CN105652015A - 多功能荧光蛋白纳米线及其介导的免疫分析方法 - Google Patents

多功能荧光蛋白纳米线及其介导的免疫分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种多功能荧光蛋白纳米线，包括蛋白纳米线以及连接在蛋白纳米线外侧的荧光分子，蛋白纳米线通过成线蛋白自组装形成，本发明多功能荧光蛋白纳米线以荧光分子作为信号分子，在位于多功能荧光蛋白纳米线两端的荧光分子表面修饰功能配体作为结合分子，可用于提高免疫检测尤其是蛋白芯片检测灵敏度。

Description

多功能荧光蛋白纳米线及其介导的免疫分析方法
技术领域
本发明涉及免疫分析领域，特别涉及一种多功能荧光蛋白纳米线及其介导的免疫分析方法。
背景技术
蛋白微阵列分析(ProteinMicroarray)技术又称蛋白芯片技术，可用于大规模蛋白质相互作用筛查、高通量靶标蛋白检测、各种蛋白质谱学分析、蛋白-核酸相互作用分析、蛋白质-小分子(药物筛选)相互作用分析等。其基本原理类似于酶联免疫吸附分析(ELISA)，将大量不同的目标蛋白按照指定顺序固定于固相载体(玻片、云母)表面，通过荧光标记抗体或相互作用分子指示靶标蛋白的位置，从而获取相互作用的信息。蛋白芯片技术使得复杂相互作用网络的构建和多目标分子同时检测成为现实。
传统的蛋白芯片是通过在抗体或相互作用分子的表面修饰荧光分子来进行信号输出，其修饰的荧光分子数量有限，过多的荧光分子修饰也会影响抗体或相互作用分子的结合能力，这限制了蛋白芯片灵敏度的提高。随着技术的发展，常规蛋白芯片的分析灵敏度1-100ng/mL(EspinaV等，Proteinmicroarraydetectionstrategies:focusondirectdetectiontechnologies，J.Immunol.Methods.290，121–133，2004.)已经无法满足临床检测和科学研究需求，亟需高灵敏的蛋白芯片检测技术。
现有蛋白芯片的荧光检测信号放大方法主要包括：
(1)银染增强(CN101539573、CN1743845A)，通过在特异性结合分子标记的纳米金的表面进行银离子的还原，从而使标记的纳米金信号增强，是一种基于化学反应的信号扩增方法；然而，银染增强的方法过程复杂，容易产生较强的背景信号，灵敏度提升有限。
(2)量子点(MeiHu等，Ultrasensitive,MultiplexedDetectionofCancerBiomarkersDirectlyinSerumbyUsingaQuantumDot-BasedMicrofluidicProteinChip，ACSNano.2010.Jan；4(1):488-494.)，该方法利用量子点本身较好的荧光性质，将其标记在抗体等特异性结合分子上，从而提高蛋白芯片的荧光信号响应；然而，量子点修饰过程复杂，容易发生荧光淬灭，批量生产的质控困难，且成本高昂，至今未进入大规模的商业化生产。
(3)碳纳米管介导的拉曼增强(BeausoleilSA等，Aprobability-basedapproachforhigh-throughputproteinphosphorylationanalysisandsitelocalization，NatBiotechnol.2008.Nov；26(11):1285-92.)，通过在碳纳米管的表面反复还原金和银，形成粗糙的金属表面，从而得到表面增强拉曼信号，用于蛋白芯片检测的信号放大；然而，碳纳米管拉曼标记的制备、标记过程复杂，需要专用的仪器，方法不通用。
(4)病毒载体介导的荧光信号放大(KimE.Sapsford等，Acowpeamosaicvirusnanoscaffoldformultiplexedantibodyconjugation:Applicationasanimmunoassaytracer，BiosensBioelectron.2006,21(8):1668-1673.)，利用病毒颗粒较大的比表面积和丰富的表面反应基团，同时修饰抗体和荧光染料，通过病毒颗粒本身来结合大量的荧光分子，从而在结合目标分子时提高荧光分子的数量来达到信号放大的目的；然而，病毒载体介导的荧光信号放大方法灵敏度提升有限，且制备过程复杂，不可控。
