CN1883465A - 脱铁蛋白－铂类抗癌药物复合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脱铁蛋白—铂类抗癌药物复合物及其制备方法。将铂类抗癌药物包裹于脱铁蛋白之中。述脱铁蛋白—铂类抗癌药物复合物的制备方法，其特征在于：将铁蛋白置于pH5.0～6.0的醋酸缓冲溶液中透析，透析液中加入连二亚硫酸钠作为还原剂，联吡啶为螯合剂，每8小时更换一次透析液，直至透析液呈无色，蛋白呈淡黄色时即得到脱铁蛋白；将脱铁蛋白和铂类抗癌药物通过解聚重组法或原位生成法，使铂类抗癌药物包裹于脱铁蛋白之中，获得脱铁蛋白—铂类抗癌药物复合物。
Description
技术领域
本发明涉及一种解决铂类抗癌药物给药的脱铁蛋白—铂类抗癌药物复合物及其制备方法。
背景技术
铂类抗癌药物，尤其是顺铂和卡铂已被应用于治疗各种癌症，所述的顺铂和卡铂结构如下：
顺铂 卡铂
目前，上述铂类抗癌药物主要通过静脉滴注或动脉灌注途径给药。但是在实际应用中，由于这些药物有严重的毒副作用，如肾毒性、神经毒性、骨髓毒性等，而且经常遇到继发抗药性问题，因而临床应用受到很大限制。靶向给药是解决这些问题的有效途径之一，其中，如何选择靶向药物载体是解决问题的关键。由于癌细胞膜上某些蛋白受体表达过度，这给人们提供了一种建立以蛋白分子为靶向药物载体的可能。
铁蛋白是一种由24条亚基组成的球形蛋白，在亚基的相交处有8条约0.4nm大小的亲水性通道通向蛋白内部。蛋白外壳内包裹着铁核，其中的铁主要以FeO(OH)形式存在。用还原剂将铁还原至+2价后，铁可以与螯合剂形成配合物离开铁蛋白，从而在铁蛋白内出现一个空腔，这个无铁的蛋白称为脱铁蛋白。这种脱铁蛋白的制备已有文献报道(参见SimonettaStefanin.Archives of Biochemistry and Biophysics，1996，325，p58-64)，它是将铁蛋白置于醋酸缓冲溶液(pH 5.5)中透析，透析液中加入连二亚硫酸钠作为还原剂，联吡啶为螯合剂，每8小时更换一次透析液直至透析液呈无色，蛋白呈淡黄色时即得到脱铁蛋白。脱铁蛋白的空腔内径为8nm。脱铁蛋白外壳仍然保留了铁蛋白的基本生化特性，因此癌细胞膜上过度表达的脱铁蛋白受体对其仍有识别作用。
发明内容
本发明的目的在于：针对铂类抗癌药物采用目前的给药途径，毒副作用大，容易产生继发抗药性问题，提供一种以脱铁蛋白为药物载体的脱铁蛋白—铂类抗癌药物复合物及其制备方法。
本发明的目的是这样实现的：一种脱铁蛋白—铂类抗癌药物复合物，其特征在于：将铂类抗癌药物包裹于脱铁蛋白之中。
本发明涉及的铂类抗癌药物为顺铂，或卡铂，或顺铂和反铂的混合物。
上述脱铁蛋白—铂类抗癌药物复合物的制备方法，其特征在于：
a)将铁蛋白置于pH 5.0～6.0的醋酸缓冲溶液中透析，透析液中加入连二亚硫酸钠作为还原剂，联吡啶为螯合剂，每8小时更换一次透析液，直至透析液呈无色，蛋白呈淡黄色时即得到脱铁蛋白；
b)将脱铁蛋白和铂类抗癌药物通过解聚重组法或原位生成法，使铂类抗癌药物包裹于脱铁蛋白之中，获得脱铁蛋白—铂类抗癌药物复合物。
在本发明所述制备方法中，所述的解聚重组法在脱铁蛋白中包裹的铂类抗癌药物是顺铂或卡铂，具体制备方法是：将脱铁蛋白加入铂类抗癌药物的饱和溶液中，所述的铂类抗癌药物的饱和溶液为顺铂或卡铂的饱和溶液，用酸性调节溶液将pH值调至2.0～3.0，轻轻震荡30分钟，再用碱性溶液将pH值调至6.0～9.0，温孵两小时后，用0.1～0.2mol/L氯化钠溶液彻底透析，使包裹有铂类抗癌药物的脱铁蛋白与溶液中未被包裹的药物分子分离，获得脱铁蛋白—铂类抗癌药物复合物。
