CN108802366B

CN108802366B - 一种检测待测样本中目标蛋白的含量的方法

Info

Publication number: CN108802366B
Application number: CN201710306828.3A
Authority: CN
Inventors: 于瑶; 韩剑; 林白雪; 陶勇
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS; University of Chinese Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS; University of Chinese Academy of Sciences
Priority date: 2017-05-04
Filing date: 2017-05-04
Publication date: 2020-01-21
Anticipated expiration: 2037-05-04
Also published as: CN108802366A

Abstract

本发明公开了一种检测待测样本中目标蛋白的含量的方法。该方法通过引入能够与目标蛋白紧密结合的目标蛋白抗体与在大肠杆菌体内通过BirA蛋白催化而被生物素修饰的不同数量bap肽段的融合蛋白，将生物素‑亲和素系统与抗原‑抗体相互作用连接起来，从而实现基于生物素‑亲和素系统的不同级数的放大。实验证明，采用本发明提供的方法可检测待测样本中目标蛋白的含量，还能够根据目标蛋白的浓度调整融合蛋白的种类、比例、浓度来满足不同的检测需求。本发明具有重大的应用价值。

Description

一种检测待测样本中目标蛋白的含量的方法

技术领域

本发明涉及免疫生物工程技术领域，具体涉及一种检测待测样本中目标蛋白的含量的方法。

背景技术

随着对微量物质检测技术的需求的日益增长，信号放大系统的研究也在逐渐升温。目前信号放大系统主要包括传统ELISA技术、无机纳米纤维技术、金属微粒技术、自组装蛋白纤维技术等等。架构信号放大系统的目的是为了使得微量的物质通过每级分子与前一级分子之间的相互作用，极弱的信号一级级地放大到可以被检测的强度。ELISA技术发明于上世纪60年代，在70年代和80年代开始发展并使用，是从抗原定位的酶标抗体技术发展成的液体标本中微量物质的检测方法，广泛地应用于临床鉴定、环境监测、质量评估、精度分析等方面。其基本原理是借助了抗原与抗体之间的特异性结合，完成一级级的信号放大，通过酶对底物的作用生成与之前不同颜色的产物且颜色强度与酶量在一定浓度范围内正相关，使得可以借助颜色的深浅来量化信号的强弱。

蛋白G是C群和G群链球菌中发现的一种IgG结合蛋白，拥有重复的结构域，其对哺乳类动物的单克隆和多克隆IgG的Fc区有着特异性高的亲和力。与同样功能的蛋白A相比，蛋白G对于大多数哺乳动物的IgG，尤其是对于IgG的亚基的亲和力更强。GB3M也是蛋白G的一种。

bap肽段是能被生物素标记的最短长度的共有肽段模型。它来源于BCCP所在的能被生物素标记的同源序列肽段库。BCCP是乙酰辅酶A羧化酶的一个亚基，在大肠杆菌中可被BirA蛋白催化使得其与生物素共价结合。其氨基酸序列在不同物种中具有一定同源性，尤其是被生物素标记的赖氨酸位点。通过在库中选取最接近于共有肽段模型的序列，并对其截短突变体性质进行检测，得到保留被生物素标记这一功能的最短长度的肽段——bap肽段。

生物素易与生物大分子共价结合，作为常用标记广泛应用于各类检测系统中。亲和素是一种与生物素分子有强亲和作用的蛋白，常用的主要为两种：一是来源于Streptomycesavidinii的链霉亲和素，是大小为66kD的四聚体蛋白；二是被发现存在于鸡蛋卵白的卵白亲和素，是大小为60kD的四亚基蛋白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题如何检测待测样本中目标蛋白的含量。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种检测待测样本中目标蛋白的含量的方法，可包括步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)：

所述步骤(a)可包括如下步骤：

(a-1)复合物和待测样本混匀，孵育；

(a-2)完成步骤(a-1)后，采用化合物A检测荧光信号值；

所述步骤(b)可包括如下步骤：

(b-1)所述复合物和目标蛋白标准溶液混匀，孵育；

(b-2)完成步骤(b-1)后，采用所述化合物A检测荧光信号值；

所述步骤(c)：根据所述目标蛋白标准溶液中目标蛋白的浓度和相应荧光信号值绘制标准曲线，将所述步骤(a-2)得到的荧光信号值代入所述标准曲线，得到待测样本中目标蛋白的含量；

所述复合物可为一个末端连接目标蛋白抗体、另一个末端连接化合物B的特异肽段；所述特异肽段可为a1)或a2)或a3)或a4)：a1)bap1肽段；a2)bap2肽段；a3)bap5肽段；a4)bap10肽段；

