CN110204618A - 制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法 - Google Patents

制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种制备抗体‑链霉亲和素偶联物的方法。该方法包括：将抗体和还原剂接触，获得经还原的含有巯基的抗体；将所述经还原的含有巯基的抗体和马来酰亚胺修饰的链霉亲和素接触，以便获得所述抗体‑链霉亲和素偶联物。本发明提供的抗体‑链霉亲和素偶联物的制备方法简单快速，而且方便可控。

Description

制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法。
背景技术
随着肿瘤治疗技术的不断进步和发展，个性化用药和靶向治疗所占的比重越来越大；而这其中的关键是预靶输送系统。“预靶”技术指利用抗体-链霉亲和素偶联物将有治疗作用的放射性物质定位到肿瘤部位。抗体使偶联物能定位在带有抗原的疾病部位；链霉亲和素捕获生物素与放射性核素螯合物。
然而获取抗体-链霉亲和素偶联物的方法还需要进一步改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法。
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法，包括：将抗体和还原剂进行第一接触反应，以便获得经还原的含有巯基的抗体；将所述经还原的含有巯基的抗体和马来酰亚胺修饰的链霉亲和素进行第二接触反应，以便获得所述抗体-链霉亲和素偶联物。
在本发明所提供的制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法中，将抗体和还原剂反应，使得抗体中的二硫键被还原，产生活性硫醇，即经还原的含有巯基的抗体；然后与马来酰亚胺修饰的链霉亲和素进行反应，从而可以获得抗体-链霉亲和素偶联物。该抗体-链霉亲和素偶联物的制备方法简单快速，而且方便可控。
本发明所提供的制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法，可以持续产生质量合格数量足够的偶联物用于预靶传送系统的临床发展和评价。而且，所获得的抗体-链霉亲和素偶联物不仅仅可以运用于预靶输送系统，用于肿瘤预定位显像和治疗；也可以运用于亲和层析等分离纯化应用；同样可以运用于免疫诊断技术，例如侧向流层析试纸条这种灵敏度较低的检测方法，可以极大的提高检测的灵敏度。
根据本发明的实施例，以上所述制备抗体-链霉亲和素的方法可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述将还原的含有巯基的抗体和所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素的质量比为2～5：1，优选为2～4:1，更优选为3：1。在该条件下进行偶联，所得到的产物中抗体和链霉亲和素至少有90％以上的抗体-链霉亲和素是按照摩尔比例为1:1和1:2的比例结合，这些偶联物方便可以用于预靶传送系统。
在本发明的一些实施例中，将所述经还原的含有巯基的抗体和所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素在室温下进行第二接触反应30～60分钟，以便获得所述抗体-链霉亲和素偶联物。
在本发明的一些实施例中，每个所述经还原的含有巯基的抗体中带有9-12个所述巯基。每个经还原的抗体中带有9～12个左右的巯基，经还原的抗体和马来酰亚胺修饰的链霉亲和素进行偶联，可以获得纯度至少90％以上的抗体-链霉亲和素偶联物，这些抗体-链霉亲和素偶联物中多数是抗体和链霉亲和素摩尔比为1:1的抗体-链霉亲和素偶联物，也含有少数抗体和链霉亲和素摩尔比为1:2的抗体-链霉亲和素偶联物。例如使用50毫摩尔DTT还原PSA可形成9-12个活性硫醇。还原性PSA能在结合反应前25℃保存超过8h而且活性硫醇没有显著损失。当二硫键被还原，非共价键作用维持重-重和重-轻链的缔合。
在本发明的一些实施例中，所述还原剂为二硫苏糖醇(DTT)。DTT与巯基乙醇作用相似，是巯基化DNA的还原剂和去保护剂，也用于还原蛋白质中二硫键，有抗氧化作用。DTT的刺激性气味和毒性比巯基乙醇低很多。而且DTT比巯基乙醇的还原能力要强，当其浓度比巯基乙醇低7倍时，两者还原效果相近。
在本发明的一些实施例中，将所述抗体和所述还原剂在室温下进行第一接触反应20～50分钟，利用30KD的超滤离心管进行过滤处理，以便获得所述经还原的含有巯基的抗体。
在本发明的一些实施例中，在4摄氏度下采用10000～15000转/分钟离心，进行所述过滤处理。
