히스토그램의 면적이 X 축에 의한 두 가지 매개 변수 Cy5가 X 축에 의한 매개 변수 PE와 비교해서 오른쪽 방향으로 면적이 증가됨이 관찰되었다.

또한, FACS를 사용하여 사분면 마커(quadrants marker)분석을 사용한 게이트1(PE parameter),게이트 2(PE 와 Cy5), 게이트3( negative control ), 게이트 4(Cy5 parameter) 분석에서 단일 자성 비드( magnetic nano particle, 1μm pore size)를 만을 처리한 음성 대조군, HIV-Tat-EGFP를 처리한 군에서는 예상되는 바와 같이, 형광이 게이트3(99.9%) 에서만 검출되거나, 본 발명에 따른 Cy5-Tat-ATTO565-Biotin에서는 게이트 2(3.54 %), 게이트 4(4.74%)에서 검출되는 효율이 관찰되었다.

이러한 FACS를 사용한 히스토그램 사용한 분석과 사분면 마커(quadrants marker)분석은 Cy5 매개변수에 의해 증가된 실험결과의 일치를 통하여, 본 발명에 따른 표지방법은 목적 단백질의 양 말단에 약 1:1의 비율로 형광 표지시킬 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 3. FRET 분석에 대한 적용 가능성 확인

본 실험예에서는, 상기 실험예 2의 결과에 기초하여 본 발명에 따른 표지 방법이 FRET 분석에 적용 가능한지 여부를 확인하고자 하였다. 한편, FRET 분석은 단백질의 구조 변화 및 이에 따른 기능 변화를 모니터링하는데 유용하다고 알려져 있으며, 이에, 본 발명자들은 HIV Tat 단백질이 Urea에 의해 비접힘 구조로 변화됨에 따라, 양 말단의 거리가 멀어져 FRET 신호는 약화될 것이라 예측하였다 (도 9). 구체적으로, Hela 세포 용해물 또는 토끼 망상적혈구 용해물로부터 수득한 5(6)-FAM_HIV Tat_ATTO-Biotin을 스트랩타비틴이 코팅된 유리 슬라이드에 고정시켰다. 4℃에서 오버나이트 동안 인큐베이션 시킨 후, 상기 슬라이드를 1M 인산 (pH 7.4) 버퍼 용액으로 3회 세척하였다. 스트랩타비딘이 코팅된 유리 슬라이드의 형광 스팟 신호 이미지는 0.1M 인산 (pH 7.4) 버퍼 용액 및 0.05% 글리세롤을 사용하여 Nikon, A1Rsi에서 수득하였다. 스팟 검출, 정량화, FRET 이미징과의 매칭 및 통계 분석을 위하여, 상기 이미지는 NIS-Elements 소프트웨어 (Nikon)을 사용하여 분석하였다. 5(6)-FAM_HIV Tat_ATTO-Biotin 구조의 접힘 (fold)을 유도하기 위하여, 배양 챔버는 상기 스트렙타비딘이 코팅된 슬라이드로 샌드위치시켰다. 비접힘 HIV Tat는 2M 농도의 urea를 포함하는 용액으로 피펫팅하여 유도하였다. FRET 측정은 각각 녹색 및 붉은색으로 형광 이미지화되는 목적 부위(ROI)에서 수행되었다. R/G 비율은 픽셀에 의한 붉은색 및 녹새 채널의 강도 비율로부터 산출되었다. FRET의 히스토그램은 목적 단백질 상의 각 픽셀의 강도 정보에 의해 작성되었다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, Hela 세포 용해물 또는 토끼 망상적혈구 용해물로부터 수득한 5(6)-FAM_HIV Tat_ATTO-Biotin의 형광 이미지를 수득할 수 있었으며, 보다 구체적으로, 도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, N 말단의 5(6)-FAM으로부터 방출되는 녹색 형광 및 C-말단의 ATTO-Biotin으로부터 방출되는 적색 형광은, 시간에 따른 형광 강도가 변화에 있어, 양 자간 유사한 경향성을 보여주었고, 이에 따라서, R/G ratio가 거의 일정하게 유지됨을 확인할 수 있었다.

한편, Urea 처리 유무에 따른, Hela 세포 용해물로부터 수득한 5(6)-FAM_HIV Tat_ATTO-Biotin의 각 형광을 비교한 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 모든 경우에 있어서, 녹색 및 적색 형광의 변화는 유사한 경향성을 보여주었고, 단백질의 구조 변화 (비접힘 구조)가 실험 결과에 반영되어, Urea를 처리한 경우, 녹색 및 적색 형광이 일정하게 감소함을 확인할 수 있었다. 또한, 도 14에 나타낸 바와 같이, 이러한 실험 결과는 토끼 망상적혈구 용해물로부터 수득한 5(6)-FAM_HIV Tat_ATTO-Biotin에서도 동일하게 관찰되었는바, 본 발명에 따른 표지방법은 단백질의 구조 변화 및 이에 따른 기능 변화를 모니터링하는 FRET 분석의 효율 증진에 기여할 수 있음을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

