CN101171022A - 抑制g蛋白信号传导的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及对与G蛋白β亚基的蛋白质相互作用位点的特异氨基酸残基结合的试剂进行鉴定的方法。还提供了根据本发明的测定而鉴定出的化合物或复合物以及使用该化合物或复合物调节G蛋白的至少一种活性的方法。

Description

抑制G蛋白信号传导的组合物和方法

引言

本发明是在美国国立卫生研究院资助(项目编号：GM60286和DK46371)的研究过程中完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。

背景技术

已发现了G蛋白β亚基(37kDa)的5种哺乳动物同种型和G蛋白γ亚基(7.8kDa)的1 2种同种型(Offermanns(2003)Prog.Biophys.Mol.Biol 83：101-30)。由G蛋白β亚基和γ亚基构成的专性异源二聚体(Gβγ)在真核细胞的许多通路中起着调控分子的作用(Neves，et al.(2002)Science 296：1636-9；Clapham and Neer(1997)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.37：167-203)。Gβγ最初被鉴定为鸟苷酸解离抑制剂(GDI)，它与结合有GDP的G蛋白α亚基(Gα)紧密结合，从而组成了G蛋白异源三聚体的基本形式，这个形式中Gα和Gβγ在信号传导中都没有活性。激动剂激发的G蛋白偶联受体(GPCR)催化Gα上的GDP与GTP的交换，并且将Gβγ从异源三聚体复合体上释放，释放出两种有活性的信号传导分子：Gα·GTP和Gβγ。Gβγ信号传导的靶标包括G蛋白调节的内向整流型钾通道(GIRK)(Krapivinsky，et al.(1993)J.Biol.Chem.273：16946-52)，I型、II型和IV型腺苷酸环化酶同种型(Tangand Gilman(1991)Science 254：1500-3；Sunahara，et al.(1996)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.36：461-80)，丝裂素激活的蛋白激酶(MAPK)(Schwindinger and Robishaw(2001)Oncogene 20：1653-60)，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)(Schwindinger and Robishaw(2001)见上文)，磷转导蛋白(phosducin)(Schulz(2001)Pharmacol Res 43：1-10)，G蛋白受体激酶(GRK)家族的至少两个成员(Koch，et al.(1993)J.Biol.Chem.268：8256-60；Inglese，et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3637-41)和其他包含PH(plextrinhomology)结构域的蛋白质包括发动蛋白(Lin，et al.(1998)Proc.Natl.A cad.Sci.USA 95：5057-60；Scaife and Margolis(1997)Cell Sighal 9：395-401)和磷脂酶Cβ(PLCβ)的β1、β2和β3同种型(Sternweis and Smrcka(1992)Trends Biochem.Sci.17：502-6；Li，etal.(1998)J.Biol.Chem.273：16265-72)以及许多其他的蛋白。

Gβ是一个由7个四股β折叠从一个中轴放射状排列构成的锥形螺旋结构(Wall，et al.(1995)Cell 83：1047-58；Lambright，et al.(1996)Nature 379：311-9)。每个β折叠由两个连续的WD-40重复元件组成，由每个重复元件的C-端保守的Trp-Asp序列而得名(Gettemans，et al.(2003)Sci STKE 2003：PE27)。Gγ亚基是一个伸展螺旋分子，位于一个穿过锥形结构的底面的疏水通道中。相对狭小的Gβ锥形结构“顶”表面是Gα(通过它的开关II区域)(Wall，et al.(1995)见上文；Lambright，et al.(1996)见上文)、磷转导蛋白(Loew，et al.(1998)Structure 6：1007-19；Gaudet，et al.(1996)Cell 87：577-88)和GRK2(Lodowski，et al.(2003)Science 300：1256-62)的主要结合位点，这正如这些复合体的晶体结构所示。突变分析表明，Gβγ的多种相互作用的配偶体包括PLC β2和腺苷酸环化酶结合于同一表面(Li，et al.(1998)见上文；Ford，et al.(1998)Science 280：1271-4)。例如在Gα和磷转导蛋白结合Gβγ的晶体结构中，位于Gβ隆凸面侧的位点作为辅助的结合面被某些Gβγ靶标特异地识别(Wall，et al.(1995)见上文；Loew，et al.(1998)见上文；Gaudet，et al.(1996)见上文；Wall，et al.(1998)Structure 6：1169-83)。

随机肽库的噬菌体展示技术已经被应用于鉴定进行结合所要求的序列和筛选与Gβ₁γ₂二聚体结合的肽(Scott，et al.(2001)EMBO J.20：767-76)。虽然已经筛选了上亿的单个克隆，但是大部分与Gβ₁γ₂结合的肽可以被分为与氨基酸序列不相关的四个类别。其中一类包括一种序                          列                            为Ser-Ile-Arg-Lys-Ala-Leu-Asn-Ile-Leu-Gly-Tyr-Pro-Asp-Tyr-Asp(SEQID NO：1)的线性肽(“SIRK”肽)。SIRK肽通过Gβ₁γ₂的亚基抑制PLC β2的激活，IC₅₀为5μM，并且阻断PI3K的激活。相反，SIRK肽对I型腺苷酸环化酶或者电压依赖的N-型Ca⁺⁺通道活性的Gβ₁γ₂调控没有或者几乎没有作用(Scott，et al.(2001)见上文)。这证明，对Gβγ结合的配偶体选择性的抑制可以实现。属于全部四个类别中的各肽以某个范围的亲和力互相竞争地与Gβ₁γ₂结合，这说明通过噬菌体展示筛选技术分离到的所有克隆在Gβ₁γ₂上有共同的结合位点(Scott，et al.(2001)见上文)。

后来的实验显示，SIRK肽不但能阻断异源三聚体的形成，而且在没有Gα_i1激活的时候，还能代替Gβ₁γ₂·Gα_i1复合体中的Gα_i1，并在完整细胞中激活G蛋白依赖性ERK1和ERK2通路(Ghosh，et al.(2003)J.Biol.Chem.278：34747-50；Goubaeva，et al.(2003)J.Biol.Chem.278：19634-41)。体外实验发现SIRK促使了不依赖于核苷交换的异源三聚体解聚(Goubaeva，et al.(2003)见上文；Ghosh，et al.(2003)见上文)，这可能地解释了ERK在完整细胞中的激活。其他Gβγ结合肽，例如由腺苷酸环化酶II而得的QEHA(Weng，et al.(1996)J.Biol.Chem.271：26445-26448；Chen，et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：2711-2714)和βARK(GRK2)的C-端区域第643-670个氨基酸(Koch，et al.(1993)见上文)虽然竞争性地与Gα亚基结合，但不能促进异源三聚体的解聚(Ghosh，et al.(2003)见上文)。这表明，这些肽与Gα-Gβγ亚基的竞争性结合并不足以加速亚基解聚。

使用掺杂诱变(doping mutagenesis)和再筛选策略获得了一个SIRK肽类似的肽，它与Gβ₁γ₂有更高的亲和性。该肽的序列为：Ser-Ile-Gly-Lys-Ala-Phe-Lys-Ile-Leu-Gly-Tyr-Pro-Asp-Tyr-Asp(SEQID NO：2)(SIGK)。对SIGK肽的体外研究表明，它也可以替代异源三聚体中的Gα_i1，并且也能有效地阻止异源三聚体的形成(Ghosh，etal.(2003)见上文)。SIRK/SIGK介导Gα_i1·GDP与Gβ₁γ₂解离的机制目前还不清楚，但该机制被认为需要Gβ₁γ₂亚基内构象的改变，以使在肽存在的时候增加Gα_i1亚基解离的速度(Ghosh，et al.(2003)见上文)。

发明内容

本发明涉及一种对可调节G蛋白的至少一种活性的试剂进行鉴定的方法。该方法包括使G蛋白β亚基与一种待测试剂相接触，并确定所述试剂是否与所述β亚基的蛋白质相互作用位点上的至少一个氨基酸残基相互作用，从而鉴定一种可调节所述G蛋白至少一种活性的试剂。

本发明还涉及一种对可与所述β亚基的蛋白质相互作用位点的至少一个氨基酸残基结合的试剂进行鉴定的方法。该方法包括以下步骤，在一种肽存在的情况下——所述肽可与β亚基的蛋白质相互作用位点的至少一个氨基酸残基结合——使G蛋白β亚基与一种待测试剂相接触，并确定所述试剂是否抑制所述肽与所述β亚基的蛋白质相互作用位点的至少一个氨基酸残基结合，从而鉴定一种可与所述β亚基的蛋白质相互作用位点的至少一个氨基酸残基结合的试剂。

本发明还涉及一种调节G蛋白的至少一种活性的方法。该方法包括使G蛋白与有效量的一种试剂相接触，所述试剂可与所述G蛋白β亚基的蛋白质相互作用位点的至少一个氨基酸残基相互作用，从而对G蛋白的至少一种活性进行调节。

本发明还是一种预防或治疗一种疾病或病症的方法，所述疾病或病症与至少一种G蛋白βγ亚基活性有关。该方法包括向患有与至少一种G蛋白βγ亚基活性有关的疾病或病症的患者或具有该患病风险的患者提供有效量的一种试剂——所述试剂可与所述G蛋白β亚基的蛋白质相互作用位点的至少一个氨基酸残基相互作用——以调节所述G蛋白的至少一种活性，从而预防或治疗与至少一种G蛋白βγ亚基活性有关的疾病或病症。与G蛋白βγ亚基活性有关的疾病或病症包括心力衰竭、成瘾性、炎症和阿片耐受等。

本发明还提供一种用于鉴定一种试剂的试剂盒，所述试剂可与所述β亚基的蛋白质相互作用位点的至少一个氨基酸残基结合。本发明的所述试剂盒包含一个SIGK肽或SIGK肽的衍生物。

本发明进一步提供了根据本发明的筛选方法进行鉴定获得的试剂，其中所述试剂具有式I、II或III的结构。

附图说明

图1显示出，预测与Gβ蛋白质相互作用位点结合的小分子可以在蛋白质相互作用位点干扰肽的相互作用。1，对照(DMSO)；2，NSC30820；3，NSC12155；4，NSC13984；5，NSC117079；6，NSC610930；7，NSC293161；8，NSC23128；9，NSC402959；10，NSC109268；11，NSC125910；12，溶于DMSO的SIGK。该检测中使用的SIGK为20μM，每种小分子为200μM。

图2显示出NSC119910与Gβγ结合，并干扰生理学相关的蛋白相互作用，如与Gα亚基的相互作用。

图3显示出NSC119910抑制磷脂酶C-Gβγ相互作用。磷脂酶的酶活性用成熟的方法测定(Ghosh and Smrcka(2003)Meth.Mol.Biol.237：67-75)。

图4显示出在存在或不存在10μM NSC119910的条件下，用fMLP或ATP激动剂激活的嗜中性粒细胞的胞质Ca²⁺浓度的峰值。fMLP，n＝3；ATP，n＝2。

图5显示出，在存在和不存在10μM NSC119910的情况下，用fMLP或ATP激活嗜中性粒细胞时，代表性实验证实的胞质Ca²⁺浓度的峰值和荧光强度降低到半峰值(t_1/2)所需要的时间。

图6显示出在本发明的示例化合物存在的情况下，PLC-β2和PLC-β3的激活被抑制。

具体实施方式

G蛋白的蛋白质相互作用位点已经被鉴定出来。SIGK结合Gβγ的结构已经被揭示，该结构表明SIGK作为一个α螺旋穿过Gα相互作用表面与Gβγ结合，并位于异源三聚体中被Gα的开关II结构域的α螺旋区域占据的位置。不论SIGK是否存在，Gβγ的构象都非常相似。因此，该晶体结构揭示了该肽是如何阻断Gα-Gβγ相互作用的。该结构也表明Gβ逐渐演化为具有高度活性且高度特化的表面结构，从而可与多种蛋白质配偶体相互作用。该特化的表面在本文被称为“蛋白质相互作用位点”或“Gβ的蛋白质相互作用位点”。对该蛋白质相互作用位点的各种特性进行的分析表明，该表面可作为一个优选的相互作用表面的基础不是该位点的固有构象柔性或非常高的表面可接近性，而是在此单个结合表面上存在丰富的多种类型的潜在可相互作用的化学物质。已经确定了蛋白质相互作用位点处识别氨基酸序列所需的该表面的特异氨基酸组合。而且，已经证实了加速异源三聚体的解离或抑制蛋白质复合体的形成所需的特异的分子相互作用。