在本发明的一些实施例中，所述方法进一步包括：将链霉亲和素和SMCC进行第三接触反应，以便获得所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素。
在本发明的一些实施例中，所述链霉亲和素和所述SMCC的摩尔比为1：2～5，优选为1:2～4，更优选为1：3。选择SMCC作为交联剂是因为它反应迅速、可定量且具有相比其它交联剂更好的稳定性。SMCC功能化的SA可无限期冻存在-70摄氏度条件下。SMCCcrosslinker(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸-N-琥珀酰亚胺酯)作为一种具有马来酰亚胺基团的异官能团蛋白质交联剂，即巯基反应和NHS酯基团的胺反应性。SMCC的9原子间隔臂是不可裂解的。环己烷桥为马来酰亚胺基团赋予了额外的稳定性，这使得SMCC成为马来酰亚胺激活蛋白的理想交联试剂。马来酰亚胺能够在pH6.5-7.5的条件下与巯基发生反应，形成稳定的硫醚键。由于间隔臂中含有环己烷桥，SMCC的马来酰亚胺基团甚至在pH7.5条件下都具有极好的稳定性。
在本发明的一些实施例中，将所述链霉亲和素和所述SMCC在室温下进行第三接触反应30～60分钟，利用30KD的超滤离心管进行过滤处理，以便获得所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素。
在本发明的一些实施例中，在4摄氏度采用10000～15000转/分钟离心，进行所述过滤处理。
根据本发明的第二方面，本发明提供了一种制备抗体-链霉亲和素的方法，包括：将抗体和二硫苏糖醇在室温下进行第一接触反应20～50分钟，以便获得经还原的含有巯基的抗体；将链霉亲和素和SMCC在室温下进行第三接触反应30～60分钟，以便获得马来酰亚胺修饰的链霉亲和素；将所述经还原的含有巯基的抗体和所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素在室温下进行第二接触反应30～60分钟，以便获得所述抗体-链霉亲和素，所述经还原的含有巯基的抗体和所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素的质量比为2～5：1，优选为3:1。
在本发明的一些实施例中，在第二接触反应进行30～60分钟后，加入连四硫酸钠溶液终止所述第二接触反应，然后利用蛋白亲和磁珠进行纯化处理，以便获得所述抗体-链霉亲和素。
在本发明的一些实施例中，在所述第一接触反应进行20～50分钟后，利用30kD的超滤离心管在4摄氏度下10000～15000转/分钟离心，以便获得所述经还原的含有巯基的抗体；在所述第二接触反应进行30～60分钟后，利用30kD的超滤离心管在4摄氏度下采用10000～15000转/分钟离心处理，以便获得马来酰亚胺修饰的链霉亲和素。
附图说明
图1是根据本发明的实施例提供的抗体和链霉亲和素的偶联示意图。
图2是根据本发明的实施例提供的PSA抗体偶联链霉亲和素后和未偶联链霉亲和素的免疫活性对比结果。
图3是根据本发明的实施例提供的经过不同摩尔比例的SMCC活化的SA与PSA抗体偶联后的凝胶电泳检测结果图。
图4是根据本发明的实施例提供的不同质量比的SMCC-SA和PSA偶联后的凝胶电泳检测结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
链霉亲和素(streptavidin，SA)是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素，并且不带任何糖基，因此与亲和素一样，一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子。生物素与链霉亲和素间的作用是目前已知强度最高的非共价作用，亲和常数(K)为1015mol/L，比抗原与抗体间的亲和力(K＝105～1011mol/L)至少高1万倍。并且，二者的结合稳定性好、专一性强，不受试剂浓度，PH环境，抑或蛋白变性剂等有机溶剂影响。在商业上可购买到高纯度产品，其具有良好的体内稳定性。链霉亲和素和生物素之间强效迅速结合，在全身行药后能从血液循环中低浓度条件下捕获生物素放射性核素螯合物输送到达疾病部位。