上述现有技术中，无论是通过提高标记分子的荧光强度(或通过化学反应来提高标记信号强度)还是提高标记荧光分子数量来放大蛋白芯片的信号，均存在灵敏度提升不足、制备复杂、成本高等缺陷。
发明内容
本发明为克服现有技术中免疫检测尤其是蛋白芯片检测灵敏度不足、制备复杂等缺点，提供一种多功能荧光蛋白纳米线及其介导的免疫分析信号放大方法，以荧光分子作为信号分子，在位于多功能荧光蛋白纳米线两端的荧光分子表面修饰功能配体作为结合分子，可用于提高免疫检测灵敏度。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
本发明一方面提供一种多功能荧光蛋白纳米线，包括蛋白纳米线以及连接在蛋白纳米线外侧的荧光分子，其中，所述蛋白纳米线通过成线蛋白自组装形成，至少一个所述荧光分子表面连接功能配体，至少一个所述荧光分子表面未连接功能配体。
在本发明一具体实施方式中，所述成线蛋白为含有能够组装成线性纳米结构自组装结构域的蛋白，例如可为酵母朊蛋白(Sup35)、淀粉样蛋白Ure2、丝素蛋白等。优选的，成线蛋白为酵母朊蛋白，Sup35的第1-61位氨基酸为自组装结构域。
在本发明一具体实施方式中，所述荧光分子包括绿色荧光蛋白或其变体蛋白等自身在一定波长的光激发后发出荧光的蛋白质，以及荧光素酶等使底物发光的蛋白质。优选的，所述荧光分子为绿色荧光蛋白。
在本发明一具体实施方式中，所述功能配体包括能够直接(如具有特异性结合能力的功能化抗体、金属结合肽、蛋白A、蛋白G等)或间接(如生物素、亲和素等)与抗体或抗原等结合的化合物，能够催化不同反应的酶分子(如甲基对硫磷水解酶MPH、辣根过氧化物酶HRP、葡萄糖氧化酶GOD或碱性磷酸酶ALP等)。优选的，所述功能配体为生物素。
在本发明一具体实施方式中，所述成线蛋白为酵母朊蛋白，所述荧光分子为绿色荧光蛋白，所述功能配体为生物素，所述绿色荧光蛋白表面通过遗传修饰连接生物素。
具体的，所述绿色荧光蛋白表面通过遗传修饰连接生物素包括：
通过分子克隆在所述绿色荧光蛋白的C末端融合生物素接受多肽(biotinacceptedpeptide,BAP)得到融合蛋白基因，将所述融合蛋白基因克隆入表达载体；
将生物素蛋白连接酶(Biotin-proteinligase,BirA)克隆入共表达载体中；
将所述表达载体、共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白和生物素；
经破碎、纯化后制得生物素化的绿色荧光蛋白。
在本发明一具体实施方式中，表面连接功能配体的荧光分子位于靠近蛋白纳米线端部的位置，且其数量小于表面未连接功能配体的荧光分子的数量。
在本发明一具体实施方式中，荧光分子为绿色荧光蛋白，功能配体为生物素，多功能荧光蛋白纳米线整合了大量的荧光蛋白在其表面，而在多功能荧光蛋白纳米线两端结合有生物素，通过生物素-亲和素-生物素相互作用，可以与生物素化的抗体-抗原复合物相结合，从而在一个抗原抗体复合物上结合大量的荧光蛋白，达到芯片表面荧光信号的大幅提高。
本发明还一方面提供一种多功能荧光蛋白纳米线的制备方法，包括如下步骤：
(1)通过分子克隆将成线蛋白LP的自组装结构域与荧光分子FP融合形成融合蛋白基因LP-FP；
(2)通过分子克隆将成线蛋白自组装结构域与荧光分子融合后，在荧光分子末端连接功能配体L，形成融合蛋白基因LP-FP-L(简称LP-L)；
(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的融合蛋白基因LP-FP及LP-L分别经表达纯化得到融合蛋白LP-FP及LP-L；
(4)将步骤(3)得到的融合蛋白LP-FP及LP-L通过自组装形成多功能荧光蛋白纳米线。
在一个具体的实施方式中，所述成线蛋白为酵母朊蛋白，所述荧光分子为绿色荧光蛋白，所述功能配体为生物素，所述绿色荧光蛋白表面通过遗传修饰连接生物素，多功能荧光蛋白纳米线的制备包括如下步骤：
(1)通过分子克隆将酵母朊蛋白Sup35的自组装结构域与绿色荧光蛋白GFP融合形成融合蛋白基因Sup35-GFP；