因此，本发明涉及一种鉴定一种试剂的方法，所述试剂可调节(即阻断或抑制，或者激活或加强)G蛋白的至少一种活性，该方法通过以下步骤进行：使G蛋白β亚基与一种待测试剂接触(例如，以高通量的方式筛选)，并确定该待测试剂是否与G蛋白β亚基的蛋白质相互作用位点的至少一个氨基酸残基相互作用。G蛋白β亚基意在包括所有五种已知的哺乳动物G蛋白β亚基同种型中的任何一种(Offermanns(2003)见上文)。G蛋白活性的意在指通过G蛋白向一个或多个下游蛋白质传导信号，所述下游蛋白质包括但不限于：G蛋白调控的内向整流型钾通道(GIRK)、腺苷酸环化酶I型、II型和IV型同种型、促分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、G蛋白受体激酶(GRK)家族成员和其他包含PH结构域的蛋白质，包括发动蛋白、磷脂酶Cβ(PLCβ)的β1、β2和β3同种型。对G蛋白活性的调节是通过该试剂与蛋白质相互作用位点的至少一个氨基酸残基结合进行的，从而阻断Gβγ亚基和Gα亚基或者Gβγ亚基和本文所述的下游蛋白质之间的相互作用。

Gβγ₁结合SIGK的晶体结构揭示了与SIGK肽相互作用的Gβ₁的残基可以被多种Gβγ结合蛋白(例如下游蛋白质)利用。例如，在Gβ₁γ₂·GRK2复合体的晶体结构中，Gβ₁的Lys57、Tyr59、Trp99、Met101、Leu117、Tyr145、Met188、Asp246和Trp332都参与了与GRK2的PH结构域的接触，并且Gβ₁的所有这些氨基酸残基也参与了与SIGK的接触(表1)。尽管存在这样的事实，但与Gβ₁接触的PH结构域的二级结构(RH-PH环、αCT区域和β4链)与纯螺旋结构的SIGK肽完全不同(Lodowski，et al.(2003)见上文)。这一论点内容在Gβ₁与磷转导蛋白结合的复合体中也再次呈现(Ford，et al.(1998)见上文)，其中同样一组Gβ₁残基与一个结合配偶体相接触，该结合配偶体有着与GRK2不同的二级结构。值得注意的是，Gα_i1的开关II区域形成一个α-螺旋，该螺旋的结合方向与SIGK肽几乎相同。然而，Gα_i1的开关II与SIGK肽没有序列上的相似性，但它包含一个与SIGK的Lys4几乎定位在相同位置的赖氨酸(Lys210)(Goubaeva，et al.(2003)见上文)。

表1

列标题关键字：Gα_i1，Gα_i1·Gβ₁γ₂异源三聚体的晶体结构(Wall，et al.(1995)见上文；Wall，et al.(1998)见上文)；磷转导蛋白，磷转导蛋白·Gβ₁γ₂复合体(Gaudet，et al.(1996)见上文)、GRK2，GRK2·Gβ₁γ₂复合体(Lodowski，et al.(2003)见上文)；SIGK，SIGK·Gβ₁γ₂复合体；PLCβ，PLCβ2/3·Gβ₁γ₂复合体突变分析(Li，et al.(1998)见上文；Ford，et al.(1998)见上文)；AC，I/II型腺苷酸环化酶·Gβ₁γ₂复合体突变分析(Ford，et al.(1998)见上文)；GIRK，Gβ₁γ₂与GIRK1/4通道相互作用突变分析(Ford，et al.(1998)见上文)；Ca⁺⁺，Gβ₁γ₂与N型或P/Q型钙通道相互作用突变分析(Ford，et al.(1998)见上文；Agler，et al.(2003)J.Gen.Physiol.121：495-510)。带下划线的残基表示SIGK·Gβ₁γ₂相互作用中的重要残基。最后一行表示靶标和SIGK界面间相同的残基的百分数。

若将Gβγ的靶标PLCβ2、腺苷酸环化酶和GIRK和CCα1B钙通道的突变数据纳入该分析，SIGK在Gβ上的足印结果与上述几个靶标的足印结果类似(Li，et al.(1998)见上文；Ford，et al.(1998)见上文)。Gβ中构成蛋白质相互作用位点的13个残基中的9个(Lys57、Tyr59、Trp99、Met101、Leu117、Tyr145、Met188、Asp246和Trp332)在Gα、GRK2和磷转导蛋白复合体中也作为接触残基存在(表1)。这些残基表明Gβ的多种结合配偶体使用了相同的一组残基。13个残基中的另外3个(Asp186、Asp228和Asn230)为SIGK和两个其他的蛋白复合体结构所共用。13个氨基酸中的另外一个，即Val100，通过其主链上的氧与SIGK接触，并且不参与其他复合体的结合相互作用。对突变干扰最敏感的SIGK结合残基也最频繁地参与与其他Gβ结合配偶体的相互作用。SIGK是通过随机肽噬菌体展示被鉴定的，其中，序列上不相关的多种肽似乎都与Gβ₁上的同一个蛋白质相互作用位点结合。

由于SIGK能够接触的Gβ₁残基和参与蛋白质Gβγ靶标的结合的Gβ₁残基之间有大范围的重合，因此SIGK是多个Gβγ结合反应的竞争性抑制剂。相关性很高的SIRK肽对几个Gβγ-依赖性通路均有作用；它阻断酶测定中的Gβγ-介导的PLC β2、PLC β3和PI3K的激活，并引起基于细胞的测定中ERK I/II的激活(Scott，et al.(2001)见上文；Goubaeva，et al.(2003)见上文)。所述效应对SIGK中与Gβ的表面相互作用的残基的突变很敏感，因为丙氨酸扫描实验已表明SIGK的Lys4、Ala5、Phe6、Ile8、Leu9和Gly10的在抑制Gβ₁γ₂对PLC β2的激活中都起到重要的作用(Scott，et al.(2001)见上文)。另外，在细胞培养物中，SIGK的Leu9对SIGK激活MAPK通路的能力十分重要(Goubaeva，etal.(2003)见上文)。然而，SIRK并不阻断对I型腺苷酸环化酶或N-型Ca²⁺通道的调控的抑制，虽然它们的足印实验结果与Gα的和PLCβ2的非常相像(Scott，et al.(2001)见上文)。相反，Gβ中可阻止SIGK进行结合的突变并不会对与其他的Gβγ结合配偶体的相互作用产生相同的影响。例如，将Leu117突变成丙氨酸会减小Gβ₁γ₂激活II型腺苷酸环化酶和PLC β3的能力，以及Gβ₁γ₂结合GRK2和SIGK的能力，但是对GIRK1/GIRK4钾通道的激活、CCα1B钙通道的激活以及PLC β2的激活没有影响(表1)(Li，et al.(1998)见上文；Ford，et al.(1998)见上文)。类似地，Gβ₁γ₂的Trp332突变为丙氨酸会减小Gβ₁γ₂对SIGK的亲和性并会损伤对II型腺苷酸环化酶、CCα1B和PLC β2和PLC β3的刺激活性，但不会影响与GRK2的相互作用、GIRK1/GIRK4的激活或者I型腺苷酸环化酶的抑制(Li，et al.(1998)见上文；Ford，et al.(1998)见上文)。Gβ₁γ₂的Leu117和Trp332都是Gβ₁的Gα_t和Gα_i1结合位点的一部分(Wall，et al.(1995)见上文；Lambright，et al.(1996)见上文；Wall，et al.(1998)见上文)，Leu117的突变还会影响Gα_i1与Gβ₁γ₂的结合(Li，et al.(1998)见上文；Ford，et al.(1998)见上文)。

与其他可阻断异源三聚体形成的肽(Ghosh，et al.(2003)见上文)不同，SIGK可促进不依赖于核苷酸交换的Gβ₁γ₂从Gα_i1的解离(Ghosh，et al.(2003)见上文；Goubaeva，et al.(2003)见上文)。例如，由GRK2的C-端获得的肽会阻断异源三聚体的形成(Ghosh，et al.(2003)见上文)，但是并不会促进Gα_i1·Gβ₁γ₂亚基的解聚，尽管GRK2·Gβ₁γ₂复合体的结构表明了该肽可能使用了与SIGK相同的Gβ₁表面(Lodowski，et al.(2003)见上文)。不拘囿于理论，SIGK可以通过两种机制中的任一种来促进异源三聚体的解聚。SIGK可能诱导Gβ₁构象的变化，这种变化会扩展到SIGK结合位点之外的其他区域，并破坏Gβ₁和Gα_i1之间的其他相互作用。然而，Gβ₁γ₂·SIGK的结构显示，SIGK在其结合位点本身之外并不引起Gβ₁的显著的构象变化。第二种机制是基于Gα_i1可以动态地与Gβ的两个表面的任一个解离并与之再结合这一假设，其中一个表面是Gβ₁顶面的开关II相互作用位点，其中SIGK以相似的方向结合，另一个表面是位于Gβ₁的一号桨叶片结构上的N-端相互作用表面。从开关II界面的Gα_i1暂时释放可使得SIGK可以接近Gβ₁。如果SIGK的解离速度比Gα_i1的N-端解离速度小，则会出现Gα_i1从Gβ完全释放的现象。因此，与Gβ顶表面结合的GRK2肽可能解离得太快以至于不能促进Gα的解离。Gβγ相互作用的这一动力模型有生物学的关联，因为许多Gβγ结合靶是与Gβ顶表面外部有结合，并且还可以短暂地试着与Gβ上的其他表面结合。

Gβ₁γ₂的蛋白质相互作用位点能够识别一系列具有各种二级结构的蛋白质配体说明它可能是优先的蛋白质结合位点的一个实例(见例如Delano，et al.(2000)Science 287：1279-1283)。优先结合表面具有高溶剂可及性、低极性和高度的构象柔性等特征(Scott，et al.(2001)见上文；Ma，et al.(2001)Curr.Opin.Struct.Biol.11：364-9；Bogan and Thorn(1998)J.Mol.Biol.280：1-9；Clackson and Wells(1995)Science 267：383-6；DeLano(2002)Curr.Opin.Struct.Biol.12：14-20)。而且，优先结合位点可能包含含量极高的所谓“热点”，即如果被突变成丙氨酸则会使结合能降低至少10倍的残基(DeLano(2002)见上文)。热点已经被用来描述蛋白质-蛋白质和蛋白质-小分子的界面，通常一个表面上任何热点的点突变都会完全阻止复合体的形成，甚至是在结合界面只掩盖了总表面积中的几百

时也是如此(Bogan and Thorn(1998)见上文；Clackson and Wells(1995)见上文；Thanos，et al.(2003)J.Am.Chem.Soc.125：15280-1；Zhang，et al.(2003)J.Biol.Chem.278：33097-104)。这些标准在本发明中被用来评估作为蛋白质表面的Gβ₁的蛋白质相互作用位点，所述蛋白质表面的化学组成和表面性质使得该表面易于用作蛋白结合位点。在Gβ的蛋白质相互作用位点的12个残基中，有8个(Lys57、Tyr59、Leu117、Tyr145、Asp186、Met188、Asn230、和Trp332)符合作为热点残基的能量标准。用丙氨酸置换这些残基中何一个都会使Gβ₁γ₂对SIGK的结合性降低10倍。很明显，这些氨基酸残基在能量上都是十分重要的节点，有利于促进SIGK的结合。Gβ₁的SIGK结合表面包括在热点中显示出的比例很高的几种残基(Bogan and Thorn(1998)见上文)。它们包括酪氨酸、色氨酸和精氨酸；既能形成极性又能形成非极性相互作用的大残基。Gβ的蛋白质相互作用位点的芳香族残基的数量比其他表面的该残基量显著更多。相对于可接近Gβ残基的8.5％的总非甘氨酸表面，38％的SIGK结合表面是由Phe、Tyr、His或Trp构成的。因此，Gβ的蛋白质相互作用位点更加非极性；总体上，Gβ的蛋白质相互作用位点中62％为非极性的，而Gβ表面可接近的残基中非极性的为29％。而且，天冬酰胺和天冬氨酸在热点表面上具有中度有利的分布，在Gβ的蛋白质相互作用位点的13个残基中占4个。这种芳香族和带电荷残基的组合使得在Gβ的蛋白质相互作用位点可以容纳具有不同化学特性的结合配偶体。优先结合表面被期望具有高度表面可接近性(DeLano，et al.(2000)见上文)。为了分析Gβ的蛋白质相互作用位点的这种性质，在残基、主链和侧链水平计算Gβ分子上总的可接近表面面积。Gβ的蛋白质相互作用位点上大部分的氨基酸的可接近性都不比其他类型的Gβ氨基酸显著更高。然而，5个残基显示出显著地偏离平均值：Tyr59、Trp99、Met101、Leu117和Trp332。对于Trp99，侧链表面的可接近性大大高于类型的平均值；Tyr59、Trp99和Met101的主链可接近性超过平均值。Leu117的主链和侧链可接近性都显著高于平均值。

