CN104655833A - 一种酶纳米复合物及其可控自组装方法和在免疫分析中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种酶纳米复合物，包括位于核心层的纳米颗粒，位于中间层的生物素及位于外层的亲和素修饰的酶；其中所述纳米颗粒为由M个相同或同源的亚基通过自组装形成的球形纳米颗粒，每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素，所述M≥12，且M为整数。此外，本发明还提供一种酶纳米复合物可控自组装方法，通过本发明方法制备得到的酶纳米复合物酶分子数量可控、均一，且通过调整组装比例，可以得到具有不同酶分子数量的酶纳米复合物；进一步的，本发明中酶-铁蛋白纳米复合物可用于免疫分析，信号稳定、重现性好、操作方便且灵敏度高。

Description

一种酶纳米复合物及其可控自组装方法和在免疫分析中的应用
技术领域
本发明涉及免疫分析领域，特别涉及一种酶纳米复合物及其可控自组装方法和复合物在免疫分析中的应用。
背景技术
酶联免疫分析(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)是临床、科研中应用广泛的特异性目标分子分析方法，其主要通过抗原-抗体分子间的特异性识别和酶分子的高效催化来实现对复杂混合物中目标分子的检测，传统的ELISA方法，通过在抗体分子上进行酶分子修饰来进行信号输出，通常是一对抗原抗体复合物对应一个酶分子，检测范围在0.1ng/ml-100ng/ml之间。随着技术的发展，该灵敏度已经不能够满足临床检测和科学研究中的需求，因此亟需发展新型的高灵敏分析方法。
目前，现有技术为了增加检测灵敏度，常见的方法是增加修饰的酶分子的数量从而提高检测灵敏度。主要包括以下几种方法：
1.层层自组装生物素化蛋白网络，例如现有技术“Layer by layerassembly of biotinylated protein networks for signal amplification”,Chem.Commun.,2013,49,2397，该技术通过多生物素标记的蛋白分子与亲和素反复的结合形成大的复合物，从而使生物素增多，结合大量亲和素修饰的酶分子，提高免疫分析灵敏度。但是，该方法存在步骤多，检测时间长，复合物表面酶分子数量不可控等问题，会造成信号不稳定或者批次间操作的差异等问题。
2.酶信号循环放大法，例如现有技术CN 102809648 A公开了一种酶信号循环放大高灵敏免疫检测方法，该方法主要是通过使用抗HRP的抗体与HRP交联，两者间相互结合形成大的酶分子复合物，来提高灵敏度。然而该方法交联会破坏HRP或抗体的活性，相互结合形成大团复合物后，尺寸、酶分子数量完全不可控，会造成信号输出不稳定等问题，而且制备过程复杂。
3.纳米自组装法，如现有技术“Seeding-induced self-assemblingprotein nanowires dramatically increase the sensitivity ofimmunoassays”，Nano Lett.9(6):2246-50.2009；“An auto-biotinylated bifunctionalprotein nanowire for ultra-sensitive molecular biosensing.BiosensBioelectron”,26(4):1137-41.2010。纳米自组装方法是通过自组装的方法将酶分子和特异性结合分子整合在蛋白纳米线上，提高最终结合在抗原-抗体复合物上的酶分子数量，提高检测灵敏度。但是该方法也存在制备不可控的问题，酶分子数量不确定，最终导致信号不稳定，无法应用于定量检测。且制备过程繁琐、成本高。
4.纳米管、纳米颗粒法，在纳米材料(如金纳米颗粒、碳纳米管等)上修饰酶分子和抗体分子，通过提高酶分子数量来提高检测灵敏度的。但是该方法中修饰过程不可控，会导致蛋白分子功能失活，修饰数量和质量难以控制，批次间重现性差。
发明内容
本发明为了克服现有技术酶分子数量不可控、重现性差、信号不稳定等缺点，提供了一种酶纳米复合物及其可控自组装方法，复合物所含有的酶分子数量基本一致，并且通过调整组装比例，可以得到具有不同酶分子数量的酶纳米复合物。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种酶纳米复合物，包括位于核心层的纳米颗粒，位于中间层的生物素及位于外层的亲和素修饰的酶；其中所述纳米颗粒为由M个相同或同源的亚基通过自组装形成的球形纳米颗粒，每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素，所述M≥12，且M为整数。
优选的，酶纳米复合物(简称ENC)中所含有的酶分子数量可通过以下公式进行简略计算：
X＝n×M-i×n/2
其中，X代表ENC中酶分子的数量，M代表纳米颗粒的亚基数目，n代表ENC中所整合的生物素化的蛋白纳米颗粒(简称NP)的数量，i代表每个NP与相邻颗粒共享的亲和素修饰的酶分子的数量。
