JP7014437B2 - 生体物質の検出方法、それに用いる化学発光指示薬 - Google Patents
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Description
前記試料に、生体物質を結合可能なタンパク質(A)と化学発光タンパク質(B)とが融合した融合タンパク質(C)、及び、前記化学発光タンパク質(B)の基質を混合すること、並びに、
前記試料からの発光シグナルを観察することを含み、
前記タンパク質(A)と前記タンパク質(B)とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されており、
前記タンパク質(A)は、前記生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質(A1)、又は、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質(A2)であり、
前記タンパク質(B)は、その発光エネルギーにより前記タンパク質(A)の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである検出方法(以下、本開示に係る検出方法ともいう。)に関する。
前記タンパク質(A)と前記タンパク質(B)とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されており、
前記タンパク質(A)は、前記生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質(A1)、又は、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質(A2)であり、
前記タンパク質(B)は、その発光エネルギーにより前記タンパク質(A)の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである化学発光指示薬に関する。
本開示に係る検出方法の検出対象としては、生体試料における生体物質が挙げられる。生体試料としては、生物に由来する該生体物質を含む試料であって、液体状であることが好ましい。そのような生体試料としては、特に制限されないが、例えば、全血、血清、血漿、及び尿などの体液試料があげられる。また、本発明における生体試料は、必要に応じて希釈及び/又は前処理などをされたものであってもよい。本開示に係る検出方法は、当然ながら、上記「生体試料」以外の試料を測定対象とすることができる。例えば、検出対象の生体物質の標準試料、すなわち、測定するためのコントロール試料が挙げられる。 生体物質としては、後述するタンパク質(A)に結合するものであって、例えば、生体内の低分子化合物、分解代謝物、核酸、糖、ペプチド、タンパク質、細胞、又は微生物等が挙げられる。
本開示に係る「生体物質を結合可能なタンパク質(A)」としては、一又は複数の実施形態において、生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質(A1)、及び、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質(A2)が挙げられる。
IFPは、infrared-fluorescent proteinの略称であり、ビリベルジンと結合して赤色の蛍光性を示すタンパク質である(Shu X, et al., Science 2009, 324(5928), 804-8-7)。
iRFPは、near-infrared fluorescent proteinの略称であり、ビリベルジンと結合して赤色の蛍光性を示すタンパク質である(Filonov GS, et al., Nat Biotech 2011, 29(8), 757-761)。
前記タンパク質(A1)としてこれらのsmURFP、IFP、又はiRFPを用いれば、例えば、ビリベルジンの検出ができる。
iLOVタンパク質は、植物青色受容体フォトトロピンのlight, oxygen or voltage-sensing (LOV)ドメイン由来の蛍光タンパク質を改変して蛍光特性がインプルーブしたタンパク質である(Chapman S., et al., PNAS 2008, 105(50) 20038-43)。
mini-SOGタンパク質は、mini Singlet Oxygen Generatorの略称であり、Arabidopsisのフォトトロピン2由来の蛍光タンパク質である(Shu X., et al., PLoS Biol. 2011, 9(4) )。
化学発光タンパク質(B)は、その発光エネルギーによりタンパク質(A)の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである。このような化学発光タンパク質(B)が融合した融合タンパク質(C)を検出試薬として使用することから、本開示に係る検出方法によれば、観察のための励起光源を使用することなく、生体物質の定量的な測定を行うことができる。化学発光タンパク質(B)としては、共鳴エネルギー移動により前記タンパク質(A)の蛍光を励起できる共鳴エネルギー移動のドナーとなりえる発光タンパク質(ルシフェラーゼ)が挙げられる。発光色によって検出を判定できる点からは、前記タンパク質(A)の発光色と、前記タンパク質(B)の発光色とは異なることが好ましい。