构象的柔性或适应性已经被认为是优先结合表面的重要的决定因素，因为这类表面能更好地结合在结构上不相关的蛋白质标靶(DeLano，et al.(2000)见上文)。根据几个蛋白质复合体环境中的相对位置变化可对残基的柔定量。四个晶体结构(Gβ₁γ₂·SIGK、Gβ₁γ₂·Gα_i1、Gβ₁γ₂·GRK2、Gβ₁γ₂·磷转导蛋白)中所有Gβ残基的没有形成复合体的Gβ₁γ₁的RMSD直方图分析显示，Gβ的蛋白质相互作用位点残基仅呈现出略高于平均侧链位置分散度(分别为1.42

和1.35

)，Trp99、Asp228和Trp332的侧链相对于平均值的正向偏离最大(均大于2

)。特别地，七号片结构内的Arg314和Trp332向Gβ₁的隆凸外凸出10

的距离以与磷转导蛋白相互作用。原子B因子也提供了一种测量构象柔挠性的方法。在没有形成复合体的Gβ₁γ₁结构中，Trp99、Val100和Met101的B因子都超过平均值至少一倍的方差(Trp99超过平均值2倍方差)。当与Gα_i1、GRK2、磷转导蛋白和SIGK复合体形成复合体后，结合位点的这些残基变得更加有序，B值与平均值接近并且有些情况下低于平均值最多达一倍的方差。因此，Gβ识别结构各异的结合配偶体的能力并不需要Gβ的蛋白质相互作用位点的大多数残基的构象都具有高度柔挠性。Gβ1的结构上的细微的改变足以使之容纳一系列的共同演化结的合配偶体。结构分析和突变分析证明Gβ上的蛋白质相互作用位点可以被看作是热表面，共同演化以促进与多种蛋白质靶标的紧密结合。然而，Gβγ作为热表面的机制是复杂的。Trp332是唯一符合热点所有四个标砖的残基，而Tyr59和Trp99则是具有所测试的热点残基四个特征中的三个。在Gβ的顶部表面还有其他残基对突变干扰敏感并被应用在与许多结合配偶体的相互作用中，但它们并未表现出所期望的热点构象挠性柔性、溶剂可及性或非极性特征。在这类残基中，Lys57和Met188特别引人关注，通过突变分析和与已知的Gβγ复合体结构的比较结果表明这两个残基在Gβ中均是能量上的显著结合的决定残基，但并不符合热点残基的任何其他的统计学标准。

因此，Gβ的蛋白质的相互作用位点的氨基酸残基旨在包括Lys57、Tyr59、Trp99、Val100、Met101、Leu117、Tyr145、Asp186、Met188、Asp228、Asn230、Asp246和Trp332。用图示的方法提供了大鼠Gβ氨基酸序列上的这些残基的位置如下：

MGEMEQLKQE AEQLKKQIAD ARKACADITL AELVSGLEVV GRVQMRTRRT

LRGHLAKIYA MHWATDSKLL VSASQDGKLI VWDTYTTNKV HAIPLRSSWV

MTCAYAPSGN FVACGGLDNM CSIYSLKSRE GNVKVSRELS AHTGYLSCCR

FLDDNNIVTS SGDTTCALWD IETGQQKTVF VGHTGDCMSL AVSPDYKLFI

SGACDASAKL WDVREGTCRQ TFTGHESDIN AICFFPNGEA ICTGSDDASC

RLFDLRADQE LTAYSHESII CGITSVAFSL SGRLLFAGYD DFNCNVWDSL

KCERVGVLSG HDNRVSCLGV TADGMAVATG SWDSFLKIWN

(GENBANK编号：AAA62620；SEQ ID NO：3)，其中蛋白质相互作用位点残基用下划线表示。

同样，这些残基在人的Gβ有相同的位置，其氨基酸序列如下：

MSELEQLRQE AEQLRNQIRD ARKACGDSTL TQITAGLDPV GRIQMRTRRT

LRGHLAKIYA MHWGTDSRLL VSASQDGKLI IWDSYTTNKV HAIPLRSSWV

MTCAYAXSGN FVACGGLDNI CSIYSLKTRE GNVRVSRELP GHTGYLSCCR

FLDDNQIITS SGDTTCALWD IETGQQTVGF AGHSGDVMSL SLAPNGRTFV

SGACDASIKL WDVRDSMCRQ TFIGHESDIN AVAFFPNGYA FTTGSDDATC

RLFDLRADQE LLMYSHDNII CGITSVAFSR SGRLLLAGYD DFNCNIWDAM

KGDRAGVLAG HDNRVSCLGV TDDGMAVATG SWDSFLKIWN

(GENBANK编号：AAA35922；SEQ ID NO：4)，其中蛋白质相互作用位点残基用下划线表示。

与位于Gβ的蛋白质相互作用位点的这些氨基酸残基的至少一个有相互作用的试剂可以通过各种异源的非键合相互作用结合以贡献结合能，所述非键合相互作用包括但不限于范德华力接触(例如，与甲硫氨酸或亮氨酸)、极性接触(例如，与天冬氨酸或天冬酰胺)或者二者的组合(例如，与赖氨酸、色氨酸或酪氨酸)。通常需要试剂与Gβ的蛋白质相互作用位点的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸残基相互作用以增强该试剂对一种或多种G蛋白相互作用蛋白质的特异性并因此增强该试剂对一个或多个G蛋白介导的信号传导通路的特异性。

对试剂是否与β亚基的蛋白质相互作用位点上的至少一个氨基酸残基相作用的测定，可以通过基于对Gβγ亚基与其他肽或蛋白质(所述其他肽或蛋白质为已知的可与Gβγ亚基相互作用的肽或蛋白质，例如，SIGK肽、Gα亚基、或下游蛋白)之间的蛋白质-蛋白质相互作用进行检测的各种体外或体内分析来实现。本文公开了体外测定的一个实例。所述测定由以下步骤组成：获得分离的Gβγ复合体；在存在有与β亚基的蛋白质相互作用位点上至少一个氨基酸残基相结合的肽(例如下述序列的SIGK肽或SIGK肽衍生物：SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12或SEQ ID NO：13)的条件下，使Gβγ复合体与待测试剂相接触；并用例如ELISA测定的方法检测所述待测试剂对所述肽与β亚基的蛋白质相互作用位点的结合进行抑制的能力。最初筛选鉴定的其他噬菌体展示的肽(Scott，et al.(2001)见上文)也可以被使用。

或者，体内测定可以被用来测定待测试剂是否与β亚基的蛋白质相互作用位点上的至少一个氨基酸残基相互作用。用一个例子说明，考虑使用双杂交测定，在该测定中使待测试剂与表达Gβγ亚基的细胞和例如SIGK等肽相接触，其中β亚基与例如DNA结合域等融合，SIGK肽与激活域融合。当SIGK肽和与Gβγ的蛋白质相互作用位点结合的时候，会诱导报告蛋白的表达。如果待测试剂破坏了SIGK肽与Gβγ的蛋白质相互作用位点结合，则会阻断报告蛋白的表达。

其他筛选例如成熟的计算筛选或者检测G蛋白依赖性下游蛋白的活性(例如，PLCβ的酶活性)的筛选也与与本文所公开的测定一起被考虑。

按照本发明的方法筛选的待测试剂，本文中也称之为化合物，它通常从试剂或化合物库中获得。这类库或者包括纯的试剂的集合或者包括试剂混合物的集合。纯的试剂的实例包括但限于蛋白质、多肽，肽、核酸、寡核苷酸、碳水化合物、脂、合成或半合成的化学物质和纯化的天然产品。试剂混合物的实例包括但不限于原核或真核细胞和组织提取物以及发酵液和细胞或组织培养的上清液等。对于试剂混合物，本发明的方法不仅被用来鉴定具有所需活性的混合物粗品，而且还提供了对混合物中有活性的试剂的纯化进行监测的手段，从而将其作为治疗药物进行表征和开发。特别地，对于经上述方法鉴定的混合物，本领域技术人员可通过公知的方法将其连续地分级分离，所述公知的方法包括但不限于沉淀、离心、过滤、超滤、选择性消化、萃取、色谱、电泳或复合物形成。可以利用最初的测定法对所得到的每个子部分的所需活性进行测定，直至得到纯的有生物活性的试剂。

库筛选可以按本文所示例的方法进行，或者也可以以能够实现快速制备和多反应处理的形式进行。待测试剂以及测定组分的储液是手工制备的，随后的移液、稀释、混合、洗涤、孵育、样品读数和数据收集都是通过市售的自动移样仪、自动工作站和用于对测定中产生的信号进行检测的分析仪来完成的。这些检测仪的实例包括但不限于发光计、分光光度计和荧光计以及测量放射性同位素衰变的仪器。

为了进一步评估使用本发明的筛选方法鉴定化合物或复合物的有效性，本领域技术人员应理解，可以使用与G蛋白相关的任何一种特定疾病或病症的一个模型系统对化合物或复合物的吸收、分布、代谢和排泄以及在急性、亚慢性和慢性研究中的潜在毒性进行评估。例如，在NG108-15/D2细胞和大鼠原代海马神经元中βγ抑制因子的过量表达可以通过阻止腺苷酸环化酶的βγ激活以阻断δ-阿片和大麻素受体诱导的PKA Cα的易位和基因表达(Yao，et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：14379-84)。因此，为了分析本发明中的化合物或复合物用于治疗成瘾性的效果，使NG108-15/D2细胞和/或大鼠原代海马神经元与所述化合物或复合物接触，并且测定其对PKA Cα的易位的作用。阻断δ-阿片和大麻素受体诱导的PKA Cα的易位的化合物或复合物可用于对成瘾性的治疗。

本发明中的化合物或复合物预防或治疗心力衰竭的效果可以通过鼠扩张性心肌病的遗传模型进行分析，所述遗传模型涉及切除编码肌肉LIM蛋白的肌肉限制性基因(MLP^-/-)(Arber，et al.(1997)Cell88：393-403)。应用这个模型已经证明，与βγ结合并阻断对β-肾上腺素能受体激酶1活性的βγ-依赖性激活的β-肾上腺素能受体激酶1抑制因子BARK-ct，可以在异丙肾上腺素存在与不存在的情况下增强心脏的收缩(Koch，et al.(1995)Science 268：1350-3)，并且恢复左心室的大小和功能(Rockman，et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.95：7000-7005)。与之类似，本发明中阻断β-肾上腺能素受体激酶1活性的βγ-依赖性激活的化合物或复合物可用于阻止或治疗心力衰竭。

本发明中的化合物或复合物预防阿片耐受的作用可以通过急性(Jiang，et al.(1995)J.Pharmacol.Exp.Ther.273：680-8)和慢性(Wells，etal.(2001)J.Pharmacol.Exp.Ther.297：597-605)依赖型模型系统进行分析，其中，将本发明中的化合物或复合物注射入小鼠的脑室内，并选择一类阿片样物质(例如吗啡)测定耐受性。能够减少为达到镇痛效果所需的阿片样物质的量的化合物或复合物可用于预防阿片样物质的耐受。

