CN107790185B - 铁硫簇-去铁蛋白复合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铁硫簇‑去铁蛋白复合物及其制备方法与应用，该复合物包括去铁蛋白和装载于其中的钌配合物和铁硫簇催化剂，其中，钌配合物的包载率为5～15％，铁硫簇催化剂的包载率为10～30％。本发明采用非共价组装的途径对光敏剂钌配合物以及非水溶性的铁硫簇催化剂分子进行功能化组装在一个蛋白分子内，提供了铁硫簇催化剂在自然界中的工作环境，从而构筑成水相光驱动产氢体系；实现了铁硫簇催化剂催化体系在水溶液中的广泛应用，该体系不仅稳定性强，且应用于光催化分解制取氢时，在光照条件下，以抗坏血酸为质子源和电子牺牲体，能够增强体系的产氢效率。
Description
技术领域
本发明属于复合物纳米材料领域，尤其涉及一种铁硫簇-去铁蛋白复合物及其制备方法与其在光催化水解制氢中的应用。
背景技术
日渐枯竭的煤、石油、天然气等不可再生资源是目前人类所依赖的主要能源，同时这些传统化石能源的燃烧会对环境造成很大的污染。环境污染和能源短缺是困扰当今及未来人类发展的两大关键问题。因此，寻找开发绿色可再生的新能源具有重要的现实意义。作为一种根本不涉及碳元素的燃料，氢气无疑是一种非常理想的清洁替代能源。而光解水技术能够直接将太阳能转化为化学能，并以氢气的形式储存，在资源紧缺的年代，发展这一技术显得愈发重要。
自然界的一种称为铁氢化酶的生物酶可以利用太阳能催化水中的质子还原成分子态的氢，其过程近似于绿色植物的光合作用，而且其性能可媲美铂催化剂。尽管天然酶活性高、选择性好，具有很好的应用价值，但是要将这些酶直接用在制氢装置上却仍然是一个挑战，因为将它们分离出来很困难，而且其在空气中的性能也很糟糕，因而在实际应用中受到限制。相比之下，铁硫簇催化剂制备简单、稳定性较高，成本也相对较低，但是大多数铁硫簇催化剂水溶性均很差，需要找到合适的方法来提高其水溶性，以便在水相中发挥其催化产氢的高效性能。
目前已有文献报道在铁硫簇氢化酶上修饰一些亲水性基团，但由于化学修饰过程复杂，稳定性最终也很有限。另外还有一些学者尝试将铁硫簇催化剂与一些载体，如壳聚糖，细胞色素c等共价相连接，这种方法同样也不容易控制两者之间的优化比例，可操作性较难。因此寻找一种包载量高且稳定性好的载体材料就显得尤为重要。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种能够在模拟自然界氢化酶水溶液环境下有效增强产氢性能的铁硫簇-去铁蛋白纳米复合物；本发明的第二目的是提供该复合物的制备方法；本发明的第三目的是提供该复合物的应用。
技术方案：本发明所述的铁硫簇-去铁蛋白复合物，包括去铁蛋白和装载于其中的钌配合物和铁硫簇催化剂，其中，钌配合物的包载率为5～15％，铁硫簇催化剂的包载率为10～30％。
本发明中，包载率的计算方法为：以钌配合物为例，包载结束后，去铁蛋白内的钌配合物的分子数与包载前投入的钌配合物分子数之比。
除了用包载率表示，本发明还可用钌配合物与去铁蛋白的个数之比为1～40:1，铁硫簇催化剂与去铁蛋白的个数之比为1～90:1来表示。
优选的铁硫簇催化剂为FeFe氢化酶、NiFe氢化酶或Fe氢化酶，其中，FeFe氢化酶(FeFe-1)的催化活性最高，在自然条件下，每个氢化酶活性中心每秒可以产生6000～9000个氢气分子。
其中，铁硫簇催化剂，其结构式如下所示：
钌配合物的表达式为[Ru(bpy)2dpqp](PF6)2(以下简称Rudpqp)或Ru(bpy)3Cl2(以下简称Rubpy)，该类钌配合物光谱范围宽，吸光能力强，且可以以较大的包载比例装载进入去铁蛋白的疏水性蛋白笼内，更好地起到光敏化的作用，其中，Rudpqp的结构式如下所示：
本发明所述铁硫簇-去铁蛋白复合物的制备方法，调节去铁蛋白水溶液的pH值为酸性，加入钌配合物后调节溶液的pH值为中性或碱性，使去铁蛋白重新组装成完整或接近的蛋白笼，得装载钌配合物的去铁蛋白复合物；将该复合物与铁硫簇催化剂混合，得铁硫簇-去铁蛋白复合物。
其中，所述钌配合物与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例为100～400:1。所述铁硫簇催化剂与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例为100～400:1。
调节去铁蛋白水溶液的pH值为2～5(酸性)；加入钌配合物后调节溶液的pH值为7～10(中性或碱性)。