本发明提供了一种制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法，包括：将抗体和还原剂进行第一接触反应，以便获得经还原的含有巯基的抗体；将所述经还原的含有巯基的抗体和马来酰亚胺修饰的链霉亲和素进行第二接触反应，以便获得所述抗体-链霉亲和素偶联物。本发明所提供的制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法，能持续产生质量合格数量足够的偶联物用于预靶传送系统的临床发展和评价。而且，这种技术不仅仅可以运用于预靶输送系统，用于肿瘤预定位显像和治疗；也可以运用于亲和层析等分离纯化应用；同样可以运用于免疫诊断技术，例如侧向流层析试纸条这种灵敏度较低的检测方法，当采用基于生物素-链霉亲和素信号放大的检测系统时，可以极大的提高灵敏度。
本发明适用于一般抗体和链霉亲和素的偶联。在本发明的至少一些实施方式中，所述抗体为PSA抗体。而且为了描述的方便，特以PSA抗体为例描述具体实施例。
本发明所述方法利用DTT还原IgG中的二硫化物生成硫醇。这些硫醇再与位于链霉亲和素表面的马来酰亚胺反应，在合适的浓度下与SMCC反应。还原的IgG和马来酰亚胺官能团化的链霉亲和素以等摩尔比例结合。在最佳反应时间，当修饰的蛋白被最大限度消耗，而还未形成太多高分子量副产物时，通过加入氧化剂连四硫酸钠(连四硫酸钠能重整未反应的硫醇的二硫化物)终止反应。
在本发明的至少一些实施方式中，将SMCC和链霉亲和素进行第三接触反应，获得马来酰亚胺修饰的链霉亲和素。在本发明的至少一些实施方式中，通过下述方法获得SMCC-SA：(1)将链霉亲和素用0.1M PBS稀释到20mg/mL，并加10％(v/v)的0.5M，pH8.0硼酸缓冲液，将pH调至8.0；(2)用DMSO溶解SMCC，然后加入到链霉亲和素中，使摩尔比例条件下链霉亲和素：SMCC＝1：3，温和地搅拌，室温反应30-60min；(3)用30K的超滤离心管4℃下12500r/m离心，除去游离的SMCC，置换缓冲液为0.1M PBS(pH 8.0)。
在本发明的至少一些实施方式中，利用DTT还原抗体，获得经还原的含有巯基的抗体。在本发明的至少一些实施方式中，利用用0.05mM的DTT活化抗体，室温孵育30min，孵育完成后，用30K的超滤离心管4℃下12500r/m离心除去溶液中的DTT。
在本发明的至少一些实施方式中，将SMCC-SA：抗体按照质量比为1:2～4，优选1：3混合，室温反应45分钟，然后加入终浓度为5mM的连四硫酸钠溶液终止反应，以便获得含有抗体-链霉亲和素偶联物的溶液。
虽然所描述的条件代表反应物加入可用结合物的最优比例，反应物不会完全被消耗，部分链霉亲和素仍未被SMCC激活因而不活跃。因此，最终的结合反应混合物中，除了可用的结合物，还包含未反应的链霉亲和素、未反应的抗体和交联副产物。未反应的链霉亲和素通过磁珠亲和分离被去除。在本发明的至少一些实施方式中，对含有抗体-链霉亲和素偶联物的溶液进行纯化。包括：(1)除去游离的亲和素：将protein G磁珠与偶联液混合，室温孵育30min后，用磁力架除去液体。(2)分离SA-antibody：用pH2.5的甘氨酸缓冲液重悬proteinG磁珠，立即用磁力架除去液体，并加入Tris-HCl调节pH至中性，防止抗体降解。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
其中，实施例中所用试剂和设备组成：
还原剂：DTT(二硫苏糖醇):国药。
终止试剂：sodium tetrathionate dihydrate(连四硫酸钠)：国药。
交联剂：SMCC：sigma
分离试剂：protein G磁珠：Thermo fisher
链霉亲和素:Thermo fisher
PSA单克隆抗体：genscript
磁力架，30K超滤离心管：Millipore
高速冷冻离心机：湘仪
缓冲液：
(1)1M的tris-HCl缓冲液：用纯化水、浓HCl和Tris配制终浓度为1mol/L，PH8.0的Tris-HCl缓冲液，0.22μm微孔滤膜除菌后4℃保存备用，有效期两个月。
(2)0.01M PBS：用纯化水、Na2HPO4、KH2PO4、NaCl配制终浓度10mmol/L的PBS缓冲液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后4℃保存备用有效期两个月。
(3)0.5M的硼酸缓冲液：用纯化水、硼酸和1M NaOH溶液配制终浓度为0.5mol/L，PH8.0的BB缓冲液，0.22μm微孔滤膜除菌后4℃保存备用，有效期两个月。
(4)0.1M甘氨酸溶液：用纯化水、甘氨酸，稀盐酸配制终浓度0.1mol/L的甘氨酸溶液，0.45μm微孔滤膜过滤除菌后4℃保存备用有效期一个月。
实施例1
参照图1所示，实施例1提供了一种制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法。
1、SMCC活化链霉亲和素：