所述bap1肽段可为氨基酸序列是序列表中序列3自N端起第222至238位所示的肽段；所述bap2肽段可为氨基酸序列是序列表中序列6自N端起第222至263位所示的肽段；所述bap5肽段可为氨基酸序列是序列表中序列9自N端起第222至338位所示的肽段；所述bap2肽段可为氨基酸序列是序列表中序列12自N端起第222至463位所示的肽段；

所述化合物B可与所述化合物A结合。

上述方法中，所述化合物B可为生物素。所述化合物A可为亲和素。所述亲和素可为卵白亲和素。所述卵白亲和素可为avidin-HRP(BioLegend公司的产品，产品目录号为405103)。

为解决上述技术问题，本发明还提供了检测待测样本中目标蛋白的含量的试剂盒。

本发明所提供的试剂盒具体可为试剂盒甲，可包括上述任一所述复合物和所述化合物A。

所述试剂盒甲还可包括目标蛋白标准溶液。

本发明所提供的试剂盒具体可为试剂盒乙，可包括上述任一所述目标蛋白抗体、所述化合物B、所述化合物A和所述特异肽段。

所述试剂盒乙还可包括目标蛋白标准溶液。

所述试剂盒甲或所述试剂盒乙在检测待测样本中目标蛋白的含量中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述复合物在检测待测样本中目标蛋白的含量中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述复合物也属于本发明的保护范围。

上述任一所述特异肽段在检测待测样本中目标蛋白的含量中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述bap1肽段的编码基因、或含有上述任一所述bap1肽段的编码基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在检测待测样本中目标蛋白的含量中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述bap1肽段的编码基因如序列表中序列2自5’末端起第664至717位所示。上述任一所述bap2肽段的编码基因如序列表中序列5自5’末端起第664至792位所示。上述任一所述bap5肽段的编码基因如序列表中序列8自5’末端起第664至1017位所示。上述任一所述bap10肽段的编码基因如序列表中序列11自5’末端起第664至1392位所示。

在本发明的一个实施例中，所述目标蛋白为抗体分子lgG。抗体分子lgG的抗体为GB3M蛋白。所述GB3M蛋白可为b1)或b2)或b3)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列3自N端起第22至219位所示的蛋白质；

b2)氨基酸序列是序列表中序列3自N端起第22至219位所示的蛋白质；

b3)将b1)或b2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

当待测目标蛋白为抗体分子lgG时，所述复合物可为c1)或c2)或c3)或c4)：

c1)一个末端连接GB3M蛋白、另一个末端连接生物素的bap1肽段；

c2)一个末端连接GB3M蛋白、另一个末端连接生物素的bap2肽段；

c3)一个末端连接GB3M蛋白、另一个末端连接生物素的bap5肽段；

c4)一个末端连接GB3M蛋白、另一个末端连接生物素的bap10肽段。

所述复合物具体可为将融合蛋白GB3M-bap1的C端连接生物素得到的复合物。所述融合蛋白GB3M-bap1可为氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质。

所述复合物具体可为将融合蛋白GB3M-bap2的C端连接生物素得到的复合物。所述融合蛋白GB3M-bap2可为氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白质。

所述复合物具体可为将融合蛋白GB3M-bap5的C端连接生物素得到的复合物。所述融合蛋白GB3M-bap5可为氨基酸序列是序列表中序列12所示的蛋白质。

所述复合物具体可为将融合蛋白GB3M-bap10的C端连接生物素得到的复合物。所述融合蛋白GB3M-bap10可为氨基酸序列是序列表中序列15所示的蛋白质。

所述复合物的制备方法为：将编码融合蛋白(融合蛋白GB3M-bap1、融合蛋白GB3M-bap2、融合蛋白GB3M-bap5或融合蛋白GB3M-bap10)的基因和编码BirA蛋白的基因导入大肠杆菌，然后将该大肠杆菌在含生物素的培养基中表达(需乳糖诱导)，纯化，进一步得到复合物。

所述“将编码融合蛋白(融合蛋白GB3M-bap1、融合蛋白GB3M-bap2、融合蛋白GB3M-bap5或融合蛋白GB3M-bap10)的基因和编码BirA蛋白的基因导入大肠杆菌”是通过导入重组质粒实现的。所述重组质粒具体可为重组质粒pEG1B、重组质粒pEG2B、重组质粒pEG5B或重组质粒pEG10B。

所述重组质粒pEG1B可为将载体pET28a的限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子得到的。

所述重组质粒pEG2B可为将载体pET28a的限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子得到的。

所述重组质粒pEG5B可为将载体pET28a的限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列7所示的DNA分子得到的。