(2)通过分子克隆将酵母朊蛋白Sup35的自组装结构域与绿色荧光蛋白GFP融合后，在绿色荧光蛋白C端连接生物素接受多肽BAP，形成融合蛋白基因Sup35-GFP-BAP(简称Sup35-BAP)；
(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的融合蛋白基因Sup35-GFP和Sup35-BAP分别经表达纯化得到融合蛋白Sup35-GFP及生物素化的Sup35-BAP蛋白；
(4)将步骤(3)得到的融合蛋白Sup35-GFP及生物素化的Sup35-BAP蛋白通过自组装形成多功能荧光蛋白纳米线。
在本发明其它实施方式中，通过分子克隆形成融合蛋白基因时，可在两个蛋白基因之间融合柔性多肽(LinkerPeptide)之后再进行蛋白融合，减少可能存在的位阻的影响。
本发明中，融合蛋白基因的表达、纯化可采用本领域常规用于蛋白表达纯化的方法，例如将融合蛋白基因克隆入表达载体，将表达载体和/或共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白，经破碎、纯化后得到融合蛋白。其中，本发明对表达载体、共表达载体、表达宿主的种类和类别不作限定，可选用本领域常规用于遗传修饰的载体和宿主，具体的，表达载体可为pET-28、pET-32、pET-15或pET-11的等，共表达载体可为pCDFDuet-1等；表达宿主可选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或哺乳动物细胞。
本发明中，克隆可通过例如链式酶聚合反应(PCR)完成。
在本发明一具体实施方式中，步骤(3)中融合蛋白基因Sup35-BAP经表达纯化后得到生物素化的Sup35-BAP蛋白具体包括：
将融合蛋白基因Sup35-BAP克隆入表达载体，将生物素蛋白连接酶(Biotin-proteinligase,BirA)克隆入共表达载体中；
将所述表达载体、共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白和生物素；
经破碎、纯化后制得生物素化的绿色荧光蛋白。
更具体的，本发明中，将生物素蛋白连接酶(BirA)克隆入共表达载体中具体包括：获取BirA基因的核苷酸序列，设计引物，在上、下游引物中分别加入限制性内切酶NcoI和SalI的酶切位点，通过PCR扩增BirA基因；将PCR产物BirA和表达载体pCDFDuet-1进行双酶切反应，收集酶切产物；将收集到的酶切产物BirA和pCDFDuet-1载体按物质的量比以6：1进行连接反应，得到BirA-pCDFDuet-1。
更具体的，本发明中，将所述表达载体、共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白和生物素具体包括：将表达载体和共表达载体加入含有表达宿主和抗生素的培养基中培养过夜，直至活化至对数生长期，加入IPTG诱导表白蛋白和生物素过夜，进行培养和表达。
在本发明一具体实施方式中，步骤(4)中将融合蛋白Sup35-GFP及生物素化的Sup35-BAP蛋白通过自组装形成多功能荧光蛋白纳米线具体包括：
将融合蛋白Sup35-GFP置于4℃下孵育一周后，形成纳米线，通过超声将纳米线破碎为纳米线片段，制备Sup35-GFP种子；
将制备好的Sup35-GFP种子与融合蛋白Sup35-GFP按照摩尔比为1:1-16混合，于4℃下孵育6-10小时，进行种子诱导自组装；
将反应产物与生物素化的Sup35-BAP蛋白按摩尔比为1:1-4混合后，4℃下离心、重悬得到多功能荧光蛋白纳米线。
优选的，所述Sup35-GFP种子与融合蛋白Sup35-GFP按照摩尔比为1:2-8混合，更优选的，按照1:4混合。
优选的，将反应产物与生物素化的Sup35-BAP蛋白按摩尔比为1:1混合，4℃下离心5-15min，优选离心10min，重悬得到多功能荧光蛋白纳米线。
本发明采用种子诱导自组装方法，种子可以快速的诱发融合有自组装结构域的融合蛋白组装在其末端，通过控制种子与单体融合蛋白的组装比，可实现对纳米线长度的控制；此外，可通过控制组装的顺序，可控的将含有功能配体的融合蛋白组装至荧光纳米线的端部，进一步的，可通过控制反应时间从而控制功能配体在荧光纳米线中所占的比例，制备得到灵敏度高、非特异性吸附低的用于免疫分析的产品。