本发明中，装载钌配合物的去铁蛋白复合物与铁硫簇催化剂混合前依次进行静置、透析、过滤及脱盐柱后处理。其中，所述透析是采用含有乙腈的PBS水溶液透析，其中，乙腈在PBS水溶液的体积比为5～30％，PBS水溶液浓度为1～200mM，透析时间为5～48h。优选的，采用含有乙腈的PBS水溶液透析5～10次，且最后一次或最后几次用不含乙腈的PBS水溶液透析，使最终体系内不含有机溶剂。
本发明中，装载钌配合物的去铁蛋白复合物与铁硫簇催化剂混合后依次进行静置、过滤及脱盐柱子后处理。
上述静置的时间为10～120min；上述过滤为滤头过滤，滤头孔径在0.22～0.8μm。
去铁蛋白水溶液加入钌配合物后先经过磁力搅拌再调节pH值为中性或碱性；其中，磁力搅拌的时间为10～120min，搅拌转速为100～1500rpm。
本发明铁硫簇-去铁蛋白复合物在光催化水解制氢中的应用，可提高分解水产氢性能。
发明原理：本发明利用去铁蛋白作为载体，将水溶性不良的铁硫簇催化剂装载在纳米笼内作为催化剂；其中，去铁蛋白是一种由24个亚基组成、具有中空结构的纳米笼，内径和外径分别为8nm和12nm，具有良好的生物兼容性，且结构非常稳定，在高温或高浓度变性剂下均不会解离，能在酸性环境下解离，中性或碱性条件下重新组装回去，因此可以装载铁硫簇催化剂和钌配合物来构建功能化纳米复合物，提供了模拟自然界氢化酶工作环境，从而构筑成水相光驱动产氢体系。
有益效果：与现有技术相比，本发明的显著优点为：通过利用去铁蛋白自身笼状结构对pH的依赖性，引入钌配合物作为体系的光敏剂，进一步利用去铁蛋白笼内及腔道内的金属离子(如Fe离子、铜离子等)结合位点对铁硫簇催化剂进行包埋，最终形成该纳米复合物。本发明采用非共价组装途径对纳米复合物表面进行功能化改造，其实现了光催化体系的水溶性，该体系不仅稳定性强，且应用于光催化水解中，在光照条件下，以抗坏血酸为质子源和电子牺牲体，能够增强体系在水相中的催化产氢效率，且不需要在特定的环境下进行，仅在化学温和的条件下即可应用于催化产氢；同时，本发明的制备方法设计合理，制备过程简单，在光催化水解制氢领域内具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为铁硫簇-去铁蛋白复合物体系光催化产氢过程示意图；
图2为铁硫簇-去铁蛋白复合物体系的组装工艺流程图；
图3为铁硫簇化合物FeFe-1的制备工艺流程图；
图4a为FeFe-1在CDCl3中的1H NMR表征图；
图4b为FeFe-1在CDCl3中的13C NMR表征图；
图5a为FeFe-1在乙腈溶剂的紫外吸收光谱图；
图5b为FeFe-1由紫外吸收测试结果得出的在328nm处的紫外标准曲线；
图6为钌配合物Rudpqp的制备工艺流程图；
图7a、7b和7c为钌配合物Rudpqp制备过程中的1H NMR表征图；
图8a为不同浓度钌配合物Rudpqp在水溶液中的紫外吸收光谱图；
图8b为钌配合物Rudpqp由紫外吸收测试结果得出的在458nm处的紫外标准曲线；
图9a为不同浓度钌配合物Rudpqp在水溶液中的荧光光谱图；
图9b为钌配合物Rudpqp由荧光测试结果得出的在624nm处的荧光标准曲线；
图10为去铁蛋白apo-HSF、钌配合物-去铁蛋白复合物Ru NP及铁硫簇-去铁蛋白复合物NC7的紫外吸收光谱图；
图11为铁硫簇-去铁蛋白复合物NC7在4摄氏度冰箱保存一周前后的紫外吸收光谱图对比；
图12a为apo-HSF的原子力显微镜表征图；
图12b为apo-HSF由原子力显微镜测试得到的纳米颗粒高度图；
图13a为铁硫簇-去铁蛋白复合物NC7的原子力显微镜表征图；
图13b为铁硫簇-去铁蛋白复合物NC7由原子力显微镜测试得到的纳米颗粒高度图；
图14为apo-HSF、Ru NP和铁硫簇-去铁蛋白复合物NC7通过动态光散射测试得到的水合粒径表征；
图15为铁硫簇-去铁蛋白复合物NC7在4摄氏度冰箱保存一周前后通过动态光散射测试得到的水合粒径表征对比；
图16为铁硫簇-去铁蛋白复合物NC7光催化产氢前后通过动态光散射测试得到的水合粒径表征对比；
图17a为不同浓度FeFe-1为淬灭剂，向Ru NP滴加引起的荧光淬灭图；
图17b为Ru NP荧光淬灭程度随不同浓度FeFe-1变化的关系图，I0与IP分别为猝灭剂加入之前和加入之后所测得的在624nm处的荧光强度；
图18a为不同浓度FeFe-1为淬灭剂，向Rudpqp溶液滴加引起的荧光淬灭图；
图18b为Rudpqp溶液荧光淬灭程度随不同浓度FeFe-1变化的关系图，I0与IP分别为猝灭剂加入之前和加入之后所测得的在624nm处的荧光强度；
图19a为以不同浓度FeFe-1为淬灭剂，逐渐向Ru NP滴加引起的瞬态荧光吸收谱检测结果图；