PLC-β2、PLC-β3和PI3Kγ已知参与化学引诱物介导的信号转导通路。PI3Kγ缺陷型小鼠失去了嗜中性粒细胞产生PtdIns(3，4，5)P₃、嗜中性粒细胞迁移和用T细胞-非依赖性抗原羟基硝基苯基-FICOLL^TM免疫产生含λ链的抗体的能力(Li，et al.(2000)Science287：1046-1049)。缺少PLC-β2和PLC-β3的小鼠的嗜中性粒细胞中Ca²⁺释放、超氧化物的产生和MAC-1的上调的功能受损(Li，et al.(2000)见上文)。而且，PLC-β2缺陷型小鼠表现出不同类型的白细胞群的趋化性增强，并对细菌、病毒和免疫复合物敏感(Jiang，et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(15)：7971-5)。因此，为了分析本发明中的化合物或复合物对炎症反应的调节作用，可给予小鼠所述化合物或复合物，并测定其对嗜中性粒细胞产生PtdIns(3，4，5)P₃、嗜中性粒细胞迁移、Ca²⁺释放、超氧化物的产生和用T细胞-非依赖性抗原羟基硝基苯基-FICOLL^TM免疫产生含λ链的抗体等能力的作用。选择性加强PLC-β2和PLC-β3和/或阻断PI3Kγ激活，从而抑制PtdIns(3，4，5)P₃的产生、嗜中性粒细胞迁移和TI-Igλ_L的产生的化合物或复合物，可用于治疗炎性病症，例如关节炎、变态反应、克罗恩病等。选择性阻断例如PLC-β2激活从而有利于嗜中性粒细胞迁移的化合物或复合物可用于促进对细菌和病毒感染的免疫反应。

使用本发明的筛选方法已经鉴定了各种化合物或复合物，所述化合物或复合物与Gβ亚基的蛋白质相互作用位点相结合以干扰或加强生理学相关的蛋白质相互作用(例如，Gα亚基相互作用和PLCβ相互作用)，从而调节G蛋白信号传导通路的活性。

因此，本发明的一个实施方案是为具有式I结构的化合物：

式I

具有式I结构且示出了各种取代基R基团的示例性化合物包括但不限于如下所示化合物及其可药用盐和复合物。

本发明的另一个实施方案为具有式II结构的化合物：

式II

具有式I结构且示出了各种取代基R基团的示例性化合物包括但不限于如下所示化合物及其可药用盐和复合物。

与Gβ的蛋白质相互作用位点结合的其他示例性化合物包括但不局限于如下化合物及其可药用盐和复合物。

本文公开的示例性化合物旨在包括所有对映异构体、异构体或互变异构体，也包括这些化合物的保留了原化合物生物活性的衍生物。

本发明的示例性化合物首先选自计算机筛选结果，从而鉴定与新的Gβ的蛋白质相互作用位点结合的配体。计算机筛选包括用SYBYL分子模拟软件，按本文公开的X-射线结构中确定的位点结构，模拟Gβ的蛋白质相互作用位点。计算机对接筛选采用的是美国国家癌症研究所的1900化合物库，其中所述化合物对Gβ的蛋白质相互作用位点的对接试验用FLEXX^TM(Tripos，Inc.，St.Louis，MO)进行对接，用CSCORE^TM(Tripos，Inc.)来评估对接结构的能量和适合程度。产生依赖算法的化合物列表和相互作用的结构模型，所述化合物被预测与Gβ的蛋白质相互作用位点相互作用。用本文公开的噬菌体ELISA结合测定法对选定的化合物进行接下来的分析，以确定这些化合物是否能结合Gβ的蛋白质相互作用位点并干扰该表面的蛋白质相互作用。化合物NSC201400和NSC119916的IC₅₀值分别是100nM和5μM，其他化合物在基于ELISA的检测中被发现与Gβγ结合的亲和性至少为50μM，并会干扰肽在蛋白质相互作用位点的相互作用(图1)。在噬菌体ELISA测定中对这些化合物进行进一步分析，发现这些化合物对Gβ的蛋白质相互作用位点有较高的亲和性，并且与它们相互作用的氨基酸残基和与SIGK相互作用的氨基酸残基相似。

表2

带下划线的残基表示在SIGK·Gβ₁γ₂相互作用中的重要残基。最后一行表示每种化合物的IC₅₀值。

为了进一步说明这些化合物的应用，已经证明NSC119910可阻断Gα亚基和Gβγ亚基间的相互作用(图2)并抑制Gβγ亚基抑制与生理学靶标的相互作用的能力，例如基于减小PLCβ的酶活性来抑制体外实验中与PLCβ的相互作用(图3)。

Gβγ调控的PI3Kγ和PLC-β2/PLC-β3的活性对化学诱导物产生的反应和炎症是重要的。PI3Kγ参与TI-Igλ_L的产生，对于PI3Kγ缺陷型小鼠，它缺乏中性粒细胞迁移(Li，et al.(2000)Science 287：1046-9)。PLC通路参与趋化作用的下调和高炎症反应病症(Li，et al.(2000)见上文)。因此就NSC119910是否抑制Gβγ/PLC相互作用并阻断PLC激活进行了测定。基于fura-2的实验数据表明，由于细胞内贮存的阳离子的释放，而产生的fMLP-刺激的嗜中性粒细胞的胞质Ca²⁺浓度会突然升高这一反应(Anderson，and Mahomed(1997)Clin.Exp.Immunol.110：132-138；Geiszt，et al.(1997)J.Biol.Chem.272：26471-26478)被10μM的NSC119910抑制(图4)。在NSC119910存在时，借助于ATP的[Ca²⁺]升高没有被显著地抑制(图4)，这表明该化合物对依赖fMLP的Ca²⁺浓度升高的作用是特异的。而且，荧光降到峰值的一半所用的时间没有被显著地影响(图5)。这些结果表明NSC119910能够在体内抑制可导致PLC激活的PLC/G-蛋白质相互作用。

阿片受体μ、Δ和κ通过α和βγ亚基与G_i和G₀蛋白偶联，并调控多个信号传导通路。具体而言，在PLC-β3缺陷型小鼠中已显示出阿片信号转导的作用增加，这表明PLC通过改变阿片依赖性的信号传导组分抑制阿片信号传导(Xie，et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：10385-10390)。假设PLC-β3在阿片反应中是作为负调控因子起着重要作用，可就NSC119910是否会抑制PLC-β3的激活并由此增强吗啡诱导的镇痛作用进行测定。按照标准实验方案(Xu，et al.(1998)J.Pharmacol.Exp.Therapeut.284：196-201)在小鼠的脑室内注射100nmol的NSC119910和不同剂量(0.1、0.3、1和3nmol)的吗啡。注射后20分钟在55℃热水甩闪尾试验中测试小鼠的镇痛反应(Wells，et al.(2001)J.Pharmacol.Exp.Therapeut.297：597-605)。仅注射吗啡的组的ED₅₀值为0.74nmol，而NSC119910+吗啡的组的ED₅₀为0.065nmol。两个ED₅₀值的差异显示出吗啡的剂量-反应曲线向左偏移11倍(表3)，这表明当联合给予NSC119910和吗啡时，仅需要较少量的吗啡就可以达到相似的镇痛效果。因此，联合给予阿片样物质和本发明的化合物可降低患者的阿片使用剂量，从而减少阿片样物质耐受的产生。

表3

已经证明NSC119910能有效地调节G-蛋白质相互作用，一系列用模拟软件鉴定的NSC119910结构类似物被用来分析与Gβ的蛋白质相互作用位点的结合。这些类似物及其与Gβγ的对应的亲和性是：

通过该分析鉴定了NSC119910类似物的通式结构，如式III所示。

式III

其中，R₁可以是取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的环烷基或取代的或未取代的环烯基；R₂和R₃独立地为氢或羟基。在某些具体的实施方案中，R₂和R₃均为羟基。

本文使用的烷基是指仅由碳和氢原子组成的、完全饱和的、具有1个到8个碳原子的直链和有支链的烃链，

烯基意在指包括至少一个碳-碳双键、具有2至约10个碳原子的直链或有支链的脂肪族烃基团。

环烷基表示大约3至12个碳原子的非芳香族单环或多环系统。

本文所使用的术语环烯基是指含大约3至12个碳原子并具有至少一个碳-碳双键的单环或多环系统，。

取代的烷基、环烷基、烯基或环烯基的取代基包括但不限于羟基、羧基、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)或者取代的或未取代的烷基。除了NSC157411和NSC122390之外，NSC119910的类似物一般在式III的R₂和R₃位上含有羟基，这似乎有助于结合；并且在式III的R₁上含有羧基取代的烷基、环烷基、烯基或环烯基取代基，它们似乎可调节活性、但非结合所需。

因此，本发明的又一个实施方案为具有式III结构的化合物及其可药用盐和复合物。

对NSC119910的类似物选择性调节PLC-β2和PLC-β3激活的能力进行了分析。在该分析中，PLC-β2和PLC-β3被纯化并且在存在或不存在βγ以及存在或不存在类似物的情况下，分别测定了PLC的酶活性。该分析的结果表明NSC119911似乎对PLC-β2激活的阻断比对PLC-β3激活的阻断更有效，NSC201400虽然阻断肽和βγ的结合但选择性增强了PLC-β3的激活(图6)。而且，虽然NSC119910、NSC和类似物NSC119893阻断Ca²⁺的流动，但是它们在其间并不干扰fMLP-依赖性ERK的激活。类似地，NSC119911、NSC158110和NSC201400也不干扰fMLP-依赖性ERK的激活。

本文公开的化合物和那些被发现与Gβ的蛋白质相互作用位点结合并干扰该表面上的蛋白质相互作用的化合物可以被应用在调节(即阻断或抑制，或者增强或促进)G蛋白的至少一种活性的方法中。所述方法包括在体外和体内使G蛋白与有效量的一种试剂相接触，所述试剂与G蛋白β亚基的蛋白质相互作用位点的至少一个氨基酸残基相互作用的，从而调节G蛋白的至少一种活性。试剂的有效量是指该量使G蛋白的活性降低或升高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。该活性的监测可以基于蛋白质-蛋白质相互作用或检测下游蛋白质活性的酶测定进行。

本领域技术人员应理解，对G蛋白的一种或多种活性的调节可用于在模型系统中选择性地分析G蛋白信号传导事件以及预防或治疗与G蛋白βγ亚基信号传导有关的疾病或病症。对预防或治疗特定疾病或病症的化合物的选择，将取决于与该疾病或病症的依赖G蛋白的特定的下游蛋白。例如，与Gβ的Lys57、Trp99、Met101、Leu117、Asp186、Asp228、Asp246和/或Trp332相互作用的化合物可用于预防或治疗腺苷酸环化酶相关的疾病和病症，而与Lys57、Tyr59、Trp99、Met101、Leu117、Tyr146、Met188、Asp246和/或Trp332相互作用的化合物对GRK2-相关疾病或病症可能会更适合。考虑到了这种对特定下游蛋白的选择性可能会减少那些对G蛋白βγ亚基信号传导相关的全部活性均抑制的拮抗物带来的副作用。

预防或治疗通常包括如下步骤：首先是识别出患有G蛋白βγ亚基的至少一种活性相关的疾病或病症(例如，充血性心力衰竭、成瘾性、高炎症反应或低炎症反应或者阿片耐受)的患者或具有该患病风险的患者。利用例如标准临床实践方法确定这类个体后，向所述个体给予药物组合物，所述药物组合物含有有效量的本文公开的或者利用本发明的筛选方法鉴定的选择性化合物。大部分情况下的治疗针对的是人，但是在表述上并不排除用于对农畜例如家畜和家禽，和宠物例如狗、猫或马的治疗。对化合物的剂量和有效量的选择是根据这样一种所需结果进行的，所述结果为患者中与G蛋白βγ亚基信号传导有关的疾病或病症的至少一种指征或症状得到减轻或逆转。例如，与充血性心力衰竭相关的某些一般性指征或症状包括心率加快、呼吸频率增加、呼吸比普通人快且深、呼吸急促喘息、易怒、烦躁、无端发怒、肿胀、浮肿、水肿、体重突然增加或缓慢增加、食欲减弱、出汗、咳嗽、淤血或喘鸣、活动水平降低、疲劳、倦怠、排尿减少或者肤色苍白、起斑或发暗。与成瘾性相关的一般性指征和症状包括但不限于无论是在家、学校或单位对他人的态度、表现和关系的改变和其他行为的改变。

在预防或治疗炎症时，选择性地调节PLC通路或PI3Kγ会对不同的炎症的治疗有帮助。例如，为了减少嗜中性粒细胞向炎症(例如关节炎)位点的迁移，需要给予一种化合物，所述化合物选择性地抑制PI3Kγ激活并从而减少有助于炎症疾病病理生理学过程的组织损伤。相反，为了促进炎症应答，例如为了增强对细菌或病毒感染的免疫应答，需要给予选择性抑制PLC通路激活的化合物。