本发明还一方面提供一种用于免疫分析的产品，所述产品包括本发明所述的多功能荧光纳米线。
其中，产品的形式可为传感器、芯片、试剂盒等，在使用时，将本发明所述的荧光纳米线与其它现有的商业试剂混合，可用于各种形式的免疫分析，例如蛋白检测、核酸检测、抗原检测、病原检测、蛋白相互作用筛查、高通量靶标蛋白检测、蛋白-核酸相互作用分析、药物筛选等。
当产品为试剂盒时，试剂盒中还可包括缓冲液、洗涤液、稀释液或显色剂等。
此外，本发明还提供一种本发明所述的多功能荧光蛋白纳米线在免疫分析中的应用。
本发明中，免疫分析可为直接免疫、间接免疫、夹心免疫等方式。
本领域技术人员知晓，本发明中多功能荧光蛋白纳米线可以应用于以治疗为目的或非治疗为目的检测中。
本发明有益效果：
1、灵敏度高，采用本发明多功能荧光蛋白纳米线进行芯片检测相对于现有的传统蛋白芯片检测方法灵敏度提高了100倍以上。
2、本发明多功能荧光蛋白纳米线制备过程简单、易行，可适用于不同的免疫检测模式，如可用于直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA等，仅仅是替换原有检测方法中的一种试剂，不改变原有操作步骤，不需要额外的设备和仪器。
3、本发明检测方法不需要进行化学修饰，通过更换功能融合蛋白，即可获得不同的性质：比如荧光(不同波长的荧光蛋白)、催化(催化不同化学反应的酶分子)、特异性结合能力(如工程化抗体、金属结合肽)等，以适用于不同的试验形式。同样可通过化学修饰获得额外的性质，由于主要成分为蛋白质，因此修饰方便、简单。因此，可用于不同用途、不同模式的检测。
附图说明
图1.本发明实施例1中融合蛋白Sup35-GFP与Sup35-BAP的结构示意图。
图2.本发明实施例1中融合蛋白Sup35-BAP体内生物素化示意图。
图3.本发明实施例2中多功能荧光蛋白纳米线的制备示意图。
图4.本发明实施例1中两种融合蛋白Sup35-GFP与Sup35-BAP的纯化及荧光蛋白、生物素化鉴定，其中，泳道1，Sup35-GFP；泳道2，Sup35-BAP；泳道M，蛋白Marker；泳道3和4，抗GFP抗体westernblot(蛋白质印记)检测Sup35-GFP与Sup35-BAP；泳道5和6，HRP标记的亲和素westernblot检测Sup35-GFP与Sup35-BAP。
图5.本发明实施例2中Sup35-GFP种子电镜表征结果。
图6.本发明实施例2中最终用于芯片检测的多功能荧光蛋白纳米线电镜表征结果。
图7.本发明实施例2中最终用于芯片检测的多功能荧光蛋白纳米线荧光显微镜的表征结果。
图8.本发明实施例2中多功能荧光蛋白纳米线长度控制电镜表征结果，其中E、F、G、H分别为不同组装比例。
图9.本发明实施例4中多功能荧光蛋白纳米线用于芯片病原检测的间接ELISA分析示意图。
图10.本发明实施例4中多功能荧光蛋白纳米线间接ELISA检测不同病原(HIV-gp120、HIV-p24、流感HA1单独病原的模拟样品，BSA为空白对照)的芯片结果。
图11.本发明实施例4中多功能荧光蛋白纳米线间接ELISA同时检测多个病原的芯片结果。
图12.本发明实施例5中多功能荧光蛋白纳米线用于芯片病原检测的夹心ELISA检测的示意图。
图13.本发明实施例5中多功能荧光蛋白纳米线用于芯片病原检测的夹心ELISA检测结果。
图14.本发明实施例5中多功能荧光蛋白纳米线用于芯片病原检测的夹心ELISA数据分析，图中四条柱状图从左到右分别BSA空白对照、HIV-p24、HAV-gp120和流感HA1。
图15.本发明实施例6中常规方法(Cy3标记的亲和素)用于芯片病原检测的夹心ELISA的示意图。
图16.本发明实施例6中常规方法(Cy3标记的亲和素)用于芯片病原检测的夹心ELISA的检测结果。
图17.本发明实施例6中常规方法(Cy3标记的亲和素)用于芯片病原检测的夹心ELISA的数据分析，图中四条柱状图从左到右分别BSA空白对照、HIV-p24、HAV-gp120和流感HA1。
具体实施方式
