JP2018070594A - プロテインタグ、タグ化タンパク質及びタンパク質精製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
また、当該技術を応用した、質量分析の対象とするタンパク質についての質量分析用標準ペプチドを提供することを目的とする。
このプロテインタグによれば、MafGタンパク質に由来する高い不溶性をタグ化されるタンパク質に付与できる。
このプロテインタグにおいて、プロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸は、トリプシンの切断部位であるアルギニンとできる。
このプロテインタグは、具体的には配列番号1〜4に記載のアミノ酸配列を含んでなるものとできる。
また、本発明は、MafGタンパク質の全長又は一部のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列にプロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、を含んでなるプロテインタグによりタグ化されたタンパク質を提供する。
このタグ化タンパク質は、例えばタンパク質を支持体に固定したプロテインアレイとして応用が可能である。
さらに、本発明は、MafGタンパク質の全長又は一部のアミノ酸配列にプロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を含んでなるプロテインタグによりタグ化されたタンパク質をプロテアーゼ処理して得られるペプチドをも提供する。
プロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を含んでなるプロテインタグによりタグ化されたタンパク質をプロテアーゼ処理して得られるペプチドは、タグ由来のペプチドが非常に短くなるように設計できるため、質量分析の対象とするタンパク質についての質量分析用標準ペプチドとして好適である。
上記プロテインタグによれば、MafGタンパク質に由来する高い不溶性を目的タンパク質に付与し、融合タンパク質を不溶化させることができるため、融合タンパク質を不溶画分に高い収率で回収できる。
このタンパク質精製方法において、前記融合タンパク質調製手順は、無細胞タンパク質合成系(例えばコムギ無細胞タンパク質合成系)又は細胞タンパク質合成系において、前記目的タンパク質と前記プロテインタグとの融合タンパク質を発現するベクターを用いて、該融合タンパク質を合成する手順とされる。また、前記精製手順は、タグ化された前記目的タンパク質を遠心分離する手順とされる。
1.プロテインタグ
(1−1)不溶化タグ
(1−2)プロテアーゼによる切断部位の設計
2.タンパク質精製方法
(2−1)融合タンパク質調製手順
(2−1−1)ベクター
(2−1−2)発現系
(2−2)精製手順
3.タグ化タンパク質とその応用
(3−1)タグ化タンパク質
(3−2)質量分析用標準ペプチド
(3−3)抗体精製
(1−1)不溶化タグ
本発明者らは、無細胞発現系(コムギ無細胞系)を用いて高い不溶性を示すタンパク質を網羅的に検索した。その結果、MafGタンパク質を見出した。MafGタンパク質は、HisタグやGSTタグ等の従来用いられている可溶化タグとの融合タンパク質として発現させた場合にも全く可溶性を示さないことが明らかになった。MafGタンパク質は、転写因子の一つであり、162残基のアミノ酸配列(配列番号1)からなる。MafG遺伝子のコーディング領域の塩基配列を配列番号5に示す。
本発明に係る不溶化タグは、タグ化されたタンパク質を後述する質量分析用標準ペプチドの作成に適用するため、MafGタンパク質のアミノ酸配列の全長又は一部のアミノ酸配列にプロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を含んでなることが好ましい。図2は、不溶化タグ及びタグ化タンパク質のプロテアーゼ切断部位を示す模式図である。不溶化タグのアミノ酸配列中に設計された切断部位を点線で、目的タンパク質のアミノ酸配列に内在する切断部位を一点破線でそれぞれ示す。点線で示す不溶化タグの切断部位には、MafGタンパク質に内在する切断部位と、新たに設けられた切断部位との両方が含まれる。
(2−1)融合タンパク質調製手順
上述の不溶化タグを用いたタンパク質精製方法について説明する。タンパク質精製方法は、融合タンパク質調製手順と精製手順とを含む。
図4に、ベクターの基本配列の一例を示す。図に示すベクターは、目的タンパク質のアミノ酸配列をコードするcDNAが挿入される位置(オープンリーディングフレーム(ORFs))の上流(5´側)に、不溶化タグのアミノ酸配列をコードするDNA配列(タグ配列)が配置された構成を有している。タグ配列のさらに上流には、転写プロモーター配列と翻訳エンハンサー配列が位置している。転写プロモーター配列及び翻訳エンハンサー配列は、ここではそれぞれSP6プロモーター配列及びコムギ無細胞タンパク質合成系でよく用いられるオメガ配列を例示するが、これらに限定されない。また、タグ配列は、ORFsの下流(3´側)に繋ぐこともできる。すなわち、不溶化タグは、N末端タグとしてもC末端タグとしても使用できる。