药物组合物可以是可药用盐或复合物的形式，并可以以在可药用载体中使用适当的剂量并的形式提供。这些药物组合物可以通过本领域熟知的方法和包含载体制得。关于这些方法和配料的一份公认的总览是Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Alfonso R.Gennaro，editor，20th ed.Lippincott Williams & Wilkins：Philadelphia，PA，2000。可药用载体、组分或运载剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包囊材料，参与将测试化合物从身体的一个器官或部分运送或转运至身体的另一个器官或部分。每种载体都必须在可与制剂中的其他成分配伍并且对患者无害这些方面是可接受的。

可以用作可药用的载体的物质的实例包括糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油类，例如花生油、棉子油、红花油、麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐水；格林氏液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；和制剂中使用的其他无毒可配伍物质。组合物中还可以存在湿润剂、乳化剂和润滑剂，例如月桂硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、包衣材料、甜味剂、调味剂和增香剂、防腐剂和抗氧化剂。

根据标准的医学实践，本发明的组合物可以采用胃肠外给药(例如，静脉、腹腔内、皮下或肌肉注射)、局部给药(包括含服和舌下)、口服、鼻内、阴道内或直肠内等方式给药。

剂量水平的选择取决于各种因素，包括所使用的本发明的具体化合物的活性、给药途径、给药时间、使用的具体化合物的排泄或代谢速率、治疗时间、与所述使用的具体化合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状态、总体健康状况和过往医疗史，以及医学领域中已知的类似因素。

具有本领域普通专业技能的医生或兽医能够很容易地确定所需的药物组合物的有效量，并给出处方。例如，医生或兽医可以从化合物的剂量水平低于达到理想效果所需的剂量水平开始，然后逐步增加剂量直至达到理想的效果。这被认为是在本领域普通技术人员必备的能力范围之内的，他们可以查阅关于具体化合物或类似化合物的已有文献确定最佳剂量。

本领域技术人员应理解，通过阅读本文公开的内容，根据本文中教导的筛选方法可以很常规地对本文示例之外的其他化合物进行鉴定。基于计算预测和/或基于它们包含式I、II或III的结构或与本文公开的示例化合物相类似的结构，本领域技术人员可选出用于筛选的其他的化合物。

通过下面的非限制性的实施例来更详细地描述本发明。

实施例1：材料

肽购买自Alpha Diagnostic International(San Antonio，TX)或-Genosys(St.Louis，MO)，进行HPLC纯化到90％以上，并通过质谱测定分子量。Ni-NTA琼脂糖购买自

(Valencia，CA)。抗生物素蛋白链霉素包被的聚苯乙烯珠粒购买自Spherotec(Libertyville，IL)。HRP缀合的抗M13抗体购买自AmershamBiosciences(Piscataway，NJ)。HRP缀合的中性链亲和素(neutravidin)购买自Pierce(Rockford，IL)。除非另外指明，所有的分子生物学试剂均购买自INVITROGEN ^TM(Carlsbad，CA)。

实施例2：Gβ₁γ₂和SIGK肽的表达和纯化

携带野生型牛Gβ₁cDNA和N-末端(His)₆-标记的牛Gγ₂cDNA的杆状病毒被用来产生相应的蛋白质。用高滴度的Gβ₁和Gγ₂的杆状病毒感染High-5细胞(INVITROGEN^TM，Carlsbad，CA；2×10⁶个细胞/mL)。用经改动的标准方法(Kozaza and Gilman(1995)J.Biol.Chem.270：1734-41)纯化Gβ₁γ₂。所有步骤均在4℃下完成。在感染后的60个小时以2600g离心收获细胞，然后按照每升细胞培养物50mL裂解缓冲液(20mM HEPES，pH8，150mM NaCl，5mM β-ME，1mMEDTA，1mL

蛋白酶抑制剂混合物P-2714)的比例将细胞重悬。用声裂法裂解细胞以2600g离心以沉淀膜。将膜捣碎从而在100mL裂解缓冲液中重悬并匀浆。加入1％的芦布若尔(C12E10，

St.Louis，MO)并搅拌使膜溶解，得到的溶液以125,000g超速离心使之澄清。将上清液上样到Ni-NTA琼脂糖(，Valencia，CA)柱上，用裂解缓冲液+1％的芦布若尔平衡。冲柱，并且利用Ni-A(20mM HEPES，pH8，0.4M NaCl，5mM β-ME，0.5％芦布若尔，0.15％胆酸盐)和Ni-B(20mM HEPES pH8，0.1M NaCl，5mM β-ME，0.25％芦布若尔，0.3％胆酸盐)缓冲液以胆酸钠置换芦布若尔。用Ni-C(20mM HEPES pH8，0.01M NaCl，5mM β-ME，1％胆酸盐，200mM咪唑)洗脱Gβ₁γ₂。将洗脱液加样到预先用QA(20mM HEPES，pH8，5mM β-ME，0.7％CHAPS，1mM EDTA)平衡过的HITRAP^TMQ(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)柱上，。用梯度的QB(QA+1.0M NaCl)洗脱Gβ₁γ₂。含有Gβ₁γ₂的部分用SDS-PAGE分析并汇集。用串联的

200柱(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)进行凝胶过滤，柱子预先用GF+CHAPS(20mM HEPES，pH8，150mM NaCl，10mM β-ME，1mM EDTA，0.7％CHAPS)缓冲液平衡。纯化产率通常为每升细胞培养物1mg的Gβ₁γ₂。

使用成熟的方法合成SIGK肽(Ser-Ile-Gly-Lys-Ala-Phe-Lys-Ile-Leu-Gly-Tyr-Pro-Asp-Tyr-Asp；SEQ ID NO：2)。肽的末端没有经过修饰；在

C4半制备柱上通过反相HPLC色谱法进行纯化。

实施例3：晶体学

将过量1.5摩尔的肽SIGK加入到Gβ₁γ₂中，用于结晶的Gβ₁γ₂·SIGK复合体的浓度是7mg/mL。利用等体积(2μL)的蛋白质和结晶溶液(15-17％PEG 4000，100mM HEPES，pH7.5，0.01-0.05M醋酸钠，10％甘油)，通过在20℃下进行蒸气扩散培养晶体。晶体的直径在一周以内达到150μm×50μm×20μm。晶体用15％甘油进行冷冻防护后在液氮中冷冻。

Gβ₁γ₂·SIGK的天然结晶用先进光源(Advanced Light Source，ALS)光束线8.2.1和8.2.2(Berkeley，CA)和先进光子源(AdvancedPhoton Source，APS)光子束线BM-19(Chicago，IL)进行筛选。从ALS 8.2.2获得的数据集用来确定结构。筛选了100个以上的晶体，用于确定结构的衍射限制在7

至2.7

的数据集。用HKL2000软件包(Otwinowski and Minor(1997)In：Methods in Enzymology，Vol.276：307-326)对衍射数据建立索引、整合和标度(表4)。晶体的空间群为P2₁2₁2₁。

表4

该终模型中包括Gβ₁的340个残基中的2-340号残基，Gγ₂的68个残基中的7-52号，SIGK的15个残基中的1-13号和37个水分子。

¹括号中数字表示最高分辨率骨架，2.8-2.7

²R_sym＝∑_h∑_i|I_i(h)-<I(h)>|/∑_h∑_iI_i(h)，其中I_i(h)和<I(h)>分别为第i个和反射h强度的平均测量值。

³该终模型中包括Gβ₁的340个残基中的2-340号残基、Gγ₂的68个残基中的7-52号和SIGK的15个残基中的1-13号。

⁴R_work＝∑_h‖F_o(h)|-|F_c(h)‖/∑_h|F_o(h)|，其中F_o(h)和F_c(h)分别为结构因子的观测值和计算值。在最后计算R-因子的时候没有用I/σ的阈值。

⁵R_free是从由随机选择的8％的数据组成的反射测试集获得的R-因子。

⁶位于N-端的B-因子大于80

，包括Gβ₁的2-41残基和Gγ₂的7-13残基。

利用程序PHASER(Storoni，et al.(2004)Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.60：432-8；Read(2001)Acta Crystallogr. D Biol.Crystallogr.57：1373-82)，通过分子置换方法解析Gβ₁γ₂·SIGK复合体的结构。Gβ₁γ₂·GRK2复合体(10MW，100％的序列一致性)中的Gβ₁γ₂的等价物被用作搜索模型。利用CNS 1.1版本(Adams，et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：5018-23；Brunger，et al.(1998)ActaCrystallographica Section D 54：905-921)中的最大似然法使目标最小化进行晶体的主体精修以后，使用模拟退火、Powell最小化和B因子精修联合对模型进行进一步的修正。经过相位修正获得的含σA-权的2Fo-Fc电子密度图显示出SIGK肽的十个残基的清晰的主链密度，并且几个SIGK肽的残基的侧链密度也可辨认。后续的模型构建用O(Jones，et al.(1991)Acta Crystallographica Section A 47：110-119)完成，接着用CNS进行模拟退火、Powell最小化和B因子精修。PROCHECK(Laskowski，et a1.(1993)J.Appl.Crystallography26：283-291)分析表明所有残基表现为主链构象大部分倾向于或额外允许

ψ空间的区域(表4)。各结构间的表面可及性、Gβ₁γ₂·SIGK接触和RMSD的计算是用CNS组件中的程序实现的。

实施例4：生物素化的Gβ₁γ₂(b-βγ)和b-βγ突变体的构建和部分纯化

野生型Gβ₁和Gβ₁突变体由在Gβ₁的氨基末端上游的赖氨酸处编码生物素化位点的杆状病毒载体PDW464产生(Goubaeva，et al.(2003)见上文)。突变体通过标准实验方案的重叠延伸PCR产生。野生型和突变型的Gβ₁的构建体由具有20个氨基酸的生物素受体肽(BAP)序列构成，所述序列与大鼠Gβ₁亚基上的氨基端内嵌融合。当在Sf9细胞中共表达生物素全酶合成酶(BirA)时，在体内Gβ₁亚基的BAP中的特异赖氨酸受体残基以共价的形式生物素化。利用这个方法，每升Sf9昆虫细胞中可以获得纯化的蛋白质中的1-2mg蛋白质。因为噬菌体ELISA测定中使用的蛋白质量为45ng，一次纯化的蛋白质就足以进行10,000至30,000次结合测定。

按照生产商的使用说明书(GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD)，通过BAC-TO-系统产生杆状病毒。用0.5mL的编码(His)₆-Gα_i1的杆状病毒、4mL的Gγ₂病毒和4mL的野生型或突变的Gβ₁病毒三次感染Sf9细胞(200mL)。用所述的经改动的成熟方法(Kozasa andGilman(1995)见上文)在感染后的60小时纯化Gβ₁γ₂二聚体。细胞沉淀物在4mL的裂解缓冲液(50mL HEPES，pH8.0、3mM MgCl₂、10mM β-巯基乙醇、1mM EDTA、100mM NaCl、10pM GDP和蛋白酶抑制剂)中经过三个液氮冻融循环过程裂解。用1％的胆酸钠溶解膜，经过20分钟的100,000g超速离心使之澄清，将其稀释到含0.5％的芦布若尔的缓冲液中，与Ni-NTA树脂混合。经过充分冲洗后，在室温下将珠粒与含有的50mM MgCl₂、10mM NaF、10μM AlCl₃、1％胆酸盐和5mM咪唑的缓冲液混合从而使Gβ₁γ₂亚基从其结合的Gα_i1上洗脱，洗脱持续1小时。b-βγ和b-βγ突变体的浓度用比较免疫印迹法和化学发光法分析。用SDS-PAGE分离蛋白质将其转移至硝酸纤维素膜，并用HRP-中性链亲和素(Pierce，Rockf ord，IL)检测。化学发光信号用EPI-CHEM II^TM暗房系统(UVP Bioimaging Systems，Upland，CA)测量。洗脱的b-βγ二聚体的浓度通过与至少经过两次凝胶分离而完全纯化的100％生物素化的Gβ₁γ₂的标准曲线相比较测得。

实施例5：b-βγ结合测定

根据标准方法进行噬菌体ELISA测定以评估肽与野生型和突变型的b-βγ的结合(Smrcka and Scott(2002)Methods Enzymol.344：557-76)。简述如下，将1μg的抗生物素蛋白链霉素固定在96-孔板上，4℃过夜。用100μL含有2％牛血清白蛋白(BSA)的Tris缓冲生理盐水(TBS)在4℃下1小时对各孔进行封闭，然后用1×TBS/0.5％TWEEN