本发明具体实施方式、实施例中“遗传修饰”指的是通过分子生物学技术对生物体的基因组进行遗传修饰，所得到的基因组成和性状改变。“亲和素”包括但不限于亲和素(Avidin)、链酶亲和素(StreptomycesAvidin)。“生物素接受多肽”(BiotinAcceptedPeptide,BAP)为能够与铁蛋白N端融合且能够连接生物素的多肽。“生物素蛋白连接酶”(Biotin-proteinLigase,BirA)是指能够活化生物素并将生物素连接到生物素受体蛋白上的酶。
本发明具体实施方式、实施例中缩写“Sup-BAP”与“Sup-GFP-BAP”可互换使用，并可代表修饰/未修饰生物素的Sup-BAP，具体所代表的含义依据上下文理解。
下面结合实施例1-2，以Sup35-GFP/Sup35-BAP多功能荧光蛋白纳米线为例，对本发明多功能荧光蛋白纳米线的制备作进一步阐述。
实施例1自生物素化荧光双功能蛋白质的制备
1、自生物素化荧光双功能蛋白质克隆：通过分子克隆将酵母朊蛋白自组装结构域(Sup35的第1-61个氨基酸，简称Sup35)与绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein，GFP)通过柔性连接多肽基因融合连接形成融合蛋白Sup35-GFP(附图1左)。在Sup35-GFP的C末端融合柔性多肽(LinkerPeptide)及生物素接受多肽(BiotinAcceptedPeptide,BAP)，形成融合蛋白Sup35-GFP-BAP(简称Sup35-BAP，附图1右)。该融合蛋白Sup35-BAP中的BAP标签可以在大肠杆菌生物素连接酶(Biotin-proteinLigase(EC6.3.4.15),BirA)的作用下被生物素化(附图2)。
2、自生物素化荧光双功能蛋白表达、纯化：融合蛋白Sup35-BAP的基因被克隆入表达载体pET28中，得到pET28-Sup35-BAP。同时克隆大肠杆菌生物素蛋白连接酶BirA到共表达载pCDFDuet中，得到pCDFDuet-BirA。将两个载体共转化入大肠杆菌表达菌株BL21，卡那霉素、链霉素双抗平板挑取阳性克隆。将挑取的阳性克隆E.coliBL21(Sup35-BAP/pCDFDuet-BirA)二次活化到卡那霉素、链霉素双抗LB培养基，37℃、200rpm振荡培养至对数生长期(OD值约为0.5)。向培养物中加入工作终浓度为1mM的IPTG和工作中浓度为50μM的生物素，25℃、120rpm振荡培养诱导蛋白表达8小时。8000rpm离心收集菌体5分钟，超声破碎菌体，10000×g离心30分钟去除细胞碎片，取上清Ni亲和层析纯化目标蛋白，即获得纯化的Sup35-BAP。
本领域技术人员知晓，本发明上述具体实施方式中蛋白的表达与纯化中具体参数(例如浓度、时间、温度等)数值并不用于限制本发明，本领域技术人员可以依据实际需求作调整。
对两种融合蛋白Sup35-GFP与Sup35-BAP的纯化及荧光蛋白、生物素化进行鉴定，结果如附图4所示。
对实施例1制得的Sup35-GFP与Sup35-BAP进行SDS-PAGE电泳，对得到的凝胶进行考马斯亮蓝染色(泳道1为Sup35-GFP，泳道2为Sup35-BAP，泳道M为蛋白Marker)，由附图4可知，在47kD分子量区有清晰明显的条带，无杂蛋白条带，说明实施例1制备的融合蛋白Sup35-GFP与Sup35-BAP纯度很高。
采用westernblot测定两种融合蛋白与抗GFP抗体的结合能力(泳道3为Sup35-GFP，泳道4为Sup35-BAP)，由附图4可知，Sup35-GFP与Sup35-BAP所在的条带(泳道3和4)分别有明显的显色，表明融合蛋白表面存在GFP。
采用westernblot测定两种融合蛋白与辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素(SA-HRP)的结合能力(泳道5为Sup35-GFP，泳道6为Sup35-BAP)，从而验证生物素化，由附图4可知，Sup35-BAP所在的条带(泳道6)有明显的显色，Sup35-GFP所在的条带(泳道5)则无明显显色，表明Sup35-BAP被生物素化。