优选的，所述纳米颗粒为蛋白纳米颗粒；本领域技术人员知晓，所述纳米颗粒还可为病毒纳米颗粒。更为优选的，所述纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒，其中，每个铁蛋白纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接24个生物素。本领域技术人员知晓，铁蛋白纳米颗粒还可为小铁蛋白，其中，每个小铁蛋白纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接12个生物素。
优选的，所述酶纳米复合物为单体，其中，所述单体表面修饰有M个酶分子。更为优选的，所述单体表面修饰有24个酶分子。
优选的，所述酶纳米复合物为多聚体；优选的，所述多聚体可为二聚体至十聚体(包括二、三、四、五、六、七、八、九、十聚体)，更为优选的，所述多聚体可为二聚体、三聚体或四聚体。当所述酶纳米复合物为二聚体时，两个纳米颗粒共用一个生物素，当纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒时，二聚体表面修饰有47个酶分子；当复合物为三聚体时，当纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒时，三聚体表面修饰有69个酶分子；当复合物为四聚体，纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒时，四聚体表面修饰有92个酶分子。依次类推，随着共用的生物素数量的增加，形成包括更多酶分子的多聚体。
优选的，所述每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素包括：
通过分子克隆在所述纳米颗粒亚基的N末端融合生物素接受多肽(biotin accepted peptide,BAP)得到融合蛋白基因，将所述融合蛋白基因克隆入表达载体；
将生物素蛋白连接酶(Biotin-protein ligase,BirA)克隆入共表达载体中；
将所述表达载体、共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白和生物素；
经破碎、纯化后制得生物素化的纳米颗粒。
优选的，所述纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒，铁蛋白包括24个相同或同源的亚基；更为优选的，铁蛋白为重组人重链铁蛋白(recombinant human heavy-chain ferritin,rHF)。
优选的，通过分子克隆在所述纳米颗粒亚基的N末端融合连接多肽之后再融合生物素接受多肽得到融合蛋白基因。减少可能存在的位阻的影响，保持生物素接受多肽远离纳米颗粒的表面。
优选的，所述表达载体和所述共表达载体为质粒载体，所述表达宿主选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或哺乳动物细胞。更为优选的，所述表达载体为pET-28、pET-32、pET-15或pET-11，所述共表达载体为pCDFDuel-1，所述表达宿主为大肠杆菌。
优选的，所述克隆通过链式酶聚合反应(PCR)完成。
优选的，将生物素蛋白连接酶(BirA)克隆入共表达载体中具体包括：获取BirA基因的核苷酸序列，设计引物，在上、下游引物中分别加入限制性内切酶NcoI和SalI的酶切位点，通过PCR扩增BirA基因；将PCR产物BirA和表达载体pCDFDuel-1进行双酶切反应，收集酶切产物；将收集到的酶切产物BirA和pCDFDuel-1载体按物质的量比以6：1进行连接反应，得到BirA-pCDFDuel-1。
优选的，将所述表达载体、共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白和生物素具体包括：将表达载体和共表达载体加入含有表达宿主和抗生素的培养基中培养过夜，直至活化至对数生长期，加入IPTG诱导表白蛋白和生物素过夜，进行培养和表达。
优选的，经破碎、纯化后制得生物素化的纳米颗粒具体包括：收集表达后的产物进行超声破粹，收集上清液，水浴反应后离心，收集上清液利用蔗糖密度梯度离心或凝胶排阻层析收集纳米颗粒。
优选的，所述酶为辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶或碱性磷酸酶。
另一方面，本发明还提供一种酶纳米复合物可控自组装方法，通过遗传修饰制备生物素化的纳米颗粒，将所述生物素化的纳米颗粒与亲和素修饰的酶混合，其中，所述纳米颗粒为由M个相同或同源的亚基通过自组装形成的球形纳米颗粒，每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素，所述M≥12，且M为整数；通过调整所述生物素化的纳米颗粒与亲和素修饰的酶的比例得到酶纳米复合物。
优选的，当生物素化的纳米颗粒与亲和素修饰的酶按物质的量比大于1：M时，复合物形成多聚体，当比例小于等于1：M时，复合物为单体。
优选的，所述纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒，每个铁蛋白纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接24个生物素，生物素化的铁蛋白纳米颗粒与亲和素修饰的酶按物质的量比为1：20～30。