前記融合タンパク質(C)において、前記タンパク質(A)と前記タンパク質(B)とは、リンカーで結合されていてもよい。該リンカーは前記タンパク質(B)から前記タンパク質(A)への共鳴エネルギー移動の効率が高くなるように選択されうる。該リンカーの長さとしては、一又は複数の実施形態において、1~10、1~5、2~4又は2~3アミノ酸残基が挙げられる。
したがって、本開示に係る検出方法は、試料中の生体物質の検出方法であって、
前記試料に、生体物質を結合可能なタンパク質(A)と化学発光タンパク質(B)とが融合した融合タンパク質(C)、及び、前記化学発光タンパク質(B)の基質を混合すること、並びに、
前記試料からの発光シグナルを観察することを含み、
前記タンパク質(A)と前記タンパク質(B)とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されており、
前記タンパク質(A)は、前記生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質(A1)、又は、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質(A2)であり、
前記タンパク質(B)は、その発光エネルギーにより前記タンパク質(A)の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである。
本開示に係る検出方法は、一又は複数の実施形態において、試料の発光シグナルから生体物質の濃度を定量的に算出する工程を含んでもよい。
本開示は、その他の態様において、融合タンパク質(C)に関する。
また、融合タンパク質(C)は、前記生体物質の化学発光指示薬として使用できる。したがって、本開示は、その他の態様において、生体物質を結合可能なタンパク質(A)と化学発光タンパク質(B)とが融合した融合タンパク質(C)を含む化学発光指示薬であって、前記タンパク質(A)と前記タンパク質(B)とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されており、前記タンパク質(A)は、前記生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質(A1)、又は、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質(A2)であり、前記タンパク質(B)は、その発光エネルギーにより前記タンパク質(A)の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである化学発光指示薬に関する。
また、前記化学発光指示薬は、本開示に係る検出方法に使用できるから、本開示は、その他の態様において、本開示に係る検出方法に使用するための前記化学発光指示薬、及びその使用に関する。
本開示は、一態様において、本開示に係る融合タンパク質(C)をコードする核酸に関する。本開示において、核酸は、合成DNA、cDNA、ゲノムDNA及びプラスミドDNAから選択される一本鎖又は二本鎖DNA、並びにこれらのDNAの転写生成物が挙げられる。
本開示は、一態様において、本開示に係る融合タンパク質(C)をコードする核酸を含む発現カセットに関する。該発現カセットにおいて、前記核酸は、導入する宿主細胞に応じた発現調節配列が作動的に連結されている。発現調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター等が挙げられ、その他には、開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、及び停止コドンなどが挙げられる。
本開示は、一態様において、本開示に係る融合タンパク質(C)を発現可能なベクターに関する。本開示は、その他の態様において、本開示に係るベクターは、一又は複数の実施形態において、本開示に係る核酸又は発現カセットを有する発現ベクターである。本開示に係るベクターは、発現させたい細胞(宿主)に応じた発現ベクター系を適宜選択して使用できる。本開示に係るベクターに利用できるベクターとしては、限定されない一又は複数の実施形態として、プラスミド、コスミド、YACS、ウイルス(例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、エピソームEBVなど)ベクター及びファージベクターが挙げられる。
本開示は、一態様において、本開示に係る融合タンパク質(C)を発現する形質転換体に関する。本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示に係る核酸又はベクターを有する形質転換体に関する。本開示の形質転換体は、一又は複数の実施形態において、本開示の核酸、発現カセット又はベクターを宿主に導入することによって作成することができる。宿主としては、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び微生物等が挙げられる。
本開示は、その他の態様において、本開示に係る検出方法で得られた発光シグナルデータに基づき試料中の生体物質の濃度を判別することを含む、試料中の生体物質の濃度判別方法に関する。
上述のように、本開示に係る検出方法で得られる発光シグナルにおけるタンパク質(A)と(B)との発光強度比は、試料中の生体物質の濃度に依存させることができる。よって、検出に使用した融合タンパク質(C)の情報と発光シグナルとから生体物質の濃度を判別することができる。
前記発光シグナルデータは、モバイル端末(スマートフォンなど)のカラーカメラなどのカラー検出器で簡便に取り込み、送受信することが可能であるから、簡便に生体物質の濃度を把握することができる。
〔1〕 試料中の生体物質の検出方法であって、