在一个具体的实施方式中，克隆通过链式酶聚合反应(PCR)完成的。将BirA克隆入pCDFDuet-1具体包括：获取BirA基因的核苷酸序列，设计引物，在上、下游引物中分别加入限制性内切酶NcoI和SalI的酶切位点，通过PCR扩增BirA基因；将PCR产物BirA和表达载体pCDFDuet-1进行双酶切反应，收集酶切产物；将收集到的酶切产物BirA和pCDFDuet-1载体按物质的量比以6：1进行连接反应，得到BirA-pCDFDuet-1。
在一个具体的实施方式中，表达载体可为质粒载体，包括但不限于pET-28、pET-32、pET-15或pET-11质粒载体等；表达宿主还可为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或哺乳动物细胞等能够进行蛋白表达的宿主。
实施例2多功能荧光蛋白纳米线的可控制备
1、Sup35-GFP种子的制备：将Sup35-GFP融合蛋白置于4℃下孵育一周后，通过超声所产生的剪切力将长的纳米线打断成为纳米线片段制备种子(参见附图5为Sup35-GFP种子电镜表征结果)，该种子可以快速的诱发融合有自组装结构域的融合蛋白组装在其末端。
2、多功能荧光蛋白纳米线的制备：将制备好的Sup35-GFP种子，与Sup35-GFP融合蛋白按照一定的摩尔比(1：1–1：16的比例区间)混合，于4℃孵育8个小时，使其发生种子诱导的快速组装。反应结束后，可发现溶液中有明显的绿色荧光絮状沉淀。将反应产物与Sup35-BAP等比混合后，4℃低速离心，反应10min后，收集沉淀，重新加入组装缓冲液(20mMTris，500mMNaCl，pH8.6)，振荡重悬沉淀，即可获得多功能荧光蛋白纳米线(bFNPw)(合成示意图参见附图3)，附图6为最终用于芯片检测的多功能荧光蛋白纳米线电镜表征结果，附图7为最终用于芯片检测的多功能荧光蛋白纳米线荧光显微镜的表征结果。
本发明荧光纳米线的制备中，通过控制种子与单体融合蛋白的组装比，即可实现对纳米线长度的控制，参见附图8，图8中E、F、G和H分别为种子、种子与单体融合蛋白摩尔比为1:2、1:4和1:8时的电镜表征图，随着单体融合蛋白的比例增加，纳米线的长度增加。其中，优选的种子与单体融合蛋白的组装比为1:4，得到适当尺寸的纳米线。
本发明中多功能荧光蛋白纳米线整合了大量的荧光蛋白在其表面，而在多功能荧光蛋白纳米线两端结合有生物素，通过生物素-亲和素-生物素相互作用，可以与生物素化的抗体-抗原复合物相结合，从而在一个抗原抗体复合物上结合大量的荧光蛋白，达到芯片表面荧光信号的大幅提高。
实施例3
在本发明一个具体的实施方式中，bFNPw可用于制备ELISA检测的产品，如传感器、芯片、试剂盒，在使用时，将本发明所述的bFNPw与其它现有的商业试剂混合，可用于各种形式的免疫分析。
本领域技术人员知晓，试剂盒中还可包括缓冲液、洗涤液、稀释液或显色剂等，在此不做赘述。
实施例4多功能荧光蛋白纳米线用于芯片表面病原检测的间接ELISA分析
本发明一具体实施方式中，将多功能荧光蛋白纳米线用于芯片表面病原检测的间接ELISA检测，用来评估该方法的选择性。
间接ELISA分析示意图参见附图9，由于多功能荧光蛋白纳米线的两端具有生物素，其可以通过生物素-亲和素-生物素的形式连接抗体，进而特异性的结合固定在芯片表面的抗原蛋白，通过检测荧光信号的强度对抗原蛋白进行定性或定量检测。
间接ELISA分析的具体步骤为：
1)抗原蛋白芯片点样，包被，洗涤；
2)封闭；
3)洗涤；
4)加入生物素化的抗体，孵育；
5)洗涤；
6)加入亲和素，孵育；
7)洗涤；
8)加入bFPNw，孵育；
9)洗涤；
10)扫描芯片，获取结果。
下面结合附图10-11对荧光纳米线介导的间接ELISA分析作进一步阐述：
1.单独检测病原
取四个芯片，在每个芯片表面分别固定不同浓度的抗原蛋白(病原)HIV-gp120、HIV-p24、流感HA1，BSA作为空白对照，每组试验点样三次，4℃下包被过夜；用PBST洗去未结合蛋白后加入BSA封闭，洗涤后向四个芯片中分别加入不同病原的生物素化抗体(Anti-F1、Anti-HIVgp120、Anti-HIVp24、Anti-HA1)进行随机实验，接着按顺序加入亲和素和本发明实施例2制备得到的多功能荧光蛋白纳米线，清洗后用芯片扫描仪扫描。