체외로 분리된 진핵 세포내에, 목적 단백질, 및 상기 목적 단백질의 C 말단에 결합되고 유리 아민기(free amine group)를 포함하는 태그를 코딩 유전자를 포함하는 벡터; 및 정제된 형광 메티오닌 또는 정제된 형광 메티오닌-진핵세포 유래의 tRNA 복합체를 도입하는 단계를 포함하며,
상기 도입하는 단계는, 적어도 1개 이상의 유리 카르복시기(free carboxyl group)를 포함하는 형광 염료가 제공되는 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은, 상기 도입된 진핵 세포의 번역 시스템에 의해 부위 선택적으로 형광 표지된 목적 단백질을 합성하는 것인, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법.
제1항에 있어서,
상기 목적 단백질은, 천연적으로 코딩된 아미노산 서열을 갖는 것인, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법.
제1항에 있어서,
상기 목적 단백질의 C 말단에 결합된 태그는, 상기 형광 염료의 유리 아민기를 지닌 라이신(K)을 포함하는 것인, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법.
제4항에 있어서,
상기 태그는, Avi 태그, His 태그 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법.
제1항에 있어서,
상기 정제된 형광 메티오닌은, 형광물질과 메티오닌을 반응시키고, 반응물에 대해 역상 크로마토그래피 및 크기 분리 크로마토그래피로 순차적으로 분리하여 정제한 것인, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법.
제1항에 있어서,
상기 정제된 형광 메티오닌은, 형광이 없는 메티오닌 흡광도에 따라 작성된 표준 곡선에 적용하여, 형광 표지된 메티오닌 함량을 정량화한 것인, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법.
제7항에 있어서,
상기 형광이 없는 메티오닌의 표준 곡선은, 0 내지 31.25 nM 농도 범위에서 측정된, 209nm에서의 흡광도의 함수를 갖는 것인, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법.
제1항에 있어서,
상기 메티오닌은, 목적 단백질의 N-말단의 개시 메티오닌이거나, 목적 단백질 내 존재하는 메티오닌인 것인, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법.
제6항에 있어서,
상기 형광물질은, 5-카르복시플루오레세인(5-carboxyfluorescein), Dansyl, Fluorescein, Texas Red, Q dot® probes, CF633 dye, Alexa Fluor probes, ATTO dyes, Cascade Blue, Cascade Yellow, Erythrosin, Coumarin, NBD, Pacific Blue, PyMPO, Pyrene, Phycoerythrin, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7 및 NBD-Phallacidin으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법.
제6항에 있어서,
상기 형광물질은, N-하이드록시석시니마이드 에스테르(NHS ester), 이소티오시아네이트(isothiocyanates), 카르복실산(carboxylic acids) 및 술포닐 클로라이드(sulfonyl chlorides)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 반응성 유도체인, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법.
제1항에 있어서,
상기 진핵세포는, 포유동물의 세포를 포함하는 것인, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법.
제1항에 있어서,
상기 도입하는 단계는, 메티오닌 결핍 조건에서 수행되는 것인, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법.
제1항에 있어서,
상기 적어도 1개 이상의 유리 카르복시기를 포함하는 형광 염료는, 바이오틴과 결합되어 있는 것인, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법.
제14항에 있어서,
상기 형광 염료는, 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 구조로 이루어진 것인, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법:
[화학식 1]

[화학식 2]

.
제1항에서 있어서,
상기 방법은, 목적 단백질의 N-말단과 C-말단에 각각 정제된 형광 및 형광 염료가 표지되는 것인, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법.
제1항에서 있어서,
상기 방법은, 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 분석에 사용하기 위한 것인, 목적 단백질의 부위 선택적인 고효율 형광 표지방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 방법으로 표지된 목적 단백질에 광원을 조사하는 단계를 포함하는, 형광 공명 에너지 전이 분석방법.
제18항에 있어서,
상기 방법은, 상기 광원을 조사하는 단계 전, 기질 상에 표지된 목적 단백질을 고정화 (immobilization)하는 단계를 추가로 포함하는, 형광 공명 에너지 전이 분석방법.
제19항에 있어서,
상기 고정화하는 단계는, 상기 기질에 존재하는 스트렙타비딘과 목적 단백질의 C-말단의 바이오틴간 결합에 의해 이루어지는 것인, 형광 공명 에너지 전이 분석방법.
체외로 분리된 진핵 세포내에, 목적 단백질, 및 상기 목적 단백질의 C 말단에 결합되고 유리 아민기(free amine group)를 포함하는, 태그를 코딩 유전자를 포함하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하며,
상기 도입하는 단계는, 적어도 1개 이상의 유리 카르복시기(free carboxyl group)를 포함하고 바이오틴과 결합되어 있는, 형광 염료가 제공되는 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 목적 단백질의 C-말단 선택적인 고효율 형광 표지방법.
제21항에 있어서,
상기 목적 단백질의 C 말단에 결합된 태그는, 상기 형광 염료의 유리 아민기를 지닌 라이신(K)을 포함하는 것인, 목적 단백질의 C-말단 선택적인 고효율 형광 표지방법.
제22항에 있어서,
상기 태그는, Avi 태그, His 태그 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 목적 단백질의 C-말단 선택적인 고효율 형광 표지방법.
제21항에 있어서,
상기 형광 염료는, 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 구조로 이루어진 것인, 목적 단백질의 C-말단 선택적인 고효율 형광 표지방법:
[화학식 1]

[화학식 2]

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