所述重组质粒pEG10B可为将载体pET28a的限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列10所示的DNA分子得到的。

与现有技术相比，本发明的创新之处在于：通过引入能够与目标蛋白(实施例中的lgG抗体分子)紧密结合的目标蛋白抗体(实施例中的GB3M蛋白)与在大肠杆菌体内通过BirA蛋白催化而被生物素修饰的不同数量bap肽段的融合蛋白(实施例中的信号放大分子G1B、信号放大分子G2B、信号放大分子G5B或信号放大分子G10B)，将生物素-亲和素系统与抗原-抗体相互作用连接起来，从而实现基于生物素-亲和素系统的不同级数的放大，这与常见的生物素修饰抗体、或、用游离亲和素连接起生物素修饰的抗体和生物素修饰的酶这两种引入生物素-亲和素系统的方法不同。因此，可利用本发明所提供的信号放大系统可检测待测样本中目标蛋白的含量，还能够根据目标蛋白的浓度调整融合蛋白的种类、比例、浓度来满足不同的检测需求。本发明具有重大的应用价值。

附图说明

图1为实施例1步骤三的实验结果。

图2为实施例1步骤四的实验结果。

图3为实施例2的实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

大肠杆菌BL21(DE3)为北京全世金生物技术有限公司的产品，产品目录号为CD601。抗体分子IgG为北京百诺威生物科技有限公司的产品，产品目录号为KGAB026。avidin-HRP为BioLegend公司的产品，产品目录号为405103。载体pET28a为Novagen公司的产品，产品目录号为69864-3。酶标板为美国Corning公司的产品，产品目录号为42452。HisTrap TM HP柱为GE公司的产品，货号为17-5247-01；其规格为1mL。生物素为国药集团化学试剂有限公司的产品，产品目录号为67000260。

TMB显色液由1体积份TMB显色液A液和1体积份TMB显色液B液混合而成。TMB显色液A液和TMB显色液B液均为上海阿拉丁生化科技股份有限公司的产品，产品目录号分别为T117927和T117928。

ZYM自诱导培养基：含20g/L乳糖、10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L甘油、0.5g/L葡萄糖、25mmol/L磷酸氢二钠、50mmol/L氯化铵、25mmol/L磷酸二氢钾、5mmol/L硫酸钠、2mmol/L的硫酸镁、50mmol/L氯化亚铁、0.02mmol/L氯化钙、0.01mmol/L氯化镁、0.01mmol/L硫酸锌、0.002mmol/L氯化钴、0.002mmol/L氯化铜、0.002mmol/L氯化镍、0.002mmol/L钼酸钠、0.002mmol/L亚硒酸钠、0.002mmol/L硼酸和0.06mmol/L盐酸的水溶液。蛋白胨和酵母提取物均为OXOID公司的产品，产品目录号分别为LP0042和LP0021。

实施例1、信号放大分子的获得

信号放大分子为信号放大分子G1B(简称G1B)、信号放大分子G2B(简称G2B)、信号放大分子G5B(简称G5B)或信号放大分子G10B(简称G10B)。

一、重组质粒的构建

1、重组质粒pEG1B的构建

将载体pET28a的限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子，得到重组质粒pEG1B。

重组质粒pEG1B中，序列表的序列1自5’末端起第1至654位所示的DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，形成序列表的序列2所示的融合基因，表达序列表的序列3所示的融合蛋白GB3M-bap1(即G1B)。融合蛋白GB3M-bap1具有His-tag标签。

重组质粒pEG1B还表达序列表中序列16所示的BirA蛋白。

2、重组质粒pEG2B的构建

将载体pET28a的限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子，得到重组质粒pEG2B。

重组质粒pEG2B中，序列表的序列4自5’末端起第1至729位所示的DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，形成序列表的序列5所示的融合基因，表达序列表的序列6所示的融合蛋白GB3M-bap2(即G2B)。融合蛋白GB3M-bap2具有His-tag标签。

重组质粒pEG2B还表达序列表中序列16所示的BirA蛋白。

3、重组质粒pEG5B的构建

将载体pET28a的限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列7所示的DNA分子，得到重组质粒pEG5B。

重组质粒pEG5B中，序列表的序列7自5’末端起第1至954位所示的DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，形成序列表的序列8所示的融合基因，表达序列表的序列9所示的融合蛋白GB3M-bap5(即G5B)。融合蛋白GB3M-bap5具有His-tag标签。

重组质粒pEG5B还表达序列表中序列16所示的BirA蛋白。

4、重组质粒pEG10B的构建

将载体pET28a的限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列10所示的DNA分子，得到重组质粒pEG10B。