芯片检测结果参见附图10，由附图10可知，四个芯片中，BSA包被的部位均未观察到荧光，表明本发明多功能荧光蛋白纳米线非特异性吸附极低；采用Anti-F1生物素化抗体进行检测时，三种病原均未观察到荧光，也表明未产生特异性吸附。而采用Anti-HIVgp120生物素化抗体进行检测时，仅包被了HIV-gp120的部位产生荧光，且随病原浓度不同荧光强度不同；采用Anti-HIVp24生物素化抗体进行检测时，仅包被了HIV-p24的部位产生荧光，且随病原浓度不同荧光强度不同；采用Anti-HA1生物素化抗体进行检测时，仅包被了HA1的部位产生荧光，且随病原浓度不同荧光强度不同；由上述结果可知，抗原与抗体之间特异性高，采用本发明多功能荧光蛋白纳米线可以用于不同抗原蛋白的免疫检测，且具有很好的选择性。
2.同时检测多个病原
在芯片表面分别固定不同浓度的抗原蛋白(病原)HIV-gp120、HIV-p24、流感HA1，BSA作为空白对照，4℃下包被过夜；用PBST洗去未结合蛋白后加入BSA封闭，洗涤后向芯片中加入不同病原的生物素化抗体(Anti-F1、Anti-HIVgp120、Anti-HIVp24、Anti-HA1)的混合物进行随机实验，接着按顺序加入亲和素和本发明实施例2制备得到的多功能荧光蛋白纳米线，清洗后用芯片扫描仪扫描。
芯片检测结果参见附图11，由附图11可知，BSA包被的部位同样未观察到荧光，而包被了不同病原的部位，分别产生荧光，结果显示该方法具有很好的选择性。
实施例5多功能荧光蛋白纳米线用于芯片表面病原检测的夹心ELISA分析
本发明一具体实施方式中，将多功能荧光蛋白纳米线用于芯片表面病原检测的夹心ELISA检测，用来评估该方法的选择性。
夹心ELISA分析示意图参见附图12，夹心ELISA分析的具体步骤为：
1)抗体芯片点样，包被，洗涤；
2)封闭；
3)洗涤；
4)加入抗原，孵育；
5)洗涤；
6)加入生物素化的抗体，孵育；
7)洗涤；
8)加入链霉亲和素，孵育；
9)洗涤；
10)加入bFPNw，孵育；
11)洗涤；
12)扫描芯片，获取结果。
下面结合附图13-14对荧光纳米线介导的夹心ELISA分析作进一步阐述：
在芯片表面分别固定用于捕获病原的抗体，用PBST洗涤未结合的抗体后加入BSA封闭；洗涤后向芯片中分别加入不同浓度(0、0.1、1、10、100、1000ng/mL)的病原样品HIV-gp120、HIV-p24、流感HA1，BSA作为空白对照；孵育洗涤后，加入不同病原的生物素化抗体(Anti-HIVgp120、Anti-HIVp24、Anti-HA1)进行实验，接着按顺序加入亲和素和本发明实施例2制备得到的多功能荧光蛋白纳米线，清洗后用芯片扫描仪扫描。
芯片检测结果参见附图13-14，由附图13可知，BSA包被的部位均未观察到荧光，而包被了不同病原的部位，分别产生荧光，且随着浓度的增加，荧光强度增加。由附图14可知，对三种病原的检测限低于0.1ng/mL，且在0.1-1000ng/mL范围内呈比例变化。
实施例6常规方法(Cy3标记的亲和素)用于芯片表面病原检测的夹心ELISA分析
本发明还采用常规方法用于芯片表面病原检测的夹心ELISA分析，将实施例5中多功能荧光蛋白纳米线改为Cy3标记的亲和素，其余步骤和参数同实施例5。附图15-17分别为常规方法的对照示意图、检测结果与数据分析，由结果可知，采用常规检测方法，对于HIV-p24和HIV-gp120病原，仅能检测到浓度为10ng/mL，而对于HA1的检测，其灵敏度更低，在100ng/mL时已无法明显区分。
由此可知，将本发明多功能荧光蛋白纳米线用于免疫分析，有效的提高了病原检测的灵敏度，通过与常规试验对比可知，检测灵敏度提升100倍以上。

Claims (10)

1.一种多功能荧光蛋白纳米线，包括蛋白纳米线以及连接在蛋白纳米线外侧的荧光分子，其中，所述蛋白纳米线通过成线蛋白自组装形成，至少一个所述荧光分子表面连接功能配体，至少一个所述荧光分子表面未连接功能配体。
2.如权利要求1所述的多功能荧光蛋白纳米线，其特征在于：所述成线蛋白为酵母朊蛋白，所述荧光分子为绿色荧光蛋白，所述功能配体为生物素，所述绿色荧光蛋白表面通过遗传修饰连接生物素。