图19b为Ru NP荧光寿命衰减程度随不同浓度FeFe-1变化的关系图，τ0与τ分别为猝灭剂加入之前和加入之后所测得的荧光寿命值；
图20a为以不同浓度FeFe-1为淬灭剂，逐渐向Rudpqp溶液滴加引起的瞬态荧光吸收谱检测结果图；
图20b Rudpqp溶液荧光寿命衰减程度随不同浓度FeFe-1变化的关系图，τ0与τ分别为猝灭剂加入之前和加入之后所测得的荧光寿命值；
图21为铁硫簇-去铁蛋白复合物NC2在不同pH条件下的产氢量检测结果图，其中牺牲剂抗坏血酸H2A浓度为0.05mol/L，光功率密度为225mW/cm2；
图22为在不同光敏剂Rudpqp浓度条件下的铁硫簇-去铁蛋白复合物(NC1、NC2、NC3、NC4)的产氢量检测结果图，其中牺牲剂抗坏血酸H2A浓度为0.05mol/L，光功率密度为225mW/cm2；
图23为在不同FeFe-1浓度条件下的铁硫簇-去铁蛋白复合物(NC3、NC5、NC6、NC7)的产氢量检测结果图，其中牺牲剂抗坏血酸H2A浓度为0.05mol/L，光功率密度为225mW/cm2；
图24为铁硫簇-去铁蛋白复合物NC7与不含去铁蛋白的复合物NC8的产氢量检测结果对比图，其中牺牲剂抗坏血酸H2A浓度为0.05mol/L，光功率密度为225mW/cm2；
图25为铁硫簇-去铁蛋白复合物NC7在4摄氏度冰箱保存一周前后的产氢量检测结果对比图，其中牺牲剂抗坏血酸H2A浓度为0.05mol/L，光功率密度为225mW/cm2；
图26为相同浓度(7.2μM)的不同光敏剂体系，Rudpqp和Rubpy，其中FeFe-1浓度为26.1μM，抗坏血酸H2A浓度为0.05mol/L，光功率密度为225mW/cm2。
具体实施方式
本申请人在纳米复合物材料制备方面进行了多年尝试与探究，摸索出一系列适宜条件来构建功能复合体系，下面对本发明的技术方案作详细说明。
下述的实现方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的；试验中的定量实验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
表1 制备系列铁硫簇-去铁蛋白复合物的组成
表1中，Rudpqp/apo-HSF或FeFe-1/apo-HSF表示每个去铁蛋白中Rudpqp或FeFe-1的个数，％表示Rudpqp或FeFe-1的包载率(或称为装载效率)。
1、铁硫簇催化剂及其制备
称取0.101g十二羰基三铁Fe3(CO)12及1,3-丙二硫醇(CH2)3(SH)2 0.0213g于10mL四氢呋喃溶液中，氩气保护下，80℃回流1小时。旋干后，得到红色物质经硅胶柱用石油醚洗脱进一步纯化，真空干燥箱干燥过夜后，即可得到红色固体0.048g。上述反应的流程如图3所示。铁硫簇催化剂的1H NMR和13C NMR的表征结果如图4a至图4b所示，核磁谱图确认与该化合物结构相匹配。
性能检测1 铁硫簇催化剂的光学性质检测
配制2mM的铁硫簇催化剂的乙腈溶液，取一定体积并用去离子水将其稀释成50μM作为储备液，用紫外分光光度计对溶液进行检测，并每次按一定比例逐级稀释。测试结果如图5a所示，该铁硫簇催化剂在328nm有特征吸收峰，且在450-500nm之间有着一个较宽的肩峰。依据朗伯-比尔定律以及铁硫簇催化剂在328nm处的吸收值，得到如图5b所示的紫外标准曲线，相关系数达到0.999。
2、钌配合物及其制备
本发明的钌配合物的结构式如下：
制备方法包括如下步骤：
(1)1,10-邻菲啰啉-5,6-二酮的合成：
首先合成1,10-邻菲啰啉-5,6-二酮，配制含有20mL浓硫酸及10mL浓硝酸的混酸溶液，逐滴加入到1,10-邻菲啰啉2.0g与溴化钾2.0g的混合物中。在130℃条件下油浴加热3小时。冷却至室温后，加入到4℃的250mL去离子水中，并用80mL的10M NaOH中和pH至6-7。然后用CHCl3萃取3次，每次100mL，最后用无水硫酸钠处理后置于真空干燥箱干燥，即可得到1.8g亮黄色的固体产物。
(2)钌配合物配体(dpqp)的合成：
称取0.084g 1,10-邻菲啰啉-5,6-二酮溶于20mL甲醇中，煮沸后快速加入0.044g2,3-二氨基哌嗪，回流3小时。将所得溶液抽滤得到灰黄色固体，用甲醇进行多次洗涤，得到0.068g黄色固体产物。
(3)钌配合物[Ru(bpy)2dpqp](PF6)2的合成
称取0.059g二氯二联吡啶钌Ru(bpy)2Cl2和0.044g钌配合物配体dpqp于20mL无水乙醇中加热回流4个小时。待红色溶液冷却到室温后，向其中加入0.293g六氟磷酸铵，得到暗红色的沉淀物，过滤后得到0.068g钌配合物[Ru(bpy)2dpqp](PF6)2。