在解聚重组法中：将脱铁蛋白通过氯化钠水溶液稀释后再加入铂类抗癌药物的饱和溶液中，脱铁蛋白在顺铂或卡铂的饱和溶液中的加入量分别为：脱铁蛋白与饱和溶液中的顺铂摩尔比为1∶1500～2500，脱铁蛋白与饱和溶液中卡铂的摩尔比为1∶3000～4000；所述的酸性调节溶液为盐酸调节溶液，所述的碱性调节溶液为氢氧化钠溶液。
在本发明所述制备方法中，所述的原位生成法在脱铁蛋白中生成铂类抗癌药物是含有顺铂和反铂的混合物，具体制备方法是：将用高氯酸钠水溶液稀释后的脱铁蛋白溶液加入500倍于蛋白浓度的K2PtCl4水溶液中，轻轻震荡30分钟后再向溶液中加入等体积的pH值为9.0～10.5的NH3-(NH4)2SO4缓冲溶液，反应24小时后，反应产物用高氯酸钠水溶液彻底透析，使内部包裹铂类抗癌药物的脱铁蛋白与溶液中的反应物分离，获得脱铁蛋白—铂类抗癌药物复合物。
在原位生成法中：所述的反应产物用0.1～0.2mol/L的高氯酸钠水溶液彻底透析。
本发明的优点在于：它利用铁蛋白对某些癌细胞的特异性靶向亲合力，将顺铂或卡铂包裹在脱铁蛋白中，以此达到靶向给药的目的。这种给药系统会减小药物对正常细胞的毒害，改善药物的治疗效果，避免药物在传输过程中的损失。本发明涉及的脱铁蛋白—铂类抗癌药物复合物制备方法简单，原料易得，操作步骤少，重复性好，不产生污染物。
附图说明
图1.脱铁蛋白—顺铂或脱铁蛋白—卡铂的结构示意图；
图2.解聚重组法制备脱铁蛋白—顺铂或脱铁蛋白—卡铂的过程示意图；
图3.原位生成法制备脱铁蛋白—顺铂的过程示意图；
图4.脱铁蛋白-15N-标记卡铂复合物的二维核磁共振谱图；
图5.对照实验中生成15N-标记顺铂和15N-标记反铂及其水合物的二维核磁共振谱图；
图6.脱铁蛋白—顺铂和脱铁蛋白—卡铂复合物的非变性电泳图；
图7.脱铁蛋白—顺铂复合物对大鼠嗜铬神经瘤细胞PC-12细胞系的抑制实验结果。
具体实施方式
图1揭示了脱铁蛋白—铂类抗癌药物复合物的模型结构。图中：1是脱铁蛋白，2是铂类抗癌药物。由图1可见，铂类抗癌药物2包裹于脱铁蛋白1之中。下面结合实施例对脱铁蛋白—铂类抗癌药物复合物的制备过程进行描述。
实施例1
将0.5mL，85mg/mL的铁蛋白装在透析袋内，再置于pH 5.5，200mL的醋酸缓冲溶液中透析，透析液中加入0.6g的连二亚硫酸钠作为还原剂，0.2g的联吡啶为螯合剂，每8小时更换一次透析液直至透析液呈无色，蛋白呈淡黄色时即得到脱铁蛋白。
实施例2
图2揭示了解聚重组法的制备过程：将氯化钠水溶液稀释后的脱铁蛋白加入顺铂或卡铂的饱和溶液中(摩尔比分别可以分别选择1∶1500～2500或1∶3000～4000)，用酸性调节溶液将pH值调至2.0，轻轻震荡30分钟，再用碱性溶液将pH值调至7.5，温孵两小时，将所得溶液装入透析袋中置于氯化钠溶液(0.15mol/L NaCl)中透析24小时，每8小时更换一次透析液，使包裹有铂类抗癌药物的脱铁蛋白与溶液中未被包裹的药物分子分离，获得脱铁蛋白—铂类抗癌药物复合物。下面以顺铂为例，详细描述用解聚重组法来制备脱铁蛋白—顺铂复合物。
将脱铁蛋白的氯化钠水溶液(1.2mg，0.015ml，0.15mol/L NaCl)加入顺铂的饱和水溶液中(12mmol/L，0.5ml，0.15mol/L NaCl)，用盐酸溶液(0.1mol/L)调节反应液的pH值至2.0，室温下静置30分钟，再用氢氧化钠溶液(0.1mol/L)小心调节溶液的pH值至7.5，室温下静置2小时，将反应产物装入透析袋中后置于氯化钠溶液(0.15mol/L，200ml)中透析24小时，每8小时更换一次透析液，可得到脱铁蛋白—顺铂复合物。用ICP法测定脱铁蛋白—顺铂复合物的铂含量，用Lowry法测定得脱铁蛋白浓度，计算出：每个脱铁蛋白分子包裹2个顺铂分子。