重组质粒pEG10B中，序列表的序列10自5’末端起第1至1329位所示的DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，形成序列表的序列11所示的融合基因，表达序列表的序列12所示的融合蛋白GB3M-bap10(即G10B)。融合蛋白GB3M-bap10具有His-tag标签。

重组质粒pEG10B还表达序列表中序列16所示的BirA蛋白。

5、重组质粒pEG的构建

将载体pET28a的限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列13所示的DNA分子，得到重组质粒pEG。

重组质粒pEG中，序列表的序列13自5’末端起第1至597位所示的DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，形成序列表的序列14所示的融合基因，表达序列表的序列15所示的融合蛋白GB3M。融合蛋白GB3M具有His-tag标签。

重组质粒pEG还表达序列表中序列16所示的birA蛋白。

二、重组大肠杆菌的获得

1、将重组质粒pEG1B转化导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌，将其命名为pEG1B/BL21(DE3)。

2、将重组质粒pEG2B转化导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌，将其命名为pEG2B/BL21(DE3)。

3、将重组质粒pEG5B转化导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌，将其命名为pEG5B/BL21(DE3)。

4、将重组质粒pEG10B转化导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌，将其命名为pEG10B/BL21(DE3)。

5、将重组质粒pEG转化导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌，将其命名为pEG/BL21(DE3)。

三、信号放大分子的表达

(1)将重组大肠杆菌(pEG1B/BL21(DE3)、pEG2B/BL21(DE3)、pEG5B/BL21(DE3)、pEG10B/BL21(DE3)或pEG/BL21(DE3))的单克隆接种于1mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养4h，得到菌液。

(2)完成步骤(1)后，将菌液全部接种于100mL含50μg/mL卡那霉素和12mg/L生物素的ZYM自诱导培养基中，然后37℃、190rpm振荡培养12h，得到诱导后的菌液。

(3)完成步骤(2)后，取诱导后的菌液，4℃、6000rpm离心20min，收集菌体。

(4)取步骤(3)收集的部分菌体，用含500mmol/L NaCl的pH8.0、10mmol/L磷酸盐缓冲液重悬，然后置冰上在超声破碎仪上超声破碎(超声波功率190W，循环程序为：破碎5s，停5s，共计5min)，然后4℃、13000rpm离心1min，收集上清和沉淀。

将步骤(2)得到的诱导后的菌液、步骤(4)收集的沉淀和上清进行SDS-PAGE。

部分实验结果见图1((a)为pEG1B/BL21(DE3)，(b)为pEG2B/BL21(DE3)，(c)为pEG5B/BL21(DE3)，(d)为pEG10B/BL21(DE3)，(e)为pEG/BL21(DE3)；Marker为蛋白Marker；箭头为目标蛋白；全菌为诱导后的菌液)。结果表明，G1B在G1B全菌、G1B沉淀和G1B上清均存在，大部分存在于G1B上清中，大小约为30kD；G2B在G2B全菌、G2B沉淀和G2B上清均存在，大部分存在于G2B上清中，大小约为35kD；G5B在G5B全菌、G5B沉淀和G5B上清均存在，大部分存在于G5B上清中，大小约为40kD；G10B在G10B全菌、G10B沉淀和G10B上清均存在，大部分存在于G10B上清中，大小约为70kD；GB3M在GB3M全菌、GB3M沉淀和GB3M上清均存在，大部分存在于GB3M上清中，大小约为28kD。

四、信号放大分子的纯化

(1)取步骤三中(3)收集的部分菌体，用含500mmol/L NaCl的pH8.0、10mmol/L磷酸盐缓冲液重悬，然后置冰上在超声破碎仪上超声破碎(超声波功率190W，循环程序为：破碎5s，停5s，共计10min)，然后4℃、9800r/min离心30min，收集上清液和沉淀。

(2)取步骤(1)收集的上清液，先用滤膜(规格为0.22μm)过滤，再上样至HisTrapTMHP柱(流速为1mL/min)。

(3)完成步骤(2)后，先用10个柱体积的含30mM咪唑和500mmol/L NaCl的pH8.0、10mmol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱(流速为1mL/min，目的为去除杂蛋白)，再用10个柱体积的含500mM咪唑和500mmol/L NaCl的pH8.5、10mmol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱(流速为1mL/min)并收集过柱后溶液。