(1)将链霉亲和素用PBS稀释到20mg/mL，并加10％(v/v)的0.5M，pH 8.0硼酸缓冲液，将pH调至8.0。
(2)平衡至室温后迅速称取SMCC，用DMSO溶解，加入到链霉亲和素中，使摩尔比例条件下链霉亲和素：SMCC＝1：3，温和地搅拌，室温反应30-60min。
(3)超滤离心，用30K的超滤离心管4℃下12500r/m离心，除去游离的SMCC，置换缓冲液为0.1M PBS(pH 8.0)，使链霉亲和素终浓度为1mg/ml。
2、DTT还原PSA抗体：
用0.05mM的DTT还原抗体，10ml 0.05mM的DTT对应加入1mgPSA抗体。室温孵育30min，孵育完成后，用30K的超滤离心管4℃下12500r/m离心除去溶液中的DTT。置换缓冲液为0.1M PBS(pH 8.0)，使PSA抗体终浓度为3mg/ml。
3、偶联：
将SMCC-SA：PSA抗体按质量比＝1：3混合，室温反应45min，加终浓度为5mM的连四硫酸钠溶液终止反应，获得偶联粗产物。
4、PSA-SA纯化：
(1)除去游离的亲和素：按等摩尔比例将protein G磁珠与偶联液混合，室温孵育30min后，用磁力架除去液体。
(2)分离SA-antibody：用0.1M pH 2.5的甘氨酸缓冲液重悬proteinG磁珠，立即用磁力架除去液体，并加入Tris-HCl调节pH至中性，防止抗体降解。
使用竞争性ELISA法测定，来反映结合物的免疫活性。简言之，将PSA抗原溶液包被在96孔微孔板上并干燥，作为固相载体和竞争目标。用过氧化酶标记的PSA作为竞争剂和报告剂，当其在某一浓度时在490nm下OD值为0.5。PSA抗体和PSA-SA偶联物被连续稀释成等份的优化PSA/HRP结合物并与抗原包被的微孔板在室温下反应1小时。清洗微孔板，加入ABTS底物溶液，孵育30分钟，然后在分光光度计上读取490nm下的值。其结果如图2所示。
从图2可以看出，通过将相同浓度PSA抗体和PSA-SA分别与包被在微孔板上的PSA抗原竞争反应，可以看出相比于PSA抗体(即未偶联链霉亲和素的PSA抗体)，PSA-SA的吸光度值更高，也即与抗原的结合量更少。经计算得到：相同浓度的PSA-SA偶联物相较于PSA抗体，至少还保留71％的免疫活性(图2中IR即代表Immunoreactive，免疫活性)。
同时将所得到的偶联粗产物进行5％的SDS-PAGE凝胶电泳检测。理论上来说所获得的偶联粗产物中至少包含以下几种物质：PSA抗体、PSA-SA、未消耗完的SMCC-SA、SA、SA-PSA-SA、以及多种高分子副产物如PSA-PSA/PSA-PSA-SA等等。在凝胶电泳结果中可以发现所测蛋白条带分子量与理论分子量十分接近，通过将脱色完全的凝胶放入凝胶成像系统中拍照，并使用图像分析软件对目的蛋白进行纯度分析得知抗体和链霉亲和素按照摩尔比例为1:1和1:2偶联物总的纯度大于90％，其中抗体-链霉亲和素1:1偶联物和抗体-链霉亲和素1:2偶联物的摩尔比例大约为：5：1。
实施例2
在选择SMCC修饰SA时，为找到SMCC与SA的最佳摩尔比例，特设置一个梯度共4种条件，分别是1X(SA:SMCC＝1:1)、2X(SA:SMCC＝1:2)、3X(SA:SMCC＝1:3)、4X(SA:SMCC＝1:4)。
即参照实施例中SMCC活化链霉亲和素的方法，在将PSA抗体提供量控制到极低水平，在偶联过程中几乎完全消耗并维持其它条件不变的前提下对比这4种不同摩尔比条件下进行抗体偶联所得到的PSA-SA和SA-PSA-SA的产量，将经过超滤离心后的产物进行5％的SDS-PAGE凝胶电泳检测。
图3是根据本发明的实施例提供的5％SDS-PAGE凝胶电泳结果图。图3中标号1为未经SMCC修饰的链霉亲和素和少量PSA抗体偶联后的凝胶检测结果，标号2～5分别为经不同摩尔比例修饰的链霉亲和素和少量PSA抗体偶联后的凝胶检测结果。以标号2的凝胶检测结果为例，从上往下所对应的条带分别代表：多个PSA抗体自连(例如可以为PSA-PSA-SA等高分子量副产物)、SA-PSA-SA、PSA-SA，SA。对比SMCC修饰SA过程中不同SMCC与SA摩尔比的实验，说明在3倍条件下能达到一个相对的平衡，一方面有最多的SA被消耗、最多的PSA-SA与SA-PSA-SA产生，另一方面产生的大分子副产品量最少，表明选择SA:SMCC的摩尔比例为1:3时，效果最佳。
实施例3
为找寻最佳偶联条件，特别是偶联过程中SMCC-SA:PSA的最佳质量比，参照实施例1所提供的方法，特设置一个梯度共4种不同浓度的对比实验，遵循单变量原则条件下与实施例1的不同之处在于，分别对比1X(SMCC-SA:PSA＝1:1)、2X(SMCC-SA:PSA＝1:2)、3X(SMCC-SA:PSA＝1:3)、4X(SMCC-SA:PSA＝1:4)等不同条件下所得到的PSA-SA的结果，并利用5％的SDS-PAGE凝胶电泳进行检测，如图4所示。