上述反应的流程如图6所示；钌配合物的1H NMR的表征结果如图7a、7b、7c所示，核磁谱图确认与该化合物结构相匹配。
性能检测2钌配合物的光学性质检测
配制2mM的钌配合物的乙腈溶液，取一定体积并用去离子水将其稀释成49μM作为储备液，用紫外分光光度计对其进行检测，并每次按一定比例进行逐级稀释。测试结果如图8a所示，该钌配合物在458nm有着独特的强而宽的谱峰，通常被认为是钌配合物的1MLCT跃迁。依据朗伯-比尔定律以及钌配合物在458nm处的吸收值，得到如图8b所示的紫外标准曲线，相关系数达到0.998。
配制2mM的钌配合物的乙腈溶液，取一定体积并用去离子水将其稀释成20μM作为储备液，用荧光分光光度计对其进行检测，并每次按一定比例逐级稀释。测试结果如图9a所示，激发波长为458nm，该钌配合物在624nm有着最大发射值，依据不同浓度的钌配合物在624nm处的荧光强度值，得到如图9b所示的荧光标准曲线，相关系数达到0.998。
3、铁硫簇催化剂及其制备
实施例1
调节去铁蛋白水溶液的pH为2，将钌配合物加入该去铁蛋白溶液，钌配合物与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例为300:1，搅拌例如采用磁力搅拌器搅拌后，再将该溶液调节pH为10，使得去铁蛋白组装回完整蛋白笼，静置一段时间。用体积含有10％乙腈溶剂的PBS水溶液(1mM)透析48h，最后一次透析用不含乙腈的PBS水溶液透析；将上述透析结束后所得到的样品用0.22μm水系滤头过滤，再用PD-10脱盐柱进行后处理，即可得到装载钌配合物的去铁蛋白复合物；随后，将上述所得到的复合物与铁硫簇催化剂共混，其中铁硫簇催化剂与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例为400:1，静置后用0.22μm水系滤头过滤，再用PD-10脱盐柱进行后处理，即可得到铁硫簇-去铁蛋白纳米复合物。钌配合物的包载率为15％，铁硫簇催化剂的包载率为30％。
如图1-2所示，通过利用去铁蛋白自身笼状结构对pH的依赖性，引入钌配合物作为体系的光敏剂，再进一步利用去铁蛋白笼内及腔道内的结合位点对铁硫簇催化剂进行包埋，最终形成该纳米复合物。采用非共价组装途径对纳米复合物表面进行功能化改造，其实现了光催化体系的水溶性，该体系不仅稳定性强，且应用于光催化水解制氢中，在光照条件下，以抗坏血酸为质子源和电子牺牲体，最终能够增强体系的产氢效率。
实施例2
调节去铁蛋白水溶液pH为2，将钌配合物加入该去铁蛋白溶液，钌配合物与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例为300:1，磁力搅拌器搅拌后，再将该溶液调节pH为10，使得去铁蛋白组装回完整蛋白笼，静置一段时间。用体积含有5％乙腈溶剂的PBS水溶液(1mM)透析48h；将上述透析结束后所得到的样品用0.22μm水系滤头过滤，再用PD-10脱盐柱进行后处理，即可得到装载钌配合物的去铁蛋白复合物；随后，将上述所得到的复合物与铁硫簇催化剂共混，其中铁硫簇催化剂与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例为400:1，静置后用0.22μm水系滤头过滤，再用PD-10脱盐柱进行后处理，即可得到铁硫簇-去铁蛋白纳米复合物。钌配合物的包载率为13％，铁硫簇催化剂的包载率为30％。
实施例3
调节去铁蛋白水溶液pH为2，将钌配合物加入该去铁蛋白溶液，钌配合物与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例为300:1，磁力搅拌器搅拌后，再将该溶液调节pH为10，使得去铁蛋白组装回完整蛋白笼，静置一段时间。用体积含有30％乙腈溶剂的PBS水溶液(1mM)透析48h，最后一次用不含乙腈的PBS水溶液透析；将上述透析结束后所得到的样品用0.22μm水系滤头过滤，再用PD-10脱盐柱进行后处理，即可得到装载钌配合物的去铁蛋白复合物；随后，将上述所得到的复合物与铁硫簇催化剂共混，其中铁硫簇催化剂与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例为400:1，静置后用0.22μm水系滤头过滤，再用PD-10脱盐柱进行后处理，即可得到铁硫簇-去铁蛋白纳米复合物。钌配合物的包载率为12％，铁硫簇催化剂的包载率为30％。
实施例4