将脱铁蛋白溶液加入卡铂的饱和水溶液，用相同方法可得到脱铁蛋白—卡铂复合物。用ICP法测定脱铁蛋白—卡铂复合物的铂含量，用Lowry法测定得脱铁蛋白浓度，计算出：每个脱铁蛋白分子包裹5个卡铂分子。
图4所示的核磁共振谱图证实了用解聚重组法制备的脱铁蛋白—卡铂复合物中包裹了卡铂。图中：a是包裹在脱铁蛋白内的卡铂；b和c是包裹在蛋白内的少量卡铂信号因受到蛋白外壳屏蔽而发生位移。
实施例3
图3揭示了原位生成法的制备过程：将用高氯酸钠水溶液稀释后的脱铁蛋白溶液加入500倍于蛋白浓度的K2PtCl4水溶液中，轻轻震荡30分钟后再向溶液中加入等体积的pH值为9.0～10.5的NH3-(NH4)2SO4缓冲溶液，反应24小时后，将反应液装入透析袋内置于高氯酸钠溶液中透析24小时，每8小时更换一次透析液，使内部包裹顺铂的脱铁蛋白与溶液中的反应物分离，获得脱铁蛋白—顺铂复合物。其具体过程是：
将脱铁蛋白的水溶液(8mg，0.1ml，0.15mol/L NaClO4)和K2PtCl4的水溶液(7.5mg，0.1ml)混合均匀，加入pH值为9.0～10.5的NH3-(NH4)2SO4缓冲溶液(0.2mol/L，0.2ml)，室温下反应24小时，反应产物装入透析袋内置于高氯酸钠溶液(0.15mol/L)中透析24小时，每8小时更换一次透析液，可得到脱铁蛋白—顺铂(+反铂)复合物。
相关反应式：
用ICP法测得脱铁蛋白—顺铂复合物的铂含量为60.5mg/L；用Lowry法测得脱铁蛋白的浓度为0.01mmol/L；对照实验中证实该方法制得的Pt-NH3中顺铂约占50％，计算出每个脱铁蛋白分子包裹15个顺铂分子，(同时还包裹了15个反铂分子)。
图5所示的是对照实验中生成15N-标记顺铂和15N-标记反铂及其水合物的二维核磁共振谱图([Pt]＝20mM，95％H2O/5％D2O，pH 5.2，298K)，图中：1是顺铂；2是反铂；3是顺铂的水解产物；4是反铂的水解产物。由核磁共振谱图证实：K2PtCl4(20mM)在NH3-(NH4)2SO4缓冲溶液(0.2mol/L，pH＝10)中室温下反应24小时后，[PtCl4]2-中的Cl-离子将部分被溶液中的NH3取代生成一系列Pt-NH3配合物，其中主要产物是顺铂和反铂。对图中相关物质的峰面积积分得到：顺铂和反铂的产率之比为1∶1。该对照实验表明进入脱铁蛋白内部的[PtCl4]2-在相同实验条件下将反应生成顺铂和反铂混合物，因此，用原位生成法可制得脱铁蛋白—顺铂复合物。
实施例4
将标记蛋白与用解聚重组法制备的脱铁蛋白-顺铂复合物和脱铁蛋白-卡铂复合物以及用原位生成法制备的脱铁蛋白-顺铂复合物中脱铁蛋白进行对比，它们的形态仍保留完整，其生化特性基本不变。在图6中，泳道1是标记蛋白；泳道2是解聚重组法制备的脱铁蛋白—卡铂复合物；泳道3是解聚重组法制备的脱铁蛋白—顺铂复合物；泳道4是原位生成法制备的脱铁蛋白-顺铂复合物。由图6所示的非变性电泳图说明：无论用哪种方法获得的由脱铁蛋白包裹顺铂、或包裹卡铂、或包裹顺铂和反铂的混合物后，它们的分子量均在440KDa附近，与铁蛋白相同，说明脱铁蛋白包裹铂类抗癌药物后，蛋白外壳依然完整，其生化特征基本没有改变。
实施例5
细胞毒活性实验采用MTT法测试：选用大鼠嗜铬神经瘤细胞PC-12细胞为肿瘤模型细胞，并采用实施例1获得的脱铁蛋白和实施例3用原位生成法制备的获得的脱铁蛋白—顺铂复合物进行对比实验。