(4)完成步骤(3)后，将过柱后溶液置于含100mmol/L NaCl的pH8.0、10mmol/L磷酸盐缓冲液，4℃透析12h，得到信号放大分子溶液。

将信号放大分子溶液进行SDS-PAGE。部分实验结果见图2(Marker为蛋白Marker)。结果表明，信号放大分子溶液中目的蛋白的纯度较高。

实施例2、信号放大系统的构建及性质测定

用包被液稀释抗体分子IgG，得到浓度为1.5ng/mL的IgG稀释液1、浓度为3ng/mL的IgG稀释液2、浓度为6ng/mL的IgG稀释液3、浓度为9ng/mL的IgG稀释液4、浓度为12ng/mL的IgG稀释液5、浓度为15ng/mL的IgG稀释液6和浓度为30ng/mL的IgG稀释液7。包被液：含1.59g/L碳酸钠和2.93g/L碳酸氢钠的水溶液。

用pH7.4、20mmol/L PBS缓冲液稀释实施例1步骤四获得的信号放大分子溶液，得到浓度为10^-8mol/L的G1B稀释液a、浓度为10^-9mol/L的G1B稀释液b、浓度为10^-10mol/L的G1B稀释液c、浓度为10^-8mol/L的G2B稀释液d、浓度为10^-9mol/L的G2B稀释液e、浓度为10^-10mol/L的G2B稀释液f、浓度为10^-8mol/L的G5B稀释液g、浓度为10^-9mol/L的G5B稀释液h、浓度为10^-10mol/L的G5B稀释液i、浓度为10^-8mol/L的G10B稀释液j、浓度为10^-9mol/L的G10B稀释液k、浓度为10^-10mol/L的G10B稀释液l、浓度为10^-8mol/L的GB3M稀释液m、浓度为10^-9mol/L的GB3M稀释液n或浓度为10^-10mol/L的GB3M稀释液p。

0.05％PBST洗液：含0.24g/L磷酸二氢钾、2.95g/L十二水磷酸氢二钠、8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾和500μL/L吐温-20的水溶液。

封闭液：含10g/L酪蛋白和20mmol/L氢氧化钠的水溶液。

1、取酶标板，每孔加入200μL IgG稀释液(IgG稀释液1、IgG稀释液2、IgG稀释液3、IgG稀释液4、IgG稀释液5、IgG稀释液6或IgG稀释液7)，4℃孵育12h，然后用0.05％PBST洗液洗涤5次，甩干。

2、完成步骤1后，每孔加入240μL封闭液，37℃孵育2h，然后用0.05％PBST洗液洗涤5次，甩干。

3、完成步骤2后，每孔加入200μL信号放大分子稀释液(G1B稀释液a、G1B稀释液b、G1B稀释液c、G2B稀释液d、G2B稀释液e、G2B稀释液f、G5B稀释液g、G5B稀释液h、G5B稀释液i、G10B稀释液j、G10B稀释液k、G10B稀释液l、GB3M稀释液m、GB3M稀释液n或GB3M稀释液p)，37℃孵育45min，然后用0.05％PBST洗液洗涤5次，甩干。

4、完成步骤3后，每孔加入100μL avidin-HRP稀释液(用pH7.4、20mmol/L PBS缓冲液将avidin-HRP稀释至2000倍体积)，然后用0.05％PBST洗液洗涤5次，甩干。

5、完成步骤4后，每孔加入100μL TMB显色液，37℃孵育7min，然后加入50μL浓度为2M的H₂SO₄水溶液，用酶标仪测量在450nm处的OD值。

GB3M稀释液m、GB3M稀释液n和GB3M稀释液p不含可放大信号的分子，作为对照。

部分实验结果见图3((a)为浓度为10^-8mol/L的信号放大分子稀释液的实验结果；(b)为浓度为10^-9mol/L的信号放大分子稀释液的实验结果；(c)为浓度为10^-10mol/L的信号放大分子稀释液的实验结果)。结果表明，在同一浓度的信号放大分子稀释液下，随着IgG浓度的升高放大效果增强；在同一浓度的IgG稀释液下，放大效果为：G10B>G5B>G2B>G1B；在IgG浓度为1.5-15ng/mL下，同一浓度信号放大分子放大效果：G10B：G5B：G2B：G1B大约为3：2：1.5：1。因此，本发明提供的信号放大系统能够进行有效地放大。

以IgG浓度为横坐标，以某浓度的信号放大分子稀释液的ΔOD_450nm值减去对照的ΔOD_450nm值为纵坐标，绘制曲线。选取线性较好的部分进行线性回归，根据回归方程计算出该浓度的信号放大分子的检测范围下限。实验结果见表1。

表1

结果表明，同一浓度信号放大分子效果的灵敏度G10B>G5B>G2B>G1B，均可以达到ng/mL数量级。因此，本发明提供的信号放大系统能够根据所需的灵敏度来选取合适的信号放大分子种类、配比、浓度来进行有效的信号检测。