优选的，所述生物素化的铁蛋白纳米颗粒与亲和素修饰的酶按物质的量比为1：20～23.5。得到的酶-铁蛋白纳米复合物为多聚体，且通过调整两者之间的比例，酶-铁蛋白纳米复合物尺寸可控、均匀，能够负载更多的酶分子，进一步提高检测灵敏度。更为优选的，所述生物素化的铁蛋白纳米颗粒与亲和素修饰的酶按物质的量比为1：20或1：22或1：23.5。
优选的，所述每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素包括：
通过分子克隆在所述纳米颗粒亚基的N末端融合生物素接受多肽(biotin accepted peptide,BAP)得到融合蛋白基因，将所述融合蛋白基因克隆入表达载体；
将生物素蛋白连接酶(Biotin-protein ligase,BirA)克隆入共表达载体中；
将所述表达载体、共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白和生物素；
经破碎、纯化后制得生物素化的纳米颗粒。
优选的，所述纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒，铁蛋白包括24个相同或同源的亚基；更为优选的，铁蛋白为重组人重链铁蛋白(recombinant human heavy-chain ferritin,rHF)。
优选的，通过分子克隆在所述纳米颗粒亚基的N末端融合连接多肽之后再融合生物素接受多肽得到融合蛋白基因。减少可能存在的位阻的影响，保持生物素接受多肽远离纳米颗粒的表面。
优选的，所述表达载体和所述共表达载体为质粒载体，所述表达宿主选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或哺乳动物细胞。更为优选的，所述表达载体为pET-28、pET-32、pET-15或pET-11，所述共表达载体为pCDFDuel-1，所述表达宿主为大肠杆菌。
优选的，所述克隆通过链式酶聚合反应(PCR)完成。
优选的，将生物素蛋白连接酶(BirA)克隆入共表达载体中具体包括：获取BirA基因的核苷酸序列，设计引物，在上、下游引物中分别加入限制性内切酶NcoI和SalI的酶切位点，通过PCR扩增BirA基因；将PCR产物BirA和表达载体pCDFDuel-1进行双酶切反应，收集酶切产物；将收集到的酶切产物BirA和pCDFDuel-1载体按物质的量比以6：1进行连接反应，得到BirA-pCDFDuel-1。
优选的，将所述表达载体、共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白和生物素具体包括：将表达载体和共表达载体加入含有表达宿主和抗生素的培养基中培养过夜，直至活化至对数生长期，加入IPTG诱导表白蛋白和生物素过夜，进行培养和表达。
优选的，经破碎、纯化后制得生物素化的纳米颗粒具体包括：收集表达后的产物进行超声破粹，收集上清液，水浴反应后离心，收集上清液利用蔗糖密度梯度离心或凝胶排阻层析收集纳米颗粒。
优选的，所述酶为辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶或碱性磷酸酶。
进一步的，本发明还提供一种用于免疫分析的试剂盒，所述试剂盒包括生物素化的纳米颗粒以及亲和素修饰的酶，所述纳米颗粒为由M个相同或同源的亚基通过自组装形成的球形纳米颗粒，每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素，所述M≥12，且M为整数。在使用时，将生物素化的蛋白纳米颗粒和亲和素修饰的酶按一定的比例进行混合，即可制得不同尺寸的ENC。试剂盒中也可包括预制好的ENC试剂，在免疫反应中无需混合直接使用即可。优选的，所述酶可为辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶。优选的，所述纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒，每个铁蛋白纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接24个生物素。
此外，本发明还提供一种酶纳米复合物在免疫分析中的应用。
本发明有益效果：
1、灵敏度高。酶纳米复合物(enzyme nano-composite，ENC)通过可控自组装整合了大量的酶分子，相较于传统的酶联免疫法，其检测灵敏度提高了1000～10000倍。
2、可控性好。通过本发明制备方法制得的ENC在不同比例下具有不同的聚集状态，所含有的酶分子数量在一定范围内稳定，从而使批次间的稳定性提高，批次内的可定量性好。
3、方法简单、成本低。基于ENC的高灵敏ELISA是在现有的商业化试剂中添加一种试剂即可达到，可自己添加，也可制备出预制试剂，灵活方便。相比化学发光和电化学检测，不需要专用的仪器设备和人员培训，并达到化学发光和电化学放光方法的灵敏度。
附图说明
图1生物素化铁蛋白纳米颗粒制备的示意图。
图2生物素化纳米颗粒的电子显微镜表征。
图3生物素化纳米颗粒的动态光散射表征尺寸。
图4western blot测定生物素化纳米颗粒与SA-HRP的结合能力。