発現系には、無細胞系あるいは細胞系を用いることができ、特にコムギ無細胞発現系を用いることができる。無細胞系のタンパク質合成系としては、他に、大腸菌、昆虫、ウサギ網状赤血球などが挙げられる。細胞系のタンパク質合成系としては、例えば、大腸菌、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母等が挙げられる。
次に、精製手順において、不溶化タグとのフュージョンタンパク質として発現された目的タンパク質を不溶画分に回収する。不溶化タグによりタグ化された目的タンパク質は、タグ化タンパク質全体として不溶化する。従って、無細胞発現系におけるインビトロトランスレーション後の混合液又は細胞発現系における細胞溶解液などを遠心分離すれば、目的タンパク質を不溶画分にペレットダウンして簡単に回収することができる(図5参照)。
(3−1)タグ化タンパク質
本発明に係るタグ化タンパク質は、上述のタンパク質精製方法によって得られ、不溶化タグによりタグ化されていることを特徴とする。タグ化タンパク質は、使用するベクターの構造によって、目的タンパク質のN末端及びC末端の少なくとも一方に不溶化タグが繋がれたものとされる。
本発明に係るタグ化タンパク質は、質量分析用標準ペプチド(内部標準用ペプチド)の作成に応用できる。LC/MS/MS(Liquid chromatography/mass spectrometry/mass spectrometry)、CE/MS/MS(capillary electrophoresis/mass spectrometry/mass spectrometry)及びGC/MS/MS(gas chromatography/mass spectrometry/mass spectrometry)において、選択反応モニタリング(SRM:selected reaction monitoring)及び多重反応モニタリング(MRM:multiple reaction monitoring)と称される分析が行われている。SRM及びMRMは、極めて特異性が高いため、超微量成分の定量性に優れている。
また、本発明に係るタグ化タンパク質は、抗体の精製に応用できる。
1.不溶化タグを用いたシグナル伝達タンパク質の精製(コムギ無細胞発現系)
本実施例では、コムギ無細胞発現系を用いて、本発明に係る不溶化タグとシグナル伝達タンパク質との融合タンパク質の合成及び精製を行った。
合成後の溶液(クルードタンパク質溶液)を、精製時に混入する共雑タンパク質を少なくするためにPBSで4倍に希釈し、15,000xg、20分間、4℃で遠心分離した。上清画分を除き、得られた沈渣(不溶画分)を精製タンパク質画分とした。
比較のため、GSTタグ融合用デスティネーションベクターを用いて同様にタンパク質合成を行った。合成後の溶液をPBSで4倍希釈し、グルタチオンレジン(GEファルマシア)に吸着させ、0.8Mグルタチオンで溶出し、精製タンパク質を回収した。
2.不溶化タグを用いた蛍光タンパク質又は酵素の精製
本実施例では、本発明に係る不溶化タグと蛍光タンパク質又は酵素との融合タンパク質を精製し、精製後の融合タンパク質が蛍光性又は酵素活性を維持していることを確認した。
3.不溶化タグを用いた網羅的なタンパク質精製
本実施例では、本発明に係る不溶化タグを用いて、網羅的なタンパク質精製を行った。
4.プロテインアレイの作製
本実施例では、本発明に係る不溶化タグを用いて精製されたタンパク質を基板に結合して、プロテインアレイを作製した。
5.プロテインアレイによる自己抗体の検出
実施例4において作製されたプロテインアレイを用いて、血清中の自己抗体の検出を行った。
6.不溶化タグを用いたタンパク質の精製(大腸菌細胞内発現系)
本実施例では、大腸細胞内発現系を用いて、本発明に係る不溶化タグとGSTとの融合タンパク質の精製を行った。
7.不溶化タグのドメイン化
本試験例では、MafGタンパク質のアミノ酸全長のうち、特に不溶性に寄与している部分配列(ドメイン)を同定した。
8.プロテアーゼ切断部位の挿入
本試験例では、試験例1で得られたドメインB及びドメインCのアミノ酸配列にプロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸を挿入し、不溶化タグのアミノ酸配列の改変を行った。
(表中のレーン番号は、図21中のレーン番号に対応する。パブリックデータベースEnsemblはhttp://asia.ensembl.org/index.htmlを参照できる)
9.タグ化タンパク質の再可溶化条件の検討
不溶化画分として回収された不溶化タグが付加された融合タンパク質(タグ化タンパク質)の再可溶化について、適切な溶媒を検討した。
10.溶媒による不溶化タグとの融合タンパク質の再可溶化
試験例3において検討された溶媒23(表7参照)について、さらに複数の、不溶化タグとの融合タンパク質(タグ化タンパク質)の再可溶化に適しているか検証した。
Claims (1)
- 質量分析の目的タンパク質と、MafGタンパク質由来の配列番号2又は3に示すアミノ酸配列からなるプロテインタグと、の融合タンパク質をトリプシン処理して得られるタグ化ペプチドを含む、前記目的タンパク質の質量分析用標準ペプチド。
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