<110> 中国科学院微生物研究所中国科学院大学

<120>一种检测待测样本中目标蛋白的含量的方法

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

gacacttaca aattaatcct taatggtaaa acattgaaag gcgaaacaac tactgaagct 60

gttgatgctg ctactgcaga aaaagtcttc aaacaatacg ctaacgacaa cggtgttgac 120

ggtgaatgga cttacgacga tgcgactaag acctttacag ttactgaaaa accagaagtg 180

atcgatgcgt ctgaattaac accagccgtg acaacttaca aacttgttat taatggtaaa 240

acattgaaag gcgaaacaac tactgaagct gttgatgctg ctactgcaga aaaagtcttc 300

aaacaatacg ctaacgacaa cggtgttgac ggtgaatgga cttacgacga tgcgactaag 360

acctttacag ttactgaaaa accagaagtg atcgatgcgt ctgaattaac accagccgtg 420

acaacttaca aacttgttat taatggtaaa acattgaaag gcgaaacaac tactaaagca 480

gtagacgcag aaactgcaga aaaagccttc aaacaatacg ctaacgacaa cggtgttgat 540

ggtgtttgga cttatgatga tgcgactaag acctttacgg taactgaaat ggttggatcc 600

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<220>

<223>

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<212> PRT

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<220>

<223>

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

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<223>

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gatggtgttt ggacttatga tgatgcgact aagaccttta cggtaactga aatggttgga 660

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ttcaaacaat acgctaacga caacggtgtt gacggtgaat ggacttacga cgatgcgact 420

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gtgacaactt acaaacttgt tattaatggt aaaacattga aaggcgaaac aactactaaa 540

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ggcgaagcag cggctaaagg tggcctgaac gatatttttg aagctcagaa aatcgaatgg 780

catgaagaca ccggcggtga agcggccgca aaaggcggtc tgaacgatat tttcgaagcg 840

caaaaaattg aatggcatga agacacgggc ggtgaagctg cggccaaagg cggtctgaat 900

gatatttttg aagcccaaaa gattgaatgg cacgaagata ccggcggtga agcagctgcg 960

aaaggcggtc tgaatgacat tttcgaagca caaaaaatag agtggcatga agatacgggc 1020

ggtgaagccg cagctaaagg cggtctgaac gacatttttg aagcccaaaa aatagagtgg 1080

cacgaggata ccggcggtga ggcggccgca aaaggcggtc tgaatgatat attcgaagcg 1140

caaaagattg aatggcatga ggatacgggc ggtgaggctg cggccaaagg cggtctgaac 1200

gatatatttg aagcgcaaaa gatagaatgg cacgaggaca ccggcggtga ggcagctgcg 1260

aaaggcggtc tgaacgatat cttcgaagcc caaaaaattg agtggcatga ggacacgggc 1320

ggtgaagcag cggcgaaagg tggcctgaac gacatctttg aagcccagaa aattgaatgg 1380

cacgaagact aa 1392

<210> 12

<211> 463

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 12

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr

20 25 30

Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu

35 40 45

Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp

50 55 60

Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu

65 70 75 80

Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu

85 90 95

Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val

100 105 110

Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn

115 120 125

Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr

130 135 140

Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala

145 150 155 160

Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu

165 170 175

Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys

180 185 190

Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp

195 200 205

Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Met Val Gly Ser Gly Gly Leu

210 215 220

Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Asp Thr Gly

225 230 235 240

Gly Glu Ala Ala Ala Lys Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln

245 250 255

Lys Ile Glu Trp His Glu Asp Thr Gly Gly Glu Ala Ala Ala Lys Gly

260 265 270

Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Asp

275 280 285

Thr Gly Gly Glu Ala Ala Ala Lys Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu

290 295 300

Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Asp Thr Gly Gly Glu Ala Ala Ala