图5生物素化纳米颗粒的生物素化效率。
图6ENC的可控制备。a、在SA-HRP饱和与过饱和的情况下ENC形成含有一个BAP-rHF纳米颗粒的单体；b、二聚体的形成；c、BAP-rHF纳米颗粒需要与相邻颗粒共享两个SA-HRP时，所形成的三聚体、四聚体；d、基于ENC的超灵敏ELISA示意图。
图7不同组装比例的ENC的电子显微镜表征。
图8间接ELISA检测抗HIV p24抗体的血清模拟样品。
图9夹心ELISA检测cTnI模拟样品。
图10基于ENC的cTnI实际样品检测(a)与使用传统ELISA方法的比较(b)。左边为17个确认发生AMI的病人样品，右边为健康人样品检测结果。
具体实施方式
本发明具体实施方式、实施例中“遗传修饰”指的是通过分子生物学技术对生物体的基因组进行遗传修饰，所得到的基因组成和性状改变。“铁蛋白纳米”为由24个相同或同源的亚基构成的具有空腔结构的球形蛋白纳米颗粒。此外，小铁蛋白为由12个相同或同源的亚基构成的具有空腔结构的球形蛋白纳米颗粒。“亲和素”包括但不限于亲和素(Avidin)、链酶亲和素(Streptomyces avidin)。“生物素接受多肽”(biotin accepted peptide,BAP)为能够与铁蛋白N端融合且能够连接生物素的多肽。“生物素蛋白连接酶”(Biotin-proteinligase,BirA)是指能够活化生物素并将生物素连接到生物素受体蛋白上的酶。
本发明具体实施方式、实施例中缩写ENC可代表酶纳米复合物、酶-铁蛋白纳米复合物、SA-HRP和BAP-rHF结合产物，具体所代表的含义依据上下文理解。
本发明具体实施方式、实施例中缩写BAP-rHF可代表修饰/未修饰生物素的BAP-rHF、BAP-Linker-rHF，具体所代表的含义依据上下文理解。
实施例1
一种酶纳米复合物，包括位于核心层的纳米颗粒，位于中间层的生物素及位于外层的亲和素修饰的酶；其中所述纳米颗粒为由M个相同或同源的亚基通过自组装形成的球形纳米颗粒，每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素，所述M≥12，且M为整数。
酶纳米复合物通过可控自组装制备，具体为通过遗传修饰制备生物素化的纳米颗粒，将所述生物素化的纳米颗粒与亲和素修饰的酶混合，其中，所述纳米颗粒为由M个相同或同源的亚基通过自组装形成的球形纳米颗粒，每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素，所述M≥12，且M为整数；通过调整所述生物素化的纳米颗粒与亲和素修饰的酶的比例得到酶纳米复合物。在一个具体的实施方式中，当生物素化的纳米颗粒与亲和素修饰的酶按物质的量比大于1：M时，复合物形成多聚体，当比例小于等于1：M时，复合物为单体。
本领域技术人员知晓，在实际使用中，由于试剂浓度测量的准确性以及其它客观条件(如系统误差、分子的具体差异等)的限制，生物素化的纳米颗粒与亲和素修饰的酶之间的比例可以根据实际需求进行微调，并不局限于上述实施例中具体数值。
本发明实施例中酶纳米复合物(简称ENC)中所含有的酶分子数量可通过以下公式进行简略计算：
X＝n×M-i×n/2
其中，X代表ENC中酶分子的数量，M代表纳米颗粒的亚基数目，n代表ENC中所整合的生物素化的蛋白纳米颗粒(简称NP)的数量，i代表每个NP与相邻颗粒共享的亲和素修饰的酶分子的数量。
在一个具体的实施方式中，纳米颗粒可为蛋白纳米颗粒或病毒纳米颗粒，在本发明一个具体实施例中，以包含24个相同或同源的铁蛋白纳米颗粒为例进行阐述。
当纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒时，酶纳米复合物记为酶-铁蛋白纳米复合物，其包括位于核心层的铁蛋白纳米颗粒、位于中间层的生物素及位于外层的亲和素修饰的酶；其中，每个铁蛋白纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接24个生物素。
酶-铁蛋白纳米复合物的制备方法为：通过遗传修饰制备生物素化的铁蛋白纳米颗粒，将生物素化的铁蛋白纳米颗粒与亲和素修饰的酶混合，其中，所述生物素化的铁蛋白纳米颗粒与亲和素修饰的酶按物质的量比为1：20～30。
在本发明实施例中，首先制备出一个表面均匀修饰生物素(Biotin)的纳米颗粒，然后加入亲和素修饰的酶分子，亲和素修饰的酶分子与生物素化纳米颗粒结合形成酶-纳米颗粒复合物。如何均匀的在纳米颗粒表面修饰生物素以及控制酶与纳米颗粒之间的比例是制备尺寸可控、均匀的酶纳米复合物的关键。
本发明一个具体实施例中，利用铁蛋白能够自组装成尺寸可控的纳米颗粒，并基于遗传修饰的方法，在铁蛋白的24条亚基上修饰生物素，使每个铁蛋白颗粒表面均匀连接24个生物素，得到均匀修饰生物素的纳米颗粒。本领域技术人员知晓，纳米颗粒不限于铁蛋白纳米颗粒，其它与铁蛋白类似的能够进行遗传修饰和可控自组装的球形蛋白纳米或病毒纳米颗粒也可适用于本发明酶-纳米可控自组装方法。
本发明经过大量的研究发现，当亲和素修饰酶分子的数量多于生物素时，就会形成酶分子包裹的纳米颗粒；当亲和素修饰的酶分子的数量少于生物素数量时，纳米颗粒间会共用亲和素，从而发生纳米颗粒间的聚集，继而形成更大尺寸的ENC，控制两者间的比例可以得到可控大小的ENC，进而得到具备不同酶分子的复合物。当生物素化的铁蛋白纳米颗粒与亲和素修饰的酶按物质的量比为1：20～30，能够得到均一、稳定的单体ENC和多聚体ENC。