前記試料に、生体物質を結合可能なタンパク質(A)と化学発光タンパク質(B)とが融合した融合タンパク質(C)、及び、前記化学発光タンパク質(B)の基質を混合すること、並びに、
前記試料からの発光シグナルを観察することを含み、
前記タンパク質(A)と前記タンパク質(B)とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されており、
前記タンパク質(A)は、前記生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質(A1)、又は、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質(A2)であり、
前記タンパク質(B)は、その発光エネルギーにより前記タンパク質(A)の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである、検出方法。
〔2〕 前記タンパク質(A1)が、ビリルビンを結合した状態で蛍光を発しうるUnaGタンパク質又はその改変体であり、検出対象の生体物質が、ビリルビンである、〔1〕に記載の検出方法。
〔3〕 前記タンパク質(A1)が、ビリベルジンを結合した状態で蛍光を発しうる、IFP、iRFP、smURFP、及びこれらの改変体であり、検出対象の生体物質がビリベルジンである、〔1〕に記載の検出方法。
〔4〕 前記タンパク質(A2)が、フラビンモノヌクレオチドを結合可能な、FbFP、iLOVタンパク質、mini-SOGタンパク質、及びこれらの改変体からなる群から選択されるタンパク質であり、検出対象の生体物質がフラビンモノヌクレオチドである、〔1〕から〔3〕のいずれかに記載の検出方法。
〔5〕 生体物質を結合可能なタンパク質(A)と化学発光タンパク質(B)とが融合した融合タンパク質(C)を含む化学発光指示薬であって、
前記タンパク質(A)と前記タンパク質(B)とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されており、
前記タンパク質(A)は、前記生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質(A1)、又は、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質(A2)であり、
前記タンパク質(B)は、その発光エネルギーにより前記タンパク質(A)の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである、化学発光指示薬。
〔6〕 〔1〕から〔4〕のいずれかに記載の検出方法に使用するための、〔5〕に記載の化学発光指示薬。
〔7〕 〔1〕から〔4〕のいずれかで規定された融合タンパク質(C)を発現可能なベクター又は形質転換体。
〔8〕 〔1〕から〔4〕のいずれかに記載の検出方法で得られた発光シグナルデータに基づき試料中の生体物質の濃度を判別することを含む、試料中の生体物質の濃度判別方法。
1.融合タンパク質(化学発光指示薬)の遺伝子構築
野生型UnaGのC末欠損変異体を、N末にBamHI制限酵素部位、C末にKpnI制限酵素部位を付加した以下のプライマーを用いて増幅した。
Forward primer: CGCGGATCCGGGTGGTTCTGGTATGG 配列番号1
Reverse primer0: (CΔ0) GCTGGTACCTTCCGTCGCCCTCCG 配列番号2
Reverse primer1: (CΔ1) GCTGGTACCCGTCGCCCTCCGGTA 配列番号3
Reverse primer2: (CΔ2) GCTGGTACCCGCCCTCCGGTAGCT 配列番号4
Reverse primer3: (CΔ3) GCTGGTACCCCTCCGGTAGCTGCG 配列番号5
Reverse primer4: (CΔ4) GCTGGTACCCCGGTAGCTGCGCAC 配列番号6
Forward primer 1: (NΔ1) GCCGGTACCGTCTTCACACTCGAAGATTTCG 配列番号7
Forward primer 2: (NΔ4) GCCGGTACCCTCGAAGATTTCGTTGGGGAC 配列番号8
Forward primer 3: (NΔ5) GCCGGTACCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGC 配列番号9
Reverse primer: ATGAATTCTTACGCCAGAATGCGTTCGCACAG 配列番号10
コロニーの生えた寒天培地を室温に置き、室温近くまで冷ました1%低融点アガロースゲルに最終濃度10μMのBilirubinを加えた溶液4mLを加えて、寒天培地上に注ぎ、室温で固めた。次に、ゲルの上から10μM Coelenterazine-h溶液を加え、すぐに暗箱に設置した一眼レフカメラ(Sony α7)により撮影し、コロニーのカラー画像を取得した。RGB画像の緑チャンネル(UnaGの発光)と青チャンネル(NLucの発光)画像からレシオ画像を作成し、レシオ値が高いコロニーをピックアップした。次に、ピックアップしたコロニーを、96ウェルプレートで、LB培地+10μM Bilirubin+100μg/mL Ampicillinで23℃、60時間培養した。培養液に10μM coelenterazineを加え、蛍光分光光度計(FV7000)あるいはプレートリーダーにより化学発光スペクトルを計測した。波長450nmで規格化し、波長525nmの相対値(レシオ値)をもとにスクリーニングを行った。