305 310 315 320

Lys Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His

325 330 335

Glu Asp Thr Gly Gly Glu Ala Ala Ala Lys Gly Gly Leu Asn Asp Ile

340 345 350

Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Asp Thr Gly Gly Glu Ala

355 360 365

Ala Ala Lys Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu

370 375 380

Trp His Glu Asp Thr Gly Gly Glu Ala Ala Ala Lys Gly Gly Leu Asn

385 390 395 400

Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Asp Thr Gly Gly

405 410 415

Glu Ala Ala Ala Lys Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys

420 425 430

Ile Glu Trp His Glu Asp Thr Gly Gly Glu Ala Ala Ala Lys Gly Gly

435 440 445

Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Asp

450 455 460

<210> 13

<211> 1594

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 13

gacacttaca aattaatcct taatggtaaa acattgaaag gcgaaacaac tactgaagct 60

gttgatgctg ctactgcaga aaaagtcttc aaacaatacg ctaacgacaa cggtgttgac 120

ggtgaatgga cttacgacga tgcgactaag acctttacag ttactgaaaa accagaagtg 180

atcgatgcgt ctgaattaac accagccgtg acaacttaca aacttgttat taatggtaaa 240

acattgaaag gcgaaacaac tactgaagct gttgatgctg ctactgcaga aaaagtcttc 300

aaacaatacg ctaacgacaa cggtgttgac ggtgaatgga cttacgacga tgcgactaag 360

acctttacag ttactgaaaa accagaagtg atcgatgcgt ctgaattaac accagccgtg 420

acaacttaca aacttgttat taatggtaaa acattgaaag gcgaaacaac tactaaagca 480

gtagacgcag aaactgcaga aaaagccttc aaacaatacg ctaacgacaa cggtgttgat 540

ggtgtttgga cttatgatga tgcgactaag acctttacgg taactgaaat ggtttaagga 600

tccgtcgaca agcttaagga gatataccat gaaggataac accgtgccac tgaaattgat 660

tgccctgtta gcgaacggtg aatttcactc tggcgagcag ttgggtgaaa cgctgggaat 720

gagccgggcg gctattaata aacacattca gacactgcgt gactggggcg ttgatgtctt 780

taccgttccg ggtaaaggat acagcctgcc tgagcccatc cagttactta atgctgaaca 840

gatattgggt cagctggatg gcggtagtgt agccgtgctg ccagttattg actccacgaa 900

tcagtacctt cttgatcgta tcggagagct taaatcgggc gatgcctgtg ttgcagaata 960

ccagcaggct ggccgtggtc gccgggggcg gaaatggttt tcgccttttg gcgcaaactt 1020

atatttgtcg atgttctggc gtctggaaca aggcccggcg gcggcgattg gtttaagtct 1080

ggttatcggt atcgtgatgg cggaagtatt acgcaagctg ggagcagata aagttcgtgt 1140

caaatggcct aatgacctct atctgcagga tcgcaagctg gcaggcattc ttgtggagct 1200

gactggcaaa actggcgatg cggcgcaaat agtcattgga gccgggatca acatggcaat 1260

gcgccgtgtt gaagagagtg tcgttaatca ggggtggatc acgctgcagg aagcggggat 1320

caatctcgat cgtaatacgt tggcggccat gctaatacgt gaattacgtg ctgcgttgga 1380

actcttcgaa caagaaggat tggcacctta tctgtcgcgc tgggaaaagc tggataattt 1440

tattaatcgc ccagtgaaac ttatcattgg tgataaagaa atatttggca tttcacgcgg 1500

aatagacaaa cagggggctt tattacttga gcaggatgga ataataaaac cctggatggg 1560

cggtgaaata tccctgcgta gtgcagaaaa ataa 1594

<210> 14

<211> 660

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 14

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggacactt acaaattaat ccttaatggt aaaacattga aaggcgaaac aactactgaa 120