实施例2
下面结合附图1-5对本发明生物素化铁蛋白纳米颗粒的制备作进一步阐述。
1、生物素化铁蛋白的基因克隆：如附图1所示，通过分子克隆在重组人重链铁蛋白(由中科院武汉病毒所分子识别与纳米生物传感学科组保藏，其核苷酸序列和蛋白序列参见序列表SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2)(recombinant human heavy-chain ferritin,简称rHF)的N末端融合生物素接受多肽(biotin accepted peptide,简称BAP，其核苷酸序列和蛋白序列参见序列表SEQ ID No.3和SEQ ID No.4)及柔性连接多肽(Linker peptide，其核苷酸序列和蛋白序列参见序列表SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6)形成融合蛋白BAP-Linker-rHF(简称BAP-rHF，其核苷酸序列和蛋白序列参见序列表SEQ ID No.7和SEQID No.8)。该融合蛋白中，BAP标签可以在大肠杆菌生物素蛋白连接酶(Biotin-protein ligase(EC 6.3.4.15),BirA，其核苷酸序列和蛋白序列参见序列表SEQ ID No.9和SEQ ID No.10)的作用下被生物素化；Linker peptide的作用是保持BAP标签远离铁蛋白纳米颗粒的表面，减少可能存在的空间位阻的影响；rHF的作用是通过自身的自组装形成纳米颗粒将生物素化的BAP标签集成在其表面，最终得到的生物素化纳米颗粒表面均匀分布24个生物素分子。
2、生物素化铁蛋白的表达、纯化：融合蛋白的基因被克隆入表达载体pET-28(购自Merck公司)中，得到pET28-BAP-rHF。同时克隆生物素蛋白连接酶BirA到共表达载体pCDFDuet-1(购自Merck公司)中，得到pCDFDuet-BirA。将两个载体共转化入表达宿主大肠杆菌表达菌株BL21(由中科院武汉病毒研究所分子识别与纳米生物传感学科组保藏)中，采用卡那霉素、链霉素双抗平板挑取阳性克隆，并培养过夜。然后二次活化至对数生长期(OD值在0.4-0.5之间)，加入终浓度为1mM的IPTG诱导表达蛋白，同时加入生物素(工作终浓度50μM)，培养过夜。5000×g离心8分钟收集菌体，弃上清，使用组织缓冲液(30mM Tris，150mM NaCl)重悬菌体。超声破碎菌体后再次10000×g离心30分钟，去除细胞碎片。取上清60℃恒温热处理40分钟，10000×g离心30分钟，去除沉淀的杂蛋白。取上清进行蔗糖密度梯度离心(38,000rpm离心4小时)和/或凝胶排阻层析(Sephrose 6B，GE)分离并收集自生物素化铁蛋白纳米颗粒。
本领域技术人员知晓，本发明上述具体实施方式中蛋白的表达与纯化中具体参数(例如浓度、时间、温度等)数值并不用于限制本发明，本领域技术人员可以依据实际需求作调整。
对收集到的铁蛋白纳米颗粒，采用电子显微镜进行表征，由本发明附图2表征图可知，采用本发明方法制备出的生物素化纳米粒子粒径均匀，发现有大量的笼形结构颗粒。通过测量600个颗粒，统计所得到的颗粒直径为13.65±0.65nm，Bar＝100nm。
对收集到的铁蛋白纳米颗粒，进行动态光散射表征其尺寸，参见附图3，显示其具有良好的单分散性，其水和半径为15.6nm。
采用western blot测定生物素化纳米颗粒与辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素(SA-HRP)的结合能力，从而验证纳米颗粒生物素化，结果如附图4所示，BAP-rHF所在的条带有明显的显色，其他条带则无明显显色，表明BAP-rHF被生物素化。
采用质谱测定生物素化纳米颗粒的生物素化效率，结果如附图5所示，根据其分子量分析,自生物素化铁蛋白亚基的分子量为23932.0与理论预测值23935.51基本一致，表明每个铁蛋白亚基都被修饰且仅被一个生物素分子修饰。
在一个具体的实施方式中，克隆通过链式酶聚合反应(PCR)完成的。将BirA克隆入pCDFDuet-1具体包括：获取BirA基因的核苷酸序列，设计引物，在上、下游引物中分别加入限制性内切酶NcoI和SalI的酶切位点，通过PCR扩增BirA基因；将PCR产物BirA和表达载体pCDFDuel-1进行双酶切反应，收集酶切产物；将收集到的酶切产物BirA和pCDFDuel-1载体按物质的量比以6：1进行连接反应，得到BirA-pCDFDuel-1。
在一个具体的实施方式中，表达载体可为质粒载体，包括但不限于pET-28、pET-32、pET-15或pET-11质粒载体等；表达宿主还可为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或哺乳动物细胞等能够进行蛋白表达的宿主。
实施例3
下面结合附图6-7对本发明酶-铁蛋白纳米复合物的可控制备作进一步阐述。