UnaGとNLucのつなぎ目の配列である2残基(GT)を、インバースPCR法によってランダムな配列に置換した。次のプライマーを使用した。
Forward primer: NNKNNKGTCTTCACACTCGAAGATTTC 配列番号13
Reverse primer: TTCCGTCGCCCTCCGGTAGCTG 配列番号14
ベクター配列を含む全長を増幅後、制限酵素DpnIで処理することでテンプレートプラスミドを処理し、Ligation後、JM109(DE3)株に形質転換し、10cmディッシュに作成したLBアガー寒天培地上で、37℃で一晩培養した。発現したコロニーを、上記2で記述した方法でスクリーニングした。
UnaGとNLucのつなぎの配列(GT)の後ろに、リンカー配列をインバースPCR法により挿入した。以下のプライマーを使用した。
Forward primer (G): GGCGTCTTCACACTCGAAGATTTC 配列番号15
Forward primer (GG): GGCGGCGTCTTCACACTCGAAGATTTC 配列番号16
Forward primer (GGS): GGCGGCAGCGTCTTCACACTCGAAGATTTC 配列番号17
Reverse primer: GGTACCTTCCGTCGCCCTC 配列番号18
ベクター配列を含む全長をPCRにて増幅後、制限酵素DpnIで処理することでテンプレートプラスミドを処理し、Ligation後、JM109(DE3)株に形質転換し、10cmディッシュに作成したLBアガー寒天培地上で、37℃で一晩培養した。発現したコロニーを、上記2で記述した方法でスクリーニングした。
JM109(DE3)株に形質転換したUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質を、200mLのLB培地+100μg/mL Carvenisillin溶液で、23℃で60時間培養した。集菌後、フレンチプレス法により大腸菌を破砕し、Ni-NTAカラム(QIAGEN)を用いたアフィニティークロマトグラフィー法により精製した。さらに、過剰なimidazoleを取り除くために、ゲルろ過カラム(PD-10, GE HealthCare)を用いた。タンパク質濃度はブラッドフォード法により計測した。
精製したUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質500μLを15mLファルコンチューブに入れ、液体窒素により凍らせた。その後、凍結乾燥装置により、タンパク質溶液の粉末を得た。粉末は室温で保存した。
最終濃度5nMのUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質に対し、0.01nM,0.05nM,0.1nM,0.5nM,1nM,2.5nM,5nM,又は10nMのビリルビン(BR)溶液及び最終濃度5μM Coelenterazine-hを混合し、発光スペクトルをマルチチャンネル分光器(PMA-12,浜松ホトニクス製)あるいはプレートリーダーにより計測した。その結果の一例を図3に示す。3回の独立した計測の平均値をプロットし、ヒルの式によりフィッティングを行った。Kd値は3.05nMであった。
96マルチウェルプレートに、最終濃度50nMの融合タンパク質に最終濃度10nM,20nM,30nM,40nM,50nM,100nM,又は250nMのビリルビン溶液及び最終濃度5μM Coelenterazine-hを混合し、iPhone(登録商標)6に搭載したアプリ(Manual - Custom exposure camera)を用い、ISO1500,露光時間0.5秒により計測した。
図5のような相関があれば、発光データ(発光色)からビリルビン濃度が算出できる。
一定濃度のビリルビン・発光基質(Coelenterazine-h)溶液に対し、原液、2倍希釈、4倍希釈又は8倍希釈のUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質溶液を混合し、発光スペクトルをマルチチャンネル分光器(PMA-12,浜松ホトニクス製)により計測し、得られた発光強度からUnaGの発光波長(530nm)の発光強度とNLucの発光波長(460nm)の発光強度とのレシオ値(530nm/460nm)を算出した。その結果の一例を図6に示す。図6において、図6Aが化学発光スペクトルを示し、図6BがUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質溶液(検出試薬)の希釈率とレシオ値(530nm/460nm)との関係を示すグラフである。
96ウェルプレート(黒色)にUnaGタンパク質溶液(8.25nM,16.5nM,31.5nM,62.5nM,125nM又は250nM)を50μLずつ加え、ついで400nMビリルビン溶液を50μLずつ加えた。マイクロプレートリーダー(SH-9000,corona社製)を用いて450nmの波長の励起光を照射後、蛍光スペクトルを取得した。その結果の一例を図7に示す。図7において、図7Aが蛍光スペクトルを示し、図7BがUnaGタンパク質溶液(検出試薬)の濃度とUnaGの発光波長(530nm)の蛍光強度との関係を示すグラフである。