洗涤三次。每个孔中加入40μL含25nM bGβ₁γ₂的TBS/0.5％

并在4℃下孵育1.5小时。洗涤各孔，然后加入1×10⁶至1×10¹⁰个噬菌体颗粒，4℃下孵育3个小时。然后用TBS/0.5％

洗涤各孔六次后，加入40μL的1∶5000稀释度的抗-M13的抗体(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，并在室温下孵育1个小时。洗涤各孔后，加入40μL2，2′-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)并在405nm的波长下进行比色反应的监测。在每次读数时减去非特异性结合。

从部分纯化的b-βγ亚基得到信号与从完全纯化的b-βγ亚基得到的信号类似。对Gα_i1·Gβ₁γ₂结合的阻断效应的评估是在存在或不存在SIGK的条件下，同时向50pM固定化的b-βγ中加入200pM的FITC-Gα_i并根据标准方法(Ghosh，et al.(2003)见上文；Sarvazyan，etal.(1998)J.Biol.Chem.273：7934-40)，用流式细胞术测定结合到珠粒上的FITC-Gα_i的量。

实施例6：Gβ₁γ₂·SIGK复合体的结构

除非特别说明，以“s”为首字母的氨基酸残基都表示SIGK残基。

Gβ₁是一个β-螺旋桨结构，包括7个4股β折叠(“桨叶片”)和N-端的一个与Gγ₂有广泛相互作用的伸展的螺旋。每个折叠都包含通过各种长度的环相连的WD-40重复单元。Gβ₁的2-340号残基被包括在模型之中。贯穿于Gβ₁的核心的B因子小于40。B因子＞60的残基存在于三个环区：二号片中的Lys127-Ser136、四号片中的Arg214-Met217和连接六号片和七号片的环中的Ser265-Ile269。Gγ₂形成一个螺旋，包括Asn24-Lys29残基形成的一个扭结和起始于His44残基的螺管结构。Gγ₂分子内部的平均B因子为44

。对于Gγ₂的N-端7个残基和C-端16个残基或Gγ₂的C-端的异戊二烯基脂质修饰都没有观察到电子密度。

SIGK形成了一个被10号位置上的甘氨酸中断的α螺旋结构。C-端的三个残基形成一个伸展的结构从Gβ₁分子中伸展出来，该伸展结构被sPro12和sAsp13与对称相关的Gβ₁分子中的Thr47和Lys337的晶体接触所支持。SIGK的N-(sSer1、sIle2)和C-端(sGly10-sAsp13)残基的B因子大于50

，其他所有残基的B因子在30-50

之间。残基1-13的主链原子的电子密度界限清楚；不与Gβ₁相接触的三个SIGK的侧链(sIle2、sLys7和sAsp13)的电子云密度混乱。该肽跨过Gβ₁的“顶”面进行结合，并被掩盖于970

的总的溶剂可及的表面区域中。该肽不与Gγ₂亚基相接触，而Gγ₂亚基是与Gβ₁隆凸的“底”表面相结合的。

与SIGK接触的Gβ₁表面分为两个区域：一个Gβ₁上与该肽的N-端相互作用的酸性区域和一个与该肽的C-端相互作用较大的非极性区域。总之，借助于β-螺旋桨的7个桨叶片中的6个片，13个Gβ₁残基直接与SIGK相接触(表5)。

表5

N-端的结合表面位于静电相互作用的中心，其中sLys4投射到Gβ₁γ₂上的一个负电荷结合口袋并与Asp228、Asn230和Asp246形成氢键或电荷的相互作用。Asp228的羰基氧和Asp246的主链氮之间的氢键稳定了Gβ₁上的3个酸性残基。Met188参与了与sLys4烷基链的范德华力相互作用，Asp186与sSer1的羰基氧形成极性的接触，它还与Cys204的酰胺形成氢键。另外，Tyr145与sSer1的主链氧、sLys4侧链以及sAla5的Cβ原子形成范德华力的相互作用，并与Gly162的邻近酰胺形成氢键。Leu117的侧链位于与sIle2和sAla5的侧链以范德华力接触的距离之内。总之，所述9个Gβ₁残基形成一个通过带电荷的和非极性的相互作用使SIGK与Gβ₁结合的表面。

SIRK和SIGK肽的突变分析结果，现在可以在SIGK·Gβ₁γ₂结构环境中得到解释(Scott，et al.(2001)见上文；Goubaeva，et al：(2003)见上文)。野生型SIRK肽抑制Gβ₁γ₂对PLCβ2的激活，IC₅₀为5μM。以丙氨酸替代SIRK肽中的sLys4肽使得IC₅₀降低12倍，将sAla5突变成甘氨酸使得IC₅₀降低13倍。将sIle2突变成丙氨酸使得肽的IC₅₀降低4倍，将sSer1突变成丙氨酸对IC₅₀没有影响(Scott，et al.(2001)见上文)。SIGK·Gβ₁γ₂的结构表明，sSer1的主链和sIle2、sLys4和sAla5的侧链与Gβ的多个残基相接触，从而可以对这些突变数据进行解释。

为了测定Gβ₁γ₂·SIGK界面上观察到的Gβ₁的残基对复合体的结合能的贡献，使用了两种方法。第一种方法用ELISA测定法测量固定化的Gβ₁γ₂亚基与展示SIGK序列的噬菌体结合(表6)。然后使ELISA结合数据与SIGK作为Gβ₁γ₂与Gα_i1相结合的竞争因子的IC₅₀值相关联(表7)。然后用包含Gβ₁亚基突变的Gβ₁γ₂异源二聚体进行两个测定。在N-端结合表面上，的Gβ₁的Asn230突变成丙氨酸使得Gβ₁γ₂对肽的亲和性减小10倍(表6)。Gβ₁残基Asp186、Met188、Tyr145和Leu117单一突变成丙氨酸也导致Gβ₁γ₂二聚体对SIGK的亲和性显著地降低(表6)。Asp228或Asp246被置换为丙氨酸的Gβ₁突变体无法与Gγ₂形成二聚体因此不作分析。然而，Asp228被置换为丝氨酸，则仅使对SIGK的亲和性稍有降低(表6)。因此，形成N-端SIGK结合界面的许多Gβ₁残基对结合能的贡献都很大。

表6

Gβ1Y2突变	％野生型信号(平均值±SD)
		Lys57Ala	18.6±4.6
Tyr59Ala	24.7±15.2
		His62Ala	111.2±11.3
Trp99Ala	66.0±7.7
		Met101Ala	32.2±15.5
Leu117Ala	2.1±2.4
		Tyr145Ala	0.8±0.9
Asp186Ala	13.0±13.1
		Met188Ala	2.5±3.7
Asn230Ala	22.4±4.2
		Asp246Ser	66.5±7.5
Phe292Ala	109.1±21.4
		His311Ala	94.3±18.9
Arg314Ala	50.2±5.0
		Trp332Ala	7.1±3.7

与SIGK肽结合的氨基酸被逐个地突变成丙氨酸(或者Asp246突变成丝氨酸)，用噬菌体ELISA测定与肽的结合。将固定化的b-βγ与展示SIGK肽的噬菌体共孵育。用α-噬菌体抗体检测噬菌体的结合；原始数据为405nm下的吸光度。所示数据是三次独立实验的三次重复测量数据的平均±SD。

表7

存在代表性的Gβ₁亚基突变体的条件下，SIGK参与FITC-Gα_i1β₁γ₂相互作用中的竞争。SIGK和FITC-Gα_i1同时加入附有野生型或突变的b-βγ蛋白的链亲合素的珠子中，结合到珠子上的FITC-Gα_i1的量用流式细胞仪检测。表中数据是三次检测的平均值+/-代表性实验的标准差。两次(Met188A)或三次(野生型、Arg314A、Trp332A)重复实验的结果相似。对所选择的具有较宽范围内的各SIGK结合亲和力的突变体进行两次测定，对两次测定进行的比较表明了失去50％的亲和性的同时IC₅₀提高5倍、失去75％的亲和性的同时IC₅₀提高10倍、失去90％的亲和性的同时IC₅₀有20倍的改变、失去98％的亲和性的同时IC₅₀有50倍的改变。IC₅₀值如下：野生型＝0.47μM、Arg314A＝1.5μM、Trp332A＝9μM和Met188A＝22μM。

结合的第二区域涉及SIGK的C-端的大部分残基(sAla5-sGly11)，这些残基填充Gβ₁的一个较大的疏水性的口袋。这个口袋长11

，从七号片的Trp332到二号片的Met188。Gβ₁的8个残基直接与SIGK的C-端表面接触，并且还有两个Gβ₁的残基协助这些残基直接参与与SIGK的相互作用。与N-端界面的sLys4相互作用的Met188，也在sLeu8的侧链的接触的距离内。SIGK的sAla5、sLeu8和sLeu9残基通过范德华力相互作用力与Lys57的烷基、Leu117、Met101、Trp99和Tyr59相互作用。Val100的主链上的氧与sLeu9侧链相作用。Trp99的吲哚亚胺与sTyr11的羟基之间形成氢键，Trp332的侧链与sIle8的主链氧和sGly10的Cα相接触。Lys57和Arg314的侧链位于Trp332的任一面并协助其结合位点的定向。Arg314与Trp332形成氢键，Lys57与Gln75上的氮原子形成氢键，进一步稳定Gβ₁上的相互作用面。该肽的丙氨酸扫描数据(Scott，et al.(2001)见上文；Goubaeva，et al.(2003)见上文)验证了这些结构上的观测结果。将sIle8、sLeu9或sGly10突变成丙氨酸使得抑制PLC激活的IC₅₀值分别增加40倍(从5μM到200μM)、60倍和12倍(Scott，et al.(2001)见上文)。sLeu9的同样的突变也阻断RASM细胞中SIRK增强ERK1/2磷酸化的能力(Goubaeva，et al.(2003)见上文)。

构成SIGK的C-端结合表面的Gβ₁的氨基酸的突变削弱了对SIGK肽的亲和力，尽管程度各不相同。Leu117、Met188或Trp332突变成丙氨酸几乎完全消除了SIGK的结合；Lys57、Tyr59、Met101和Arg314的突变的效果要弱(表6和表8)。Trp99的突变导致亲和力降低4倍。这里给出的所有Gβ₁突变(即变成丙氨酸)以及其对SIGK结合亲和力的影响的小结在表8中列出。

表8

考虑到N-端和C-端SIGK结合界面的所有数据，发现所测SIGK肽的15个残基中的7个残基和12个Gβ残基中的10个残基对界面的结合能的贡献显著，与结构模型十分一致。

Gβ₁在Gβ₁γ₂·SIGK复合体上的结合表面在SIGK结合后没有显著变化。Gβ₁γ₂·SIGK复合体和没有形成复合体的Gβ₁γ₂异源二聚体(1TBG(Sondek，et al.(1996)Nature 379：369-74)；Val40-Asn340，仅Cα)的Gβ₁的核心残基之间的RMSD为0.88

然而，Trp99、Tyr59、Asp228、Leu117和Met101的侧链可以为配合SIGK而旋转，从而使这些残基中的原子产生的相对于其在未形成复合体的Gβ₁中的位置的最大移位分别为4.03.6

2.9 

2.8 和2.3 

SIGK结合表面上的残基的B因子接近于复合体的整体B因子的平均值。然而，与SIGK结合以后Trp99的B因子值降低2倍，通过比较两个结构的标准化的B因子即可表明这一点。在该分析中，SIGK的结合不会使Gβ为了调整各种转变而产生大的构象变化或紊乱。SIGK·Gβ₁γ₂复合体可以和另外5种有蛋白质靶标的Gβ₁γ₂复合体比较：Gβ₁γ₂·Gα_i1异源三聚体(1GG2)(Wall，et al.(1995)见上文；Wall，et al.(1998)见上文)和Gβ₁γ₁·Gα_t/i异源三聚体(1GOT)(Lambright，et al.(1996)见上文)、Gβ₁γ₁·磷转导蛋白复合体(1AOR和2TRC)(Loew，et al.(1998)见上文；Gaudet，et al.(1996)见上文)和Gβ₁γ₂·GRK2复合体(1OMV)(Lodowski，et al.(2003)见上文)。由具有每种上述结构的Gβ₁γ₂·SIGK复合体的叠加得到Gβ₁的残基40-340的平均RMS偏差小于1.0

(仅Cα)。除了Gβ₁γ₁·磷转导蛋白复合体中的几个残基以外，Gβγ异源二聚体不会为了结合蛋白质靶标而进行显著的结构重排，它在Gβ₁γ₂·SIGK结构中的情况也是一样。