酶-铁蛋白纳米复合物(以下简称ENC)的制备原理：铁蛋白会组装成24个亚基组成的纳米颗粒，通过在其N端融合BAP标签，可以形成表面均匀分布24个BAP标签的纳米颗粒。在生物素蛋白连接酶BirA的作用下，BAP会被生物素化，这样每个融合BAP-rHF会被且仅被一个生物素修饰，最终得到的融合蛋白BAP-rHF纳米颗粒表面会均匀修饰24个生物素分子。
将BAP-rHF纳米颗粒与亲和素修饰的酶(本发明实施例中亲和素具体为链酶亲和素，酶为辣根过氧化物酶，记为SA-HRP)混合，通过生物素与亲和素的结合，SA-HRP可以结合在BAP-rHF纳米颗粒的表面。
如附图6-a和7-a所示，当溶液中SA-HRP的量远远超过或等于BAP-rHF表面生物素分子的数量时(即SA-HRP：BAP-rHF纳米颗粒≥24：1时)，在一个具体的实施方式中，配比可以为24～30：1，本领域技术人员知晓SA-HRP的量可以更大，但是饱和后继续增加酶的用量意义不大。BAP-rHF纳米颗粒表面的生物素分子就会被SA-HRP所饱和，从而形成表面覆盖有HRP仅含有一个纳米颗粒的ENC。随着SA-HRP数量的减少，BAP-rHF纳米颗粒表面的生物素分子不能被SA-HRP所饱和时，BAP-rHF纳米颗粒间就必须共享SA-HRP，从而形成纳米颗粒间的聚集。
如附图6-b和7-b所示，当SA-HRP：BAP-rHF纳米颗粒＝23.5：1时，每两个BAP-rHF纳米颗粒间就必须共享一个SA-HRP，这样就会形成两个BAP-rHF纳米颗粒聚集的ENC。本领域技术人员知晓，在具体的试验中，由于试剂浓度测量的准确性以及其它客观条件(如系统误差、分子的具体差异等)的限制，形成二聚体时两者的比例并不局限于23.5：1，也可依据实际需求作微调。
如附图6-c和7-c所示，进一步减少SA-HRP的量达到SA-HRP：BAP-rHF纳米颗粒＝23：1时，每个纳米颗粒就需要与相邻的纳米颗粒共享两个SA-HRP分子，从而形成三聚体或四聚体形式的ENC。SA-HRP：BAP-rHF纳米颗粒＝22.5：1时，每个纳米颗粒就需要与相邻的两个或三个纳米颗粒共享多个SA-HRP分子，从而形成大的多聚体(如附图7-d、7-e)。进一步减少SA-HRP的量，例如可为20～22.5：1，可以得到更多纳米颗粒聚集的紧密堆积的ENC(如附图7-f)。本领域技术人员知晓，在具体的试验中，由于试剂浓度测量的准确性以及其它客观条件(如系统误差、分子的具体差异等)的限制，形成多聚体时两者的比例并不局限于上述具体数值，也可依据实际需求作微调。
当SA-HRP的量减少到一定比例，这种趋势发生改变。
本发明实施例中ENC中所含有的酶分子数量可通过以下公式进行简略计算：
X＝n×24-i×n/2
其中，X代表ENC中酶分子的数量，n代表ENC中所整合的生物素化的铁蛋白纳米颗粒(简称bFNP)的数量，i代表每个bFNP与相邻颗粒共享的SA-HRP的数量。
在一个具体的实施方式中，单体的ENC含有酶分子约为24个、二聚体(共用一个亲和素)有47个酶分子、三聚体(共用2个亲和素)或四聚体(共用2个亲和素)有69-92个，六至十聚体(共用3个亲和素)有141-225个酶分子，且随着共享的亲和素增多所含有的酶分子会更多，当达到一定比例后，最终可使ENC含有高达数百个酶分子。
相对已有的提高酶分子数量的方法，本发明所制备的ENC具有更大的形态一致性。而且本方法仅需在现有的商业化试剂中添加bFNP即可制备，非常便捷。同时，也可以制成预制试剂，满足大部分形式免疫分析的使用。
在一个具体的实施方式中，本发明中酶还可为葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、蔗糖氧化酶、酪氨酸氧化酶等可用于酶联反应的酶。
实施例4
在本发明一个具体的实施方式中，ENC可用于制备ELISA检测试剂盒，试剂盒包括生物素化的纳米颗粒以及亲和素修饰的酶，纳米颗粒为由M个相同或同源的亚基通过自组装形成的球形纳米颗粒，每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素，其中M≥12，且M为整数。在使用时，将生物素化的蛋白纳米颗粒和亲和素修饰的酶按一定的比例进行混合，即可制得不同尺寸的ENC。
在一个具体的实施方式中，试剂盒包括生物素化的铁蛋白纳米颗粒以及亲和素修饰的酶，其中每个铁蛋白纳米颗粒表面均匀连接24个生物素。在使用时，将生物素化的铁蛋白纳米颗粒和亲和素修饰的酶按一定的比例进行混合，即可制得不同尺寸的ENC。也可以将ENC预制成实际，在实际使用中直接添加即可。此外，单独使用本发明试剂盒中的生物素化的纳米颗粒与其它现有的商业试剂混合，也可用于免疫分析。
其中，本发明中酶可为辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、蔗糖氧化酶、酪氨酸氧化酶等可用于酶联反应的酶。
本领域技术人员知晓，试剂盒中还可包括缓冲液、洗涤液、稀释液或显色剂等，在此不做赘述。
实施例5
下面结合附图6-10对本发明基于ENC的超灵敏ELISA作进一步阐述。以下实施例中以酶-铁蛋白纳米复合物为例，本领域技术人员知晓，ENC不仅限于酶-铁蛋白纳米复合物，其它与铁蛋白类似的能够进行遗传修饰和可控自组装的球形蛋白纳米或病毒纳米颗粒也可适用于本发明ELISA检测。