调节去铁蛋白水溶液pH为2，将钌配合物加入该去铁蛋白溶液，钌配合物与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例为300:1，磁力搅拌器搅拌后，再将该溶液调节pH为10，使得去铁蛋白组装回完整蛋白笼，静置一段时间。用体积含有30％乙腈溶剂的PBS水溶液(1mM)透析5h，最后一次用不含乙腈的PBS水溶液透析；将上述透析结束后所得到的样品用0.22μm水系滤头过滤，再用PD-10脱盐柱进行后处理，即可得到装载钌配合物的去铁蛋白复合物；随后，将上述所得到的复合物与铁硫簇催化剂共混，其中铁硫簇催化剂与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例为400:1，静置后用0.22μm水系滤头过滤，再用PD-10脱盐柱进行后处理，即可得到铁硫簇-去铁蛋白纳米复合物。钌配合物的包载率为13％，铁硫簇催化剂的包载率为30％。
实施例5
调节去铁蛋白水溶液pH为2，将钌配合物加入该去铁蛋白溶液，钌配合物与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例为300:1，磁力搅拌器搅拌后，再将该溶液调节pH为10，使得去铁蛋白组装回完整蛋白笼，静置一段时间。用体积含有30％乙腈溶剂的PBS水溶液(1mM)透析24h，最后一次用不含乙腈的PBS水溶液透析，用0.22μm水系滤头过滤，再用PD-10脱盐柱进行后处理，即可得到装载钌配合物的去铁蛋白复合物；随后，将上述所得到的复合物与铁硫簇催化剂共混，其中铁硫簇催化剂与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例为400:1，静置后用0.22μm水系滤头过滤，再用PD-10脱盐柱进行后处理，即可得到铁硫簇-去铁蛋白纳米复合物。钌配合物的包载率为12％，铁硫簇催化剂的包载率为30％。
实施例6
设置四组平行试验，考察去铁蛋白水溶液pH对钌配合物包载率的影响。
分别调节去铁蛋白水溶液pH为2、3、4、5，将钌配合物加入该去铁蛋白溶液，钌配合物与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例为300:1，磁力搅拌器搅拌后，再将该溶液调节pH为10，使得去铁蛋白组装回完整蛋白笼，静置一段时间。用体积含有30％乙腈溶剂的PBS水溶液(1mM)透析48h，最后一次用不含乙腈的PBS水溶液透析，用0.22μm水系滤头过滤，再用PD-10脱盐柱进行后处理，即可得到装载钌配合物的去铁蛋白复合物；随后，将上述所得到的复合物与铁硫簇催化剂共混，其中铁硫簇催化剂与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例为400:1，静置后用0.22μm水系滤头过滤，再用PD-10脱盐柱进行后处理，即可得到铁硫簇-去铁蛋白纳米复合物。结合如下表2，实施例表明pH值对铁硫簇-去铁蛋白复合物中钌配合物包载率有较大影响，pH值越低，去铁蛋白解组装越彻底，分散比较均匀，钌配合物包载率越高。当pH小于2时，去铁蛋白解组装后维持解离状态；pH大于5时，不利于钌配合物的包载。
表2 pH值对铁硫簇-去铁蛋白复合物中钌配合物包载率的影响
实施例7
设置四组平行试验，考察钌配合物投料比对钌配合物包载率的影响。
将去铁蛋白水溶液调节pH为2，将钌配合物加入该去铁蛋白溶液，钌配合物与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例分别为100:1、200:1、300:1、400:1，磁力搅拌器搅拌后，再将该溶液调节pH为10，使得去铁蛋白组装回完整蛋白笼，静置一段时间。用体积含有30％乙腈溶剂的PBS水溶液(1mM)透析48h，最后一次用不含乙腈的PBS水溶液透析；将上述透析结束后所得到的样品用0.22μm水系滤头过滤，再用PD-10脱盐柱进行后处理，即可得到装载钌配合物的去铁蛋白复合物；随后，将上述所得到的复合物与铁硫簇催化剂共混，其中铁硫簇催化剂与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例为200:1，静置后用0.22μm水系滤头过滤，再用PD-10脱盐柱进行后处理，即可得到铁硫簇-去铁蛋白纳米复合物。结合如下表3，实施例表明钌配合物投料量对铁硫簇-去铁蛋白复合物中钌配合物包载率有较大影响，投料量越大，钌配合物包载率越高。投料比小于100:1时，去铁蛋白装载分子的数量有限，不利于后面性能测试，大于400:1时，去铁蛋白内部空间有限，也无法容纳太多数量的分子。