これに対し、UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質を用いて計測した実施例2では、検出試薬の濃度によって発光強度は異なるものの、スペクトルの波形が一定であり(図6A)、図6Bに示す通り、検出試薬の濃度にかかわらず同一のビリルビン濃度に対するピークレシオ値(530nm/460nm)は略同じであった。このため、UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質を使用することにより、検出試薬の濃度に関わらない測定、つまり定量的な計測が可能であるといえる。
配列番号 2:リバースプライマー
配列番号 3:リバースプライマー
配列番号 4:リバースプライマー
配列番号 5:リバースプライマー
配列番号 6:リバースプライマー
配列番号 7:フォワードプライマー
配列番号 8:フォワードプライマー
配列番号 9:フォワードプライマー
配列番号10:リバースプライマー
配列番号11:UnaG(C 0)-NLuc(N 1)融合タンパク質の塩基配列
配列番号12:UnaG(C 0)-NLuc(N 1)融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号13:フォワードプライマー
配列番号14:リバースプライマー
配列番号15:フォワードプライマー
配列番号16:フォワードプライマー
配列番号17:フォワードプライマー
配列番号18:リバースプライマー
Claims (11)
- 試料中の生体物質の検出方法であって、
前記試料に、生体物質を結合可能なタンパク質(A)と化学発光タンパク質(B)とが融合した融合タンパク質(C)、及び、前記化学発光タンパク質(B)の基質を混合すること、並びに、
前記試料からの発光シグナルを観察することを含み、
前記タンパク質(A)と前記タンパク質(B)とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されており、
前記タンパク質(A)は、前記生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質(A1)であり、
前記タンパク質(B)は、その発光エネルギーにより前記タンパク質(A1)の蛍光を励起できるものである、検出方法。 - 前記タンパク質(A1)が、ビリルビンを結合した状態で蛍光を発しうるUnaGタンパク質又はその改変体であり、
検出対象の生体物質が、ビリルビンである、請求項1に記載の検出方法。 - 前記タンパク質(A1)が、ビリベルジンを結合した状態で蛍光を発しうる、IFP、iRFP、smURFP、及びこれらの改変体からなる群から選択されるタンパク質であり、
検出対象の生体物質が、ビリベルジンである、請求項1に記載の検出方法。 - 生体物質を結合可能なタンパク質(A)と化学発光タンパク質(B)とが融合した融合タンパク質(C)を含む化学発光指示薬であって、
前記タンパク質(A)と前記タンパク質(B)とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されており、
前記タンパク質(A)は、前記生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質(A1)であり、
前記タンパク質(B)は、その発光エネルギーにより前記タンパク質(A)の蛍光を励起できるものである、化学発光指示薬。 - 請求項1から3のいずれかに記載の検出方法に使用するための、請求項4に記載の化学発光指示薬。
- 請求項1から3のいずれかで規定された融合タンパク質(C)を発現可能なベクター又は形質転換体。
- 請求項1から3のいずれかに記載の検出方法で得られた発光シグナルデータに基づき試料中の生体物質の濃度を判別することを含む、試料中の生体物質の濃度判別方法。
- 試料中の生体物質の検出方法であって、
前記試料に、生体物質を結合可能なタンパク質(A)と化学発光タンパク質(B)とが融合した融合タンパク質(C)、及び、前記化学発光タンパク質(B)の基質を混合すること、並びに、
前記試料からの発光シグナルを観察することを含み、
前記検出する生体物質は、自家蛍光分子であり、
前記タンパク質(A)と前記タンパク質(B)とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されており、
前記タンパク質(A)は、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質(A2)であり、
前記タンパク質(B)は、その発光エネルギーにより前記タンパク質(A2)の自家蛍光を励起できるものである、検出方法。 - 前記タンパク質(A2)が、フラビンモノヌクレオチドを結合可能な、FbFP、iLOVタンパク質、mini-SOGタンパク質、及びこれらの改変体からなる群から選択されるタンパク質であり、
検出対象の生体物質が、フラビンモノヌクレオチドである、請求項8に記載の検出方法。 - 生体物質を結合可能なタンパク質(A)と化学発光タンパク質(B)とが融合した融合タンパク質(C)を含む化学発光指示薬であって、
前記タンパク質(A)と前記タンパク質(B)とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されており、
前記タンパク質(A)は、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質(A2)であり、
前記タンパク質(B)は、その発光エネルギーにより前記タンパク質(A2)の自家蛍光を励起できるものである、化学発光指示薬。 - 前記発光シグナルの観察は、前記発光シグナルをカラー検出器で検出することを含む、請求項1から3、8及び9のいずれかに記載の検出方法。
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