1、ENC用于免疫分析大幅提高灵敏度的原理：通过控制SA-HRP与BAP-rHF纳米颗粒之间的摩尔比例，即可得到尺寸可控的ENC，ENC整合了大量的酶分子，同时又具有SA包覆的表面。如附图6-d所示，ENC可以在通过生物素-亲和素相互作用将大量的酶分子结合于生物素化抗体-抗原复合物上，从而达到大幅提高免疫分析灵敏度的目的。
2、ENC的制备：测定BAP-rHF纳米颗粒和SA-HRP的浓度，按照一定比例(物质的量比为1：20–1：30之间)将BAP-rHF纳米颗粒与SA-HRP混合并剧烈振荡混匀后，4度孵育备用。
3、基于ENC的超灵敏免疫分析：
a、基于ENC的间接ELISA，其具体步骤为：
1)将抗原包被于酶标板；
2)洗涤；
3)封阻；
4)洗涤；
5)分别加入样品及阴阳性对照，孵育；
6)洗涤；
7)加入生物素化一抗，孵育；
8)洗涤；
9)加入预先制备的不同比例的ENC，孵育；
10)洗涤；
11)加入底物反应，孵育；
12)终止反应，测定结果。
b、基于ENC的夹心ELISA，其具体步骤为：
1)将捕获抗体包被于酶标板；
2)洗涤；
3)封阻；
4)洗涤；
5)每孔加入样品及阴阳性对照，孵育；
6)洗涤；
7)加入生物素化识别抗，孵育；
8)洗涤；
9)加入预先制备的不同比例的ENC，孵育；
10)洗涤；
11)加入底物反应，孵育；
12)终止反应，测定结果。
将ENC用于间接ELISA检测HIV p24抗体和心肌肌钙蛋白cTnI的结果分别提高了检测灵敏度1000和10000倍。
下面结合附图8对基于ENC的p24抗体检测作进一步阐述：
1)将纯化的p24抗原(购自苏州杰恩)用包被缓冲液(碳酸盐缓冲液)稀释为10μg/mL，100μL/孔包被96孔板(购自corning)，4℃过夜。
2)洗涤，PBST(含有0.05％Teween 20的PBS，300μL/孔)洗3遍。
3)封阻，每孔加入300μL的5％的脱脂牛奶(PBS溶解)，37℃封阻2小时。
4)洗涤，PBST洗3遍。
5)将p24抗体用健康人血清梯度稀释(从1μg/mL到1pg/ml)，每孔加入100μL，于恒温混匀仪上37℃反应2小时。
6)甩去反应液，用PBST(320μL/孔)洗3次，每次在恒温混匀仪上振荡2分钟。
7)将生物素化的羊抗小鼠IgG(购自博士德)按说明书稀释，每孔加入100μL，于恒温混匀仪上37℃反应1小时。
8)甩去反应液，用PBST(320μL/孔)洗3次，每次在恒温混匀仪上振荡2分钟。
9)每孔加入100μL ENC(组装比例1：20～23.5)，于恒温混匀仪上37℃反应1小时。
10)甩去反应液，用PBST(320μL/孔)洗3次，每次在恒温混匀仪上振荡2分钟。
11)每孔加入200μL的TMB显色液，37℃显色10分钟。显色结束，每孔加入50μL的硫酸终止液(2M)，在酶标仪上(Bio-SynergyH1)测定450nm的光吸收值。
由附图8结果显示，使用了ENC的抗p24抗体检测相对使用传统酶标抗体的检测灵敏度提高了1,000倍以上。
下面结合附图9对基于ENC的cTnI标准品和临床样品的检测5做进一步阐述。
1)将cTnI抗体捕获抗体(购自Hytest，产品编号19C7)用包被缓冲液(碳酸盐缓冲液)稀释为5μg/mL，以100μL/孔加入到96微孔板中(购自Corning)，4℃过夜。
2)甩去包被液，用PBST(320μL/孔)洗3次，每次在恒温混匀仪上振荡2分钟。
3)每孔加入320μL的5％的脱脂牛奶(PBS溶解)，于恒温混匀仪上37℃封阻2小时。
4)甩去反应液，用PBST(320μL/孔)洗3次，每次在恒温混匀仪上振荡2分钟。
5)将cTnI标准品(购自Hytest，产品编号8RTI7)梯度稀释于无cTnI血清(购自Hytest，产品编号8TFS)，样品浓度为1μg/mL到1pg/ml，于恒温混匀仪上37℃反应2小时。
6)甩去反应液，用PBST(320μL/孔)洗3次，每次在恒温混匀仪上振荡2分钟。
7)每孔加入100μL的1:1000稀释的生物素化cTnI抗体识别抗体(抗体购自Hytets，产品编号16A11，生物素化试剂盒购自Dojindo)，于恒温混匀仪上37℃反应1小时。
8)甩去反应液，用PBST(320μL/孔)洗3次，每次在恒温混匀仪上振荡2分钟。
9)每孔加入100μL预先制备的ENC(组装比例1：20～23.5)，于恒温混匀仪上37℃反应1小时。
10)甩去反应液，用PBST(320μL/孔)洗3次，每次在恒温混匀仪上振荡2分钟。
11)每孔加入200μL的TMB显色液(购自Sigma)，37℃显色10min。显色结束，每孔加入50μL的硫酸终止液(2M)，在酶标仪上(Bio-Synergy H1)测定450nm的光吸收值。
由附图9结果显示基于ENC的cTnI检测灵敏度相对传统方法提高了10,000倍以上。
下面结合附图10对cTnI的实际样品检测做进一步阐述。
为了测试基于ENC的方法在实际样品中的可靠性，将ENC用于发生AMI病人的血清检测cTnI。首先通过对40份健康人血清的检测，确定ENC方法检测的截断值(cut-offvalue)。然后将基于ENC的免疫分析方法(检测结果参见附图10-a)用于17份病人血清和17份健康人血清混合样品的测试，检测方法同上述夹心ELISA的方法步骤，作为对照，传统的ELISA方法(检测结果参见附图10-b)同时进行。由附图10结果表明基于ENC的方法检出了所有病人血清，而传统方法则有四份未检出，有两份难以判断。这说明基于ENC的免疫分析方法是可以适用于临床样品的，且相对于传统方法具备更高的检测灵敏度和准确性。