表3 钌配合物投料量对复合物中钌配合物包载率的影响
实施例8
设置四组平行试验，考察铁硫簇催化剂投料比对铁硫簇包载率的影响。
将去铁蛋白水溶液调节pH为2，将钌配合物加入该去铁蛋白溶液，钌配合物与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例为300:1，磁力搅拌器搅拌后，再将该溶液调节pH为10，使得去铁蛋白组装回完整蛋白笼，静置一段时间。用体积含有30％乙腈溶剂的PBS水溶液(1mM)透析48h，最后一次用不含乙腈的PBS水溶液透析；将上述透析结束后所得到的样品用0.22μm水系滤头过滤，再用PD-10脱盐柱进行后处理，即可得到装载钌配合物的去铁蛋白复合物；随后，将上述所得到的复合物与铁硫簇催化剂共混，其中铁硫簇催化剂与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例为100:1、200:1、300:1、400:1，静置后用0.22μm水系滤头过滤，再用PD-10脱盐柱进行后处理，即可得到铁硫簇-去铁蛋白纳米复合物。结合如下表4，实施例表明铁硫簇催化剂投料量对铁硫簇-去铁蛋白复合物中铁硫簇催化剂包载率有较大影响，投料量越大，铁硫簇催化剂包载率越高。投料比小于100:1时，去铁蛋白装载分子的数量有限，不利于后面性能测试，大于400:1时，去铁蛋白内空间有限，也无法容纳太多数量的分子。
表4 铁硫簇催化剂投料量对复合物中铁硫簇催化剂包载率的影响
性能检测3 铁硫簇-去铁蛋白复合物的光学性质表征
配制2mL的去铁蛋白(apo-HSF)溶液、装载钌配合物的去铁蛋白复合物(Ru NP)以及包载一定比例钌配合物和铁硫簇催化剂的铁硫簇-去铁蛋白复合物(nanocomposite 7,NC7)，用紫外分光光度计对其进行检测。
结果如图10所示，apo-HSF具有着蛋白自身的位于280nm左右的吸收峰，当通过蛋白组装的方式将钌配合物包载到蛋白内后，即Ru NP，该复合物在459nm便体现出了Rudpqp的吸收峰，相比于Rudpqp 458nm的吸收峰而言，该复合物的吸收发生了些许红移，可能是由于Rudpqp与apo-HSF的相互作用所导致的。随后形成铁硫簇-去铁蛋白复合物NC7时，便会显现出铁硫簇催化剂在338nm的特征吸收峰，证实了铁硫簇催化剂能够被成功包埋进入去铁蛋白。而且如图11所示，该复合物的光学稳定性很好，于4℃冰箱保存一周，其紫外吸收光谱仍未发生较大变化，与之前的光学性质基本保存一致。
性能检测4 铁硫簇-去铁蛋白复合物的结构表征
原子力显微镜(Atomic Force Microscope，AFM)是一种可用来研究包括绝缘体在内的固体材料表面结构的分析仪器，利用这种检测手段我们可以了解去铁蛋白的外观形貌及颗粒大小。如图12a所示，该图像是apo-HSF水溶液的AFM结果，根据高度分析，如图12b所示apo-HSF的直径为7.0±1.1nm，当我们制备成铁硫簇-去铁蛋白复合物时，如图13a、13b所示，粒径增加到9.4±1.3nm。
随后又使用动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)对样品溶液进行了测试。结果如图14所示，apo-HSF、Ru NP和NC7的水力半径分别为10.1±1.5nm、13.5±1.8nm和13.5±1.9nm。
并且将该样品保存一周后，再进行DLS测试，NC7的水力半径未发生较大变化，结果如图15所示；同样，将产氢测试后的样品再进行DLS测试，水力半径几乎未发生变化，结果如图16所示。
性能检测5 铁硫簇-去铁蛋白复合物中光敏剂与催化剂的电子转移研究
为了研究铁硫簇-去铁蛋白复合物的电子转移过程，配制含有相同浓度(4.3μM)的Rudpqp和Ru NP溶液。利用荧光分光光度计，测试时逐渐向原溶液中加入10μL铁硫簇催化剂溶液(2mM)，监测铁硫簇催化剂对Rudpqp和Ru NP溶液的淬灭效应。其中Ex＝458nm，Em＝520-720nm，并且利用如下Stern-Volmer方程计算淬灭速率常数Ksv及淬灭速率常数Kq：
I0/I＝1+Kq[Q]
Kq＝τ0·Ksv
在上述公式中，I0表示未加铁硫簇催化剂时Rudpqp或Ru NP在624nm处的荧光强度，I表示加了一定浓度铁硫簇催化剂时Rudpqp或Ru NP在624nm处的荧光强度，Q表示铁硫簇催化剂的浓度，Kq表示铁硫簇催化剂对Rudpqp或Ru NP的淬灭速率常数，Ksv表示铁硫簇催化剂对Rudpqp或Ru NP的淬灭常数，τ0表示Rudpqp或Ru NP在无氧条件下的荧光寿命值。