实施例7：通过流式细胞术测定α-βγ相互作用

根据标准方法(Sarvazyan，et al.(1998)见上文)制备荧光素标记的Gα_i1(Fα_i1)。被用来测定肽对Gα-Gβγ相互作用的影响的测定方法包括竞争测定和解离测定(Ghosh，et al.(2003)见上文)。简述如下，对于基于竞争的测定，将100pM的Fα_i1和标明浓度的肽加到固定在每毫升10⁵珠粒上的50pM的b-Gβ₁γ₂中，在室温下孵育30分钟以达到平衡。然后，珠子结合的荧光用BD Biosciences FACSCALIBUR^TM流式细胞仪记录。用Graph Pad Prism 4对数据做背景荧光校正并与S形的剂量响应曲线拟合。为了测量Fα_i1从b-Gβ₁γ₂上的解离，将100pM的Fα_i1在室温下与50pM固定化的b-Gβ₁γ₂孵育15-20分钟。结合的Fα_i1亚基的荧光被测量，然后加入过量200倍的没有被标记的Gα_i1或肽，在既定的时间测量仍然结合在珠粒上的Fα_i1的量。

实施例8：蛋白质相互作用位点的分子识别

已经证明与SIGK肽结合的界面分成两大类相互作用；一个与该肽的疏水核心(氨基酸8-10，Ile-Leu-Gly)相接触，C-末端结合界面和一个与该肽的N-末端(主要是Lys4)相连的N-末端界面，由此确定了识别该肽的分子基础。因此，Gβ₁的公共结合表面的氨基酸被逐个地置换为丙氨酸，以确定哪些氨基酸对Gβ₁γ₂与九种不同的SIGK肽衍生物的相互作用是最至关重要的(表9)。

表9

噬菌体名称	序列＊	SEQ ID NO：	组
				3.142FC1	SIGKALFILGYPDYDLCSKAYLLLGQTCSCKRTKAQILLAPCT	567	I
C143C	WCPPKAMTQLGIKACSCGHGLKVQSTIGACA	89	II
				C4C5C8	SCEKRYGIEFCTSCEKRLGVRSCTSCARFFGTPGCT	101112	III
C2	WCPPKLEQWYDGCA	13	IV

^＊带下划线的残基表示接触N-末端的赖氨酸残基和疏水核心的残基。选择这九个肽是为了代表以前鉴定的肽的不同的一致组(见Scottet al.(2001)见上文；表9)，并对一致组内或一致组间的结合特征进行比较。展示所述肽的噬菌体与野生型Gβ₁γ₂的结合所发出的ELISA信号是不同的，但是处于相似的区间内(相对于噬菌体3.14的25％-100％的结合)。如本文所公开，通过对在基于溶液的测定中肽的行为结果进行比较，ELISA测定得到的结合信号与亲和性的丧失被关联。例如，ELISA中一个表现出结合性丧失80％的突变体，同时它在溶液中肽亲和性有相应的10倍的改变。出于本文公开的目的，任何将结合性降低至低于野生型结合性的20％以下的置换被认为是该肽的关键性结合接触。该分析所得数据示于表10。

表10

野生型或丙氨酸替代的生物素化Gβ₁γ₂亚基被固定在抗生物素蛋白链霉素包被的96-孔板上，然后加入噬菌体。噬菌体结合用本文所述评估。针对噬菌体对该板的非特异性结合进行数据校正，数据用野生型结合百分比表示。所示数据为三次独立实验的两次重复测定的平均值±SD。

意外的是，所述肽的每一种使用了SIGK的结合界面中的不同的氨基酸组合以实现其特定的相互作用。在所述肽之中一个主要的特征是在C-末端的界面中强烈地需要Trp332。Lys57、Tyr59和Leu117也在这个界面内，通常对肽的结合贡献很大，虽然在有些情况下它们的作用不是绝对必需。其余的氨基酸对每种肽的结合有更为多样的作用。例如，SIGK对Trp99仅有最小的需求，而Ser-Cys-Lys-Arg-Thr-Lys-Ala-Gln-Ile-Leu-Leu-Ala-Pro-Cys-Thr(C1；SEQ ID NO：7)的结合绝对需要Trp99。对于Tyr145也存在这种相反的情况，SIGK的结合绝对需要Tyr145，而Ser-Cys-Lys-Arg-Thr-Lys-Ala-Gln-Ile-Leu-Leu-Ala-Pro-Cys-Thr(C1；SEQ ID NO：7)的结合则不受该突变的影响。

SIGK的N-末端与Gβ亚基的相互作用是通过两个主要的接触实现的：sSer1与βAsp186和βTyr145残基的相互作用；以及sLys4与βMet188通过范德华力相互作用，与βAsn230、βAsp246和βAsp228通过氢键或电荷相互作用进行相互作用。在本文使用的表达系统中，Asp228Ala和Asp246Ala不与γ形成二聚体，并且无法被纯化；然而Asp246Ser则被表达和纯化。通常，第I、II和IV组中的肽基本上需要与N-末端区域结合，这一点可通过Met188Ala和Asp246Ser突变体的结合性完全丧失(除SIGK之外)和对Asn230的广泛需要反映出来。

第I、II和IV组中的肽具有一个保守的基序，其中一个赖氨酸与一个疏水核心基序间隔3个氨基酸(见表9)。SIGK中的该基序提供了在单α-螺旋转角中与N-末端结合表面相互作用的赖氨酸和与C-末端相互作用的Ile-Leu-Gly基序之间的合适间隔距离。其他一些肽被认为采用了相似的α-螺旋结构，这使这个间隔至关重要。第III组的肽结合C-末端相互作用区域，但是缺少对Met188的需要，并且对Asn230和Asp246的需要极少，这说明它们与β的相互作用并不使用N-末端的结合表面。

与SIGK没有明显直接结合的两个氨基酸Arg314和His311也被分析。Arg314的置换导致SIGK结合的降低程度不大；然而，对于其他肽Arg314是绝对需要，这表明这些肽可能与该氨基酸直接相互作用。His311完全位于SIGK肽结合位点外，因为它可能参与βγ亚基的构象变化(Gaudet，et al.(1996)见上文；Loew，et al.(1998)见上文)也被突变。His311的咪唑侧链距离Arg314的胍基氮的距离是13

，而Arg314是和任何肽都明显相互作用的最近的氨基酸。His311不太可能与来自展示衍生肽的噬菌体的氨基酸有直接的相互作用。然而，将His311突变成丙氨酸对各种肽的结合的影响各异。被His311A影响结合的肽的结合也需要Arg314，这个作用可能由于Arg314的位置的改变。

已经证明，预计在Gα-Gβγ界面结合的两种肽βARK-ct肽(氨基酸643-670)和QEHA阻断异源三聚体的形成，但是不能促进异源三聚体的解聚(Ghosh，et al.(2003)见上文)。GRK2(βARK)-Gβγ复合体的晶体结构显示与βARK-ct肽相互作用的表面和SIGK-Gα-开关II结合位点部分地重合(Lambright，et al.(1996)见上文；Wall，et al.(1995)见上文；Lodowski，et al.(2003)见上文)。具体而言，疏水口袋内的氨基酸Trp99、Trp332和Try59在所有三个结构中是共同的相互作用位点。SIGK肽和α开关II有一个赖氨酸残基占据Gβ上几乎相同的位置。虽然βARK-ct肽在相似位置上有一个赖氨酸残基，但是相互作用的几何学和性质是不同的。βARK仅与Asp228相互作用，而SIGK和Gα与Asp228、Asp246、Asn230和Met188相互作用。基于这个差异，确定在该界面上的SIGK的特异相互作用是否对促进解聚是至关重要的。

为了检测亚基解聚，使用了来自噬菌体展示筛选的另一种肽SCAR肽。N-末端相互作用界面内与SIGK的sLys4接触的氨基酸Asn230、Asp246和Met188对结合SCAR并不重要。SCAR缺少在相对于疏水核心基序的正确位置上的赖氨酸残基，所述正确位置为能达到赖氨酸结合的N-末端表面的位置(表9)。因此，SCAR不能促进亚基解聚。SIGK和SCAR两者都能和Gα_i竞争与Gβ₁γ₂的结合，IC₅₀分别是0.5和1.7μM。然而，与SIGK肽不同，饱和浓度的SCAR肽不能促进已经形成的异源三聚体的解聚。浓度最高达160μM(饱和浓度的四倍)的SCAR没有引起解聚。SCAR没有促进异源三聚体解聚的能力不是因为其低结合亲和性，因为SIRK具有相似的亲和性并且促进解聚。这些结果表明与N-末端界面结合的肽对加速异源三聚体的解聚时必需的。

为了更加直接地评估与N-末端肽结合界面结合的肽的重要性，SIRK的sLys4残基被突变成丙氨酸，以去除与N-末端结合口袋的关键性接触。对于阻断Gα-Gβγ相互作用，该肽的亲和性比SIRK显著降低(IC₅₀＝60μM对比1.4μM)；然而，在高浓度时它阻断的水平接近于SIRK的阻断水平。虽然能阻断Gα-Gβγ的相互作用，但SIRK(Lys4Ala)并不能加速异源三聚体的解聚。相对于固有的解聚速度，SIRK(Lys4Ala)的Fα_i1表观解聚速率明显降低。这可能是因为SIRK(Lys4Ala)是低亲和阻断剂，并且对抑制Fα_i1的再结合没有效果。为了证实SIRK(Lys4Ala)的低亲和性不是其不具有加速解聚的能力的原因，对一个与SIRK(Lys4Ala)有可比拟的亲和性的肽即SIRK(Gly10Ala)(IC₅₀～80μM)进行测试。该肽含有Lys4但Ala置换了位置10上的Gly，因此SIRK(Gly10Ala)保持了与N-末端界面的结合，但由于与C-末端区域的相互作用降低而减小了亲和性。虽然具有对Gβγ的低亲和性，但SIRK(Gly10Ala)在高浓度时阻断异源三聚体形成，也还是能加速异源三聚体的解聚。

SIGK在异源三聚体的Gα亚基的开关II域占据的区域结合Gβ₁。异源三聚体的晶体结构显示Gα的开关界面(包含开关I和开关II)通过多个接触掩盖Gβ的约1,800

(Lambright，et al.(1996)见上文；Wall，et al.(1995)见上文)；然而，该界面上的β亚基氨基酸的突变对α亚基结合的作用(近似于Gα-Gβγ相互作用的K_d)并没有通过直接的结合测定测量。GTP结合后开关I和开关II产生较大的构象变化，这些变化被认为介导了异源三聚体的解聚。

本文公开的Gβ₁亚基突变体从昆虫细胞分离而来，与Gγ₂和六-组氨酸标记的Gα_i1形成复合体，这说明从晶体结构预测的亚基之间上述接触中的许多并不是每个都对Gα亚基结合都至关重要。为了确定哪些氨基酸对肽提高解聚的速率常数的能力有贡献，测量Fα_i1与每个独立的b-β₁γ₂置换突变体解聚的速率常数(k_off)。野生型的固有解聚速率是0.123s-1，与以前的测量十分一致(Sarvazyan，et al.(1998)J.Biol.Chem.273：7934-7940)。所有这些突变的数据在表11中显示。

表11

突变	Koff ＊＊
		野生型Lys57AlaTyr59AlaTrp99AlaMet101AlaLeu117AlaTyr145AlaAsp186AlaMet188AlaAsn230AlaAsp246SerArg314AlaTrp332Ala	0.123±0.0429min-10.144±0.0441min-10.181±0.0726min-10.288±0.0547min-10.114±0.0175min-10.361±0.0258min-10.155±0.0423min-10.160±0.0429min-10.122±0.0380min-10.148±0.0488min-1---0.118±0.0246min-10.301±0.0420min-1

^＊＊四次独立实验的平均值±SD。

^#与野生型比较的统计学显著性(p＜0.05)，用单因素ANOVA和独立线性对比确定。

k_off无法测量，因为F-α_i的显著的稳定结合无法被检测。

这些结果显示在测试的12个突变体中，Trp99Ala、Leu117Ala和Trp332Ala与野生型有统计学上的差异，伴有k_off相对较小程度的提高。另一方面，虽然可以基于6HisGα_i结合来纯化Asp246Ser(但从大量培养只能得到很低产量)，但是在流式细胞术测定中使用的低浓度使得Asp246Ser不能在该测定中稳定地结合F-α_i1。这表明与Asp246的相互作用对稳定的Gα亚基相互作用至关重要，但在主要为疏水性的C-末端界面中各独立的相互作用并没有那么重要。