3.如权利要求1或2所述的多功能荧光蛋白纳米线，其特征在于：表面连接功能配体的荧光分子位于靠近蛋白纳米线端部的位置，且其数量小于表面未连接功能配体的荧光分子的数量。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的多功能荧光蛋白纳米线的制备方法，包括如下步骤：
(1)通过分子克隆将成线蛋白的自组装结构域与荧光分子融合形成融合蛋白基因LP-FP；
(2)通过分子克隆将成线蛋白自组装结构域与荧光分子融合后，在荧光分子末端连接功能配体，形成融合蛋白基因LP-L；
(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的融合蛋白基因LP-FP及LP-L分别经表达纯化得到融合蛋白LP-FP及LP-L；
(4)将步骤(3)得到的融合蛋白LP-FP及LP-L通过自组装形成多功能荧光蛋白纳米线。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述成线蛋白为酵母朊蛋白，所述荧光分子为绿色荧光蛋白，所述功能配体为生物素，所述绿色荧光蛋白表面通过遗传修饰连接生物素，所述多功能荧光蛋白纳米线的制备包括如下步骤：
(1)通过分子克隆将酵母朊蛋白的自组装结构域与绿色荧光蛋白融合形成融合蛋白基因Sup35-GFP；
(2)通过分子克隆将酵母朊蛋白的自组装结构域与绿色荧光蛋白融合后，在绿色荧光蛋白C端连接生物素接受多肽BAP，形成融合蛋白基因Sup35-BAP；
(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的融合蛋白基因Sup35-GFP和Sup35-BAP分别经表达纯化得到融合蛋白Sup35-GFP及生物素化的Sup35-BAP蛋白；
(4)将步骤(3)得到的融合蛋白Sup35-GFP及生物素化的Sup35-BAP蛋白通过自组装形成多功能荧光蛋白纳米线。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中融合蛋白基因Sup35-BAP经表达纯化后得到生物素化的Sup35-BAP蛋白具体包括：
将融合蛋白基因Sup35-BAP克隆入表达载体，将生物素蛋白连接酶克隆入共表达载体中；
将所述表达载体、共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白和生物素；
经破碎、纯化后制得生物素化的绿色荧光蛋白。
7.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中将融合蛋白Sup35-GFP及生物素化的Sup35-BAP蛋白通过自组装形成多功能荧光蛋白纳米线具体包括：
将融合蛋白Sup35-GFP置于4℃下孵育一周后，形成纳米线，通过超声将纳米线破碎为纳米线片段，制备Sup35-GFP种子；
将制备好的Sup35-GFP种子与融合蛋白Sup35-GFP按照摩尔比为1:1-16混合，于4℃下孵育6-10小时，进行种子诱导自组装；
将反应产物与生物素化的Sup35-BAP蛋白按摩尔比为1:1-4混合后，4℃下离心、重悬得到多功能荧光蛋白纳米线。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述Sup35-GFP种子与融合蛋白Sup35-GFP按照摩尔比为1:2-8混合，优选为1:4混合；和/或，
将反应产物与生物素化的Sup35-BAP蛋白按摩尔比为1:1混合，4℃下离心5-15min，优选离心10min，重悬得到多功能荧光蛋白纳米线。
9.一种用于免疫分析的产品，其特征在于：所述产品包括如权利要求1-3任一项所述的多功能荧光蛋白纳米线或如权利要求4-7任一项所述制备方法制得的多功能荧光蛋白纳米线。
10.一种如权利要求1-3任一项所述的多功能荧光蛋白纳米线或如权利要求4-7任一项所述制备方法制得的多功能荧光蛋白纳米线在免疫分析中的应用。
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