铁硫簇催化剂对Ru NP荧光猝灭的结果如图17a所示，拟合数据得到图17b，根据计算得到Ksv＝4.5×103M-1，又根据后面荧光寿命的测试，如图19a所示，得到Ru NP初始荧光寿命为896.6ns，因而Kq＝5.0×109M-1s-1。
铁硫簇催化剂对Rudpqp荧光猝灭的结果如图18a所示，拟合数据得到图18b，根据计算得到Ksv＝3.2×103M-1，又根据后面荧光寿命的测试，如图20a所示，得到Ru NP初始荧光寿命为628.4ns，因而Kq＝5.1×109M-1s-1。
根据结果分析可得，无论是在去铁蛋白内还是在均相溶液中，铁硫簇催化剂和钌配合物之间均可发生相似的电子转移过程，说明在去铁蛋白框架内，铁硫簇催化剂对激发态的钌配合物可以发生有效的淬灭过程。在空间上相对分离的光敏剂和铁硫簇催化剂之间，这种长程的电子转移过程没有受到明显的限制。
同时，根据前面所述，还用瞬态荧光吸收测试仪检测了相同浓度(4.3μM)的Rudpqp和Ru NP溶液(严格除氧)的荧光寿命值，每次测试时逐渐向原溶液中加入20μL铁硫簇催化剂溶液(2mM)，监测铁硫簇催化剂对Rudpqp和Ru NP溶液的淬灭效应。其中Ex＝409nm，且用如下方程计算动态淬灭速率常数KD：
τ0/τ＝1+KD[Q]
在上述公式中，τ0为未加铁硫簇催化剂时Rudpqp或Ru NP的荧光寿命值，τ表示加了一定浓度铁硫簇催化剂时Rudpqp或Ru NP的荧光寿命值，Q表示铁硫簇催化剂的浓度，KD表示铁硫簇催化剂对Rudpqp或Ru NP的动态淬灭常数。根据瞬态荧光吸收谱图及拟合的寿命衰减曲线，如图19a、19b所示，铁硫簇催化剂对Ru NP的动态淬灭常数为3.9×103M-1，而如图20a、20b所示，铁硫簇催化剂对Rudpqp的动态淬灭常数为4.3×103M-1。
性能检测6铁硫簇-去铁蛋白复合物光催化产氢性能pH值依赖性测试
光催化分解水产氢测试实验被执行在一个100mL的反应器中，该反应器连接着在线气体循环系统。在实验前，将我们所制备的铁硫簇-去铁蛋白复合物(20mL)与1mL H2A(1M)混合，并用1M NaOH溶液调节体系的pH为4.0、5.3、6.1和7.4，将该样品加入反应器，密闭后用真空泵进行抽真空处理，确保体系无氧。光源采用装有滤光片(cut 420nm)的300W氙灯，光功率密度为225mW/cm2，每隔半小时气相色谱采集一次气体，经过气相色谱分析得到氢气浓度，并与氢标准曲线进行比对，得到铁硫簇-去铁蛋白复合物样品产氢量，而产氢转化数计算为产氢量除以铁硫簇分子数。
上述实验结果如图21所示，铁硫簇-去铁蛋白复合物的产氢性能随着pH的降低而增加，考虑到铁硫簇-去铁蛋白复合物的等电点在pH 4.4附近，故后期选择pH 5.3作为产氢最佳的pH值。
性能检测7铁硫簇-去铁蛋白复合物的光催化产氢性能随光敏剂含量测试
光催化分解水产氢测试实验被执行在一个100mL的反应器中，该反应器连接着在线气体循环系统。在实验前，将我们所制备的钌配合物与去铁蛋白投料比例为100,200,300,400:1的铁硫簇-去铁蛋白复合物，分别表示为NC1,NC2,NC3,NC4(20mL)与1mL H2A(1M)混合，并用1M NaOH溶液调节体系的pH为5.3，将该样品加入反应器，密闭后用真空泵进行抽真空处理，确保体系无氧。光源采用装有滤光片(cut 420nm)的300W氙灯，光功率密度为225mW/cm2，每隔半小时气相色谱采集一次气体，经过气相色谱分析得到氢气浓度，并与氢标准曲线进行比对，得到铁硫簇-去铁蛋白复合物样品产氢量，而产氢转化数计算为产氢量除以铁硫簇分子数。
上述实验结果如图22，铁硫簇-去铁蛋白复合物产氢性能随光敏剂钌配合物含量的增加而增加，当增加到一定程度，再增加光敏剂浓度对产氢性能影响不大。
性能检测8铁硫簇-去铁蛋白复合物的光催化产氢性能随铁硫簇催化剂含量变化测试
光催化分解水产氢测试实验被执行在一个100mL的反应器中，该反应器连接着在线气体循环系统。在实验前，将我们所制备的铁硫簇催化剂与去铁蛋白投料比例为100,200,300,400:1的铁硫簇-去铁蛋白复合物分别表示为NC5,NC3,NC6,NC7(20mL)与1mL H2A(1M)混合，并用1M NaOH溶液调节体系的pH为5.3，将该样品加入反应器，密闭后用真空泵进行抽真空处理，确保体系无氧。光源采用装有滤光片(cut 420nm)的300W氙灯，光功率密度为225mW/cm2，每隔半小时气相色谱采集一次气体，经过气相色谱分析得到氢气浓度，并与氢标准曲线进行比对，得到铁硫簇-去铁蛋白复合物样品产氢量。
上述实验结果如图23所示，铁硫簇-去铁蛋白复合物的产氢性能随着铁硫簇催化剂含量的增加而增加。