实施例9：小分子库筛选

噬菌体ELISA测定被用来确定计算机筛选方法鉴定出的小分子是否能与Gβγ蛋白质相互作用表面相互作用。按照成熟的方法应用展示SIGK肽的噬菌体(Scott，et al.(2001)见上文；Smrcka and Scott(2002)见上文)。筛选是基于包含Gβγ亚基和噬菌体的孔的吸光度(OD)的减小。在每张板中有三个孔中包含阳性对照，所述阳性对照与包括b-βγ亚基、SIGK-噬菌体和适量的载体结合。三个背景孔中不含βγ亚基。

如本文公开的，生物素化的Gβγ亚基被固定在包被有抗生物素蛋白链霉素的96-孔板的表面，随后加入展示Gβγ-结合肽的噬菌体，并在存在和不存在测试化合物的情况下用抗-噬菌体抗体检测结合。

实施例10：抑制嗜中性粒细胞中的Gβγ信号传导

Ca²⁺流用分化的HL-60嗜中性粒细胞培养物(0.2×10⁶细胞/mL)的两个35mL培养物测量。细胞在DMSO(1.2％)中培养三天，用HSS洗涤，用2mL的HBSS重新悬浮细胞，浓度为7×10⁶细胞/mL。生长培养基中加入DMSO诱导这些细胞分化成形态和功能上的成熟中性粒细胞(Collins，et al.(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：2458；Collins，etal.(1979)J.Exp.Med.149：969)。嗜中性粒细胞被预加载一种荧光的Ca²⁺-敏感性指示剂fura-2(1μM)(Suh，et al.(1996)J.Biol.Chem.271：32753)45分钟，用HBSS洗涤并用2mL的无指示剂HBSS重新悬浮细胞。将每140μL等份试样的细胞中加至总体积为2mL的HBSS中。通过340和380nm处的双激发和510nm处的发射得到荧光率。在建立了稳定的基线之后，加入DMSO或者NSC119910并孵育5分钟。随后，加入fMLP或者ATP激动剂以激活Ca²⁺从细胞内贮库中释放。

序列表

<110>罗彻斯特大学

A.V.斯马卡(ALAN V.SMRCKA)

J.方特(JOSE FONT)

T.博纳斯(TABETHA BONACCI)

<120>抑制G蛋白信号传导的组合物和方法

<130>RO0002WO

<150>US 60/659,267

<151>2006-03-07

<160>13

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>1

Ser Ile Arg Lys Ala Leu Asn Ile Leu Gly Tyr Pro Asp Tyr Asp

 1               5                  10                  15

<210>2

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>2

Ser Ile Gly Lys Ala Phe Lys Ile Leu Gly Tyr Pro Asp Tyr Asp

 1               5                  10                  15

<210>3

<211>340

<212>PRT

<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)

<400>3

Met Gly Glu Met Glu Gln Leu Lys Gln Glu Ala Glu Gln Leu Lys Lys

 1               5                  10                  15

Gln Ile Ala Asp Ala Arg Lys Ala Cys Ala Asp Ile Thr Leu Ala Glu

            20                  25                  30

Leu Val Ser Gly Leu Glu Val Val Gly Arg Val Gln Met Arg Thr Arg

        35                  40                  45

Arg Thr Leu Arg Gly His Leu Ala Lys Ile Tyr Ala Met His Trp Ala

    50                  55                  60

Thr Asp Ser Lys Leu Leu Val Ser Ala Ser Gln Asp Gly Lys Leu Ile

65                  70                  75                  80

Val Trp Asp Thr Tyr Thr Thr Asn Lys Val His Ala Ile Pro Leu Arg

                85                  90                  95

Ser Ser Trp Val Met Thr Cys Ala Tyr Ala Pro Ser Gly Asn Phe Val

            100                 105                 110

Ala Cys Gly Gly Leu Asp Asn Met Cys Ser Ile Tyr Ser Leu Lys Ser

        115                 120                 125

Arg Glu Gly Asn Val Lys Val Ser Arg Glu Leu Ser Ala His Thr Gly

    130                 135                 140

Tyr Leu Ser Cys Cys Arg Phe Leu Asp Asp Asn Asn Ile Val Thr Ser

145                 150                 155                 160

Ser Gly Asp Thr Thr Cys Ala Leu Trp Asp Ile Glu Thr Gly Gln Gln

                165                 170                 175

Lys Thr Val Phe Val Gly His Thr Gly Asp Cys Met Ser Leu Ala Val

            180                 185                 190

Ser Pro Asp Tyr Lys Leu Phe Ile Ser Gly Ala Cys Asp Ala Ser Ala

        195                 200                 205

Lys Leu Trp Asp Val Arg Glu Gly Thr Cys Arg Gln Thr Phe Thr Gly

    210                 215                 220

His Glu Ser Asp Ile Asn Ala Ile Cys Phe Phe Pro Asn Gly Glu Ala

225                 230                 235                 240

Ile Cys Thr Gly Ser Asp Asp Ala Ser Cys Arg Leu Phe Asp Leu Arg

                245                 250                 255

Ala Asp Gln Glu Leu Thr Ala Tyr Ser His Glu Ser Ile Ile Cys Gly

            260                 265                 270

Ile Thr Ser Val Ala Phe Ser Leu Ser Gly Arg Leu Leu Phe Ala Gly

        275                 280                 285

Tyr Asp Asp Phe Asn Cys Asn Val Trp Asp Ser Leu Lys Cys Glu Arg

    290                 295                 300

Val Gly Val Leu Ser Gly His Asp Asn Arg Val Ser Cys Leu Gly Val

305                 310                 315                 320

Thr Ala Asp Gly Met Ala Val Ala Thr Gly Ser Trp Asp Ser Phe Leu

                325                 330                 335

Lys Ile Trp Asn

            340

<210>4

<211>340

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>misc_feature

<222>(107)..(107)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>4

Met Ser Glu Leu Glu Gln Leu Arg Gln Glu Ala Glu Gln Leu Arg Asn

 1               5                  10                  15

Gln Ile Arg Asp Ala Arg Lys Ala Cys Gly Asp Ser Thr Leu Thr Gln

            20                  25                  30

Ile Thr Ala Gly Leu Asp Pro Val Gly Arg Ile Gln Met Arg Thr Arg

        35                  40                  45

Arg Thr Leu Arg Gly His Leu Ala Lys Ile Tyr Ala Met His Trp Gly

    50                  55                  60

Thr Asp Ser Arg Leu Leu Val Ser Ala Ser Gln Asp Gly Lys Leu Ile

65                  70                  75                  80

Ile Trp Asp Ser Tyr Thr Thr Asn Lys Val His Ala Ile Pro Leu Arg

                85                  90                  95

Ser Ser Trp Val Met Thr Cys Ala Tyr Ala Xaa Ser Gly Asn Phe Val

            100                 105                 110

Ala Cys Gly Gly Leu Asp Asn Ile Cys Ser Ile Tyr Ser Leu Lys Thr

        115                 120                 125

Arg Glu Gly Asn Val Arg Val Ser Arg Glu Leu Pro Gly His Thr Gly

    130                 135                 140

Tyr Leu Ser Cys Cys Arg Phe Leu Asp Asp Asn Gln Ile Ile Thr Ser

145                 150                 155                 160

Ser Gly Asp Thr Thr Cys Ala Leu Trp Asp Ile Glu Thr Gly Gln Gln

                165                 170                 175

Thr Val Gly Phe Ala Gly His Ser Gly Asp Val Met Ser Leu Ser Leu

            180                 185                 190

Ala Pro Asn Gly Arg Thr Phe Val Ser Gly Ala Cys Asp Ala Ser Ile

        195                 200                 205

Lys Leu Trp Asp Val Arg Asp Ser Met Cys Arg Gln Thr Phe Ile Gly

    210                 215                 220

His Glu Ser Asp Ile Asn Ala Val Ala Phe Phe Pro Asn Gly Tyr Ala

225                 230                 235                 240

Phe Thr Thr Gly Ser Asp Asp Ala Thr Cys Arg Leu Phe Asp Leu Arg

                245                 250                 255

Ala Asp Gln Glu Leu Leu Met Tyr Ser His Asp Asn Ile Ile Cys Gly

            260                 265                 270

Ile Thr Ser Val Ala Phe Ser Arg Ser Gly Arg Leu Leu Leu Ala Gly

        275                 280                 285

Tyr Asp Asp Phe Asn Cys Asn Ile Trp Asp Ala Met Lys Gly Asp Arg

    290                 295                 300

Ala Gly Val Leu Ala Gly His Asp Asn Arg Val Ser Cys Leu Gly Val

305                 310                 315                 320

Thr Asp Asp Gly Met Ala Val Ala Thr Gly Ser Trp Asp Ser Phe Leu

                325                 330                 335

Lys Ile Trp Asn

            340

<210>5

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>5

Ser Ile Gly Lys Ala Leu Phe Ile Leu Gly Tyr Pro Asp Tyr Asp

 1               5                  10                  15

<210>6

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>6

Leu Cys Ser Lys Ala Tyr Leu Leu Leu Gly Gln Thr Cys

 1               5                  10

<210>7

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>7

Ser Cys Lys Arg Thr Lys Ala Gln Ile Leu Leu Ala Pro Cys Thr

 1                5                 10                  15

<210>8

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>8

Trp Cys Pro Pro Lys Ala Met Thr Gln Leu Gly Ile Lys Ala Cys

 1               5                  10                  15

<210>9

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>9

Ser Cys Gly His Gly Leu Lys Val Gln Ser Thr Ile Gly Ala Cys Ala

 1               5                  10                  15

<210>10

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>10

Ser Cys Glu Lys Arg Tyr Gly Ile Glu Phe Cys Thr

 1               5                  10

<210>11

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>11

Ser Cys Glu Lys Arg Leu Gly Val Arg Ser Cys Thr

 1               5                 10

<210>12

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>12

Ser Cys Ala Arg Phe Phe Gly Thr Pro Gly Cys Thr

 1                5                 10

<210>13

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>13

Trp Cys Pro Pro Lys Leu Glu Gln Trp Tyr Asp Gly Cys Ala

 1               5                  10

Claims (7)

1.一种对可调节G蛋白的至少一种活性的试剂进行鉴定的方法，包括使G蛋白β亚基与一种待测试剂相接触，并确定所述试剂是否与所述β亚基的蛋白质相互作用位点的至少一个氨基酸残基相互作用，从而鉴定一种可调节所述G蛋白的至少一种活性的试剂。

2.一种试剂，所述试剂根据权利要求1中的方法鉴定。

3.一种用于鉴定一种试剂的方法，所述试剂可与所述β亚基的蛋白质相互作用位点的至少一个氨基酸残基结合，所述方法包括：

在存在一种肽的条件下，使G蛋白β亚基与一种待测试剂相接触，所述肽可与β亚基的蛋白质相互作用位点的至少一个氨基酸残基结合；并且

确定所述试剂是否抑制所述肽对所述β亚基的蛋白质相互作用位点的至少一个氨基酸残基的结合，从而鉴定一种可与所述β亚基的蛋白质相互作用位点的至少一个氨基酸残基结合的试剂。

4.一种试剂，所述试剂根据权利要求3的方法鉴定。

5.一种用于鉴定一种试剂的试剂盒，所述试剂可与所述β亚基的蛋白质相互作用位点的至少一个氨基酸残基结合，所述试剂盒包含一个SIGK肽或SIGK肽衍生物。

6.一种用于调节G蛋白的至少一种活性的方法，包括使G蛋白与有效量的一种试剂接触，所述试剂可与所述G蛋白β亚基的蛋白质相互作用位点的至少一个氨基酸残基相互作用，从而调节所述G蛋白的至少一种活性。

7.一种预防或治疗一种疾病或病症的方法，所述疾病或病症与至少一种G蛋白βγ亚基活性有关，所述方法包括对患有与至少一种G蛋白βγ亚基活性有关的疾病或病症的患者或具有该患病风险的患者给予有效量的一种试剂——所述试剂可与所述G蛋白β亚基的蛋白质相互作用位点的至少一个氨基酸残基相互作用——从而调节所述G蛋白的至少一种活性，由此预防或治疗与至少一种G蛋白βγ亚基活性有关的疾病或病症。

Images