gctgttgatg ctgctactgc agaaaaagtc ttcaaacaat acgctaacga caacggtgtt 180

gacggtgaat ggacttacga cgatgcgact aagaccttta cagttactga aaaaccagaa 240

gtgatcgatg cgtctgaatt aacaccagcc gtgacaactt acaaacttgt tattaatggt 300

aaaacattga aaggcgaaac aactactgaa gctgttgatg ctgctactgc agaaaaagtc 360

ttcaaacaat acgctaacga caacggtgtt gacggtgaat ggacttacga cgatgcgact 420

aagaccttta cagttactga aaaaccagaa gtgatcgatg cgtctgaatt aacaccagcc 480

gtgacaactt acaaacttgt tattaatggt aaaacattga aaggcgaaac aactactaaa 540

gcagtagacg cagaaactgc agaaaaagcc ttcaaacaat acgctaacga caacggtgtt 600

gatggtgttt ggacttatga tgatgcgact aagaccttta cggtaactga aatggtttaa 660

<210> 15

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 15

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr

20 25 30

Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu

35 40 45

Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp

50 55 60

Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu

65 70 75 80

Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu

85 90 95

Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val

100 105 110

Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn

115 120 125

Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr

130 135 140

Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala

145 150 155 160

Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu

165 170 175

Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys

180 185 190

Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp

195 200 205

Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Met Val

　　210 215

<210> 16

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 16

Met Lys Asp Asn Thr Val Pro Leu Lys Leu Ile Ala Leu Leu Ala Asn

1 5 10 15

Gly Glu Phe His Ser Gly Glu Gln Leu Gly Glu Thr Leu Gly Met Ser

20 25 30

Arg Ala Ala Ile Asn Lys His Ile Gln Thr Leu Arg Asp Trp Gly Val

35 40 45

Asp Val Phe Thr Val Pro Gly Lys Gly Tyr Ser Leu Pro Glu Pro Ile

50 55 60

Gln Leu Leu Asn Ala Glu Gln Ile Leu Gly Gln Leu Asp Gly Gly Ser

65 70 75 80

Val Ala Val Leu Pro Val Ile Asp Ser Thr Asn Gln Tyr Leu Leu Asp

85 90 95

Arg Ile Gly Glu Leu Lys Ser Gly Asp Ala Cys Val Ala Glu Tyr Gln

100 105 110

Gln Ala Gly Arg Gly Arg Arg Gly Arg Lys Trp Phe Ser Pro Phe Gly

115 120 125

Ala Asn Leu Tyr Leu Ser Met Phe Trp Arg Leu Glu Gln Gly Pro Ala

130 135 140

Ala Ala Ile Gly Leu Ser Leu Val Ile Gly Ile Val Met Ala Glu Val

145 150 155 160

Leu Arg Lys Leu Gly Ala Asp Lys Val Arg Val Lys Trp Pro Asn Asp

165 170 175

Leu Tyr Leu Gln Asp Arg Lys Leu Ala Gly Ile Leu Val Glu Leu Thr

180 185 190

Gly Lys Thr Gly Asp Ala Ala Gln Ile Val Ile Gly Ala Gly Ile Asn

195 200 205

Met Ala Met Arg Arg Val Glu Glu Ser Val Val Asn Gln Gly Trp Ile

210 215 220

Thr Leu Gln Glu Ala Gly Ile Asn Leu Asp Arg Asn Thr Leu Ala Ala

225 230 235 240

Met Leu Ile Arg Glu Leu Arg Ala Ala Leu Glu Leu Phe Glu Gln Glu

245 250 255

Gly Leu Ala Pro Tyr Leu Ser Arg Trp Glu Lys Leu Asp Asn Phe Ile

260 265 270

Asn Arg Pro Val Lys Leu Ile Ile Gly Asp Lys Glu Ile Phe Gly Ile

275 280 285

Ser Arg Gly Ile Asp Lys Gln Gly Ala Leu Leu Leu Glu Gln Asp Gly

290 295 300

Ile Ile Lys Pro Trp Met Gly Gly Glu Ile Ser Leu Arg Ser Ala Glu

305 310 315 320

Lys

Claims

1.一种检测待测样本中目标蛋白的含量的方法，包括步骤（a）、步骤（b）和步骤（c）：

所述步骤（a）包括如下步骤：

（a-1）复合物和待测样本混匀，孵育；

（a-2）完成步骤（a-1）后，采用亲和素检测荧光信号值；

所述步骤（b）包括如下步骤：

（b-1）所述复合物和目标蛋白标准溶液混匀，孵育；

（b-2）完成步骤（b-1）后，采用所述亲和素检测荧光信号值；

所述步骤（c）：根据所述目标蛋白标准溶液中目标蛋白的浓度和相应荧光信号值绘制标准曲线，将所述步骤（a-2）得到的荧光信号值代入所述标准曲线，得到待测样本中目标蛋白的含量；

所述复合物为一个末端连接目标蛋白抗体、另一个末端连接生物素的特异肽段；所述特异肽段为a1）或a2）或a3）或a4）：a1）bap1肽段；a2）bap2肽段； a3）bap5肽段；a4）bap10肽段；

所述bap1肽段为氨基酸序列是序列表中序列3自N端起第222至238位所示的肽段；所述bap2肽段为氨基酸序列是序列表中序列6自N端起第222至263位所示的肽段；所述bap5肽段为氨基酸序列是序列表中序列9自N端起第222至338位所示的肽段；所述bap10肽段为氨基酸序列是序列表中序列12自N端起第222至463位所示的肽段；

所述生物素可与亲和素结合。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述亲和素为卵白亲和素。

3.一种检测待测样本中目标蛋白的含量的试剂盒甲，包括权利要求1或2所述复合物和亲和素。

4.如权利要求3所述试剂盒甲，其特征在于：所述试剂盒甲还包括目标蛋白标准溶液。

5.权利要求3或4所述试剂盒甲在检测待测样本中目标蛋白的含量中的应用。

6.权利要求1或2中所述复合物在检测待测样本中目标蛋白的含量中的应用。

7.权利要求1或2中所述复合物。