性能检测9 铁硫簇-去铁蛋白复合物的光催化产氢性能与无去铁蛋白的铁硫簇体系对比
光催化分解水产氢测试实验被执行在一个100mL的反应器中，该反应器连接着在线气体循环系统。在实验前，将我们所制备的铁硫簇-去铁蛋白复合物(20mL)或与无去铁蛋白的铁硫簇体系(其中钌配合物、铁硫簇催化剂含量均与前者相同)与1mL H2A(1M)混合，并用1M NaOH溶液调节体系的pH为5.3，将该样品加入反应器，密闭后用真空泵进行抽真空处理，确保体系无氧。光源采用装有滤光片(cut 420nm)的300W氙灯，光功率密度为225mW/cm2，每隔半小时气相色谱采集一次气体，经过气相色谱分析得到氢气浓度，并与氢标准曲线进行比对，得到样品产氢量，而产氢转化数计算为产氢量除以铁硫簇分子数。
上述实验结果如图24所示，当铁硫簇被组装成铁硫簇-去铁蛋白复合物后，由于解决了铁硫簇的水溶性不好的问题，其产氢性能相对于无去铁蛋白保护的铁硫簇体系有着大幅度提升。
性能检测10 铁硫簇-去铁蛋白复合物的光催化产氢性能稳定性研究
光催化分解水产氢测试实验被执行在一个100mL的反应器中，该反应器连接着在线气体循环系统。在实验前，将所制备的铁硫簇-去铁蛋白复合物(20mL)或4℃冰箱中保存一周的铁硫簇-去铁蛋白复合物(20mL)与1mL H2A(1M)混合，并用1M NaOH溶液调节体系的pH为5.3，将该样品加入反应器，密闭后用真空泵进行抽真空处理，确保体系无氧。光源采用装有滤光片(cut 420nm)的300W氙灯，光功率密度为225mW/cm2，每隔半小时气相色谱采集一次气体，经过气相色谱分析得到氢气浓度，并与氢标准曲线进行比对，得到样品产氢量。
上述实验结果如图25所示，4℃冰箱中保存一周前后，铁硫簇-去铁蛋白复合物产氢性能基本没有发生变化，说明其稳定性较佳。
性能检测11水溶性不同的钌配合物光敏剂光催化分解水产氢性能研究
光催化分解水产氢测试实验被执行在一个100mL的反应器中，该反应器连接着在线气体循环系统。在实验前，将我们所配制的含有铁硫簇、Rudpqp或水溶性很好的钌配合物Rubpy(20mL)与1mL H2A(1M)混合，并用1M NaOH溶液调节体系的pH为5.3，将该样品加入反应器，密闭后用真空泵进行抽真空处理，确保体系无氧。光源采用装有滤光片(cut 420nm)的300W氙灯，光功率密度为225mW/cm2，经过气相色谱分析得氢气浓度，并计算得到样品产氢量。
上述实验结果如图26所示，相对于含有水溶性不佳的Rudpqp的铁硫簇体系，水溶性较好的Rubpy的铁硫簇体系产氢性能更佳。
Claims (10)
1.一种铁硫簇-去铁蛋白复合物，其特征在于：包括去铁蛋白和装载于其中的钌配合物和铁硫簇催化剂，其中，钌配合物的包载率为5～15％，铁硫簇催化剂的包载率为10～30％。
2.根据权利要求1所述的铁硫簇-去铁蛋白复合物，其特征在于：所述铁硫簇催化剂为FeFe氢化酶、NiFe氢化酶或Fe氢化酶。
3.根据权利要求1所述的铁硫簇-去铁蛋白复合物，其特征在于：所述钌配合物为[Ru(bpy)2dpqp](PF6)2或Ru(bpy)3Cl2。
4.权利要求1所述铁硫簇-去铁蛋白复合物的制备方法，其特征在于：调节去铁蛋白水溶液的pH值为酸性，加入钌配合物后调节溶液的pH值为中性或碱性，使去铁蛋白重新组装成完整的蛋白笼，得装载钌配合物的去铁蛋白复合物；将该复合物与铁硫簇催化剂混合，得铁硫簇-去铁蛋白复合物。
5.根据权利要求4所述复合物的制备方法，其特征在于：所述钌配合物与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例为100～400:1。
6.根据权利要求4所述复合物的制备方法，其特征在于：所述铁硫簇催化剂与去铁蛋白纳米颗粒的投料比例为100～400:1。
7.根据权利要求4所述复合物的制备方法，其特征在于：调节所述去铁蛋白水溶液的pH值为2～5；加入钌配合物后调节所述溶液的pH值为7～10。
8.根据权利要求4所述复合物的制备方法，其特征在于：所述装载钌配合物的去铁蛋白复合物与铁硫簇催化剂混合前依次进行静置、透析、过滤及脱盐柱后处理。
9.根据权利要求8所述复合物的制备方法，其特征在于：所述透析是采用含有乙腈的PBS水溶液透析，其中，乙腈在PBS水溶液的体积比为5～30％，透析时间为5～48h。
10.权利要求1-3任一所述的铁硫簇-去铁蛋白复合物或权利要求4-9任一方法制得的铁硫簇-去铁蛋白复合物在光催化水解制氢中的应用。
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