本领域技术人员知晓，本发明具体实施例中免疫反应中所使用的参数例如清洗液、时间、温度、试剂使用量、浓度并不用于限制本发明的保护范围，其可以依据试验需求进行合理选择。本领域技术人员知晓，本发明具体实施例中ENC组装比例的数值可以依据具体试验的需求作微调，并不局限于实施例中所列举的具体数值。
本领域技术人员知晓，本发明中酶纳米复合物可以应用于以治疗为目的或非治疗为目的检测中。

Claims (17)

1.一种酶纳米复合物，其特征在于：包括位于核心层的纳米颗粒，位于中间层的生物素及位于外层的亲和素修饰的酶；其中所述纳米颗粒为由M个相同或同源的亚基通过自组装形成的球形纳米颗粒，每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素，所述M≥12，且M为整数。
2.如权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述纳米颗粒为蛋白纳米颗粒。
3.如权利要求2所述的复合物，其特征在于：所述蛋白纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒，其中每个铁蛋白纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接24个生物素。
4.如权利要求3所述的复合物，其特征在于：所述复合物为单体，所述单体表面修饰有24个酶分子。
5.如权利要求3所述的复合物，其特征在于：所述复合物为多聚体，所述多聚体为二聚体至十聚体。
6.如权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述酶为辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶或碱性磷酸酶。
7.如权利要求1-6任一项所述的复合物，其特征在于：所述每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素包括：
通过分子克隆在所述纳米颗粒亚基的N末端融合生物素接受多肽得到融合蛋白基因，将所述融合蛋白基因克隆入表达载体；
将生物素蛋白连接酶克隆入共表达载体中；
将所述表达载体、共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白和生物素；
经破碎、纯化后制得生物素化的纳米颗粒。
8.如权利要求7所述的复合物，其特征在于：通过分子克隆在所述纳米颗粒亚基的N末端融合连接多肽之后再融合生物素接受多肽得到融合蛋白基因。
9.如权利要求7所述的复合物，其特征在于：所述表达载体和所述共表达载体为质粒载体，所述表达宿主选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或哺乳动物细胞。
10.如权利要求9所述的复合物，其特征在于：所述表达载体为pET-28、pET-32、pET-15或pET-11，所述共表达载体为pCDFDuel-1，所述表达宿主为大肠杆菌。
11.如权利要求7所述的复合物，其特征在于：所述克隆通过链式酶聚合反应完成。
12.一种如权利要求1-11任一项所述复合物的可控自组装方法，其特征在于：通过遗传修饰制备生物素化的纳米颗粒，将所述生物素化的纳米颗粒与亲和素修饰的酶混合，其中，所述纳米颗粒为由M个相同或同源的亚基通过自组装形成的球形纳米颗粒，每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素，所述M≥12，且M为整数；通过调整所述生物素化的纳米颗粒与亲和素修饰的酶的比例得到酶纳米复合物。
13.如权利要求要求12所述的方法，其特征在于：所述纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒，每个铁蛋白纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接24个生物素，生物素化的铁蛋白纳米颗粒与亲和素修饰的酶按物质的量比为1：20～30。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于：所述生物素化的铁蛋白纳米颗粒与亲和素修饰的酶按物质的量比为1：20～23.5。
15.一种用于免疫分析的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求1-11任一项所述的酶纳米复合物。
16.一种用于免疫分析的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括生物素化的纳米颗粒以及亲和素修饰的酶，所述纳米颗粒为由M个相同或同源的亚基通过自组装形成的球形纳米颗粒，每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素，所述M≥12，且M为整数。
17.一种如权利要求1-11任一项所述的酶纳米复合物在免疫分析中的应用。
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