将PC12细胞使用96孔盘培养，细胞密度为1×104/孔，温孵24小时后分别加入100μl浓度为1和2×10-6M的脱铁蛋白—顺铂复合物、脱铁蛋白、顺铂溶液，温孵16小时后移去培养液，用磷酸缓冲液洗尽介质，再加入营养液，培养细胞24小时。向每孔加入10μL MTT溶液((5mg·mL-1)，在37℃下反应4小时后移去溶液，向每孔加入150μL DMSO，培养盘在室温下温孵30分钟后用酶标仪测量在490nm处的吸收，计算出不同介质中细胞的存活率。
图7是脱铁蛋白—顺铂复合物对大鼠嗜铬神经瘤细胞PC-12细胞系的抑制实验结果，图中：Af-CDDP是脱铁蛋白—顺铂复合物；Af是脱铁蛋白。实验结果表明：用原位生成法制备的脱铁蛋白—顺铂复合物对一种常用的神经肿瘤模型细胞(PC12)具有明显的抑制作用，说明包裹在脱铁蛋白—顺铂复合物中的顺铂仍然具有抑制肿瘤细胞繁殖的效力。
上述各实施例不是对本发明的具体限制。
Claims (7)
1、一种脱铁蛋白-铂类抗癌药物复合物，其特征在于：将铂类抗癌药物包裹于脱铁蛋白之中。
2、根据权利要求1所述的脱铁蛋白-铂类抗癌药物复合物，其特征在于：所述的铂类抗癌药物为顺铂或卡铂或顺铂和反铂的混合物。
3、根据权利要求1或2所述脱铁蛋白-铂类抗癌药物复合物的制备方法，其特征在于：
a)将铁蛋白置于pH 5.0～6.0的醋酸缓冲溶液中透析，透析液中加入连二亚硫酸钠作为还原剂，联吡啶为螫合剂，每8小时更换一次透析液，直至透析液呈无色，蛋白呈淡黄色时即得到脱铁蛋白；
b)将脱铁蛋白和铂类抗癌药物通过解聚重组法或原位生成法，使铂类抗癌药物包裹于脱铁蛋白之中，获得脱铁蛋白-铂类抗癌药物复合物。
4、根据权利要求3所述脱铁蛋白-铂类抗癌药物复合物的制备方法，其特征在于：所述的解聚重组法在脱铁蛋白中包裹的铂类抗癌药物是顺铂或卡铂，具体制备方法是：将脱铁蛋白加入铂类抗癌药物的饱和溶液中，所述的铂类抗癌药物的饱和溶液为顺铂或卡铂的饱和溶液，用酸性调节溶液将pH值调至2.0～3.0，轻轻震荡30分钟，再用碱性溶液将pH值调至6.0～9.0，温孵两小时后，用0.1～0.2mol/L氯化钠溶液彻底透析，使包裹有铂类抗癌药物的脱铁蛋白与溶液中未被包裹的药物分子分离，获得脱铁蛋白-铂类抗癌药物复合物。
5、根据权利要求4所述脱铁蛋白-铂类抗癌药物复合物的制备方法，其特征在于：将脱铁蛋白通过氯化钠水溶液稀释后再加入铂类抗癌药物的饱和溶液中，脱铁蛋白在顺铂或卡铂的饱和溶液中的加入量分别为：脱铁蛋白与饱和溶液中的顺铂摩尔比为1∶1500～2500，脱铁蛋白与饱和溶液中卡铂的摩尔比为1∶3000～4000；所述的酸性调节溶液为盐酸调节溶液，所述的碱性调节溶液为氢氧化钠溶液。
6、根据权利要求3所述脱铁蛋白-铂类抗癌药物复合物的制备方法，其特征在于：所述的原位生成法在脱铁蛋白中生成铂类抗癌药物是含有顺铂和反铂的混合物，具体制备方法是：将用高氯酸钠水溶液稀释后的脱铁蛋白溶液加入500倍于蛋白浓度的K2PtCl4水溶液中，轻轻震荡30分钟后再向溶液中加入等体积的pH值为9.0～10.5的NH3-(NH4)2SO4缓冲溶液，反应24小时后，反应产物用高氯酸钠水溶液彻底透析，使内部包裹铂类抗癌药物的脱铁蛋白与溶液中的反应物分离，获得脱铁蛋白-铂类抗癌药物复合物。
7、根据权利要求6所述脱铁蛋白-铂类抗癌药物复合物的制备方法，其特征在于：所述的反应产物用0.1～0.2mol/L的高氯酸钠水溶液彻底透析。
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