图4为根据本发明的实施例提供的5％SDS-PAGE凝胶电泳结果图。将脱色完全的凝胶放入凝胶成像系统中拍照，并使用图像分析软件对目的蛋白进行分子量分析得到的PSA-SA 206kDa值与215kDa的理论值非常吻合。SA-PSA-SA 295kDa值与双取代结合物的理论分子量值280kDa非常接近。对比SMCC-SA偶联PSA抗体过程中不同SMCC-SA与PSA质量比的实验，说明在3倍条件下(即SMCC-SA：PSA＝1:3)能达到一个相对的平衡，一方面有最多的PSA-SA产生，另一方面产生的大分子副产品量最少。
本文中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种制备抗体-链霉亲和素偶联物的方法，其特征在于，包括：
将抗体和还原剂进行第一接触反应，以便获得经还原的含有巯基的抗体；
将所述经还原的含有巯基的抗体和马来酰亚胺修饰的链霉亲和素进行第二接触反应，以便获得所述抗体-链霉亲和素偶联物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将还原的含有巯基的抗体和所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素的质量比为2～5：1，优选为2～4:1，更优选为3：1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述经还原的含有巯基的抗体和所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素在室温下接触反应30～60分钟，以便获得所述抗体-链霉亲和素偶联物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每个所述经还原的含有巯基的抗体中带有9～12个所述巯基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原剂为二硫苏糖醇；
任选地，将所述抗体和所述还原剂在室温下接触反应20～50分钟，利用30KD的超滤离心管进行过滤处理，以便获得所述经还原的含有巯基的抗体；
任选地，在4摄氏度下采用10000～15000转/分钟离心，进行所述过滤处理。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：
将链霉亲和素和SMCC进行第三接触反应，以便获得所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述链霉亲和素和所述SMCC的摩尔比为1：2～5，优选为：1:2～4，更优选为1：3；
任选地，将所述链霉亲和素和所述SMCC在室温下进行第三接触反应30～60分钟，利用30KD的超滤离心管进行过滤处理，以便获得所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素；
任选地，在4摄氏度采用10000～15000转/分钟离心，进行所述过滤处理。
8.一种制备抗体-链霉亲和素的方法，其特征在于，包括：
将抗体和二硫苏糖醇在室温下进行第一接触反应20～50分钟，以便获得经还原的含有巯基的抗体；
将链霉亲和素和SMCC在室温下进行第三接触反应30～60分钟，以便获得马来酰亚胺修饰的链霉亲和素；
将所述经还原的含有巯基的抗体和所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素在室温下进行第二接触反应30～60分钟，以便获得所述抗体-链霉亲和素，所述经还原的含有巯基的抗体和所述马来酰亚胺修饰的链霉亲和素的质量比为2～5：1，优选为3:1。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在第二接触反应进行30～60分钟后，加入连四硫酸钠溶液终止所述第二接触反应，然后利用蛋白亲和磁珠进行纯化处理，以便获得所述抗体-链霉亲和素。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述第一接触反应进行20～50分钟后，利用30kD的超滤离心管在4摄氏度下采用10000～15000转/分钟离心处理，以便获得所述经还原的含有巯基的抗体；
在所述第三接触反应进行30～60分钟后，利用30kD的超滤离心管在4摄氏度下采用10000～15000转/分钟离心处理，以便获得马来酰亚胺修饰的链霉亲和素。
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